WO2018073414A1 - Lepista flaccida destine a etre utilise dans le traitement d'une maladie due a une mutation non-sens - Google Patents

Lepista flaccida destine a etre utilise dans le traitement d'une maladie due a une mutation non-sens Download PDF

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WO2018073414A1
WO2018073414A1 PCT/EP2017/076848 EP2017076848W WO2018073414A1 WO 2018073414 A1 WO2018073414 A1 WO 2018073414A1 EP 2017076848 W EP2017076848 W EP 2017076848W WO 2018073414 A1 WO2018073414 A1 WO 2018073414A1
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nonsense mutation
flaccida
lepista
mutation
extract
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PCT/EP2017/076848
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Sylvie REBUFFAT
Christine MAULAY-BAILLY
Séverine AMAND
Fabrice Lejeune
Original Assignee
Muséum National D'histoire Naturelle
Centre National De La Recherche Scientifique
Université Lille 1, Sciences Et Technologies
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Definitions

  • Lepista flaccida for use in the treatment of nonsense mutation disease
  • the invention relates to the fungus Lepista flaccida for use in the treatment of a disease caused by a nonsense mutation of a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon. It also relates to an extract of Lepista flaccida intended to be used in the treatment of a disease due to a nonsense mutation of a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon.
  • the nonsense mutations correspond to point mutations that lead to the transformation of a codon allowing the incorporation of an amino acid during the translation into a stop codon (UGA, UAG or UAA) which causes the translation to stop.
  • a nonsense mutation is the activation of an mRNA surveillance mechanism that will degrade the mRNA carrying the nonsense mutation.
  • This mechanism is called NMD (for "nonsense-mediated mRNA decay") and prevents the synthesis of a truncated protein (Hug et al, 2016, Nucleic acids res 44, 1483-1495, Kervestin and Jacobson, 2012, Popp and Maquat , 2014 Mol cells, 37, 1-8, Schweingruber et al, 2013, Biochem Biophys.Acta 1829: 612-623).
  • NMD for "nonsense-mediated mRNA decay”
  • Trans read is not observed on the physiological stop codon (ie, the stop codon terminating an open wild reading phase) in higher eukaryotic cells, even in the presence of translational activating molecules (Welch et al, 2007, Nature 447, 87-91), with the exception to date of four genes using transliteration on their physiological stop codon (Loughran et al, 2014, Nucleic Acids Res 42, 8828-8838).
  • the transliteration of a premature stop codon from a mRNA bearing this premature stop codon makes it possible to lead to the synthesis of a protein of size identical to that of the wild-type protein and having at most a single mutated amino acid (different ) relative to the wild-type protein.
  • the amino acid incorporated during transliteration at the premature stop codon may be different from that present in the wild-type protein. If this amino acid is not incompatible with the function of the protein, the protein synthesized after trans read will then be functional.
  • G418 is one of the most effective translational activating molecules (Bidou et al, 2004, Gen. Ther., 11, 619-627, Dranchak et al, 201 1, J. Cell Biochem 112, 1250-1258, Sangkuhl et al. al., 2004, Hum Mol Genet, 13, 893-903), but its toxicity does not allow therapeutic development (Swan, 1997, Seminephrol, 17, 27-33).
  • DAP 2,6-diaminopurine
  • Clitocin is known for its clinical use in the treatment of leukemia (Burchenal et al., 1949, Cancer, 2, 19) and its antiviral activity (Friend, 1951, Proc. Soc Exp Biol Med 78, 150-153).
  • Clitocin is known for its ability to correct nonsense mutations (patent WO2004 / 009609) but also for their toxicity.
  • the invention proposes to use the fungus Lepista flaccida or an extract of this fungus for the correction of nonsense mutations.
  • the fungus is known by several denominations, the most common being Lepista flaccida, Lepista inversa, Paralepista flaccida, Para ⁇ epista inversa, Clitocybe flaccida and Clitocybe inversa.
  • this fungus is called Lepista flaccida (source Mycobank) or Paralepista flaccida (source Index fungorum). For the rest of the text, only the name Lepista flaccida is retained.
  • the inventors have indeed demonstrated that the fungus Lepista flaccida contains 2,6-diaminopurine (DAP).
  • DAP 2,6-diaminopurine
  • the invention provides the Lepista flaccida mushroom containing at least 2,6-diaminopurine (DAP), for use in the treatment and / or prevention of a disease caused by a nonsense mutation. a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon.
  • DAP 2,6-diaminopurine
  • an extract of Lepista flaccida comprising at least 2,6-diaminopurine (DAP) makes it possible to treat and / or prevent a disease due to a nonsense mutation of a gene leading to premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon.
  • DAP 2,6-diaminopurine
  • Any process for the preparation of the extract of Lepista flaccida can be implemented insofar as it allows at least the extraction of the DAP.
  • the method of preparation of this extract is a method of maceration and / or infusion of the fungus Lepista flaccida in a solvent.
  • the process can be applied to both the freshly collected mushroom and dehydrated mushroom by lyophilization or drying.
  • maceration means that the fungus is brought into contact with the solvent without heating.
  • infusion means that the fungus is brought into contact with the hot solvent, generally heated to a temperature between 20 ° C and 100 ° C, depending on the boiling point of the solvent used.
  • the extract can also be prepared first by maceration (without heating) and then by infusion (the solvent is heated, always in the presence of the fungus) or vice versa.
  • this method comprises the following steps:
  • water acidified for example with acetic acid, hydrochloric acid, formic acid, trifluoroacetic acid, hydrofluoric acid, fluoroacetic acid, oxalic acid
  • water made basic for example with sodium hydroxide or ammonia
  • hydrocarbon such as hexane, cyclohexane, benzene, toluene, xylene, trichlorethylene, perchlorethylene,
  • an alcohol such as methanol, ethanol, propan-1-ol, propan-2-ol, butanol, furfuryl alcohol,
  • ketone such as acetone and methyl isobutyl ketone
  • an ether such as diethyl ether (also called ethyl ether, diethyl ether or diethyl ether), methyl terbutyl ether and tetrahydrofuran,
  • glycol such as ethylene glycol and propylene glycol
  • glycol ether such as propylene glycol methyl ether and propylene glycol butyl ether
  • ester such as ethyl acetate or ethyl lactate
  • a carbonate ester such as propylene carbonate
  • nitro derivative such as nitromethane, 2-nitropropane and nitrobenzene
  • a sulfur derivative such as thionyl chloride, sulphuryl chloride and dimethyl sulphoxide
  • a nitrogen derivative such as dimethylformamide, triethylamine, N-methyl-2-pyrrolidone, ⁇ , ⁇ -dimethylformamide, pyridine and acetonitrile
  • chlorinated derivative such as chloroform and dichloromethane (also called methylene chloride)
  • chloroform and dichloromethane also called methylene chloride
  • step B) filtration of the mixture obtained in step A) to recover on the one hand a solid phase and on the other hand a liquid phase;
  • the solvent is selected from water, a C 1 -C 4 alcohol, a mixture of water and at least one C 1 -C 4 alcohol and a mixture of at least two C1 to C 4 alcohols.
  • this process further comprises, before step A), a step A1) of freezing at -80 ° C.
  • Lepista flaccida mushrooms such as obtained after harvesting and lyophilization, Lepista mushrooms. flaccida as obtained after harvest.
  • the freeze-drying step A1) of Lepista flaccida mushrooms as obtained after harvesting can also be replaced by an oven drying step at 40 ° C for 24 to 72 hours of the Lepista flaccida mushrooms as obtained after harvesting.
  • the method of the invention further comprises after step A1) but before step A), a step A2) of grinding the mushrooms obtained after step A1).
  • the mushroom after maceration and / or infusion is removed, for example by simple filtration.
  • Lepista flaccida is dried or lyophilized prior to maceration and / or infusion into the solvent.
  • the invention also provides an extract of Lepista flaccida obtained by the above method for use in the treatment and / or prevention of a disease due to a nonsense mutation of a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon.
  • the extract of the invention comprises at least 2,6-diaminopurine (DAP) and clitocin.
  • Clitocin may be the alpha-anomer of clitocin (6-amino-5-nitro-4- ( ⁇ -D-ribofuranosylamino) -pyrimidine), the beta-anion of clitocin (6-amino-5-nitro-4- (3-D-riboruranosylamino) -pyrimidine), or a mixture of both.
  • this extract has no toxicity in vivo.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an extract of Lepista flaccida as defined above and a pharmaceutically acceptable excipient for use in the treatment and / or prevention of a disease caused by a nonsense mutation. of a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon.
  • excipient is understood to mean a substance which comprises the extract of Lepista flaccida according to the invention in a composition conferring on it, for example, properties of stability, of form (for example liquid, solid, capsule), of taste, of dissolution (for example, targeted dissolution in the stomach or digestive tract) and color.
  • “Pharmaceutically acceptable excipient” means an excipient which does not produce an adverse, allergic or undesirable reaction when administered to a subject. This includes all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic agents, delayed absorption agents and other similar substances. For administration to humans, the preparations must meet the criteria of sterility, pyrogenicity, and the general safety and purity standards required by the regulatory offices.
  • the excipient may for example be water.
  • the present invention also relates to a method for treating and / or preventing diseases due to a nonsense mutation of a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon as defined above. , comprising administering a therapeutically effective amount of an extract of Lepista flaccida or a pharmaceutical composition as defined above to a subject in need of this treatment.
  • treatment refer both to the therapeutic treatment and the terms "prevention” or “prevention” relate to prophylactic or preventive measures, for which the object is to prevent or slow the progression of the disease due to a nonsense mutation of a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon.
  • the subjects who need treatment include those who already have a disease due to a nonsense gene mutation leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon, those predisposed to a disease due to to a nonsense mutation of a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon and those in which a disease caused by a nonsense mutation of a gene leading to the premature introduction of a gene a stop codon UGA and / or UAA must be prevented.
  • a subject is successfully treated for disease caused by nonsense mutation of a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon if, after receiving a therapeutically effective amount of Lepista flaccida or extract of Lepista flaccida or a pharmaceutical composition according to the invention, the subject shows an observable or measurable reduction, or the absence, of at least one of the following: reduction of the number of pathogenic cells, reduction of the percentage of pathogenic versus total cells, and / or one or more of the symptoms associated with disease caused by a nonsense mutation in a gene leading to the premature introduction of a UGA stop codon and / or or UAA or an improvement in the quality of life.
  • the assessment parameters above are easily measurable by routine procedures familiar to a physician.
