WO2018030735A1 - Tctp 단백질을 포함하는 난모세포 노화 방지 또는 수정능력 개선용 조성물 - Google Patents

Tctp 단백질을 포함하는 난모세포 노화 방지 또는 수정능력 개선용 조성물 Download PDF

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protein
oocytes
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infertility
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오정수
전혁준
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Sungkyunkwan University
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Sungkyunkwan University
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0609—Oocytes, oogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving the anti-aging or fertility of oocytes, and more particularly to a composition for improving the quality of eggs, including TCTP (Translationally controlled tumour protein) protein as an active ingredient.
  • TCTP Translationally controlled tumour protein
  • the mammalian egg After ovulation, the mammalian egg stays in the middle of the second meiosis until fertilization. If fertilization does not occur for a long time, the egg continues to undergo time-dependent qualitative aging during what is known as postovulatory aging. During the postovulatory aging period, the egg shows morphological cellular and molecular changes, including spontaneous activation, partial cortical granular extracellular efflux, zona pelvic hardening, mitochondrial dysfunction, spindle abnormality and loss of chromosomal integrity. This malformation can inhibit embryonic development after fertilization, and also severely damage the quality of the egg and eventually lead to cell death.
  • oxidative stress is considered to be one of the important factors involved in impairment of egg quality. Indeed, it has been found that ROS levels increase with egg age and cell death due to oxidative stress during egg in vitro culture.
  • the poor ovarian responder is often referred to as a group of hyperovulation-induced hyporesponders, where ovarian responds to ovarian ovulation through ovulation inducers, especially for in vitro procedures.
  • This term is used to express the degree of response of the ovary to the drug.
  • ovarian respond when the ovarian responds by the ovulation inducer (ovarian respond) is poor (poor), it is expressed as ovarian deterioration, and it is often said that ovarian function is reduced and ovulation induction is not good.
  • COS controlled ovarian stimulation
  • the translationally controlled tumour protein (TCTP) protein is known to play an important role in cell survival and growth, and recent research has shown that TCTP utilizes amino acid fragment information to bind to ATM and enhance the enzyme function of ATM. Furthermore, TCTP and ATM have been shown to play an important role in repairing DNA damaged by radiation. However, the effect of the TCTP on the egg quality has not been reported yet (see Korean Patent Publication No. 10-0630657).
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems in the prior art, the present inventors have diligently tried to find a substance having an anti-aging effect of oocytes, TCTP (Translationally controlled tumour protein) protein of the present invention The present invention was completed by confirming that there was an effect of protecting the egg from postovulatory aging after ovulation.
  • TCTP Translationally controlled tumour protein
  • an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of infertility or infertility comprising a TCTP (Translationally controlled tumour protein) protein as an active ingredient.
  • TCTP Translationally controlled tumour protein
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of infertility or infertility comprising a TCTP (Translationally controlled tumour protein) protein as an active ingredient.
  • TCTP Translationally controlled tumour protein
  • the TCTP protein may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the composition may maintain the quality of the egg through the reduction of spindle and chromosome abnormalities of oocytes.
  • the composition may inhibit the generation of reactive oxygen species (ROS) in oocytes.
  • ROS reactive oxygen species
  • the composition may reduce the abnormal placement of mitochondira of oocytes.
  • the present invention also provides a method of treating or preventing infertility or infertility, comprising administering to a subject a composition comprising a translationally controlled tumour protein (TCTP) protein as an active ingredient.
  • TCTP translationally controlled tumour protein
  • the present invention also provides a therapeutic or prophylactic use of infertility or infertility of a composition comprising a TCTP (Translationally controlled tumour protein) protein as an active ingredient.
  • TCTP Translationally controlled tumour protein
  • the present invention relates to a composition for improving anti-aging or fertility of oocytes comprising a translationally controlled tumour protein (TCTP) protein as an active ingredient, wherein the protein prevents infertility (infertility) through improving the quality of eggs.
  • TCTP translationally controlled tumour protein
  • the protein prevents infertility (infertility) through improving the quality of eggs.
  • it can be usefully used for the treatment, it is expected to be used as a culture medium additive used in in vitro fertilization.
  • 1 is a diagram showing the effect of aging (oocyte quality) of the egg (aging).
  • Figure 2a is a diagram confirming that the amount of TCTP changes as the egg ages.
  • Figure 2b is a diagram confirming the change in the spindle and chromosome (spindle and chromosome) of oocytes, the change in the amount of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial arrangement when reducing TCTP in the egg.
  • spindle and chromosome spindle and chromosome
  • FIG. 3 is a diagram showing the effect of maintaining the oocyte quality (oocyte quality) of TCTP treatment.
  • FIG. 5 is a view schematically showing the effect of TCTP (Translationally controlled tumour protein) oocytes anti-aging / fertility improvement effect.
  • TCTP Translationally controlled tumour protein
  • the translationally controlled tumour protein (TCTP) protein overexpression can reduce aging-related abnormalities of the ovum, resulting in ROS accumulation, mitochondrial defects and prevention of treatment of the protein.
