WO2018079499A1 - 同種造血幹細胞移植後の予後の予測を補助する方法 - Google Patents

同種造血幹細胞移植後の予後の予測を補助する方法 Download PDF

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WO2018079499A1
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transplantation
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秀和 ▲高▼橋
剛 田邉
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Yamaguchi University NUC
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Yamaguchi University NUC
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for assisting prediction of prognosis after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, and a prognostic prediction kit after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation used in such a method.
  • Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation refers to hematopoietic stem cell transplantation using a cell other than itself as a donor. Although the survival rate after allogeneic transplantation has improved compared to before, the 5-year survival rate is only 40-60%. In addition, means for preventing post-transplant complications such as acute graft-versus-host disease (AGvHD) and chronic graft-versus-host disease (CGvHD) are still limited. ing.
  • AGvHD acute graft-versus-host disease
  • CGvHD chronic graft-versus-host disease
  • the allele (match) mismatch (match / mismatch) at the HLA locus between donor and recipient is well known. It is standard practice to match HLA alleles between recipients.
  • the major HLA genes are composed of 6 loci of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DPB1, and HLA-DQB1, and there are a total of 12 alleles in the diploid human genome. Because the HLA locus is very polymorphic, it is extremely difficult to find a 12/12 allele matching donor for all recipients.
  • HLA-DPB1 and HLA-DQB1 which are relatively unimportant in bone marrow transplantation between unrelated individuals, are not considered, and a total of three loci of HLA-A, HLA-B, and HLA-DRB1 are used. It is standard in developed countries to match and to match the HLA-C locus for possible recipients (6 / 8-8 / 8 allyl match).
  • polymorphisms of genes other than HLA As a method for further improving the prognosis after allogeneic transplantation, it is conceivable to use polymorphisms of genes other than HLA. In fact, search for genetic polymorphisms such as single-nucleotide polymorphism (SNP) affecting prognosis after allogeneic transplantation has been conducted all over the world. However, no polymorphism has been found that is reproducible and has a strong effect that affects clinical practice.
  • SNP single-nucleotide polymorphism
  • KIR Insert cell immunoglobulin like receptor
  • Patent Document 1 The KIR (Killer cell immunoglobulin like receptor) gene family has been proposed as one of the few non-HLA SNP candidates that affect the prognosis after allogeneic transplantation (see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • KIR encodes a receptor protein that physically binds directly to HLA at the cell surface.
  • the combination of the KIR gene and the recipient HLA-C allele (not a donor mismatch) in this document affects recurrence after allogeneic transplantation for patients with acute myelogenous leukemia (AML).
  • AML acute myelogenous leukemia
  • NLRP3 which is an intracellular NOD-like receptor family, is a protein that activates Caspase-1 by inflammasome formation.
  • Such single nucleotide polymorphisms of NLRP3 are related to the onset of familial cold autoinflammatory syndrome, fulminant allergic diseases, etc.
  • HLA mismatch allogeneic hematopoietic cell transplantation the relationship between the single nucleotide polymorphism of NLRP3 and the prognosis in the transplantation is not described, and the type of recipient disease is not considered. .
  • an object of the present invention is to provide a method for predicting the prognosis after transplantation for each primary disease even when the HLA is partially mismatched.
  • the present inventors first attempted to identify both donor and recipient SNPs affecting prognosis after bone marrow transplantation. From October 2006 to April 2009, the subjects performed unrelated bone marrow transplantation that minimally matched a total of 3 loci and 6 alleles of HLA-A, HLA-B, and HLA-DRB1 via the Japan Bone Marrow Bank. 999 pairs of donors and recipients received. Since the HLA-C locus is not always matched, it can be said to be an HLA locus 6 / 8-8 / 8 allyl match.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the present invention is as follows. (1) Among alleles at all four loci of HLA genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, and HLA-DRB1, 1 allele or 2 alleles are mismatched between donor and recipient in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation And when the recipient's primary disease is a malignant blood disease (excluding myelodysplastic syndrome (MDS)), the 26th base (rs10925027, C) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the donor or recipient NLRP3 gene Or a single nucleotide polymorphism in T), or a single nucleotide polymorphism in the 26th base of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 (rs46212666, C or T) or a single nucleotide polymorphism in linkage disequilibrium with these, and A method of assisting in predicting the prognosis after transplantation using the type of the primary
  • Prognosis is onset of 2-4 grade acute graft-versus-host disease (2-4AGvHD), onset of chronic graft-versus-host disease (CGvHD), overall survival (OS), or non-recurrent mortality (NRM)
  • 2-4AGvHD acute myeloid leukemia
  • ALL acute lymphocytic leukemia
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • LM lymphoid malignant tumor
  • MPD myeloproliferative disease
  • plasma cell is a sex tumor (PCD) or a solid tumor (ST).
  • a prognostic kit for predicting prognosis after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation which is used in the method according to (1) to (6) above, comprising the probe according to [1] or [2] below: And a kit.
  • HLA is partially mismatched, that is, the same species in the case where 1 allele or 2 alleles are mismatched among 8 alleles at the 4 loci of HLA-A, HLA-B, HLA-C, and HLA-DRB1 of the HLA gene It becomes possible to predict the prognosis after transplantation. By performing such a prognostic prediction, it is possible to select a donor with a lower risk of developing complications or mortality when selecting a donor.
  • FIG. 7 shows clinical data for 999 pairs of recipients.
  • FIG. 9 shows clinical data (upper) and transplantation data (lower) of 999 pairs of donors. It is a figure which shows matching of HLA and blood type in a 999 pair donor and a recipient.
  • Example 1 shows the results of cumulative incidence curves (CICs) analysis (unadjusted analysis) of extensive CGvHD (ExCGvHD) based on the combination of donor NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch FIG.
  • CICs cumulative incidence curves
  • HLA-C MM means HLA-C mismatch
  • HLA-C MM 0 means no HLA-C mismatch
  • HLA-C MM 1 means an HLA-C mismatch of 1 or 2 (dashed line: 1 or 2 allyl mismatch of HLA-C).
  • the numerical value of N indicates the number of donor-recipient pairs used in the analysis (the same applies to FIGS. 4A to 14B below).
  • pmt represents a value obtained by Gray test using permutation (the same applies to FIGS. 4A, B, 6C, and 8 below).
  • P is a value obtained by a normal Gray test (the same applies to the NRM and release in FIGS. 4A to C, FIGS. 6A to E, FIGS. 7A and B, FIGS. 8, 10, and 14A and B below).
  • CICs cumulative generation curve
  • the horizontal axis is the number of years after transplantation, and the vertical axis is the cumulative incidence of ExCGvHD (the same applies to FIGS. 4B and 4C below).
  • the cumulative occurrence curve (CICs) analysis (unadjusted analysis) result of EXCGvHD based on the combination of SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch of donor NLRP3 (ALL patient or 6others patient (6others patient: CML))
  • FIG. 4 is a view showing other patients (any of leukemia, LM, MPD, PCD, and ST other than AML / ALL / CML).
  • Example 1 it is a figure which shows the cumulative generation curve (CICs) analysis (unadjusted analysis) result (MDS patient) of ExCGvHD based on the combination of SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch of donor NLRP3.
  • CICs cumulative generation curve
  • production of ExCGvHD multivariate analysis
  • HLA-C MM is the number of HLA-C mismatches (HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 total tridentate 6 alleles match, and at least one allele of HLA-C 2 alleles is mismatched) ( 0, 1, or 2) (same in FIGS. 9 and 12 below),
  • Donor rs10925027 (T-additive) shows the effect based on the number of T alleles (0, 1, or 2)
  • HLA -C MM x Donor rs10925027 shows the effect of the product of these two numbers.
  • P and P.I. xt is a value obtained by the Wald test (the same applies to FIGS. 9 and 12 below).
  • Example 2 shows the results of cumulative curve analysis (unadjusted analysis) of 2-4AGvHD based on the combination of recipient NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46261266) and HLA-C mismatch (all malignant patients)
  • FIG. The horizontal axis is the number of days after transplantation, and the vertical axis is the cumulative incidence of 2-4AGvHD (the same applies to FIGS. 6B to 6E below).
  • it is a figure which shows the cumulative generation curve analysis (unadjusted analysis) result (AML patient) of 2-4AGvHD based on the combination of recipient's NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46261266) and HLA-C mismatch.
  • Example 2 it is a figure which shows the cumulative generation curve analysis (unadjusted analysis) result (ALL patient) of 2-4AGvHD based on the combination of recipient's NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46261266) and HLA-C mismatch.
  • Example 2 it is a figure which shows the cumulative generation curve analysis (unadjusted analysis) result (MDS patient) of 2-4AGvHD based on the combination of recipient's NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch.
  • Example 2 it is a figure which shows the cumulative generation curve analysis (unadjusted analysis) result (6others patient) of 2-4AGvHD based on the combination of SNP (rs46212666) and HLA-C mismatch of recipient NLRP3.
  • Example 3 it is a figure which shows the cumulative occurrence curve analysis (unadjusted analysis) result (AML patient) of the non-relapse death (NRM) based on the combination of donor's NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch.
  • P (T-domi) is a value obtained by a normal Gray test under the T dominant model (the same applies to FIG. 7B below).
  • Example 3 it is a figure which shows the cumulative occurrence curve analysis (unadjusted analysis) result (ALL patient) of the non-relapse mortality (NRM) based on the combination of donor's NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch. .