  • the patients are preselected as having in a gene of interest said nonsense mutation on at least one allele.
  • subject refers to a mammal, preferably a human.
  • the subject may be a "patient”.
  • a warm-blooded animal preferably a human, waiting to receive or receiving medical care, who has undergone a medical procedure, or who is being followed for the development of a genetic disorder related to a non-mutated -sense of a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon.
  • a “therapeutically effective amount” refers to the amount of Lepista flaccida or Lepista flaccida extract or pharmaceutical composition necessary and sufficient to, without causing significant and adverse side effects to the subject, to decrease or halt progression, or to worsening of one or more of the symptoms of the disease due to a nonsense mutation in a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon, to relieve the symptoms of the disease due to a nonsense mutation of a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon, and / or to cure the disease due to a nonsense mutation of a gene leading to premature introduction a UGA and / or UAA stop codon.
  • Lepista flaccida or of Lepista flaccida extract or of a pharmaceutical composition as defined above may be adapted by those skilled in the art depending on the subject and the method of preparation of the extract.
  • Lepista flaccida or Lepista flaccida extract according to the invention may be formulated for oral or nasal administration, or by intravenous, intramuscular or subcutaneous injection, preferably orally.
  • the determination of the dose at which said Lepista flaccida or Lepista flaccida extract according to the invention is used can be carried out by techniques known to those skilled in the art, for example in clinical trials. This dose will depend on various factors including in particular the activity of the Lepista flaccida extract according to the invention, the mode of administration, the duration of administration, the duration of treatment, other drugs or compounds used in combination with said Lepista flaccida or Lepista flaccida extract according to the invention, the age, sex, weight, general state of health and medical history of the subject being treated.
  • Disease due to a nonsense mutation in a gene leading to the premature introduction of a UGA and / or UAA stop codon means a disease caused partially or totally by the presence of a nonsense mutation. affecting one or two alleles of a gene of interest in germ cells and / or somatic cells; the nonsense mutation being a point mutation of a codon that results in the change from a codon encoding an amino acid to a stop codon UGA and / or UAA which causes the translation to stop.
  • the disease may be partially caused by the presence of a nonsense mutation affecting one allele of a gene of interest, the other allele having a other type of mutation.
  • the diseases treated and / or prevented by the extract of Lepista flaccida according to the invention or by the pharmaceutical composition of the invention are in particular the inflammatory diseases due to the said nonsense mutation (s), the neurodegenerative diseases due to said nonsense mutation (s), autoimmune diseases due to said nonsense mutation (s), cardiovascular disease due to said nonsense mutation (s), pulmonary diseases due to said nonsense mutation (s), cancers due to said nonsense mutation (s), amyloidosis due to said nonsense mutation (s), Alzheimer's disease due to said nonsense mutation (s), atherosclerosis due to said nonsense mutation (s), gigantism due to said non-significant mutation (s) meaning, dwarfism due to said nonsense mutation (s), hypothyroidism due to said nonsense mutation (s), hyperthyroidism ie due to said nonsense mutation (s), cystic fibrosis due to said nonsense mutation (s), obesity due to said nonsense mutation (s), disease Parkinson's disease due to said nonsense mutation (s), Niemann Pick's disease
  • the disease is selected from cystic fibrosis due to said nonsense mutation (s), retinitis pigmentosa due to said nonsense mutation (s), muscular dystrophies due to said mutation (s) nonsense, hemophilia due to said nonsense mutation (s), beta-thalassemia due to said nonsense mutation (s), mucopolysaccharidosis due to said ) nonsense mutation (s), spinal muscular atrophy due to said nonsense mutation (s).
  • the disease due to said nonsense mutation may be cystic fibrosis due to the nonsense mutation of a gene leading to the premature introduction of a UGA or UAA stop codon in the CFTR gene.
  • Cystic fibrosis due to the nonsense mutation of a gene leading to the premature introduction of a UGA or UAA stop codon in the CFTR gene can lead, for example, in a non-limiting manner to the following mutations: G27X, Q39X, K52X , W57X, R75X, Y109X, Y122X, W202X, W216X, C225X, Q290X, L320X, W401X, Q414X, S434X, S466X, S489X, G542X, Q552X, R553X, E585X, Q634X, E656X, G673X, R709X, K710X, L732X, G745X , R764X, R785X, R792X
  • FIG. 1 is a schematic representation of the construction used to demonstrate the effectiveness of the Lepista flaccida extract of the invention as a UGA, UAG and UAA mutations corrector
  • FIG. 2 shows the measurement of the luciferase activity in human HeLa cells expressing a luciferase gene carrying a premature stop codon UAA, UAG or UGA treated with the extract of Lepista flaccida obtained according to the process described in the example 2 compared to the G418 positive control at 1 mg / ml,
  • FIG. 3 represents the Western blot analysis showing the re-expression of the TP53 gene carrying a nonsense mutation on its two alleles after treatment with the extract of Lepista flaccida obtained according to the process described in Example 2 in comparison with FIG. with the G418.
  • the size of the total p53 protein (p53FL) and the truncated p53 protein (p53TR) are indicated on the right side of the gel and the molecular weights are indicated to the left of the gel.
  • the three left columns represent a serial dilution of untreated Hela cell extract.
  • CBP80 is used as a load control.
  • FIG. 4 shows the cellular toxicity curve of the Lepista flaccida extract obtained according to the process described in Example 2 in comparison with that of the G418 positive control
  • FIG. 5 shows the correction efficiency of the nonsense mutations by the treatment with the extract of Lepista flacccida obtained according to the methods described in Examples 2 and 3.
  • the size of the protein Total p53 (p53FL) and truncated p53 protein (p53TR) are indicated on the right side of the gel and molecular weights are indicated to the left of the gel.
  • the three left columns represent a serial dilution of untreated Hela cell extract.
  • UPF1 is used as a load control.
  • FIG. 6 shows the in vivo effect of the Lepista flaccida extract of the invention obtained according to the method described in Example 3 on MDX mice (carrying a nonsense UAA mutation in the gene coding for dystrophin) having drunk water containing the Lepista flaccida extract of the invention in comparison with that of MDX mice having drunk only pure water only.
  • FIG. 6 shows the in vivo effect of the Lepista flaccida extract of the invention obtained according to the method described in Example 3 on MDX mice (carrying a nonsense UAA mutation in the gene coding for dystrophin) having drunk water containing the Lepista flaccida extract of the invention in comparison with that of MDX mice having drunk only pure water only.
  • Example 7 shows the measurement of the luciferase activity in human HeLa cells expressing a luciferase gene carrying a premature stop codon UGA treated with the extract of Lepista flaccida obtained according to the process described in Example 2 (10 ng ⁇ L), DAP (5.29 ⁇ ), clitocin form ⁇ (3.73 ⁇ ) or the mixture of DAP and clitocin.
  • the data represent the average of two independent experiments.
  • Lepista flaccida mushroom collections were held in the Paris region (Bois de Vincennes, Parc du Sausset, Fontainebleau forest). 8 kg of fresh material was collected. Commonly synonymized fungi (Lepista flaccida I Paralepista flaccida / Clitocybe flaccida and Lepista inversa I Paralepista inversa / Clitocybe inversa) were harvested and mixed. After being dusted, the mushrooms were placed in the freezer at -80 ° C. overnight and then lyophilized at -110 ° C. under secondary vacuum at 10 -4 mbar for 24-48 hours. from 8 kg of fresh mushrooms harvested (yield 8%).
  • the dried mushrooms obtained were then ground with mortar.
  • the fine powder obtained can be stored in glass jars at room temperature.
  • the lyophilized or dried mushroom powder is more easily and sustainably preserved than the fresh mushroom.
  • the preparation of the Lepista flaccida extract according to the invention is preferably carried out with lyophilized or dried mushrooms and then ground into powder form.
  • 100 mg of the mushroom powder as obtained in Example 1 are macerated in 200 ml of a hydroalcoholic mixture (water / methanol 50/50) with stirring for 24 hours at room temperature. The mixture is then filtered to recover the hydroalcoholic phase (filtrate). The extract is obtained by concentration of the filtrate at reduced pressure.
  • a hydroalcoholic mixture water / methanol 50/50
  • Example 3 Another method of preparation of Lepista flaccida extract according to the invention is to macerate the mushroom powder as obtained in Example 1 in water heated to 100 ° C.
  • 100 mg of the mushroom powder are macerated in 200 ml of water with stirring for 20 minutes at a temperature of 100 ° C.
  • the mixture is then filtered to recover the aqueous phase (filtrate).
  • the extract is obtained by concentration of the filtrate at reduced pressure.
  • Another method of preparation of Lepista flaccida extract according to the invention is to macerate the mushroom powder as obtained in Example 1 in unheated water (room temperature).
  • 100 mg of the mushroom powder are macerated in 200 mL of water with stirring for 24 hours at room temperature. The mixture is then filtered to recover the aqueous phase (filtrate). The extract is obtained by concentration of the filtrate at reduced pressure.
  • Another method of preparation of Lepista flaccida extract according to the invention is to macerate the mushroom powder as obtained in Example 1 in 100% methanol.
  • 100 mg of the mushroom powder are macerated in 200 ml of methanol with stirring for 6 hours at room temperature.
  • the mixture is then filtered to recover the methanolic phase (filtrate).
  • the extract is obtained by concentration of the filtrate at reduced pressure.
  • clitocin reference A-7052-001, Azur Isotop
  • Five range points were prepared by serial dilutions in milliQ water at 5.1 (P ⁇ ⁇ / '; 1 ( ⁇ ⁇ & ⁇ /'; 5.10 * 4 ⁇ & ⁇ 1 ; 10 "4 ⁇ 1 ; 5.10 " 5 ⁇ g. ⁇ U l in triplicate and injected into LC-MS.
  • 2,6 diaminopurine (DAP) and clitocin were assayed on a Polar Advantage II Acclaim TM column; (3 ⁇ , 1 x 150 mm) (Thermo Fisher Scientific).
  • the mobile phase consisted of milliQ water containing 0.1% formic acid (solvent (A)) and HPLC grade acetonitrile (solvent (B)).
  • the analyzes were carried out at a flow rate of 0.3 ⁇ . ⁇ -1 with the following gradient: 3% of (B) for 5 minutes, change from 3% to 80% of (B) in 1 minute, hold at 80 % of (B) for 2 minutes then return to the starting conditions 3% (B) in 1 minute and rebalancing for 2 minutes to 3% (B) Under these conditions, the retention times are 0.9 min for the DAP and 2.7 min for clitocin ⁇ form.
