WO2018185439A1 - Microcompartiment de cellules hématopoïétiques malignes et procédé de préparation d'un tel microcompartiment - Google Patents

Microcompartiment de cellules hématopoïétiques malignes et procédé de préparation d'un tel microcompartiment Download PDF

Info

Publication number
WO2018185439A1
WO2018185439A1 PCT/FR2018/050855 FR2018050855W WO2018185439A1 WO 2018185439 A1 WO2018185439 A1 WO 2018185439A1 FR 2018050855 W FR2018050855 W FR 2018050855W WO 2018185439 A1 WO2018185439 A1 WO 2018185439A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
microcompartment
lymphoma
cellular
Prior art date
Application number
PCT/FR2018/050855
Other languages
English (en)
Inventor
Laurence BRESSON-BEPOLDIN
Simon LATOUR
Isabelle MAHOUCHE
Pierre Nassoy
Kevin ALESSANDRI
Karin Tarte
Frédéric MOURCIN
Original Assignee
Universite de Bordeaux
Centre National De La Recherche Scientifique
INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale)
Institut D'optique Graduate School
Institut Bergonie
Universite De Rennes 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Bordeaux, Centre National De La Recherche Scientifique, INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale), Institut D'optique Graduate School, Institut Bergonie, Universite De Rennes 1 filed Critical Universite de Bordeaux
Priority to US16/603,264 priority Critical patent/US20200370022A1/en
Priority to EP18718897.4A priority patent/EP3607056A1/fr
Priority to JP2020504449A priority patent/JP2020524523A/ja
Publication of WO2018185439A1 publication Critical patent/WO2018185439A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0012—Cell encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1352—Mesenchymal stem cells
    • C12N2502/1358—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/04—Screening or testing on artificial tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/74—Alginate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the invention relates to a method for preparing microcompartmental cells comprising malignant haematopoietic cells.
  • the invention also relates to such cellular micro-compartments and to their use, in particular in the pharmaceutical field, for the screening and identification of molecules of interest likely to treat a hematological malignancy.
  • Cancers of hematopoietic tissues, or hematological malignancies, are characterized by a disorder of the multiplication and differentiation of cells of a blood line.
  • the most common malignant hemopathies include leukemias and lymphomas.
  • Leukemia is a cancer of bone marrow cells, which is characterized by abnormal and massive proliferation of precursors of incompletely differentiated white blood cells, to the detriment of red blood cells, normal white blood cells and platelets.
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • AML acute myeloblastic leukemia
  • CML chronic myeloid leukemia
  • Lymphoma is a group of cancers of the lymphatic system that originates in a secondary lymphoid organ and can spread to all parts of the lymphatic system.
  • lymphoma There are two main types of lymphoma: Hodgkin lymphoma and non-Hodgkin lymphoma (NHL).
  • NHLs are cancers whose incidence has been increasing for 40 years in developed countries and which ranks as the 10th most cancers in terms of frequency.
  • lymphomas are formed and evolve within the secondary lymphoid organs comprising several types of cells (microenvironmental cells and lymphoma cells), which interact with each other within an extracellular matrix via soluble and membrane molecules, and are subjected to bio-mechanical forces. All of these factors affect the development of lymphoma, but also the response to treatment. However, 2D models do not reproduce these phenomena and are therefore only weakly representative of the pathophysiological processes of lymphomas.
  • animal models have been developed in which human cancer cells are grafted or injected. Such animal models are however expensive, difficult to reproduce, and generally not representative of the physiological phenomena of human hematological malignancies.
  • 3D cancer cell cultures have been developed. These 3D cultures are particularly interesting for studying the mechanisms of progression of cancers and better testing anti-cancer treatments. Indeed, cells cultured in 3D within a matrix or in aggregates, have an architecture closer to the tissue and the tumor and show an expression of their genes similar to that of the tumor in vivo (Gravelle et al, 2014 Am. J. Pathol 184: 2082-295, Weiswald et al., 2009, Br. J. Cancer 101: 473-482). In addition, models of 3D co-cultures mimicking cancer cell / stromal cell interactions can at least partially reproduce the tumor niche and study the consequences on tumor progression or drug resistance.
  • 3D models of lymphomas are generally obtained using collagen sponges (Kobayashi et al., Trends Immunol 31: 422-428), the so-called “hanging drop” technique (Gravelle et al., 2014. Am., J. Pathol. : 282-295) or a polystyrene architecture (Caicedo-Carvajal et al. J. Tissue Eng 2011: 362326).
  • these techniques have many disadvantages, both in terms of costs and reproducibility, making them irrelevant for the industrial scale study of new drugs.
  • the developed 3D cultures do not include any element of the tumor microenvironment, thus limiting their relevance.
  • the inventors have found that by coextruding a hydrogel solution with a solution of cells comprising lymphoma cells, and optionally lymphoid-type stromal cells, i.e., close to stromal cells that infiltrate lymphomas, and extracellular matrix, said cells aggregated within the hydrogel capsule to organize themselves into a cell mass approximating the cellular organization within a lymphoma. Furthermore, depending on the type of cells coextruded with the hematopoietic malignant cells, the inventors have discovered that it is possible to recreate a tumor niche mimicking a tumor niche in vivo.
  • microcompartments in which the nature of the cells and the intercellular interactions are substantially similar to those observed within a lymphomatous tumor niche, or leukemia.
  • the cellular microcompartments developed according to the invention are particularly relevant as 3D models of hematological malignancies, in particular for the screening and the identification of new candidate molecules for the treatment of lymphomas and / or leukemias.
  • the process according to the invention makes it possible to obtain very large quantities of microcompartment of perfectly controlled dimensions.
  • the microcompartments obtained are easy to manipulate, making them particularly suitable for use on a large scale, particularly in the pharmaceutical field.
  • the subject of the invention is therefore a method for preparing a cellular microcompartment comprising an aggregate of cells containing malignant hematopoietic cells encapsulated in a hydrogel layer, according to which a hydrogel solution and a solution of cells comprising hematopoietic cells. malignancies are co-extruded concentrically and then crosslinked.
  • the cell solution comprises lymphoma cells or leukemic cells.
  • the invention also relates to a microcompartment cell capable of being obtained by the method according to the invention, wherein said microcompartment comprises an aggregate of cells comprising at least malignant haematopoietic cells, encapsulated in a hydrogel layer.
  • a cellular microcompartment consists of a single cell aggregate encapsulated in a hydrogel layer.
  • said microcompartment comprises an aggregate of cells, consisting solely of lymphoma cells, encapsulated in a hydrogel layer. In another embodiment, the microcompartment comprises an aggregate of cells, consisting solely of leukemic cells, encapsulated in a hydrogel layer.
  • said microcompartment comprises an aggregate of cells composed in particular of lymphoma cells and lymphoid-type stromal cells, as well as an extracellular matrix layer between the cell aggregate and the hydrogel layer.
  • said microcompartment comprises an aggregate of cells composed in particular of leukemic cells and medullary-type stromal cells, as well as an extracellular matrix layer between the cell aggregate and the hydrogel layer.
  • the invention also relates to a cellular microcompartment comprising a cell aggregate encapsulated in a hydrogel layer, wherein the cell aggregate comprises malignant hematopoietic cells, such as lymphoma cells or leukemic cells, and stromal cells, said microcompartment further comprising an extracellular matrix layer between the cell aggregate and the hydrogel layer.
  • a cellular microcompartment comprising a cell aggregate encapsulated in a hydrogel layer, wherein the cell aggregate comprises malignant hematopoietic cells, such as lymphoma cells or leukemic cells, and stromal cells, said microcompartment further comprising an extracellular matrix layer between the cell aggregate and the hydrogel layer.
  • the invention also relates to a method for screening or identifying a compound for the treatment and / or prevention of a lymphoma comprising the steps of: (a) contacting a cellular microcompartment according to the invention, optionally free of a hydrogel layer, with a test compound;
  • the invention also relates to a use of a cellular microcompartment according to the invention for the screening or identification of a compound for the treatment of a hematological malignancy, such as lymphoma or leukemia.
  • Figure 1 Encapsulation of SUDHL4 and HLY1 lymphoma cells in an alginate capsule.
  • SUDHL4 and HLY1 cells express GFP.
  • Figure 1A shows images of the phase contrast and fluorescence capsules at different times (J1-J11) after encapsulation, the images being acquired with an Olympus CKX41 microscope (x10 objective).
  • Figure 1B shows the growth curves measured for the cell clusters inside the alginate capsules from the photos, using the ImageJ® software.
  • FIG. 2 Cell microcompartment formation according to the invention comprising only lymphomatous or leukemic cells (A) or lymphomatous or leukemic cells, and stromal cells (B).
  • A lymphomatous or leukemic cells
  • B stromal cells
  • 1 hydrogel capsule
  • 2 capsule light
  • 3 lymphoma cells
  • 4 growth phase
  • S hydrogel capsule containing a cluster of lymphoma cells
  • 6 dissolution step of the hydrogel capsule
  • 7 cluster of lymphoma cells
  • 8 extracellular matrix layer
  • 9 stromal cells
  • 10 growth phase
  • 11 hydrogel capsule containing a cluster of lymphoma and stromal cells
  • 12 cluster of lymphoma and stromal cells.
  • FIG 3 Microcompartmental cells comprising a cluster of follicular lymphoma cells of the DOHH2 line and of lymphoid-type stromal cells (RESTO, Ame-Thomas Blood 2007; 109: 693) in an alginate capsule covered with an internal layer of Matrigel ® to J9 after encapsulation. The images were obtained in phase contrast using a Leica DMI8 microscope (x10 objective).
  • Figure 4 Dissolution of the cell microcellular alginate capsule comprising a cluster of follicular lymphoma cells of line DOHH2 (A) and a cluster of follicular lymphoma cells of line DOHH2 and RESTO cells (B) on day 9 after encapsulation.
  • Figure S Flow cytometric analysis of dead cells in clusters of cells comprising SUDHL4 (SA) lymphoma cells or HLY1 (B) lymphoma cells after different encapsulation times.
  • Figure 6 Analysis of the residual effect of the stromal tumor niche on the growth of lymphoma cells. Images of cellular micro-compartments in an alginate capsule coated with an internal Matrigel® layer comprising only RESTO (A) cells, only DOHH2 (B) lymphoma cells, RESTO cells and DOHH2 (C) lymphoma cells. The images were obtained in phase contrast using a Leica DMI8 microscope (x10 objective). The scale bar is the same for all three images.
  • FIG. 7 Comparative effects of Etoposide (A) and Cisplatin (B) on cell death after contacting, for 48 hours, a suspension of HLY1 cells (suspension) or a HLY1 cell cluster derived from a cellular microcompartment according to the invention, comprising only lymphomatous cells, with increasing doses of etoposide ( ⁇ g / ml) or cisplatin ( ⁇ M).
  • FIG. 8 Microcompartment cell showing differentiation of stromal cells into pro-tumoral lymphoid stroma.
  • Cellular microcomponents comprising a cluster of follicular lymphoma cells of the DOHH2 line and lymphoid-type stromal cells RESTO in an alginate capsule coated with an internal layer of Matrigel® at D8 after encapsulation.
  • CD20 (revealing B-cell), GFP (revealing RESTO cells) and TG2 markings were made on a fixed spheroid and embedded in paraffin.
  • the image was taken under a confocal microscope LSM510 objective x20.
  • the image on the right is the superposition of the first three images.
  • Arrows indicate RESTO cells (GFP +) expressing TG2.
  • Figure 9 Study of the diffusion of doxorubicin in SUDHL4 cells cultured in suspension or in spheroids.
  • SUDHL4 cells cultured in suspension or after 7 days in 3D in the presence or absence of extracellular matrix (ECM) (Mg: matrigel) and RESTO cells are treated for 24 hours with doxorubicin ( ⁇ ). After dissociation of the cells cultured in 3D, the fluorescence intensity of the cells was analyzed by flow cytometry.
  • ECM extracellular matrix
  • Figure 10 Representative images showing the penetration of antibodies in the cellular microcompartment.
  • SC-GFP + Microcompartment containing DLBCL SUDHL4 cells cultured in 3D in the presence of ECM.
  • B Labeling with Rituximab (RTX) - 633.
  • the capsules are incubated for 12h with AC, then they are imaged with a microscope confocal Zeiss LSMS10 to the x25 lens.
  • the nuclei are marked with DAPI in blue.
  • the outline of the capsules is visible (marked at the periphery on the images).
  • Figure 11 Comparison of the cytotoxic effects of doxorubicin and etoposide on cells of DLBCL SUDHL4 grown in 2D (suspension) or in 3D ⁇ ECM ⁇ Resto. Cells or spheroids at J7 post-encapsulation are treated for 48 hours with drugs. At the end of the treatment, the cell viability is measured using the CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay® kit (Promega).
  • FIG. 12 Cellular Cell Micromembrane Formation According to the Invention as a Function of Time from T Cells in Primary Culture from a Patient With Sezary Lymphoma
  • the cells are labeled with calcein-AM to visualize live cells and with propidium iodide (PI) to visualize dead cells.
  • PI propidium iodide
  • the nuclei are stained with DAPI.
  • D10 days after encapsulation
  • the invention relates to a cellular microcompartment, in 3D, comprising an aggregate, or cluster, of malignant hematopoietic cells encapsulated in a hydrogel envelope.
  • the terms “hydrogel layer”, “hydrogel capsule” or “hydrogel envelope” denote a three-dimensional structure formed from a matrix of polymer chains swollen with a liquid, and preferentially some water.
  • the polymer or polymers of the hydrogel layer are crosslinkable polymers when subjected to a stimulus, such as a temperature, a pH, ions, etc.
  • the hydrogel used is biocompatible, in that it is not toxic to the cells.
  • the hydrogel layer must allow the diffusion of oxygen and nutrients to feed cells in the cell microcompartment and allow their survival.
  • the hydrogel layer also passes test molecules, such as pharmaceutical molecules.
  • the polymers of the hydrogel layer may be of natural or synthetic origin.
  • the outer layer of hydrogel contains one or more polymers among sulfonate-based polymers, such as sodium polystyrene sulfonate, acrylate-based polymers, such as sodium polyacrylate, polyethylene glycol diacrylate, the gelatin methacrylate compound, polysaccharides, and especially polysaccharides of bacterial origin, such as gellan gum, or of plant origin, such as as pectin or alginate.
  • the outer hydrogel layer comprises at least one of alginate.
  • the outer layer of hydrogel comprises only alginate.
  • alginate is understood to mean linear polysaccharides formed from ⁇ -D-mannuronate (M) and ⁇ -L-guluronate (G), salts and derivatives thereof.
  • the alginate is a sodium alginate, composed of more than 80% of G and less than 20% of M, with an average molecular mass of 100 to 400 kDa (for example: PRONOVA® SLG100) and at a total concentration of between 0.5% and 5% by weight (weight / volume).
  • the hydrogel layer comprises polymers capable of limiting cell adhesion ("cell-repellent"), such as natural polysaccharides (for example sodium alginate), or polymers comprising polyethylene glycol units, so that to facilitate, where appropriate, the separation of said hydrogel layer from the cluster of cells that it covers or its degradation without affecting the structure of the cell aggregate.
  • cell-repellent such as natural polysaccharides (for example sodium alginate), or polymers comprising polyethylene glycol units
  • the cell compartment according to the invention is characterized by the presence, in the internal volume of the hydrogel envelope, of an aggregate of cells organized in a cohesive cluster in which the cells interact.
  • the cell aggregate comprises malignant hematopoietic cells.
  • malignant hematopoietic cells is meant cancer cells derived from the differentiation of lymphoid (i.e., lymphocytes) or myeloid (i.e., erythrocyte, leukocyte, platelet) progenitors.
  • lymphoid i.e., lymphocytes
  • myeloid i.e., erythrocyte, leukocyte, platelet
  • the hematopoietic malignant cells are chosen from lymphomatous cells and leukemic cells.
  • the cell aggregate contained in the hydrogel outer envelope comprises lymphoma cells.
  • lymphoma cells refer to lymphoid malignant cells.
  • the lymphoma cells are chosen from follicular lymphoma, diffuse large B-cell lymphoma, Burkitt's lymphoma, mantle cell lymphoma, peripheral T lymphoma, lymphoblastic lymphoma, anaplastic lymphoma, lymphoma of the zone marginal, lymphoma of MALT ("Mucosa- associated lymphoid tissue"), lymphoma of the lymphoplasmocyte, and / or lymphoma of the spleen, cutaneous T-cell lymphoma, cutaneous B-cell lymphoma.
  • the cell aggregate contained in the hydrogel outer envelope comprises leukemic cells.
  • leukemic cells denote malignant blood cells.
  • the leukemic cells may be selected from acute myeloblastic leukemia cells, chronic myeloid leukemias, chronic lymphoid leukemias, acute leukemias.
  • malignant hematopoietic cells can come from cellular models, but also be obtained from patients.
  • the use of lymphoma or leukemia cells from a particular patient may be particularly interesting in the context of personalized medicine, for the identification of molecule (s) particularly adapted (s) to the treatment of lymphoma or leukemia of said patient .
  • the tumor cells of the patient are advantageously purified before use.
  • the purification is done by negative selection, in order to avoid the introduction of antibodies into the cell culture.
  • the cell aggregate of the cellular microcompartment comprises only lymphoma cells.
  • the organization of lymphoma cells into a cohesive cell cluster within the hydrogel capsule makes it possible to confer on these cells resistance to the penetration of external molecules that is close to the resistance observed in the cells of a lymphoma.
  • the cell aggregate of the cellular microcompartment comprises only leukemic cells.
  • the cell aggregate comprises, in addition to malignant hematopoietic cells, stromal cells.
  • the nature of the stromal cells chosen depends advantageously on the nature of the associated hematopoietic malignant cells.
  • the microcompartment further comprises an extracellular matrix layer. Indeed, the inventors have shown that the presence of an extracellular matrix is necessary for the adhesion and survival of stromal cells and for the formation of the aggregate of mixed cells within the hydrogel capsule.
  • the extracellular matrix layer advantageously tapes the inner face of the hydrogel envelope.
  • the extracellular matrix layer comprises a mixture of proteins and extracellular compounds promoting cell culture, and more particularly that of stromal cells.
  • the extracellular matrix comprises structural proteins, such as laminins containing the ⁇ 1, ⁇ 4 or ⁇ 5 subunits, the ⁇ or ⁇ 2 subunits, and the ⁇ or ⁇ 3 subunits of entactin and vitronectin. , fibronectin, laminin, collagen, as well as growth factors, such as TGF-beta and / or EGF.
  • the extracellular matrix layer consists of, or contains Matrigel® and / or Geltrex®.
  • the malignant hematopoietic cells are lymphoma cells and the stromal cells are lymphoid stromal cells, such as adipose tissue stem cells (ADSCs), or more particularly, cells of the type RESTO.
  • Stromal cells of the RESTO type are lymphoid stromal cells derived from tonsils ("tonsil-derived stromal cells"). Isolation and characterization of RESTO cells can be done according to the protocol described in the publication Amé-Thomas et al. Blood 2007. The tonsils are cut into pieces and then incubated in a solution containing DNAse I and collagenase IV. The cell suspension is then deposited on a Percoll® gradient.
  • RESTO stomal cells
  • CD4S hematopoietic cell markers
  • CD10S mesenchymal cell markers
  • RESTO cells are known to have characteristics close to those of fibroblastic reticular cells of secondary lymphoid organs: secretion of chemokines, fibronectin and a transglutaminase network in response to TNF ⁇ (Tumor Necrosis Factor) and LTaip2 (LymphoToxin) .
  • TNF ⁇ Tumor Necrosis Factor
  • LTaip2 LTaip2
  • the cell aggregate may comprise, in addition to lymphoma cells, cells normally present in the microenvironment of a lymphoma.
