WO2018117312A1 - 다공성 나노 복합체 - Google Patents

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porous
nanocomposite
porous nanocomposite
chitosan
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변정훈
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영남대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present application relates to a porous nanocomposite, a method for manufacturing the same, and a device for manufacturing the same.
  • Inorganic-organic hybrid particles based on calcium carbonate (CaCO 3 ) (CC) are biocompatible and have a unique structure suitable for effectively protecting DNA from damage occurring during gene transfection into target cells.
  • Calcium carbonate is a common substance present in the range of natural products such as rocks, eggshells and shells of marine organisms. With regard to the industrial field, calcium carbonate particles are used as fillers for various mixed compounds such as plastics, rubber, paints and the like.
  • Chitosan is another rich natural compound with good biocompatibility, biodegradability and antimicrobial activity, which is currently used intensively as a carrier or vehicle for various biomedical applications.
  • the combination of calcium carbonate and chitosan may have a strong potential for use in the biomedical field.
  • the manufacture of calcium carbonate-chitosan hybrid nanostructures for use in the biomedical field has not been reported yet.
  • the present application is excellent in biocompatibility, and can effectively protect DNA from damage generated during gene transfection into target cells, thereby enabling efficient delivery of DNA, drugs or other functional reagents, and also inflammation around the implant.
  • a porous nanocomposite a method for manufacturing the same, and a device for manufacturing the same, which may be coated on an implant fixture to suppress the implantation.
  • the present application relates to a porous nanocomposite.
  • exemplary porous nanocomposite of the present application having a porous structure containing calcium carbonate in the core portion, a biocompatible material in the shell portion, the pores are formed in the shell portion, excellent biocompatibility, and target cells DNA can be effectively protected from damage during transfection of the gene, thereby efficiently delivering DNA, drugs, or other functional reagents, and also coating the implant fixture to prevent inflammation around the implant. It can provide a porous nanocomposite that can be.
  • nano may mean a size in nanometers (nm), for example, may mean a size of 1 to 1,000 nm, but is not limited thereto.
  • nanocomposite refers to a material having an average diameter of nanometers (nm) unit, a composite material combining two or more kinds of materials having a superior function physically or chemically different from the original material. And, for example, it may mean a composite having an average diameter of 1 to 1,000 nm, but is not limited thereto.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a porous nanocomposite according to an embodiment of the present application.
  • the porous nanocomposite 100 includes a core part 110 and a shell part 120 surrounding the core part 110.
  • the nanocomposite 100 may be a particle having a dual structure of a core-shell.
  • the nanocomposite may be prepared by preparing calcium carbonate particles to form a core, and bonding a biocompatible polymer to the core to form a shell surrounding the core.
  • core refers to a portion existing at the innermost side of the double structure
  • shell refers to the outermost portion of the double structure surrounding the core
  • wrap means that the outer circumferential surface of the particles is substantially covered, wherein the outer circumferential surface is formed to substantially cover, for example, 50% or more, 60% or more of the outer circumferential surface At least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%, or at least 99%.
  • the core portion 110 includes calcium carbonate.
  • the calcium carbonate is a biocompatible material and may be included in the core portion 110 of the porous nanocomposite 100 of the present application to effectively protect DNA, drugs, or other functional reagents from damage generated during gene transfection into target cells. have.
  • the shell part 120 surrounds the core part 110 and includes a material having biocompatibility and biodegradability and having antibacterial activity.
  • the shell portion 120 includes a biocompatible material.
  • the nanocomposite 100 of the present application has excellent biocompatibility and antimicrobial properties, and thus may be used as a carrier or transportation means in various biomedical fields.
  • a zwitterion material may be used as the biocompatible material.
  • the "cationic ionic material” refers to a material that is ionized in the electrolyte to be electrically positive and negative, and the zwitterionic material may have both a cationic functional group and an anionic functional group.
  • the amphoteric ionic material may be used without particular limitation so long as it has biocompatibility and has a cationic functional group and an anionic functional group.
  • the zwitterionic material is chitosan, 3- [N, N-dimethyl (3-myristoylaminopropyl) ammonio] propanesulfonate, 3-[(3-colamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate, 3-[(3-collamidepropyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate, N-decyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1- Propanesulfonate, N-dodecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, N-tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate, amidosul Forbetaine-16, 4-n-oct
  • the amphoteric ion chitosan may have a chitosan amine group as a cationic functional group and a succinic anhydride group as an anionic functional group.
  • the succinic anhydride group included in the amphoteric ion chitosan has excellent photoactivity to light having a wavelength of 300 nm or less, and thus, a shell having a porous structure can be formed by a simple process such as light irradiation.
  • amphoteric ion chitosan dissolves well even at neutral pH and can function usefully as a vehicle or carrier of the polymer in the human body.
  • the molar ratio of the anionic functional group to the cationic functional group in the zwitterionic material may be 0.05 to 0.95.
  • the molar ratio may be 0.1 to 0.9, 0.2 to 0.85, 0.25 to 0.8, or 0.3 to 0.7, preferably 0.6 to 0.7.
  • the amphoteric ionic material has a molar ratio of anionic functional groups to cationic functional groups in the above-mentioned range, so that the amphoteric ionic material reacts more sensitively to irradiation of light having a wavelength of 300 nm or less, and thus more easily in the shell portion.
  • the porous structure may be formed, and the total specific surface area of the nanocomposite may be increased by increasing the volume and diameter of the pores included in the shell portion.
  • the nanocomposite 100 of the present application may be a carrier or a carrier capable of efficiently delivering DNA, drugs, or other functional reagents. Can be used as a vehicle.
  • the shell portion has pores with an average diameter of 20 nm or less, for example, 18 nm or less, 16 nm or less, or 15 nm or less.
  • the lower the lower limit of the average diameter of the pores the larger the specific surface area and excellent transport capacity. Therefore, the lower limit is not particularly limited, but in view of manufacturability, 7 nm or more, 9 nm or more, 11 nm or more or 12 nm. It may be abnormal.
  • the specific surface area of the pores of the porous nanocomposite 100 of the present application is 50 m 2 / g to 1000 m 2 / g, for example 70 m 2 / g to 500 m 2 / g, 90 m 2 / g to 300 m 2 / g, 110 m 2 / g to 200 m 2 / g or 90 m 2 / g to 185 m 2 / g.
  • the said "specific surface area” means the surface area of the pores measured by the Brunauer-Emmett-Teller (BET) method, and means the total surface area per unit mass of the pores. As the specific surface area of the porous nanocomposite is adjusted within the above-mentioned range, the nanocomposite may have better transport capacity.
  • the pore volume of the porous nanocomposite 100 is 0.1 cm 3 / g to 1.5 cm 3 / g, for example, 0.2 cm 3 / g to 1.1 cm 3 / g, 0.3 cm 3 / g to 0.6 cm 3 / g or 0.34 cm 3 / g to 0.53 cm 3 / g.
  • the nanocomposite may have better transport capacity.
  • the porosity of the porous nanocomposite 100 of the present application may be 5% to 95%.
  • the porosity means a fraction of the volume occupied by the total pore with respect to the total volume of the nanocomposite.
  • the porosity of the porous nanocomposite may be 10% to 90%, 20% to 85%, 30% to 80%, or 40% to 75%, but is not limited thereto.
  • the nanocomposite may have better transport capacity.
  • the pores formed in the shell portion 120 of the porous nanocomposite 100 may include microporous and mesoporous.
  • the average diameter of the micropores may be less than 2 nm.
  • the average diameter of the micropores may be 0.001 nm to 2 nm, 0.01 nm to 2 nm, or 0.1 nm to 2 nm, but is not limited thereto.
  • the specific surface area of the micropores having an average diameter of less than 2 nm may be 2 m 2 / g to 100 m 2 / g.
  • the specific surface area of the micropores may be 10 m 2 / g to 70 m 2 / g, 20 m 2 / g to 40 m 2 / g or 28 m 2 / g to 39 m 2 / g, It is not limited to this.
  • the volume of the micropores having an average diameter of less than 2 nm may be 0.01 cm 3 / g to 0.5 cm 3 / g.
  • the volume of the micropores may be 0.015 cm 3 / g to 0.3 cm 3 / g, 0.02 cm 3 / g to 0.1 cm 3 / g or 0.025 cm 3 / g to 0.09 cm 3 / g, but It is not limited.
  • the average diameter of the mesopores may be 2 nm to less than 50 nm.
  • the average diameter of the mesopores may be 5 nm to 40 nm or 10 nm to 30 nm, but is not limited thereto.
  • the specific surface area of mesopores having an average diameter of 2 nm to less than 50 nm may be 50 m 2 / g to 500 m 2 / g.
  • the specific surface area of the mesopores is 60 m 2 / g to 400 m 2 / g, 70 m 2 / g to 300 m 2 / g, 80 m 2 / g to 200 m 2 / g, 90 m 2 / g to 150 m 2 / g or 95 m 2 / g to 145 m 2 / g, but is not limited thereto.
  • the volume of mesopores having an average diameter of less than 2 nm to 50 nm may be 0.05 cm 3 / g to 0.75 cm 3 / g.
  • the volume of the mesopores may be 0.1 cm 3 / g to 0.7 cm 3 / g, 0.2 cm 3 / g to 0.5 cm 3 / g or 0.3 cm 3 / g to 0.45 cm 3 / g, but It is not limited.
  • the average diameter of the porous nanocomposite 100 of the present application may be 50 nm to 500 nm.
  • the average diameter of the porous nanocomposite may be 100 nm to 300 nm, 150 nm to 200 nm, 160 nm to 180 nm, or 165 nm to 170 nm.
  • the biocompatible material may be included in an amount of 5 parts by weight to 95 parts by weight with respect to 100 parts by weight of calcium carbonate.
  • the biocompatible material may include 15 parts by weight to 85 parts by weight, 25 parts by weight to 75 parts by weight, or 35 parts by weight to 70 parts by weight with respect to 100 parts by weight of calcium carbonate, but is not limited thereto.
  • the centerline average roughness value of the surface of the nanocomposite 100 may be 0.5 nm to 50 nm.
  • the average roughness value of the surface of the nanocomposite 100 may be 1 nm to 40 nm, 2 nm to 30 nm, 3 nm to 20 nm, or 5 nm to 10 nm, but is not limited thereto.
  • the center line average roughness is measured under the standard of JIS B0031, JIS B0601 or ISO 468.
  • the present application also relates to a method for producing a porous nanocomposite.
  • the manufacturing method is a method for manufacturing the above-described porous nanocomposite, the details of the porous nanocomposite described below may be equally applicable to the contents described in the porous nanocomposite.
  • the method for preparing a porous nanocomposite of the present application includes a first spraying step, a second spraying step, and a light irradiation step.
  • the first spraying step is a step for forming calcium carbonate nanoparticles contained in the core portion of the nanocomposite described above, in the first spraying step, the calcium carbonate nanoparticles are a calcium carbonate precursor solution in the flow of carbon dioxide gas It is formed by spraying in the form of droplets.
  • the calcium carbonate precursor aqueous solution may be an aqueous calcium hydrogen carbonate solution in which calcium hydrogen carbonate is dissolved in water.
  • the manufacturing method of the present application may further include a drying step for drying the water.
  • the drying step may proceed until all the water is dried, and the drying step may be performed by any conventional drying method using a diffusion dryer, etc., it is not particularly limited.
  • the calcium carbonate nanoparticles formed in the first spraying step are moved according to the flow of carbon dioxide gas, and then the second spraying step may be performed.
  • the second spraying step is a step for forming the shell portion of the nanocomposite by attaching a biocompatible material to the calcium carbonate nanoparticles, in the second spraying step to the calcium carbonate nanoparticles formed in the first spraying step
  • the solution containing the biocompatible material is sprayed, thereby forming droplets containing the calcium carbonate nanoparticles to which the biocompatible material is attached.
  • the solution comprising the biocompatible material may be prepared by dissolving the aforementioned biocompatible material, for example, an amphoteric ionic material, in a solvent.
  • a solvent one or more selected from the group consisting of water, acetic acid, DMSO, dichloromethane, and oil may be used, and since the zwitterionic material is well dissolved in a solvent of neutral pH, Can be used as a solvent.
  • the solution containing the biocompatible material may be a solution in which the zwitterionic material, for example, zwitterionic chitosan is dissolved in water.
  • the second spraying step may be performed under the condition of flowing carbon dioxide gas.
  • the calcium carbonate nanoparticles formed in the first spraying step move along the carbon dioxide gas stream, and in the second spraying step, a solution containing the biocompatible material in the gas stream containing the calcium carbonate nanoparticles.
  • a solution containing the biocompatible material in the gas stream containing the calcium carbonate nanoparticles By spraying, droplets containing calcium carbonate nanoparticles having the biocompatible material attached thereto can be formed.
  • the droplets formed in the second spraying step may be moved according to the flow of carbon dioxide gas, and then the light irradiation step may be performed.
  • the light irradiation step is a step for making the shell portion of the nanocomposite into a porous structure, and in the light irradiation step, light can be irradiated to the calcium carbonate nanoparticles to which the biocompatible material formed in the second spraying step is attached.
  • the biocompatible material for example, the succinic anhydride group included in the amphoteric ion chitosan has excellent photoactivity to light having a wavelength of 300 nm or less, whereby, the shell of a porous structure can be formed by simple processes, such as light irradiation.
  • the light irradiated in the light irradiation step may be light having a wavelength of 300 nm or less, for example, light having a wavelength of 280 nm or less, 260 nm or less, or 250 nm or less, but is not limited thereto. .
  • the light irradiation step may be performed simultaneously with the solvent extraction step.
  • the solvent extraction step is a step of extracting a solvent from the droplet formed in the second spraying step, the step of extracting the solvent to remove completely.
  • the solvent extraction step may be carried out by heating the droplets at a temperature of 80 °C to 100 °C, for 1 minute to 3 minutes, for example, the heating temperature is 85 °C to 95 °C or 90 °C to 93 °C
  • the heating time may be 1.3 minutes to 1.9 minutes or 1.6 minutes to 1.8 minutes, but is not limited thereto.
  • the first spraying step, the second spraying step, the light irradiation step, and the solvent extraction step may be performed under the condition of flowing carbon dioxide gas.