  • Convective / chromosomal abnormalities (abnormalities) and the like have been specifically identified, based on which the present invention has been completed.
  • the present invention is characterized by providing a composition for improving anti-aging or fertility of oocytes comprising a translationally controlled tumour protein (TCTP) protein, and the amino acid sequence of the TCTP protein is shown in SEQ ID NO: 1. .
  • TCTP translationally controlled tumour protein
  • Oocytes aging refers to a condition in which the quality of an egg is weakened due to spontaneous activation of oocytes, zona pellucida hardening, mitochondrial dysfunction, spindle abnormality and loss of chromosomal integrity.
  • postovulatory aging refers to a process of ovulation after ovulation, but not until cell division in the middle of the second meiosis and until cell death when the stopped egg is not fertilized.
  • oocyte maturation represents the maturation process of ovarian cells in the ovary, which once the maturation is stopped in the state of the first maturation electricity having a huge nucleus (ovary cell)
  • the oocytes become a magnetic pronucleus, and the fusion of the male pronucleus with the fertilization process is possible.
  • Oocytes are said to be aging because the cell cycle occurs, such as chromosome separation, rather than dying. Do not.
  • TCTP translationally controlled tumour protein
  • TCTP Translationally controlled tumour protein
  • TCTP Translationally controlled tumour protein
  • the pharmaceutical composition when used in the form of a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition comprises a composition containing a pharmaceutically effective amount of TCTP (Translationally controlled tumour protein) protein as an active ingredient It may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • TCTP Translationally controlled tumour protein
  • the pharmaceutically effective amount herein refers to an amount sufficient to prevent or treat the symptoms of diseases caused by aging oocytes.
  • the composition according to the present invention when used in the form of a composition for the medium, the composition may be added to the basal medium used for culture of a normal mammalian fertilized egg.
  • the "basic medium” is different depending on the species of mammal, but includes any one or more selected from the group consisting of inorganic salts, carbon sources, amino acids, bovine serum albumin and cofactors, and includes all common media known to those skilled in the art. can do.
  • the inorganic salts may be used NaCl, KCl, NaHCO 3 and the like, as the carbon source can be used, such as glucose, sodium, pyruvate and calcium lactate salts, glutamine as an amino acid Including essential amino acids and non-essential amino acids, and other trace elements and buffers can be used as cofactors.
  • the basal medium may further include antibiotics
  • the basal medium may be a commercially available medium known for mammalian cell culture, for example CR1-aa (Rosenkrans, CF Jr. , et al., Biol. Reprod., 49 (3); 459-462, 1993), TCM (tissue culture medium of medium199, Gibro, USA; Yue, C., et al., Development, 121: 2645-2654 , 1995), CZB (Chatot-Ziomek-Bavister medium; Chatot, CL, et al., J. Reprod. Fert., 86: 679-688, 1989) and the like, and such basal media may also be used by those skilled in the art. May be appropriately selected.
  • the mammalian fertilized egg to which the media composition of the present invention can be applied corresponds to any fertilized egg that can be cultured in vitro, and the fertilized egg may be targeted to both in vitro fertilized eggs and cloned eggs.
  • the in vitro fertilized eggs prepared by modifying the initial maturated eggs can be targeted.
  • in vitro fertilization refers to an egg and sperm taken in vitro fertilization
  • replicate fertilization refers to a somatic donor nucleus is injected into the nucleus pulposus egg removed genetic material and fused by physical or chemical methods.
  • the present invention also provides a method of treating infertility (infertility) comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • infertility infertility
  • subject means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, a mammal, such as a primate, mouse, dog, cat, horse and cow, which is human or non-human. .
  • the dosage form such as dosage and route of administration may be appropriately selected by those skilled in the art according to the age, condition, body weight, absorbency of the active ingredient in the body, inactivation rate and excretion rate, disease type, and the concomitant drug. .
  • mice All procedures regarding the care and use of mice were conducted according to the guidelines and approved by the Animal Care and Use Committee of Sungkyunkwan University.
  • mice 4-6 week old female CD-1 mice were injected intraperitoneally with gonadotropin (GTH) serum (PMSG, 10 IU; Sigma-Aldrich) of pregnant mare and ovaries were isolated 46-50 hours later.
  • GTH gonadotropin
  • human chorionic gonadotropin serum hCG, 10 IU; Sigma-Aldrich
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • TCTP knockdown MII oocytes and TCTP overexpressing oocytes were incubated for 12 and 24 hours after injection, respectively. After washing, oocytes were incubated in non-IBMX M16 medium (37 ° C., 5% CO 2 ). All reagents and media were purchased from Sigma-Aldrich unless otherwise specified.
  • mice were injected with gonadotropin (GTH) serum (PMSG, 5 IU; Sigma-Aldrich) of pregnant mare, and 48 hours later, human chorionic gonadotropin serum (hCG, 5 IU; Sigma-Aldrich).
  • GTH gonadotropin
  • hCG human chorionic gonadotropin serum
  • COCs Cumulus oocyte complexes
  • Cumulus cells were dispersed with 0.1% bovine testicular hyaluronidase (Sigma-Aldrich) in M2 medium (Sigma-Aldrich).
