WO2018052193A1 - 중간엽줄기세포 또는 그로부터 분비되는 단백질을 이용한 유비퀴틴 프로테아좀 조절제를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

중간엽줄기세포 또는 그로부터 분비되는 단백질을 이용한 유비퀴틴 프로테아좀 조절제를 스크리닝하는 방법 Download PDF

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Definitions

  • It relates to a method for screening a ubiquitin proteasome modulator using mesenchymal stem cells.
  • Degenerative brain disease is a disease that occurs in the brain among degenerative diseases that occur with age, and can be classified in consideration of major symptoms and invasive brain areas, including Alzheimer's disease and Parkinson's disease.
  • Degenerative brain disease is known to be caused by neuronal degeneration and neuronal death due to genetic and environmental factors due to aging, but the exact cause is not known yet. It is a situation.
  • UPS Ubiquitin-proteasome system
  • the ubiquitin proteasome system is involved in biological processes such as defective protein removal, cell division, and damaged DNA repair in eukaryotic cells.
  • diseases such as degenerative brain diseases, abnormalities in the ubiquitin proteasome system can cause toxic proteins to accumulate in vivo.
  • degenerative brain disease In Alzheimer's disease, it has been reported that amyloid protein inhibits activity in the ubiquitin proteasome system and reduced brain proteasome activity in Alzheimer's disease animal models (see Non-Patent Documents 1-6).
  • the present inventors have tried to find a substance that modulates the ubiquitin proteasome activity of the brain, and found that mesenchymal stem cells increase the proteasome activity of neurons.
  • the present invention was completed by identifying that Agouti related peptide was secreted.
  • One aspect is to provide a method for screening ubiquitin proteasome activity modulators such as ubiquitin proteasome activity enhancers, or ubiquitin proteasome activity inhibitors using mesenchymal stem cells.
  • ubiquitin proteasome activity modulators such as ubiquitin proteasome activity enhancers, or ubiquitin proteasome activity inhibitors using mesenchymal stem cells.
  • One aspect provides methods for screening ubiquitin proteasome activity modulators such as ubiquitin proteasome agonists, antagonists, or therapeutic agents for degenerative brain diseases using mesenchymal stem cells.
  • ubiquitin proteasome regulating agents may refer to substances that modulate the ubiquitin proteasome system.
  • the regulation may include substances that increase or decrease the activity of the ubiquitin proteasome.
  • the ubiquitin proteasome agonist that increases the activity of the ubiquitin proteasome may be a treatment for degenerative brain disease.
  • neurodegenerative disease may refer to a disease caused by deterioration of the structure or function of brain tissue or brain cells as aging progresses.
  • Examples of the degenerative brain disease may include Alzheimer's disease (senile dementia), dementia, Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease, Pick's disease, Huntington's disease or tau disease.
  • Alzheimer's disease is used interchangeably with senile dementia and refers to a disease involving mental degeneration associated with certain degenerative brain diseases characterized by senile plaques, neuroinflammatory tangles, and progressive nerve loss. can do.
  • Parkinson's disease can refer to chronic and progressive degenerative diseases of the central nervous system, which often impair motor function and speech.
  • Huntington's disease may mean a neurodegenerative disease caused by three-base repeated expansion in a gene encoding Huntington's protein, accompanied by chorea, psychosis, dementia and the like.
  • the term “Lou Gehrig's disease” refers to a disease in which only motor neuron cells are selectively killed, and the upper motor neuron cells of the cerebral cortex and the motor motor cells of the brain stem and spinal cord are gradually destroyed.
  • pick's disease may mean a disease that indicates progressive destruction of nerve cells in the brain.
  • tauopathy of the present invention may refer to a neurodegenerative disorder in which the brain nerve is damaged by abnormal accumulation of tau protein (family closely related to intracellular microtubule-related protein) in brain tissue.
  • the method comprises the steps of: (1) contacting the mesenchymal stem cells with nerve cells; (2) measuring the ubiquitin proteasome activity of the nerve cell, wherein the step measures the activity of the ubiquitin proteasome while identifying the protein secreted or expressed from the mesenchymal stem cells, or the candidate substance (1) measuring the activity of the ubiquitin proteasome after treating the neurons together; And (3) selecting a candidate substance that changes the activity of the ubiquitin proteasome as compared to a protein or no control group secreted or expressed from the mesenchymal stem cells that change the activity of the ubiquitin proteasome as a ubiquitin proteasome regulator. It may be a method for screening a ubiquitin proteasome modulator comprising the step.
  • the method may comprise (1) contacting the mesenchymal stem cells with neurons in vitro or administering the mesenchymal stem cells to an experimental animal on in vivo . step; (2) measuring the ubiquitin proteasome activity of the neurons and brain of the experimental animal, wherein the step measures the activity of the ubiquitin proteasome while identifying the protein secreted from the mesenchymal stem cells, or a candidate substance Measuring the activity of the ubiquitin proteasome after treating neurons or experimental animals together in step (1); And (3) selecting a candidate substance that changes the activity of the ubiquitin proteasome as a ubiquitin proteasome regulator as compared to the protein or the untreated control that changed the activity of the ubiquitin proteasome. It may be a method of screening.
  • the method comprises the steps of: (1) contacting an AgRP (Agouti-related ppeptide) or an active fragment thereof with neurons; (2) measuring the ubiquitin proteasome activity of the nerve cell, wherein the step is measuring the activity of the ubiquitin proteasome after treating the candidate material with the nerve cell in step (1); And (3) selecting a candidate substance whose activity of the ubiquitin proteasome is changed as compared to the untreated control group as a ubiquitin proteasome activity modulator.
  • the AgRP or the active fragment thereof may be to increase the activity of the ubiquitin proteasome.
  • MSCs Mesenchymal Stem Cells
  • the mesenchymal stem cells may be umbilical cord-derived, bone marrow-derived, placental-derived, or adipose-derived mesenchymal stem cells.
  • the umbilical cord may refer to a line connecting the mother and the abdomen to enable the mammalian fetus to grow in the placenta, and generally, three vessels surrounded by Wharton's Jelly, that is, two umbilical arteries and one umbilical vein Therefore, in the present specification, the mesenchymal stem cells may be umbilical cord or cord blood-derived mesenchymal stem cells. It may be carried out in a method obvious to those skilled in the art, and is described, for example, in Pittenger et al. (Science 284: 143, 1997) and van et al. (J. Clin. Invest., 58: 699, 1976).
  • the mesenchymal stem cells may be genetically engineered to secrete AgRP (Agouti-related ppeptide) or active fragments thereof, or to overexpress or secrete AgRP or active fragments thereof.
  • the term “Agouti-related ppeptide (AgRP)” may refer to a neural peptide produced in the brain by AgRP / NPY neurons.