  • LC-MS analyzes were performed by electrospray ionization in positive mode.
  • the capillary voltage was 3500 volts.
  • the mass spectra were carried out over a range of from 50 to 1300 m / z in continuous mode.
  • the Compass Data Analysis 4.4.200 ® software was used to reprocess the spectra and integrate the peaks in order to perform the dosing curves.
  • the concentration of 2,6 diaminopurine (DAP) in the extract of Lepista flaccida is between 4 and 6 mg / g extract
  • the concentration of clitocin ⁇ form in the extract is between 10 and 20 mg / g of extract.
  • the concentration of clitocin form a is below the limit of quantification. of the method ( ⁇ 0.01 mg / g extract). Characterization of DAP and clitocin:
  • DAP 2,6 diaminopurine
  • clitocin ⁇ form 2,6 diaminopurine
  • MS mass spectrometry
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • the effectiveness of the Lepista flaccida extract obtained according to Example 2 was determined by screening using the construct shown in Figure 1.
  • the DNFc encoding the fijrefly luciferase was interrupted by an intron and a mutation.
  • nonsense either UGA, or UAG, or UAA
  • NMD nonsense-mediated mRNA decay
  • HeLa cells are transfected with the construct shown in Figure 1 carrying one of the three nonsense mutations using lipofectamine according to the manufacturer's protocol (Lifetechnologies). The next day, the cells are divided into 96-well plates and the Lepista flaccida extract obtained in Example 2 and the G418 positive control are added immediately before a 24-hour incubation. Finally, the SteadyLite plus substrate (Perkin Elmer) is added to the culture medium and the plates read to the Tristar luminometer (Berthold). Each well is read for 10 seconds and the plate is read twice.
  • SteadyLite plus substrate Perkin Elmer
  • Figure 2 shows the results of this screening test on each of the three nonsense mutations and whose indicated well contains Lepista flaccida extract obtained according to Example 2 at 100 ng / L.
  • the positive control is the compound G418 at 1 mg / ml. It can be seen from FIG. 2 that the Lepista flaccida extract of the invention has no significant effect on the UAG codon, but that it is on the other hand much more effective than the G418 control on the UAA and UGA codons. .
  • the Calu-6 cells (carrying a nonsense UGA mutation on the two alleles coding for the TP53 gene at codon 196) were incubated for 24 hours in the presence of culture medium (RPMI, 10% decomplemented beef serum and 1% zellshield), culture medium containing 25 ng / ⁇ l of Lepista flaccida extract of Example 2 or 1 mg / ml of G418.
  • the proteins are then purified using a lysis buffer containing 5% SDS, 50 mM Tris pH 7.3 and 20 mM EDTA.
  • the resulting lysate is subjected to 30 sonication runs before being centrifuged for 5 minutes at 100Oxg. The supernatant is recovered and one tenth is deposited on a 10% acrylamide gel before transferring the proteins to a nitrocellulose membrane. This membrane is then exposed to a primary anti-p53 or CBP80 antibody overnight at 4 ° C, followed by a secondary antibody coupled to peroxidase activity to reveal the presence of the p53 and CBP80 proteins using the West Femto supersignal substrate (Pierce ).
  • the Lepista flaccida extract of the invention makes it possible to restore the expression of the TP53 gene containing a nonsense UGA mutation in Calu-6 cells more efficiently than the G418 positive control. .
  • p53FL refers to a full length p53 protein
  • p53TR refers to a truncated p53 protein
  • Example 2 the toxicity of the Lepista flaccida extract obtained according to Example 2 was evaluated. For this, the growth of the cell population in the absence or presence of either the Lepista flaccida extract of the invention, or the G418 positive control was followed.
  • the concentration of the Lepista flaccida extract obtained according to Example 2 of the invention in the culture medium was 25 ng / ⁇ and the concentration in the G418 positive control was 1000 ng / ⁇ .
  • FIG. 4 shows the result of these measurements over 10 days. As can be seen in FIG. 4, there is a slowing down of the growth of the cell population with the extract of Lepista flaccida according to the invention, but this growth is always positive, indicating that there are more cells in division only cells in cell cycle arrest or dead.
  • the effectiveness of the Lepista flaccida extract obtained according to Examples 2 or 3 was identified by screening as described in Example 7.
  • the HeLa cells are transfected with the construct shown in Figure 1 carrying one of the three nonsense mutations using lipofectamine according to the manufacturer's protocol (Lifetechnologies).
  • the cells are divided into 96-well plates and Lepista flaccida extracts obtained according to Example 2 and Example 3 and the G418 positive controls are added immediately before a 24-hour incubation.
  • the SteadyLite plus substrate Perkin Elmer
  • the plates read to the Tristar luminometer (Berthold). Each well is read for 10 seconds and the plate is read twice.
  • Figure 5A shows the results of this screening assay on each of the three nonsense mutations after treatment with extracts of Lepista flaccida. It is found that the extracts obtained by the method of Example 2 (H7) and that of Example 3 (infusion at 100 ° C.) are much more effective than the G418 positive controls at 21 ⁇ / ⁇ l and 1000 ⁇ / ⁇ l. on the UAA and UGA codons.
  • the Calu-6 cells (carrying a nonsense UGA mutation on the two alleles coding for the TP53 gene at codon 196) were incubated for 24 hours in the presence of culture medium (RPMI, 10% decomplemented beef serum and 1% zellshield), containing 25 ng / ⁇ l of extract. of Lepista flaccida obtained according to Example 2 or 3.
  • the proteins are then purified using a lysis buffer containing 5% of SDS, 50 mM Tris pH 7.3 and 20 mM EDTA.
  • the lysate obtained is subjected to 30 sonication pits before being centrifuged for 5 minutes at 100OOxg. The supernatant is recovered and one tenth is deposited on a 10% acrylamide gel before transferring the proteins to a nitrocellulose membrane. This membrane is then exposed to a primary anti-p53 or UPF1 antibody overnight at 4 ° C, followed by a secondary antibody coupled to peroxidase activity to reveal the presence of the p53 and UPF1 proteins using the West Femto supersignal substrate (Pierce ).
  • the Lepisia flaccida extract obtained according to Example 3 (100 ° C.) or Example 2 (H7) makes it possible to restore the expression of the TP53 gene containing a nonsense mutation.
  • UGA in Calu-6 cells.
  • p53FL refers to a full length p53 protein
  • p53TR refers to a truncated p53 protein
  • Example 3 the Lepista flaccida extract obtained according to the protocol described in Example 3 (water at 100 ° C.) was tested on MDX mice.
  • mice Two groups of MDX mice were constituted as follows: four males and five females were exposed to Lepista flaccida extract, and three males and three females were not treated. All mice were between 6 and 8 weeks old at the beginning of the experiment.
  • the drink of one of the two groups of mice was water only, and the drink of the other group was the aqueous phase obtained during the preparation mode of Lepista flaccida extract according to Example 3.
  • mice Every other day physical exercises were done to measure the running ability of each group of mice. For this, the mice are introduced into a closed wheel linked to a computer and software for measuring the running time.
  • the Lepista flaccida extract of the invention has the property of being able to correct nonsense mutations UGA and UAA only. This semi -exclusivity of Stop codons is an advantage since it decreases any nonspecific effects.
  • the Lepista flaccida extract of the invention allows a re-expression at the protein level of a gene carrying a nonsense mutation UGA and / or UAA at a much greater level than can be achieved with G418 which is yet the molecule leading to the most effective re-expression, so far (Bidou et al, 2004, Dranchak et al, 2011, Sangkuhl et al, 2004, previously cited).
  • the Lepista flaccida extract of the invention has another advantage compared to G418 which is that it shows little or no toxicity on cells in culture as observed by following cell proliferation and apoptosis rate in cells exposed to DMSO, G418 or Lepista flaccida extract of the invention.
  • Lepista flaccida extract of the invention activates the reading but does not induce NMD inhibition to correct the UGA and / or UAA nonsense mutations.
  • the cDNA encoding the firefly luciferase was interrupted by an intron and a nonsense mutation UGA was introduced at greater than 55 nucleotides. upstream (-6) of the position of the intron, so as to activate the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) on the corresponding mRNA.
  • NMD nonsense-mediated mRNA decay
  • concentrations of DAP and clitocin ⁇ form used in these experiments correspond to the concentrations of DAP (0.56% of the extract) and the clitocin (1.52% of the extract) found in 10 ⁇ g of extract. .
  • HeLa cells are transfected with the construct shown in Figure 1 carrying the nonsense UGA mutation using lipofectamine according to the manufacturer's protocol (Lifetechnologies). The next day, the cells are divided into 96-well plates and the extract of Lepista flaccida, DAP, clitocin and the mixture DAP / clitocin are added immediately before a 24 hour incubation. Finally, the SteadyLite plus substrate (Perkin Elmer) is added to the culture medium and the plates read to the Tri star luminometer (Berthold). Each well is read for 10 seconds and the plate is read twice. the
  • FIG. 7 shows the results of the correction efficiency on the nonsense mutation UGA for the extract of Lepista flaccida obtained according to Example 2 (H7), the DAP, the clitocin form ⁇ and the mixture of DAP and clitocin form ⁇ . It can be seen from FIG. 7 that the extract of Lepista flaccida has a corrective effect on the UGA codon that is very significantly greater than DAP alone or clitocine alone, or DAP and clitocine in combination.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation du Lepista flaccida destiné à être utilisé dans le traitement d'une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA. Elle concerne également un extrait du Lepista flaccida comprenant au moins de la 2,6-diaminopurine (DAP) obtenu par macération ou infusion de Lepista flaccida dans un solvant. Elle concerne aussi cet extrait de Lepista flaccida destiné à être utilisé dans le traitement d'une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA. Elle concerne encore une méthode de traitement thérapeutique comprenant une étape d'administration de Lepista flaccida ou d'un extrait de Lepista flaccida ou d'une composition pharmaceutique comprenant cet extrait de Lepista flaccida. L'invention trouve application dans le domaine pharmaceutique, en particulier pour le traitement des maladies dues à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction d'un codon stop UGA et/ou UAA.

Description

Lepista flaccida destiné à être utilisé dans le traitement d'une maladie due à une mutation non-sens
L'invention concerne le champignon Lepista flaccida destiné à être utilisé dans le traitement d'une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA. Elle concerne également un extrait de Lepista flaccida destiné à être utilisé dans le traitement d'une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA. Elle concerne aussi cet extrait de Lepista flaccida destiné à être utilisé dans le traitement d'une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA obtenu par macération et/ou infusion de Lepista flaccida dans un solvant. Elle concerne encore une composition pharmaceutique comprenant cet extrait de Lepista flaccida.