  • TCTP-mCherry-cRNA was microinjected with homogeneous ooplasm into the cytoplasm of intact fresh oocytes and covered with sterile mineral oil. It was kept in medium (37 ° C., 5% CO 2 ) for 12 hours. At this time, control oocytes were microinjected with mCherry-cRNA.
  • dsRNA or cRNA was injected into the cytoplasm of the egg using a Leica inverted microscope (DMIRB) and a FemtoJet microinjector (microinjector, Eppendorf, Germany) equipped with a micromanipulator (Narishige, Japan). After injection, oocytes were incubated for 24 hours in M16 medium supplemented with IMBX. Thereafter, transfer to fresh medium and incubated under mineral oil (37 ° C., 5% CO 2 ).
  • Oocytes were incubated for 1 hour in M16 medium with 20 ⁇ M of dihydrodamine 123 (DHR-123, ThermoFisher scientific, USA) and DCFHFDA (Sigma, USA) and then washed with PBS / PVP. Oocytes were visualized with a 530-550 nm filter, and fluorescence signals were obtained using a Nikon Eclipse Ti inverted microscope with CCD cooled camera (DS-Qi1Mc, Nikon, Japan) and quantified using Image J software.
  • DHR-123 dihydrodamine 123
  • DCFHFDA DCFHFDA
  • Oocytes were incubated for 30 minutes in CytoPainter mitochondrial staining buffer (abcam, USA) and images were taken with confocal laser scanning microscope (LSM 700, Zeiss, Germany). Signals in MII oocytes were analyzed by Image J (https://imagej.nih.gov/ij/).
  • Annexin-V staining kit (BD Biosciences, USA) was used. Oocytes were stained in the dark with 100 ml of binding buffer to which 5 ⁇ l of Annexin-V-FITC was added according to the manufacturer's instructions. Fluorescence signals were measured using a fluorescence microscope with 450-490 nm excitation and 520 nm emission filters.
  • Primary antibodies include anti-TCTP (Abcam; 1: 500), anti-pTCTP (Cell Signaling Technology; 1: 500), anti-Plk1 (Santa Cruz; 1: 500), anti-CHFR (Abcam; 1: 500) and ⁇ -actin (Cell Signaling; 1: 2500) was used, and HRP-labeled mice and rabbit antibodies (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) were used as secondary antibodies.
  • oocytes Certain stages of oocytes were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 minutes, permeabilized with phosphate buffered saline (PBS) with 0.1% Triton X-100 for 15 minutes and then blocked with PBS with 3% bovine serum albumin. . The oocytes were then incubated with primary antibodies and incubated with Alexa Fluor-binding 488 and 594 secondary antibodies (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). DAPI was used for DNA control. Unless otherwise noted, at least 20 oocytes were examined in each group. The antibodies used in this experiment are as follows.
  • Antibodies Incorporated 1:50.
  • ICSI Intracytoplasmic sperm injection
  • sperm were collected from the tail of the epididymidis (cauda epididymidis) of mature B6D2F1 male mice and incubated for 30 minutes in M2 medium (37 ° C., 5% CO 2 ) for each experiment. 1 ⁇ l of the suspension was placed in droplets of 10% polyvinyl pyrrolidone (PVP) -HEPES-buffered HTF solution (Irvine Scientic, Santa Ana, CA) in a micromanipulation chamber. ICSI was performed as described below (Kimura and Yanagimachi, 1995).
  • PVP polyvinyl pyrrolidone
  • HTF solution Irvine Scientic, Santa Ana, CA
  • Sperm heads were separated from the tail using several piezo pulses in the neck area and the heads were injected into ovulated eggs from the B6D2F1 female mice of Example 1-1. After recovering for 10 minutes at room temperature, the eggs were incubated in KSOM medium. In this case, eggs were used only when they had general surface characteristics and were not spontaneously activated. After 6-8 hours of incubation, the rate of PN formation was assessed, and the development rate of eggs reached the 2-cell Cleavage stage / blastocyste stage 22-24 and 96-98 hours after sperm injection, respectively. The survival rate was assessed based on the ratio of sperm surviving to sperm injected from egg.
  • TCTP Translationally controlled tumour protein
  • TCTP translationally controlled tumour protein
  • TCTP Translationally controlled tumour protein
  • ICSI intracytoplasmic sperm injection
  • the present invention relates to a composition for the treatment or prevention of infertility or infertility comprising a TCTP (Translationally controlled tumour protein) protein as an active ingredient, the protein relates to the prevention or treatment of infertility (fertility) through improving the quality of the egg It may be usefully used in the field, and may also be used as a culture solution additive used for in vitro fertilization.
  • TCTP Translationally controlled tumour protein

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Abstract

본 발명은 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 난모세포 (oocytes)의 노화 방지 또는 수정능력 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 단백질은 난자의 질 개선을 통하여 불임 (난임)의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있으며, 체외 수정 시 사용되는 배양액 첨가물로도 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

TCTP 단백질을 포함하는 난모세포 노화 방지 또는 수정능력 개선용 조성물
본 발명은 난모세포 (oocytes)의 노화 방지 또는 수정능력 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 난자의 질 개선용 조성물에 관한 것이다.