  • the term "cells of the microenvironment" refers to the cells present in the aggregate of cells that are not lymphomatous cells.
  • the cell aggregate can also comprise, in addition to stromal cells, cells of the immune system, such as macrophages.
  • malignant hematopoietic cells are leukemic cells and stromal cells are medullary stromal cells, such as HS-S line cells, or bone marrow Mesenchymal Stromal Cells (MSCs).
  • stromal cells are medullary stromal cells, such as HS-S line cells, or bone marrow Mesenchymal Stromal Cells (MSCs).
  • the ratio of lymphoma cells / stromal cells in the cell aggregate is between 1/1 and 1000/1.
  • the ratio may vary over time, the amount of lymphoma cells tending to increase exponentially compared to stromal cells.
  • the ratio of lymphoma cells / stromal cells is between 1/1 and 10000/1.
  • the cell density in the cellular microcompartment at D8 is between one hundred and several thousand cells.
  • a microcompartment with a diameter of 200 ⁇ preferably comprises 100 to 10,000 cells.
  • the microcompartment cell is closed. It is the outer layer of hydrogel that gives its size and shape to the cellular microcompartment.
  • the microcompartment can have any shape compatible with encapsulation of cells, including a spheroidal, ovoid or tabular shape.
  • the cell aggregate is constrained in the internal volume of said hydrogel layer, and once the cells are confluent, the aggregate can no longer increase in volume.
  • the microcompartment cell has a diameter or a smaller dimension between 50 ⁇ and 600 ⁇ . "Smallest dimension" means twice the minimum distance between a point on the outer surface of the hydrogel layer and the center of the microcompartment.
  • the thickness of the hydrogel outer layer represents 5% to 30% of the radius of the microcompartment.
  • the "thickness" of a layer is the dimension of said layer extending radially with respect to the center of the microcompartment.
  • the cellular microcompartment has a diameter or a smaller dimension of between 50 ⁇ and 300 ⁇ . Such dimensions ensure that all of the cells in the cell aggregate, including those in the center of said cell aggregate, have sufficient access to oxygen and nutrients that diffuse through the hydrogel layer. Thus, no phenomenon of hypoxia and / or necrosis is observed within such a microcompartment, all cells having sufficient access to small molecules that diffuse through the hydrogel envelope.
  • the cellular microcompartment has a diameter or a smaller dimension between 500 ⁇ and 600 ⁇ .
  • cells in the center of the cell aggregate have little or no access to oxygen and nutrients that diffuse through the hydrogel wrap.
  • Such microcompartments are particularly interesting for the study of the phenomena of hypoxia and / or necrosis which can sometimes occur in a lymphoma.
  • the invention also relates to methods of preparing microcompartmental cells for obtaining cell microcompartments comprising an aggregate of cells containing malignant hematopoietic cells encapsulated in an outer hydrogel envelope. After encapsulation of the cells, they will reorganize within the hydrogel envelope, so as to form a cohesive cluster.
  • the encapsulation is done by means of a concentric coextrusion process, in which the hydrogel solution is coextruded with the cell solution, before being crosslinked by means of a crosslinking solution capable of crosslinking the hydrogel.
  • Concentric coextrusion it is meant that the solutions are coextruded so that one solution surrounds the other solution.
  • the concentric coextrusion is such that the hydrogel solution surrounds the cell solution.
  • drops of coextruded solutions then fall into the crosslinking solution, comprising a crosslinking agent capable of crosslinking the hydrogel and thus forming a hydrogel capsule around the cells.
  • the solutions are coextruded directly in the crosslinking solution, so as to form an outer hydrogel tube in which the cells will be organized.
  • drops of coextruded solutions pass through a crosslinking aerosol (made from a crosslinking solution) so as to allow at least partial crosslinking of the hydrogel layer around the drop of solution of cells.
  • the partially crosslinked microcompartments then fall into a crosslinking solution where the crosslinking is terminated.
  • any extrusion process for concentrically coextruding hydrogel and cells can be used.
  • the process according to the invention is implemented by means of a concentric double-wall extrusion device as described in patent FR2986165.
  • crosslinking solution means a solution comprising at least one crosslinking agent adapted to crosslink a hydrogel comprising at least one hydrophilic polymer, such as alginate, when it is applied. contact with it.
  • the crosslinking solution may be, for example, a solution comprising at least one cation divalent.
  • the crosslinking solution may also be a solution comprising another known crosslinking agent of the alginate or of the hydrophilic polymer to be crosslinked, or a solvent, for example water or an alcohol, adapted to allow crosslinking by irradiation or by any other means. other technique known in the art.
  • the crosslinking solution is a solution comprising at least one divalent cation.
  • the divalent cation is a cation that makes it possible to crosslink alginate in solution.
  • H may be for example a divalent cation selected from the group consisting of Ca 2+ , Mg 2+ , Ba 2+ and Sr 2 "1" , or a mixture of at least two of these divalent cations.
  • the divalent cation, such as Ca 24 ⁇ may be associated with a counterion to form, for example, CaCl or CaCCh type solutions, well known to those skilled in the art.
  • the crosslinking solution may also be a solution comprising CaC0 3 coupled to Glucono delta-lactone (GDL) forming a solution of CaCOs-GDL.
  • the crosslinking solution may also be a mixture of CaCO 3 -CaSO 4 -GDL.
  • the crosslinking solution is a solution comprising calcium, in particular in the Ca 2+ form.
  • the crosslinking solution may also be a solution comprising polylysine.
  • the divalent cation concentration in the crosslinking solution is between 10 and 1000 mM.
  • the crosslinking solution may comprise other constituents, which are well known to those skilled in the art, than those described above, in order to improve the crosslinking of the hydrogel sheath under the conditions, in particular time and / or temperature, special.
  • the hydrogel solution is coextruded with a solution of cells.
  • the cell density in the cell solution is between 1 ⁇ 10 6 and 100 ⁇ l cells / ml.
  • the cell solution used for coextrusion contains only lymphomatous cells suspended in culture medium.
  • the cell solution used for coextrusion contains only leukemic cells suspended in culture medium.
  • the cell solution used for coextrusion comprises lymphoma cells and lymphoid stromal cells, suspended in an extracellular matrix.
  • the number ratio of lymphoma cells / stromal cells in the cell solution is between 1/1 and 1/2.
  • such a solution may also comprise immune cells, preferentially chosen from macrophages.
  • the number ratio of lymphoma cells / microenvironment cells in the cell solution is advantageously between 1/1 and 1/2.
  • the cell solution used for coextrusion comprises leukemic cells and medullary stromal cells, suspended in an extracellular matrix.
  • the ratio in number of leukemic cells / stromal cells in the cell solution is between 1/1 and 1/2.
  • the cell suspension advantageously represents between 50 and 95% of the volume of the solution, while the extracellular matrix represents between 5 and 50% of said volume.
  • coextrusion also involves an intermediate solution, including sorbitol.
  • the coextrusion is carried out so that the intermediate solution is extruded between the hydrogel solution and the cell solution.
  • the extrusion rate of the hydrogel solution is between 5 and 100 mlVh, preferably between 15 and 60 mIJh.
  • the extrusion rate of the cell solution is between 5 and 100 mJh, preferably between 10 and 50mIVh.
  • the extrusion rate of the intermediate solution is between 5 and 100 mJh, preferably between 10 and 50 mlVh.
  • the coextrusion rate of the different solutions can be easily modulated by those skilled in the art, so as to adapt the diameter or the smallest dimension of the cellular microcompartment and / or the thickness of the hydrogel layer.
  • the extrusion rates of the cell solution and the intermediate solution are identical.
  • the extrusion rate of the hydrogel solution is substantially equal to the extrusion rate of the cell solution and optionally of the intermediate solution.
  • the hydrogel solution, the intermediate solution and the cell solution are loaded into three concentric compartments of a coextrusion device, so that the solution of Hydrogel, forming the first stream, surrounds the intermediate solution that forms the second stream, which itself surrounds the cell solution that forms the third stream.
  • the tip of the device extrusion, through which the three flows out, opens above the crosslinking solution.
  • the tip of the extrusion device is located about 50 cm, +/- 10 cm, of the crosslinking solution.
  • An electric field is generated at the output of the coextrusion device, to allow the formation of microdroplets.
  • a copper ring is disposed about 1 cm at the exit of the coextrusion device.
  • Microdroplets thus fall sequentially into the crosslinking bath where the hydrogel layer is crosslinked, forming an outer shell around the cells.
  • the tip of the extrusion device opens into a crosslinking aerosol, formed by microdroplets of crosslinking solution, so that the hydrogel layer of the microdroplets begins to crosslink in contact with the microdroplets of the aerosol .
  • the crosslinking may, if appropriate, continue in a crosslinking solution in which the microdroplets are received.
  • the method according to the invention makes it possible very rapidly to obtain several thousand microcompartments that are substantially identical in terms of size and composition.
  • the method according to the invention makes it possible to encapsulate malignant hematopoietic cells, such as lymphomatous cells, in an external hydrogel envelope. After only a few hours, the cells contained in the hydrogel envelope reorganize, so as to aggregate and form a cluster of cells that becomes cohesive after a few days.
  • the microcompartment cell obtained by coextrusion is maintained in a suitable culture medium for two to twelve days before being used, preferably between four and ten days. This latency advantageously allows the cells to aggregate and form a cell cluster mimicking the cluster of cells in a lymphoma.
  • the cell microcompartment obtained by coextrusion as such, that is to say with the external hydrogel shell. It is otherwise possible to proceed before any use to hydrolysis of the hydrogel shell, in order to recover the aggregate of cells. It is also possible to freeze the cell microcompartment obtained by coextrusion (with the hydrogel casing) for later use.
  • microcompartment cell according to the invention can be used for many applications, particularly for pharmacological purposes.
  • microcompartmental cells according to the invention can in particular be used for identification and / or validation tests of candidate molecules having an action on hematological malignancies.
  • candidate molecules having an action on hematological malignancies.
  • the permeability of certain hydrogels is sufficient to pass molecules having a molecular weight less than or equal to 200 kDa. It is therefore possible to study these molecules directly on the microcompartment cell. In the case of molecules of higher molecular weight, it is possible to hydrolyze the outer hydrogel shell before performing the tests. Thus, ⁇ study is done directly on ⁇ clusters of cells.
  • the hydrolysis of the hydrogel casing is performed 6 or 10 days after the coextrusion, so as to ensure that the cluster of cells is well formed and that the cells are cohesive.
  • the cellular microcompartments according to the invention can also be used in personalized medicine, using cells of a subject presenting a lymphoma or leukemia, in order to specifically test the reaction of said subject to different treatments, before selecting the most appropriate treatment for said subject.
  • Hydrogel Solution 2.5% Alginate w / v (LF200FTS) in 0.5mM SDS
  • Extracellular matrix Matrigel® classic (without phenol red and with growth factors)
  • Exudation device - 3 x 12ml hamilton syringes containing respectively 2.5% sterile alginate and the other two 300mM sterile sorbitol syringes
  • the alginate capsules are obtained according to the method described in Alessandri et al (PNAS 2013, DOI: 10.1073 / pnas.1309482110 and LOC 2016 DOI: 10.1039 / c61c00133e) and in the application WO2013113855.
  • the microfluidic coextrusion device for the production of capsules is placed about 50 cm above a petri dish containing the crosslinking solution.
  • the alginate solution, the sorbitol solution and the cell solution are then co-injected into the microfluidic coextrusion device, to form composite droplets which are crosslinked by falling into the calcium bath.
  • the coextrusion device is operated for 10 seconds, and produces about 5000 alginate capsules per second, totaling about 50,000 capsules.
  • the alginate capsules are then recovered by filtering the calcium bath with a 40 ⁇ mesh cell strainer which retains the capsules. These are rinsed with the base of medium then re-suspended in the final medium.
  • a potential of + 2kV was applied via an electrode in the alginate.
  • a copper ring with a mass of 3 cm in diameter is positioned approximately 1 cm from the tip of the microfluidic coextrusion device to generate the electric field necessary for the electro-formation of the droplets.
  • Microcompartmental cells comprising only SUDHL4 or HLY1 lymphoma cells
  • the lymphoma cells Prior to encapsulation, the lymphoma cells are cultured in DMEM supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) in a humid atmosphere at 37 ° C in the presence of 5% CO 2.
  • FCS fetal calf serum
  • the cells are centrifuged and resuspended in sorbitol (300 mM) at a rate of 6 to 100.10 6 10.10 ceUules / mL.
  • the number of cells per capsule varies between 30 and 100.
  • the capsules are cultured in DMEM medium supplemented with 10% FCS in a CO2 oven at 37 ° C.
  • the medium is changed every 2 to 3 days.
  • the capsules are divided into 96-well plates, one capsule per well.
  • the clusters of cells are then periodically imaged (every other day) in phase contrast and in fluorescence if the cell line expresses a fluorescent protein.
  • the area of cell clusters is measured using ImageJ® software and growth curves are established ( Figure 1B).
  • lymphocytic cells In order to get closer to the microenvironment of a lymph node, lymphocytic cells (DOHH2) are co-cultured with Matrigel® extracellular matrix and "RESTO" type stromal cells.
  • DOHH2 lymphocytic cells
  • the RESTO cells were previously cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum in a humid atmosphere at 37 ° C with 5% CCh. At the time of encapsulation, the cells are detached from the support by action of trypsin, and then they are resuspended in the extracellular matrix in the presence of lymphoma cells at a ratio of 1/1.
  • the cell density of RESTO cells and lymphoma cells may vary from 10-50.10 6 cells / ml.
  • the coextrusion encapsulation method makes it possible to obtain a coating of the inner wall of the alginate capsules by the extracellular matrix.
  • This coating allows the adhesion of stromal cells and promotes the formation of the tumor niche. In a few days, the cells organize themselves freely and form a cluster of cohesive cells after 4-10 days of culture (FIG. 3).
  • Micro-compartments were made according to the invention from lymphocyte cells from patients with Sezary syndrome (cutaneous T-cell leukemic form). After encapsulation, the cells grow inside the alginate capsules and form a cluster of cells after about ten days ( Figure 12). This confirms that the method according to the invention makes it possible to obtain cellular microcompartments from primary cells of patients, which makes it possible to envisage the use of this method in personalized medicine.
  • Example 2 Analysis of cellular microcompartments
  • Capsules containing clusters of SUDHL4 or HLY1 cells are placed in agarose wells coated with DMEM medium without phenol red (on D1-D6). The images are acquired using a ZEISS lsm 510 confocal microscope. Two types of analysis are performed: a one-time analysis after marking the microcompartment with a fluorophore, and an analysis using intermittent imaging, after labeling or non-labeling of cells with a fluorophore. The cells are labeled with calcein-AM and propidium iodide to visualize the dead cells; the cell nuclei are marked in blue with Hoechst 33342.
  • the paraffin-embedded immunofluorescence technique was adapted to the analysis of the capsules: capsules containing the cell clusters are removed and included in a gelled solution of agarose with a low melting point of 2%. Once gelled, the agarose block containing the capsules is immersed in a 4% paraformaldehyde fixative for 30 minutes. After fixation, the samples are treated according to the protocols conventionally described for immunohistochemistry.
  • Ki67 protein which is a marker of cell activation
  • cleaved caspase 3 which makes it possible to evaluate cell death
  • the extracellular matrix consists mainly of fibronectin, collagen I and laminin. Immunofluorescence analysis showed the presence of these three types of matrix in the cell clusters of microcompartments, whereas the same cells grown in suspension do not express these matrices. D] Dissolution of alginate capsules
  • FIG. 4 shows an example of dissolution of a capsule containing a cluster of cells comprising only SUDHL4 lymphoma cells (FIG. 4A) and a capsule containing a cluster of cells comprising DOHH2 lymphoma cells and stromal cells (FIG. 4B). .
  • the alginate capsules are dissolved and the clumps of cells dissociated before being incubated with a marker of the apoptosis (TMRM) and then analyzed by flow cytometer in the presence of counting beads (Figure S). Over time, it is observed that the number of cells increases, while the proportions of dead cells within the cell clusters decrease between J3 and J10, which is correlated with the increase in the volume of the spheroid described in Figure 1A .
  • TMRM marker of the apoptosis
  • FIG. 6 the reconstitution of a tumor niche similar to that found in the lymph node (C: RESTO + DOHH2 cells) promotes the growth of tumor B cells.
  • C RESTO + DOHH2 cells
  • stromal cells differentiate into pro-tumoral lymphoid stroma (Thomazy et al, 2003, Ohe et al., 2016) expressing, inter alia, transglutaminase 2 (TG2) which has a role in the stabilization of extracellular matrix and cell adhesion.
  • TG2 transglutaminase 2
  • the Resto-type stromal cell (FRC) culture in the presence of tumor B cells and extracellular matrix leads to the expression of TG2 revealed by immunolabeling.
  • FRC Resto-type stromal cell
  • TMRM the alginate capsules are previously dissolved and the clumps of dissociated cells
  • Preclinical cancer drug research has the worst success rate of any therapeutic trial, with less than 5% of candidate compounds passing phase m clinical trials.
  • One of the explanations for these failures is the lack of a relevant model capable of reproducing the spread of drugs within a tumor. Indeed, one of the hypotheses to explain the decrease in the effectiveness of molecules during the transition from pre-clinical tests to clinical trials is that cell density within tumors would slow the penetration and spread of drugs, decreasing their effectiveness.
  • the 3D model according to the invention is relevant for studying the diffusion of drugs within a lymphomatous tumor niche.
  • doxorubicin which is otherwise used in the standard treatment of B-cell lymphoma
  • ECM extracellular matrix
  • stromal cells of RESTO type were incubated 24h in the presence or absence of Doxorubicin ( ⁇ ).
  • the fluorescence intensity of the cells was then measured by flow cytometry.
  • Standard treatment for B-cell lymphoma is conventional multidrug therapy combined with CD20-directed immunotherapy expressed on the surface of mature B cells.
  • CD20-directed immunotherapy expressed on the surface of mature B cells.
  • the spheroids were incubated on post-encapsulation day-7 in the presence of anti-CD19 AC directly coupled to phycoerythrin (PE) (very strongly expressed in B cells), or
  • the diffusion of drugs is impaired in the 3D structures according to the invention.
  • the purpose of the present experiment is to verify if this alteration is correlated with a chemoresistance.
  • the efficacy of two conventional chemotherapies doxorubicin and etoposide was tested in parallel on cells cultured in suspension (2D) and on clumps of cells from microcompartmental cells according to the invention, containing lymphomatous cells alone. or in the presence of ECM, with or without RESTO stromal cells, treated with increasing concentrations of these chemotherapy molecules.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'invention a trait à un procédé de préparation de microcompartiments cellulaires comprenant une capsule d'hydrogel enveloppant un amas de cellules lymphomateuses. L'invention a également trait à un tel microcompartiment cellulaire et à son utilisation pour le criblage de molécules anti-cancéreuses.