  • the flow rate of the carbon dioxide gas stream may be controlled to 0.05 L / min to 50 L / min.
  • the flow rate of the carbon dioxide gas flow may be controlled to 0.5 L / min to 30 L / min, 1 L / min to 10 L / min or 2 L / min to 5 L / min, but is not limited thereto. no.
  • the present application also relates to an apparatus for producing a porous nanocomposite.
  • the manufacturing apparatus is a device for manufacturing the above-mentioned porous nanocomposite, the details of the porous nanocomposite and the method for producing the porous nanocomposite to be described later described in the porous nanocomposite and the manufacturing method of the porous nanocomposite This may apply equally.
  • the apparatus for manufacturing a porous nanocomposite includes a first spraying unit 210, a second spraying unit 220, and a light irradiation unit 230.
  • the first spraying unit 210 is a portion where the first spraying step for forming the above-described calcium carbonate nanoparticles is performed, the first spraying unit 210 is a calcium carbonate precursor solution in the carbon dioxide gas stream It may include a first spray device 211 for spraying.
  • a detailed description of the first spraying device 211 may be the same as described in the first spraying step of the method of manufacturing the porous nanocomposite, and thus the description thereof will be omitted.
  • Calcium carbonate nanoparticles formed in the first spraying unit 210 is present in the form of droplets containing water, as described above in the first spraying step of the method of manufacturing the porous nanocomposite, to remove the water It may further comprise a drying device.
  • a drying apparatus As the drying apparatus according to an embodiment, a diffusion dryer may be used.
  • the diffusion dryer may be filled with an absorption bed of an absorption-adsorption method including activated carbon and silica, and the droplets pass through the hollow of the extraction layer. The solvent can be extracted.
  • the second sprayer 220 is a portion in which the second spraying step for forming a droplet including the calcium carbonate nanoparticles to which the biocompatible material is attached is performed, and the second sprayer 220 is the carbonic acid. It may include a second spray device 221 for spraying a solution containing a biocompatible material to the calcium nanoparticles. A detailed description of the second spraying device 221 may be the same as described in the second spraying step of the method of manufacturing the porous nanocomposite, and thus the description thereof will be omitted.
  • the light irradiator 230 is a portion where the light irradiation step for forming the above-mentioned porous shell portion is performed, the light irradiator 230 may include a light source 231.
  • the light source 231 may be, for example, a UV lamp or the like as a light source capable of emitting light having a wavelength of 300 nm or less, but is not limited thereto.
  • the description of the light irradiation unit 230 may be the same as described in the light irradiation step of the method of manufacturing the porous nanocomposite, and thus will be omitted.
  • the first spraying unit 210, the second spraying unit 220, and the light irradiating unit 230 may be maintained under a condition in which carbon dioxide gas flows.
  • the detailed description of the conditions under which the carbon dioxide gas flows may be equally applicable to the description of the method of preparing the porous nanocomposite, and thus the description thereof will be omitted.
  • the light irradiator 230 may further include a solvent removing means.
  • the calcium carbonate nanoparticles to which the biocompatible material that reaches the light irradiation part 230 via the second spraying part 220 along the flow of carbon dioxide gas are present in the form of droplets. Therefore, the light irradiation unit 230 may further include a solvent removing means, the solvent removing means may be performed to remove the solvent at the same time as the light irradiation.
  • the extraction means may comprise an extraction means 232 or drying means.
  • the extraction means 232 may be an extraction furnace including an inlet portion 2321 and an outlet portion 2322, wherein an extraction solvent is included in the inlet portion 2321. Through the extraction means 232 may be introduced through, the outlet portion 2322 may be discharged the mixture extracted by the extraction solvent.
  • a drying means may be used as the solvent removing means.
  • a diffusion dryer may be used as the drying means, and a detailed description thereof will be omitted as it is the same as described above.
  • the porous nanocomposites of the present application are excellent in biocompatibility and can effectively protect DNA from damage generated during gene transfection into target cells, thereby effectively applying DNA, drugs or other functional reagents when applied to the biomedical field. It can also be delivered, and can also be coated on the implant fixture portion to suppress inflammation around the implant.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a porous nanocomposite according to an embodiment of the present application.
  • FIG. 2 is a view schematically showing a method for producing a porous nanocomposite of the present application.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing an apparatus for producing a porous nanocomposite of the present application.
  • FIG. 5 shows transmission electron microscope images of the porous nanocomposites of Examples 2 to 3 and the nanoparticles of Comparative Examples 1 to 3.
  • FIG. 5 shows transmission electron microscope images of the porous nanocomposites of Examples 2 to 3 and the nanoparticles of Comparative Examples 1 to 3.
  • FIG. 6 is a high magnification TEM image of morphological changes of the porous nanocomposites of Examples 2 and 3 when UV is not irradiated or when UV is irradiated.
  • FIG. 7 shows the surface tissue characteristics and scanning microscope images of the porous nanocomposites of Examples 2 and 3 at 77.4 K.
  • FIG. 8 shows TEM images of the nanocomposites of Comparative Examples 4 and 5.
  • FIG. 9 shows Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) spectra of porous nanocomposites of Examples 2 to 3 and nanoparticles of Comparative Examples 1 to 3.
  • FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy
  • Macrophage macrophage inflammatory proteins
  • LPS lipopolysaccharide
  • Cho-Cs cholesterol modified chitosan
  • MIP Inflammatory Protein
  • FIG. 12 is a graph showing fluorescence images and graphs showing in vitro gene transfection efficiencies of porous nanocomposites, lipofectamine and nanoparticles of Comparative Examples 2 to 3 of Examples 2 to 3.
  • FIG. 12 is a graph showing fluorescence images and graphs showing in vitro gene transfection efficiencies of porous nanocomposites, lipofectamine and nanoparticles of Comparative Examples 2 to 3 of Examples 2 to 3.
  • FIG. 12 is a graph showing fluorescence images and graphs showing in vitro gene transfection efficiencies of porous nanocomposites, lipofectamine and nanoparticles of Comparative Examples 2 to 3 of Examples 2 to 3.
  • FIG. 13 is an electrophoretic mobility shift experiment performed to confirm the formation of the porous nanocomposite and the complex of the gene with respect to the ratio of the porous nanocomposite: DNA of Example 3 used in the gene transfection test. The figure which showed the result.
  • FIG. 14 is a view exemplarily showing an implant in which the porous nanocomposite of the present application is coated on a fixture portion.
  • a calcium carbonate using a Diffusion Dryer filled with a collison sprayer having an orifice opening diameter of about 0.05 mm to 1 mm and a silica gel and activated carbon mixed in a mass ratio of about 1: 0 to 0.2: 0.8 (CC) Nanoparticles were prepared. More specifically, a pure carbon dioxide flow of 99.999% purity was passed through a mass flow meter (3810DS, Kofloc, Japan) to control the flow rate at a flow rate of 3 L / min. In addition, 0.2 g of calcium hydrogen carbonate [Ca (HCO 3 ) 2 ] solution dissolved in water was sprayed onto carbon dioxide gas to form a Droplet, which was then passed through a diffusion dryer to extract water.
  • a pure carbon dioxide flow of 99.999% purity was passed through a mass flow meter (3810DS, Kofloc, Japan) to control the flow rate at a flow rate of 3 L / min.
  • amphoteric ion chitosan (ZC) precursor solution with a molar ratio (An / Am) of succinic anhydride group to chitosan amine group was then sprayed directly onto the gas stream containing calcium carbonate (CC) particles.
  • the amphoteric ion chitosan / calcium carbonate hybrid droplets (ZC @ CC) thus prepared were irradiated with ultraviolet rays of 245 nm wavelength for 1.7 min residence time at an intensity of 760 ⁇ W / cm 2 and a wall temperature of 90 ° C. (LOT-ORIEL). , Germany) was subjected to a heated tubular reactor and solvent extraction was applied to the droplets simultaneously with light irradiation.
  • the residence time required in the tube furnace was calculated via the following general formula (1).
  • ⁇ is the time to saturate the gas into vapor from the evaporation of the droplet
  • D d is the diameter of the droplet
  • ⁇ v is the vapor diffusion coefficient
  • C (D d ) is the number concentration of the droplet.
  • FIG. 2 also shows 1 H NMR (Inova 300, Varian, US) spectra of ZC. Although not shown, for pure chitosan, approximately 2.6 ppm (-NHCOOCH 2 CH 2 COOH), 4.0 ppm [H- of N-acetyl glucosamine (GlcNAc), H3-H6 and glucosamine (GlcN) of GlcNAc] and 4.8 ppm (GlcN) Bands in the chemical shifts of H1).
  • ZC with a molar ratio (An / Am) of succinic anhydride group to chitosan amine group of 0.5 has an additional band at chemical shifts of about 3.15 ppm (H2 of GlcN) and 4.3 ppm (-NHCOCH 2 CH 2 COOH).
  • a porous nanocomposite was prepared in the same manner as in Example 1, except that an amphoteric ion chitosan (ZC) precursor solution having a molar ratio of succinic anhydride group to chitosan amine group was 0.3.
  • ZC amphoteric ion chitosan
  • a porous nanocomposite was prepared in the same manner as in Example 1, except that the amphoteric ion chitosan (ZC) precursor solution having a molar ratio of succinic anhydride group to chitosan amine group was 0.7.
  • ZC amphoteric ion chitosan
  • Amphoteric ion chitosan nanoparticles having an average particle diameter of 176.5 nm were prepared using an amphoteric ion chitosan (ZC) precursor having a molar ratio of 0.3 to an succinic anhydride group to the chitosan amine group used in Example 2.
  • ZC amphoteric ion chitosan
  • Amphoteric ion chitosan nanoparticles having an average particle diameter of 189.7 nm were prepared using an amphoteric ion chitosan (ZC) precursor having a molar ratio of 0.7 to a succinic anhydride group to the chitosan amine group used in Example 3.
  • ZC amphoteric ion chitosan
  • the nanocomposite was prepared in the same manner as in Example 1 except that the precursor solution in which pure chitosan (Polysciences) was dissolved instead of the amphoteric ion chitosan (ZC) precursor solution was sprayed onto the calcium carbonate particles.
  • the precursor solution in which pure chitosan (Polysciences) was dissolved instead of the amphoteric ion chitosan (ZC) precursor solution was sprayed onto the calcium carbonate particles.
  • a nanocomposite was prepared in the same manner as in Example 1 except that a precursor solution in which cholesterol-modified chitosan (Ch-Cs) was dissolved in place of the amphoteric ion chitosan (ZC) precursor solution was sprayed onto the calcium carbonate particles.
  • Ch-Cs cholesterol-modified chitosan
  • ZC amphoteric ion chitosan
  • the cholesterol modified chitosan (Ch-Cs) was prepared as follows. 1.2 g of chitosan oligosaccharide Lactate (Sigma-Aldrich, US) in 20 mL of dimethyl sulfoxide was added to 2.4 mL of triethylamine in 30 mL of dichloromethane. The reaction mixture was stirred for 30 minutes. To the mixture was added 340 mg of Cholesteryl Chloroformate in 10 mL of Dichloromethane and the reaction mixture was stirred for 3 days at room temperature. The mixture was concentrated under reduced pressure to precipitate the formed product by centrifugation.
  • amphoteric ion chitosan (ZC) precursor solutions with a molar ratio of succinic anhydride groups to chitosan amine groups of 0.7 0.1 mL of polyethyleneimine (PEI) was added to amphoteric ion chitosan (ZC) with a molar ratio of succinic anhydride to chitosan amines of 0.7.
  • PEI polyethyleneimine
  • the particle size distribution of the produced particles was determined by the Differential Mobility Analyzer (3081, TSI, US), Electrostatic Classifier (3080, TSI, US), Condensation Particle Counter (3776). , TSI, US) and a Soft X-ray Charger (4530, HCT, Korea) were used to measure the Mobility Particle Sizer (SMPS).
  • the SMPS system used to measure the Mobility Equivalent Diameter was operated for a sample flow rate of 0.3 L / min, Sheath Flow of 3.0 L / min, and Scan Time of 135 seconds (measurement). Range: 15.1 to 661.2 nm).
  • the mass (m) of the nanocomposites and nanoparticles prepared in Examples and Comparative Examples was measured using a microbalance (DV215CD, Ohaus, Switzerland), and also confirmed through the following general formula (2).
  • Q is the flow rate of carbon dioxide gas
  • t s is the sampling time
  • ⁇ (D p ) is the partial dust collection rate
  • C m (D p ) is the mass concentration of the particles.
  • TEM Transmission electron microscopy
  • FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy
  • the samples were prepared by physical filtration, i.e., a polyetrafluoroethylene (PTFE) media substrate (0.2 ⁇ m) by mechanical filtration mainly by diffusion of particles on the substrate surface. Pore size, diameter of 47 mm, 11807-47-N, Sartorius, Germany) and spectra were recorded on a Nicolet 6700 FTIR spectrometer (Thermo Electron, US). Spectra were obtained for samples ranging from 4000 to 400 cm ⁇ 1 in absorbance mode.
  • PTFE polyetrafluoroethylene
  • Zeta Potential of porous nanoparticles and plasmid DNA (pDNA) complexes was determined using a Zeta Potential Analyzer (Nano ZS-90, Malvern Instruments, UK). The particles were mixed with pDNA and incubated at room temperature for 30 minutes. The complex was then diluted to a suitable concentration in double deionized water. Zeta potential measurements were performed at 25 ° C. and calculated using software provided by the manufacturer.
  • the cytotoxicity of the porous nanocomposites of the examples was MTS (3- (4,5-dimethyl-thiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) 2H-tetra By helium cells).
  • Cells were incubated in 200 mL of Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM Carlsbad, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% relative humidity. Cells were seeded in 96-well Microtiter Plate (Nunc, Germany) at a density of 1 ⁇ 10 5 cell / well.
  • DMEM Carlsbad, USA Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the culture medium was replaced with Serum Supplemented Culture Media containing 1 mg / mL of the porous nanocomposite of the example and the cells were incubated for 24 hours. Then 30 ⁇ L of MTS reagent was added to each well. The cells were incubated for an additional 2 hours. The absorbance was then measured using a Microplate Reader (Spectra Plus, TECAN, Switzerland) at a wavelength of 490 nm. Cell viability (%) was compared to untreated comparative cells in media without the porous nanocomposites of the examples and calculated by the following general formula (3).
