WO2018020008A1 - Vorrichtung zur isolierung von stammzellen aus fötalen geweben - Google Patents

Vorrichtung zur isolierung von stammzellen aus fötalen geweben Download PDF

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WO2018020008A1
WO2018020008A1 PCT/EP2017/069192 EP2017069192W WO2018020008A1 WO 2018020008 A1 WO2018020008 A1 WO 2018020008A1 EP 2017069192 W EP2017069192 W EP 2017069192W WO 2018020008 A1 WO2018020008 A1 WO 2018020008A1
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tissue
stem cells
fetal
incubation chamber
cells
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PCT/EP2017/069192
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Marius Alexander Möbius
Mario Rüdiger
Daniel Freund
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Technische Universität Dresden
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/02—Means for pre-treatment of biological substances by mechanical forces; Stirring; Trituration; Comminuting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources

Definitions

  • the invention relates to an apparatus for isolating stem cells from fetal tissues which comprises an incubation chamber, at least one pump, a tissue solution solution reservoir, a rinse solution reservoir, optionally a control unit, optionally an impurity separation means and optionally a means for expansion having isolated stem cells.
  • the invention further relates to a method for isolating stem cells from fetal tissue, which inter alia, the mechanical dissociation and the enzymatic digestion of the fetal tissue and optionally a
  • the device and method of the invention are particularly suitable for isolating mesenchymal stem cells from fetal tissues such as umbilical cord tissue, placental tissue or fetal lung tissue.
  • the umbilical cord is a waste product from which fetal stem cells can be obtained without these risks to the donor.
  • MSCs are mesenchymal precursor cells found in almost all mesodermal tissues and the umbilical cord and placenta, respectively. MSCs are potent anti-inflammatory and stimulate the growth and regeneration of various tissues (vessels, lungs, etc.). They can therefore be used for the treatment of diseases with excessive inflammatory reaction, impaired vascularization and / or consequent tissue damage. To date, well over 1,000 patients have been treated with autologous or allogeneic MSCs from various tissues worldwide (Lalu et al., 2012), and nearly 1,000 clinical trials are already completed or underway (Monsarrat et al., 2016). For example, MSCs can be used as cell therapies for impaired function or under-functioning of the premature lungs (van Haaften 2009, Chang 2014).
  • exogenous MSCs have resulted in interaction with the lung tissue and the "on-demand" secretion of proteins, small molecules, and cellular components (exosomes, mitochondria, etc.), protecting endogenous lung cells and stimulating lung growth (Möbius 2016).
  • MSCs as a pharmaceutical product poses a problem. None of the MSC populations previously used in clinical trials have conformed to a traditional pharmaceutical product in their manufacture. Each cell product, batch or batch is different and the results of the clinical trials are not comparable. The same applies to conventionally produced cell-free products, eg conditioned, purified cell culture medium; Exosomes, etc.
  • MSCs represent an inhomogeneous cell population.
  • the MSCs obtained from a donor differentiate in culture partly due to various factors in therapeutically inactive cells, partly in transdifferentiated cells and partly in therapeutically active cells.
  • the harvested and previously used cell product is a variable mixture of therapeutically active, less active or non-active cells.
  • Umbilical cord MSCs are an alternative to MSCs from "classical” sources such as bone marrow (BM-MSCs) and adipose tissue (AT-MSCs) . These classically derived MSCs have several disadvantages: BM-MSCs are often highly expanded cells from older donors The proportion of therapeutically active cells in both the starting material and the final product is low, and the isolation of MSCs from bone marrow and adipose tissue is always associated with invasive surgery (puncture). On the other hand, umbilical cord MSCs have advantages. The umbilical cord is a de facto infinite source of "young" MSCs. In the treatment of heart attacks, umbilical cord MSCs are therapeutically superior to BM-MSCs (Yannarelli et al., 2013).
  • WO 2006/094286 provides a method of isolating stromal cells from pancreatic tissue.
  • the method includes both mechanical dissociation and enzyme digestion of pancreatic donor tissue.