  • Example 3 it is a figure which shows the cumulative occurrence curve analysis (unadjusted analysis) result of non-relapse mortality (NRM) based on the combination of donor NLRP3 SNP (rs46212666) and HLA-C mismatch.
  • 8A is a 6others patient
  • FIG. 8B is a CML patient or other leukemia patient
  • FIG. 8C is a LM, PCD, MPD, or ST patient.
  • Example 3 it is a figure which shows the multivariate analysis result by Fine-Gray proportional hazard regression of the non-recurrence death (NRM) based on the interaction of donor's NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch.
  • FIG. 9A shows the case of HLA-C MM, which is non-relapse mortality (NRM) over the entire follow-up period.
  • Example 9 shows HLA-C / Q / P MM (HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 total 3 6 alleles match, HLA-C, HLA-DPB1, HLA-DQB1 total 3 This is the case of at least one allele of locus 6 alleles and mismatched deaths (NRM) within 100.
  • Example 4 it is a figure which shows the cumulative occurrence curve analysis (unadjusted analysis) result of the non-relapse mortality (NRM) based on the combination of SNP of recipient NLRP3, and HLA-C mismatch.
  • the patient's primary disease is ALL.
  • the horizontal axis is the number of years after transplantation, and the vertical axis is the cumulative incidence of non-recurrent deaths.
  • Example 5 it is a figure which shows the univariate Kaplan-Meier analysis result (AML patient) of the overall survival rate (OS) based on the combination of SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch of donor NLRP3.
  • P is a value obtained by a normal log-rank test (the same applies to the OS in FIGS. 11B and 11C, FIGS. 13A and 13B, and FIGS. 14A and 14B below).
  • P (T-domi) is a value obtained by a normal log-rank test under the T dominant model (the same applies to FIG. 13A below).
  • the horizontal axis represents the number of years after transplantation, and the vertical axis represents the overall survival rate (OS) (the same applies to FIGS. 11B and 11C below).
  • OS overall survival rate
  • Example 5 it is a figure which shows the univariate Kaplan-Meier analysis result (ALL patient) of the overall survival rate (OS) based on the combination of SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch of donor NLRP3.
  • P. pmt is a value obtained by a log-rank test using permutation (the same applies to FIG. 11C below).
  • Example 5 it is a figure which shows the univariate Kaplan-Meier analysis result (6others patient) of the overall survival rate (OS) based on the combination of SNP (rs46212666) and HLA-C mismatch of donor NLRP3.
  • Example 5 it is a figure which shows the multivariate analysis result by Cox proportional hazard regression of the overall survival rate (OS) based on interaction of SNP (rs10925027) and HLA-C mismatch of donor NLRP3.
  • Example 6 it is a figure which shows the univariate Kaplan-Meier analysis result (AML patient) of the survival rate (OS) based on the combination of SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch of recipient NLRP3.
  • the horizontal axis represents the number of years after transplantation, and the vertical axis represents the overall survival rate (OS) (the same applies to FIG. 13B below).
  • Example 6 it is a figure which shows the univariate Kaplan-Meier analysis result (ALL patient) of the overall survival rate (OS) based on the combination of recipient's NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch.
  • Example 7 it is a figure which shows the analysis result (original disease is an AML patient) about the relationship between onset of CGvHD, non-relapsed death, relapse, and overall survival rate.
  • “Limited” indicates a case where localized CGvHD is developed
  • “Extensive” indicates a case where ExCGvHD is developed.
  • Example 7 it is a figure which shows the analysis result (original disease is a 6others patient) about the relationship between onset of CGvHD, non-relapsed death, relapse, and overall survival rate. It is a figure which shows the example of the donor selection method using this invention.
  • the HLA genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, and HLA-DRB1 at the four loci between donors and recipients in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation Among 8 alleles, in the case where 1 allele or 2 alleles are mismatched and the recipient's primary disease is malignant blood disease (excluding myelodysplastic syndrome (MDS)), SEQ ID NO: 1 of the donor or recipient NLRP3 gene
  • MDS myelodysplastic syndrome
  • Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation means hematopoietic stem cell transplantation using cells other than autologous donors. Such allogeneic transplantation is a radical treatment method for malignant blood diseases, and can be classified into bone marrow transplantation, peripheral blood transplantation, or umbilical cord blood transplantation according to stem cell-derived tissue. Bone marrow transplantation is preferable. Further, allogeneic hematopoietic stem cell transplantation can be classified according to the donor into interrelated allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and unrelated allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.
  • the race of the recipient and / or donor of the present invention is not particularly limited, and may be any of Japanese, East Asian, West Asian, North American, South American, European, African, preferably East Asians, more preferably Japanese.
  • the recipient using the present invention is preferably a first transplant patient.
  • malignant blood diseases means diseases other than MDS among malignant blood diseases.
  • diseases other than MDS include acute myeloid leukemia (AML), acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic myeloid leukemia (CML), leukemia (OL) other than AML, ALL and CML, lymphatic system Malignant tumor (LM), myeloproliferative disease (MPD), plasma cell tumor (PCD), or solid tumor (ST) can be mentioned, ALL or AML can be mentioned preferably, ALL more preferably Can be mentioned.
  • the SNP at the 26th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the NLRP3 gene is an intron SNP involved in susceptibility to food-induced anaphylaxis and aspirin-induced asthma in Japanese.
  • SNP (rs10925027) in the 26th base of the base sequence shown to sequence number 2 of NLRP3 gene is SNP located downstream of both NLRP3 and OR2B11 genes.
  • the rs number is a reference number (Reference SNP ID number) of the SNP in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) SNP database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/).
  • the linkage disequilibrium relationship means that in a population of organisms, there is a non-random correlation between alleles or genetic markers (polymorphisms) of a plurality of loci, that is, a specific combination thereof ( Haplotype) means a population genetic phenomenon where the frequency of the haplotype is significantly higher, linkage disequilibrium coefficient r 2 > 0.5, preferably r 2 > 0.6, more preferably r 2 > 0. Examples include bases that satisfy 64 relationships.
  • the SNPs having a linkage disequilibrium (r 2 > 0.64) relationship with rs10925027 include rs121143966, rs4925659, rs111307268, rs60882383, rs1015932929, rs60883325, rs1074753, rs104853, rs104853 , Rs10733112, and rs4925663, and SRSs that have a linkage disequilibrium (r 2 > 0.64) relationship with rs46212666 include rs3806265 and rs3838354.
  • the linkage disequilibrium coefficient can be calculated with VCFtools version 0.1.11.
  • the prognosis in the present invention is not particularly limited as long as it is a complication, survival rate or death resulting from allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, but the onset of class 2-4 acute graft-versus-host disease (2-4AGvHD), extensive chronic graft Mention of host disease (ExCGvHD), overall survival (OS), or non-recurrent mortality (death without primary disease recurrence: NRM).
  • 2-4AGvHD acute graft-versus-host disease
  • ExCGvHD extensive chronic graft Mention of host disease
  • OS overall survival
  • NRM non-recurrent mortality
  • kits for predicting prognosis after transplantation of allogeneic hematopoietic stem cells of the present invention the kit for predicting prognosis after transplantation of allogeneic hematopoietic stem cells used in the method for assisting prediction of prognosis after transplantation in the above-mentioned allogeneic hematopoietic stem cell transplantation of the present invention
  • the kit is not particularly limited as long as it includes the following probe (1) or (2), and each SNP can be detected by using such a probe.
  • a probe comprising an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with a sequence of 15 to 50 bases comprising
  • a single nucleotide polymorphism at the 26th base (rs46212666, T or C) of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a single nucleotide polymorphism in a relationship of linkage disequilibrium with the single nucleotide polymorphism
  • a probe comprising an oligonucleotide that hybridizes under stringent conditions with a sequence of 15 to 50 bases comprising
  • the probe may be 15 to 50 bases, preferably 10 to 40 bases, more preferably 15 to 30 bases.
  • an oligo probe synthesized using an artificial nucleic acid such as Locked Nucleic Acid (LNA) as a probe it is possible to obtain a probe that specifically hybridizes even with a short base.
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • the above stringent conditions refer to conditions in which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Specifically, 6 ⁇ SSC (1.5 M NaCl, 0.15 M tricitrate A solution containing sodium is assumed to be 10 ⁇ SSC), and a hybrid is formed at 45 ° C. in a solution containing 50% formamide, followed by washing with 2 ⁇ SSC at 50 ° C. (Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6) or 3 ⁇ SSC / 0.3 ⁇ SDS in a solution containing hybrids at 54 ° C. (10 ⁇ SSC / 1% SDS solution), cleaning solution B (20 ⁇ SSC), and cleaning solution C (5 ⁇ SSC) are sequentially washed (see JP 2011-250726 A).
  • SNP a method for analyzing a known SNP can be used.
  • a real-time PCR method a direct sequencing method, a Taqman (registered trademark) PCR method, an Invader (registered trademark) method, a Luminex (registered trademark) method, a quenching primer / Probe (QP) method, MALDI-TOF method, molecular beacon method and the like.
  • a nucleic acid fragment containing a SNP site to be measured by an amplification reaction using genomic DNA of a biological sample collected from a donor or a recipient as a template is amplified by PCR using a primer, and the nucleic acid fragment obtained
  • a method for detecting hybridization with a pair of probes corresponding to a wild type and a variant type and a method for detecting a wild type and a variant type by using a probe specific to the SNP site in the PCR amplification process. Can be mentioned.