Description

Microcompartiment de cellules hématopoïétiques malignes et procédé de préparation d'un tel microcompartiment
L'invention a trait à un procédé de préparation de microcompartiments cellulaires comprenant des cellules hématopoïétiques malignes. L'invention a également trait à de tels microcompartiments cellulaires et à leur utilisation notamment dans le domaine pharmaceutique, pour le criblage et l'identification de molécules d'intérêt susceptibles de traiter une hémopathie maligne.
Les cancers des tissus hématopoïétiques, ou hémopathies malignes, se caractérisent par un trouble de la multiplication et de la différenciation des cellules d'une lignée sanguine. Parmi les hémopathies malignes les plus courantes, on peut citer les leucémies et les lymphomes.
La leucémie est un cancer des cellules de la moelle osseuse, qui se caractérise par une prolifération anormale et massive de précurseurs de globules blancs non complétements différenciés, au détriment notamment des globules rouges, globules blancs normaux et plaquettes. H existe quatre grands types de leucémie : la leucémie aiguë lymphoblastique (LAL), la leucémie lymphoïde chronique (LLC), la leucémie aiguë myéloblastique (LAM) et la leucémie myéloïde chronique (LMC).
Le lymphome est un groupe de cancers du système lymphatique qui prend naissance dans un organe lymphoïde secondaire et peut s'étendre à toutes les parties du système lymphatique. On distingue deux grands types de lymphomes : le lymphome de Hodgkin et les lymphomes non- hodgkiniens (LNH). Les LNH sont des cancers dont l'incidence est en augmentation depuis 40 ans dans les pays développés et qui se placent au lOème rang des cancers en termes de fréquence.
Les traitements actuellement disponibles, qui combinent le plus souvent chimiothérapie et immunothérapie, ne sont efficaces que chez une partie des patients, du fait de l'existence de nombreuses résistances ou rechutes. Cela s'explique notamment par l'absence de modèles cellulaires pertinents pour tester les molécules candidates. En effet, à l'heure actuelle, les molécules candidates sont testées in vitro sur des lignées cellulaires en suspension (pour les cellules non adhérentes) ou en monocouche (pour les cellules adhérentes). Ces modèles cellulaires, en deux dimensions (2D), ne sont pas représentatifs des lymphomes puisque, contrairement aux cellules au sein de la tumeur, toutes les cellules ont un accès identique tant aux nutriments et à l'oxygène, qu'aux molécules candidates. De plus, les lymphomes se forment et évoluent au sein des organes lymphoïdes secondaires comprenant plusieurs types de cellules (cellules du microenvironnement et cellules lymphomateuses), qui interagissent entre eux au sein d'une matrice extracellulaire via des molécules solubles et membranaires, et sont soumis à des forces bio-mécaniques. L'ensemble de ces éléments impacte le développement des lymphomes, mais également la réponse aux traitements. Or, les modèles 2D ne permettent pas de reproduire ces phénomènes et ne sont donc que faiblement représentatifs des processus physio-pathologiques des lymphomes.
Pour pallier les inconvénients de ces modèles 2D, des modèles animaux ont été développés, dans lesquels des cellules cancéreuses humaines sont greffées ou injectées. De tels modèles animaux sont cependant coûteux, difficilement reproductibles, et généralement peu représentatifs des phénomènes physiologiques des hémopathies malignes humaines.
Récemment, des cultures de cellules cancéreuses en trois dimensions (3D) ont été développées. Ces cultures en 3D sont particulièrement intéressantes pour étudier les mécanismes de progression des cancers et mieux tester les traitements anti-cancéreux. En effet, les cellules cultivées en 3D au sein d'une matrice ou en agrégats, présentent une architecture plus proche du tissu et de la tumeur et montrent une expression de leurs gènes similaire à celle de la tumeur in vivo (Gravelle et al, 2014, Am. J. Pathol. 184 : 2082-295 ; Weiswald et al, 2009, Br. J. Cancer 101 : 473-482). De plus, des modèles de co-cultures en 3D mimant les interactions cellules cancéreuses/cellules stromales permettent de reproduire au moins partiellement la niche tumorale et d' en étudier les conséquences sur la progression tumorale ou la résistance aux drogues.
En ce qui concerne le développement de cultures 3D de lymphomes, plusieurs techniques ont ainsi été développées. Les modèles 3D de lymphomes sont généralement obtenus en utilisant des éponges de collagène (Kobayashi et al 2010. Trends Immunol. 31 : 422-428), la technique dite de la goutte pendante (Gravelle et al 2014. Am. J. Pathol. 184 :282-295) ou une architecture de polystyrène (Caicedo-Carvajal et al 2011. J. Tissue Eng 2011 : 362326). Cependant, ces techniques présentent de nombreux inconvénients, tant en termes de coûts que de reproductibilité, les rendant peu pertinentes pour l'étude à l'échelle industrielle de nouveaux médicaments. De plus, les cultures 3D développées n'intègrent pas d'élément du microenvironnement tumoral, limitant ainsi leur pertinence.
H existe donc toujours un besoin de système de culture cellulaire en 3D, qui soit représentatif au niveau physiopathologique et/ou en termes de propriétés mécaniques des hémopathies malignes, et qui puisse être produit à grande échelle, sans coût excessif. Résumé de l'invention
En travaillant sur le développement d'un système de culture cellulaire en 3D qui soit le plus représentatif d'un lymphome et des phénomènes biologiques et mécaniques auxquels ils sont soumis in vivo, les inventeurs ont découvert qu'il est possible de fabriquer de manière automatisée et reproductible des microcompartiments cellulaires comprenant au moins des cellules hématopoïétiques malignes entourées par une capsule externe en hydrogel, en utilisant un système de coextrusion. Plus précisément, les inventeurs ont découvert qu'en coextrudant une solution d'hydrogel avec une solution de cellules comprenant des cellules lymphomateuses, et de manière optionnelle des cellules stromales de type lymphoïde, c'est-à-dire proches des cellules stromales qui infiltrent les lymphomes, et de la matrice extracellulaire, lesdites cellules s'agrégeaient au sein de la capsule d'hydrogel pour s'organiser en une masse cellulaire se rapprochant de l'organisation cellulaire au sein d'un lymphome. Par ailleurs, en fonction du type de cellules coextrudé avec les cellules hématopoïétiques malignes, les inventeurs ont découvert qu'il est possible de recréer une niche tumorale mimant une niche tumorale in vivo. Ainsi, il est possible d'obtenir des microcompartiments au sein desquels la nature des cellules et les interactions intercellulaires sont sensiblement proches de celles observées au sein d'une niche tumorale lymphomateuse, ou leucémique. Les microcompartiments cellulaires développés selon l'invention sont particulièrement pertinents comme modèles 3D d'hémopathies malignes, notamment pour le criblage et l'identification de nouvelles molécules candidates pour le traitement des lymphomes et/ou des leucémies. Par ailleurs, le procédé selon l'invention permet d'obtenir de très grandes quantités de microcompartiments de dimensions parfaitement maîtrisées. Les microcompartiments obtenus sont facilement manipulables, les rendant particulièrement adaptés à une utilisation à grande échelle, notamment dans le domaine pharmaceutique. L'invention a donc pour objet un procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire comprenant un agrégat de cellules contenant des cellules hématopoïétiques malignes encapsulé dans une couche d'hydrogel, selon lequel une solution d'hydrogel et une solution de cellules comprenant des cellules hématopoïétiques malignes sont co-extrudées concentriquement, puis réticulées. Avantageusement, la solution de cellules comprend des cellules lymphomateuses ou des cellules leucémiques.
H est également possible de prévoir dans la solution de cellules, des cellules stromales et de la matrice extracellulaire, afin d'obtenir un microcompartiment cellulaire qui se rapproche, au niveau des interactions cellulaires et de l'organisation, d'une niche tumorale. L'invention a également pour objet un microcompartiment cellulaire susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention, dans lequel ledit microcompartiment comprend un agrégat de cellules comprenant au moins des cellules hématopoïétiques malignes, encapsulé dans une couche d'hydrogel. Selon l'invention, un microcompartiment cellulaire est constitué d'un unique agrégat de cellules encapsulé dans une couche d'hydrogel.
Dans un mode de réalisation, ledit microcompartiment comprend un agrégat de cellules, constitué uniquement de cellules lymphomateuses, encapsulé dans une couche d'hydrogel. Dans un autre mode de réalisation, le microcompartiment comprend un agrégat de cellules, constitué uniquement de cellules leucémiques, encapsulé dans une couche d'hydrogel.
Dans un autre mode de réalisation, ledit microcompartiment comprend un agrégat de cellules composé notamment de cellules lymphomateuses et de cellules stromales de type lymphoïde, ainsi qu'une couche de matrice extracellulaire entre l'agrégat de cellules et la couche d'hydrogel. Dans un autre mode de réalisation, ledit microcompartiment comprend un agrégat de cellules composé notamment de cellules leucémiques et de cellules stromales de type médullaire, ainsi qu'une couche de matrice extracellulaire entre l'agrégat de cellules et la couche d'hydrogel.
L'invention concerne également un microcompartiment cellulaire comprenant un agrégat de cellules encapsulé dans une couche d'hydrogel, dans lequel l'agrégat de cellules comprend des cellules hématopoïétiques malignes, telles que des cellules lymphomateuses ou des cellules leucémiques, et des cellules stromales, ledit microcompartiment comprenant en outre une couche de matrice extracellulaire entre l'agrégat de cellules et la couche d'hydrogel.
L'invention a aussi pour objet une méthode de criblage ou d'identification d'un composé pour le traitement et/ou la prévention d'un lymphome comprenant les étapes de : (a) mettre en contact un microcompartiment cellulaire selon l'invention, éventuellement dépourvu de couche d'hydrogel, avec un composé à tester ;
(b) sélectionner le composé apte à inhiber au moins partiellement la croissance de l'agrégat de cellules dudit microcompartiment cellulaire et/ou à tuer au moins partiellement des cellules de l'agrégat de cellules dudit microcompartiment cellulaire. Avantageusement, une telle méthode de criblage est réalisée in vitro. L'invention a aussi pour objet une utilisation d'un microcompartiment cellulaire selon l'invention pour le criblage ou l'identification d'un composé pour le traitement d'une hémopathie maligne, telle qu'un lymphome ou une leucémie.
Avantageusement, une telle utilisation pour le criblage est une utilisation in vitro. Brève description des figures
Figure 1 : Encapsulation de cellules lymphomateuses SUDHL4 et HLY1 dans une capsule d'alginate. Les cellules SUDHL4 et HLY1 expriment la GFP. La figure 1A montre des images des capsules en contraste de phase et en fluorescence à différents temps (Jl - Jl 1) après encapsulation, les images étant acquises avec un microscope Olympus CKX41 (objectif xlO). La figure 1B montre les courbes de croissance mesurées pour les amas de cellules à l'intérieur des capsules d'alginate à partir des photos, au moyen du logiciel ImageJ®.
Figure 2 : Formation de microcompartiments cellulaires selon l'invention, comprenant uniquement des cellules lymphomateuses ou leucémiques (A) ou des cellules lymphomateuses ou leucémiques, et des cellules stromales (B). 1 : capsule d'hydrogel, 2 : lumière de la capsule, 3 : cellules lymphomateuses, 4 : phase de croissance, S : capsule d'hydrogel contenant un amas de cellules lymphomateuses, 6 : étape de dissolution de la capsule d'hydrogel, 7 : amas de cellules lymphomateuses, 8 : couche de matrice extracellulaire, 9 : cellules stromales, 10 : phase de croissance, 11 : capsule d'hydrogel contenant un amas de cellules lymphomateuses et stromales, 12 : amas de cellules lymphomateuses et stromales. Figure 3 : Microcompartiments cellulaires comprenant un amas de cellules de lymphome folliculaire de lignée DOHH2 et de cellules stromales de type lymphoïde (RESTO, Ame- Thomas Blood 2007; 109:693) dans une capsule d'alginate recouverte d'une couche interne de Matrigel® à J9 après encapsulation. Les images ont été obtenues en contraste de phase au moyen d'un microscope Leica DMI8 (objectif xlO). Figure 4 : Dissolution de la capsule d'alginate de microcompartiments cellulaires comprenant un amas de cellules de lymphome folliculaire de lignée DOHH2 (A) et un amas de cellules de lymphome folliculaire de lignée DOHH2 et de cellules RESTO (B) à J9 après encapsulation.
Figure S : Analyse par cytométrie en flux des cellules mortes dans des amas de cellules comprenant des cellules lymphomateuses SUDHL4 (SA) ou des cellules lymphomateuses HLY1 (B) après différents temps d' encapsulation. Figure 6 : Analyse de l'effet supplétif de la niche tumorale stromale sur la croissance des cellules lymphomateuses. Images de microcompartiments cellulaires dans une capsule d'alginate recouverte d'une couche interne de Matrigel® comprenant uniquement des cellules RESTO (A), uniquement des cellules lymphomateuses DOHH2 (B), des cellules RESTO et des cellules lymphomateuses DOHH2 (C). Les images ont été obtenues en contraste de phase au moyen d'un microscope Leica DMI8 (objectif xlO). La barre d'échelle est identique pour les trois images.
Figure 7 : Effets comparatifs de l'Etoposide (A) et du Cisplatine (B) sur la mort cellulaire après mise en contact, pendant 48h, d'une suspension de cellules HLY1 (suspension) ou d'un amas de cellules HLY1 issu d'un microcompartiment cellulaire selon l'invention, comprenant uniquement des cellules lymphomateuses, avec des doses croissantes d'étoposide (ug/mL) ou de cisplatine (uM).
Figure 8 : Microcompartiment cellulaire montrant la différenciation des cellules stromales en stroma lymphoïde pro-tumoral. Microcompartiments cellulaires comprenant un amas de cellules de lymphome folliculaire de lignée DOHH2 et de cellules stromales de type lymphoïde RESTO dans une capsule d'alginate recouverte d'une couche interne de Matrigel® à J8 après encapsulation. Les marquages CD20 (révélant les lymphocytes B), GFP (révélant les cellules RESTO) et TG2 ont été réalisés sur un sphéroïde fixé et inclus en paraffine. L'image a été prise au microscope confocal LSM510 objectif x20. L'image de droite correspond à la superposition des trois premières images. Les flèches indiquent les cellules RESTO (GFP+) exprimant la TG2.
Figure 9 : Etude de la diffusion de la doxorubicine dans les cellules SUDHL4 cultivées en suspension ou en sphéroïdes. Des cellules SUDHL4 cultivées en suspension ou après 7 jours en 3D en présence ou non de matrice extracellulaire (ECM) (Mg : matrigel) et de cellules RESTO sont traitées pendant 24h avec la doxorubicine (ΙμΜ). Après dissociation des cellules cultivées en 3D, l'intensité de fluorescence des cellules a été analysée en cytométrie de flux.