  • the AgRP may include AgRP from vertebrates, including humans, eg, mammals, fish, amphibians, birds, or reptiles.
  • the AgRP may be meant to include a precursor of AgRP (eg, in humans, a signal peptide domain that is 20 amino acid residues from the N-terminus in the AgRP gene product of 132 amino acid sequences (precursor of AgRP)). Is removed to produce AgRP consisting of 112 amino acid residues).
  • the AgRP or active fragment thereof can also be used as a genetically engineered host cell comprising a nucleotide sequence encoding the AgRP or active fragment thereof.
  • the term "genetic engineering” or “genetically engineered” as used herein refers to the act of introducing one or more genetic modifications to a cell or to a cell made thereby.
  • the mesenchymal stem cell or host cell may be genetically engineered to increase the expression or activity of AgRP or an active fragment thereof, for example, an exogenous gene encoding AgRP or an active fragment thereof. have.
  • the increase in activity may mean that the activity of the same type of protein or enzyme has a higher activity as compared to the activity of an endogenous protein or enzyme that is not or has a given genetically unengineered parental cell (eg, wild type). .
  • the exogenous gene may be expressed in an amount sufficient to increase the activity of the protein mentioned in the mesenchymal stem cell or host cell compared to its parent cell.
  • the exogenous gene may be introduced into the parent cell through an expression vector.
  • the exogenous gene may be introduced into the parent cell in the form of a linear polynucleotide.
  • the exogenous gene may be expressed from an expression vector (eg, plasmid) in a cell.
  • the exogenous gene may be inserted into the genetic material (eg, chromosome) in the cell for stable expression.
  • Step (1) may mean a step of treating or contacting mesenchymal stem cells, AgRP or active fragments thereof to nerve cells.
  • the treatment or contacting may include co-culturing the mesenchymal stem cells with nerve cells, or administering the mesenchymal stem cells, AgRP or an active fragment thereof to an experimental animal, such as the brain of an animal, such as the hippocampus. Can be.
  • the treatment or contact may bring the host cell into contact with, for example, coculture, or host cell comprising a nucleotide sequence encoding AgRP or an active fragment thereof, or connect the host cell to an experimental animal, eg, Administration to an animal's brain, such as the hippocampus.
  • the coculture and administration can be carried out for a method and period of time such that those skilled in the art can achieve the desired effect, for example, mesenchymal stem cells or AgRP or active fragments thereof.
  • the measurement of ubiquitin proteasome activity may mean the identification of the ubiquitin-proteasome pathway (UPP).
  • UPP ubiquitin-proteasome pathway
  • UPP ubiquitin-proteasome pathway
  • the proteasome substrate to which the fluorescent moiety is bound may be overexpressed in a nerve cell, and the activity of the proteasome may be measured by measuring the fluorescence intensity. It may also be measured using a Raybio cytokine assay.
  • the step of identifying the protein secreted from the mesenchymal stem cells for the identification of proteasome activity regulatory protein may further include. Identification of the protein secreted from the mesenchymal stem cells may be performed before or after the step of measuring the activity of the ubiquitin proteasome.
  • candidate substances for proteasome activity regulation may be additionally screened.
  • the candidate material may be treated together to determine the activity of the ubiquitin proteasome.
  • the candidate substance may be, for example, the test compound or test composition may be a low molecular compound, an antibody, an antisense nucleotide, a short interfering RNA, a short hairpin RNA, a nucleic acid, a protein, a peptide, other extracts, or It may include natural products.
  • a step of selecting a candidate substance that changes the activity of the ubiquitin proteasome as compared to the protein or the untreated control which increases the activity of the ubiquitin proteasome may be performed as a ubiquitin proteasome modulator.
  • a protein that increases the activity of the ubiquitin proteasome for example, a protein that reduces the fluorescence intensity, or a protein that reduces the amount of ubiquitin conjugate protein, is in contact with a control, eg, a neuron. It may be a protein secreted or expressed more than the protein secreted or expressed in mesenchymal stem cells.
  • the protein or candidate substance that increases the activity of the ubiquitin proteasome may be an ubiquitin proteasome agonist, and the protein or candidate substance that reduces the activity of the ubiquitin proteasome may be an ubiquitin proteasome antagonist.
  • the method further comprises determining whether the identified protein or candidate substance modulates the activity of the ubiquitin proteasome.
  • the method may further include determining whether the concentration is controlled, decreased or increased, for example, the amount of the ubiquitin conjugate protein. Determining whether the ubiquitin proteasome activity is increased in a concentration-dependent manner may be confirmed by treating the ubiquitin proteasome activity inhibitor, for example, MG-132 together.
  • FIG. 1 confirms that human umbilical cord mesenchymal stem cells increase the activity of proteasome of nerve cells; 1A: Determination of chymotrypsin-like fluorescent substrate activation, FIG. 1B: Determination of amount of ubiquitin conjugate protein.
  • FIG. 2 confirms that human umbilical cord mesenchymal stem cells secrete AgRP protein; 2A: Raybio cytokine assay results, FIG. 2B: Quantitative real time PCR results.
  • FIG. 3 shows that AgRP secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells increases the proteasome activity of neurons;
  • Figure 3a Determination of chymotrypsin-like fluorescent substrate activation,
  • Figure 3b Determination of the amount of ubiquitin conjugate protein.
  • FIG. 4 is a diagram confirming that the AgRP protein secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells increases proteasome activity of hippocampal derived cells of an animal model;
  • Figure 4a Western blotting measurement of Ub conjugate,
  • Figure 4b Relative expression values of Ub conjugate.
  • FIG. 5 shows that AgRP protein secreted by human umbilical cord mesenchymal stem cells increases proteasome activity in an animal model
  • FIG. Figure 5a measurement of chymotrypsin-like fluorescent substrate activation
  • Figure 5b experimental protocol
  • Figure 5c measurement of chymotrypsin-like fluorescent substrate activation
  • Figure 5d determination of the amount of ubiquitin conjugate protein.
  • the umbilical cord is cut 3-4 cm long, then the tissue is chopped and treated with collagenase solution (Gibco, USA) for 60-90 minutes to break down the extracellular matrix, followed by 0.25% trypsin (Gibco , USA) was added to further induce degradation at 37 ° C. for 30 minutes.
  • collagenase solution Gibco, USA
  • trypsin Gibco , USA
  • fetal bovine serum FBS; Biowest, USA
  • DMEM Dulbecco Modified Eagle Medium
  • Nerve cells used SH-SY5Y (ATCC, USA).
  • SH-SY5Y (ATCC, USA) cells were 90% confluency in a 6 well plate (BD Falcon, USA), a transwell insert (BD Falcon, USA) was inserted into each well, and a human umbilical cord was inserted into the insert chamber.