  • the probe of the present invention may be used by being fixed on a carrier.
  • the carrier include a planar substrate and a bead-like spherical carrier. Specifically, the above-mentioned JP2011-250726A. And the carrier described in the publication.
  • the probe for detecting the wild type and the probe for detecting the variant type may be fixed to the same carrier or different carriers.
  • the probe can be obtained by, for example, chemically synthesizing with a nucleic acid synthesizer.
  • a nucleic acid synthesizer a DNA synthesizer, a fully automatic nucleic acid synthesizer, or the like can be used.
  • the method for measuring HLA is not particularly limited, and examples thereof include an LCT method, a DNA typing method, and a fluorescent bead method.
  • the prognostic kit for prognosis after transplantation of allogeneic hematopoietic stem cells may contain a reagent for HLA measurement according to the method for measuring each HLA.
  • Genomic DNA was purified from 200 ⁇ L of donor and recipient peripheral blood using QIAamp DNA Blood Mini kit (manufactured by Qiagen), and amplified with Illustra GenomiPhiHY kit (manufactured by GE Healthcare).
  • FIG. 1 shows the TaqMan assay probe, the sequence of the primers used in the PCR direct sequence, and the sequence in the vicinity of the SNP.
  • DNA sequencing reaction was performed using primers and BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit, and analyzed with 3730 ⁇ DNA Analyzer (Applied Biosystems). For each SNP base, after visual inspection of each chromatogram, the ratio of the peak height of the strongest signal base and the second strongest base was calculated. When the peak ratio was less than 3, the genotype was judged to be heterozygous. When the peak ratio was 3 or more, it was judged to be homozygous for the strongest signal base.
  • the subjects performed unrelated bone marrow transplantation with minimal matching of all three loci and 6 alleles of HLA-A, HLA-B, and HLA-DRB1 through the Japan Bone Marrow Bank from October 2006 to April 2009. 999 pairs of donors and recipients that meet the following four conditions: The four conditions are: a Japanese pair, a donor age of 20 years or older, survival data after transplantation of the patient, and the HLA12 locus was actually genotyped and actually HLA-A , HLA-B, HLA-DRB1 6 alleles are confirmed to be matched. Since the HLA-C locus is not necessarily matched, it can be said to be an HLA locus 6/8, 7/8, or 8/8 allyl match.
  • the donor and recipient clinical data, transplant data and matching are shown in FIGS. 2A-C.
  • CGvHD Primary endpoints for prognosis after transplantation are grade 2-4 acute GvHD (2-4AGvHD), overall survival (OS), chronic GvHD (CGvHD), non-recurrent mortality (NRM), and relapse within 100 days after transplantation .
  • Major events for OS and NRM were defined as death from all factors and death from without relapse, respectively.
  • AGvHD is a classic classification (Glucksberg, H. et al.
  • the following libraries of R language environment were used as statistical analysis software. Survival library (version 2.38) for Kaplan-Meier curve, Log-rank test, cumulative occurrence curve, and Cox proportional hazard regression, Gray test, and cmprsk library (version for Fine-Gray proportional hazard regression) 2.2), MASS library (version 7.3) and crrstep (version 2015-2) were used for variable selection, and aod library (version 1.3) was used for Wald test. The Log-rank test and Gray test using permutation were performed in the same manner as the permllogrank function included in the clinfun library (version 1.0).
  • Example 1 Interaction (combination) of donor NLRP3 SNP and HLA-C mismatch on diffuse chronic GvHD (ExCGvHD)
  • the cumulative occurrence curves (CICs) of ExCGvHD based on the combination of donor NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch were analyzed by the above method. The results are shown in FIGS. 3 and 4A to C. Furthermore, multivariate analysis was performed by Fine-Gray proportional hazard regression based on the interaction between the donor NLRP3 SNP (rs10925027) and HLA-C mismatch. The results are shown in FIG.
  • the genotype of the NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) on the donor side should be a high expression type (CC).
  • CC high expression type
  • the cumulative incidence of ExCGvHD is low at the same level as the 8/8 allele match of HLA-A, HLA-B, HLA-C, and HLA-DRB1
  • TT low expression type
  • the NLRP3 SNP genotype on the recipient side may be a high expression type (CC).
  • CC high expression type
  • the cumulative incidence of 2-4AGvHD was low, but when HLA-C was 1-2 allyl mismatch, it was revealed that the cumulative incidence of 2-4AGvHD was rather high.
  • FIGS. 6B to 6E a subgroup analysis was performed for each primary disease of the recipient. As a result, the cumulative incidence of 2-4AGvHD when HLA-C is 2 allele mismatch and the recipient NLRP3 SNP genotype is high expression type (CC) is high in AML or ALL patients. High in ALL patients.
  • Example 3 Effect of Donor NLRP3 SNP and HLA-C Mismatch Combination on Non-Recurrent Mortality (NRM) NRM Based on Combination of Donor NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C Mismatch Using the above Method A cumulative generation curve analysis was performed. The results are shown in FIGS. 7A, B, and 8. Furthermore, multivariate analysis was performed by Fine-Gray proportional hazard regression based on the interaction between the donor NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch. The results are shown in FIG.
  • NRM HLA-
  • CT or TT low expression type
  • NRM HLA-
  • the cumulative incidence was higher than the 8/8 allele match of A, HLA-B, HLA-C, and HLA-DRB1, and this risk trend was strongly seen in the early post-transplant period within 4 months after transplant.
  • NRM is more cumulative than HLA8 / 8 allele match if HLA-C is mismatched and donor NLRP3 SNP genotype is highly expressed (CC) The rate was even lower.
  • Example 4 Effect of Combination of Recipient NLRP3 SNP and HLA-C Mismatch on Non-Recurrent Death (NRM) In combination of recipient NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch Based on the NRM cumulative generation curve analysis. The results are shown in FIG.
  • Example 5 Effect of Donor NLRP3 SNP and HLA-C Mismatch Combination on Overall Survival (OS) All of the above based on the combination of donor NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch A Kaplan-Meier curve (KMCs) analysis of viability was performed. The results are shown in FIGS. 11A-C. Furthermore, multivariate analysis was performed by Cox proportional hazard regression based on the interaction between the donor NLRP3 SNP (rs10925027) and the HLA-C mismatch. The results are shown in FIG.
  • KMCs Kaplan-Meier curve
  • donor NLRP3 SNPs are under-expressed when 8/8 allele matches of HLA-A, HLA-B, HLA-C, and HLA-DRB1
  • the type (CT or TT) was higher in OS than the high expression type (CC).
  • the donor NLRP3 SNP was higher in the high expression type (CC) than in the low expression type (CT or TT).
  • OS Since OS has a combined effect of adding the effect of relapse (due to death) to the effect of NRM, and relapse showed a tendency opposite to that of NRM (not shown), OS has a difference in the vertical axis compared to NRM. The width became smaller.
  • Example 6 Effect of combination of recipient NLRP3 SNP and HLA-C mismatch on overall survival (OS) Combination of recipient NLRP3 SNP (rs10925027 or rs46212666) and HLA-C mismatch by the above method Kaplan-Meier curve (KMCs) analysis of OS based on. The results are shown in FIGS. 13A and 13B.
  • Example 7 Effect of CGvHD on non-recurrent mortality (NRM), recurrence, and overall survival (OS) Presence of CGvHD onset within 1 year after transplantation is related to NRM, recurrence, and OS after 1 year A univariate analysis was performed to see what effect it had. The results are shown in FIGS. 14A and 14B.
  • the present invention can be used in donor selection in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.