  • test [A] is the absorbance of the well with the nanocomposite
  • the [A] control is the absorbance of the comparative wells.
  • the transfection performance of the Hila cells of the porous nanocomposite of Example was measured using pDNA including Firefly Luciferase and GFP gene.
  • Cells were seeded in 24-well plates in RMPI 1640 medium (Gifco, USA) containing 10% FBS at a density of 1 ⁇ 10 6 cells / well and 80 before transfection. Grow to reach percent fusion. Prior to the transfection, the medium was exchanged with fresh medium containing 10% FBS. Cells were treated with the porous nanocomposite solution of Example containing 2 ⁇ g of pDNA for 4 hours at 37 ° C. and the final volume was adjusted to 500 ⁇ L by medium. After exchange with fresh medium containing 10% FBS, cells were further oriented for 48 hours.
  • Peritoneal Macrophages were seeded in 24-well plates at a density of 10 5 cells per well in 1 mL of medium. After one day orientation, 0.1 mL of Janus particle solution was injected into each well to adjust the particle concentration in the medium to 2 mg / mL. For comparison purposes, 0.1 mL of polyethyleneimine (PEI, 765090, Sigma-Aldrich, USA), poly-1-lysine (PLL, P4707, Sigma-Aldrich, USA) or polyethylene glycol (PEG, 81188, Sigma-Aldrich, USA) ) was injected into the Collison nebulizer instead of the amphoteric ion chitosan precursor solution.
  • PEI polyethyleneimine
  • PLL poly-1-lysine
  • PEG polyethylene glycol
  • the culture medium was centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes to separate the supernatants.
  • Macrophages were induced by adding lipopolysaccharide (LPS) to media at a final concentration of 1 ⁇ g / mL immediately before comparison.
  • Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) was performed to determine MIP levels using the MIP-2 ELISA kit (R & D Systems, USA). Supernatants collected from LPS-induced macrophages were always diluted 10 times before analysis. The difference was considered significant at p ⁇ 0.01.
  • the gene condensation capacity of the porous nanocomposites of Examples 2 to 3 under different weight ratios was found to be 242 g of tris-acetate-ethylenediaminetetraacetic acid buffer (Tris) containing 0.5 ⁇ g / mL of Ethidium Bromide. 57.1 mL glacial acetic acid and 0.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0) were analyzed by 1% agarose gel electrophoresis.
  • the porous nanocomposites of the examples and the complexes containing the genes in different weight ratios were prepared by mixing, vortexing, and incubating for 30 minutes at room temperature. About 100 ng of each of the complexes was charged to an agarose gel.
  • the particles were analyzed using a moving particle scanning sizer (3936, TSI, US), and the average diameter, standard deviation, and number of the porous nanocomposites.
  • each concentration is 169.2 nm, 1.71 and 1.74 ⁇ 10 6 cm - was three.
  • the diameter, standard deviation and number concentration of the pure calcium carbonate nanoparticles were 74.7 nm, 1.73 and 4.94 ⁇ 10 6 cm -3 , respectively, and the amphoteric ion chitosan nano having a molar ratio of succinic anhydride group to the chitosan amine group of Comparative Example 2 was 0.3.
  • the mass fraction of calcium carbonate (CC) and zwitterionic chitosan (ZC) in the porous nanocomposites of Examples 2 and 3 was obtained using a Piezobalance Particle Monitor (3522, Kanomax, Japan). And the porous nanocomposites of Example 2 were 0.71 and 0.29, respectively, and the porous nanocomposites of Example 3 were 0.68 and 0.32, respectively.
  • FIG. 5 shows transmission electron microscope images of porous nanocomposites of Examples 2 to 3 and nanoparticles of Comparative Examples 1 to 3.
  • FIG. 5 shows transmission electron microscope images of porous nanocomposites of Examples 2 to 3 and nanoparticles of Comparative Examples 1 to 3.
  • Encapsulation efficiency of the amphoteric ion chitosan of the calcium carbonate particles of the porous nanocomposites of Examples 2 and 3 was 97.9% and 98.7%, respectively.
  • the average diameter of the pure calcium carbonate nanoparticles of Comparative Example 1 was 72 ⁇ 5.1 nm, and the average diameter of the amphoteric ion chitosan nanoparticles of Comparative Example 2 was 171 ⁇ 9.3 nm.
  • the average diameter of the porous nanocomposites of Examples 2 and 3 was 166 ⁇ 9.1 nm, which is consistent with the data shown in FIG. 4 and Table 1 above.
  • FIG. 6 shows a high-magnification TEM image when no UV is irradiated or UV irradiated in a heated tubular reactor, which is obtained through photo-derived transformation of the amphoteric ion chitosan component on the calcium carbonate particles in the gas phase.
  • the morphological changes of the porous nanocomposites of Examples 2 and 3 are supported.
  • FIG. 7 shows surface tissue characteristics and scanning microscopy images of the porous nanocomposites of Examples 2 and 3 at 77.4 K.
  • the adsorbed volume first increased from 0 to 0.05 at relative pressure (P / P 0 ), which is associated with the rapid adsorption of the micropores of the porous nanocomposite.
  • the adsorbed volume then slowly increased from P / P 0 to 0.05 to 0.85 due to capillary suction in the mesopores of the porous nanocomposite.
  • the adsorbed volume increased significantly from 0.9 to 0.99 due to strong capillary condensation.
  • Table 2 below shows surface tissue properties such as surface area (SA), pore volume (PV) and diameter of the porous nanocomposites of Examples 2 and 3.
  • FIG. 8 shows that the morphology of the calcium carbonate particles is in elliptical form, while pure chitosan (Cs) and cholesterol-chitosan (Ch-Cs) particles exhibit similar spherical shapes with smooth surfaces and are separated from each other. It was. As calcium carbonate particles pass through the orifice of the nebulizer, the calcium carbonate particles are encapsulated by pure chitosan or cholesterol-chitosan particles because of the gas pressurization system.
  • FIG. 9 shows Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) spectra of porous nanocomposites of Examples 2 to 3 and nanoparticles of Comparative Examples 1 to 3.
  • FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy
  • ZC zwitterionic chitosan
  • FIG. 9 shows a dominant band at 1540 cm ⁇ 1 , which indicates the bending vibration of NH amide (Amide II) due to the presence of N- Succinylation. Bending Vibration).
  • the spectra show typical absorption bands at 3360 cm ⁇ 1 , 2920 cm ⁇ 1 , 2880 cm ⁇ 1 , 1680 cm ⁇ 1, and 1360 cm ⁇ 1 , respectively, which represent the —OH group, —CH 2 group, — CH 3 group, amide I group and amide III group.
  • the peak at 1440 cm ⁇ 1 is due to the carbonate group, indicating that the crystal of calcium carbonate (CC) is calcite.
  • ZC amphoteric ion chitosan
  • zeta potentials of the porous nanocomposites of Examples 2 to 3 and the pDNA complexes or the nanoparticles of Comparative Examples 1 to 3 and pDNAs are shown in Table 3 below. As shown in Table 3, there was no significant difference between the zeta potentials of Comparative Examples 2 and 3 using pure zwitterionic ion chitosan (ZC) particles and Examples 2 and 3 using porous nanocomposites, which showed Merging surface It does not affect the surface chemistry.
  • ZC pure zwitterionic ion chitosan
  • FIG. 11 shows macrophage inflammatory protein (Macrophage Inflammatory) from lipopolysaccharide (LPS) -derived macrophages of unmodified chitosan (Cs) and cholesterol modified chitosan (Ch-Cs) with the porous nanocomposites of Examples 2 and 3 Protein, MIP) is a graph comparing the degree of inhibition of production.
  • the results in FIG. 11 show that the porous nanocomposites of Examples 2 and 3 were derived from lipopolysaccharide (LPS) -derived macrophages than the unmodified chitosan (Cs) and cholesterol modified chitosan (Ch-Cs) shown in FIG. 8.
  • Macrophage Inflammatory Protein (MIP) production can be significantly inhibited.
  • FIG. 12 shows GFP-derived fluorescence images of Hila cells for lipofectamine or porous nanocomposites of Examples 2 and 3 of 50: 1, between lipofectamine and porous nanocomposites of Examples 2 and 3 The transfection and similarity of was further confirmed.
  • the porous nanocomposite of Example 3 compared to the porous nanocomposite of Example 2 Greater transfection capacity in Es may also result from greater porosity.
  • the control of size and porosity like the toxic / inflammatory response, allows for efficient gene / drug delivery applications without increasing the ratio of nanocomposite: DNA. It's going on.
  • FIG. 13 shows an electrophoretic mobility shift experiment performed to confirm the formation of the porous nanocomposite and the complex of the gene in relation to the ratio of the porous nanocomposite: DNA of Example 3 used in the gene transfection test.
  • lane 1 is pDNA
  • lanes 2 to 5 have a porous nanocomposite: pDNA mass ratio of 5: 1, 10: 1, 20: 1 and 50: 1, respectively
  • lane 6 Shows the case of lipofectamine.
  • the 50: 1 ratio was more effective for gene binding than the other ratio.
  • this is consistent with gene transfection test results and indicated significant gene isolation from the combination, as capillary inhalation of the nanocomposites to carry genes at smaller rates was not sufficient.
  • a continuous gas phase process was performed under UV irradiation, and a biocompatible amphoteric ion chitosan-calcium carbonate porous nanocomposite was prepared.
  • These porous nanocomposites with photoinduced modifications have been used in vitro experiments of biocompatibility and transfection efficiency.
  • the average diameter of the porous nanocomposites was about 166 nm (72 nm calcium carbonate and 171 nm amphoteric ion chitosan), and the porous nanocomposites had mesoporous structures, for example, with an average pore diameter of about 13 nm. .
  • the pure calcium carbonate nanoparticles of Comparative Example 1 having a minimum cell viability of about 75% and the porous nanocomposites of the Example having a minimum cell viability of about 78% were comparative examples having a minimum cell viability of about 80%. It showed slightly higher cytotoxicity than pure chitosan nanoparticles of 2 and 3.
  • the porous nanocomposites of Examples 2 and 3 reached a transducing ability similar to lipofectamine of 2.7 ⁇ 10 9 RLU / mg or less of the positive control at a weight ratio of porous nanocomposite: DNA of 50: 1 due to the porous structure. to be.
  • porous nanocomposites of Examples 2 and 3 showed a significant improvement in gene transfection ability compared to the pure chitosan nanoparticles of Comparative Examples 2 and 3.
  • the nanocomposite 100 of the present application may be coated on an implant fixture portion in order to suppress inflammation around the implant.

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Abstract

본 출원은, 다공성 나노 복합체, 이의 제조 방법 및 이의 제조 장치에 관한 것으로, 본 출원의 다공성 나노 복합체에 의하면 생체 적합성이 우수하고, 표적 세포에 유전자 형질 주입 동안 발생되는 손상으로부터 DNA를 효과적으로 보호할 수 있어, DNA, 약물 또는 기타 기능성 시약을 효율적으로 전달할 수 있고, 또한, 상기 나노 복합체는 임플란트 주위의 염증을 억제하기 위하여 임플란트 픽스쳐(Implant Fixture) 부분에 코팅될 수 있다.

Description

다공성 나노 복합체
본 출원은, 다공성 나노 복합체, 이의 제조 방법 및 이의 제조 장치에 관한 것이다.
최근, 에너지 저장, 생물 의학, 마이크로 및 나노 전자 기술 등, 다양한 기술 분야에서 기능성 물질 및 장치로서, 원하는 크기, 모양, 그리고, 물리화학적 및 광학적 특성을 효율적으로 사용하기 위한 유기 및 무기 성분으로 이루어진 하이브리드 나노 물질을 제조하기 위하여 다양한 접근 방식이 이용되어 왔다. 따라서, 적절한 기능과 잘 구조화된 하이브리드 나노 물질을 제조하기 위하여, 다기능이고, 조정이 가능하며, 효율적인 전략을 찾는 것은, 특히, 나노과학 및 나노공학 물질 기술에 직면하는 매우 중요한 문제이다. 생물 의학 적용에 있어서, DNA, 약물 또는 기타 기능성 시약의 효율적인 전달을 위하여 나노 스폰지로부터 형성할 수 있는 다공성 디자인, 생체적합성 나노플랫폼(Nanoplatform)은 많은 관심 영역이다.
탄산칼슘(CaCO3)(CC)이 기반된 무기-유기 하이브리드 입자는 생체적합성이 있고, 표적 세포로 유전자 형질 주입 동안 발생되는 손상으로부터 DNA를 효과적으로 보호하는데 적합한 독특한 구조를 갖는다. 탄산칼슘은 바위, 달걀 껍질 및 해양 유기체의 껍질 등 천연 제품의 범위에 존재하는 일반적인 물질이다. 산업 분야에 관하여, 탄산칼슘 입자는 플라스틱, 고무, 페인트 등 다양한 혼합 화합물에 대한 필러로서 사용된다. 키토산은 우수한 생체적합성, 생분해성 및 항균 활성을 가진 또 다른 풍부한 천연 화합물이며, 상기 키토산은 현재 다양한 생물 의학 분야에 대한 담체 또는 운송 수단으로서, 집중적으로 사용되었다. 또한, 탄산칼슘 및 키토산의 조합은 생물 의학 분야에 사용하기 위한 강한 잠재력을 가질 수 있다. 그러나, 생물 의학 분야에 사용하기 위한 탄산칼슘-키토산 하이브리드 나노 구조의 제조는 아직 보고되지 않고 있다.
본 출원은, 생체 적합성이 우수하고, 표적 세포에 유전자 형질 주입 동안 발생되는 손상으로부터 DNA를 효과적으로 보호할 수 있어, DNA, 약물 또는 기타 기능성 시약의 효율적인 전달을 할 수 있고, 또한, 임플란트 주위의 염증을 억제하기 위한 임플란트 픽스쳐(Implant Fixture) 부분에 코팅될 수 있는 다공성 나노 복합체, 이의 제조 방법 및 이의 제조 장치를 제공한다.