  • the isolated stromal cells from the pancreas can be used in vitro for differentiation into complete or partially differentiated pancreatic cells for the Transplantation can be induced in a patient.
  • the isolated stromal cells from pancreas can be transplanted directly into a patient and differentiated into the desired cell types in vivo.
  • EP 2 433 713 provides a system for processing and separating samples comprising a sample processing unit and a sample separation unit.
  • the separation of the samples takes place by means of magnetic separation.
  • biological materials such as cells from different organs and tissues, must be magnetically labeled with a suitable specific binding ligand.
  • WO 2015/170347 discloses a method for the separation, accumulation and co-culture of a mixture of fetal cells containing one or more different types of mesenchymal stem cells derived from placenta, amnion, amniotic fluid, chorion and umbilical cord and / or other products of conception have been obtained under hypoxic or normoxic conditions and are suitable for the treatment of a variety of diseases ranging from congenital to degenerative to malignant diseases.
  • the devices and methods known from the prior art have the disadvantage that high-quality MSCs can not be provided in sufficient numbers for clinical applications and that the batches produced by MSCs do not meet the requirements of "good manufacturing practice" (US Pat. GMP). Description of the invention
  • the object of the invention is therefore to provide a device which is the GMP-compliant production of high quality, therapeutically usable
  • MSCs Stem cells, in particular MSCs from fetal tissues for in particular regenerative and immunomodulatory applications in adult and pediatric medicine allows.
  • the device according to the invention should be particularly suitable for GMP-compliant MSCs from fetal tissues and to provide in large quantities.
  • fetal tissue is tissue which has emerged from the fertilized ovum and the resulting embryoblast plus trophoblasts, and thus separates itself from the maternal tissue.
  • Fetal tissue is preferably tissue obtained immediately after birth (i) from a fetus (stillbirth) that died in the womb, (ii) fetus (abortion) born before reaching extrauterine viability, or (iii) tissue derived from the newborn is separated immediately after birth (especially the membranes, the placenta and the umbilical cord).
  • the object of the invention is achieved by providing a device having the features according to claim 1.
  • the device according to the invention for isolating stem cells from fetal tissues has in particular
  • At least one pump is provided.
  • At least one storage container for a tissue solution At least one storage container for a tissue solution
  • At least one reservoir for a rinse solution At least one reservoir for a rinse solution
  • an agent for the removal of impurities for example in a density gradient
  • a means of expanding the isolated stem cells has the advantage that, compared to conventionally used devices, the isolation of stem cells, in particular MSCs, results in a significantly higher yield of stem cells, in particular primary MSCs.
  • Particularly advantageous is the device for the isolation of primary MSCs from the umbilical cord.
  • the incubation container preferably consists of a material that can be sterilized, in particular autoclaved. Suitable materials such as glass, stainless steel or autoclavable plastics.
  • the incubation chamber is a heatable container. This has the advantage that the digestion of the fetal tissue, which can be carried out enzymatically, can be carried out at temperatures which are optimal for the enzymes used.
  • the temperature in the incubation chamber is set in the range of 30 ° C to 42 ° C, preferably in the range of 35 ° C to 40 ° C. It is particularly preferred if the temperature in the incubation chamber is adjusted to a temperature of 37.degree. This temperature represents the optimum temperature for enzymes in the tissue digestion solution that are of human origin.
  • the temperature in the incubation chamber can be controlled by means of a thermostat, a temperature sensor or temperature sensor, which is connected to the control unit, for example.
  • the tempering of the contents of the incubation chamber can also be done externally by means of an electric heating plate. It is conceivable that the incubation chamber 11 is designed double-walled, so that the heating of the contents of the incubation chamber by means of a liquid medium, such as water, and a thermostat can be done. It is particularly preferred if the temperature in the incubation chamber can be regulated by means of a Peltier element which is provided with a sterilizable or disposable envelope. In another embodiment, the incubation chamber may also be a non-heatable container.