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Abstract

本発明の課題は、同種造血幹細胞移植において、ドナーとレシピエントとのＨＬＡが一部ミスマッチの場合においても移植後の予後を予測する方法を提供することにある。　同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチで、かつレシピエントが悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群（ＭＤＳ）を除く）の患者の場合において、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらの連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及びレシピエントの原疾患の種類を指標として移植後の予後の予測を補助する。

Description

同種造血幹細胞移植後の予後の予測を補助する方法
　本発明は、同種造血幹細胞移植後の予後の予測を補助する方法や、かかる方法に使用する、同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットに関する。
　同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ　ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：以下、「同種移植」ともいう）とは自分以外の細胞をドナーとする造血幹細胞移植のことである。同種移植後の生存率は以前より改善されてはいるものの、５年生存率は４０－６０％にとどまっている。また急性移植片対宿主病（ａｃｕｔｅ　ｇｒａｆｔ―ｖｅｒｓｕｓ―ｈｏｓｔ　ｄｉｓｅａｓｅ：ＡＧｖＨＤ）や慢性移植片対宿主病（ｃｈｒｏｎｉｃ　ｇｒａｆｔ―ｖｅｒｓｕｓ―ｈｏｓｔ　ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＧｖＨＤ）等の移植後の合併症を防ぐ手段は依然限られている。
　同種移植においては、投薬治療よりも最適なドナーの選択法を確立することによって死亡や合併症を予防することが望ましい。同種移植後の予後に影響を与える遺伝学的因子としてドナーとレシピエント間のＨＬＡ座における対立遺伝子（アリル）の適合度（マッチ／ミスマッチ）は良く知られており、同種移植の際にドナーとレシピエント間のＨＬＡアリルをマッチさせることが標準的に行われている。主要なＨＬＡ遺伝子はＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１の６座からなり、２倍体であるヒトゲノムにおいて合計１２アリル存在する。ＨＬＡ遺伝子座は非常に多型的であるため、全てのレシピエントについて１２／１２アリルマッチするドナーを見つけることは極めて難しい。また、主要なＨＬＡがある程度以上マッチしていれば、１２／１２アリル全マッチと移植後の予後に大きな差はないという報告もある。これらの理由で、非血縁者間骨髄移植においては重要性の相対的に低いＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１は考慮せず、最低限ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の合計３座をマッチさせて、可能なレシピエントについてはさらにＨＬＡ－Ｃ座もマッチ（６／８－８／８アリルマッチ）させる方法が先進国では標準的である。
　同種移植後の予後をさらに改善する方法として、ＨＬＡ以外の遺伝子の多型を利用することが考えられる。実際、同種移植後の予後に影響する一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ―ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）等の遺伝的多型の探索が世界中で行われてきた。しかし、再現性があり臨床に影響を与えるような強い効果を持つ多型は見出されていない。
　同種移植後の予後に影響を与える数少ない非ＨＬＡのＳＮＰの候補としてはＫＩＲ（ｋｉｌｌｅｒ　ｃｅｌｌ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子ファミリーが提案されている（特許文献１、非特許文献１参照）。ＫＩＲは細胞表面でＨＬＡと直接物理的に結合する受容体タンパク質をコードする。しかし、かかる文献におけるＫＩＲ遺伝子とレシピエント側のＨＬＡ－Ｃアリル（ドナーとのミスマッチではない）の組み合わせが急性骨髄性白血病（Ａｃｕｔｅ　Ｍｙｅｌｏｌｄ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ：ＡＭＬ）患者に対する同種移植後の再発に影響を与えるという主要な結果の解釈に疑問が呈され（非特許文献２参照）、対する非特許文献１の著者の返答で交互作用は有意でない（Ｐ＝０．１４）ことが報告された（非特許文献３参照）。また、非特許文献１のＦｉｇｕｒｅ　３Ｃには、ＫＩＲ遺伝子の再発予防効果がＨＬＡ－Ｃのミスマッチの存在に依存するという結果も報告されていたが、論文の遺伝子型解読結果が多くの誤りを含んでいたことが著者から後に報告されて、修正後のＦｉｇｕｒｅ　３Ｃの解析結果は有意でない（Ｐ＝０．２４）ことが判明した（非特許文献４参照）。さらに同じグループからの追加研究では元の結果は再現されなかった（非特許文献５参照)。上記からＫＩＲ遺伝子とＨＬＡアリルの組み合わせの効果は世界的にも十分に確認されているとは言えない現状である。また、日本人等の集団ではそもそもＨＬＡ－ＣのＫＩＲタンパク質との結合に関与するアリルの多型の頻度が非常に低いため、臨床応用は難しいと思われる。
　一方、細胞内のＮＯＤ－ｌｉｋｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｆａｍｉｌｙであるＮＬＲＰ３は、インフラマソーム形成によりＣａｓｐａｓｅ－１を活性化させるタンパク質である。かかるＮＬＲＰ３の一塩基多型は、家族性感冒自己炎症性症候群の発症原因やアレルギー疾患の劇症化等と関係していること（特許文献２、非特許文献６参照）や、同種造血細胞移植において、マウスのレシピエントＮＬＲＰ３遺伝子がＭＨＣミスマッチ移植におけるＡＧｖＨＤに関与すること（非特許文献７参照）や、ＨＬＡが完全に一致した兄弟姉妹間移植の同種造血細胞移植において、ドナーのＮＬＲＰ３の一塩基多型が再発、全生存率、移植関連死亡率、又はＧｖＨＤに関与すること（非特許文献８－１０参照）が開示されている。しかしながら、ＨＬＡミスマッチの同種造血細胞移植において、かかるＮＬＲＰ３の一塩基多型と前記移植における予後との関係は記載されておらず、またレシピエントの原疾患（underlying　disease）の種類も考慮されていない。
　このように、ＨＬＡの適合度以外には同種移植後の予後を予測する手段は実用化されていない。
特表２０１６－５１７０８８号公報 特開２０１１－２４４７８号公報
Venstrom　et　al.,　HLA-C-dependent　prevention　of　leukemia　relapse　by　donor　activating　KIR2DS1.　N.　Engl.　J.　Med.　367,　805-816（2012） Fischer　&　Uhrberg.　Prevention　of　leukemia　relapse　by　donor　activating　KIR2DS1.　N.　Engl.　J.　Med.　367,　2054-2055(2012） N.　Engl.　J.　Med.　367,　author　reply　2055.(2012） Venstrom　et　al.,　Donor　activating　KIR2DS1　in　leukemia.　N.　Engl.　J.　Med.　371,　2042(2014) Sobecks,　R.M.　et　al.　Impact　of　KIR　and　HLA　Genotypes　on　Outcomes　after　Reduced-Intensity　Conditioning　Hematopoietic　Cell　Transplantation.　Biol.　Blood　Marrow　Transplant.　21,　1589-159(2015) Hitomi,　Y　et　al.　Associations　of　functional　NLRP3　polymorphisms　with　susceptibility　to　food-induced　anaphylaxis　and　aspirin-induced　asthma.　Journal　of　Allergy　and　Clinical　Immunology　Volume　124,　Issue　4,　Pages　779-785.e6(2009) Jankovic,　D.　et　al.　The　Nlrp3　inflammasome　regulates　acute　graft-versus-host　disease.　J.　Exp.　Med.　210,　1899-1910(2013). Granell　M.　et　al.　Common　variants　in　NLRP2　and　NLRP3　genes　are　strong　prognostic　factors　for　the　outcome　of　HLA-identical　sibling　allogeneic　stem　cell　transplantation.　Blood　15:4337-4342(2008) Takami,　A.　et　al.　Association　of　Functional　Single　Nucleotide　Variation　in　the　NLRP3　Gene　with　Survival　Outcomes　After　Unrelated　Bone　Marrow　Transplantation.　Blood　120:3140(2012) Takami,　A.　et　al.　A　Single　Nucleotide　Polymorphism　in　the　NLRP3　Gene　Is　Associated　with　Acute　Graft-Versus-Host　Disease　After　HLA-Matched　Unrelated　Bone　Marrow　Transplantation.　Blood　118:4073(2011)
　上述のように、これまでは同種移植後の予後予測に関する研究において、ＨＬＡが１２／１２アリルマッチした同種移植を対象にして、レシピエントの原疾患を区別せずに解析している例が多かった。しかしながら、ＨＬＡが１２／１２アリルマッチした同種移植は現在の臨床現場では少数に限られており、実際には多数の実施例を占めるＨＬＡが一部ミスマッチの場合において、原疾患ごとに移植後の予後を予測する方法が求められていた。そこで本発明の課題は、ＨＬＡが一部ミスマッチの場合においても原疾患ごとに移植後の予後を予測する方法を提供することにある。
　本発明者らは、まず骨髄移植後の予後に影響を与えるドナーとレシピエント側両方のＳＮＰの同定を試みた。対象者は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の合計３座６アリルを最低限マッチさせた非血縁骨髄移植を、日本骨髄バンクを介して２００６年１０月から２００９年４月に受けた９９９ペアのドナーとレシピエントである。ＨＬＡ－Ｃ座はマッチしているとは限らないので、ＨＬＡ座６／８－８／８アリルマッチといえる。日本骨髄バンクから提供されたこれら計１９９８の被験者のＤＮＡ検体を用いて、ＮＬＲＰ１、ＮＬＲＰ２、ＮＬＲＰ３、及びＣＡＲＤ８の一塩基多型（ＳＮＰ）を計５つ（ＮＬＲＰ３のみ２つずつで、他は１つずつ）の遺伝子型を決定した。そして、移植後の予後と、ドナー及び／又はレシピエントのＳＮＰの遺伝子型との関連について、被験者の臨床データを用いて統計解析を行った。その結果、移植後の予後に関してＨＬＡのミスマッチ（６／８、７／８アリルマッチ）とＮＬＲＰ３の一塩基多型であるｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６の発現型との間で統計的に有意な交互作用があることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチで、かつレシピエントの原疾患が悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群（ＭＤＳ）を除く）の場合において、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらと連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及びレシピエントの原疾患の種類を指標として移植後の予後の予測を補助する方法。