Les mutations non-sens correspondent à des mutations ponctuelles qui conduisent à transformer un codon permettant l'incorporation d'un acide aminé lors de la traduction en un codon stop (UGA, UAG ou UAA) qui provoque l'arrêt de la traduction.
Ces mutations sont à l'origine d'environ dix pourcent des cas de maladies génétiques rares, telles que la mucoviscidose, la myopathie de Duchenne, l'hémophilie, le nanisme, etc.. ou fréquentes telles que certaines maladies métaboliques, neurologiques ou cancers (Mort et al., 2008, Hume Mutât. 29, 1037-1047).
La conséquence d'une mutation non-sens est l'activation d'un mécanisme de surveillance des ARNm qui va dégrader l'ARNm porteur de la mutation non-sens. Ce mécanisme est appelé NMD (pour « nonsense-mediated mRNA decay ») et prévient la synthèse d'une protéine tronquée (Hug et al, 2016 ; Nucleic acids res. 44, 1483-1495 ; Kervestin and Jacobson, 2012; Popp and Maquat, 2014 Mol cells. 37, 1-8; Schweingruber et al, 2013, Biochem biophys. Acta. 1829 : 612-623). Une mutation non-sens conduit par conséquent à l'absence d'expression du gène porteur de cette mutation dans la majeure partie des cas.
Plusieurs stratégies ont été développées pour corriger les conséquences d'une mutation non-sens (Benhabiles et al, 2016, Non-Sense Mutation Correction in Human Diseuses: an Approach for Targeted Medicine, Elseivier edn. Publisher Catherine Van Der Laan), notamment l'inhibition du NMD et/ou l'activation de la trans lecture. La translecture est un mécanisme conduisant à l'incorporation, au cours de la traduction, d'un acide aminé lorsque le ribosome atteind un codon stop prématuré. La trans lecture n'est pas observée sur le codon stop physiologique (i.e., le codon stop terminant une phase ouverte de lecture sauvage) dans les cellules d'eucaryotes supérieurs, même en présence de molécules activatrices de translecture (Welch et al, 2007, Nature. 447, 87-91), à l'exception à ce jour de quatre gènes utilisant la translecture sur leur codon stop physiologique (Loughran et al, 2014, Nucleic Acids res. 42, 8828-8838). La translecture d'un codon stop prématuré à partir d'un ARNm porteur de ce codon stop prématuré permet de conduire à la synthèse d'une protéine de taille identique à celle de la protéine sauvage et présentant au maximum un seul acide aminé muté (différent) par rapport à la protéine sauvage. L'acide aminé incorporé lors de la translecture au niveau du codon stop prématuré peut être différent de celui présent dans la protéine sauvage. Si cet acide aminé n'est pas incompatible avec la fonction de la protéine, la protéine synthétisée après trans lecture sera alors fonctionnelle.
Plusieurs molécules ont été identifiées pour leur capacité à induire la translecture (Benhabiles et al, 2016 précédemment cité), il s'agit notamment de certains membres de la famille des aminoglycosides comme la gentamycine ou la généticine (aussi appelée G418) et des molécules n'appartenant pas à cette famille comme l'ataluren (aussi appelé PTC 124 ou Translarna) ou l'amlexanox (Du et al, 2009; J. Exp. Med. 206, 2285-2297 ; Welch et al , 2007, précédemment cité). Cependant, ces molécules ont une efficacité de translecture très limitée et/ou une toxicité importante. Par exemple, il n'a pas été clairement démontré chez des patients atteints de myopathie de Duchenne liée à une mutation non-sens, que l'ataluren pouvait restaurer l'expression d'un gène porteur de cette mutation non-sens (Fitzhugh and Writer, 2016 Bioword. 27, 3-5). Le G418 est une des molécules activant la translecture les plus efficaces (Bidou et al, 2004, Gen. Ther., 11, 619-627; Dranchak et al, 201 1, J. Cell Biochem. 112, 1250-1258; Sangkuhl et al, 2004, Hum Mol Genêt. 13, 893- 903), mais sa toxicité ne permet pas un développement thérapeutique (Swan, 1997, Seminephrol, 17, 27-33).
Par ailleurs, la 2,6-diaminopurine (DAP) est connue pour son utilisation en clinique dans le traitement de la leucémie (Burchenal et al, 1949, Cancer. 2, 1 19) et son activité antivirale (Friend, 1951 , Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 78, 150-153). La clitocine est connue pour sa capacité à corriger les mutations non-sens (brevet WO2004/009609) mais également pour leur toxicité.
Dans ce contexte, l'invention propose d'utiliser le champignon Lepista flaccida ou un extrait de ce champignon pour la correction des mutations non-sens. Le champignon est connu sous plusieurs dénominations, les plus usuelles étant Lepista flaccida, Lepista inversa, Paralepista flaccida, Paraïepista inversa, Clitocybe flaccida et Clitocybe inversa. Selon le référentiel taxonomique utilisé, ce champignon est dénommé Lepista flaccida (source Mycobank) ou Paralepista flaccida (source Index fungorum). Pour la suite du texte, seul le nom Lepista flaccida est retenu.
Les Inventeurs ont en effet mis en évidence que le champignon Lepista flaccida contient de la 2,6-diaminopurine (DAP). La présence de cette molécule, en plus de celle de la ciitocine, expliquerait pour partie l'activité marquée de ce champignon pour corriger les mutations non-sens.
La 2,6-diaminopurine ( chimique suivante :
Figure imgf000004_0001
Plus précisément, l'invention propose le champignon Lepista flaccida contenant au moins de la 2,6-diaminopurine (DAP), destiné à être utilisé dans le traitement et/ou la prévention d'une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA.
En effet, les inventeurs ont découvert qu'un extrait de Lepista flaccida comprenant au moins de la 2,6-diaminopurine (DAP) permet de traiter et/ou prévenir une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA.
Tout procédé de préparation de l'extrait de Lepista flaccida pourra être mis en œuvre dans la mesure où il permet au moins l'extraction de la DAP.
Ainsi, le procédé de préparation de cet extrait est un procédé de macération et/ou infusion du champignon Lepista flaccida dans un solvant. Le procédé peut être appliqué aussi bien au champignon fraîchement collecté qu'au champignon déshydraté par lyophilisation ou par séchage. Le terme macération signifie que le champignon est mis en contact avec le solvant sans chauffage.
Le terme infusion signifie que le champignon est mis en contact avec le solvant chaud, généralement chauffé à une température comprise entre 20°C et 100°C, selon le point d'ébullition du solvant utilisé.
L'extrait peut également être préparé d'abord par macération (sans chauffage) puis par infusion (le solvant est chauffé, toujours en présence du champignon) ou l'inverse.
Plus précisément, ce procédé comprend les étapes suivantes :
A) macération et/ou infusion du champignon Lepista flaccîda dans un solvant choisi parmi :
- de l'eau ; de l'eau acidifiée par exemple avec de l'acide acétique, de l'acide chlorhydrique, de l'acide formique, de l'acide trifluoroacétique, de l'acide fluorhydrique, de l'acide fiuoroacétique, de l'acide oxalique ; de l'eau rendue basique par exemple avec de Phydroxyde de sodium ou de l'ammoniaque,
- un hydrocarbure tel que l'hexane, le cycîohexane, le benzène, le toluène, le xylène, le trichloroéthylène, le perchloroéthylène,
- un alcool tel que le méthanol, l'éthanol, le propan-l-ol, propan-2-ol, le butanol, l'alcool furfurylique,
- une cétone telle que l'acétone et la méthylisobutylcétone,
- un éther tel que l'éther diéthylique (appelé également éther éthyîique, oxyde de diéthyle ou diéthyléther), le méthyl terbutyl éther et le tétrahydrofurane,
- un glycol tel que l'éthylène glycol et le propylène glycol,
- un éther de glycol tel que le propylène glycol méthyl éther et le propylène glycol butyl ether,
- un ester tel que l'acétate d'éthyle, le lactate d'éthyle,
- un ester de carbonate tel que le carbonate de propylène,
- un dérivé nitré tel que le nitrométhane, le 2-nitropropane et le nitrobenzène,
- un dérivé soufré tel que le chlorure de thionyle, le chlorure de sulfuryle, et le diméthylsulfoxyde, - un dérivé azoté tel que le diméthylformamide, la triéthylamine, la N- méthyl-2-pyrrolidone, le Ν,Ν-diméthylformamide, la pyridine et l'acétronitrile,
- un dérivé chloré tel que le chloroforme et le dichlorométhane (appelé également chlorure de méthylène), et
- les mélanges de deux ou plus de ces solvants, à une température comprise entre 20 et 100 °C selon le point d'ébullition des solvants ;
B) filtration du mélange obtenu à l'étape A) pour récupérer d'une part une phase solide et d'autre part une phase liquide ;
C) récupération de la phase liquide obtenue après l'étape B) .
De préférence, dans ce procédé, le solvant est choisi parmi de l'eau, un alcool en Ci à C4, un mélange d'eau et d'au moins un alcool en Ci à C4 et un mélange d'au moins deux alcools en Ci à C4.
Selon un mode de mise en œuvre préféré, ce procédé comprend de plus, avant l'étape A), une étape Al ) de congélation à -80°C des champignons Lepista flaccida tels qu'obtenus après récolte et de lyophilisation, des champignons Lepista flaccida tels qu'obtenus après récolte.
L'étape Al) de lyophilisation des champignons Lepista flaccida tels qu'obtenus après récolte peut également être remplacée par une étape de séchage à l'étuve à 40°C pendant 24 à 72 heures des champignons Lepista flaccida tels qu'obtenus après récolte.
Toujours de préférence, le procédé de l'invention comprend de plus après l'étape Al) mais avant l'étape A), une étape A2) de broyage des champignons obtenus après l'étape Al).
Cependant, lorsque les solvants ne sont pas simplement de l'eau, ils doivent être évaporés et l'extrait obtenu doit être remis dans de l'eau potable, avant d'être consommé.
De préférence, dans l'extrait de l'invention le champignon après macération et/ou infusion est retiré, par exemple par une simple filtration.
Egalement de préférence, le Lepista flaccida est séché ou lyophilisé avant sa macération et/ou infusion dans le solvant.