Figure 10 : Images représentatives montrant la pénétration des anticorps dans le microcompartiment cellulaire. A) Marquage avec Γ AC anti-CD19-PE. Aa) Microcompartiment contenant des cellules de lymphome folliculaire DOHH2 cultivées en 3D en présence d'ECM et de cellules stromales RESTO (SC-GFP+). Ab) Microcompartiment contenant des cellules de DLBCL SUDHL4 cultivées en 3D en présence d'ECM. B) Marquage avec le Rituximab (RTX)- 633. Ba) Microcompartiment contenant des cellules de lymphome folliculaire DOHH2 cultivées en 3D en présence d'ECM et de cellules stromales RESTO (SC-GFP+) visualisées en Bb). Les capsules sont incubées 12h avec les AC, puis elles sont imagées avec un microscope confocal Zeiss LSMS10 à l'objectif x25. Les noyaux sont marqués au DAPI en bleu. Le contour des capsules est visible (trait à la périphérie sur les images).
Figure 11 : Comparaison des effets cytotoxiques de la doxorubicine et de l'étoposide sur des cellules de DLBCL SUDHL4 cultivées en 2D (suspension) ou en 3D ± ECM ± Resto. Les cellules ou sphéroïdes à J7 post-encapsulation sont traitées pendant 48h avec les drogues. A la fin du traitement, la viabilité cellulaire est mesurée à l'aide du kit CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay_(Promega).
Figure 12 : Formation de microcompartiments cellaulires selon l'invention en fonction du temps à partir de lymphocytes T en culture primaire issus de patient atteint du lymphome de Sezary. A différents temps de culture après encapsulation, les cellules sont marquées avec la calcéine-AM pour visualiser les cellules vivantes et avec de l'iodure de propidium (PI), pour visualiser les cellules mortes. Les noyaux sont colorés au DAPI. On note une augmentation de la mort cellulaire lorsque le sphéroïde est très dense, 10 jours après encapsulation (D10).
Description détaillée Microcompartiment cellulaire
L'invention a pour objet un microcompartiment cellulaire, en 3D, comprenant un agrégat, ou amas, de cellules hématopoïétiques malignes encapsulé dans une enveloppe en hydrogel.
Dans le contexte de l'invention, les termes « couche d'hydrogel », « capsule en hydrogel » ou « enveloppe en hydrogel » désignent une structure tridimensionnelle formée à partir d'une matrice de chaînes de polymères gonflée par un liquide, et préférentiellement de l'eau. Avantageusement, le ou les polymères de la couche d'hydrogel sont des polymères réticulables lorsque soumis à un stimulus, tel qu'une température, un pH, des ions, etc. Avantageusement, l'hydrogel utilisé est biocompatible, en ce sens qu'il n'est pas toxique pour les cellules. En outre, la couche d'hydrogel doit permettre la diffusion d'oxygène et de nutriments pour alimenter les cellules contenues dans le microcompartiment cellulaire et permettre leur survie. Avantageusement, la couche d'hydrogel laisse également passer des molécules à tester, telles que des molécules pharmaceutiques. Les polymères de la couche d'hydrogel peuvent être d'origine naturelle ou synthétique. Par exemple, la couche externe d'hydrogel contient un ou plusieurs polymères parmi les polymères à base de sulfonate, tels que le polystyrène sulfonate de sodium, les polymères à base d'acrylate, tels que le polyacrylate de sodium, le polyéthylène glycol diacrylate, le composé gélatine méthacrylate, les polysaccharides, et notamment les polysaccharides d'origine bactérienne, tels que la gomme gellane, ou d'origine végétale, tels que la pectine ou l'alginate. Dans un mode de réalisation, la couche externe d'hydrogel comprend au moins de l'alginate. Préférentiellement, la couche externe d'hydrogel ne comprend que de l'alginate. Dans le contexte de l'invention, on entend par « alginate » des polysaccharides linéaires formés à partir de β-D-mannuronate (M) et α-L-guluronate (G), des sels et dérivés de ceux-ci. Avantageusement, l'alginate est un alginate de sodium, composé à plus de 80% de G et moins de 20% de M, avec une masse moléculaire moyenne de 100 à 400 kDa (par exemple : PRONOVA® SLG100) et à une concentration totale comprise entre 0.5% et 5% en masse volumique (poids/volume).
Avantageusement, la couche d'hydrogel comprend des polymères aptes à limiter l'adhésion cellulaire (« cell-repellent »), tels que des polyosides naturels (par exemple l'alginate de sodium), ou des polymères comprenant des motifs polyéthylène glycol, afin de faciliter le cas échéant la séparation de ladite couche d'hydrogel de l'agrégat de cellules qu'elle enveloppe ou sa dégradation sans affecter la structure de l'agrégat de cellules.
Le compartiment cellulaire selon l'invention se caractérise par la présence, dans le volume interne de l'enveloppe d'hydrogel, d'un agrégat de cellules organisées en un amas cohésif au sein duquel les cellules interagissent.
Selon l'invention, l'agrégat de cellules comprend des cellules hématopoïétiques malignes. Par « cellules hématopoïétiques malignes », on entend des cellules cancéreuses issues de la différenciation de progéniteurs lymphoïdes (i.e., lymphocytes) ou myéloïdes (i.e., érythrocytes, leucocytes, plaquettes). Préférentiellement, dans le contexte de l'invention, les cellules hématopoïétiques malignes sont choisies parmi les cellules lymphomateuses et les cellules leucémiques.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'agrégat de cellules contenu dans l'enveloppe externe en hydrogel comprend des cellules lymphomateuses. Dans le contexte de l'invention, les « cellules lymphomateuses » désignent des cellules lymphoïdes malignes. Avantageusement, les cellules lymphomateuses sont choisies parmi les cellules de lymphome folliculaire, de lymphome diffus à grandes cellules B, de lymphome de Burkitt, de lymphome du manteau, de lymphome T périphérique, de lymphome lymphoblastique, de lymphome anaplasique, de lymphome de la zone marginale, de lymphome du MALT (« Mucosa- associated lymphoid tissue »), de lymphome lymphoplasmocytaire, et/ou de lymphome de la rate, de lymphome T cutané, de lymphome B cutané.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, l'agrégat de cellules contenu dans l'enveloppe externe en hydrogel comprend des cellules leucémiques. Dans le contexte de l'invention, les « cellules leucémiques » désignent des cellules sanguines malignes. Notamment, les cellules leucémiques peuvent être choisies parmi des cellules de leucémies aiguës myéloblastiques, leucémies myéloïdes chroniques, leucémies lymphoïdes chroniques, leucémies aiguës. Selon l'invention, les cellules hématopoïétiques malignes peuvent provenir de modèles cellulaires, mais également être obtenues à partir de patients. L'utilisation de cellules lymphomateuses ou leucémiques provenant d'un patient particulier peut être particulièrement intéressant dans le cadre de la médecine personnalisée, pour l'identification de molécule(s) particulièrement adaptée(s) au traitement du lymphome ou de la leucémie dudit patient. Dans ce cas, les cellules tumorales du patient sont avantageusement purifiées avant utilisation. Avantageusement, la purification se fait par sélection négative, afin d'éviter l'introduction d'anticorps dans la culture cellulaire.
Dans un mode de réalisation, l'agrégat de cellules du microcompartiment cellulaire comprend uniquement des cellules lymphomateuses. L'organisation des cellules lymphomateuses en un amas cellulaire cohésif au sein de la capsule en hydrogel permet de conférer auxdites cellules une résistance à la pénétration de molécules externes qui se rapproche de la résistance observée au sein des cellules d'un lymphome.
Dans un autre mode de réalisation, l'agrégat de cellules du microcompartiment cellulaire comprend uniquement des cellules leucémiques. Dans un autre mode de réalisation, et afin de se rapprocher histologiquement des niches tumorales, l'agrégat de cellules comprend, en plus des cellules hématopoïétiques malignes, des cellules stromales. La nature des cellules stromales choisie dépend avantageusement de la nature des cellules hématopoïétiques malignes associées. Dans ce cas, le microcompartiment comprend en outre une couche de matrice extracellulaire. En effet, les inventeurs ont montré que la présence d'une matrice extracellulaire est nécessaire à l'adhésion et la survie des cellules stromales et à la formation de l'agrégat de cellules mixtes au sein de la capsule d'hydrogel. Selon l'invention, la couche de matrice extracellulaire tapisse avantageusement la face interne de l'enveloppe en hydrogel. La couche de matrice extracellulaire comprend un mélange de protéines et de composés extracellulaires favorisant la culture cellulaire, et plus particulièrement celle des cellules stromales. Préférentiellement, la matrice extracellulaire comprend des protéines structurelles, telles que des laminines contenant les sous-unités al, a4 ou aS, les sous-unités βΐ ou β2, et les sous-unités γΐ ou γ3, de l'entactine, de la vitronectine, de la fibronectine, des laminines, du collagène, ainsi que des facteurs de croissance, tels que du TGF-béta et/ou de l'EGF. Dans un mode de réalisation, la couche de matrice extracellulaire consiste en, ou contient du Matrigel® et/ou de la Geltrex®.
Dans un mode de réalisation particulier, les cellules hématopoïétiques malignes sont des cellules lymphomateuses et les cellules stromales sont des cellules stromales lymphoïdes, telles que des cellules souches de tissu adipeux ADSC (adipose-derived stem cells), ou plus particulièrement, des cellules de type RESTO. Les cellules stromales de type RESTO s'entendent de cellules stromales lymphoïdes dérivées d'amygdales (« tonsil-derived stromal cells »). L'isolement et la caractérisation des cellules RESTO peut se faire selon le protocole décrit dans la publication Amé-Thomas et al. Blood 2007. Les amygdales sont coupées en morceaux puis incubées dans une solution contenant de la DNAse I et de la collagénase IV. La suspension cellulaire est ensuite déposée sur un gradient de Percoll®. Les cellules à l'interface de la fraction de Percoll® 15%/25% sont mises en culture. Après 48 heures de culture, les cellules stomales (RESTO) adhérent au plastique et les cellules en suspension sont éliminées. Les cellules RESTO se caractérisent par une morphologie fusiforme et par l'absence de marqueurs de cellules hématopoïétiques (CD4S) et la présence de marqueurs de cellules mésenchymateuses (CD10S, CD90 et CD73). Ces cellules se caractérisent également par leur potentiel de différentiation dans les lignages adipocytaire, chondroblastique et ostéoblastique. Les cellules RESTO sont connues pour présenter des caractéristiques proches de celles des cellules fibroblastiques réticulaires des organes lymphoïdes secondaires : sécrétion de chimiokines, de fibronectine et d'un réseau de transglutaminase en réponse au TNFa (Tumor Necrosis Factor) et à la LTaip2 (LymphoToxine).
Plus généralement, l'agrégat de cellules peut comporter, outre des cellules lymphomateuses, des cellules normalement présentes dans le microenvironnement d'un lymphome. Dans le contexte de l'invention, on désigne par « cellules du microenvironnement » les cellules présentes dans l'agrégat de cellules qui ne sont pas des cellules lymphomateuses. Ainsi, selon l'invention, l'agrégat de cellules peut également comporter outre des cellules stromales, des cellules du système immunitaire, telles que des macrophages.
Dans un mode de réalisation particulier, les cellules hématopoïétiques malignes sont des cellules leucémiques et les cellules stromales sont des cellules stromales médullaires, telles que des cellules de lignée HS-S, ou des MSC (« Mesenchymal Stromal Cells ») de moelle osseuse.
Avantageusement, le ratio cellules lymphomateuses/cellules stromales dans l'agrégat de cellules est compris entre 1/1 et 1000/1. Dans le cas de cellules lymphomateuses provenant de lignées cellulaires, le ratio peut varier dans le temps, la quantité de cellules lymphomateuses tendant à augmenter de manière exponentielle, comparativement aux cellules stromales. D'une manière générale, une fois que le microcompartiment a atteint sa taille maximale, généralement dans les huit jours suivant l'encapsulation des cellules dans l'enveloppe d'hydrogel (J8), et que les cellules ne peuvent plus croître à l'intérieur de l'enveloppe d'hydrogel, le ratio cellules lymphomateuses/cellules stromales est compris entre 1/1 et 10000/1. Dans un mode de réalisation, la densité cellulaire dans le microcompartiment cellulaire à J8 est comprise entre une centaine et plusieurs milliers de cellules. Par exemple, un microcompartiment présentant un diamètre de 200μιη comprend préférentiellement 100 à 10000 cellules.
Préférentiellement, le microcompartiment cellulaire est clos. C'est la couche externe en hydrogel qui confère sa taille et sa forme au microcompartiment cellulaire. Le microcompartiment peut avoir n'importe quelle forme compatible avec l'encapsulation de cellules, notamment une forme sphéroïde, ovoïde ou tabulaire. L'agrégat de cellules est contraint dans le volume interne de ladite couche d'hydrogel, et une fois les cellules à confluence, l'agrégat ne peut plus augmenter en volume. Dans un mode de réalisation particulier, le microcompartiment cellulaire a un diamètre ou une plus petite dimension compris entre 50 μιη et 600 μιη. Par « plus petite dimension », on entend le double de la distance minimale entre un point situé sur la surface externe de la couche en hydrogel et le centre du microcompartiment. Avantageusement, l'épaisseur de la couche externe en hydrogel représente 5% à 30% du rayon du microcompartiment. Dans le contexte de l'invention, « l'épaisseur » d'une couche est la dimension de ladite couche s 'étendant radialement par rapport au centre du microcompartiment.
Dans un exemple de réalisation particulier, le microcompartiment cellulaire a un diamètre ou une plus petite dimension compris entre 50 μηι et 300 μηι. De telles dimensions garantissent que l'ensemble des cellules de l'agrégat de cellules, y compris celles situées au centre dudit agrégat de cellules, a un accès suffisant à l'oxygène et aux nutriments qui diffusent à travers la couche d'hydrogel. Ainsi, aucun phénomène d'hypoxie et/ou de nécrose n'est observé au sein d'un tel microcompartiment, toutes les cellules ayant un accès suffisant aux petites molécules qui diffusent à travers l'enveloppe d'hydrogel.
Dans un autre exemple de réalisation, le microcompartiment cellulaire a un diamètre ou une plus petite dimension compris entre 500 μηι et 600 μηι. Dans ce cas, les cellules situées au centre de l'agrégat de cellules n'ont pas ou peu accès à l'oxygène et aux nutriments qui diffusent à travers l'enveloppe d'hydrogel. De tels microcompartiments sont particulièrement intéressants pour l'étude des phénomènes d'hypoxie et/ou de nécrose qui peuvent parfois se rencontrer dans un lymphome.
Procédés de préparation de microcompartiments cellulaires