  • the incubation chamber may contain a pH probe.
  • the pH probe is connected to the control unit so that signals of the pH probe in the control unit can be processed and thereby timing and amount of addition of the rinse solution into the incubation chamber can be controlled.
  • this embodiment also makes it possible to control the addition of further solutions, such as the addition of a washing solution and / or further enzyme solutions at one or more specific times.
  • the incubation chamber is preferably designed such that it is possible to generate in the incubation chamber an atmosphere in which the oxygen content is depleted. In this case, the oxygen content in the atmosphere of the incubation chamber is adjusted to a proportion in the range of 2-21%, preferably 2-15% or 2-10%, particularly preferably 2-5%.
  • the incubation chamber can have further connections, which make it possible to carry out a gas exchange of the atmosphere of the incubation container.
  • the incubation chamber contains a means for comminuting the fetal tissue.
  • the comminuting agent is used to mechanically disrupt or dissociate the fetal tissue from which the stem cells, preferably MSCs, are to be isolated. This results in a
  • the means for comminuting the fetal tissue is a mechanical means, for example a cutting device.
  • the means for comminuting the fetal tissue is a rotating knife system.
  • the incubation chamber contains a means for mixing the tissue digest suspension, preferably a means for stirring the tissue digest suspension, more preferably a stirrer or rotor. In a particularly preferred embodiment, the mixing of the tissue digest suspension
  • Tissue digest suspension with the rotating knife system reached which is used for mechanical dissociation of the tissue.
  • the tissue pulp suspension is continuously stirred by means of the rotating blade system in the incubation chamber. It can thereby be achieved that the substrate accessibility of the enzymes used for tissue digestion is ensured at all times.
  • the incubation chamber has openings / connections for lines and hoses.
  • the incubation chamber has at least two openings for connections and lines.
  • the incubation chamber can also have more, that is more than two openings / connections for pipes and hoses.
  • tissue disruption solution and / or a rinse solution may be added to the incubation chamber via the ports / ports.
  • the tissue disruption solution preferably contains an enzyme mixture, preferably a mixture of enzymes, particularly preferably enzymes of eukaryotic origin, in particular preferably enzymes which are free of potential contaminations by animal products (so-called "animal origin free” (AoF) enzymes or products)
  • AoF enzymes can be purified by chromatography
  • Fermentation from, for example, genetically modified microorganisms are obtained industrially. Very particular preference is given to recombinant enzymes of human origin.
  • the enzymatic digestion is carried out with an enzyme mixture, wherein the composition of the enzyme mixture is specially adapted to the extracellular matrix composition of the fetal tissue. It is particularly preferred if the composition of the enzyme mixture is specifically to the extracellular
  • Matrix composition of umbilical cord tissue is adjusted. It is particularly preferred if the tissue disruption solution contains a mixture of the enzymes hyaluronidase and / or neutral protease and / or collagenase and / or DNAse.
  • the tissue disruption solution comprises an enzyme mixture of collagenase, hyaluronidase and a DNAse. It is also very particularly preferred if the tissue disruption solution contains an enzyme mixture of collagenase, neutral protease and a DNAse.
  • the DNAse used in the tissue digestion solution is preferably DNAse I, for example Pulmozyme (Roche Diagnostics).
  • the DNAse used in the tissue digestion solution serves to reduce the viscosity, resulting in optimal separation of target cells (e.g., primary MSCs) and impurities in a subsequent one
  • Density gradient separation leads. It is particularly preferred if enzymes which are free of animal contaminants are used in the tissue disruption solution.
  • the collagenase used in the tissue digestion solution is, for example, Collagenase NB IV / VI (SERVA Electrophoresis).
  • tissue disruption solution is chemically defined buffer solutions or chemically defined culture media, such as, for example, Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) or Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). These may additionally be mixed with specific salts and chemically defined substances (cofactors or cosubstrates) in order to best support the enzymatic digestion in their composition and to keep the amount of enzyme to be used as low as possible.