  • stem cells (1X10 5 / 1mL) are not dispensed to serum is added to Minimal Essential Medium alpha 1X; in for 24 hours at (MEM ⁇ 1x Gibco-Invitrogen, USA) , 37 °C, 5% cO 2 environment, were the co-culture .
  • the collected cells were subjected to ultra-sonication using a retic buffer (30 mM Tris (pH 7.8), 5 mM MgCl 2, 5 mM KCl, 0.5 mM DTT, 2 mM ATP).
  • a retic buffer (30 mM Tris (pH 7.8), 5 mM MgCl 2, 5 mM KCl, 0.5 mM DTT, 2 mM ATP).
  • 96 ⁇ l black / clear plate 5 ⁇ g protein and chymotrypsin-like fluorescent substrate, 200 ⁇ M (final concentration: 100 ⁇ M), Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Enzo, Republic of Korea) clear plate) (BD Falcon, USA) and incubated for 4 hours at 37 °C.
  • the reaction was timed by adding ethanol. Chymotrypsin-like fluorescent substrate activation was measured using a fluorometer (Glomax, Promega, USA) and the results
  • ubiquitin conjugates Ub, 1: 1000; Santa Cruz, USA
  • beta actin (1: 5000; Santa Cruz, USA) antibodies
  • the secondary antibody (goat anti-mouse IgG-HRP; Ab frontier, USA) was then treated at room temperature for one hour, and the blots were developed using ECL (Advansta, USA) and the results are shown in FIG. 1B.
  • the chymotrypsin-like activity which is a major degradation activity of the proteasome
  • the amount of the ubiquitin conjugate protein was increased in co-culture.
  • the decrease in one neuron, and the fluorescence intensity was reduced in the co-cultured neurons compared to the non-co-cultured neurons.
  • the medium was removed after co-culture for the Raybio cytokine assay and concentrated using centricon (Millipore, USA). Concentrated media samples were analyzed using RayBio® Human Cytokine Antibody Arrays-Biotin-Label Based G Series (Raybiotech, USA) capable of 509 secretion protein analysis. Proteins with increased 10-fold secretion through WJ-MSC co-culture were analyzed by Equation 1 below, and the results are shown in FIG. 2A.
  • Quantitative real-time PCR was first performed RNA extraction using TRIzol (Life Technologies, USA) in cultured cells, and cDNA synthesis using SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA). The following primers were prepared and used to proceed with PCR;
  • GAPDH REV CCT TCT CCA TGG TGG TGA A (SEQ ID NO: 4).
  • PCR was performed using a Step ONE Plus system (AB, USA) and 2X Power SYBR Green Master Mix (AB, USA) and the conditions were as follows: 95 ° C. 10 minutes, 95 ° C. 15 seconds, 59 ° C. 30 seconds. (40 cycles).
  • Example 1.2 In order to analyze the effect of AgRP, the protein identified in Example 1.2, on ubiquitin proteasome activity in neurons, experiments were performed as follows.
  • the activity of the proteasome was confirmed by chymotrypsin-like activity in the same manner as in Example 1.1, the results are shown in Figure 3a.
  • the amount of ubiquitin conjugate protein was confirmed in the same manner as in Example 1.1, and the results are shown in FIGS. 3B and 3C.
  • mouse hippocampal-derived cells (HT22; Professor Paik, Kyunghee University) were treated with proteasome activity inhibitor MG-132 (Calbiochem, USA) at a concentration of 1 ⁇ M in serum-free DMEM (Biowest, USA) medium, AgRP was treated with each concentration (1, 10, 20, 50 ng / mL) and incubated for 24 hours, 37 °C, 5% CO 2 environment. Thereafter, the amount of ubiquitin conjugate protein was confirmed in the same manner as in Example 1.1. The results are shown in FIG. 4.
  • mice C57BL6 / J; 10-13 months; Jackson Laboratories, USA
  • 10-13 months of age Alzheimer's disease animal model 5XFAD Jackson Laboratories, USA
  • mice administered with PBS alone were used.
  • mice administered with PBS alone were used.
  • mice were euthanized by coronary perfusion and the hippocampus was removed.
  • the removed hippocampus was ground with a medicine bowl, and the protein was extracted in the same manner as in Example 1.1.
  • Proteasome activity was measured in the same manner as in Example 1.1, and the results are shown in Figure 5a.
  • the groups treated with human umbilical cord mesenchymal stem cells and AgRP increased SUC activity compared to the control group, and the amount of ubiquitin conjugate protein in the groups administered with both human umbilical cord mesenchymal stem cells and AgRP decreased compared to the control group. It was confirmed. In addition, it was observed that the SUC activity was lower and the amount of ubiquitin conjugate protein was higher in 6 months 5XFAD hippocampus than in 6 months normal rat hippocampus.
  • a method for controlling the activity of the ubiquitin proteasome in the brain can be screened using the method according to one embodiment, and the screened material thereby increases the activity of the ubiquitin proteasome in the brain. It can be usefully used in the treatment of degenerative brain diseases.

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Abstract

중간엽줄기세포 또는 그로부터 분비되는 단백질을 이용한 유비퀴틴 프로테아좀 조절제, 예를 들면, 퇴행성 뇌질환 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 스크리닝 방법은 중간엽줄기세포 또는 그로부터 분비되는 단백질을 이용하여 유비퀴틴 프로테아좀 시스템을 조절할 수 있는 단백질, 또는 물질을 스크리닝할 수 있는 효과가 있다.

Description

중간엽줄기세포 또는 그로부터 분비되는 단백질을 이용한 유비퀴틴 프로테아좀 조절제를 스크리닝하는 방법
중간엽줄기세포를 이용한 유비퀴틴 프로테아좀 조절제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질환은 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중에서도 뇌에서 발생하는 질환을 의미하며, 주요 증상과 침범되는 뇌부위를 고려해 구분할 수 있는데, 알츠하이머 질환이나 파킨슨 질환 등이 포함된다. 퇴행성 뇌질환은 노화에 따른 신경퇴화와 유전적 및 환경적 요인들로 인해 단백질이 응집돼 신경세포가 사멸해 야기되는 것으로 알려져 있지만, 아직 정확한 원인은 밝혀지지 않아 원인 규명을 위한 기초 연구가 활발히 진행되고 있는 상황이다.