（２）同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の３座における６アリルがマッチしていることを特徴とする上記（１）記載の方法。
（３）同種造血幹細胞移植が非血縁者間同種造血幹細胞移植であることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の方法。
（４）予後が、２－４級急性移植片対宿主病（２－４ＡＧｖＨＤ）発症、慢性移植片対宿主病（ＣＧｖＨＤ）発症、全生存率（ＯＳ）、又は非再発死亡（ＮＲＭ）であることを特徴とする上記（１）～（３）のいずれか記載の方法。
（５）悪性血液疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ系悪性腫瘍（ＬＭ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、形質細胞性腫瘍（ＰＣＤ）、又は固形腫瘍（ＳＴ）であることを特徴とする上記（１）～（４）のいずれか記載の方法。
（６）悪性血液疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）であることを特徴とする上記（５）記載の方法。
（７）上記（１）～（６）記載の方法に使用する、同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットであって、以下の〔１〕又は〔２〕記載のプローブを含むことを特徴とするキット。
〔１〕ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号１に示す２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５～５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
〔２〕ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号２に示す２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５～５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
（８）ＨＬＡを測定するための試薬を含むことを特徴とする上記（７）記載のキット。
　本発明により、ＨＬＡが一部ミスマッチ、すなわちＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチの場合における同種移植後の予後を予測することが可能となる。かかる予後の予測を行うことで、ドナーを選択する際により合併症発症リスクや死亡リスクが少ないドナーを選択することが可能となる。
ＳＮＰ遺伝子型の同定におけるＴａｑＭａｎアッセイのプローブ、ＰＣＲダイレクトシークエンスに用いたプライマーの配列、及びＳＮＰ近傍の配列を示す図である。 ９９９ペアのレシピエントの臨床データを示す図である。 ９９９ペアのドナーの臨床データ（上）及び移植のデータ（下）を示す図である。 ９９９ペアのドナーとレシピエントにおけるＨＬＡや血液型のマッチングを示す図である。 実施例１において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく広範性ＣＧｖＨＤ（ＥｘＣＧｖＨＤ）の累積発生曲線（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｃｕｒｖｅｓ：ＣＩＣｓ）解析（未調整解析）結果を示す図である。レシピエントは図２Ａのグループ１に示す悪性疾患（Ｍａｌｉｇｎａｎｔ）患者（Ｎ＝８２２）である。初回移植症例のみを統計解析の対象とした（以下の図４Ａ－１４Ｂにおいて同様）。なお、図中、「ＨＬＡ－Ｃ　ＭＭ」はＨＬＡ－Ｃミスマッチを意味し、「ＨＬＡ－Ｃ　ＭＭ　０」はＨＬＡ－Ｃミスマッチ無し（実線：ＨＬＡ－Ｃのアリルマッチ）、「ＨＬＡ－Ｃ　ＭＭ　１－２」はＨＬＡ－Ｃミスマッチが１又は２（破線：ＨＬＡ－Ｃの１又は２アリルミスマッチ）を示す。また、Ｎの数値は解析に用いたドナー・レシピエントのペアの数を示し（以下の図４Ａ－図１４Ｂにおいて同様）、Ｐ．ｐｍｔはパーミュテーションを用いたＧｒａｙのテストによる値を示す（以下の図４Ａ、Ｂ、図６Ｃ、図８において同様）。Ｐは通常のＧｒａｙのテストにより求めた値で（以下の図４Ａ～Ｃ、図６Ａ～Ｅ、図７Ａ、Ｂ、図８、図１０、及び図１４Ａ、ＢのＮＲＭとｒｅｌａｐｓｅにおいて同様）ある。 実施例１において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＥｘＣＧｖＨＤの累積発生曲線（ＣＩＣｓ）解析（未調整解析）結果（ＡＭＬ患者）を示す図である。横軸は移植後の年数、縦軸はＥｘＣＧｖＨＤの累積発生率（以下の図４Ｂ、４Ｃも同様）である。 実施例１において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＥｘＣＧｖＨＤの累積発生曲線（ＣＩＣｓ）解析（未調整解析）結果（ＡＬＬ患者又は６ｏｔｈｅｒｓ患者（６ｏｔｈｅｒｓ患者：ＣＭＬ、その他の（ＡＭＬ・ＡＬＬ・ＣＭＬ以外の）白血病、ＬＭ、ＭＰＤ、ＰＣＤ、及びＳＴのいずれかの患者）を示す図である。 実施例１において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＥｘＣＧｖＨＤの累積発生曲線（ＣＩＣｓ）解析（未調整解析）結果（ＭＤＳ患者）を示す図である。 実施例１において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの交互作用に基づくＦｉｎｅ－Ｇｒａｙ比例ハザード回帰による多変量解析（ＥｘＣＧｖＨＤの累積発生）結果を示す図である。また、ＨＬＡ－Ｃ　ＭＭはＨＬＡ－Ｃ　ミスマッチ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の合計３座６アリルがマッチで、ＨＬＡ－Ｃの２アリルのうち少なくとも１アリルがミスマッチ）の数（０、１、又は２）に基づく効果を示し（以下の図９、１２において同様）、Ｄｏｎｏｒ　ｒｓ１０９２５０２７（Ｔ－ａｄｄｉｔｉｖｅ）はＴアリルの数（０、１、又は２）に基づく効果を示し、ＨＬＡ－Ｃ　ＭＭ×Ｄｏｎｏｒ　ｒｓ１０９２５０２７はこれら２つの数の積の効果を示す。Ｐ及びＰ．ｘｔはＷａｌｄテストにより求めた値（以下の図９、１２において同様）である。 実施例２において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２－４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析（未調整解析）結果（全悪性疾患（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）患者）を示す図である。横軸は移植後の日数、縦軸は２－４ＡＧｖＨＤの累積発生率（以下の図６Ｂ～６Ｅも同様）である。 実施例２において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２－４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析（未調整解析）結果（ＡＭＬ患者）を示す図である。 実施例２において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２－４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析（未調整解析）結果（ＡＬＬ患者）を示す図である。 実施例２において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２－４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析（未調整解析）結果（ＭＤＳ患者）を示す図である。 実施例２において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２－４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析（未調整解析）結果（６ｏｔｈｅｒｓ患者）を示す図である。 実施例３において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく非再発死亡（ＮＲＭ）の累積発生曲線解析（未調整解析）結果（ＡＭＬ患者）を示す図である。Ｐ（Ｔ-ｄｏｍｉ）は、Ｔ優性モデルの下で、通常のＧｒａｙのテストにより求めた値（以下の図７Ｂも同様）である。 実施例３において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく非再発死亡（ＮＲＭ）の累積発生曲線解析（未調整解析）結果（ＡＬＬ患者）を示す図である。 実施例３において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく非再発死亡（ＮＲＭ）の累積発生曲線解析（未調整解析）結果を示す図である。図８（ａ）は６ｏｔｈｅｒｓ患者、図８（ｂ）はＣＭＬ患者又はその他の白血病患者、図８（ｃ）はＬＭ、ＰＣＤ、ＭＰＤ、ＳＴのいずれかの患者である。横軸は移植後の年数、縦軸は非再発死亡の累積発生率である。 実施例３において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの交互作用に基づく非再発死亡（ＮＲＭ）のＦｉｎｅ－Ｇｒａｙ比例ハザード回帰による多変量解析結果を示す図である。図９（ａ）はＨＬＡ－Ｃ　ＭＭの場合であり、追跡期間全体にわたる非再発死亡（ＮＲＭ）である。図９（ｂ）はＨＬＡ－Ｃ／Ｑ／Ｐ　ＭＭ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の合計３座６アリルがマッチで、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１の合計３座６アリルのうち少なくとも１アリルがミスマッチ）の場合であり、かつ１００以内の非再発死亡（ＮＲＭ）である。 実施例４において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく非再発死亡（ＮＲＭ）の累積発生曲線解析（未調整解析）結果を示す図である。患者の原疾患はＡＬＬである。横軸は移植後の年数、縦軸は非再発死亡の累積発生率である。 実施例５において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率（ＯＳ）の単変量Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ解析結果（ＡＭＬ患者）を示す図である。Ｐは通常のｌｏｇ-ｒａｎｋテストにより求めた値である（以下の図１１Ｂ、１１Ｃ、図１３Ａ、１３Ｂ、並びに図１４Ａ，１４ＢのＯＳにおいて同様）。Ｐ（Ｔ-ｄｏｍｉ）は、Ｔ優性モデルの下で、通常のｌｏｇ-ｒａｎｋテストにより求めた値である（以下の図１３Ａにおいて同様）。横軸は移植後の年数、縦軸は全生存率（ＯＳ）（以下の図１１Ｂ、１１Ｃも同様）である。 実施例５において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率（ＯＳ）の単変量Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ解析結果（ＡＬＬ患者）を示す図である。Ｐ．ｐｍｔはパーミュテーションを用いたｌｏｇ-ｒａｎｋテストによる値（以下の図１１Ｃも同様）を示す。 実施例５において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率（ＯＳ）の単変量Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ解析結果（６ｏｔｈｅｒｓ患者）を示す図である。 実施例５において、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの交互作用に基づく全生存率（ＯＳ）のＣｏｘ比例ハザード回帰による多変量解析結果を示す図である。 実施例６において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率（ＯＳ）の単変量Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ解析結果（ＡＭＬ患者）を示す図である。横軸は移植後の年数、縦軸は全生存率（ＯＳ）（以下の図１３Ｂも同様）である。 実施例６において、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率（ＯＳ）の単変量Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ解析結果（ＡＬＬ患者）を示す図である。 実施例７において、ＣＧｖＨＤの発症と非再発死亡、再発（ｒｅｌａｐｓｅ）、及び全生存率との関係についての解析結果（原疾患がＡＭＬ患者）を示す図である。図中、Ｌｉｍｔｅｄは限局的ＣＧｖＨＤを発症した場合、ＥｘｔｅｎｓｉｖｅはＥｘＣＧｖＨＤを発症した場合を示す。 実施例７において、ＣＧｖＨＤの発症と非再発死亡、再発（ｒｅｌａｐｓｅ）、及び全生存率との関係についての解析結果（原疾患が６ｏｔｈｅｒｓ患者）を示す図である。 本発明を用いたドナー選択法の例を示す図である。