L'invention a également pour objet des procédés de préparation de microcompartiments cellulaires permettant d'obtenir des microcompartiments cellulaires comprenant un agrégat de cellules contenant des cellules hématopoïétiques malignes encapsulé dans une enveloppe externe d'hydrogel. Après encapsulation des cellules, celles-ci vont se réorganiser au sein de l'enveloppe d'hydrogel, de manière à former un amas cohésif. L' encapsulation se fait au moyen d'un procédé de coextrusion concentrique, lors duquel la solution d'hydrogel est coextrudée avec la solution de cellules, avant d'être réticulée au moyen d'une solution de réticulation apte à réticuler l'hydrogel. Par « coextrusion concentrique », on entend que les solutions sont coextrudées de telle manière qu'une solution entoure l'autre solution. Dans le cas présent, la coextrusion concentrique est telle que la solution d'hydrogel entoure la solution de cellules. Dans un mode de réalisation, des gouttes de solutions coextrudées tombent alors dans la solution de réticulation, comprenant un agent de réticulation apte à réticuler l'hydrogel et ainsi à former une capsule d'hydrogel autour des cellules. Dans un autre mode de réalisation, les solutions sont coextrudées directement dans la solution de réticulation, de manière à former un tube externe en hydrogel dans lequel vont s'organiser les cellules. Dans un autre mode de réalisation, des gouttes de solutions coextrudées traversent un aérosol de réticulation (réalisé à partir d'une solution de réticulation) de manière à permettre une réticulation au moins partielle de la couche d'hydrogel autour de la goutte de solution de cellules. Avantageusement, les microcompartiments partiellement réticulés tombent ensuite dans une solution de réticulation où la réticulation se termine.
Tout procédé d'extrusion permettant de coextruder de manière concentrique de l'hydrogel et des cellules peut être utilisé. Notamment, il est possible de réaliser les microcompartiments cellulaires selon l'invention en adaptant la méthode et le dispositif microfluidique décrits dans Alessandri et al., (PNAS, September 10, 2013 vol. 110 no.37 14843-14848 ; Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604) ou dans Onoe et al., (Nat Material 2013, 12(6):584-90). Par exemple, le procédé selon l'invention est mis en œuvre au moyen d'un dispositif d'extrusion à double enveloppe concentrique tel que décrit dans le brevet FR2986165.
Dans le contexte de l'invention, on entend par « solution de réticulation », une solution comprenant au moins un agent réticulant adapté pour réticuler un hydrogel comprenant au moins un polymère hydrophile, tel que de l'alginate, lorsqu'elle est mise en contact avec celui- ci. La solution de réticulation peut être par exemple une solution comprenant au moins un cation divalent. La solution de réticulation peut également être une solution comprenant un autre agent réticulant connu de l'alginate ou du polymère hydrophile à réticuler, ou un solvant, par exemple de l'eau ou un alcool, adapté pour permettre une réticulation par irradiation ou par toute autre technique connue dans l'art. Avantageusement, la solution de réticulation est une solution comprenant au moins un cation divalent. Préférentiellement, le cation divalent est un cation permettant de réticuler de l'alginate en solution. H peut s'agir par exemple d'un cation divalent choisi dans le groupe comprenant Ca2+, Mg2+, Ba2+ et Sr2"1", ou d'un mélange d'au moins deux de ces cations divalents. Le cation divalent, par exemple le Ca24\ peut être associé à un contre- ion pour former par exemple des solutions de type CaCh ou CaCCh, bien connues de l'homme du métier. La solution de réticulation peut également être une solution comprenant du CaC03 couplé à du Glucono delta-lactone (GDL) formant une solution de CaCOs-GDL. La solution de réticulation peut également être un mélange de CaC03-CaS04-GDL. Dans un mode de mise en œuvre particulier du procédé selon l'invention, la solution de réticulation est une solution comprenant du calcium, notamment sous la forme Ca2+. La solution de réticulation peut également être une solution comprenant de la polylysine. L'homme du métier est à même d'ajuster la nature du cation divalent et/ou du contre-ion, ainsi que sa concentration aux autres paramètres du procédé de la présente invention, notamment à la nature du polymère utilisé et à la vitesse et/ ou au degré de réticulation désiré(e). Par exemple, la concentration de cation divalent dans la solution de réticulation est comprise entre 10 et 1000 mM. La solution de réticulation peut comprendre d'autres constituants, bien connus de l'homme du métier, que ceux décrit ci-dessus, afin d'améliorer la réticulation de la gaine d'hydrogel dans les conditions, notamment temps et/ou température, particulières.
Selon l'invention, la solution d'hydrogel est coextrudée avec une solution de cellules.
Avantageusement, la densité cellulaire dans la solution de cellules est comprise entre 1.106 et lOO.li^ ceUules/mL.
Dans un mode de réalisation particulier, la solution de cellules utilisée pour la coextrusion ne contient que des cellules lymphomateuses en suspension dans du milieu de culture.
Dans un mode de réalisation particulier, la solution de cellules utilisée pour la coextrusion ne contient que des cellules leucémiques en suspension dans du milieu de culture. Dans un autre mode de réalisation, la solution de cellules utilisée pour la coextrusion comprend des cellules lymphomateuses et des cellules stromales lymphoïdes, en suspension dans une matrice extracellulaire. Avantageusement, le ratio en nombre de cellules lymphomateuses / cellules stromales dans la solution de cellules est compris entre 1/1 et 1/2. Optionnellement, une telle solution peut également comporter des cellules immunitaires, préférentiellement choisies parmi des macrophages. Dans ce cas, le ratio en nombre de cellules lymphomateuses/cellules du microenvironnement dans la solution de cellules est avantageusement compris entre 1/1 et 1/2. Dans un autre mode de réalisation, la solution de cellules utilisée pour la coextrusion comprend des cellules leucémiques et des cellules stromales médullaires, en suspension dans une matrice extracellulaire. Avantageusement, le ratio en nombre de cellules leucémiques / cellules stromales dans la solution de cellules est compris entre 1/1 et 1/2.
Lorsque la solution de cellules comprend de la matrice extracellulaire, la suspension cellulaire représente avantageusement entre 50 et 95% du volume de la solution, tandis que la matrice extracellulaire représente entre 5 et 50% dudit volume.
Dans un mode de réalisation particulier, la coextrusion implique également une solution intermédiaire, comprenant du sorbitol. Dans ce cas, la coextrusion est réalisée de manière à ce que la solution intermédiaire soit extradée entre la solution d'hydrogel et la solution de cellules. Dans un mode de mise en œuvre particulier, la vitesse d'extrusion de la solution d'hydrogel est comprise entre 5et 100 mlVh, préférentiellement entre 15 et 60 mIJh.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, la vitesse d'extrusion de la solution de cellules est comprise entre 5 et 100 mIJh, préférentiellement entre 10 et 50mIVh.
Dans un mode de mise en œuvre particulier, la vitesse d'extrusion de la solution intermédiaire est comprise entre 5 et 100 mIJh, préférentiellement entre 10 et 50 mlVh.
La vitesse de coextrusion des différentes solutions peut être facilement modulée par l'homme du métier, de manière à adapter le diamètre ou la plus petite dimension du microcompartiment cellulaire et/ou l'épaisseur de la couche d'hydrogel. Préférentiellement, les vitesses d'extrusion de la solution de cellules et de la solution intermédiaire sont identiques. Avantageusement, la vitesse d'extrusion de la solution d'hydrogel est sensiblement égale à la vitesse d'extrusion de la solution de cellules et éventuellement de la solution intermédiaire.
Dans un mode de mise en œuvre particulier du procédé selon l'invention, la solution d'hydrogel, la solution intermédiaire et la solution de cellules sont chargées dans trois compartiments concentriques d'un dispositif de coextrusion, de manière à ce que la solution d'hydrogel, formant le premier flux, entoure la solution intermédiaire qui forme le second flux, qui elle- même entoure la solution de cellules qui forme le troisième flux. La pointe du dispositif d'extrusion, par laquelle sortent les trois flux, débouche au-dessus de la solution de réticulation. Par exemple, la pointe du dispositif d'extrusion est située à environ 50 cm, +/- 10cm, de la solution de réticulation. Un champ électrique est généré au sortir du dispositif de coextrusion, afin de permettre la formation des microgouttelettes. Pour cela, par exemple, un anneau de cuivre est disposé à environ 1 cm au sortir du dispositif de coextrusion. Des microgouttelettes tombent ainsi de manière séquentielle dans le bain de réticulation où la couche d'hydrogel est réticulée, formant une enveloppe externe autour des cellules. De manière alternative ou additionnelle, la pointe du dispositif d'extrusion débouche dans un aérosol de réticulation, formé de microgouttes de solution de réticulation, de sorte que la couche d'hydrogel des microgouttelettes commence à se réticuler au contact des microgouttes de l'aérosol. La réticulation peut, le cas échéant, se poursuivre dans une solution de réticulation dans laquelle les microgouttelettes sont réceptionnées.
Afin d'améliorer la polydispersité des gouttes au sortir du dispositif de coextrusion, et éviter ainsi que les microgouttelettes fusionnent avant d'atteindre la solution de réticulation, il est possible d'appliquer un potentiel de +1 à +5kV, et notamment un potentiel de +2kV, à la solution d'hydrogel, par exemple au moyen d'une électrode disposée dans la solution d'hydrogel.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir très rapidement plusieurs milliers de microcompartiments sensiblement identiques en termes de dimensions et de composition. Le procédé selon l'invention permet d'encapsuler des cellules hématopoïétiques malignes, telles que des cellules lymphomateuses, dans une enveloppe externe en hydrogel. Après seulement quelques heures, les cellules contenues dans l'enveloppe d'hydrogel se réorganisent, de manière à s'agréger et former un amas de cellules qui devient cohésif au bout de quelques jours. Avantageusement, le microcompartiment cellulaire obtenu par coextrusion est maintenu dans un milieu de culture adapté pendant deux à douze jours avant d'être utilisé, préférentiellement entre quatre et dix jours. Ce temps de latence permet avantageusement aux cellules de s'agréger et de former un amas cellulaire mimant l'amas de cellules au sein d'un lymphome.
Selon l'invention, il est possible d'utiliser le microcompartiment cellulaire obtenu par coextrusion tel quel, c'est-à-dire avec l'enveloppe externe d'hydrogel. H est autrement possible de procéder préalablement à toute utilisation à une hydrolyse de l'enveloppe d'hydrogel, afin de récupérer l'agrégat de cellules. H est également possible de congeler le microcompartiment cellulaire obtenu par coextrusion (avec l'enveloppe d'hydrogel) pour une utilisation ultérieure. Applications
Les microcompartiments cellulaires selon l'invention peuvent être utilisés pour de nombreuses applications, notamment à visées pharmacologiques.
Les microcompartiments cellulaires selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour des tests d'identification et/ou de validation de molécules candidates ayant une action sur les hémopathies malignes. En fonction des cellules hématopoïétiques malignes contenues dans le microcompartiment cellulaire, il est possible de cibler un type d' hémopathies malignes particulier.
Selon l'invention, il est possible d'utiliser directement les microcompartiments cellulaires, c'est-à-dire avec l'enveloppe externe d'hydrogel. Notamment, la perméabilité de certains hydrogels, tels que l'alginate, est suffisante pour laisser passer des molécules ayant un poids moléculaire inférieur ou égal à 200 kDa. Il est donc possible d'étudier ces molécules directement sur les microcompartiments cellulaires. Dans le cas de molécules de poids moléculaire plus important, il est possible d'hydrolyser l'enveloppe externe d'hydrogel avant de pratiquer les tests . Ainsi, Γ étude se fait directement sur Γ amas de cellules . Avantageusement, l'hydrolyse de l'enveloppe d'hydrogel est réalisée 6 ou 10 jours après la coextrusion, de manière à garantir que l'amas de cellules s'est bien formé et que les cellules sont cohésives.
Les microcompartiments cellulaires selon l'invention peuvent également être utilisés en médecine personnalisée, en utilisant des cellules d'un sujet présentant un lymphome ou une leucémie, afin de tester spécifiquement la réaction dudit sujet à différents traitements, avant de sélectionner le traitement le plus adapté pour ledit sujet.
EXEMPLES
Exemple 1 : Procédé d'obtention des microcompartiments cellulaires Matériel & méthode Cellules :
Lignées humaines de type lymphomes diffus à grande cellules B (DLBCL) (SUDHL4 et HLY1) Lignées humaines de type lymphome folliculaire (DOHH2) Lymphocytes B issus de biopsies de patients purifiés par sélection négative (Maby-El Hajjami et al. Can Res 2009 : 69 (7) 3228 :37)
Cellules stromales de type « RESTO » (Aîné-Thomas et al. (Blood 2007)) Solutions : Solution de réticulation : CaCfc 100mM à 37°C Solution intermédiaire : Sorbitol 300mM
Solution d'hydrogel : alginate 2,5% w/v (LF200FTS) dans 0,5mM SDS
Matrice extracellulaire : Matrigel® classique (sans rouge phénol et avec facteurs de croissance)
Dispositif de œextrusion - 3 seringues hamilton 12ml contenant respectivement de Γ alginate 2,5% stérile et les deux autres du sorbitol 300 mM stériles
-tuyau standard Teflon de diamètre 13mm
- pompe à seringues neMESYS® (de la société Cetoni) et logiciel associé
- puce d'injection imprimée en 3D (voir publication Alessandri K et al., 2016) Procédé de œextrusion
Les capsules d' alginate sont obtenues selon le procédé décrit dans Alessandri et al (PNAS 2013, DOI: 10.1073/pnas.1309482110 et LOC 2016 DOI: 10.1039/c61c00133e) et dans la demande WO2013113855.
Plus précisément, environ 1.106 cellules sont re-suspendues dans une solution de sorbitol et de Matrigel® pour obtenir un volume final de 100|xL à 50% en volume de Matrigel®. Cette solution de cellules est conservée à 4°C.
Le dispositif de coextrusion micro fluidique pour la production de capsules est disposé à environ 50cm au-dessus d'une boîte de Pétri contenant la solution de réticulation. La solution d'alginate, la solution de sorbitol et la solution de cellules sont alors co-injectées dans le dispositif de coextrusion microfluidique, afin de former des gouttelettes composites qui sont réticulées en tombant dans le bain de calcium. Le dispositif de coextrusion est mis en fonctionnement pendant 10 secondes, et produit environ 5000 capsules d'alginate par seconde, soit au total environ 50.000 capsules. Les capsules d'alginate sont alors récupérées en filtrant le bain de calcium avec une passoire à cellules maille 40μπι qui retient les capsules. Celles-ci sont rincées avec de la base de milieu puis re-suspendues dans le milieu définitif.