한편, 미국의 어윈 로즈와 이스라엘의 아론 치카노베르, 아브람 헤르슈코 박사는 유비퀴틴(ubiquitin)이라는 분자가 붙어있는 단백질을 유비퀴틴 프로테아좀 시스템 (Ubiquitin-proteasome system; UPS)이 선택적으로 분해하는 과정을 밝혀내 2004년 노벨 화학상을 수상 하였다. 유비퀴틴 프로테아좀 시스템은 진핵 세포에서 불량 단백질 제거, 세포 분열, 손상된 DNA 수리와 같은 생체 과정에 관여한다. 퇴행성 뇌질환과 같은 질병에서 유비퀴틴 프로테아좀 시스템이 이상이 생기게 되면 독성 단백질이 생체 내 축적이 되는 현상을 일으키게 된다. 특히, 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머병에서, 아밀로이드 단백질이 유비퀴틴 프로테아좀 시스템에 활성을 억제하고, 알츠하이머병 동물 모델에서 뇌의 프로테아좀 활성이 감소된다는 것이 보고된바 있다(비특허 문헌 1 내지 6 참조).
이에 본 발명자들은, 뇌의 유비퀴틴 프로테아좀 활성을 조절하는 물질을 찾기 위해 노력한 결과, 중간엽줄기세포가 신경 세포의 프로테아좀 활성을 증가시킨다는 것을 확인하였고, 프로테아좀 활성 조절 단백질인 AgRP(Agouti related peptide)을 분비한다는 것을 동정함으로써, 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 중간엽줄기세포를 이용하여 유비퀴틴 프로테아좀 활성 조절제, 예를 들면, 유비퀴틴 프로테아좀 활성 증가제, 또는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 중간엽줄기세포를 이용하여 유비퀴틴 프로테아좀 활성 조절제, 예를 들면, 유비퀴틴 프로테아좀 작용제, 길항제, 또는 퇴행성 뇌질환 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "유비퀴틴 프로테아좀 조절제(ubiquitin proteasome regulating agents)"는 유비퀴틴 프로테아좀 시스템을 조절하는 물질을 의미할 수 있다. 예를 들면, 상기 조절은 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시키거나 감소시키는 물질을 포함할 수 있다. 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시키는 유비퀴틴 프로테아좀 작용제는 퇴행성 뇌질환 치료제일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "퇴행성 뇌질환(neurodegenerative disease)"은 노화가 진행됨에 따라 뇌조직 또는 뇌세포의 구조 또는 기능이 퇴화되어 발생하는 질병을 의미할 수 있다. 상기 퇴행성 뇌질환의 예로는 알츠하이머병(노인성 치매), 치매, 파킨슨병, 루게릭병, 픽병, 헌팅턴병 또는 타우병증을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "알츠하이머병"이란 노인성 치매와 호환적으로 사용되고, 노인성 플라크, 신경염증 엉킴(tangles), 및진행성 신경 손실로 특징되는 특정 퇴행성 뇌질환과 관련된 정신적인 퇴화를 수반하는 질병을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "파킨슨병"이란 종종 운동 기능 및 언어능력을 손상시키는 중추 신경계의 만성 및 진행성 퇴행성 질환을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "헌팅턴병"이란 헌팅턴 단백질을 암호화하는 유전자 내 3 염기 반복 팽창에 의해 야기되어, 무도증, 정신이상, 치매 등이 수반되는 신경퇴행성 질환을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "루게릭병"이란 운동신경세포만 선택적으로 사멸되는 질환으로 대뇌 피질의 상위운동신경세포와 뇌간 및 척수의 아래운동신경세포 모두가 점차적으로 파괴되는 질환을 의미할 수 있다.
본 명에서에서 용어 "픽병(pick's disease)"는 뇌의 신경세포의 진행성 파괴를 나타내는 질환을 의미할 수 있다.
본 발명의 용어 "타우병증"이란 타우 단백질(세포 내 마이크로튜불-관련 단백질과 밀접하게 관련된 패밀리)이 뇌조직에 비정상적으로 축적됨에 의하여 뇌신경이 손상되는 신경퇴행성 질환을 의미할 수 있다.
상기 방법은, (1) 중간엽줄기세포를 신경 세포와 접촉시키는 단계; (2) 상기 신경 세포의 유비퀴틴 프로테아좀 활성을 측정하는 단계로서, 상기 단계는 중간엽줄기세포로부터 분비 또는 발현되는 단백질을 확인하면서 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 측정하거나, 또는 후보 물질을 상기 단계 (1)에서 신경 세포에 함께 처리한 후 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 측정하는 것인 단계; 및 (3) 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 변화시킨 중간엽줄기세포로부터 분비 또는 발현되는 단백질 또는 무처리 대조군에 비해 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 변화시킨 후보 물질을 유비퀴틴 프로테아좀 조절제로서 선별하는 단계를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 조절제를 스크리닝하는 방법일 수 있다.
또한, 예를 들면, 상기 방법은, (1) 중간엽줄기세포를 인 비트로(in vitro) 상에서 신경 세포와 접촉시키거나, 또는 중간엽줄기세포를 인 비보(in vivo) 상에서 실험 동물에 투여하는 단계; (2) 상기 신경 세포 및 실험 동물의 뇌의 유비퀴틴 프로테아좀 활성을 측정하는 단계로서, 상기 단계는 중간엽줄기세포로부터 분비되는 단백질을 확인하면서 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 측정하거나, 또는 후보 물질을 상기 단계 (1)에서 함께 신경 세포 또는 실험 동물에 처리한 후 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 측정하는 것인 단계; 및 (3) 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 변화시킨 단백질 또는 무처리 대조군에 비해 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 변화시킨 후보 물질을 유비퀴틴 프로테아좀 조절제로서 선별하는 단계를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 조절제를 스크리닝 하는 방법일 수 있다.