본 출원은 다공성 나노 복합체에 관한 것이다. 예시적인 본 출원의 다공성 나노 복합체는, 코어부에 탄산칼슘을 포함하고, 쉘부에 생체 적합성 물질을 포함하며, 상기 쉘부에 기공이 형성되어 있는 다공성 구조를 가짐으로써, 생체 적합성이 우수하고, 표적 세포에 유전자 형질 주입 동안 발생되는 손상으로부터 DNA를 효과적으로 보호할 수 있어, DNA, 약물 또는 기타 기능성 시약을 효율적으로 전달할 수 있고, 또한, 임플란트 주위의 염증을 억제하기 위하여 임플란트 픽스쳐(Implant Fixture) 부분에 코팅될 수 있는 다공성 나노 복합체를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 용어 「나노」는 나노 미터(nm) 단위의 크기를 의미할 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1,000 nm의 크기를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 용어 「나노 복합체」는 나노 미터(nm) 단위의 평균 직경을 가지며, 2 종류 이상의 물질을 조합한 복합 물질로써 물리적 또는 화학적으로 원래 소재와는 다른 우수한 기능을 갖는 물질을 의미할 수 있고, 예를 들어, 1 내지 1,000 nm의 평균 직경을 갖는 복합체를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 첨부된 도면을 참조로 본 출원의 다공성 나노 복합체, 상기 복합체의 제조 방법 및 제조장치를 설명하나, 첨부된 도면은 예시적인 것으로, 본 출원의 범위가 첨부된 도면에 한정되는 것은 아니다.
도 1은, 본 출원의 일 구현예에 따른 다공성 나노 복합체를 예시적으로 나타낸 도면이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 출원의 일 구현예에 따른 다공성 나노 복합체(100)는 코어부(110) 및 상기 코어부(110)를 둘러싸고 있는 쉘부(120)를 포함한다. 하나의 예시에서 상기 나노 복합체(100)는 코어-쉘의 2중 구조를 가지는 입자일 수 있다. 예를 들면, 상기 나노 복합체는 탄산칼슘 입자를 제조하여 코어를 형성하며, 상기 코어에 생체 적합성 고분자를 결합시켜 상기 코어를 둘러싸는 쉘을 형성함으로써 제조된 것일 수 있다.
상기에서 「코어」는 상기 2중 구조의 가장 내측에 존재하는 부분을 의미하며, 상기 「쉘」은 상기 코어를 둘러싸며 상기 2중 구조의 최 외측 부분을 의미한다.
또한, 상기에서 「둘러싼다」는 입자의 외주 표면이 실질적으로 덮이도록 형성되는 것을 의미하며, 상기에서 외주 표면이 실질적으로 덮이도록 형성되는 것은 예를 들면, 외주 표면의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상이 덮이도록 형성되는 것을 의미한다.
상기 코어부(110)는, 탄산칼슘을 포함한다. 상기 탄산칼슘은 생체 적합성 재료이며, 표적 세포로 유전자 형질 주입 동안 발생되는 손상으로부터 DNA, 약물 또는 기타 기능성 시약을 효과적으로 보호하기 위하여 본 출원의 다공성 나노 복합체(100)의 코어부(110)에 포함될 수 있다.
상기 쉘부(120)는 상기 코어부(110)를 둘러싸고 있으며, 생체 적합성 및 생분해성을 갖고, 항균 활성을 가진 물질을 포함한다. 예를 들어, 상기 쉘부(120)는 생체 적합성 물질을 포함한다. 상기 쉘부(120)가 생체 적합성 물질을 포함함에 따라, 본 출원의 나노 복합체(100)는 우수한 생체 적합성 및 항균성을 가지므로, 다양한 생물 의학 분야에서 담체 또는 운송 수단으로 사용될 수 있다.
하나의 예시로서, 상기 생체 적합성 물질의 종류로는, 양쪽성 이온(Zwitterion) 물질을 사용할 수 있다. 상기 「양쪽성 이온 물질」은 전해질 내에서 이온화되어 전기적으로 양성과 음성을 모두 나타내는 물질을 의미하며, 상기 양쪽성 이온 물질은 양이온성 작용기 및 음이온성 작용기를 모두 가질 수 있다.
상기 양쪽성 이온 물질로는 생체 적합성을 가지며, 양이온성 작용기 및 음이온성 작용기를 가지는 것이라면, 특별한 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 양쪽성 이온 물질은 키토산, 3-[N,N-디메틸(3-미리스토일아미노프로필)암모니오]프로판설포네이트, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트, 3-[(3-콜라미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판설포네이트, N-데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 아미도설포베타인-16, 4-n-옥틸벤조일아미도-프로필-디메틸암모니오설포베타인, 3-(1-피리디노)-1-프로판 설포네이트, 설포베타인 메타크릴레이트, 카르복시베타인 메타크릴레이트, 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린, 티로신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 트립토판, 발린, 히스티딘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있고, 바람직하게는, 상기 양쪽성 이온 물질은 양쪽성 이온 키토산(Zwitterionic chitosan, ZC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 양쪽성 이온 키토산은 키토산 아민기를 양이온성 작용기로 가지고, 숙신산 무수물기를 음이온성 작용기로 가질 수 있다. 상기 양쪽성 이온 키토산에 포함되는 숙신산 무수물기는 300 nm 이하의 파장의 빛에 대한 우수한 광활성을 가지며, 이에 따라 광 조사 등의 간단한 공정에 의하여, 다공성 구조의 쉘을 형성할 수 있다. 나아가 양쪽성 이온 키토산은 중성 pH에서도 잘 용해되며, 인체 내에서 고분자의 운송 수단 또는 담체로서 유용하게 작용할 수 있다.
또한, 상기 양쪽성 이온 물질 내의 양이온성 작용기에 대한 음이온성 작용기의 몰비는 0.05 내지 0.95일 수 있다. 예를 들어, 상기 몰비는 0.1 내지 0.9, 0.2 내지 0.85, 0.25 내지 0.8, 또는 0.3 내지 0.7, 바람직하게는 0.6 내지 0.7일 수 있다. 상기 양쪽성 이온 물질은 전술한 범위 내의 양이온성 작용기에 대한 음이온성 작용기의 몰비를 가짐으로써, 상기 양쪽성 이온 물질은 300 nm 이하의 파장의 광의 조사에 보다 민감하게 반응하므로, 보다 용이하게 쉘부의 다공성 구조를 형성할 수 있으며, 상기 쉘부에 포함되는 기공의 부피 및 직경을 증가시켜, 나노 복합체의 전체 비표면적을 증가시킬 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 쉘부(120)는 다공성 구조를 가지며, 이에 따라, 큰 비표면적을 가지므로, 본 출원의 나노 복합체(100)는 DNA, 약물 또는 기타 기능성 시약을 효율적으로 전달할 수 있는 담체 또는 운송 수단으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 쉘부에는 평균 직경이 20 nm 이하, 예를 들어, 18 nm 이하, 16 nm 이하 또는 15 nm이하의 기공이 형성되어 있다. 상기 기공의 평균 직경의 하한 값이 작을수록 비표면적이 커져 우수한 운송 능력을 가지므로, 하한 값은 특별히 제한되는 것은 아니나, 제조 가능성 측면에서, 7 nm 이상, 9 nm 이상, 11 nm 이상 또는 12 nm 이상일 수 있다.
하나의 예시에서, 본 출원의 다공성 나노 복합체(100)의 기공의 비표면적은 50 m2/g 내지 1000 m2/g, 예를 들면, 70 m2/g 내지 500 m2/g, 90 m2/g 내지 300 m2/g, 110 m2/g 내지 200 m2/g 또는 90 m2/g 내지 185 m2/g일 수 있다. 상기 「비표면적」은 BET(Brunauer-Emmett-Teller) 법으로 측정된 기공의 표면적으로서, 기공의 단위 질량당 전 표면적을 의미한다. 상기 다공성 나노 복합체의 비표면적이 전술한 범위 내로 조절됨에 따라, 상기 나노 복합체는 보다 우수한 운송 능력을 가질 수 있다.
상기 다공성 나노 복합체(100)의 기공의 부피는 0.1 cm3/g 내지 1.5 cm3/g, 예를 들면, 0.2 cm3/g 내지 1.1 cm3/g, 0.3 cm3/g 내지 0.6 cm3/g 또는 0.34 cm3/g 내지 0.53 cm3/g일 수 있다. 마찬가지로, 상기 다공성 나노 복합체의 기공 부피가 전술한 범위 내로 조절됨에 따라, 상기 나노 복합체는 보다 우수한 운송 능력을 가질 수 있다.
상기 본 출원의 다공성 나노 복합체(100)의 공극률은 5% 내지 95%일 수 있다. 상기 공극률은 나노 복합체 전체 부피에 대한 전체 기공이 차지하는 부피의 분율을 의미한다. 예를 들어, 상기 다공성 나노 복합체의 공극률은 10% 내지 90%, 20% 내지 85%, 30% 내지 80% 또는 40% 내지 75%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 다공성 나노 복합체의 공극률이 전술한 범위 내로 조절됨에 따라, 상기 나노 복합체는 보다 우수한 운송 능력을 가질 수 있다.
상기 다공성 나노 복합체(100)의 쉘부(120)에 형성된 기공은 미세 기공(Microporous) 및 메조 기공(Mesoporous)을 포함할 수 있다.
하나의 예시에서, 상기 미세 기공의 평균 직경은 2 nm 미만일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세 기공의 평균 직경은 0.001 nm 내지 2 nm, 0.01 nm 내지 2 nm 또는 0.1 nm 내지 2 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 평균 직경이 2 nm 미만의 미세 기공의 비표면적은 2 m2/g 내지 100 m2/g일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세 기공의 비표면적은 10 m2/g 내지 70 m2/g, 20 m2/g 내지 40 m2/g 또는 28 m2/g 내지 39 m2/g일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 평균 직경이 2 nm 미만의 미세 기공의 부피는 0.01 cm3/g 내지 0.5 cm3/g일 수 있다. 예를 들어, 상기 미세 기공의 부피는 0.015 cm3/g 내지 0.3 cm3/g, 0.02 cm3/g 내지 0.1 cm3/g 또는 0.025 cm3/g 내지 0.09 cm3/g일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 예시에서, 상기 메조 기공의 평균 직경은 2 nm 내지 50 nm 미만일 수 있다. 예를 들어, 상기 메조 기공의 평균 직경은 5 nm 내지 40 nm 또는 10 nm 내지 30 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 평균 직경이 2 nm 내지 50 nm 미만의 메조 기공의 비표면적은 50 m2/g 내지 500 m2/g일 수 있다. 예를 들어, 상기 메조 기공의 비표면적은 60 m2/g 내지 400 m2/g, 70 m2/g 내지 300 m2/g, 80 m2/g 내지 200 m2/g, 90 m2/g 내지 150 m2/g 또는 95 m2/g 내지 145 m2/g 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 평균 직경이 2 nm 내지 50 nm 미만의 메조 기공의 부피는 0.05 cm3/g 내지 0.75 cm3/g일 수 있다. 예를 들어, 상기 메조 기공의 부피는 0.1 cm3/g 내지 0.7 cm3/g, 0.2 cm3/g 내지 0.5 cm3/g 또는 0.3 cm3/g 내지 0.45 cm3/g일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 예시에서, 본 출원의 다공성 나노 복합체(100)의 평균직경은 50 nm 내지 500 nm일 수 있다. 예를 들어, 상기 다공성 나노 복합체의 평균직경은 100 nm 내지 300 nm, 150 nm 내지 200 nm, 160 nm 내지 180 nm 또는 165 nm 내지 170 nm일 수 있다.
상기 생체 적합성 물질은 탄산칼슘 100 중량부 대비 5 중량부 내지 95 중량부로 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 생체 적합성 물질은 탄산칼슘 100 중량부 대비 15 중량부 내지 85 중량부, 25 중량부 내지 75 중량부 또는 35 중량부 내지 70 중량부로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 예시에서, 상기 나노 복합체(100)의 쉘부(120)는 다공성 구조를 가지므로, 상기 나노 복합체(100) 표면의 중심선 평균 거칠기 값은 0.5 nm 내지 50 nm일 수 있다. 예를 들어, 상기 나노 복합체(100) 표면의 평균 거칠기 값은 1 nm 내지 40 nm, 2 nm 내지 30 nm, 3 nm 내지 20 nm 또는 5 nm 내지 10 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기에서, 중심선 평균 거칠기는, 거칠기 곡선에서 평균선의 방향으로 기준 길이 L만큼 추출하여, 추출한 부분의 평균선 방향을 X축으로 하고, 높이 방향을 Y축으로 하여, 거칠기 곡선을 함수 y = f(x)로 표시 하였을 때 하기 수학식 1로 구할 수 있는 값을 마이크로 미터(㎛) 또는 나노 미터(nm)로 나타낸 것을 의미한다. 상기 중심선 평균 거칠기는, JIS B0031, JIS B0601 또는 ISO 468의 규격 하에서 측정된다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2016015238-appb-I000001
본 출원은 또한, 다공성 나노 복합체의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 제조 방법은, 전술한 다공성 나노 복합체를 제조하기 위한 방법으로서, 후술하는 다공성 나노 복합체에 대한 구체적인 사항은 다공성 나노 복합체에서 기술한 내용이 동일하게 적용될 수 있다.
도 2는 본 출원의 다공성 나노 복합체의 제조 방법을 모식적으로 나타낸 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 출원의 다공성 나노 복합체의 제조 방법은 제 1 분무 단계, 제 2 분무 단계 및 광 조사 단계를 포함한다.
상기 제 1 분무 단계는 전술한 나노 복합체의 코어부에 포함되는 탄산칼슘 나노입자를 형성하기 위한 단계로서, 상기 제 1 분무 단계에서, 상기 탄산칼슘 나노입자는 이산화탄소 기체의 흐름에 탄산칼슘 전구체 수용액을 액적 형태로 분무하여 형성된다.
상기 탄산칼슘 전구체 수용액은 탄산수소칼슘이 물에 용해된 탄산수소칼슘 수용액일 수 있다.
상기 제 1 분무 단계를 통하여, 탄산칼슘 전구체 수용액을 이산화탄소 기체의 흐름에 분무하면, 상기 전구체 수용액 액적에 이산화탄소가 용해되어 하기 반응식 1의 반응이 일어나며, 상기 반응 중에 상기 탄산수소칼슘이 탄산칼슘으로 전환되면서 탄산칼슘 나노 입자가 형성될 수 있다.