  • substrates should be contained for the aerobic or anaerobic metabolism of the cells, preferably glucose or sodium pyruvate.
  • the buffer solution should preferably a C02 ⁇ independent buffer system include (for example HEPES or sodium biphosphate).
  • normal, already GMP-compliant (C02-buffered) media such as DMEM could also be used.
  • C02-buffered media such as DMEM
  • the control of the CO2 concentration in the incubation chamber is necessary in addition to the control of the O2 concentration.
  • the rinsing solution is used for neutralization or rebuffering and the viscosity reduction of the cell suspension after mechanical comminution and after enzymatic Gewebeverdau.
  • the rinse solution is preferably a chemically defined buffer solution or a chemically defined culture medium such as Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) or Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  • PBS Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the incubation chamber has at least one outlet.
  • the incubation chamber may also have multiple outlets.
  • the at least one outlet serves to transfer the tissue suspension suspension obtained after the mechanical dissociation and the enzymatic digestion into other containers or other constituents of the device according to the invention.
  • Such a further component of the device according to the invention may be, for example, a means for the separation of impurities in a density gradient.
  • the invention provides a device for isolating stem cells from fetal tissues, the device
  • control unit optionally a control unit
  • the means for separating impurities in a density gradient may be, for example, a centrifuge. Suitable for this purpose is any conventional type of centrifuge suitable for performing density gradient centrifugation. Preferably, the
  • This embodiment of the device according to the invention has the advantage that for the subsequent expansion a very homogeneous starting population of stem cells, in particular primary MSCs, can be provided, since contaminants, such as endothelial cells, epithelial cells and blood cells in the
  • Density gradient centrifugation be separated.
  • the device according to the invention has no means for separating impurities in a density gradient.
  • the device according to the invention has a means for expanding the isolated stem cells, in particular primary MSCs.
  • a device for isolating stem cells from fetal tissues the device
  • control unit optionally an agent for the separation of impurities in a density gradient
  • the means for expanding stem cells may be, for example, an adherent enrichment agent.
  • an adherence-enhancing agent typically provides a culture surface for the isolated cells on which the isolated cells can grow and multiply.
  • this culture surface is a
  • the adherence accumulation of the isolated cells may be carried out in a bioreactor, wherein the bioreactor contains beads and the culture surface for the isolated cells is provided by the beads.
  • the adherence accumulation of the isolated cells is performed in selective media for stem cells, especially primary MSCs. It is particularly preferred if the expansion of the isolated stem cells, in particular primary MSCs, is carried out in a culture medium containing additives that specifically support the growth of stem cells, in particular the primary MSCs.
  • the culture medium for the expansion of the isolated stem cells is also preferably chemically defined, free of potential contamination by animal products (AoF) and GMP compliant.
  • Such additives may be, for example, human platelet-rich plasma or human platelet lysate.
  • the means for adherence accumulation of the isolated stem cells, in particular the isolated primary MSCs is preferably connected by a tube to the outlet of the incubation chamber for tissue digestion.
  • the connection of the HyperStack ® system using the incubation vessel through a hose can ensure that the digestion of fetal tissues up to the expansion of the isolated cells can take place in a closed system.
  • the reservoir for the tissue digestion solution and / or the reservoir for the rinsing solutions by means of tubes via openings / connections with the incubation container are connected.
  • the at least one pump, preferably two, three or more pumps, according to the requirements of the device according to the invention, contained in the device according to the invention can be any type of conventionally available pump.
  • the pumps contained in the device according to the invention are peristaltic pumps. It is therefore particularly preferred if the tissue disruption solution from the corresponding storage container and / or the rinsing solution from the corresponding storage container can be filled into the incubation container by means of a separate peristaltic pump. It is also preferred if the tissue digestion suspension after mechanical comminution and enzymatic digestion by means of a peristaltic pump in either the downstream Means for separating impurities in the density gradient, for example a
  • Density gradient centrifuge, and / or in the subsequent means for Adhstedzanreichtation, for example, a HYPERStack ® vessel or a bead-based bioreactor can be transmitted.