또한, 다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 (1) AgRP(Agouti-related ppeptide) 또는 그의 활성 단편을 신경 세포와 접촉시키는 단계; (2) 상기 신경 세포의 유비퀴틴 프로테아좀 활성을 측정하는 단계로서, 상기 단계는 후보 물질을 상기 단계 (1)에서 신경 세포에 함께 처리한 후 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 측정하는 것인 단계; 및 (3) 무처리 대조군에 비해 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 변화시킨 후보 물질을 유비퀴틴 프로테아좀 활성 조절제로서 선별하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 구체예에 있어서, 상기 AgRP 또는 그의 활성 단편은 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시키는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cells:MSCs)는 자기재생능력(self-renewal)과 줄기세포능(stemness maintenance)을 유지하고 다양한 간엽 조직으로 분화할 수 있는 세포를 의미할 수 있고, 포유류, 예를 들면 인간을 포함한 동물의 중간엽줄기세포를 포함할 수 있다. 또한, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄 유래, 골수 유래, 태반 유래, 또는 지방 유래 중간엽줄기세포인 것일 수 있다. 상기 탯줄은 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미할 수 있으며, 일반적으로 와튼 젤리(Wharton's Jelly)로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직을 의미할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 상기 중간엽줄기세포는 제대 또는 제대혈 유래 중간엽줄기세포일 수 있다. 중간엽줄기세포의 분리는 통상의 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면, Pittenger 등(Science 284: 143, 1997)와 van 등(J. Clin. Invest., 58: 699, 1976)의 문헌들에 개시되어 있다. 상기 중간엽줄기세포는 AgRP(Agouti-related ppeptide) 또는 그의 활성 단편을 분비하거나, AgRP 또는 그의 활성 단편을 과발현, 또는 분비하도록 유전적으로 조작된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "AgRP(Agouti-related ppeptide)"는 AgRP/NPY 뉴런에 의해 뇌에서 생산되는 신경 펩티드를 의미할 수 있다. 상기 AgRP는 인간을 포함한 척추동물, 예를 들면, 포유류, 어류, 양서류, 조류, 또는 파충류 유래의 AgRP를 포함할 수 있다. 또한, 상기 AgRP는 AgRP의 전구체도 포함하는 의미일 수 있다(예를 들면, 인간의 경우, 132개의 아미노산 서열의 AgRP 유전자 산물(AgRP의 전구체)에서 N-말단으로부터 20개 아미노산 잔기인 신호 펩티드 도메인이 제거되어 112개의 아미노산 잔기로 구성된 AgRP가 생산된다). 또한 상기 AgRP 또는 그의 활성 단편은 상기 AgRP 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전적으로 조작된 숙주 세포로 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 용어 "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 세포를 나타낸다. 예를 들면, 상기 중간엽줄기세포 또는 숙주 세포는 AgRP 또는 그의 활성 단편의 발현 또는 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된 것, 예를 들면, AgRP 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 외인성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 활성 증가는 주어진 유전적으로 조작되지 않은 모세포(예, 야생형)가 갖지 않는 또는 갖는 내재적 단백질 또는 효소의 활성에 비해, 동일한 타입의 단백질 또는 효소의 활성이 보다 더 높은 활성을 갖는 것을 의미할 수 있다. 상기 외인성 유전자는, 상기 중간엽줄기세포 또는 숙주 세포에서 그 모세포에 비하여 언급된 단백질의 활성이 증가되기에 충분한 양으로 발현된 것일 수 있다. 상기 외인성 유전자는 발현 벡터를 통하여 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 선형 폴리뉴클레오티드 형태로 모세포 내로 도입된 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 세포 내에서 발현 벡터 (예, 플라스미드)로부터 발현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 외인성 유전자는 안정적인 발현을 위하여 세포 내의 유전물질 (예, 염색체)에 삽입되어 발현되는 것일 수 있다.
상기 단계 (1)은 중간엽줄기세포, AgRP 또는 그의 활성 단편을 신경 세포에 처리, 또는 접촉시키는 단계를 의미할 수 있다. 상기 처리 또는 접촉은 중간엽줄기세포를 신경 세포와 공배양하거나, 또는 중간엽줄기세포, AgRP 또는 그의 활성 단편을 실험 동물, 예를 들면 동물의 뇌, 예를 들면, 해마에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 처리 또는 접촉은 AgRP 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포와 신경 세포와 접촉시키거나, 예를 들면, 공배양하거나, 또는 상기 숙주 세포를 실험 동물, 예를 들면, 동물의 뇌, 예를 들면, 해마에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 공배양 및 투여는 통상의 당업자가 목적하는 효과, 예를 들면, 중간엽줄기세포 또는 AgRP 또는 그의 활성 단편이 신경 세포에 영향을 미칠 수 있도록 하는 방법 및 기간 동안 수행될 수 있다.
상기 단계 (2)에 있어서, 유비퀴틴 프로테아좀 활성의 측정은 유비퀴틴 프로테아좀 경로(ubiquitin-proteasome pathway:UPP)의 확인을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "유비퀴틴 프로테아좀 경로(ubiquitin-proteasome pathway:UPP)"는 세포 내에서 일어나는 단백질 분해 경로 중의 하나로서, 단백질이 유비퀴틴(Ubiquitin: Ub)에 의해 표지된 후 프로테아좀에 의해 세포질 또는 핵에서 분해되는 과정을 의미할 수 있다. 따라서, 상기 유비퀴틴 프로테아좀 활성은 UPP에 의해 분해되는 단백질, 예를 들면, 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양을 확인함으로써 측정될 수 있다. 또한, 다른 구체예에 있어서, 예를 들면, 형광 모이어티가 결합된 프로테아좀 기질을 신경 세포에 과발현 시키고, 형광 세기의 측정을 통해 프로테아좀의 활성을 측정할 수도 있고, 레이바이오 사이토킨 어세이(Raybio cytokine assay)를 사용하여 측정할 수도 있다.
상기 방법에 있어서, 중간엽줄기세포를 신경 세포에 처리 후에, 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 측정하는 단계는, 프로테아좀 활성조절 단백질의 동정을 위해 중간엽줄기세포로부터 분비되는 단백질을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 중간엽줄기세포로부터 분비되는 단백질의 확인은 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 측정하는 단계 전 또는 후에 수행될 수 있다.
또한 상기 방법에 있어서, 중간엽줄기세포로부터 분비되는 단백질 이외에, 추가적으로 프로테아좀 활성 조절의 후보 물질을 스크리닝할 수도 있다. 예를 들면, 상기 단계 (1)에서 후보 물질을 같이 처리하여, 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 측정하는 것일 수 있다. 상기 후보 물질은, 예를 들면, 피검 화합물 또는 피검 조성물은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있다.
이후에, 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시킨 단백질 또는 무처리 대조군에 비해 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 변화시킨 후보 물질을 유비퀴틴 프로테아좀 조절제로서 선별하는 단계가 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시킨 단백질, 예를 들면, 상기 형광 세기를 감소시킨 단백질, 또는 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양을 감소시킨 단백질은 대조군, 예를 들면, 신경 세포와 접촉시키지 않은 중간엽줄기세포에서 분비 또는 발현되는 단백질에 비해 더 많이 분비 또는 발현된 단백질일 수 있다.
상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시킨 단백질 또는 후보 물질은 유비퀴틴 프로테아좀 작용제이고, 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 감소시킨 단백질 또는 후보 물질은 유비퀴틴 프로테아좀 길항제인 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 동정된 단백질 또는 후보 물질이 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 조절하는지 더 확인하기 위해, 상기 중간엽줄기세포로부터 분비되는 단백질 및 후보 물질이 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 농도 의존적으로 조절하는지, 감소시키는지 또는 증가시키는지 여부, 예를 들면, 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양을 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 농도 의존적으로 증가시키는지 여부를 확인하는 단계는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 억제제, 예를 들면, MG-132를 함께 처리하여 확인하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 방법에 의하면, 중간엽줄기세포 또는 그로부터 분비되는 단백질을 이용하여 유비퀴틴 프로테아좀 시스템을 조절할 수 있는 단백질, 또는 물질을 스크리닝할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 인간 제대 중간엽줄기세포가 신경 세포의 프로테아좀을 활성을 증가시킨다는 것을 확인한 도면이다; 도 1a: 키모트립신 유사 형광기질 활성화 측정, 도 1b: 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양 측정.