[반응식 1]
Ca(HCO3)2 + H2O → Ca(OH)2 + CO2
Ca(OH)2 + CO2 → CaCO3 + H2O
상기 제 1 분무 단계에서 형성된 탄산칼슘 나노입자는 물을 포함하는 액적(Droplet) 형태로 존재하기 때문에, 본 출원의 제조 방법은 상기 물을 건조시키기 위한 건조 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 건조 단계는 상기 물이 모두 건조될 때까지 진행될 수 있으며, 상기 건조 단계는 확산 건조기 등을 이용한 통상적인 모든 건조방법에 의해 수행될 수 있으므로, 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 제 1 분무 단계에서 형성된 탄산칼슘 나노입자는, 이산화 탄소 기체의 흐름에 따라 이동하며, 이 후 제 2 분무 단계가 수행될 수 있다.
상기 제 2 분무 단계는, 상기 탄산칼슘 나노입자에 생체 적합성 물질을 부착하여 전술한 나노 복합체의 쉘부를 형성하기 위한 단계로서, 상기 제 2 분무 단계에서는 상기 제 1 분무 단계에서 형성된 탄산칼슘 나노입자에 상기 생체 적합성 물질을 포함하는 용액이 분무되며, 이에 따라 상기 생체 적합성 물질이 부착된 탄산칼슘 나노입자를 포함하는 액적이 형성된다.
상기 생체 적합성 물질을 포함하는 용액은 용매 내에 전술한 생체 적합성 물질, 예를 들어, 양쪽성 이온 물질을 용해시켜 제조될 수 있다. 상기 용매로는 물, 초산, DMSO, 디클로로메탄(Dichloromethane) 및 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 상기 양쪽성 이온 물질은 중성 pH의 용매에도 잘 녹으므로, 바람직하게는 물을 용매로 사용할 수 있다. 하나의 예시에서, 상기 생체 적합성 물질을 포함하는 용액은 물에 양쪽성 이온 물질, 예를 들면 양쪽성 이온 키토산이 용해된 용액일 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 제 2 분무 단계도 제 1 분무 단계와 마찬가지로, 이산화탄소 기체가 흐르는 조건 하에 진행될 수 있다. 예를 들어, 상기 제 1 분무 단계에서 형성된 탄산칼슘 나노입자는 이산화탄소 기체 흐름을 따라 이동하며, 상기 제 2 분무 단계에서는, 상기 탄산칼슘 나노입자를 함유하는 기체 흐름에 상기 생체 적합성 물질을 포함하는 용액을 분무함으로써, 상기 생체 적합성 물질이 부착된 탄산칼슘 나노입자를 포함하는 액적이 형성될 수 있다.
상기 제 2 분무 단계에서 형성된 액적은 이산화 탄소 기체의 흐름에 따라 이동하며, 이 후 광 조사 단계가 수행될 수 있다.
상기 광 조사 단계는 나노 복합체의 쉘부를 다공성 구조로 만들기 위한 단계로서, 광 조사 단계에서는, 상기 제 2 분무 단계에서 형성된 생체 적합성 물질이 부착된 탄산칼슘 나노입자에 광을 조사할 수 있다.
상기 생체 적합성 물질이 부착된 탄산칼슘 나노입자에 광을 조사하면, 상기 생체 적합성 물질, 예를 들어, 양쪽성 이온 키토산에 포함되는 숙신산 무수물기는 300 nm 이하의 파장의 빛에 대한 우수한 광활성을 가지며, 이에 따라 광 조사 등의 간단한 공정에 의하여, 다공성 구조의 쉘을 형성할 수 있다.
상기 광 조사 단계에서 조사되는 광은 300 nm 이하의 파장의 빛일 수 있으며, 예를 들어, 280 nm 이하, 260 nm 이하 또는 250 nm 이하의 파장을 가지는 빛을 조사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 예시에서, 상기 광 조사 단계는 용매 추출 단계와 동시에 수행될 수 있다.
상기 용매 추출 단계는 상기 제 2 분무 단계에서 형성된 액적으로부터 용매를 추출하는 단계로서, 상기 용매를 추출하여 완전히 제거하기 위한 단계이다. 상기 용매 추출 단계는 상기 액적을 80℃ 내지 100℃의 온도에서, 1분 내지 3분 동안 가열하여 수행될 수 있으며, 예를 들어, 상기 가열 온도는 85℃ 내지 95℃ 또는 90℃ 내지 93℃일 수 있고, 상기 가열 시간은 1.3분 내지 1.9분 또는 1.6분 내지 1.8분일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 바와 같이, 상기 제 1 분무 단계, 제 2 분무 단계, 광 조사 단계 및 용매 추출 단계는 이산화탄소 기체가 흐르는 조건 하에 진행될 수 있다. 상기 이산화탄소 기체 흐름의 유량은 0.05 L/min 내지 50 L/min로 제어될 수 있다. 예를 들어, 상기 이산화탄소 기체 흐름의 유량은 0.5 L/min 내지 30 L/min, 1 L/min 내지 10 L/min 또는 2 L/min 내지 5 L/min으로 제어될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 또한, 다공성 나노 복합체의 제조 장치에 관한 것이다. 상기 제조 장치는, 전술한 다공성 나노 복합체를 제조하기 위한 장치로서, 후술하는 다공성 나노 복합체 및 상기 다공성 나노 복합체의 제조 방법에 대한 구체적인 사항은 다공성 나노 복합체 및 상기 다공성 나노 복합체의 제조 방법에서 기술한 내용이 동일하게 적용될 수 있다.
도 3은 본 출원의 일 구현예에 따른 다공성 나노 복합체의 제조 장치를 모식적으로 나타낸 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 다공성 나노 복합체의 제조 장치는 제 1 분무부(210), 제 2 분무부(220) 및 광 조사부(230)를 포함한다.
하나의 예시에서, 제 1 분무부(210)는 전술한 탄산칼슘 나노입자를 형성하기 위한 제 1 분무 단계가 수행되는 부분으로서, 상기 제 1 분무부(210)는 이산화탄소 기체 흐름에 탄산칼슘 전구체 수용액을 분무하는 제 1 분무장치(211)를 포함할 수 있다. 상기 제 1 분무장치(211)에 대한 구체적인 설명은 상기 다공성 나노 복합체의 제조 방법의 제 1 분무 단계에서 기술한 내용이 동일하게 적용될 수 있으므로, 이를 생략하기로 한다.
상기 제 1 분무부(210)에서 형성된 탄산칼슘 나노입자는 상기 다공성 나노 복합체의 제조 방법의 제 1 분무 단계에서 전술한 바와 같이, 물을 포함하는 액적 형태로 존재하기 때문에, 상기 물을 제거하기 위한 건조 장치를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현 예에 따른 상기 건조 장치로는 확산 건조기(Diffusion Dryer)를 사용할 수 있다. 하나의 예시에서, 상기 확산 건조기의 내부에는 활성탄소와 실리카을 포함하는 흡수-흡착 방식의 추출층(Extraction Bed)이 충진되어 있을 수 있고, 상기 추출층의 중공(Hollow)을 통하여 상기 액적이 지나가면서 용매가 추출될 수 있다.
상기 제 2 분무부(220)는 전술한 생체 적합성 물질이 부착된 탄산 칼슘 나노입자를 포함하는 액적을 형성하기 위한 제 2 분무 단계가 수행되는 부분으로서, 상기 제 2 분무부(220)는 상기 탄산칼슘 나노입자에 생체 적합성 물질을 포함하는 용액을 분무하는 제 2 분무장치(221)를 포함할 수 있다. 상기 제 2 분무장치(221)에 대한 구체적인 설명은 상기 다공성 나노 복합체의 제조 방법의 제 2 분무 단계에서 기술한 내용이 동일하게 적용될 수 있으므로, 이를 생략하기로 한다.
상기 광 조사부(230)는 전술한 다공성 쉘부를 형성하기 위한 광 조사 단계가 수행되는 부분으로서, 상기 광 조사부(230)는 광원(231)을 포함할 수 있다. 상기 광원(231)은 300 nm 이하의 파장의 빛을 방출할 수 있는 광원으로서, 예를 들면, UV 램프 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 광 조사부(230)에 대한 설명은 상기 다공성 나노 복합체의 제조 방법의 광 조사 단계에서 기술한 내용이 동일하게 적용될 수 있으므로, 이를 생략하기로 한다.
상기 제 1 분무부(210), 제 2 분무부(220) 및 광 조사부(230)는 이산화탄소 기체가 흐르는 조건 하에 유지될 수 있다. 상기 이산화탄소 기체가 흐르는 조건에 대한 구체적인 설명은 다공성 나노 복합체의 제조 방법에서 기술한 내용이 동일하게 적용될 수 있으므로, 이를 생략하기로 한다.
상기 광 조사부(230)에는 용매 제거 수단이 추가로 포함될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이산화 탄소 기체의 흐름을 따라 상기 제 2 분무부(220)를 거쳐 광 조사부(230)에 도달한 생체 적합성 물질이 부착된 탄산 칼슘 나노 입자는 액적 형태로 존재하게 된다. 따라서, 상기 광 조사부(230)는 용매 제거 수단을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 용매 제거 수단에서는 광 조사와 동시에 용매를 제거하는 공정이 수행될 수 있다. 하나의 예시에서, 상기 추출 수단은, 추출 수단(232) 또는 건조 수단을 포함할 수 있다.
일 예시에서, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 추출 수단(232)은 유입부(2321) 및 유출부(2322)를 포함하는 추출 로(Furnace)일 수 있고, 추출 용매가 상기 유입부(2321)를 통해 추출 수단(232)으로 유입될 수 있고, 상기 유출부(2322)로는 추출 용매에 의해 추출된 혼합물을 배출될 수 있다.
또한, 도면에 도시하지는 않았지만, 상기 용매 제거 수단으로 건조 수단을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 건조 수단으로는 확산 건조기를 사용할 수 있으며, 이에 대한 구체적인 설명은 전술한 바와 동일하므로 생략하기로 한다.
본 출원의 다공성 나노 복합체는, 생체 적합성이 우수하고, 표적 세포에 유전자 형질 주입 동안 발생되는 손상으로부터 DNA를 효과적으로 보호할 수 있어, 생물 의학 분야에 적용 시, DNA, 약물 또는 기타 기능성 시약을 효율적으로 전달할 수 있고, 또한, 임플란트 주위의 염증을 억제하기 위하여 임플란트 픽스쳐(Implant Fixture) 부분에 코팅될 수 있다.
도 1은, 본 출원의 일 구현예에 따른 다공성 나노 복합체를 예시적으로 나타낸 도면이다.
도 2는, 본 출원의 다공성 나노 복합체의 제조 방법을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 3은, 본 출원의 다공성 나노 복합체의 제조 장치를 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 4는, 실시예 2 내지 3의 다공성 나노 복합체 및 비교예 1의 순수 탄산칼슘 나노입자(CC), 비교예 2의 키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.3인 양쪽성 이온 키토산 나노입자[ZC(An/Am=0.3)] 및 비교예 3의 키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.7인 양쪽성 이온 키토산(ZC) 나노입자의 크기 분포 측정 결과를 나타낸 도면이다
도 5는, 실시예 2 내지 3의 다공성 나노 복합체 및 비교예 1 내지 3의 나노 입자의 투과 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
도 6은, UV가 조사되지 않거나, UV가 조사된 경우의 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 형태학적 변화를 촬영한 고배율 TEM 이미지이다.
도 7은, 77.4 K에서 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 표면 조직 특성 및 주사 현미경 이미지을 나타낸다.
도 8은, 비교예 4 및 5의 나노 복합체의 TEM 이미지를 나타낸 도면이다.
도 9는, 실시예 2 내지 3의 다공성 나노 복합체 및 비교예 1 내지 3의 나노 입자의 퓨리에 변환 적외선 분광기(FTIR) 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은, MTS 분석을 사용한 힐라 세포(HeLa Cells)에서 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체와 pDNA의 복합체의 서로 다른 농도에서의 세포독성을, 비교예 1의 순수 탄산칼슘 나노입자 및 비교예 2 및 3의 양쪽성 이온 키토산 나노입자의 결과와 비교한 결과 그래프이다.
도 11은, 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체와 변형되지 않은 키토산(Cs) 및 콜레스테롤 변형된 키토산(Ch-Cs)의 지질다당류(LPS)-유도된 대식세포로부터의 대식세포 염증 단백질(Macrophage Inflammatory Protein, MIP) 생성의 억제 정도를 비교한 그래프이다.
도 12는, 실시예 2 내지 3의 다공성 나노 복합체, 리포펙타민 및 비교예 2 내지 3의 나노 입자의 인비트로 유전자 형질 주입 효율을 나타낸 그래프 및 형광 이미지를 나타낸 도면이다.
도 13은, 유전자 형질 주입 시험에서 사용된 실시예 3의 다공성 나노 복합체:DNA의 비율에 관한 다공성 나노 복합체와 유전자의 복합체의 형성을 확인하기 위하여 수행된 전기영동 이동성 변화 실험(Electrophoretic Mobility Shift Experiment) 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는, 본 출원의 다공성 나노 복합체가 픽스쳐 부분에 코팅된 임플란트를 예시적으로 나타낸 도면이다.
<부호의 설명>
100: 나노 복합체
110: 코어부
120: 쉘부
210: 제 1 분무부
211: 제 1 분무 장치
220: 제 2 분무부
221: 제 2 분무 장치
230: 광 조사부
231: 광원
232: 추출 로
2321: 유입부
2322: 유출부
이하 실시예 및 비교예를 통하여 상기 기술한 내용을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 출원의 범위가 하기 제시된 내용에 의해 제한되는 것은 아니다.