Il suffit ensuite de simplement boire l'extrait obtenu par le procédé décrit ci-dessus pour obtenir l'effet thérapeutique et/ou préventif voulu. Dès lors, l'invention propose également un extrait de Lepista flaccida obtenu par le procédé ci-dessus destiné à être utilisé dans le traitement et/ou la prévention d'une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA.
L'extrait de l'invention comprend au moins de la 2,6-diaminopurine (DAP) et de la clitocine. La clitocine peut être l'anomère alpha de la clitocine (6-amino-5-nitro-4-(a-D- ribofuranosylamino)-pyrimidine), l'anomère beta de la clitocine (6-amino-5-nitro-4-((3-D- riboruranosylamino)-pyrimidine), ou un mélange des deux.
Comme cela sera montré dans les exemples, cet extrait n'a pas de toxicité in vivo.
Il est capable de restaurer l'expression des gènes contenant une mutation non-sens UGA et/ou UAA d'une manière très efficace.
La présente invention a aussi pour objet une composition pharmaceutique comprenant un extrait de Lepista flaccida tel que défini ci-dessus et un excipient pharmaceutiquement acceptable destinée à être utilisée dans le traitement et/ou la prévention d'une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA.
On entend par « excipient » une substance qui comporte l'extrait de Lepista flaccida selon l'invention dans une composition lui conférant par exemple des propriétés de stabilité, de forme (par exemple liquide, solide, gélule), de goût, de dissolution (par exemple dissolution ciblée dans l'estomac ou le tube digestif) et de couleur.
Un « excipient pharmaceutiquement acceptable » désigne un excipient qui ne produit pas de réaction défavorable, allergique ou indésirable lorsqu'il est administré à un sujet. Cela inclut tous les solvants, les milieux de dispersion, les enrobages, les agents antibactériens et antifongiques, les agents isotoniques, les agents à absorption retardée et autres substances similaires. Pour une administration chez un être humain, les préparations doivent répondre aux critères de stérilité, de pyrogénicité, et aux normes de sécurité et de pureté générales requises par les offices régulateurs. L'excipient peut par exemple être de l'eau.
La présente invention a aussi pour objet une méthode pour traiter et/ou prévenir des maladies dues à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA telle que définie ci-dessus, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un extrait de Lepista flaccida ou d'une composition pharmaceutique tels que définis ci-dessus à un sujet ayant besoin de ce traitement.
Les termes « traitement » ou « traiter » concernent à la fois le traitement thérapeutique et les termes « prévention » ou « prévenir » concernent les mesures prophylactiques ou préventives, pour lesquels l'objet est d'empêcher ou de ralentir la progression de la maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA. Les sujets qui ont besoin d'un traitement incluent ceux qui ont déjà une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA, ceux prédisposés à une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA et ceux chez qui une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA doit être prévenue.
Un sujet est traité avec succès pour une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA si, après avoir reçu une quantité thérapeutiquement efficace de Lepista flaccida ou d'extrait de Lepista flaccida ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention, le sujet montre une réduction observable ou mesurable, ou l'absence, de l'un au moins des points suivants : réduction du nombre de cellules pathogènes, réduction du pourcentage de cellules pathogènes par rapport aux cellules totales, et/ou de l'un ou de plusieurs des symptômes associés à la maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA ou une amélioration de la qualité de vie. Les paramètres d'évaluation ci-dessus sont facilement mesurables par les procédures de routine familières à un médecin.
Avantageusement, les patients sont présélectionnés comme présentant dans un gène d'intérêt ladite mutation non-sens sur au moins un allèle.
Le terme « sujet » concerne un mammifère, de préférence un humain. Dans un mode de réalisation préféré, le sujet peut être un « patient », le. un animal à sang chaud, de préférence un humain, en attente de recevoir ou recevant des soins médicaux, qui a fait l'objet d'une procédure médicale, ou qui est suivi pour le développement d'une maladie génétique liée à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA. Une « quantité thérapeutiquement efficace » concerne la quantité de Lepista flaccida ou d'extrait de Lepista flaccida ou de composition pharmaceutique nécessaire et suffisante pour, sans causer d'effets secondaires significatifs et défavorables pour le sujet, diminuer ou stopper la progression, ou l'aggravation de l'un ou de plusieurs des symptômes de la maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA, pour soulager les symptômes de la maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA, et/ou pour guérir la maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA.
Les modes et voies d'administration du Lepista flaccida ou d'extrait de Lepista flaccida ou d'une composition pharmaceutique tels que définis ci-dessus peuvent être adaptés par l'homme du métier en fonction du sujet et du procédé de préparation de l'extrait. A titre d'exemple, Lepista flaccida ou l'extrait de Lepista flaccida selon l'invention peut être formulé pour une administration par voie orale ou nasale, ou par injection par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée, de préférence par voie orale.
La détermination de la dose à laquelle ledit Lepista flaccida ou extrait de Lepista flaccida selon l'invention est utilisé peut s'effectuer par des techniques connues de l'homme du métier, par exemple lors d'essais cliniques. Cette dose dépendra de divers facteurs comprenant notamment l'activité de l'extrait de Lepista flaccida selon l'invention, du mode d'administration, de la durée de l'administration, de la durée du traitement, d'autres médicaments ou composés utilisés en combinaison avec ledit Lepista flaccida ou extrait de Lepista flaccida selon l'invention, de l'âge, du sexe, du poids, de l'état de santé générale et de l'histoire médicale antérieure du sujet qui est traité.
On entend par « maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA », une maladie causée partiellement ou totalement par la présence d'une mutation non-sens affectant un ou deux allèles d'un gène d'intérêt dans les cellules germinales et/ou les cellules somatiques ; la mutation non-sens étant une mutation ponctuelle d'un codon qui entraîne le changement d'un codon codant un acide aminé en un codon stop UGA et/ou UAA qui entraîne l'arrêt de la traduction. En particulier, la maladie peut être causée partiellement par la présence d'une mutation non-sens affectant un allèle d'un gène d'intérêt, l'autre allèle présentant un autre type de mutation. Plusieurs maladies dues à cette mutation non-sens ont été décrites (Keeling et al., 2006; Bidou et al., 2012; Lee and Dougherty, 2012 ; Kosuga et al, 2016). Ces maladies peuvent affecter différents organes, tels que le foie, les intestins, le rein, le poumon, le muscle, la moelle osseuse ou le système nerveux central.
Les maladies dues à la mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA et/ou UAA peuvent être identifiées par des méthodes de génotypage des cellules du sujet à traiter, plus particulièrement par séquençage ou par quantification de l'expression du gène d'intérêt. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier (Baharin et al., 2015 ; Bladen et al., 2015 ; Cangul et al., 2015 ; Carmosino et al., 2016 ; Csanyi et al., 2016 ; Kosuga et al., 2016 ; Lin et al., 2016 ; oosing et al., 2016 ; Xia et al., 2016 ; Zemrani et al., 2016 ; Zhao et al., 2016). Par exemple, la Demande Internationale WO 2012/016930 décrit de manière générale une méthode pour déterminer si une maladie est due à cette mutation non-sens.
Les maladies traitées et/ou prévenues par l'extrait de Lepista flaccida selon l'invention ou par la composition pharmaceutique de l'invention sont en particulier les maladies inflammatoires dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les maladies neurodégénératives dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les maladies auto- immunes dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les maladies cardiovasculaires dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les maladies pulmonaires dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les cancers dus à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'amylose due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie d'Alzheimer due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'athérosclérose due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le gigantisme dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le nanisme dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'hypothyroïdie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'hyperthyroïdie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la mucoviscidose due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'obésité due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de Parkinson due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de Niemann Pick due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, 1 ' hypercho lestérolémie familiale due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la rétinite pigmentaire due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Marfan dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les maladies lysosomales dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les dystrophies musculaires dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'hémophilie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les céroïde-lipofuscinoses neuronales infantiles tardives dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la béta-thalassémie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Dravet dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'achromatopsie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome d'Usher de type IC dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome d'Elhers-Danlos type musculo- contractural dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome Alagille dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome d'Alstrôm dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, un déficit en antithrombine dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le complexe de Carney dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Currarinon dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'anémie de Blackfan-Diamond due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la protoporphyrie érythropoïétique due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de Fabry due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le déficit congénital en facteur XIII dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la glycogénose de Bickel-Fanconi due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la triméthylaminurie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de Gaucher due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de Rendu-Osier due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'homocystinurie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Joubert dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de Krabbe due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'acidurie L-2-HG due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'acidémie méthylmalonique due à ladite (auxdites) mutation(s) non- sens, le syndrome de Peters-plus dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Townes-Brocks dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de von Willebrand due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Wiskott-Aldrich dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Kabuki dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de Dorfiman-Chanarin due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie des yeux de poisson due à un déficit partiel en lécithine-cholestérol- acyl-transférase due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les mucopolysaccharidoses dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le déficit en coenzyme Q10 dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Zellweger dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le cancer colorectal dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'entéropathie congénitale due à un déficit de l'entéropeptidase due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Peutz-Jeghers dû à ladite (auxdites) mutation(s) non- i l
sens, le syndrome de Jervell et Lange Nielsen dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Lynch dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie des inclusions microvillositaires due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la xanthinurie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'acidose due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome d'Alport dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Bardet Biedl dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Birt-Hogg-Dubé dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de Dent due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Giteîman dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de léiomyomatose héréditaire-cancer du rein dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de Minkowski-Chauf ard due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'amaurose congénitale de Leber due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'intolérance aux protéine dibasiques avec lysinurie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la néphronophthise due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la polykystose rénale récessive due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le pseudohypoaldostéronisme dû à ladite (auxdites) rnutation(s) non-sens, l'hypoplasie et la dysplasie rénales dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le carcinome à cellule claire du rein dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le carcinome papillaire du rein de type 2 dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome d'Ochoa dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de von Hippel-Lindau due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la tumeur de Wi ms due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le rachitisme hypophosphatémique lié à ΓΧ dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la néphropathie hyperuricémique familiale juvénile due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la sclérose tubéreuse de Bourneville due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome néphrotique finlandais dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome néphrotique idiopathique cortico-résistant dû à ladite (auxdites) mutation(s), le syndrome de Pierson dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Denys-Drash dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Schimke dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la résistance au glucocorticoïde primaire due à ladite (auxdites) mutation(s) non- sens, le rachitisme vitamino-résistant hypophosphatémique dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'hyperoxalurie primitive de type 1 due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le pseudohypoaldostéronisme type 1 (PHAl) dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'acidose tubulaire rénale type 2 due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de Bassen-Komzweig due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome d'Alpers Huttenlocher dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le déficit en carbamoyl-phosphate synthase I (CPS1) dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de surcharge en esters de cholestérol due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le déficit en citrine dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Dubin- Johnson dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la déficience en facteur V due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la glycogénose due à ladite (auxdites) mutation(s) non- sens, l'hémophilie due à un déficit en facteur VIII ou IX due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le carcinome hépatocellulaire dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la porphyrie hépatoérythropoïétique due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la paraplégie spastique familiale due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'hypo- betalipoprotéinémie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le déficit constitutionnel en facteur XI dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le diabète de type adulte chez le jeune dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'anémie hypochrome microcytaire due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de déplétion de l'ADN mitochondrial dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la déplétion de l'ADN mitochondrial due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la phénylcétonurie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la polykystose hépatique due à ladite (auxdites) mutation(s) non- sens, la porphyrie cutanée tardive due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la cholestase intrahépatique progressive familiale due à ladite (auxdites) mutation(s) non- sens, la maladie de Wilson due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, 1 ' hypercholestérolémie autosomale dominante due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la déficience en facteur XII due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la déficience en facteur X due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, hypofibrinogénémie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'afibrinogénémie due à ladite (auxdites) mutation(s) non- sens, la déficience en facteur VII due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, 1 ' agammaglobulinémie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la thrombocytopénie amégakaryocytaire due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'anémie dysérythropoïétique congénitale type 2 due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les dystrophies musculaires de Duchenne (DMD) et de Becker (BMD) dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les myopathies centronucléaires dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les dystrophies musculaires des ceintures dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la myopathie de Miyoshi due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la dystrophie musculaire congénitale de type Ullrich due à ladite (auxdites) mutation(s) non- sens, l'amyotrophie spinale due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'épidermolyse bulleuse dystrophique due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la maladie de Hailey- Hailey due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'épidermolyse bulleuse jonctionnelle type Herlitz due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Netherton dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, le syndrome de Hurler dû à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la LINCL (Late Infantile Neuronal Ceroid Lîpofuscmosis) due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens.