Pour améliorer la polydispersité, un potentiel de +2kV a été appliqué via une électrode dans l'alginate. Un anneau de cuivre à la masse de 3cm de diamètre est positionné à environ 1cm de la pointe du dispositif microfluidique de coextrusion pour générer le champ électrique nécessaire à l'éléctro-formation des gouttelettes.
A] Microcompartiments cellulaires comprenant uniquement des cellules lymphomateuses SUDHL4 ou HLY1
Avant l'encapsulation, les cellules lymphomateuses sont cultivées dans du milieu DMEM additionné de 10% de sérum de veau fœtal (SVF) en atmosphère humide à 37°C en présence de 5% de C02.
Au moment de l'encapsulation, les cellules sont centrifugées et re-suspendues dans du sorbitol (300mM) à raison de 10.106 à 100.106 ceUules/mL.
Après encapsulation, le nombre de cellules par capsule varie entre 30 et 100. Les capsules sont cultivées en milieu DMEM additionné de 10% de SVF dans une étuve à CO2 à 37°C. Le milieu est changé tous les 2 à 3 jours.
Pour quantifier la croissance des amas de cellules, les capsules sont réparties en plaques de 96 puits, à raison d'une capsule par puits. Les amas de cellules sont ensuite imagés régulièrement (tous les 2 jours) en contraste de phase et en fluorescence si la lignée cellulaire exprime une protéine fluorescente. Ainsi on obtient une série de photos représentant la croissance d'un amas de cellules unique au cours du temps. A partir de ces photos, l'aire des amas de cellules est mesurée à l'aide du logiciel ImageJ® et des courbes de croissance sont établies (figure 1B).
On observe ainsi que les amas de cellules sont constitués entre J4-J10 après l'encapsulation. Plus précisément, entre J6 et J10, on observe que les cellules s'agrègent et forment une masse unique dans la capsule d'alginate (figure 1A). B] Microcompartiments cellulaires comprenant des cellules lvmphomateuses et des cellules stromales
Afin de se rapprocher du microenvironnement d'un ganglion lymphatique, des cellules lvmphomateuses (DOHH2) sont co-cultivées avec de la matrice extracellulaire Matrigel® et des cellules stromales de type « RESTO ».
Les cellules RESTO ont été préalablement cultivées en milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal en atmosphère humide à 37°C avec 5% de CCh. Au moment de l'encapsulation, les cellules sont détachées du support par action de la trypsine, puis elles sont re-suspendues dans la matrice extracellulaire en présence de cellules lymphomateuses selon un ratio 1/1.
La densité cellulaire des cellules RESTO et des cellules lymphomateuses peut varier de 10- 50.106 cellules /mL.
La méthode d'encapsulation par coextrusion permet d'obtenir un revêtement de la paroi interne des capsules d'alginate par la matrice extracellulaire. Ce revêtement permet l'adhésion des cellules stromales et favorise la formation de la niche tumorale. En quelques jours, les cellules s'organisent librement et forment un amas de cellules cohésives après 4-10 jours de culture (figure 3).
C] Microcompartiments cellulaires réalisés à partir de cellules de patients
Des microcompartiments ont été réalisés selon l'invention à partir de cellules lymphocytaires issues de patient atteints de syndrome de Sezary (Forme leucémique du lymphome T cutané). Après encapsulation, les cellules croissent à l'intérieur des capsules d'alginate et forment un amas de cellules au bout d'une dizaine de jours (Figure 12). Cela confirme que le procédé selon l'invention permet d'obtenir des microcompartiments cellulaires à partir de cellules primaires de patients, ce qui permet d'envisager l'utilisation de ce procédé en médecine personnalisée. Exemple 2 : Analyse des microcompartiments cellulaires
A] Imagerie en temps réel
Des capsules contenant des amas de cellules SUDHL4 ou HLY1 sont placées dans des puits d'agarose recouverts de milieu DMEM sans rouge de phénol (à J1-J6). L'acquisition des images se fait au microscope confocal ZEISS lsm 510. Deux types d'analyses sont réalisés: une analyse à un temps t après marquage des microcompartiments avec un fluorophore, et une analyse en imagerie intermittente, après marquage ou non des cellules avec un fluorophore. Les cellules sont marquées avec de la calcein-AM et de l'iodure de propidium, afin de visualiser les cellules mortes ; les noyaux cellulaires sont marqués en bleu avec du Hoechst 33342.
H est ainsi possible de suivre la migration des cellules au sein de la capsule, ainsi que les interactions entre cellules.
B] Immunofluorescence en coupe de paraffine
Pour pouvoir étudier l'expression ou la régionalisation des protéines dans les cellules au sein des amas de cellules, la technique d' immunofluorescence sur coupe de paraffine a été adaptée à l'analyse des capsules : des capsules contenant les amas de cellules sont prélevées et incluses dans une solution gélifiée d'agarose à faible point de fusion à 2 %. Une fois gélifié, le bloc d'agarose contenant les capsules est plongé dans un fixateur de type paraformaldéhyde à 4% pendant 30 min. Après fixation, les échantillons sont traités selon les protocoles classiquement décrits pour rimmunohisto fluorescence.
L'expression de la protéine Ki67, qui est un marqueur de l'activation cellulaire, et l'expression de la caspase 3 clivée, qui permet d'évaluer la mort cellulaire, ont été évaluées. Les marquages ont été réalisés sur des coupes d'amas de cellules correspondant à peu près au centre de ceux- ci.
On constate l'absence de régionalisation de mort ou de prolifération cellulaire au sein des amas cellulaires. Ces observations sont tout à fait comparables à celles effectuées dans des tumeurs de cellules SUDHL4 obtenues après xénogreffe dans des souris immunodéficientes.
C] Analyse de la matrice extracellulaire dans les amas de cellules
Une des caractéristiques du microenvironnement ganglionnaire est la présence de matrice extracellulaire sécrétée par les cellules stromales et les lymphocytes B tumoraux. La matrice extracellulaire est constituée principalement de fibronectine, de collagène I et de laminine. Une analyse par immunofluorescence a permis de montrer la présence de ces trois types de matrice dans les amas de cellules des microcompartiments, alors que les mêmes cellules cultivées en suspension n'expriment pas ces matrices. D] Dissolution des capsules d'alginate
Pour l'analyse qualitative et quantitative à haut débit des amas de cellules, il est important de pouvoir récupérer les cellules contenues dans la capsule d'hydrogel. Une fois récupérées, il est possible de les trier et/ou de les analyser en cytométrie en flux ou par toute autre méthode d'analyse appropriée, comme le séquençage à haut débit, les dosages biochimiques, etc.
Des microcompartiments (à J9 après encapsulation) sont prélevés et la capsule d'alginate est dissoute en plongeant les microcompartiments dans un tampon phosphate additionné de 1 mM d'EGTA. La Figure 4 montre un exemple de dissolution d'une capsule contenant un amas de cellules comprenant uniquement des cellules lymphomateuses SUDHL4 (figure 4A) et d'une capsule contenant un amas de cellules comprenant des cellules lymphomateuses DOHH2 et des cellules stromales (figure 4B).
On constate qu'après dissolution de la capsule, les cellules constituant l'amas de cellules ne se dispersent pas et montrent une cohésion qui est compatible avec la présence de matrice extracellulaire. E] Cytométrie en flux
Afin d'accéder au nombre de cellules au sein des amas de cellules et au pourcentage de cellules mortes aux différents stades de croissance, les capsules d'alginate sont dissoutes et les amas de cellules dissociés avant d'être incubés avec un marqueur de l'apoptose (TMRM) puis analysés au cytomètre en flux en présence de billes de comptage (Figure S). Au cours du temps, on observe que le nombre de cellules augmente, alors que les proportions de cellules mortes au sein des amas de cellules diminuent entre J3 et J10, ce qui est en corrélation avec l'augmentation du volume du sphéroïde décrit en figure 1A.
F] Effet supplétif de la niche tumorale sur la croissance des cellules de lymphomes
Les lymphocytes B tumoraux issus de patients, ainsi que certaines lignées cellulaires, ne sont pas capables de survivre et/ou de former des amas de cellules lorsqu'ils sont cultivés seuls. Comme cela est visible sur la figure 6 (A-C), la reconstitution d'une niche tumorale proche de celle retrouvée dans le ganglion lymphatique (C : cellules RESTO + DOHH2), favorise la croissance des lymphocytes B tumoraux. G] Différenciation des cellules stromales en stroma lvmphoïde pro-tumoral
Au cours de la formation de la niche tumorale du lymphome folliculaire, les cellules stromales se différencient en stroma lymphoïde pro-tumoral (Thomazy et al, 2003 ; Ohe et al., 2016) exprimant, entre autres, la transglutaminase 2 (TG2) qui a un rôle dans la stabilisation de la matrice extra-cellulaire et l'adhésion cellulaire.
Comme cela est visible sur la figure 8, la culture de cellules stromales de type Resto (FRC) en présence de cellules B tumorales et de matrice extra-cellulaire entraine l'expression de la TG2, révélée par immunomarquage. Ceci montre que le modèle 3D de culture cellulaire selon l'invention reproduit les principales caractéristiques d'une niche tumorale lymphomateuse, à savoir l' effet supplétif du stroma sur les lymphocytes B et la différenciation du stroma en stroma pro-tumoral.
Exemple 3 : Criblage de molécules anti-cancéreuses
H est reconnu que la chimiorésistance de certains lymphomes est en partie liée à une mauvaise pénétration des drogues au sein des structures 3D et à la présence de cellules du microenvironnement.
L'efficacité de deux chimiothérapies conventionnelles (cisplatine et étoposide) a été testée de manière parallèle sur des cellules cultivées en suspension (2D) et sur des amas de cellules issus de microcompartiments cellulaires selon l'invention (3D), traités avec des concentrations croissantes de ces molécules. Après 48h d'incubation, les cellules sont marquées au TMRM (les capsules d'alginate sont préalablement dissoutes et les amas de cellules dissociés) puis analysées au cytomètre afin d'évaluer le pourcentage de mort cellulaire pour chaque dose de molécule.
Les résultats montrent que les cellules organisées en amas de cellules (3D), qui présentent une structure plus proche de la structure d'une tumeur, sont moins sensibles aux chimiothérapies conventionnelles que les mêmes cellules cultivées en suspension (Figure 7). Cela confirme que le modèle 3D selon l'invention est plus pertinent pour faire du criblage de drogues anticancéreuses que des cellules en suspension. Exemple 4 : Diffusion des drogues dans le microcompartiment cellulaire
A] Chimiothérapies conventionnelles
La recherche de médicaments contre le cancer au niveau préclinique a le pire taux de succès de tous les essais thérapeutiques, avec moins de 5% de composés candidats passant la phase m des essais cliniques. Une des explications à ces échecs est l'absence de modèle pertinent capable de reproduire la diffusion des drogues au sein d'une tumeur. En effet, une des hypothèses pour expliquer la diminution de l'efficacité des molécules lors du passage de tests pré-cliniques vers les essais cliniques serait que la densité cellulaire au sein des tumeurs freinerait la pénétration et la diffusion des drogues, diminuant d'autant leur efficacité. Comme montré à l'exemple 3 ci-dessus, le modèle 3D selon l'invention est pertinent pour étudier la diffusion des drogues au sein d'une niche tumorale lymphomateuse.
Pour effectuer des tests de diffusion de drogues, les propriétés auto-fluorescentes de la doxorubicine (qui est par ailleurs utilisée dans le traitement standard des lymphomes B) ont été utilisées. Ainsi, des cellules SUDHL4 cultivées en suspension ou en 3D en présence ou non de matrice extracellulaire (ECM) et ou de cellules stromales de type RESTO ont été incubées 24h en présence ou non de Doxorubicine (ΙμΜ).
L'intensité de fluorescence des cellules a ensuite été mesurée par cytométrie en flux.
Les résultats montrent que les cellules cultivées en 3D dans le microcompartiment selon l'invention sont moins fluorescentes que les cellules cultivées en 2D, suggérant donc que dans un contexte 3D, les cellules sont moins exposées à la chimiothérapie. De façon très intéressante, on observe que la diffusion de la drogue est davantage freinée lorsque les cellules sont cultivées en 3D en présence de matrice et de cellules RESTO (Figure 9). Ainsi, en freinant la diffusion des molécules au sein des sphéroïdes selon l'invention (et par analogie des tumeurs) on montre comment le microenvironnement peut exercer un rôle dans la résistance aux drogues.
B] Anticorps
Le traitement standard des lymphomes B consiste en une polychimiothérapie conventionnelle associée à une immunothérapie dirigée contre le CD20 exprimé à la surface des lymphocytes B matures. Pour pouvoir tester le potentiel thérapeutique de certaines immunothérapies dans le système de culture cellulaire 3D selon l'invention, il est intéressant de montrer que les anticorps (AC) sont capables de pénétrer dans le microcompartiment.
Pour tester cela, les sphéroïdes ont été incubés à J7-J9 post-encapsulation en présence - d'AC anti-CD19 directement couplé à la phycoérythrine (PE) (très fortement exprimé dans les lymphocytes B), ou
- de Rituximab, qui est TAC thérapeutique utilisé pour les lymphomes B, qui a été directement couplé avec un fluorophore (lex=633nm).
Après une nuit d'incubation avec les AC, on observe un marquage des cellules au sein des sphéroïdes (Figure 10). Cela montre que le modèle 3D selon l'invention est adapté pour faire du criblage d'AC thérapeutiques.
C] Réponse aux drogues
Comme démontré ci-dessus, la diffusion des drogues est altérée dans les structures 3D selon l'invention. Le but de la présente expérimentation est de vérifier si cette altération est corrélée à une chimiorésistance. Pour cela, l'efficacité de deux chimiothérapies conventionnelles (doxorubicine et étoposide) a été testée de manière parallèle sur des cellules cultivées en suspension (2D) et sur des amas de cellules issus de microcompartiments cellulaires selon l'invention, contenant des cellules lymphomateuses seules ou en présence d'ECM, avec ou sans cellules stromales RESTO, traités avec des concentrations croissantes de ces molécules de chimiothérapie.
Après 48h d'incubation, la survie cellulaire a été évaluée par la mesure de Γ ATP intracellulaire à l'aide du kit CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay.(Promega).
Les résultats montrent que les cellules organisées en amas de cellules (3D), qui présentent une structure plus proche de la structure d'une tumeur (cellules lymphomateuses + ECM ± RESTO), sont moins sensibles aux chimiothérapies conventionnelles que les mêmes cellules cultivées en suspension (Figure 11 et tableau 1).
Cela confirme que le modèle 3D selon l'invention est plus pertinent pour faire du criblage de drogues anticancéreuses que des cellules en suspension. Tableau 1 : IC50 des différentes drogues selon le modèle d'étude utilisé.
Figure imgf000026_0001