다공성 나노 복합체 및 나노입자의 제조
실시예 1
도 2와 같이, 오리피스 개구 직경이 약 0.05 mm 내지 1 mm인 콜리슨 분무기 및 실리카겔 및 활성탄이 약 1:0 내지 0.2:0.8의 의 질량비로 혼합되어 충전된 확산 건조기(Diffusion Dryer)를 사용하여 탄산칼슘(CC) 나노 입자를 제조하였다. 보다 구체적으로, 99.999% 순도의 순수 이산화탄소 흐름을 질량 유량계(3810DS, Kofloc, 일본)를 통과시켜 유량을 3 L/min의 유량으로 제어하였다. 또한, 물에 용해된 0.2 g의 탄산수소칼슘[Ca(HCO3)2] 용액을 이산화탄소 기체에 분무하여 액적(Droplet)을 형성하였고, 그 다음 확산 건조기를 통과시켜 물을 추출하였다.
공급된 이산화탄소 흐름이 상기 수용액에 용해되면 반응 중에 수산화칼슘[Ca(OH)2]이 탄산칼슘(CaCO3)으로 전환된다.
그 다음 상기 탄산칼슘(CC) 입자가 함유된 기체의 흐름에 직접 키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비(An/Am)가 0.5인 양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체 용액을 분무하였다. 이 후 제조된 양쪽성 이온 키토산/탄산칼슘 하이브리드 액적(ZC@CC)은 760 μW/cm2의 강도 및 90℃의 벽 온도로 1.7분의 체류 시간동안 245 nm 파장의 자외선이 조사(LOT-ORIEL, Germany)되는 가열된 관형 반응기를 통과시켜, 상기 액적에 광 조사와 동시에 용매 추출을 적용하였다. 상기 액적의 완전한 증발을 촉진하기 위하여, 튜브 로에서 요구되는 체류 시간은 하기 일반식 1을 통하여 계산하였다.
[일반식 1]
Figure PCTKR2016015238-appb-I000002
상기 일반식 1에서, τ는 액적의 증발로부터 증기로 기체를 포화시키는 시간이고, Dd는 액적의 직경이며, δv는 증기 확산계수이고, C(Dd)는 액적의 수 농도이다.
도 2의 삽화는 또한, ZC의 1H NMR(Inova 300, Varian, US) 스펙트럼을 보여준다. 도면에 나타내지 않았지만 순수 키토산의 경우, 약 2.6 ppm(-NHCOOCH2CH2COOH), 4.0 ppm [N-acetyl glucosamine(GlcNAc)의 H2, GlcNAc의 H3-H6 및 glucosamine(GlcN)] 및 4.8 ppm(GlcN의 H1)의 화학적 시프트(Chemical Shifts)에서 밴드가 존재한다. 그러나, 키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비(An/Am)가 0.5인 ZC는 약 3.15 ppm(GlcN의 H2) 및 4.3 ppm(-NHCOCH2CH2COOH)의 화학적 시프트(Chemical Shifts)에서 추가적인 밴드를 가졌다.
실시예 2
키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.3인 양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체 용액을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 다공성 나노 복합체를 제조하였다.
실시예 3
키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.7인 양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체 용액을 사용한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 다공성 나노 복합체를 제조하였다.
비교예 1
양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체 용액을 분무하는 단계를 생략한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 평균 입경이 74.7 nm인 순수 탄산칼슘 나노입자를 제조하였다.
비교예 2
실시예 2에서 사용한 키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.3인 양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체를 사용하여 평균 입경이 176.5 nm인 양쪽성 이온 키토산 나노입자를 제조하였다.
비교예 3
실시예 3에서 사용한 키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.7인 양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체를 사용하여 평균 입경이 189.7 nm인 양쪽성 이온 키토산 나노입자를 제조하였다.
비교예 4
양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체 용액 대신에 순수 키토산(Polysciences 社)이 용해된 전구체 용액을 탄산칼슘 입자에 분무한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 나노 복합체를 제조하였다
비교예 5
양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체 용액 대신에 콜레스테롤 변형 키토산(Ch-Cs)이 용해된 전구체 용액을 탄산칼슘 입자에 분무한 것을 제외하고, 실시예 1과 동일한 방식으로 나노 복합체를 제조하였다.
상기 콜레스테롤 변형된 키토산(Ch-Cs)은 다음과 같이 제조하였다. 20 mL의 디메틸 술폭시드(Dimethyl Sulfoxide) 내 1.2 g의 키토산 올리고당 유산염(Chitosan Oligosaccharide Lactate, Sigma-Aldrich, US)을 30 mL의 디클로로메탄(Dichloromethane) 내 2.4 mL의 트리에틸아민(Triethylamine)에 첨가하여 반응한 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 상기 혼합물에 10 mL의 디클로로메탄(Dichloromethane) 내 340 mg의 콜레스테릴 클로로포메이트(Cholesteryl Chloroformate)를 첨가하고, 상기 반응 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 감압 하에 농축시켜 형성된 생성물을 원심 분리에 의해 침전시켰다. 이 후, 상기 생성물을 30 mL의 디클로로메탄(Dichloromethane)으로 5회 세척한 후, 상기 생성물을 초음파 처리에 의해 물에 분산시키고, 3일 동안 분자량 컷-오프(Cut-Off) 3000을 갖는 막(Membrane)을 사용하여 투석하여 콜레스테롤 변형된 키토산(Ch-Cs)을 제조하였다.
비교예 6
키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.7인 양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체 용액 대신에, 0.1 mL의 폴리에틸렌이민(PEI)을 키토산 아민에 대한 숙신산 무수물의 몰비가 0.7인 양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체와 혼합한 용액을 사용한 것을 제외하고, 실시예 3과 동일한 방식으로 나노 복합체를 제조하였다.
비교예 7
키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.7인 양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체 용액 대신에, 0.1 mL의 폴리-l-라이신(PLL)을 키토산 아민에 대한 숙신산 무수물의 몰비가 0.7인 양쪽성 이온 키토산(ZC) 전구체와 혼합한 용액을 사용한 것을 제외하고, 실시예 3과 동일한 방식으로 나노 복합체를 제조하였다.
실험예 - 다공성 나노 복합체 및 나노 입자의 특성 평가
<입자 크기 분포>
제조된 입자의 입자 크기 분포는 미분형 정전 분급기(Differential Mobility Analyzer)(3081, TSI, US), 정전 분류기(Electrostatic Classifier)(3080, TSI, US), 응축 입자 계수기(Condensation Particle Counter)(3776, TSI, US) 및 연질 X-선 중화기(Soft X-ray Charger)(4530, HCT, Korea)로 구성된 이동성 입자 주사 정립기(Scanning Mobility Particle Sizer, SMPS)를 사용하여 측정하였다. 이동성 등가 입경(Mobility Equivalent Diameter)을 측정하기 위하여 사용된 SMPS 시스템은 0.3 L/min의 샘플 유량, 3.0 L/min의 시스 유량(Sheath Flow) 및 135초의 주사 시간(Scan Time) 동안 작동시켰다(측정 범위: 15.1 내지 661.2 nm). 실시예 및 비교예에서 제조된 나노 복합체 및 나노 입자의 질량(m)은 미량 천칭(Microbalance)(DV215CD, Ohaus, Switzerland)을 사용하여 측정하였고, 또한, 하기 일반식 2를 통하여 확인하였다.
[일반식 2]
Figure PCTKR2016015238-appb-I000003
상기 일반식 2에서, Q는 이산화탄소 기체의 유량이고, ts는 샘플링 시간이며, η(Dp)는 부분집진율이고, Cm(Dp)는 입자의 질량 농도이다.
투과 전자 현미경(TEM)(CM-100, FEI/Philips, US) 이미지는 46 내지 180 kV의 가속 전압 범위에서 얻었다. TEM 검사를 위해 샘플은 나노 입자 수집기(Nano Particle Collector)(NPC-10, HCT, Korea)를 사용하여, 1.0 L/min의 샘플 유량 및 5 kV의 작동 전압에서 직접 정전 기상 샘플링(Direct Electrostatic Gas-phase Sampling)에 의해 제조되었다.
탄산칼슘-키토산 나노 입자에 대한 주사 전자 현미경(SEM)(NOVA nanoSEM, FEI, US) 이미지는 15 kV의 가속전압에서 얻었다. 탄산칼슘-키토산 다공성 나노 복합체의 질소 흡착 등온선은 10-6 내지 1의 범위의 상대 압력 및 77.4 K에서 공극률 측정기(Porosimeter)(ASAP 2010, Micromeritics Ins. Corp., US)를 사용하여 측정되었다.
퓨리에 변환 적외선 분광기(FTIR) 분석을 위해, 샘플은 물리적 여과, 즉, 주로 기질 표면 상에 입자의 확산에 의한 기계적 여과에 의한 폴리에트라플루오로에틸렌(PTFE) 배지(media) 기질(0.2 ㎛의 기공 크기, 47 mm의 직경, 11807-47-N, Sartorius, Germany)을 사용하여 제조되었고, 스펙트럼은 Nicolet 6700 FTIR 분광기(Thermo Electron, US) 상에 기록되었다. 흡광도 모드에서 4000 내지 400 cm-1의 범위의 샘플에 대한 스펙트럼을 얻었다.
다공성 나노 입자와 플라스미드 DNA(plasmid DNA, pDNA) 복합체의 제타 포텐셜(Zeta Potential)은 제타 포텐셜 분석기(Nano ZS-90, Malvern Instruments, UK)를 사용하여 결정되었다. 상기 입자는 pDNA와 혼합되었고, 30분 동안 실온에서 배양되었다. 이후, 상기 복합체를 이중 탈이온수에 적당한 농도로 희석하였다. 제타 포텐셜 측정은 25℃에서 수행되었고, 제조업체에서 제공된 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
<인비트로 세포 독성 및 형질 주입(Transfection)>
실시예의 다공성 나노 복합체의 세포독성은 MTS(3-(4,5-디메틸-티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)2H-테트라졸륨) 분석에 의해, 힐라 세포(HeLa cells) 를 사용하여 평가되었다. 세포는 37℃, 5%의 CO2 및 95%의 상대 습도에서 10%의 소태아혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco's 변형 이글 배지(DMEM Carlsbad, USA) 200 mL에서 배양되었다. 세포는 96-웰 미량정량판(96-Well Microtiter Plate)(Nunc, Germany)에 1×105 cell/well의 밀도로 뿌려졌다. 24시간 후, 배양 배지는 1 mg/mL의 실시예의 다공성 나노 복합체를 함유하는 혈청 보충 배양 배지(Serum Supplemented Culture Media)로 교체되었고, 세포는 24시간 동안 배양되었다. 그 후, 30 μL의 MTS 시약은 각 웰에 첨가되었다. 세포는 추가로 2 시간 동안 배양되었다. 이 후, 흡광도는 490 nm의 파장에서 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)(Spectra Plus, TECAN, Switzerland)를 사용하여 측정되었다. 세포 생존율(%)은 실시예의 다공성 나노 복합체가 없는 배지 내의 비처리된 비교 세포와 비교하였고, 하기 일반식 3에 의하여 계산되었다.
[일반식 3]
[A]test = [A]control × 100%
상기 일반식 3에서, 상기 [A]test는 나노 복합체가 있는 웰의 흡광도이고, [A]control은 비교 웰들의 흡광도이다.
실시예의 다공성 나노 복합체의 힐라 세포의 형질 주입 성능은 반딧불이 발광효소(Firefly Luciferase) 및 GFP 유전자를 포함하는 pDNA를 사용하여 측정되었다. 세포는 10%의 FBS를 함유하는 RMPI 1640 배지(Gifco, USA)의 24-웰 플레이트(24-Well Plate)에 1×106 cell/well의 밀도로 뿌려졌고, 형질 주입(Transfection) 이전에 80%의 융합에 도달하도록 성장시켰다. 상기 형질 주입 전, 배지는 10%의 FBS를 함유하는 새로운 배지로 교환되었다. 세포는 37℃에서 4시간 동안 2 μg의 pDNA를 함유하는 실시예의 다공성 나노 복합체 용액으로 처리되었고, 최종 부피는 배지에 의하여 500 μL로 조절되었다. 10%의 FBS를 포함하는 새로운 배지로 교환한 후, 세포는 48시간동안 더 배향되었다. 이 후, 성장 배지는 제거되었고, 세포는 200 μL의 Reporter Lysis Buffer(Promega, USA)에 실온에서 30분 동안 교반되었다. 용해물(Lysates)은 튜브로 이동되었고, 5분 동안 13,000 rpm에서 원심 분리되었다. 발광효소 활성(Luciferase Activity)은 루미노미터(Luminometer)(TD-20/20, Promega, USA)로 측정되었다. 총 단백질은 BCA 단백질 분석 키트(BCA Protein Assay Kit)(ThermoFisher Scientific, USA)에 의하여 결정되었다. 최종 발광효소 활성은 상대 발광 단위 (RLU)/mg 단백질로 나타내었다. 역 형광 현미경(Inverted Fluorescent Microscope)(Nikon Eclipse TE2000-S, Japan)은 힐라 세포에서 실시예 1 및 2의 다공성 나노 복합체의 GFP 발현을 관찰하기 위하여 사용되었다.
모든 실험은 3회 수행되었고, 그 결과는 평균 및 표준 편차로 보고되었다. 통계 분석은 스튜던트 테스트(Student's T-Test)를 사용하여 수행되었다. 차이는 p<0.05에서 유의한 것으로 고려되었다.
<대식세포 염증성 단백질(MIP) 생성>
복막 대식세포(Peritoneal Macrophages)는 배지 1 mL 내에 웰 당 105 cell 의 밀도로 24-웰 플레이트(24-Well Plate)에 뿌려졌다. 하루 배향 후, 0.1 mL의 Janus 입자 용액이 배지 내 입자 농도를 2 mg/mL로 조절하기 위하여 각각의 웰에 주입되었다. 비교 목적으로, 0.1 mL의 폴리에틸렌이민(PEI, 765090, Sigma-Aldrich, USA), 폴리-1-라이신(PLL, P4707, Sigma-Aldrich, USA) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG, 81188, Sigma-Aldrich, USA)이 양쪽성 이온 키토산 전구체 용액 대신에 콜리슨 분무기에 주입되었다. 24시간 배향 후, 배양 배지는 상층액(Supernatants)을 분리하기 위하여, 10분 동안 2000 rpm에서 원심 분리되었다. 대식세포는 비교 직전에 1 μg/mL의 최종 농도의 배지에 지질다당류(LPS)를 첨가함으로써 유도되었다. 효소-연결 면역 흡수측정 검사(Enzyme-Linked　Immunosorbent Assay, ELISA)은 MIP-2 ELISA 키트(R&D Systems, USA)을 사용하여 MIP 수준을 결정하기 위하여 수행되었다. LPS-유도된 대식세포로부터 수집된 상층액은 분석 전에 항상 10번 희석되었다. 그 차이는 p<0.01에서 유의한 것으로 고려되었다.