배란 후, 포유류의 난자는 수정될 때까지 제 2 감수분열 (MII)의 중기에 머무르게 된다. 만약 수정이 장시간 발생하지 않는 경우, 일명 배란 후의 노화 (postovulatory aging) 시기 동안 난자는 계속해서 시간-의존적 질적 노화를 겪는다. 배란 후의 노화 (postovulatory aging) 시기 동안 난자는 자발적 활성화, 부분 피질 과립 세포 외 유출, 투명대 경화, 미토콘드리아 기능 장애, 스핀들 이상 및 염색체 무결성의 손실을 포함하는, 형태학적 세포 및 분자의 변화를 보여준다. 이 기형 현상은 수정 이후의 배아 발달을 저해할 수 있으며, 또한, 난자의 품질에 심각한 손상을 주고, 결국 세포 사멸을 이끌게 된다.
비록, 난자의 배란 후의 노화 (postovulatory aging)에는 다양한 요인에 따른 영향이 있지만, 산화성 스트레스가 난자 품질의 손상에 관여하는 중요한 요소 중 하나로 간주되고 있다. 실제로, 난자의 체외 배양 기간 동안 난자 연령에 따라 ROS 수준이 증가하고, 산화적 스트레스에 의한 세포 사멸이 증가하는 것이 밝혀졌다.
더불어, 난소기능저하 (poor ovarian responder, POR)는 흔히 과배란 유도 저반응군이라고 부르기도 하는데, 이때 난소의 반응 (ovarian respond)은 특히 시험관시술을 목적으로 배란 유도제를 통해 난소의 배란을 유도할 경우, 약물에 대한 난소의 반응 정도를 표현하는 용어로 쓰인다. 즉, 배란 유도제에 의한 난소 반응 (ovarian respond)이 잘되지 않는 (poor) 경우에 난소기능저하라고 표현하며, 이를 흔히 난소기능이 저하되어 배란 유도가 잘되지 않는다고 말하고 있다.
시험관 시술을 위해서는 체내의 FSH의 농도를 높여 과배란 유도 (controled ovarian stimulation, COS)를 통한 여러 개의 난자를 채취하는 과정이 필요한데. 이때, 동일한 용량에서도 사람에 따라 COS에 대한 난소 반응이 제각각일 뿐만 아니라 반응 정도를 예측하기도 힘들다. 즉, 어떤 사람에서는 COS자극에 과도하게 반응해서 난소과잉증후군이 나타나는 반면, 어떤 사람은 고용량의 자극에도 불구하고 난소반응이 현저하게 떨어지는 난소기능저하가 될 수 있다.
현재 시험관 시술에 있어서 쟁점은 질 좋은 난자를 여럿 확보하는 것이고, 이에, 난자의 품질을 유지하기 위한 방법을 개발하는 것이 요구되고 있다.
TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질은 세포 생존과 성장에 중요한 역할을 하는 단백질로 알려져 있으며, 최근 연구에서는 TCTP가 아미노산 조각 정보를 활용하여 ATM과 결합하고, ATM의 효소 기능을 높여준다는 사실이 밝혀졌고, 나아가 TCTP 및 ATM이 방사선에 의해 손상된 DNA를 복구하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 하지만, 이러한 TCTP가 난자의 질에 미치는 영향은 아직 보고된 바가 없다(한국등록특허공보 10-0630657 참조).
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 난모세포 (oocytes)의 노화 방지 효과를 갖는 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질이 배란 후의 노화 (postovulatory aging)로부터 난자를 보호하는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 불임 또는 난임 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 불임 또는 난임 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 TCTP 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 난모세포의 방추체 (spindle) 및 염색체 (chromosome) 이상 (abnormalities)의 감소를 통하여 난자의 질을 유지할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 난모세포 내 ROS(Reactive oxygen species) 생성을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 난모세포의 미토콘드리아 (mitochondira)의 비정상적인 배치를 감소시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 불임 또는 난임의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 불임 또는 난임의 치료 또는 예방 용도를 제공한다.
본 발명은 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 난모세포 (oocytes)의 노화 방지 또는 수정능력 개선용 조성물에 관한 것으로, 상기 단백질은 난자의 질 개선을 통하여 불임 (난임)의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있으며, 체외 수정 시 사용되는 배양액 첨가물로도 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 노화 (aging)가 난자의 질 (oocyte quality)에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2a는 난자가 노화함에 따라 TCTP의 양이 변화하는 것을 확인한 도이다.
도 2b는 TCTP를 난자 내에서 감소시킬 때 난모세포의 방추체 및 염색체(spindle 및 chromosome)의 변화와, 활성산소종 (ROS)의 양이 변화하는 것 및 미토콘드리아의 배치 변화를 확인한 도이다.