　本発明の移植後の予後の予測を補助する方法としては、同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチで、かつレシピエントの原疾患が悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群（ＭＤＳ）を除く）の場合において、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらの連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及びレシピエントの原疾患の種類を指標として移植後の予後の予測を補助する方法であれば特に制限されず、かかる方法は、医師による診断は含まれない。
　同種造血幹細胞移植とは、自己以外の細胞をドナーとする造血幹細胞移植のことを意味する。かかる同種移植は悪性血液疾患の根治療法であり、幹細胞の由来組織によって骨髄移植、末梢血移植、又は臍帯血移植のいずれかに分類することができ、本発明の同種移植は上記いずれの移植でもよいが、骨髄移植であることが好ましい。また、同種造血幹細胞移植は、そのドナーによって血縁者間同種造血幹細胞移植と非血縁者間同種造血幹細胞移植に分類できるが、本発明においては非血縁者間同種造血幹細胞移植であることが好ましい。
　本発明のレシピエント及び／又はドナーの人種は特に制限されず、日本人、東アジア人、西アジア人、北アメリカ人、南アメリカ人、欧州人、アフリカ人のいずれでもよいが、好ましくは東アジア人、より好ましくは日本人である。また、本発明を用いるレシピエントとしては、初回移植の患者であることが好ましい。
　ドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチの場合とは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の４座における８アリル中１アリルがミスマッチで７アリルがマッチ（７／８）、又はＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の４座における８アリル中２アリルがミスマッチで６アリルがマッチする場合を意味し、マッチするアリルは特に限定されないが、少なくともＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の３座における６アリルがマッチしていることが好ましい。
　本発明において、悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群（ＭＤＳ）を除く）とは、悪性血液疾患のうち、ＭＤＳ以外の疾患を意味する。かかるＭＤＳ以外の疾患としては、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、又は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、その他（ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ以外）の白血病（ＯＬ）、リンパ系悪性腫瘍（ＬＭ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、形質細胞性腫瘍（ＰＣＤ）、又は固形腫瘍（ＳＴ）を挙げることができ、ＡＬＬ又はＡＭＬを好適に挙げることができ、ＡＬＬをより好適に挙げることができる。
　本発明において、ＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基におけるＳＮＰ（ｒｓ４６１２６６６）は、日本人における食物誘因アナフィラキシーやアスピリン誘因喘息に対する感受性に関与するイントロンＳＮＰである。また、ＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基におけるＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７）は、ＮＬＲＰ３とＯＲ２Ｂ１１遺伝子の両方の下流に位置しているＳＮＰである。ここで、ｒｓ番号は米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）におけるＳＮＰのリファレンス番号（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＳＮＰ　ＩＤ　ｎｕｍｂｅｒ）である。
　本発明において、上記連鎖不平衡の関係とは、生物の集団において、複数の遺伝子座の対立遺伝子又は遺伝的マーカー（多型）の間にランダムでない相関がみられる、すなわちそれらの特定の組合せ（ハプロタイプ）の頻度が有意に高くなる集団遺伝学的な現象にある関係を意味し、連鎖不平衡係数ｒ２＞０．５、好ましくはｒ２＞０．６、より好ましくはｒ２＞０．６４の関係を満たす塩基を挙げることができる。具体的には、ｒｓ１０９２５０２７と連鎖不平衡（ｒ２＞０．６４）の関係にあるＳＮＰとしてはｒｓ１２１４３９６６、ｒｓ４９２５６５９、ｒｓ１１１３０７２６８、ｒｓ６０８２３５８３、ｒｓ１０１５９２３９、ｒｓ５６３８３８２９、ｒｓ６０８３１０２５、ｒｓ１０７５４５５８、ｒｓ３４６９１５３５、ｒｓ１０８０２５０２、ｒｓ４９２５５４７、ｒｓ１０７５４５５９、ｒｓ１０７３３１１１、ｒｓ１０７３３１１２、ｒｓ４９２５６６３を挙げることができ、ｒｓ４６１２６６６と連鎖不平衡（ｒ２＞０．６４）の関係にあるＳＮＰとしてはｒｓ３８０６２６５、ｒｓ３８３５３０４を挙げることができる。連鎖不平衡係数は、ＶＣＦｔｏｏｌｓのバージョン０．１．１１で算出することができる。
　本発明における予後としては、同種造血幹細胞移植後に生じる合併症、生存率又は死亡であれば特に制限されないが、２－４級急性移植片対宿主病（２－４ＡＧｖＨＤ）発症、広範性慢性移植片対宿主病（ＥｘＣＧｖＨＤ）発症、全生存率（ＯＳ）、又は非再発死亡（原疾患の再発が起こっていない死亡：ＮＲＭ）を挙げることができる。
　本発明により、移植後の予後の予測の補助は、１）ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらの連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及び、２）レシピエントの原疾患、の１）及び２）の２種類を指標として行うことができる。従来、ドナーの選択については原疾患の種類が考慮されずにＨＬＡのマッチ／ミスマッチのみが指標として用いられており、移植後の予後については、よりＨＬＡがマッチした方がリスクが少ないという指標しかなく、ＨＬＡの一部ミスマッチの場合において、より詳細に予後のリスクを判断する指標はなかった。こうした中、本発明によりＨＬＡ－Ｃがミスマッチの場合において、レシピエントの原疾患の種類と、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとの組み合わせによって移植後の予後のリスクが異なることが明らかとなった。そのため、かかる組み合わせに基づき様々な予後リスクを予測することが可能となる。具体的には、例えば以下の表１に示すようにそれぞれの指標に基づいて、予後の予測を補助することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットとしては、上記本発明の同種造血幹細胞移植における移植後の予後の予測を補助する方法に使用する、同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットであって、以下の（１）又は（２）のプローブを含む限り特に制限されず、かかるプローブを用いることによってそれぞれのＳＮＰを検出することが可能となる。
（１）ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｔ又はＣ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５～５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
（２）ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｔ又はＣ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５～５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
　上記プローブとしては、１５～５０塩基であればよいが、好ましくは１０～４０塩基、より好ましくは１５～３０塩基からなるプローブを挙げることができる。なお、プローブとしてＬｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）等の人工核酸を用いて合成したオリゴプローブを用いることで、短い塩基でも特異的にハイブリダイズするプローブとすることが可能となる。
　上記ストリンジェントな条件下としては、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１５Ｍ　クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular　Biology,　John　Wiley　&　Sons,　N.　Y.　(1989),　6.3.1-6.3.6）や、３×ＳＳＣ／０．３×ＳＤＳを含む溶液中で５４℃にてハイブリッドを形成させた後、洗浄液Ａ（１０×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ溶液）、洗浄液Ｂ（２０×ＳＳＣ）及び洗浄液Ｃ（５×ＳＳＣ）で順次洗浄するような条件（特開２０１１－２５０７２６号公報参照）等を挙げることができる。
　ＳＮＰは、公知のＳＮＰを分析する方法を用いることができ、リアルタイムＰＣＲ法、ダイレクトシーケンシング法、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ法、インベーダー（登録商標）法、ルミネックス（登録商標）法、クエンチングプライマー／プローブ（ＱＰ）法、ＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ法、分子ビーコン法等を挙げることができる。具体的には、ドナー又はレシピエントから採取した生体試料のゲノムＤＮＡを鋳型とする増幅反応によって測定対象のＳＮＰ部位を含む核酸断片を、プライマーを用いてＰＣＲで増幅し、得られた核酸断片と、野生型及びバリアント型に対応する一対のプローブとのハイブリダイゼーションを検出する方法や、上記ＰＣＲ増幅過程において、当該ＳＮＰ部位に特異的なプローブを用いることで、野生型及びバリアント型を検出する方法を挙げることができる。
　また、本発明のプローブは、担体上に固定して用いてもよく、担体としては、平面状の基板やビーズ状の球状担体を挙げることができ、具体的には、上記特開２０１１－２５０７２６号公報に記載された担体を挙げることができる。また、野生型を検出するプローブとバリアント型を検出するプローブとを同一の担体に固定してもよいし、異なる担体に固定してもよい。
　上記プローブは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、ＤＮＡシンセサイザー、全自動核酸合成装置等を使用することができる。
　ＨＬＡを測定する方法としては特に制限されず、ＬＣＴ法、ＤＮＡタイピング法、蛍光ビーズ法等を挙げることができる。また、上記同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットには、上記それぞれのＨＬＡを測定する方法に応じたＨＬＡ測定用の試薬を含んでもよい。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、本発明の実施例において、ＳＮＰ遺伝子型の同定、ドナー・レシピエント、評価項目、統計解析については、次に示すとおりに行った。