<아가로스 겔 지연 분석(Agarose Gel Retardation Assay)>
상이한 중량비 하에서 실시예 2 내지 3의 다공성 나노 복합체의 유전자 응축 능력이, 0.5 μg/mL의 브롬화 에티듐(Ethidium Bromide)를 함유하는 트리스-아세테이트-에틸렌디아민테트라아세트산 완충액(트리스(Tris) 242 g, 빙초산 57.1 mL 및 에틸렌디아민테트라아세트산 0.5 mM, pH 8.0)을 사용하여 1% 아가로스 겔 전기영동에 의하여 분석되었다. 실시예의 다공성 나노 복합체 및 유전자를 상이한 중량비로 함유하는 복합체는, 혼합, 볼텍싱(Voltexing), 및 30분 동안 실온에서 배양하여 제조되었다. 상기 각각의 복합체 약 100 ng을 아가로스 겔에 채웠다. 청색 염료를 채운 겔(New England BioLabs, USA)은 각 웰(well)에 첨가되었고, 아가로스 겔 전기영동은 50분 동안 80 V의 정전압에서 수행되었다. 그 다음, 생성된 겔의 유전자 밴드는 365 nm의 파장에서 자외선 투과 발광기(Ultraviolet Transilluminator) 하에서 가시화되었다.
측정 결과 및 분석
도 4는 실시예 2 내지 3의 다공성 나노 복합체 및 비교예 1의 순수 탄산칼슘 나노입자(CC), 비교예 2의 키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.3인 양쪽성 이온 키토산 나노입자[ZC(An/Am=0.3)] 및 비교예 3의 키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.7인 양쪽성 이온 키토산(ZC) 나노입자의 크기 분포 측정 결과를 나타낸 도면이다. 상기 실시예 2의 다공성 나노 복합체의 평균 직경, 표준 편차 및 수 농도를 검증하기 위하여 이동성 입자 주사 정립기(3936, TSI, US)를 사용하여 분석하였고, 다공성 나노 복합체의 평균 직경, 표준 편차 및 수 농도는 각각 169.2 nm, 1.71 및 1.74 × 106 cm- 3이었다. 순수 탄산칼슘 나노 입자의 직경, 표준 편차 및 수 농도는 각각 74.7 nm, 1.73 및 4.94 × 106 cm-3이었고, 비교예 2의 키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.3인 양쪽성 이온 키토산 나노입자[ZC(An/Am=0.3)]의 직경, 표준 편차 및 수 농도는 각각 176.5 nm, 1.67 및 1.06 × 106 cm- 3이었다. 실시예 2의 다공성 나노 복합체에 대한 상기 값은 비교예 1의 순수 탄산칼슘 나노 입자 보다 키토산 아민기에 대한 숙신산 무수물기의 몰비가 0.3인 양쪽성 이온 키토산 나노입자[ZC(An/Am=0.3)]의 나노 입자에 더 가까웠다. 추가적인 피크는 없었고, 이는 탄산칼슘 입자가 양쪽성 이온 키토산과 잘 결합되어 탄산칼슘/양쪽성 이온 키토산 나노 복합체(ZC@CC)로 변환되었음을 시사한다. 실시예 3의 다공성 나노 복합체에 대한 상기 값은 하기 표 1에 나타내었다.
구분 평균 직경(nm) 표준 편차(-) 수 농도(particles/cm3)
비교예 1(Pure CC) 74.7 1.73 4.94×106
비교예 2ZC(An/Am=0.3) 176.5 1.67 1.06×106
비교예 3ZC(An/Am=0.7) 189.7 1.69 1.12×106
실시예 2ZC@CC(An/Am=0.3) 169.2 1.71 1.74×106
실시예 3ZC@CC(An/Am=0.7) 169.6 1.70 1.33×106
실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체 내의 탄산칼슘(CC) 및 양쪽성 이온 키토산(ZC)의 질량 분율(Mass Fraction)은, 피에조발란스 입자 모니터(Piezobalance Particle Monitor)(3522, Kanomax, Japan)를 사용하여 측정되었고, 실시예 2의 다공성 나노 복합체의 경우, 각각 0.71 및 0.29이고, 실시예 3의 다공성 나노 복합체의 경우, 각각 0.68 및 0.32이었다.
도 5는 실시예 2 내지 3의 다공성 나노 복합체 및 비교예 1 내지 3의 나노 입자의 투과 전자 현미경 이미지를 나타낸다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 투과 전자 현미경 이미지에서, 대부분의 탄산칼슘(CC) 입자는 타원형상을 가지는 반면, 양쪽성 이온 키토산(ZC) 입자는 구 형상을 보이며, 매끄러운 표면을 가졌다. 그럼에도 불구하고, 두 입자는 잘 분리되었다. 양쪽성 이온 키토산(ZC) 입자의 경우, 입자는 그라데이션[어두운 코어-밀집된 고체(Dark Core-Dense Solid) 및 밝은 쉘-가벼운 고체(Bright Shell-Light Solid)]를 가졌고, 이는 주어진 건조 속도 때문에 이러한 방법에 의해 얻어졌으며, 확산(D d 2/4δ v) 및 대류 건조(τd)에 대한 상대적 시간 스케일을 나타내는 무차원 수인 하기 일반식 4의 페클렛 수(Peclet Number, Pe)로 설명될 수 있다.
[일반식 4]
Figure PCTKR2016015238-appb-I000004
현재 조건의 Pe 값은 1보다 상당히 작았고, 이로부터 액적의 코어 영역을 향한 계면에서 용질의 이동이 대류 건조와 함께 머물기에 충분하다는 것을 확인하였으며, 이로 인하여, 밀집된 고체 입자의 형성을 유도하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 탄산칼슘(CC) 입자가 다른 분무기에 주입되었을 때, 그들은 기체 가압 시스템(Gas Pressurizing System)에 의하여 양쪽성 이온 키토산(ZC) 액적에 의하여 캡슐화 되었다. 도 5와 같이, 실시예의 다공성 나노 복합체의 경우, 고배율 TEM 이미지는 탄산칼슘(CC) 코어 입자 주위의 회색 그물망(Network) 쉘을 나타내었고, 이는 탄산칼슘 입자를 완전히 덮은 양쪽성 이온 키토산(ZC) 모이어티의 존재를 시사한다. 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 탄산칼슘 입자의 양쪽성 이온 키토산의 캡슐화(Encapsulation) 효율은 각각 97.9% 및 98.7%였다. 비교예 1의 순수 탄산칼슘 나노 입자의 평균 직경은 72±5.1 nm이었고, 비교예 2의 양쪽성 이온 키토산 나노입자의 평균 직경은 171±9.3 nm이었다. 또한, 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 평균 직경은 166±9.1 nm이었으며, 이는 도 4 및 상기 표 1에 나타낸 데이터와 일치한다.
도 6은 가열된 관형 반응기에서 UV가 조사되지 않거나, UV가 조사된 경우의 고배율 TEM 이미지를 나타내며, 이는 기체 상에서 탄산칼슘 입자에 양쪽성 이온 키토산 성분의 광 유도 변형(Photo-Derived Transformation)을 통한 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 형태학적 변화를 뒷받침 한다.
도 7은 77.4 K에서 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 표면 조직 특성 및 주사 현미경 이미지을 나타낸다. 도 7에 나타나는 바와 같이, 흡착된 부피는 먼저 상대 압력(P/P0)에서, 0에서 0.05로 증가하였고, 이것은 다공성 나노 복합체의 미세 기공(Micropores)의 빠른 흡착과 연관되어 있다. 그 다음, 흡착된 부피는 다공성 나노 복합체의 메조 기공(Mesopores) 내의 모세관 흡입으로 인해 P/P0에서 0.05에서 0.85로 천천히 증가하였다. 상기 흡착된 부피는 강력한 모세관 응축 때문에 0.9에서 0.99로 더 대폭적으로 증가하였다. 하기 표 2는 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 표면적(Surface Area, SA), 기공 부피(Pore Volume, PV) 및 직경과 같은 표면 조직 특성을 나타낸다.
구분 전체 기공 미세 기공(Micropore) 메조 기공(Mesopore) 평균 기공 직경 (nm
SA(m2/g) PV(cm3/g) SA(m2/g) PV(cm3/g) SA(m2/g) PV(cm3/g) PV(cm3/g)
실시예 2 123.58 0.346 28.43 0.025 95.15 0.321 12.16
실시예 3 182.73 0.529 38.57 0.088 144.16 0.441 14.71
또한, 도 7의 삽화는, 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 주사 현미경(SEM, NOVA nanoSEM, FEI, US) 이미지이며, 탄산칼슘 입자 상의 다공성 구조를 명확히 보여준다.
반면, 도 8에 나타낸 비교예 4 및 5의 나노 복합체에서는 탄산칼슘 입자 상에 어떠한 다공성 구조도 나타나지 않았다. 도 8은, 탄산칼슘 입자의 모폴로지가 타원 형태임을 나타내었으며, 반면에 순수 키토산(Cs) 및 콜레스테롤-키토산(Ch-Cs) 입자는 부드러운 표면을 갖는 유사한 구 형상을 나타내며, 서로 분리되어 있음을 나타내었다. 탄산 칼슘 입자가 분무기의 오리피스(Orifice)를 통과할 때, 탄산 칼슘 입자는 기체 가압 시스템 때문에 순수 키토산 또는 콜레스테롤-키토산 입자에 의해 캡슐화 된다. 도 8의 TEM 이미지는 탄산칼슘 나노입자 주변의 회색의 바깥쪽 쉘을 보여주며, 이는 순수 키토산(Cs) 또는 콜레스테롤-키토산 모이어티가 탄산칼슘 입자를 완전히 덮음을 시사한다. 그러나 비록 비교예 4 및 5의 복합체가 실시예의 다공성 나노 복합체와 동일한 방법에 제조되었으나, 본 출원의 양쪽성 이온 키토산-탄산칼슘 복합체와 달리, 비교예 4 및 5의 복합체에서는 탄산칼슘 입자 상에 다공성 키토산 그물망이 존재하지 않았다. 이러한 차이점은 성분들 사이의 물에 대한 용해도 및 자외선의 광 민감성으로부터 기인한다. 즉, 이러한 현상에 대한 두 가지 가능한 설명은, 1) 숙시닐기가 다른 작용기보다 자외선의 조사에 더 민감할 수 있고, 2) 양쪽성 이온 키토산(ZC)가 중성 pH에서 더 잘 녹으므로, 따라서, 다공성 구조를 더 잘 형성할 수 있다. 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 경우에서, An/Am=0.3인 실시예 2의 다공성 나노 복합체의 경우보다 An/Am=0.7인 실시예 3의 다공성 나노 복합체의 경우에 더 큰 공극률(Porosity)을 나타내는 것은, 상기 설명을 더욱 입증하고 있다.
도 9는 실시예 2 내지 3의 다공성 나노 복합체 및 비교예 1 내지 3의 나노 입자의 퓨리에 변환 적외선 분광기(FTIR) 스펙트럼을 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 양쪽성 이온 키토산(ZC)의 FTIR 스펙트럼은 1540 cm-1에서 우세한 밴드를 나타내며, 이는 숙시닐기(N-Succinylation)의 존재로 인한 N-H 아미드(Amide II)의 휨 진동(Bending Vibration)으로 색인될 수 있다. 나아가, 스펙트럼은 3360 cm-1, 2920 cm-1, 2880 cm-1, 1680 cm-1 및 1360 cm-1에서 전형적인 흡수 밴드를 나타내고, 이는 각각 순수 키토산의 -OH기, -CH2기, -CH3기, 아미드 I 기 및 아미드 III기를 나타낸다. 1440 cm-1에서의 피크는 카보네이트기에 기인하며, 이는 탄산칼슘(CC)의 결정이 방해석임을 나타낸다. 양쪽성 이온 키토산(ZC)이 탄산칼슘(CC) 입자와 합쳐진 후에, 아미드 II 및 아미드 III 기의 스펙트럼은 현저하게 강화되었지만 탄산칼슘(CC)에 대한 밴드는 사라졌다. 이는 거의 모든 탄산칼슘(CC) 입자가 정량적으로 양쪽성 이온 키토산(ZC)에 의해 덮혀 졌음을 의미한다. 1360 cm-1 및 1540 cm-1에서 1380 cm-1 및 1550 cm-1의 높은 파수로의 피크의 이동은 양쪽성 이온 키토산(ZC) 및 탄산칼슘(CC) 사이의 결합 효과(Associative Effect)를 나타낸다. 또한, 1680 cm-1에서의 약화된 피크는 또한 양쪽성 이온 키토산(ZC)와 탄산칼슘(CC) 사이의 배위(coordination)를 제안한다.
한편, 상기 실시예 2 내지 3의 다공성 나노 복합체와 pDNA의 복합체 또는 비교예 1 내지 3의 나노 입자와 pDNA의 복합체의 제타 포텐셜은 하기 표 3에 나타내었다. 표 3과 같이, 순수 양쪽성 이온 키토산(ZC) 입자를 사용한 비교예 2 및 3과 다공성 나노 복합체를 사용한 실시예 2 및 3의 제타 포텐셜 간에는 상당한 차이가 없었으며, 이는 합쳐짐(Merging)이 표면 화학(Surface Chemistry)에 영향을 미치지 않았음을 의미한다.
구분 제타 포텐셜(mV)
실시예 2 - 14.3±2.22
실시예 3 - 39.5±4.21
비교예 1 - 1.89±0.29
비교예 2 - 15.6±2.85
비교예 3 - 39.1±5.58
실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 동적 광산란 측정이 먼저 수행되었다. 인비트로 측정 전에 직접 기상 샘플링된 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체가 유리판 상에 적용되었다. 그 결과, 모든 시험에서 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체에 대한 유체 역학 직경의 편차는 3.4%보다 크지 않았고, 1 내지 14일의 보관일 사이에 유의한 차이가 없음을 나타냈다. 이것은 실시예의 나노 복합체가 더 많은 조사를 보증하는 안정성을 갖는다는 것을 의미한다.