De préférence, la maladie est choisie parmi la mucoviscidose due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la rétinite pigmentaire due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les dystrophies musculaires dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'hémophilie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la béta-thalassémie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les mucopolysaccharidoses dues à ladite (auxdites) mutation(s) non- sens, l'amyotrophie spinale due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens.
En particulier, la maladie due à ladite mutation non-sens peut être la mucoviscidose due à la mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA ou UAA dans le gène CFTR. La mucoviscidose due à la mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA ou UAA dans le gène CFTR peut conduire par exemple, de manière non-limitative aux mutations suivantes : G27X, Q39X, K52X, W57X, R75X, Y109X, Y122X,W202X, W216X, C225X, Q290X, L320X, W401X, Q414X, S434X, S466X, S489X, G542X, Q552X, R553X, E585X, Q634X, E656X, G673X, R709X, K710X, L732X, G745X, R764X, R785X, R792X, G827X, C832X, W846X, R851X, W882X, Q890X, G1003X, Q1042X, W1063X, W1089X, W1098X, R1 102X, E1 104X, R1128X ; R1 158X, R1 162X, S1 196X, W1204X, S1206X, W1282X, Q1313X, Q1382X, Q1390X, Q141 1X, Q1412X, Q1476X.
L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture des exemples qui suivent et qui sont décrits en référence aux figures annexées dans lesquelles :
- la figure 1 est une représentation schématique de la construction utilisée pour démontrer l'efficacité de l'extrait de Lepista flaccida de l'invention en tant que correcteur de mutations UGA, UAG et UAA, - la figure 2 montre la mesure de l'activité luciférase dans les cellules humaines HeLa exprimant un gène luciférase porteur d'un codon stop prématuré UAA, UAG ou UGA traitées avec l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon le procédé décrit dans l'exemple 2 par rapport au contrôle positif G418 à 1 mg/ml,
- la figure 3 représente l'analyse par Western blot montrant la réexpression du gène TP53 porteur d'une mutation non-sens sur ses deux allèles après traitement avec l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon le procédé décrit dans l'exemple 2 en comparaison avec le G418. La taille de la protéine p53 totale (p53FL) et la protéine p53 tronquée (p53TR) sont indiquées sur le côté droit du gel et les poids moléculaires sont indiqués à gauche du gel. Les trois colonnes de gauches représentent une dilution en série d'extrait de cellules Hela non traitées. CBP80 est utilisé comme contrôle de charge.
- la figure 4 montre la courbe de toxicité cellulaire de l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon le procédé décrit dans l'exemple 2 en comparaison avec celle du contrôle positif G418,
- la figure 5 montre l'efficacité de correction des mutations non-sens par le traitement avec l'extrait de Lepista flacccida obtenu selon les procédés décrits dans les exemples 2 et 3. A) mesure de l'activité luciférase dans les cellules humaines HeLa exprimant un gène luciférase porteur d'un codon stop prématuré UAA, UAG ou UGA traitées avec l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon le procédé décrit dans l'exemple 2 ou 3 par rapport au contrôle positif G418 à 21 μ^μΐ ou 1000 μg/ml. B) Analyse par Western blot de la réexpression du gène TP53 porteur d'une mutation non-sens sur ses deux allèles après traitement avec l'extrait Lepista flaccida obtenu selon le procédé décrit dans l'exemple 2 ou 3. La taille de la protéine p53 totale (p53FL) et la protéine p53 tronquée (p53TR) sont indiquées sur le côté droit du gel et les poids moléculaires sont indiqués à gauche du gel. Les trois colonnes de gauches représentent une dilution en série d'extrait de cellules Hela non traitées. UPF1 est utilisé comme contrôle de charge.
- La figure 6 montre l'effet in vivo de l'extrait de Lepista flaccida de l'invention obtenu selon le procédé décrit dans l'exemple 3 sur des souris MDX (porteuses d'une mutation non-sens UAA dans le gène codant la dystrophine) ayant bu de l'eau contenant l'extrait de Lepista flaccida de l'invention en comparaison à celui de souris MDX n'ayant bu que de l'eau pure seulement. - La figure 7 montre la mesure de l'activité luciférase dans les cellules humaines HeLa exprimant un gène luciférase porteur d'un codon stop prématuré UGA traitées avec l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon le procédé décrit dans l'exemple 2 (10 ng^L), la DAP (5,29 μΜ), la clitocine forme β (3,73 μΜ) ou le mélange de DAP et clitocine. Les données représentent la moyenne de deux expériences indépendantes.
Exemple 1
Préparation de la poudre de Lepista flaccida utilisée pour la préparation de l'extrait de Lepista flaccida.
Les collectes de champignons Lepista flaccida ont eu lieu en région parisienne (bois de Vincennes, Parc du Sausset, forêt de Fontainebleau). 8 kg de matériel frais ont été collectés. Les champignons communément synonymisées (Lepista flaccida I Paralepista flaccida / Clitocybe flaccida et Lepista inversa I Paralepista inversa / Clitocybe inversa) ont été récoltés et mélangés. Après avoir été dépoussiérés, les champignons ont été placés au congélateur à -80°C pendant une nuit puis lyophilisés à -110°C sous vide secondaire à 10"4 mbar pendant 24 à 48 heures. 646 g de champignon sec ont été obtenus à partir des 8 kg de champignons frais récoltés (rendement 8 %).
Les champignons secs obtenus ont ensuite été broyés au mortier. La poudre fine obtenue peut être conservée dans des bocaux en verre à température ambiante. La poudre de champignons lyophilisés ou séchés se conserve de manière plus simple et durable que le champignon frais.
La préparation de l'extrait de Lepista flaccida selon l'invention est de préférence effectuée avec des champignons lyophilisés ou séchés, puis broyés sous forme de poudre.r Exemple 2
Préparation de l'extrait de Lepista flaccida selon l'invention utilisant un mélange hydroalcoolique (H7).
100 mg de la poudre de champignon comme obtenue à l'exemple 1 sont macérés dans 200 mL d'un mélange hydroalcoolique (eau/méthanol 50/50) sous agitation pendant 24 heures à température ambiante. Le mélange est ensuite filtré pour récupérer la phase hydroalcoolique (filtrat). L'extrait est obtenu par concentration du filtrat à pression réduite.
Exemple 3 Un autre mode de préparation de l'extrait de Lepista flaccida selon l'invention consiste à faire macérer la poudre de champignon comme obtenue à l'exemple 1 dans de l'eau chauffée à 100°C.
100 mg de la poudre de champignon sont macérés dans 200 mL d'eau sous agitation pendant 20 minutes à une température de 100°C. Le mélange est ensuite filtré pour récupérer la phase aqueuse (filtrat). L'extrait est obtenu par concentration du filtrat à pression réduite.
Exemple 4
Un autre mode de préparation de l'extrait de Lepista flaccida selon l'invention consiste à faire macérer la poudre de champignon comme obtenue à l'exemple 1 dans de l'eau non chauffée (température ambiante).
100 mg de la poudre de champignon sont macérés dans 200 mL d'eau sous agitation pendant 24 heures à température ambiante. Le mélange est ensuite filtré pour récupérer la phase aqueuse (filtrat). L'extrait est obtenu par concentration du filtrat à pression réduite.
Exemple 5
Un autre mode de préparation de l'extrait de Lepista flaccida selon l'invention consiste à faire macérer la poudre de champignon comme obtenue à l'exemple 1 dans du méthanol à 100%.
100 mg de la poudre de champignon sont macérés dans 200 mL de méthanol sous agitation pendant 6 heures à température ambiante. Le mélange est ensuite filtré pour récupérer la phase méthanolique (filtrat). L'extrait est obtenu par concentration du filtrat à pression réduite.
Exemple 6
Caractérisation et dosage de la 2,6 diaminopurine (DAP) et de la clitocine dans l'extrait de Lepista inversa obtenu selon les modes de préparation décrits ci dessus.
Préparation des étalons :
La 2,6 diaminopurine commerciale (référence 247847, Sigma-Aldrich) a été utilisée comme étalon externe pour réaliser la courbe de dosage de la 2,6 diaminopurine (DAP) dans l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon les modes de préparation décrits dans les exemples 2, 3, 4 et 5. Cinq points de gamme ont été préparés par dilutions successives dans l'eau milliQ à 5.10'3 ig.\xLA 10'3 μg.μL-1; 5.10"4 μ^μΐ'1; 10"4 §.μυ'; 5.10"5 μξ.μΐ'1 en triplicat et injectés en LC-MS. La clitocine commerciale (référence A-7052-001 , Azur Isotop) a été utilisée comme étalon externe pour réaliser la courbe de dosage de la clitocine. Cinq points de gamme ont été préparés par dilutions successives dans l'eau milliQ à 5.1(P μ μΙ/'; 1(Γ μ&μΙ/'; 5.10* 4 μ&μΐ 1; 10"4 μ . 1; 5.10"5 μg.μUl en triplicat et injectés en LC-MS.