도 3은 TCTP 처리 시 난자의 질 (oocyte quality) 유지 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 TCTP 처리 시 수정 후 발생 단계에 미치는 효과를 나타내는 도이다.
도 5는 TCTP (Translationally controlled tumour protein)의 난모세포(oocytes) 노화 방지/수정능력 개선 효과를 개략적으로 나타낸 도이다.
본 발명자들은, 실시예에서 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질 과발현 (overexpression)이 난자의 노화 관련 이상 (abnormalities)을 감소시킬 수 있다는 점에 기반하여 상기 단백질의 처리에 따른 ROS 축적, 미토콘드리아 결함 및 방추체/염색체 이상 (abnormalities) 등을 구체적으로 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 난모세포 (oocytes) 노화 방지 또는 수정능력 개선용 조성물을 제공함에 특징이 있으며, 상기 TCTP 단백질의 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타내었다.
본 발명의 "난모세포 (oocytes) 노화"란 난모세포의 자발적 활성화, 투명대 경화, 미토콘드리아 기능 장애, 스핀들 이상 및 염색체 무결성의 손실 등으로 난자의 품질이 약화된 상태를 말한다. 이때, 배란 후의 노화 (postovulatory aging)는 난자가 배란된 이후 제 2 감수분열 중기에 더이상 세포분열이 일어나지 않고 멈춰있는 난자가 수정이 되지 않았을 때 세포 사멸이 되기 전까지의 과정을 의미하는 반면, 상기 배란 후의 노화 시기와 구별되는 개념으로서, 난자 성숙 (Oocyte maturation)은 난소 내 난세포의 성숙과정을 나타내는 것으로 거대한 핵 (난핵포)을 갖는 제1 성숙분열 전기의 상태에서 성숙분열을 일단 휴지하다가 난성숙 유기물질의 작용으로 성숙분열을 재개하며 난핵포 붕괴가 시작되는 2 회의 성숙분열과정을 거쳐 난핵은 자성전핵이 되어 웅성전핵과 수정 완료과정인 융합이 가능해진 상태를 칭하며, 난자가 성숙하는 과정에서는 세포가 죽어가는 과정이 아니라 염색체 분리 등 세포 주기가 일어나고 있기 때문에 난자가 노화한다고 하지 않는다.
본 발명의 일실시예에서는, TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질의 난모세포 (oocytes) 노화 방지 및 수정능력 개선 효과를 확인하기 위해, TCTP 단백질의 녹다운 (knockdown) 및 과발현에 따른 난모세포 노화-관련 품질을 확인한 결과, 상기 난모세포에 녹다운 (knockdown) TCTP 단백질 처리 시, TCTP 과발현군에 비하여 우수한 노화-관련 품질 저하 방지 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다 (실시예 3 및 4 참조).
따라서, 본 발명에 따른 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질은 ROS 저해 활성 및 방추체/염색체 (spindle/chromosome) 이상 (abnormalities) 감소 효과를 갖는 바, 난모세포 (oocytes) 노화 방지 및 수정능력 개선 효과가 요구되는 다양한 목적 및 용도, 예컨대 난임, 불임 등의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
하나의 양태로서, 본 발명에 따른 조성물이 약학적 조성물의 형태로 사용되는 경우, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하고 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 난모세포(oocytes) 노화에 의해 기인하는 질환의 증상을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 말한다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명에 따른 조성물이 배지용 조성물의 형태로 사용되는 경우, 상기 조성물을 통상적인 포유동물 수정란 배양에 이용되는 기본 배지에 첨가하여 사용할 수 있다. 본 발명에서 "기본 배지"는 포유동물의 종에 따라 차이가 있으나, 무기염류, 탄소원, 아미노산, 소 혈청 알부민 및 보조인자로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하며, 당업자에게 알려진 일반적인 배지를 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 무기염류로는 NaCl, KCl, 및 NaHCO3 등을 사용할 수 있고, 탄소원으로는 글루코즈, 나트륨, 피루베이트 및 젖산칼슘염 등을 사용할 수 있으며, 아미노산으로는 글루타민을 비롯한 필수아미노산 및 비필수아미노산, 보조인자로는 기타 미량원소 및 완충액 등을 사용할 수 있다.
또한 상기 "기본 배지"는 항생제를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직한 실시예로서 상기 기본 배지로는 포유동물 세포 배양용으로 공지되어 상업화된 여러 배지, 예를 들어 CR1-aa (Rosenkrans, CF Jr., et al., Biol. Reprod., 49(3);459-462, 1993), TCM (tissue culture medium of medium199, Gibro, USA; Yue, C., et al., Development, 121:2645-2654, 1995), CZB (Chatot -Ziomek-Bavister medium; Chatot, C.L., et al., J. Reprod. Fert., 86:679-688, 1989) 등을 그대로 사용할 수 있으며, 이러한 기본 배지 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 본 발명의 배지 조성물을 적용시킬 수 있는 포유동물 수정란은 체외에서 배양될 수 있는 수정란이라면 모두 이에 해당하고, 상기 수정란은 체외수정란 또는 복제수정란을 모두 대상으로 할 수 있으며, 바람직하게는 초기 성숙란을 수정시켜 제조한 체외수정란을 대상으로 할 수 있다. 여기서 "체외수정란"이란 난자와 정자를 채취하여 체외에서 수정시킨 것을 말하고, "복제수정란"이란 체세포 공여핵을 유전물질이 제거된 수핵 난자에 주입한 후 물리적 또는 화학적 방법으로 융합시킨 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 불임(난임)의 치료방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
이때 투여량과 투여 경로와 같은 투여방식은 개체의 연령, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법
1-1. 난모세포 수집 및 배양
마우스의 관리 및 사용에 관한 모든 절차는 지침에 따라 실시되었고, 성균관대학교의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다.