도 10은, MTS 분석을 사용한 힐라 세포(HeLa Cells)에서 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체와 pDNA의 복합체의 서로 다른 농도에서의 세포독성을, 비교예 1의 순수 탄산칼슘 나노입자 및 비교예 2 및 3의 양쪽성 이온 키토산 나노입자의 결과와 비교한 결과 그래프이다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체와 pDNA의 복합체의 세포독성은 1 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL 및 50 μg/mL와 같이, 서로 다른 농도에서 MTS 분석을 사용하여 힐라 세포(HeLa cells)에서 결정되었고, 비교예 1의 순수 탄산칼슘 나노입자 및 비교예 2 및 3의 양쪽성 이온 키토산 나노입자의 결과와 비교하였다. 입자 용액을 제조하기 위하여, 초음파 조건 하에 1분 동안 물 속에 기판을 담금으로써, 샘플 입자들은 유리 기판 등의 소수성 기판으로부터 먼저 박리되었다. 측정 결과, 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체에 대한 세포 생존율은 78 % 초과인 반면, 비교예 1의 순수 탄산칼슘 나노입자 및 비교예 2 내지 3의 양쪽성 이온 키토산 나노입자의 세포 생존율은 각각 75% 초과 및 80% 초과로 나타났다. 가장 낮은 생존율은 비교예 1의 순수 탄산칼슘 나노 입자에 대한 것이었는데, 이는 힐라 세포에 산화적 손상을 유발할 수 있음을 나타내며, 이는 실시예의 다공성 나노 복합체의 세포 독성에 영향을 줄 수 있다. 그럼에도 불구하고, 상기 결과는 제조된 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체가 비 세포 독성일 수 있는 생체적합성을 가지고 있음을 의미하며, 대체로 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체 및 비교예 2 및 3의 키토산 나노 입자 사이에는 세포 생존력의 현저한 차이가 없었다. 또한, 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체가 활성화된 대식세포(Activated Macrophages)를 유도하는 조직에 투여되는 비경구적 응용(Parenteral Applications)도 고려될 수 있다.
도 11은 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체와 변형되지 않은 키토산(Cs) 및 콜레스테롤 변형된 키토산(Ch-Cs)의 지질다당류(LPS)-유도된 대식세포로부터의 대식세포 염증 단백질(Macrophage Inflammatory Protein, MIP) 생성의 억제 정도를 비교한 그래프이다. 도 11의 결과는 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체가 도 8에 나타나는 변형되지 않은 키토산(Cs) 및 콜레스테롤 변형된 키토산(Ch-Cs)보다 지질다당류(LPS)-유도된 대식세포로부터의 대식세포 염증 단백질(Macrophage Inflammatory Protein, MIP) 생성을 상당히 억제할 수 있음을 나타낸다. 이는, MIP 생성을 조절하는, 양쪽성 이온 키토산 표면, 세포 표면 수용체 및/또는 LPS 사이의 결합 때문이다. 비교예 6 및 7의 나노 복합체보다 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 더 적은 MIP 생성은 더 많은 아민 함량으로 인한 것일 수 있음을 나타내며, 이것은 또한, 비교예 4 및 5의 나노 복합체의 더 높은 MIP 값을 뒷받침한다.
실시예의 다공성 나노 복합체의 생의학적 잠재성을 확인하기 위하여, 발광효소(Luciferase) 및 GFP 유전자를 포함하는 pDNA를 사용한 힐라 세포 내의 형질주입 효율이 측정되었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 힐라 세포계(Cell Line)의 다공성 나노 복합체:DNA의 중량비가 25:1 미만인 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 형질 주입 효율은 리포펙타민을 양성 대조군으로 사용되었을 때 보다 현저하게 낮아졌다. 50:1 경우의 효율은 리포펙타민의 효율과 비슷한 정도에 도달하였다. 도 12는 또한, 리포펙타민 또는 50:1의 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체에 대한 힐라 세포의 GFP-유래된 형광 이미지를 나타내며, 리포펙타민과 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체 사이의 형질 주입 및 유사성을 추가로 확인되었다. 비교예 2 및 3의 양쪽성 이온 키토산 나노 입자와 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체 사이의 제타 포텐셜에는 상당한 차이가 없기 때문에, 비교예 2 및 3의 키토산 나노 입자와 비교하여 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체의 더 높은 효율은 더 높은 공극률(Porosity)로 인해 GFP 유전자를 운반하기 위한 용량이 높기 때문이다. 비록 실시예 2의 다공성 나노 복합체에서의 형질 주입 능력은 제타 포텐셜 차이로 인하여 비교예 3의 순수 양쪽성 이온 키토산 나노 입자 보다 컸지만, 실시예 2의 다공성 나노 복합체에 비해 실시예 3의 다공성 나노 복합체에서의 더 큰 형질 주입 능력은 또한 더 큰 공극률(porosity)로부터 유래될 수 있다. pH 7.4에서의 170 nm 이하의 큰 크기를 갖는 입자의 음전하에 따라, 크기 및 공극률(Porosity)의 조절은 독성/염증 반응과 마찬가지로 나노 복합체:DNA의 비율의 증가 없이 효율적인 유전자/약물 전달 적용을 위하여 진행되고 있다.
도 13은 유전자 형질 주입 시험에서 사용된 실시예 3의 다공성 나노 복합체:DNA의 비율에 관한 다공성 나노 복합체와 유전자의 복합체의 형성을 확인하기 위하여 수행된 전기영동 이동성 변화 실험(Electrophoretic Mobility Shift Experiment)을 나타낸다. 도 13에서, 레인(Lane) 1은 pDNA이고, 레인 2 내지 5는 실시예 3의 다공성 나노 복합체:pDNA 질량 비율이 각각 5:1, 10:1, 20:1 및 50:1이며, 레인 6은 리포펙타민인 경우를 보여준다. 50:1의 비율은 다른 비율보다 유전자 결합에 더 효과적이었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 이 것은, 더 작은 비율에서 유전자를 운반하기 위한 나노 복합체의 모세관 흡입이 충분하지 않기 때문에, 유전자 형질 주입 검사 결과와 일치하였고, 그리고, 조합으로부터 상당한 유전자 분리를 나타냈다.
결론적으로, 우선, 자외선 조사 하에서 연속적인 기상 공정이 수행되었으며, 생체적합성 양쪽성 이온 키토산-탄산칼슘 다공성 나노 복합체를 제조하였다. 광 유도된 변형에 의한 이들 다공성 나노 복합체는 생체적합성 및 형질 주입 효율의 인비트로 실험에 사용되었다. 다공선 나노 복합체의 평균 직경은 약 166 nm(72 nm의 탄산 칼슘 및 171 nm의 양쪽성 이온 키토산)이었으며, 상기 다공성 나노 복합체는 예를 들어, 평균 기공 직경이 약 13 nm의 메조 세공 구조를 가졌다. 인비트로 측정 결과, 약 75%의 최소 세포 생존률을 가지는 비교예 1의 순수 탄산칼슘 나노 입자 및 약 78%의 최소 세포 생존률을 가지는 실시예의 다공성 나노 복합체는 약 80%의 최소 세포 생존률을 갖는 비교예 2 및 3의 순수 키토산 나노 입자보다 약간 높은 세포 독성을 나타냈다. 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체는 50:1의 다공성 나노 복합체:DNA의 중량비에서 양성 대조군인 2.7 × 109 RLU/mg 이하의 리포펙타민과 유사한 형질 주입 능력에 도달했으며, 이는 다공성 구조 때문이다. 실시예 2 및 3의 다공성 나노 복합체는 비교예 2 및 3의 순수 키토산 나노 입자와 비교하여 유전자 형질 주입 능력이 현저히 향상되는 것을 나타냈다. 이러한 결과는, 친환경적이며, 다용도 수단으로서, 지속적인 단일-통과 처리를 확립할 것이고, 이 방법을 설계, 제작 및 변형하기 위한 다양한 수단을 제공하며, 이는 광범위한 생기능성 나노 물질에 일반적으로 적용될 수 있다.
한편, 본 출원의 나노 복합체(100)는 도 14와 같이, 임플란트 주위의 염증을 억제하기 위하여 임플란트 픽스쳐(Implant Fixture) 부분에 코팅될 수 있다.

Claims (23)

  1. 탄산칼슘을 포함하는 코어부; 및
    상기 코어부를 둘러싸고 있으며, 평균 직경이 20 nm 이하의 기공이 형성되어 있고, 생체 적합성 물질을 포함하는 쉘부;를 포함하는 다공성 나노 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서, 기공의 비표면적이 50 m2/g 내지 1000 m2/g인 다공성 나노 복합체.
  3. 제 1 항에 있어서, 기공의 부피는 0.1 cm3/g 내지 1.5 cm3/g인 다공성 나노 복합체.
  4. 제 1 항에 있어서, 기공은 평균 직경이 2 nm 미만의 미세 기공 및 평균 직경이 2 nm 내지 50 nm 미만의 메조 기공을 포함하는 다공성 나노 복합체.
  5. 제 4 항에 있어서, 평균 직경이 2 nm 미만의 미세 기공의 비표면적은 2 m2/g 내지 100 m2/g인 다공성 나노 복합체.
  6. 제 4 항에 있어서, 평균 직경이 2 nm 미만의 미세 기공의 부피는 0.01 cm3/g 내지 0.5 cm3/g인 다공성 나노 복합체.
  7. 제 4 항에 있어서, 평균 직경이 2 nm 내지 50 nm 미만의 메조 기공의 비표면적은 50 m2/g 내지 500 m2/g인 다공성 나노 복합체.
  8. 제 4 항에 있어서, 평균 직경이 2 nm 내지 50 nm 미만의 메조 기공의 부피는 0. 05 cm3/g 내지 0.75 cm3/g인 다공성 나노 복합체.
  9. 제 1 항에 있어서, 생체 적합성 물질은 양이온성 작용기 및 음이온성 작용기를 갖는 양쪽성 이온(Zwitterion)물질인 다공성 나노 복합체.
  10. 제 9 항에 있어서, 양쪽성 이온 물질은 키토산, 3-[N,N-디메틸(3-미리스토일아미노프로필)암모니오]프로판설포네이트, 3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트, 3-[(3-콜라미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판설포네이트, N-데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트, 아미도설포베타인-16, 4-n-옥틸벤조일아미도-프로필-디메틸암모니오설포베타인, 3-(1-피리디노)-1-프로판 설포네이트, 설포베타인 메타크릴레이트, 카르복시베타인 메타크릴레이트, 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린, 티로신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 트립토판, 발린, 히스티딘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 다공성 나노 복합체.
  11. 제 9 항에 있어서, 양쪽성 이온 물질은 양이온성 작용기에 대한 음이온성 작용기의 몰비가 0.05 내지 0.95인 다공성 나노 복합체.
  12. 제 11 항에 있어서, 양쪽성 이온 물질은 키토산이며, 양이온성 작용기는 키토산 아민기이고 음이온성 작용기는 숙신산 무수물기인 다공성 나노 복합체.
  13. 제 1 항에 있어서, 평균직경이 50 nm 내지 500 nm인 다공성 나노 복합체.
  14. 제 1 항에 있어서, 생체 적합성 물질은 탄산칼슘 100 중량부 대비 5 중량부 내지 95 중량부로 포함되는 다공성 나노 복합체.
  15. 제 1 항에 있어서, 표면의 중심선 평균 거칠기 값이 0.5 nm 내지 50 nm인 다공성 나노 복합체.
  16. 이산화탄소 기체의 흐름에 탄산칼슘 전구체 수용액을 분무하여 탄산칼슘 나노입자를 형성하는 제 1 분무 단계;
    상기 탄산칼슘 나노입자에 생체 적합성 물질을 포함하는 용액을 분무하여 생체 적합성 물질이 부착된 탄산칼슘 나노입자를 포함하는 액적을 형성하는 제 2 분무 단계; 및
    상기 생체 적합성 물질이 부착된 탄산칼슘 나노입자에 300 nm 이하의 광을 조사하는 광 조사 단계를 포함하는 다공성 나노 복합체의 제조 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 탄산칼슘 전구체 수용액은 탄산수소칼슘 수용액인 다공성 나노 복합체의 제조 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 제 1 분무 단계에서 형성된 탄산칼슘 나노입자를 건조하는 건조 단계를 추가로 포함하는 다공성 나노 복합체의 제조 방법.
  19. 제 16 항에 있어서, 광 조사 단계는 생체 적합성 물질이 부착된 탄산 칼슘 나노입자를 포함하는 액적으로부터 용매를 추출하는 용매 추출 단계와 동시에 수행되는 다공성 나노 복합체의 제조 방법.
  20. 제 16 항에 있어서, 이산화탄소 기체 흐름의 유량은 0.5 L/min 내지 50 L/min로 제어되는 다공성 나노 복합체의 제조 방법.
  21. 이산화탄소 기체 흐름에 탄산칼슘 전구체 수용액을 분무하는 제 1 분무장치를 포함하고 탄산칼슘 나노입자를 형성하는 제 1 분무부;
    상기 탄산칼슘 나노입자에 생체 적합성 물질을 포함하는 용액을 분무하는 제 2 분무장치를 포함하고, 생체 적합성 물질이 부착된 탄산 칼슘 나노입자를 포함하는 액적을 형성하는 제 2 분무부; 및
    상기 생체 적합성 물질이 부착된 탄산칼슘 나노입자에 300 nm 이하의 광을 조사하는 광원을 포함하는 광 조사부;를 포함하며,
    상기 제 1 분무부, 제 2 분무부 및 광 조사부는 이산화탄소 기체가 흐르는 조건 하에 유지되는 다공성 나노 복합체의 제조 장치.
  22. 제 21 항에 있어서, 제 1 분무부에서 형성된 탄산칼슘 나노입자를 건조시키는 건조 장치를 추가로 포함하는 다공성 나노 복합체의 제조 장치.
  23. 제 21 항에 있어서, 광 조사부에는 생체 적합성 물질이 부착된 탄산 칼슘 나노입자를 포함하는 액적으로부터 용매를 추출시키는 추출 수단을 추가로 포함하는 다공성 나노 복합체의 제조 장치.
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