도 2는 인간 제대 중간엽줄기세포가 AgRP 단백질을 분비하는 것을 확인한 도면이다; 도 2a: 레이바이오 사이토킨 어세이 결과, 도 2b: 정량적 실시간 PCR 결과.
도 3은 인간 제대 중간엽줄기세포가 분비하는 AgRP가 신경 세포의 프로테아좀 활성을 증가시키는 것을 확인한 도면이다; 도 3a: 키모트립신 유사 형광기질 활성화 측정, 도 3b: 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양 측정.
도 4는 인간 제대 중간엽줄기세포가 분비하는 AgRP 단백질이 동물 모델의 해마 유래 세포의 프로테아좀 활성을 증가시키는 것을 확인한 도면이다; 도 4a: Ub 컨쥬게이트의 웨스턴 블랏팅 측정, 도 4b: Ub conjugate의 상대적 발현 값.
도 5는 인간 제대 중간엽줄기세포가 분비하는 AgRP 단백질이 동물 모델에서 프로테아좀 활성을 증가시키는 것을 확인한 도면이다; 도 5a: 키모트립신 유사 형광기질 활성화 측정, 도 5b: 실험 프로토콜, 도 5c: 키모트립신 유사 형광기질 활성화 측정, 도 5d: 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양 측정.
이하 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예. 인간 중간엽줄기세포를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료 효능을 갖는 단백질의 스크리닝 및 그에 의해 동정된 단백질의 활성 분석
1. 인간 중간엽줄기세포를 이용한 퇴행성 뇌질환 치료 효능을 갖는 단백질 스크리닝
1.1. 인간 제대 중간엽줄기세포의 신경 세포에 대한 활성 확인
인간 제대 중간엽줄기세포(Wharton's Jelly-MSC: WJ-MSCs)가 신경 세포의 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시킨다는 것을 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
인간 제대 중간엽줄기세포는 본원에서 승인한 IRB (IRB# 2015-09-023-003)의 기준에 따라 삼성서울병원 산부인과와의 협업 연구를 통하여 탯줄을 확보한 후 기존에 보고된 프로토콜에 따라 중간엽줄기세포 분리 진행을 하였다(Choi, M, Lee, HS, Naidansaren, P, Kim, HK, O, E, Cha, JH, et al. (2013). Proangiogenic features of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal/stem cells and their ability to form functional vessels. Int J Biochem Cell Biol 45: 560-570). 구체적으로, 탯줄을 3-4 cm 길이 자른 다음, 조직을 잘게 자르고 콜라게나아제 용액(Gibco, USA)을 이용하여 세포외기질을 분해하기 위해 60-90 분 동안 처리 해준 다음, 0.25% 트립신 (Gibco, USA)을 추가하여 30분 동안, 37°C에서 분해를 더 유도하였다. 이후에, 소태아혈청(FBS; Biowest, USA)을 첨가하여, 1000g에서 10분 동안 원심분리를 이용하여 세포를 얻고, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco Modified Eagle Medium) (DMEM; Biowest, USA) 에 20% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco,USA)이 첨가된 배지를 이용하여 37 ℃, 5% CO2 환경에서 세포를 배양하였고, passage 5 에서 6 이된 WJ-MSC를 실험에 사용하였다.
신경 세포는 SH-SY5Y(ATCC, USA)를 사용하였다. 먼저, 6 웰 플레이트(BD Falcon, USA)에서 SH-SY5Y (ATCC, USA)세포가 90% confluency가 되었을 때, transwell insert (BD Falcon, USA)를 각 웰에 삽입하여, insert chamber에 인간 제대 중간엽줄기세포(1X105/1mL)를 분주하여 혈청이 첨가 되지 않은 Minimal Essential Medium alpha 1X (MEMα1x; Gibco-Invitrogen, USA)에서 24시간 동안, 37 ℃, 5% CO2 환경에서, 공동 배양을 하였다.
이후에, 인간 제대 중간엽줄기세포가 신경 세포의 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시키는지 확인하기 위해, 세포에서의 프로테아좀의 주요 분해 활성인 키모트립신 유사 활성, 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양, 및 형광 기질이 도입된 신경세포에서의 형광 세기를 측정하였다. 대조군으로는 중간엽줄기세포와 공동배양하지 않은 신경세포를 사용하였다.
구체적으로, 수집된 세포를 레틱 버퍼(retic buffer) (30 mM Tris (pH 7.8), 5mM MgCl2, 5mM KCl, 0.5mM DTT, 2 mM ATP)를 이용하여 초음파 처리(ultra-sonication)를 한 이후에, 5 μg의 단백질과 키모트립신 유사 형광기질인 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Enzo, Republic of Korea)을 200 μM (최종 농도: 100 μM)으로 96 웰 블랙/클리어 플레이트(black/clear plate) (BD Falcon, USA)에 넣고, 37 ℃에서 4시간까지 배양하였다. 반응은 에탄올을 첨가하여 정시시켰다. 키모트립신 유사 형광기질 활성화는 플루오로미터(fluorometer) (Glomax, Promega, USA)를 사용하여 측정을 수행하였고, 그 결과를 도 1a에 나타내었다.
프로테아좀 시스템으로 분해되는 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양의 측정은 웨스턴 블랏팅을 통해 확인하였다. 웨스턴 블랏팅은 먼저, 레틱 버퍼(retic buffer)로 초음파 처리한 단백질을 우레아 버퍼(urea buffer) 와 1:1로 혼합하였다. 이후에, 원심분리를 하여, 상층액을 모아서 Bradford assay (Bio-rad, USA)를 이용하여 단백질 정량을 하였다. 각 샘플에서 10 μg에 단백질을 겔에 로딩한 후, SDS를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 트랜스퍼시킨 이후에, 5% 탈지유(BD Difco, USA)에 1% TBST (Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20) 이 첨가된 용액에 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 이후에, 유비퀴틴 컨쥬게이트 (Ub, 1:1000; Santa Cruz, USA) 와 베타 액틴(1:5000; Santa Cruz, USA) 항체를 처리하였고, 4 ℃°C에서 하룻밤동안 배양하였다. 이후, 이차 항체(goat anti-mouse IgG-HRP; Ab frontier, USA)를 한 시간 동안 상온에서 처리하고, 블랏들은 ECL (Advansta, USA) 를 이용하여 발달시켰고, 그 결과를 도 1b에 나타내었다.