4-6 주령 암컷 CD-1 마우스에 임신 암말의 생식선 자극 호르몬 (GTH) 혈청 (PMSG, 10 IU; Sigma-Aldrich)을 복강 내 주사하고, 46-50 시간 후에 난소를 분리하였다. MII기 유도를 위해, 인간 융모성 생식선 자극 호르몬 혈청 (hCG, 10 IU; Sigma-Aldrich)을 주사하였다. 난모세포는 모낭에서 수집하고, 감수분열 재개를 방지하기 위하여 3-아이소뷰틸-1-메틸산틴 (3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX) 200 μM이 첨가된 M2 배지에서 회수하였다. 시험관 (in vitro) 내 성숙을 유도하기 위하여, TCTP 녹다운 (knockdown) MII 난모세포 및 TCTP 과발현 난모세포를 주사 후 각각 12, 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 난모세포는 무-IBMX M16 배지 (37℃, 5% CO2)에 배양하였다. 모든 시약 및 배지는 특별히 명시되지 않는 한 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
또한, 성숙한 B6D2F1 암컷 마우스에 임신 암말의 생식선 자극 호르몬 (GTH) 혈청 (PMSG, 5 IU; Sigma-Aldrich)을 주사하고, 48 시간 후에 인간 융모성 생식선 자극 호르몬 혈청(hCG, 5 IU; Sigma-Aldrich)을 주사하여 과배란시켰다. COCs (cumulus oocyte complexes)는 hCG의 주입 13 시간 후에 난관에서 수집하였다. 난구세포는 M2 배지 (Sigma-Aldrich)에 0.1 % 소 고환 히알루로니다아제 (Sigma-Aldrich)와 함께 분산시켰다. 몇 분 후, 난모세포는 M2 배지 방울로 이동시키고 부드러운 피펫으로 거의 모든 난구세포를 제거하였다. TCTP의 과발현 및 시험관 (in vitro) 내 노화 난모세포를 얻기 위하여, TCTP-mCherry-cRNA를 균질 난형질 (homogeneous ooplasm)과 함께 무결함 신선 난모세포의 세포질에 미세주입하고, 무균 미네랄 오일로 덮어 KSOM 배지 (37℃, 5% CO2)에서 12 시간 동안 유지하였다. 이때, 대조군 (control) 난모세포는 mCherry-cRNA와 함께 미세주입하였다.
1-2. 미세주입술 (Microinjection)
약 5-10 pl의 dsRNA 또는 cRNA를 미세조작기 (micromanipulator, Narishige, Japan)가 장착된 Leica inverted 현미경 (DMIRB) 및 FemtoJet 미세주사기 (microinjector, Eppendorf, Germany)를 사용하여 난자의 세포질에 주입하였다. 주입 후, 난모세포는 IMBX가 첨가된 M16 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 신선한 배지로 옮기고 미네랄 오일 하에서 배양 (37℃, 5% CO2)하였다.
1-3. 세포 내 ROS 측정
난모세포를 다이하이드로로다민 123 (DHR-123, ThermoFisher scientific, USA) 20 μM 및 DCFHFDA (Sigma, USA)를 첨가한 M16 배지에서 1시간 동안 배양한 후, PBS/PVP로 세척하였다. 난모세포는 530-550 nm 필터로 시각화하고, 형광 신호는 Nikon Eclipse Ti inverted microscope with CCD cooled camera (DS-Qi1Mc, Nikon, Japan)를 이용하여 획득하였고, Image J software를 사용하여 정량화하였다.
1-4. 미토콘드리아 (Mitochondrial) 분석
난모세포는 CytoPainter 미토콘드리아 염색 버퍼 (abcam, USA)에서 30 분간 배양하고, 공초점 레이저 주사 현미경 (LSM 700, Zeiss, Germany)로 이미지를 촬영하였다. MII기 난모세포에서 신호는 Image J (https://imagej.nih.gov/ij/)로 분석하였다.
1-5. 세포 염색 (Annexin-V staining)
난모세포의 초기 세포사멸 (apoptosis)을 검출하기 위하여, Annexin-V 염색 키트 (BD Biosciences, USA)를 사용하였다. 난모세포는 제조사의 지시에 따라, Annexin-V-FITC 5 μl이 첨가된 결합 완충액 100 ml로 어두운 곳에서 염색하였다. 형광 신호는 450-490 nm 여기 (excitation) 및 520 nm 방출 (emission) 필터로 형광현미경을 이용하여 측정하였다.