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire comprenant un agrégat de cellules contenant des cellules hématopoïétiques malignes encapsulé dans une couche d'hydrogel, selon lequel une solution d'hydrogel et une solution de cellules comprenant des cellules hématopoïétiques malignes sont co-extrudées concentriquement puis réticulés.
2. Procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire selon la revendication 1, selon lequel les cellules hématopoïétiques malignes sont des cellules lymphomateuses.
3. Procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire selon la revendication 2, selon lequel la solution de cellules comprend en outre des cellules stromales lymphoïdes et de la matrice extracellulaire.
4. Procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire selon la revendication 1, selon lequel les cellules hématopoïétiques malignes sont des cellules leucémiques.
5. Procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire selon la revendication 4, selon lequel la solution de cellules comprend en outre des cellules stromales médullaires et de la matrice extracellulaire.
6. Procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications précédentes, selon lequel la densité cellulaire dans la solution de cellules est comprise entre 10.106 et 100.106 cellules/mL, et/ou selon lequel le ratio en nombre de cellules hématopoïétiques malignes / cellules stromales dans la solution de cellules est compris entre 1/1 et 1/2.
7. Procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire selon la revendication 3 ou S, selon lequel la solution de cellules comprend entre 1% et 90% en volume de cellules et entre 10 et 99%% en volume de matrice extracellulaire.
8. Procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications précédentes, ledit procédé comprenant une étape additionnelle consistant à :
- appliquer un potentiel de + 2kV à la solution d'hydrogel ; et/ou
- générer un champ électrique entre des moyens de coextrusion et la solution de réticulation.
9. Procédé de préparation d'un microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications précédentes, ledit procédé comprenant une étape ultérieure consistant à :
- congeler les microcompartiments cellulaires ; et/ou
- hydrolyser la capsule d'hydrogel des microcompartiments cellulaires pour récupérer l'agrégat de cellules.
10. Microcompartiment cellulaire susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel ledit microcompartiment forme une structure tridimensionnelle close comprenant un agrégat de cellules formant un amas cohésif contraint dans le volume interne du microcompartiment, ledit agrégat comprenant au moins des cellules hématopoïétiques malignes, encapsulé dans une couche externe d'hydrogel.
11. Microcompartiment cellulaire selon la revendication 10, dans lequel ledit microcompartiment est constitué d'un agrégat de cellules lymphomateuses encapsulé dans une couche d'hydrogel, ou d'un agrégat de cellules leucémiques encapsulé dans une couche d'hydrogel.
12. Microcompartiment cellulaire selon la revendication 10, dans lequel ledit microcompartiment comprend en outre une couche de matrice extracellulaire entre l'agrégat de cellules et la couche d'hydrogel et dans lequel l'agrégat de cellules comprend en outre des cellules stromales, préférentiellement des cellules stromales de type RESTO.
13. Microcompartiment cellulaire selon la revendication 12, dans lequel le ratio en nombre cellules hématopoïétiques malignes/cellules stromales dans l'agrégat de cellules est compris entre 1/1 et 1000/1.
14. Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 10 à 13, dans lequel la couche externe comprend de l'alginate.
15. Microcompartiment cellulaire selon la revendication 11, dans lequel les cellules lymphomateuses sont choisies parmi des lignées cellulaires ou des cellules tumorales purifiées de lymphome folliculaire, de lymphomes diffus à grandes cellules B, de lymphome de Burkitt, de lymphome du manteau, de lymphome T périphérique, de lymphome lymphoblastique, de lymphome anaplasique, de lymphome de la zone marginale, de lymphome du MALT (« Mucosa-associated lymphoid tissue »), de lymphome lymphoplasmocytaire, de lymphome de la rate, de lymphomes B cutané, de lymphomes T cutané.
16. Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 10 à 15, dans lequel ledit microcompartiment a un diamètre ou une plus petite dimension comprise entre 50 μιη et 1000 μηι, préférentiellement entre 150 μηι et 300 μηι, ou entre 500 μηι et 600 μηι.
17. Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 10 à 16, dans lequel la densité cellulaire est comprise entre une centaine et plusieurs milliers de cellules, préférentiellement
100 à 10000 cellules par microcompartiments.
18. Microcompartiment cellulaire comprenant un agrégat de cellules encapsulé dans une couche d'hydrogel, dans lequel l'agrégat de cellules comprend des cellules hématopoïétiques malignes, telles que des cellules lymphomateuses ou des cellules leucémiques, et des cellules stromales, ledit microcompartiment comprenant en outre une couche de matrice extracellulaire entre l'agrégat de cellules et la couche d'hydrogel.
19. Méthode de criblage ou d'identification d'un composé pour le traitement d'un lymphome comprenant les étapes :
(a) optionnellement, dissoudre la couche d'hydrogel d'un microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 10 à 18 ;
(a') mettre en contact le microcompartiment cellulaire avec un composé à tester ;
(b) sélectionner le composé apte à inhiber au moins partiellement la croissance de l'agrégat de cellules dudit microcompartiment cellulaire et/ou à tuer au moins partiellement les cellules de l'agrégat de cellules dudit microcompartiment cellulaire.
20. Utilisation d'un microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 10 à 18 pour le criblage ou l'identification d'un composé pour le traitement d'une hémopathie maligne, telle qu'un lymphome ou une leucémie.
PCT/FR2018/050855 2017-04-07 2018-04-05 Microcompartiment de cellules hématopoïétiques malignes et procédé de préparation d'un tel microcompartiment WO2018185439A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/603,264 US20200370022A1 (en) 2017-04-07 2018-04-05 Malignant hematopoietic cell microcompartment and method for preparing such a microcompartment
EP18718897.4A EP3607056A1 (fr) 2017-04-07 2018-04-05 Microcompartiment de cellules hématopoïétiques malignes et procédé de préparation d'un tel microcompartiment
JP2020504449A JP2020524523A (ja) 2017-04-07 2018-04-05 悪性造血細胞微小区画およびかかる微小区画の調製方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1753067A FR3065010A1 (fr) 2017-04-07 2017-04-07 Microcompartiment de cellules hematopoietiques malignes et procede de preparation d'un tel microcompartiment
FR1753067 2017-04-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018185439A1 true WO2018185439A1 (fr) 2018-10-11