형광기질이 도입된 신경세포에서의 형광 세기의 측정은 GFP가 붙어 있는 프로테아좀의 기질은 GFP-degron을 신경 세포에 리포펙타민 2000 (Life Technologies, USA) 형질전환 방법으로 과발현하고, 공초좀 현미경 (LSM 700; Carl Zeiss AG, Jena, Germany)으로 관찰한 후 형광 세기를 Image-J (NIH, USA) 분석 프로그램을 이용하여, 측정하였고 그 결과를 도 1c에 나타내었다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 공동 배양을 한 신경 세포에서 프로테아좀의 주요 분해 활성인 키모트립신 유사 활성이 공동 배양을 하지 않은 신경 세포 보다 높고, 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양이 공동 배양을 한 신경 세포에서 감소하였으며, 공동 배양을 한 신경 세포에서 공동 배양을 하지 않은 신경 세포 대비 형광 세기가 줄어드는 것을 확인하였다. 상기의 결과로, 인간 제대 중간엽줄기세포를 신경 세포와 공동 배양시, 신경 세포의 프로테아좀 활성이 높아지는 것을 알 수 있다.
1.2. 인간 제대 중간엽줄기세포로부터 분비되는 단백질의 동정
인간 제대 중간엽줄기세포를 신경 세포와 공동 배양하였을 시, 분비되는 단백질을 동정하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
구체적으로 인간 제대 중간엽줄기세포로부터 분비되는 단백질을 확인하기 위해 레이바이오 사이토킨 어세이(Raybio cytokine assay) 및 정량적 실시간 PCR(real time quantitative reverse transcription PCR)을 수행하였다.
레이바이오 사이토킨 어세이를 하기 위해 공동배양을 한 후 배지를 제거하고, 센트리콘(centricon) (Millipore, USA)을 사용하여 농축하였다. 농축한 배지 샘플들은 509 분비단백질 분석이 가능한 RayBio® Human Cytokine Antibody Arrays - Biotin-Label Based G Series (Raybiotech, USA)를 이용하여 분석을 수행하였다. WJ-MSC 공동배양을 통해 10배 분비가 증가된 단백질들을 하기 수학식 1로 분석을 하였고, 그 결과를 도 2a에 나타내었다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2017008531-appb-I000001
정량적 실시간 PCR은 먼저 배양한 세포에서 TRIzol (Life Technologies, USA) 를 이용하여 RNA 추출을 하였고, SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA)를 사용하여 cDNA 합성을 하였다. PCR를 진행 하기 위해 다음과 같은 프라이머들을 제작 및 사용을 하였다;
AGRP Forward (FOR): AGT CAC GTG TGG CCC TTC AT(서열번호 1)
AGRP Reverse (REV): TCC GGG ATT CTT GCC TAG AG(서열번호 2)
GAPDH FOR: CGA GAT CCC TCC AAA ATC AA(서열번호 3)
GAPDH REV: CCT TCT CCA TGG TGG TGA A(서열번호 4).
Step ONE Plus system (AB, USA) 과 2X Power SYBR Green Master Mix (AB, USA)를 사용하여 PCR을 수행하였고, 그 조건은 다음과 같았다: 95 ℃ 10 분, 95 ℃ 15초, 59℃ 30초(40 cycles). AGRP 발현 분석은 Livak 과 Schmittgen의 2-△△CT 방법(Leitch, AE, Lucas, CD, Marwick, JA, Duffin, R, Haslett, C, and Rossi, AG (2012). Cyclin-dependent kinases 7 and 9 specifically regulate neutrophil transcription and their inhibition drives apoptosis to promote resolution of inflammation. Cell Death Differ 19: 1950-1961.)으로 수행하였고, 그 결과를 도 2b에 나타내었다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 인간 제대 중간엽줄기세포를 신경 세포와 공동 배양을 하였을 때, AgRP라는 단백질을 분비한다는 것을 확인하였다.
2. 동정된 단백질의 활성 분석
2.1. 동정된 단백질이 신경 세포에서 유비퀴틴 프로테아좀 활성에 미치는 영향 분석
상기 실시예 1.2.에서 동정된 단백질인 AgRP가 신경 세포에서 유비퀴틴 프로테아좀 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, 신경 세포 SH-SY5Y (ATCC, USA)세포가 90% confluency가 되었을 때, 혈청이 첨가되지 않은 Minimal Essential Medium alpha 1X (MEMα1x; Gibco-Invitrogen, USA)에 1, 10, 20, 50ng/mL AgRP (R&D, USA) 를 처리하고, 24시간 동안, 37 ℃, 5% CO2 환경에서 배양을 하였다. 대조군으로는 1, 10, 20, 50ng/mL의 PBS 중 0.1% BSA를 사용하였다.
프로테아좀의 활성은 상기 실시예 1.1과 동일한 방법으로 키모트립신 유사 활성을 확인하였고, 그 결과를 도 3a에 나타내었다. 또한, 상기 실시예 1.1과 동일한 방법으로 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양을 확인하였고, 그 결과를 도 3b 및 3c에 나타내었다.
신경 세포 SH-SY5Y (ATCC, USA)세포가 90% confluency가 되었을 때, serum이 첨가 되지 않은 Minimal Essential Medium alpha 1X (MEMα1x; Gibco-Invitrogen, USA)에 농도별 (0-50 ng/mL)로 AgRP를 처리하고, 24시간 동안, 37 ℃, 5% CO2 환경에서 배양을 하였다. 대조군으로는 PBS 중 0.1% 소태아 혈청(BSA)을 동일한 농도로 SH-SY5Y에 처리 하였다.
추가적으로, 무혈청 DMEM (Biowest, USA)배지에서 생쥐 해마 유래 세포(HT22; 백남인 교수님, 경희대학교)에 프로테아좀 활성 저해제인 MG-132(Calbiochem, USA)를 1 μM의 농도로 처리하였고, AgRP를 농도 별로 (1,10,20,50 ng/mL) 같이 처리하고 24시간 동안, 37 ℃, 5% CO2 환경에서 배양을 하였다. 이후에, 상기 실시예 1.1.과 동일한 방법으로 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양을 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, AgRP를 처리한 신경세포가 대조군인 정상 세포에 비해 키모트립신 유사 활성(Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC:SUC)이 증가하였고, 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 발현 양이 AgRP 농도 의존적으로 감소된 것을 확인하였다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 프로테아좀 저해제인 MG-132를 AgRP와 같이 처리하여 주었을 때, AgRP가 농도 의존적으로 유비퀴킨 컨쥬게이트 단백질의 발현 양이 감소시키는 것을 확인하였다.