1-6. 면역학적 블로팅 (Immunoblotting) 분석
난모세포를 SDS 샘플 버퍼에 용해 후, SDS-PAGE를 실시하였다. 전사 후, 1시간 동안 실온에서 blocking buffer (0.1 % Tween-20, 3 % BSA, TBS buffer)로 막을 차단한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 일차 항체와 함께 배양하였다. 이를 TBST buffer (0.1 % Tween-20, TBS buffer)로 3 회 세척한 후에, 1 시간 동안 이차 항체로 인큐베이션하였으며, ECL Plus Western Blotting 검출 키트 (GE 헬스케어)로 검출하였다. 일차 항체는 anti-TCTP (Abcam; 1:500), anti-pTCTP (Cell Signaling Technology; 1:500), anti-Plk1 (Santa Cruz; 1:500), anti-CHFR (Abcam; 1:500) 및 β-actin (Cell Signaling; 1:2500)을 사용하였으며, HRP-표지 마우스 및 래빗 항체 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)를 이차 항체로 사용하였다.
1-7. 면역형광 (Immunofluorescence) 분석
특정 단계의 난모세포를 10 분간 4 % 파라포름알데히드로 고정하고, 15 분간 0.1 % 트리톤 X-100이 첨가된 인산완충식염수 (PBS)로 투과시킨 후, 3 % 소혈청알부민과 함께 PBS로 블로킹하였다. 이후, 난모세포는 일차 항체와 함께 배양하고, Alexa Fluor-결합 488 및 594 이차 항체 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)로 인큐베이션하였다. DNA 대조용으로 DAPI를 사용하였다. 특별한 언급이 없는 한, 각 그룹마다 적어도 20 개의 난모세포를 조사하였다. 본 실험에 사용된 항체는 다음과 같다. anti-TCTP (Abcam; 1:50), anti-pTCTP (Cell Signaling Technology; 1:50), anti-CHFR (Abcam; 1:100), anti-acetylated α-tubulin (Sigma; 1:500) 및 anticentromere antibody (Antibodies Incorporated; 1:50).
1-8. 세포질 내 정자 주입술 (Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)
먼저, 정자는 성숙한 B6D2F1 수컷 마우스의 꼬리 부고환부속물 (cauda epididymidis)로부터 수집하고, 각 실험을 위하여 M2 배지 (37℃, 5% CO2)에서 30 분 동안 배양하였다. 현탁액의 1 μl를 미세 조작 챔버에서 10 % 폴리비닐 피롤리돈 (PVP)-HEPES- 완충 HTF 용액 (Irvine Scientic, Santa Ana, CA) 방울 (droplets)에 위치시켰다. ICSI는 하기 설명대로 수행하였다 (Kimura and Yanagimachi, 1995).
정자 머리는 목 영역에 여러 개의 피에조 펄스 (piezo pulses)를 사용하여 꼬리로부터 분리하고, 머리를 실시예 1-1의 B6D2F1 암컷 마우스로부터 배란된 난자에 주입하였다. 실온에서 10 분간 회복 후, 난자를 KSOM 배지에서 배양하였다. 이때, 난자는 일반적인 표면의 특징을 가지고 자발적으로 활성화되지 않은 경우에만 사용되었다. 6-8 시간 배양 후, 수정 (PN formation) 속도를 평가하였으며, 난자의 발달율은 정자 주입 후 각각 22-24 및 96-98 시간 후에 2세포 난할 (Cleavage) 단계/배반포 (blastocyste) 단계에 도달한 난자에서 주입한 정자 대비 생존한 정자의 비율을 기준으로 평가하였다.
실시예 2. 노화 (aging)가 난자의 질 (oocyte quality)에 미치는 영향 확인
난모세포가 노화됨에 따라, 난자의 질 (oocyte quality)에 어떠한 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에 따라, 세포 생존율, ROS 수준, 세포사멸 (apoptosis) 등을 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 난자가 노화됨에 따라 생존율은 감소하고, 활성산소종 (ROS)의 양이 증가하며, 세포사멸 (apoptosis) 또한 증가하는 것을 확인하였고, 나아가 난모세포의 방추체 및 염색체 (spindle 및 chromosome)에도 이상이 생김을 알 수 있었다.
상기 결과를 종합한 결과, 노화에 의해 나타나는 표현형 (phenotype)들로서, 세포 생존율, 활성산소종 (ROS)의 양 및 방추체/염색체 (spindle/chromosome) 이상 등이 나타남을 알 수 있었다.
실시예 3. TCTP 처리 시 난자의 노화 (oocyte aging)에 미치는 효과 확인
TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질이 난자의 노화에 관여하고 있는지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에 따라, TCTP 억제 시 세포 생존율, ROS 수준, 세포사멸 (apoptosis) 등을 측정하고, 난자에 TCTP dsRNA 주입 (injection) 후 TCTP의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 난자가 노화함에 따라 TCTP의 양 변화가 감소하는 것을 확인하였으며, 나아가 난자에 TCTP dsRNA 주입 시, TCTP의 양이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이, TCTP를 난자 내에서 감소시켰을 때, 난모세포의 방추체 및 염색체 (spindle 및 chromosome)에 이상이 생겼으며, 활성산소종 (ROS)의 양이 증가하였고, 미토콘드리아의 배치가 비정상적으로 변하는 것을 확인하였다.