（ＳＮＰ遺伝子型の同定）
　ドナー及びレシピエントそれぞれの末梢血２００μＬをＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｂｌｏｏｄ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてゲノムＤＮＡを精製し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ　ＧｅｎｏｍｉＰｈｉＨＹ　ｋｉｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で増幅した。ＳＮＰ遺伝子型の同定は、２０ｎｇの増幅したＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　及び　ＴａｑＭａｎ　ＳＮＰ　Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ　Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、７９００ＨＴ及び／又はＶｉｉＡ７　ｒｅａｌ―ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）装置でＰＣＲし、かかる装置に付属のソフトウェアを用いて行った。デフォルト閾値（ｑｕａｌｉｔｙ＝９５）を超えたシグナルだけを正しく遺伝子型判定されたものとした。遺伝子型判定されなかったサンプルや正しく遺伝子型判定されたサンプルの一部は、ＰＣＲ及びダイレクトサンガーシークエンスによって遺伝子型を同定した。
　ｒｓ１０９２５０２７、又はｒｓ４６１２６６６のＳＮＰをカバーする短鎖ゲノム領域は、それぞれ上記で得られた１０ｎｇのゲノムＤＮＡをテンプレートとし、ＥｘＴａｑ　ＨＳ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いたＰＣＲによって増幅した。ＴａｑＭａｎアッセイのプローブ、上記ＰＣＲダイレクトシークエンスに用いたプライマーの配列、及びＳＮＰ近傍の配列を図１に示す。
　ＤＮＡシークエンス反応はプライマーとＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔを用いて行い、３７３０×ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）によって解析した。それぞれのＳＮＰ塩基において、それぞれのクロマトグラム目視検査の後、シグナルの最も強い塩基及び二番目に強い塩基のピークの高さの比を算出した。ピークの比が３未満の場合、遺伝子型はヘテロ接合と判断し、３以上の場合にはシグナルの最も強い塩基のホモ接合と判断した。
（ドナー・レシピエント）
　被験者は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の合計３座６アリルを最低限マッチさせた非血縁骨髄移植を、公益財団法人日本骨髄バンクを介して２００６年１０月から２００９年４月に受けた次の４つの条件を満たす９９９ペアのドナー及びレシピエントである。４つの条件とは、日本人ペアであること、ドナー年齢が２０歳以上であること、患者の移植後の生存日数データが存在すること、ＨＬＡ１２座が遺伝子型再決定されて実際にＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の６アリルがマッチしていることが確認されたペアであること、である。ＨＬＡ－Ｃ座はマッチしているとは限らないので、ＨＬＡ座６／８、７／８、又は８／８アリルマッチといえる。上記ドナー及びレシピエントの臨床データ、移植のデータ及びマッチングを図２Ａ～Ｃに示す。
（評価項目）
　移植後の予後の主要評価項目は移植後１００日以内の２－４級急性ＧｖＨＤ（２－４ＡＧｖＨＤ）、全生存率（ＯＳ）、慢性ＧｖＨＤ（ＣＧｖＨＤ）、非再発死亡（ＮＲＭ）、再発である。慢性ＧｖＨＤ（ＣＧｖＨＤ）としては、広範型慢性ＧｖＨＤ（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ　ＣＧｖＨＤ：ＥｘＣＧｖＨＤ）、限局的慢性ＧｖＨＤ（ｌｉｍｉｔｅｄ　ＣＧｖＨＤ）、広範型と限局型両方の慢性型ＧｖＨＤ（ｏｖｅｒａｌｌ　ＣＧｖＨＤ）のいずれかの項目とした。ＯＳとＮＲＭに対する主要イベントは、それぞれすべての要因による死、再発歴なし(ｗｉｔｈｏｕｔ　ｐｒｉｏｒ　ｒｅｌａｐｓｅ)による死と定義づけた。ＡＧｖＨＤは次の文献に記載の古典的な分類（Glucksberg,　H.　et　al.　Clinical　manifestations　of　graft-versus-host　disease　in　human　recipients　of　marrow　from　HL-A-matched　sibling　donors.　Transplantation　18,　295-304　(1974)、Przepiorka,　D.　et　al.　1994　Consensus　Conference　on　Acute　GVHD　Grading.　Bone　Marrow　Transplant.　15,　825-828　(1995)）に基づいて分類した。ＣＧｖＨＤは次の文献に記載のＳｅａｔｔｌｅ分類（Shulman,　H.M.　et　al.　Chronic　graft-versus-host　syndrome　in　man.　A　long-term　clinicopathologic　study　of　20　Seattle　patients.　Am.　J.　Med.　69,　204-217　(1980)）に基づき診断した。
（統計解析）
　全生存率の分析方法は、未調整解析としてＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法とＬｏｇ－ｒａｎｋテストを用い、多変量解析としてはＣｏｘ比例ハザード回帰を用いた。全生存率以外の指標の分析方法は、未調整解析として累積発生率とＧｒａｙのテストを用い、多変量解析としてＦｉｎｅ－Ｇｒａｙ比例ハザード回帰を用いた。これらの解析には統計ソフトＲ（ｖｅｒ．３．２．２）を用いた。多変量解析の調整因子は、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１のアリルマッチ度、性別、年齢、レシピエントの病期や状態、移植時の処置等である。尚、本研究の多変量解析では、変数選択を行ったあとに残った変数間の交互作用の項についても変数選択を再度行った。最終モデルに残った変数と変数間交互作用の両方について、移植後成績と有意に関連しているかどうかについてＷａｌｄテストを用いて検定した。
　統計解析ソフトとして、Ｒ言語環境（バージョン３．２．２）の以下のライブラリーを用いた。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線、Ｌｏｇ－ｒａｎｋテスト、累積発生曲線、及びＣｏｘ比例ハザード回帰にはｓｕｒｖｉｖａｌライブラリー（バージョン２．３８）を、Ｇｒａｙのテスト、及びＦｉｎｅ－Ｇｒａｙ比例ハザード回帰にはｃｍｐｒｓｋライブラリー（バージョン２．２）を、変数選択にはＭＡＳＳライブラリー（バージョン７．３）とｃｒｒｓｔｅｐ（バージョン２０１５－２）を、Ｗａｌｄテストにはａｏｄライブラリー（バージョン１．３）を用いた。パーミュテーションを用いたＬｏｇ－ｒａｎｋテストやＧｒａｙのテストは、ｃｌｉｎｆｕｎライブラリー（バージョン１．０）に含まれるｐｅｒｍｌｏｇｒａｎｋ関数と同様の方法で行った。
＜実施例１＞広範性慢性ＧｖＨＤ（ＥｘＣＧｖＨＤ）に対するドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ－Ｃミスマッチの交互作用（組み合わせ）
　上記の方法でドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＥｘＣＧｖＨＤの累積発生曲線（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｃｕｒｖｅｓ：ＣＩＣｓ）解析を行った。結果を図３、図４Ａ～Ｃに示す。さらに、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの交互作用に基づくＦｉｎｅ－Ｇｒａｙ比例ハザード回帰による多変量解析を行った。結果を図５に示す。
　まず、図３に示すように、悪性（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）疾患全体において、ＨＬＡ－Ｃがミスマッチであっても、ドナー側のＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）の遺伝子型が高発現型（ＣＣ）であれば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の８／８アリルマッチと同等レベルにＥｘＣＧｖＨＤの累積発生率が低く、低発現型（ＴＴ）であれば、ＥｘＣＧｖＨＤの累積発生率が高いことが明らかになった。そこでさらにレシピエントの原疾患ごとに分類して解析したところ、図４Ａ～Ｃ、図５に示すように、ＭＤＳ患者以外で上記傾向があり、特にＡＬＬ患者において高値であることや、かかる傾向は、移植後４カ月以内の移植後初期に強く見られることが明らかとなった。すなわち、ＥｘＣＧｖＨＤはＨＬＡ－Ｃミスマッチ単独の存在でリスクが高くなるのではなく、ドナーのＮＬＲＰ３のｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６における低発現型（ＴＴ）と組み合わさった時に発症リスクが高くなること、上記傾向はすべての原疾患において同様ではなく、ＭＤＳ患者以外においてみられることが明らかとなった。
＜実施例２＞２－４級急性ＧｖＨＤ（２－４ＡＧｖＨＤ）に対するレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ－Ｃミスマッチの交互作用
　上記の方法でレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく２－４ＡＧｖＨＤの累積発生曲線解析を行った。結果を図６Ａ～Ｅに示す。
　図６Ａに示すように、悪性（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）疾患全体において、ＨＬＡ－Ｃ　ＭＭが０（８アリルマッチ）の場合には、レシピエント側のＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型が高発現型（ＣＣ）であれば２－４ＡＧｖＨＤ累積発生率は低いが、ＨＬＡ－Ｃが１－２アリルミスマッチの場合、２－４ＡＧｖＨＤ累積発生率がむしろ高いことが明らかとなった。次に、図６Ｂ～Ｅに示すように、レシピエントの原疾患ごとのサブグループ解析を行った。その結果、ＨＬＡ－Ｃが２アリルミスマッチかつレシピエント側のＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型が高発現型（ＣＣ）の場合における上記２－４ＡＧｖＨＤ累積発生率は、ＡＭＬ又はＡＬＬ患者で高値であり、特にＡＬＬ患者において高値であった。上記結果から、ＨＬＡ－Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）のみが２－４ＡＧｖＨＤ累積発生率に影響を与えるのではなく、ＨＬＡ－Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）とＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型の組み合わせが２－４ＡＧｖＨＤ累積発生率に影響を与えることが明らかとなった。換言すれば、２－４ＡＧｖＨＤ発症を予測する際には、ＨＬＡ－Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）と共にＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型も考慮する必要があることが明らかとなった。
＜実施例３＞非再発死亡（ＮＲＭ）に対するドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせの影響
　上記の方法でドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＮＲＭの累積発生曲線解析を行った。結果を図７Ａ、Ｂ、図８に示す。さらに、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの交互作用に基づくＦｉｎｅ－Ｇｒａｙ比例ハザード回帰による多変量解析を行った。結果を図９に示す。