상기의 결과로, AgRP가 신경 세포에서 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
2.2. 동정된 단백질이 동물 모델에서 프로테아좀 활성에 미치는 영향 분석
AgRP가 동물 모델에서 프로테아좀 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해 하기의 실험을 수행하였다. 동물 모델로서는 정상 마우스(C57BL6/J; 10-13개월; Jackson Laboratories, USA) 및 10-13 개월령의 알츠하이머병 동물 모델 5XFAD (Jackson Laboratories, USA)를 사용하였다.
먼저, 정상 마우스의 해마에 2 X 105 세포수(2 X 105/3μl)의 인간 제대 중간엽줄기세포를, 그리고 AgRP (1000ng/kg)을 stereotaxic기계 (Harvard apparatus, USA) 를 이용하여, bregma 좌표를 잡은 후 0.5 μl/min 속도로 해마에 투여 하였다 (A/P -2.3mm, M/L -1.3mm, and D/V -2.0 mm). 대조군으로는 PBS만 투여한 마우스를 사용하였다. 투여 1주일 후에, 정상 마우스를 관동맥 관류로 안락사 시킨 후, 해마를 제거하였다. 제거된 해마를 약사발로 갈은 다음, 상기 실시예 1.1과 동일한 방법으로 단백질을 추출하였다. 프로테아좀 활성은 상기 실시예 1.1.과 동일한 방법으로 측정하였고, 그 결과를 도 5a에 나타내었다.
그 결과, 인간 제대 중간엽줄기세포 와 AgRP를 투여한 군들이 PBS만 투여를 한 군에 비해 프로테아좀 활성이 증가한 것을 확인하였다.
이러한 정상 마우스에서의 실험 결과를 바탕으로 알츠하이머병 동물 모델인 5XFAD에서의 실험을 진행하였다. 실험은 도 5b에 나타낸 바와 같은 좌표를 이용하여 대조군으로 인산완충식염수를 3μl의 용량을 투여하였고, 실험군으로서는 인간 제대 중간엽줄기세포 및/또는 AgRP를 각각 2X105/3μl, 1000ng/kg의 용량으로 상기와 동일한 방법으로 동물 모델의 해마에 투여하였다. 투여 1주일 후에, 상기 정상 마우스에서의 실험과 동일한 방법으로 단백질을 추출하였다. 프로테아좀 활성은 상기 실시예 1.1.과 동일한 방법으로 키모트립신 유사 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 5c에 나타내었다.
기존에 보고된 실험들과 동일하게 같은 개월 수 정상 쥐에 비해, 알츠하이머병 동물 마우스 모델 (5XFAD)에서 프로테아좀 활성이 줄어든 것을 확인하고자 예비 실험을 진행 하였다. 6개월 된 정상과 5XFAD 쥐를 안락사 시킨후, 해마를 적출하여 상기와 동일한 방법으로 단백질을 추출하여 프로테아좀 활성은 상기 실시예 1.1.과 동일한 방법으로 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양을 측정하였고, 그 결과를 도 5d에 나타내었다.
그 결과, 인간 제대 중간엽줄기세포 와 AgRP를 투여한 군들은 대조군에 비하여 SUC 활성이 증가하였고, 인간 제대 중간엽줄기세포 및 AgRP를 모두 투여해준 군들의 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양이 대조군에 비해 감소한 것을 확인하였다. 또한 6개월 정상쥐 해마의 비해, 6개월 5XFAD 해마에서 SUC 활성이 낮고 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양이 높다는 것을 관찰하였다.
상기의 결과로, 일 구체예에 따른 방법을 사용하여 뇌의 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 조절하는 물질을 스크리닝 할 수 있으며, 또한 이에 의해 스크리닝된 물질은 뇌의 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시켜 퇴행성 뇌질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 할 수 있다.

Claims (14)

  1. (1) 중간엽줄기세포를 신경 세포와 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 신경 세포의 유비퀴틴 프로테아좀 활성을 측정하는 단계로서, 상기 단계는 중간엽줄기세포로부터 분비 또는 발현되는 단백질을 확인하면서 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 측정하거나, 또는 후보 물질을 상기 단계 (1)에서 신경 세포에 함께 처리한 후 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 측정하는 것인 단계; 및
    (3) 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 변화시킨 중간엽줄기세포로부터 분비 또는 발현되는 단백질, 또는 무처리 대조군에 비해 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 변화시킨 후보 물질을 유비퀴틴 프로테아좀 활성 조절제로서 선별하는 단계를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 조절제를 스크리닝 하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시킨 단백질 또는 후보 물질은 유비퀴틴 프로테아좀 작용제이고, 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 감소시킨 단백질 또는 후보 물질은 유비퀴틴 프로테아좀 길항제인 것인 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 유비퀴틴 프로테아좀 작용제는 퇴행성 뇌질환 치료제인 것인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머병, 치매, 파킨슨병, 루게릭병, 픽병, 헌팅턴병 및 타우병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 중간엽줄기세포로부터 분비 또는 발현되는 단백질 및 후보 물질이 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 농도 의존적으로 증가 또는 감소시키는지 여부를 확인하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 농도 의존적으로 증가시키는지 여부를 확인하는 단계는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 억제제를 함께 처리하여 확인하는 것인 방법.
  7. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성은 유비퀴틴 컨쥬게이트 단백질의 양을 확인하는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 AgRP(Agouti-related ppeptide) 또는 그의 활성 단편을 분비하거나, AgRP 또는 그의 활성 단편을 분비하도록 유전적으로 조작된 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 제대 유래, 제대혈 유래, 골수 유래, 태반 유래, 또는 지방 유래 중간엽줄기세포인 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 후보 물질은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 및 천연물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 인 것인 방법.
  11. (1) AgRP(Agouti-related ppeptide) 또는 그의 활성 단편을 신경 세포와 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 신경 세포의 유비퀴틴 프로테아좀 활성을 측정하는 단계로서, 상기 단계는 후보 물질을 상기 단계 (1)에서 신경 세포에 함께 처리한 후 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 측정하는 것인 단계; 및
    (3) 무처리 대조군에 비해 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 변화시킨 후보 물질을 유비퀴틴 프로테아좀 활성 조절제로서 선별하는 단계를 포함하는 유비퀴틴 프로테아좀 활성 조절제를 스크리닝 하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 증가시킨 단백질 또는 후보 물질은 유비퀴틴 프로테아좀 작용제이고, 유비퀴틴 프로테아좀의 활성을 감소시킨 단백질 또는 후보 물질은 유비퀴틴 프로테아좀 길항제인 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 유비퀴틴 프로테아좀 작용제는 퇴행성 뇌질환 치료제인 것인 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 AgRP 또는 그의 활성 단편과 신경 세포의 접촉은 AgRP 또는 그의 활성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포와 신경 세포를 접촉시키는 것인 방법.
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