Analyses LC-MS :
Des solutions à 0,1 mg/mL de l'extrait obtenu selon les modes de préparation décrits dans les exemples 2, 3, 4 et 5 à partir de la poudre de champignon comme obtenue à l'exemple 1 ont été préparées dans l'eau milliQ pour être injectées en LC-MS.
L'extrait de Lepista flaccida obtenu selon les modes de préparation décrits dans les exemples 2, 3, 4 et 5 a été analysé par chromatographie liquide (RSLC ultimate 3000®, Thermo Fisher Scientific) couplée à un spectromètre de masse (Maxis II, Brucker) en tandem quadripôle-temps de vol (Q-TOF), source d'ionisation par électrospray (ESI).
La 2,6 diaminopurine (DAP) et la clitocine ont été dosées sur une colonne Acclaim™ Polar Advantage II ; (3 μηι, 1 x 150 mm) (Thermo Fisher Scientific). La phase mobile était constituée d'eau milliQ contenant 0,1% d'acide formique (solvant (A)) et d'acétonitrile de qualité HPLC (solvant (B)). Les analyses ont été effectuées à un débit de 0,3 μί.ΗΊΪη" 1 avec le gradient suivant : 3% de (B) durant 5 minutes, passage de 3% à 80% de (B) en 1 minute, maintien à 80% de (B) pendant 2 minutes puis retour aux conditions de départ 3% (B) en 1 minute et rééquilibrage pendant 2 minutes à 3% (B). Dans ces conditions, les temps de rétention sont 0,9 min pour la DAP et 2,7 min pour la clitocine forme β.
Les analyses LC-MS ont été réalisées par ionisation électrospray en mode positif. La tension du capillaire était de 3500 volts. Les spectres de masse ont été réalisés sur une gamme allant de 50 à 1300 m/z en mode continu. Le logiciel Compass Data Analysis 4.4.200 ® a été utilisé pour retraiter les spectres et intégrer les pics afin de réaliser les courbes de dosage.
Compte tenu du volume d'injection de 1 μΐ, et de la concentration de 0,1 mg.mL"1 des solutions injectées, la concentration de 2,6 diaminopurine (DAP) dans l'extrait de Lepista flaccida est comprise entre 4 et 6 mg/g d'extrait, et la concentration de la clitocine forme β dans l'extrait est comprise entre 10 et 20 mg/g d'extrait. En revanche, la concentration de la clitocine forme a est inférieure à la limite de quantification de la méthode (<0,01 mg/g d'extrait). Caractérisation de la DAP et de la clitocine:
La 2,6 diaminopurine (DAP) et la clitocine forme β ont été identifiées par leurs temps de rétention en HPLC (DAP: 0,9 min; clitocine forme β: 2,7 min dans les conditions décrites ci dessus) et leurs caractéristiques en spectrométrie de masse (MS) et en résonance magnétique nucléaire (RMN) par comparaison avec des échantillons de référence commerciaux.
Exemple 7
L'efficacité de l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon l'exemple 2 a été déterminée par criblage en utilisant la construction montrée en figure 1. Dans cette construction, l'ÀDNc codant la fïrefly luciférase a été interrompu par un intron et une mutation non-sens (soit UGA, soit UAG, soit UAA) a été introduite à plus de 55 nucléotides en amont de la position de Γ intron, de façon à activer le nonsense-mediated mRNA decay (NMD) sur l'ARNm correspondant.
Dans ce test, les cellules HeLa sont transfectées avec la construction montrée en figure 1 portant une des trois mutations non-sens en utilisant de la lipofectamine selon le protocole du fabricant (Lifetechnologies). Le jour suivant, les cellules sont réparties en plaques de 96 puits et l'extrait de Lepista flaccida obtenu à l'exemple 2 et le contrôle positif G418 sont ajoutés immédiatement avant une incubation de 24 heures. Finalement, le substrat SteadyLite plus (Perkin Elmer) est ajouté au milieu de culture et les plaques ont été lues au luminomètre Tristar (Berthold). Chaque puits est lu sur 10 secondes et la plaque est lue deux fois.
La figure 2 montre les résultats de ce test de criblage sur chacune des trois mutations non-sens et dont le puits indiqué contient de l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon l'exemple 2 à 100 ng^L. Dans ces figures, le contrôle positif est le composé G418 à 1 mg/ml. On constate à partir de la figure 2 que l'extrait de Lepista flaccida de l'invention n'a aucun effet significatif sur le codon UAG, mais qu'il est en revanche beaucoup plus efficace que le contrôle G418 sur les codons UAA et UGA.
Exemple 8
Pour valider l'efficacité de l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon l'exemple 2 en tant que correcteur des mutations non-sens UGA et/ou UAA, les cellules Calu-6 (porteuses d'une mutation non-sens UGA sur les deux allèles codant le gène TP53 au niveau du codon 196) ont été incubées pendant 24 heures en présence de milieu de culture (RPMI, 10% de sérum de bœuf décomplémenté et 1% de zellshield), de milieu de culture contenant 25 ng/μΐ d'extrait de Lepista flaccida de l'exemple 2 ou 1 mg/ml de G418. Les protéines sont ensuite purifiées au moyen d'un tampon de lyse contenant 5% de SDS, 50 mM Tris pH 7.3 et 20 mM EDTA, Le lysat obtenu est soumis à 30 puises de sonication avant d'être centrifugé 5 minutes à lOOOOxg. Le surnageant est récupéré et un dixième est déposé sur un gel d'acrylamide à 10% avant de transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose. Cette membrane est ensuite exposée à un anticorps primaire anti-p53 ou CBP80 pendant une nuit à 4°C, puis à un anticorps secondaire couplé à une activité peroxidase pour révéler la présence des protéines p53 et CBP80 en utilisant le substrat supersignal West Femto (Pierce).
Comme on peut le voir en figure 3, l'extrait de Lepista flaccida de l'invention permet de restaurer l'expression du gène TP53 contenant une mutation non-sens UGA, dans des cellules Calu-6, plus efficacement que le contrôle positif G418.
En figure 3, « p53FL » désigne une protéine p53 de longueur entière et « p53TR » désigne une protéine p53 tronquée.
Exemple 9
Dans cet exemple, la toxicité de l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon l'exemple 2 a été évaluée. Pour cela, la croissance de la population de cellules en l'absence ou en présence soit de l'extrait de Lepista flaccida de l'invention, soit du contrôle positif G418 a été suivie.
Le test a été effectué de la façon suivante :
15 puits de plaques à 6 puits ont reçu 50 000 cellules Calu-6 au départ et sont incubées par groupe de 5 en présence de DMSO, d'extrait de Lepista flaccida obtenu à l'exemple 1 ou de contrôle positif G418. Toutes les 48 heures, les cellules d'un puits par condition de traitement sont récoltées après digestion à la trypsine et comptées au cytomètre TALI (Lifetechnologies). Le reste des cellules collectées est utilisé pour mesurer l'apoptose comme décrit dans Jia et al, 2015, Cell Def Differ. 22, 1754-1763.
La concentration de l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon l'exemple 2 de l'invention dans le milieu de culture était de 25 ng/μΐ et la concentration en contrôle positif G418 était de 1 000 ng/μΐ.
Un comptage des cellules et une mesure de l'apoptose ont été effectués sur chaque culture de cellules tous les deux jours. La figure 4 montre le résultat de ces mesures sur 10 jours. Comme on peut le voir à la figure 4, on note un ralentissement de la croissance de la population de cellules avec l'extrait de Lepista flaccida selon l'invention mais cette croissance est toujours positive, indiquant qu'il y a plus de cellules en division que de cellules en arrêt de cycle cellulaire ou mortes.
On peut également voir à partir de la figure 4 que, la population traitée avec le contrôle positif G418, contrairement à la population de cellules traitées avec l'extrait de Lepista flaccida de l'invention, diminue indiquant une forte toxicité de G418 comparé à l'extrait Lepista flaccida.
Exemple 10
L'efficacité de l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon les exemples 2 ou 3 a été identifiée par criblage comme décrit dans l'exemple 7. Dans ce test, les cellules HeLa sont transfectées avec la construction montrée en figure 1 portant une des trois mutations non- sens en utilisant de la lipofectarnine selon le protocole du fabricant (Lifetechnologies). Le jour suivant, les cellules sont réparties en plaques de 96 puits et les extraits de Lepista flaccida obtenus selon l'exemple 2 et l'exemple 3 et les contrôles positifs G418 sont ajoutés immédiatement avant une incubation de 24 heures. Finalement, le substrat SteadyLite plus (Perkin Elmer) est ajouté au milieu de culture et les plaques ont été lues au luminomètre Tristar (Berthold). Chaque puits est lu sur 10 secondes et la plaque est lue deux fois.
La figure 5A montre les résultats de ce test de criblage sur chacune des trois mutations non-sens après traitement avec les extraits de Lepista flaccida. On constate que les extraits obtenus par le procédé de l'exemple 2 (H7) et celui de l'exemple 3 (infusion à 100°C) sont beaucoup plus efficaces que les contrôles positifs G418 à 21 μ§/μ1 et 1000μ /μ1 sur les codons UAA et UGA.
Pour valider l'efficacité de l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon les exemples 2 et 3 en tant que correcteur des mutations non-sens UGA et/ou UAA, les cellules Calu-6 (porteuses d'une mutation non-sens UGA sur les deux allèles codant le gène TP53 au niveau du codon 196) ont été incubées pendant 24 heures en présence de milieu de culture (RPMI, 10% de sérum de bœuf décomplémenté et 1% de zellshield), contenant 25 ng/μΐ d'extrait de Lepista flaccida obtenu selon l'exemple 2 ou 3. Les protéines sont ensuite purifiées au moyen d'un tampon de lyse contenant 5% de SDS, 50 mM Tris pH 7.3 et 20 mM EDTA. Le lysat obtenu est soumis à 30 puises de sonication avant d'être centrifugé 5 minutes à lOOOOxg. Le surnageant est récupéré et un dixième est déposé sur un gel d'acrylamide à 10% avant de transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose. Cette membrane est ensuite exposée à un anticorps primaire anti-p53 ou UPF1 pendant une nuit à 4°C, puis à un anticorps secondaire couplé à une activité peroxidase pour révéler la présence des protéines p53 et UPF1 en utilisant le substrat supersignal West Femto (Pierce).