　図７Ａ、Ｂ、図８に示すように、ＡＬＬ患者、及び６ｏｔｈｅｒｓ患者では、ＨＬＡ－Ｃがミスマッチでさらにドナー側のＮＬＲＰ３のＳＮＰが低発現型（ＣＴ又はＴＴ）であれば、ＮＲＭはＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の８／８アリルマッチよりも累積発生率が高く、かかるリスクの傾向は、移植後４カ月以内の移植後初期に強く見られた。さらに、ＡＬＬ患者、及び６ｏｔｈｅｒｓ患者では、ＨＬＡ－Ｃがミスマッチでドナー側のＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型が高発現型（ＣＣ）であれば予想外にもＮＲＭはＨＬＡ８／８アリルマッチよりも累積発生率はさらに低かった。上記結果から、ＨＬＡ－Ｃミスマッチ単独の存在でＮＲＭの発症リスクが高くなるのではなく、ドナーのＮＬＲＰ３のｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６におけるＳＮＰが低発現型（ＣＴ又はＴＴ）と組み合わさった時に発症リスクが高くなることが明らかとなった。なお、このＮＲＭの中で、移植後数か月以降の死についてはＥｘＧｖＨＤによる死亡と解釈できる。しかし、図７Ａ、Ｂ、図８、図９において、ドナー側のＮＬＲＰ３におけるＳＮＰが低発現型（ＣＴ又はＴＴ）であれば、移植後初期におけるＮＲＭ発症率の上昇が高いことから、数か月以降に加えて移植後初期のＮＲＭにもドナーのＮＬＲＰ３におけるＳＮＰとＨＬＡ－Ｃの交互作用が関与していることを示している。その詳細な機構は不明だが、例えば感染症による死亡に対するドナーのＮＬＲＰ３におけるＳＮＰとＨＬＡ－Ｃの特定の組み合わせによる防御作用等が考えられる。
＜実施例４＞非再発死亡（ＮＲＭ）に対するレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせの影響
　上記の方法でレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＮＲＭの累積発生曲線解析を行った。結果を図１０に示す。
　図１０に示すように、ＡＬＬ患者では、ＨＬＡ－Ｃがミスマッチでさらにレシピエント側のＮＬＲＰ３のＳＮＰが高発現型（ＣＣ）であればＮＲＭはＨＬＡ８／８アリルマッチよりもＮＲＭの累積発生リスクが高くなることが明らかとなった。かかるリスクの傾向は、移植後４カ月以内の移植後初期に見られたので、図６Ｃで示した急性ＧｖＨＤの影響と考えられる。
＜実施例５＞全生存率（ＯＳ）に対するドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせの影響
　上記の方法でドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づく全生存率のＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線（ＫＭＣｓ）解析を行った。結果を図１１Ａ～Ｃに示す。さらに、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの交互作用に基づくＣｏｘ比例ハザード回帰による多変量解析を行った。結果を図１２に示す。
　図１１Ａ～Ｃ、１２に示すように、ＡＬＬ及び６ｐｔｈｅｒｓ患者では、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の８／８アリルマッチした場合、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰは低発現型（ＣＴ又はＴＴ）の方が高発現型（ＣＣ）よりもＯＳが高かった。ＨＬＡ－Ｃがミスマッチの場合では、移植後１．５年以内においてドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰは高発現型（ＣＣ）の方が低発現型（ＣＴ又はＴＴ）よりもＯＳが高かった。上記結果から、ＨＬＡ－Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）のみがＯＳに影響を与えるのではなく、ＨＬＡ－Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）とＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型の組み合わせがＯＳに影響を与えることが明らかとなった。換言すれば、ＯＳを予測する際には、ＨＬＡ－Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）と共にＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型も考慮する必要があることが明らかとなった。一方、ＭＤＳ患者においてはＨＬＡ－Ｃ座におけるアリルの適合度（マッチ／ミスマッチ）とＮＬＲＰ３のＳＮＰの遺伝子型の組み合わせは全生存率に影響を与えなかった（図示せず）。なお、ＯＳは、ＮＲＭの影響に再発（による死亡）の影響を足し合わせる複合効果となり、再発はＮＲＭと反対の傾向を示したため（図示せず）、ＯＳはＮＲＭと比較して縦軸における差幅が小さくなった。
＜実施例６＞全生存率（ＯＳ）へのレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせの影響
　上記の方法でレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰ（ｒｓ１０９２５０２７又はｒｓ４６１２６６６）とＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせに基づくＯＳのＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ曲線（ＫＭＣｓ）解析を行った。結果を図１３Ａ、Ｂに示す。
　上述の実施例２で示したようにＡＬＬの患者ではレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ－Ｃミスマッチの組み合わせが２－４ＡＧｖＨＤに強く影響する。この結果と一致して、図１３Ａ、Ｂに示すように、レシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰが高発現型（ＣＣ）でＨＬＡ－ＣがミスマッチであるＡＬＬ患者は移植直後の数か月のＯＳが低下した。また、ＡＭＬ患者の場合、高発現型（ＣＣ）でＡＧｖＨＤがやや上昇するが、ＯＳは高発現型（ＣＣ）と低発現型（ＣＴ＋ＴＴ）とで有意差は見られなかった。一方、ＭＤＳ患者においてはレシピエントのＮＬＲＰ３のＳＮＰによる影響は見られなかった（図示せず）。
＜実施例７＞非再発死亡（ＮＲＭ）、再発、及び全生存率（ＯＳ）対するＣＧｖＨＤの影響
　移植後１年以内のＣＧｖＨＤの発症の有無が、１年経過後のＮＲＭ、再発、及びＯＳにどのような影響を及ぼすかについて単変量解析を行った。結果を図１４Ａ、Ｂに示す。
　図１４Ａに示すように、ＡＭＬ患者の場合にはＣＧｖＨＤを発症した場合にはＮＲＭが起こりにくく、また、ＯＳが上昇していた。他方、図１４Ｂに示すように、ＡＬＬ又は６ｏｔｈｅｒｓ患者の場合には、ＣＧｖＨＤが発症した方がＮＲＭを起こしやすく、また、ＯＳが低下していた。この結果から、原疾患の種類によって、ＣＧｖＨＤ発症がその後のＮＲＭ、再発、及びＯＳへ及ぼす影響が異なることが明らかとなった。この結果は、ドナーのＮＬＲＰ３のＳＮＰとＨＬＡ－Ｃミスマッチの交互作用（組み合わせ）がＮＲＭやＯＳに対して有害な作用を示すのはＡＬＬ及び６ｏｔｈｅｒｓでありＡＭＬではないことをうまく説明する。
＜実施例のまとめ＞
　現在、同種造血幹細胞移植のドナー選択法は、ドナーとレシピエント間のＨＬＡのマッチングに基づいている。上記実施例により、ＭＤＳ以外の悪性血液疾患ではＨＬＡの適合度単独が重要なのではなく、ＨＬＡの適合度とＮＬＲＰ３のＳＮＰとの交互作用が重要であることが新たに判明した。すなわち、ＨＬＡ－ＣがミスマッチであってもＮＬＲＰ３のＳＮＰの適切な遺伝子型と組み合わされば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１完全マッチと同等もしくはそれ以上の良好な生存率若しくは合併症予防効果が得られることが明らかとなった。これらの結果をまとめて新しいドナー選択法の一例を図１５に示す。本発明の方法を用いて適切なドナーを選択することによって同種造血幹細胞移植における合併症が低減することが見込まれる。また、ＨＬＡの一部ミスマッチの場合でも適切なＳＮＰと組み合わせれば生存率がむしろ高くなることがあるという結果は意外であり、ＨＬＡの６／８－８／８アリルマッチを行っていない国、若しくは行うことができない国等では、今後ドナーの選択肢が広がることが期待される。また、ＧｖＨＤや死亡の起こる確率の高いＨＬＡとＮＬＲＰ３のＳＮＰの組み合わせをドナーとして選択せざると得ない場合においても、予後のハイリスク群として投薬等による予防や治療を考慮することができる。
　本発明は、同種造血幹細胞移植におけるドナーの選択において利用可能である。

Claims (8)

  1. 同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の４座における８アリルのうち、１アリル又は２アリルがミスマッチで、かつレシピエントの原疾患が悪性血液疾患（骨髄異形形成症候群（ＭＤＳ）を除く）の場合において、ドナー若しくはレシピエントのＮＬＲＰ３遺伝子の配列番号１に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、若しくは配列番号２に示す塩基配列の２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型又はこれらと連鎖不平衡の関係にある一塩基多型、及びレシピエントの原疾患の種類を指標として移植後の予後の予測を補助する方法。
  2. 同種造血幹細胞移植におけるドナーとレシピエント間でＨＬＡ遺伝子のＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１の３座における６アリルがマッチしていることを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 同種造血幹細胞移植が非血縁者間同種造血幹細胞移植であることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
  4. 予後が、２－４級急性移植片対宿主病（２－４ＡＧｖＨＤ）発症、慢性移植片対宿主病（ＣＧｖＨＤ）発症、全生存率（ＯＳ）、又は非再発死亡（ＮＲＭ）であることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載の方法。
  5. 悪性血液疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ系悪性腫瘍（ＬＭ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、形質細胞性腫瘍（ＰＣＤ）、又は固形腫瘍（ＳＴ）であることを特徴とする請求項１～４のいずれか記載の方法。
  6. 悪性血液疾患が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）であることを特徴とする請求項５記載の方法。
  7. 請求項１～６記載の方法に使用する、同種造血幹細胞移植後の予後の予測用キットであって、以下の〔１〕又は〔２〕記載のプローブを含むことを特徴とするキット。
    〔１〕ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号１に示す２６番目の塩基（ｒｓ１０９２５０２７、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５～５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
    〔２〕ＮＬＲＰ３遺伝子において、配列番号２に示す２６番目の塩基（ｒｓ４６１２６６６、Ｃ又はＴ）における一塩基多型、又は該一塩基多型と連鎖不平衡の関係にある一塩基多型を含む連続する１５～５０塩基からなる配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドからなるプローブ；
  8. ＨＬＡを測定するための試薬を含むことを特徴とする請求項７記載のキット。

     
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