Family

ID=59325423

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2018/050855 WO2018185439A1 (fr) 2017-04-07 2018-04-05 Microcompartiment de cellules hématopoïétiques malignes et procédé de préparation d'un tel microcompartiment

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20200370022A1 (fr)
EP (1) EP3607056A1 (fr)
JP (1) JP2020524523A (fr)
FR (1) FR3065010A1 (fr)
WO (1) WO2018185439A1 (fr)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3134116A1 (fr) * 2022-04-05 2023-10-06 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupée en 3D et ayant une faible teneur en TNF alpha
FR3134114A1 (fr) * 2022-04-05 2023-10-06 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes adaptés pour la culture à grande échelle
FR3134117A1 (fr) * 2022-04-05 2023-10-06 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes adaptés pour la culture à grande échelle
WO2023194482A1 (fr) * 2022-04-05 2023-10-12 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupee en 3d et ayant une faible teneur en tnf alpha

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2986165A1 (fr) 2012-01-31 2013-08-02 Capsum Procede de preparation de capsules rigidifiees

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2986165A1 (fr) 2012-01-31 2013-08-02 Capsum Procede de preparation de capsules rigidifiees
WO2013113855A2 (fr) 2012-01-31 2013-08-08 Capsum Capsules contenant des cellules de mammifères

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ABARRATEGI: "The Journal of Clinical Investigation", 1 February 2017 (2017-02-01), XP055395887, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5272182/pdf/jci-127-89364.pdf> [retrieved on 20170803] *
ALESSANDRI ET AL., PNAS, 2013
ALESSANDRI ET AL., PNAS, vol. 110, no. 37, 10 September 2013 (2013-09-10), pages 14843 - 14848
AMÉ-THOMAS ET AL., BLOOD, 2007
AME-THOMAS, BLOOD, vol. 109, 2007, pages 693
CAICEDO-CARVAJAL ET AL., J. TISSUE ENG, vol. 2011, 2011, pages 362326
GRAVELLE ET AL., AM. J. PATHOL., vol. 184, 2014, pages 2082 - 295
GRAVELLE ET AL., AM. J. PATHOL., vol. 184, 2014, pages 282 - 295
JENNA L WILSON ET AL: "REVIEW Stem Cell Microencapsulation for Phenotypic Control, Bioprocessing, and Transplantation", 13 December 2012 (2012-12-13), XP055395784, Retrieved from the Internet <URL:http://onlinelibrary.wiley.com/store/10.1002/bit.24802/asset/24802_ftp.pdf?v=1&t=j5w980ys&s=ec0a2bc37ce5d98662ed9ee61cf60b5517de84bb> [retrieved on 20170803] *
K. ALESSANDRI ET AL: "Cellular capsules as a tool for multicellular spheroid production and for investigating the mechanics of tumor progression in vitro", PROCEEDINGS NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES PNAS, vol. 110, no. 37, 26 August 2013 (2013-08-26), US, pages 14843 - 14848, XP055282232, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.1309482110 *
KEVIN ALESSANDRI ET AL: "A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC)", LAB ON A CHIP, vol. 16, no. 9, 1 January 2016 (2016-01-01), pages 1593 - 1604, XP055393107, ISSN: 1473-0197, DOI: 10.1039/C6LC00133E *
KOBAYASHI ET AL., TRENDS IMMUNOL., vol. 31, 2010, pages 422 - 428
LAB ON A CHIP, vol. 16, no. 9, 2016, pages 1593 - 1604
MABY-EL HAJJAMI ET AL., CAN RES, vol. 69, no. 7, 2009, pages 3228
ONOE ET AL., NAT MATERIAL, vol. 12, no. 6, 2013, pages 584 - 90
RAO WEI ET AL: "Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules", BIOMATERIALS, vol. 35, no. 27, 1 September 2014 (2014-09-01), pages 7762 - 7773, XP028859316, ISSN: 0142-9612, DOI: 10.1016/J.BIOMATERIALS.2014.06.011 *
ROBERT G. MANNINO ET AL: "3D microvascular model recapitulates the diffuse large B-cell lymphoma tumor microenvironment in vitro", LAB ON A CHIP, vol. 17, no. 3, 30 January 2017 (2017-01-30), pages 407 - 414, XP055395758, ISSN: 1473-0197, DOI: 10.1039/C6LC01204C *
THAO THI THU VU ET AL: "Characterization of leukemic cell behaviors in a soft marrow mimetic alginate hydrogel", JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH. PART B: APPLIED BIOMATERIALS, vol. 100B, no. 7, 1 October 2012 (2012-10-01), US, pages 1980 - 1988, XP055395764, ISSN: 1552-4973, DOI: 10.1002/jbm.b.32765 *
THERESE ANDERSEN ET AL: "3D Cell Culture in Alginate Hydrogels", MICROARRAYS, vol. 4, no. 2, 24 March 2015 (2015-03-24), pages 133 - 161, XP055328462, ISSN: 2076-3905, DOI: 10.3390/microarrays4020133 *
WEISWALD ET AL., BR. J. CANCER, vol. 101, 2009, pages 473 - 482

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3134116A1 (fr) * 2022-04-05 2023-10-06 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupée en 3D et ayant une faible teneur en TNF alpha
FR3134115A1 (fr) * 2022-04-05 2023-10-06 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupée en 3D et ayant une faible teneur en granzyme B
FR3134114A1 (fr) * 2022-04-05 2023-10-06 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes adaptés pour la culture à grande échelle
FR3134117A1 (fr) * 2022-04-05 2023-10-06 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes adaptés pour la culture à grande échelle
WO2023194482A1 (fr) * 2022-04-05 2023-10-12 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupee en 3d et ayant une faible teneur en tnf alpha
WO2023194479A1 (fr) * 2022-04-05 2023-10-12 Treefrog Therapeutics Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupee en 3d et ayant une faible teneur en granzyme b

Also Published As

Publication number Publication date
US20200370022A1 (en) 2020-11-26
FR3065010A1 (fr) 2018-10-12
JP2020524523A (ja) 2020-08-20
EP3607056A1 (fr) 2020-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3607056A1 (fr) Microcompartiment de cellules hématopoïétiques malignes et procédé de préparation d&#39;un tel microcompartiment
Yu et al. Random and aligned electrospun PLGA nanofibers embedded in microfluidic chips for cancer cell isolation and integration with air foam technology for cell release
Spasojevic et al. Reduction of the inflammatory responses against alginate-poly-L-lysine microcapsules by anti-biofouling surfaces of PEG-b-PLL diblock copolymers
EP3713665B1 (fr) Procéde de fabrication de capsules formées d&#39;une enveloppe externe d&#39;hydrogel réticulé entourant un noyau central
EP2882290B1 (fr) Systeme permettant la maintenance en survie et le transport de biopsies de peau et ses applications
FR2501715A1 (fr) Procede de culture de cellules necessitant une fixation pour la fabrication de substances therapeutiques
FR3063736A1 (fr) Microfibre cellulaire creuse et procede de fabrication d&#39;une telle microfibre cellulaire creuse
Sabu et al. Nanomedicines targeting glioma stem cells
Zhou et al. Expansion of ovarian cancer stem-like cells in poly (ethylene glycol)-cross-linked poly (methyl vinyl ether-alt-maleic acid) and alginate double-network hydrogels
Yang et al. Capturing circulating tumor cells through a combination of hierarchical nanotopography and surface chemistry
Brancato et al. Tumor-stroma interactions alter the sensitivity of drug in breast cancer
Rima et al. Microfluidic harvesting of breast cancer tumor spheroid-derived extracellular vesicles from immobilized microgels for single-vesicle analysis
FR3071508A1 (fr) Modele ex vivo de peau humaine inflammee et ses utilisations pour le criblage de composes anti-inflammatoires
EP3752594B1 (fr) Reseau tridimensionnel biocompatible et son utilisation en tant que support de cellules
JP7306647B2 (ja) 移植片及びその使用
EP3256568A1 (fr) Procede d&#39;implantation d&#39;amas cellulaires dans un explant de peau
Li et al. Synthetic viscoelastic activating cells for T cell engineering and cancer therapy
US11162068B2 (en) Biomimetic support for three-dimensional cell culturing, method for manufacturing same, and use thereof
WO2023194479A1 (fr) Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupee en 3d et ayant une faible teneur en granzyme b
Tian et al. OPEN ACCESS EDITED BY Jin Yan, Xi'an Jiaotong University, China
Garmanchouk et al. Formation of multicellular aggregates under different conditions of microenvironment
Reed Assessment of the biocompatibility, stability, and suitability of novel thermoresponsive films for the rapid generation of cellular constructs
Kamali Dashtarzheneh Development of 3D cancer models and targeted fluorescent gold nanoclusters
EP2524031B1 (fr) Lignees de cellules souches humaines et murines : modeles de precurseurs de cellules endotheliales
FR3109584A1 (fr) Microcompartiment pour la culture de cellules de cnidaires

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18718897

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2020504449

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018718897

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018718897

Country of ref document: EP

Effective date: 20191107