Comme on peut le voir à la figure 5B, l'extrait de Lepisîa flaccida obtenu selon l'exemple 3 (100°C) ou l'exemple 2 (H7) permet de restaurer l'expression du gène TP53 contenant une mutation non-sens UGA, dans des cellules Calu-6.
En figure 5B, «p53FL » désigne une protéine p53 de longueur entière et « p53TR » désigne une protéine p53 tronquée.
Exemple 11
Dans cet exemple, l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon le protocole décrit à l'exemple 3 (eau à 100°C) a été testé sur des souris MDX.
Deux groupes de souris MDX ont été constitués de la façon suivante : quatre mâles et cinq femelles ont été exposés à l'extrait de Lepista flaccida, et trois mâles et trois femelles n'ont pas reçu de traitement. Toutes les souris avaient entre 6 et 8 semaines au début de l'expérience. La boisson de l'un des deux groupes de souris était de l'eau uniquement, et la boisson de l'autre groupe était la phase aqueuse obtenue au cours du mode préparation de l'extrait de Lepista flaccida selon l'exemple 3.
Tous les deux jours des exercices physiques ont été effectués pour mesurer la capacité à courir de chaque groupe de souris. Pour cela, les souris sont introduites dans une roue fermée liée à un ordinateur et à un logiciel pour mesurer le temps de course.
La figure 6 montre les résultats de ces essais.
Comme on peut le voir en figure 6, le temps de course des souris du groupe traité avec l'extrait de Lepisîa flaccida de l'invention augmentait régulièrement avec le traitement, passant d'environ 100 s à plus de 350 s en sept jours alors que sur la même période le groupe de souris n'ayant pas été traité n'augmentait pas ou peu sa capacité à courir, le temps de course passant de 100 s à environ 150 s.
En conclusion, l'extrait de Lepista flaccida de l'invention a la propriété de pouvoir corriger les mutations non-sens UGA et UAA, uniquement. Cette semi -exclusivité de codons stop est un avantage puisque cela diminue les éventuels effets non spécifiques. L'extrait de Lepista flaccida de l'invention permet une réexpression au niveau protéique d'un gène porteur d'une mutation non-sens UGA et/ou UAA à un niveau bien plus important que ce qui peut être atteint avec le G418 qui est pourtant la molécule conduisant à la réexpression la plus efficace, jusqu'à présent (Bidou et al, 2004, Dranchak et al, 2011; Sangkuhl et al, 2004, précédemment cités).
L'extrait de Lepista flaccida de l'invention a un autre avantage en comparaison au G418 qui est qu'il ne montre que peu ou pas de toxicité sur des cellules en culture comme observé en suivant la prolifération cellulaire et le taux d'apoptose dans des cellules exposées au DMSO, au G418 ou à l'extrait de Lepista flaccida de l'invention.
Enfin, il a été montré que l'extrait de Lepista flaccida de l'invention active la translecture mais n'induit pas d'inhibition du NMD pour corriger les mutations non-sens UGA et/ou UAA.
Enfin l'effet in vivo de l'extrait du Lepista flaccida a été démontré sur des souris MDX.
Exemple 12
Pour évaluer l'efficacité de l'extrait de Lepista flaccida à celle de la DAP et de la clitocine prises séparément ou en mélange, l'effet de l'extrait de Lepista flaccida à 10 ng/^L obtenu selon l'exemple 2, a été comparé à celui de la clitocine forme β à la concentration de 529 nM, et de la DAP (référence 247847, Sigma-Aldrich) à la concentration de 373 nM, ou du mélange de DAP (373 nM) et clitocine forme β (529 nM). L'efficacité a été mesurée par criblage en utilisant la construction montrée en figure 1. Dans cette construction, l'ADNc codant la firefly luciférase a été interrompu par un intron et une mutation non-sens UGA a été introduite à plus de 55 nucléotides en amont (-6) de la position de l'intron, de façon à activer le nonsense-mediated mRNA decay (NMD) sur l'ARNm correspondant. Les concentrations de DAP et clitocine forme β utilisées dans ces expériences correspondent aux concentrations de la DAP (0,56 % de l'extrait) et la clitocine (1 ,52% de l'extrait) trouvées dans 10 ng^iL d'extrait.
Dans ce test, les cellules HeLa sont transfectées avec la construction montrée en figure 1 portant la mutation non-sens UGA en utilisant de la lipofectamine selon le protocole du fabricant (Lifetechnologies). Le jour suivant, les cellules sont réparties en plaques de 96 puits et l'extrait de Lepista flaccida, la DAP, la clitocine et le mélange DAP/clitocine sont ajoutés immédiatement avant une incubation de 24 heures. Finalement, le substrat SteadyLite plus (Perkin Elmer) est ajouté au milieu de culture et les plaques ont été lues au luminomètre Tri star (Berthold). Chaque puits est lu sur 10 secondes et la plaque est lue deux fois. les
La figure 7 montre les résultats de l'efficacité de correction sur la mutation non-sens UGA pour l'extrait de Lepista flaccida obtenu selon l'exemple 2 (H7), la DAP, la clitocine forme β et le mélange de DAP et de clitocine forme β. On constate à partir de la figure 7 que l'extrait de Lepista flaccida a un effet correcteur sur le codon UGA très significativement plus important que la DAP seule ou la clitocine seule, ou bien la DAP et la clitocine en combinaison.

Claims

REVENDICATIONS
1. Lepista flaccida destiné à être utilisé dans le traitement et/ou la prévention d'une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA ou UAA.
2. Extrait de Lepista flaccida comprenant au moins de la 2,6-diaminopurine destiné à être utilisé dans le traitement et/ou la prévention d'une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop UGA ou UAA.
3. Extrait de Lepista flaccida comprenant au moins de la 2,6-diaminopurine destiné à être utilisé selon la revendication 2 obtenu par macération ou infusion du champignon Lepista flaccida dans un solvant.
4. Extrait de Lepista flaccida comprenant au moins de la 2,6-diaminopurine destiné à être utilisé selon la revendication 2 ou 3 obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes :
A) macération et/ou infusion du champignon Lepista flaccida dans un solvant choisi parmi :
- de l'eau, de l'eau acidifiée par exemple avec de l'acide chlorhydrique, de l'acide formique, de l'acide trifluoroacétique, de l'acide acétique, de l'acide fluorhydrique, de l'acide fluoroacétique, de l'acide oxalique, de l'eau rendue basique par exemple avec de l'hydroxyde de sodiums ou de l'ammoniaque,
- un hydrocarbure tel que l'hexane, le cyclohexane, le benzène, le toluène, le xylène, le trichloroéthylène, le perchloroéthylène,
- un alcool tel que le méthanol, l'éthanol, le propan-l-ol, propan-2-ol, le butanol, l'alcool furfurylique,
- une cétone telle que l'acétone et la méthylisobutylcétone,
- un éther tel que Γ éther diéthylique, le méthyl terbutyl éther et le tétrahydrofurane,
- un glycol tel que l'éthylène glycol et le propylène glycol, - un éther de glycol tel que, le méthyl éther, le propylène glycol méthyl éther et le propylène glycol butyl éther,
- un ester tel que l'acétate d'éthyle, le lactate d'éthyle,
- un ester de carbonate tel que le carbonate de propylène,
- un dérivé nitré tel que le nitrométhane, le 2-nitropropane et le nitrobenzène,
- un dérivé soufré tel que le chlorure de thionyle, le chlorure de sulfuryle et le diméthylsulfoxyde,
- un dérivé azoté tel que le diméthylformamide, la triéthylamine, la N-méthyl-2- pyrrolidone, le Ν,Ν-diméthylformamide, la pyridine et l'acétronitrile,
- un dérivé chloré tel que le chloroforme et le dichlorométhane,
- les mélanges de deux ou plus de ces solvants, à une température comprise entre 20 et 100 °C selon le point d'ébullition des solvants;
B) fïltration du mélange obtenu à l'étape A) pour récupérer d'une part une phase solide et d'autre part une phase liquide ;
C) récupération de la phase liquide obtenue après l'étape B).
5. Extrait de Lepista flaccida comprenant au moins de la 2,6-diaminopurine destiné à être utilisé selon la revendication 3 ou 4 caractérisé en ce que dans son procédé d'obtention, le solvant est choisi parmi un alcool en Ci à C4> de l'eau, un mélange d'eau et d'au moins un alcool en Ci à Q et un mélange d'au moins deux alcools en Ci à Q.
6. Extrait de Lepista flaccida destiné à être utilisé selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5 caractérisé en ce qu'il comprend de plus, après l'étape C), lorsque le solvant n'est pas de l'eau, une étape d'évaporation de ce solvant et la dilution dans de l'eau de la phase obtenue après cette évaporation du solvant.
7. Extrait de Lepista flaccida comprenant au moins de la 2,6-diaminopurine destiné à être utilisé selon l'une quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend en outre de la clitocine.
8. Composition pharmaceutique comprenant un extrait de Lepista flaccida selon l'une quelconque des revendications 2 à 7 et un excipient pharmaceutiquement acceptable destinée à être utilisée dans le traitement et/ou la prévention d'une maladie due à une mutation non-sens d'un gène conduisant à l'introduction prématurée d'un codon stop
UGA ou UAA.
9. Lepista flaccida selon la revendication 1, caractérisé(e) en ce que ladite maladie est choisie parmi la mucoviscidose due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la rétinite pigmentaire due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les dystrophies musculaires dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'hémophilie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la béta-thalassémie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les mucopolysaccharidoses dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'amyotrophie spinale due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens.
10. Extrait de Lepista flaccida selon l'une quelconque des revendications 2 à 7 caractérisé(e) en ce que ladite maladie est choisie parmi la mucoviscidose due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la rétinite pigmentaire due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les dystrophies musculaires dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'hémophilie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la béta-thalassémie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les mucopolysaccharidoses dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'amyotrophie spinale due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens.
11. Composition pharmaceutique selon la revendication 8 caractérisé(e) en ce que ladite maladie est choisie parmi la mucoviscidose due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la rétinite pigmentaire due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les dystrophies musculaires dues à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, l'hémophilie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, la béta-thalassémie due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens, les mucopolysaccharidoses dues à ladite (auxdites) mutation(s) non- sens, l'amyotrophie spinale due à ladite (auxdites) mutation(s) non-sens.
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