상기 결과를 종합한 결과, TCTP가 감소하면 노화에 의해 나타나는 표현형 (phenotype)들이 증가하며, 이를 통하여 TCTP 감소하는 경우, 난자의 노화 진행이 빨라지는 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. TCTP 처리 시 난자의 질 (oocyte quality) 유지 효과 확인
TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질의 난자의 질 유지 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에 따라, TCTP 증가 시 세포 생존율, ROS 수준, 세포사멸 (apoptosis) 등을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, TCTP를 난자 내에서 증가시켰을 때, 활성산소종 (ROS)의 양이 감소하였고, 난모세포의 방추체 및 염색체 (spindle 및 chromosome)에 이상이 감소하였으며, 미토콘드리아의 배치가 비정상적으로 변하는 것이 적어지는 것을 확인하였다.
상기 결과를 종합한 결과, TCTP가 증가하는 경우, 난자의 노화 진행을 늦추고, 이에 따라 난자의 질을 유지하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. TCTP 처리 시 수정 후 발생 단계에 미치는 효과 확인
TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질의 수정 후 발생 단계에 있어서의 질 개선 효과를 확인하기 위하여, TCTP mRNA 주입으로 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 발현시킨 후, 실시예 1-8의 방법으로 세포질 내 정자 주입술 (Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)에 의해 인공수정을 시킨 수정란을 발생 단계별로 관찰하였다.
그 결과, 하기 표 1 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 수정 후 초기발생 단계에서 발달율이 현저하게 높아지는 것을 확인하였다.
발달율 Fresh No. (%) Tre. B (Ctrl) No. (%) Tre. A (TCTP) No. (%) P 값
No. of ICSI 60 106 125
수정 (Fertilization) (2 PN) 59 (98.4±1.60) 99 (92.7±1.84) 119 (95.6±1.32)
난할 (Cleavage) 58 (96.8±3.17) 81 (76.5±3.48) 112 (90.6±2.98) 1 vs. 2 : 0.0032 vs. 3 : 0.007
배반포 (Blastocyst) 53 (87.0±6.50) 37 (34.1±5.45) 78 (62.6±4.66) 1 vs. 2 : 0.0002 vs. 3 : 0.0011 vs. 3 : 0.015
이러한 결과는, TCTP가 난자의 노화를 억제함으로써 수정능력을 증가시키는 효과가 있음을 시사하고 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 불임 또는 난임의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 상기 단백질은 난자의 질 개선을 통하여 불임 (난임)의 예방 또는 치료와 관련한 기술분야에서 유용하게 이용될 수 있으며, 체외 수정 시 사용되는 배양액 첨가물로도 이용될수 있다.
<210> 1
<211> 172
<212> PRT
<213> Translationally controlled tumour protein
<400> 1
Met Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Ile Ser His Asp Glu Met Phe Ser Asp
1 5 10 15
Ile Tyr Lys Ile Arg Glu Ile Ala Asp Gly Leu Cys Leu Glu Val Glu
20 25 30
Gly Lys Met Val Ser Arg Thr Glu Gly Asn Ile Asp Asp Ser Leu Ile
35 40 45
Gly Gly Asn Ala Ser Ala Glu Gly Pro Glu Gly Glu Gly Thr Glu Ser
50 55 60
Thr Val Ile Thr Gly Val Asp Ile Val Met Asn His His Leu Gln Glu
65 70 75 80
Thr Ser Phe Thr Lys Glu Ala Tyr Lys Lys Tyr Ile Lys Asp Tyr Met
85 90 95
Lys Ser Ile Lys Gly Lys Leu Glu Glu Gln Arg Pro Glu Arg Val Lys
100 105 110
Pro Phe Met Thr Gly Ala Ala Glu Gln Ile Lys His Ile Leu Ala Asn
115 120 125
Phe Lys Asn Tyr Gln Phe Phe Ile Gly Glu Asn Met Asn Pro Asp Gly
130 135 140
Met Val Ala Leu Leu Asp Tyr Arg Glu Asp Gly Val Thr Pro Tyr Met
145 150 155 160
Ile Phe Phe Lys Asp Gly Leu Lys Met Glu Lys Cys
165 170

Claims (7)

  1. TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는, 불임 또는 난임의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 난모세포의 방추체 (spindle) 및 염색체 (chromosome) 이상 (abnormalities)의 감소를 통하여 난자의 질을 유지하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 난모세포 내 ROS (Reactive oxygen species) 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 난모세포의 미토콘드리아 (mitochondira)의 비정상적인 배치를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 불임 또는 난임의 치료 또는 예방 방법.
  7. TCTP (Translationally controlled tumour protein) 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물의 불임 또는 난임의 치료 또는 예방 용도.
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