  • This embodiment has the advantage that the pumps contained in the device according to the invention have no direct contact with the liquids contained in the device according to the invention. This ensures that the device according to the invention represents a completely closed system for isolating stem cells, in particular primary MSCs.
  • the density gradient centrifuge may, for example, operate on the principle of a Peeler centrifuge or may be a continuous centrifuge (e.g., a modified slow-speed CEPA centrifuge, Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH).
  • the device according to the invention thus represents a closed system.
  • the device can be disinfected or sterilized as a closed system, for example autoclavable.
  • the device is wholly or partly designed as a pre-sterilized disposable system for single use.
  • the hoses and reservoir, possibly also the Incubation chamber, and the HYPERStack ® system are suitable to be designed as a pre-sterilized disposable system.
  • the device according to the invention is characterized in that it contains no means for magnetic separation of target cells (stem cells, especially MSCs) and contaminants, such as endothelial cells, blood cells or epithelial cells.
  • the device according to the invention for isolating stem cells from fetal tissues is a closed system
  • a pump in particular a peristaltic pump, for the transfer of the tissue disruption solution into the incubation chamber
  • a pump in particular a peristaltic pump for the
  • a means for the separation of impurities in a density gradient preferably a density gradient centrifuge
  • This device designed as a closed system can be sterilized, preferably autoclavable, or, alternatively, is configured in part as a pre-sterilized disposable system for single use.
  • the tissue digestion solution reservoir, the rinse solution reservoir and the density gradient separation agent and / or the isolated stem cell expansion means are connected to the incubation chamber via autoclavable tubes or preferably via disposable tubes.
  • This configuration as a closed system has numerous advantages.
  • the cell harvest and cell yield is significantly improved compared to conventional open systems and methods (SERVA, Miltenyi Biotec). With this closed system can be a closed and automated
  • Isolation method of stem cells in particular primary MSCs are performed. Manual activities on this closed system can be reduced to a minimum.
  • a very high initial amount of MSCs is achieved by a particularly efficient tissue turnover, especially when using umbilical cord tissue.
  • the thus constructed completely closed system also allows the use and connection of a closed system also for the expansion of the cells (for example, HyperStack ®, Corning). Because of the closed nature of the system, any contact between the user and the isolated cells can be avoided, greatly reducing the risk of contamination.
  • the device according to the invention especially if designed as a closed system, is particularly advantageous because it can provide high levels of young, low-expansion cells for clinical applications.
  • the device according to the invention may further include a control unit.
  • This control unit can optionally be decoupled from the device according to the invention, in particular when the device according to the invention is to be disinfected or sterilized as a closed system, for example autoclaved, or as a closed system with partially sterilizable components (isolation chamber,
  • Shredder etc.
  • components some of which are disposable, such as tubing and bag systems, which can be sterilized before isolation of the MSCs into a closed system.
  • the control unit may be a process computer or a conventionally available computer system, such as a laptop or a personal computer. It is also possible that the control unit is a smartphone or a tablet computer. In this case, the control unit is preferably connected wirelessly (for example via WLAN or Bluetooth®) to the device according to the invention.
  • the control unit serves to control and regulate all necessary processes in the device according to the invention, or to control the individual components of the device according to the invention.
  • the control unit preferably by means of a process software installed on the control unit, the rotational speed of the rotating blade system for the mechanical dissociation of the fetal tissue can be regulated.
  • the rotating knife system operates for example at a speed in the range of 1,000 to 10,000 min -1, preferably in the range from 1000 to 9000 min -1, 1000 to 8000 min -1, 1000 to 7000 min -1, 1000 to 6000 min -1, 1,500 to 5,000 min- 1 or 1,500 to 4,000 min -1 , more preferably in the range of 2,000 to 3,000 min -1 .
  • the control unit can also control the temperature in the incubation chamber during tissue digestion.
  • the control unit can also control the pumps contained in the device according to the invention. For example, it is possible to control the timing and amount of addition of the tissue digest solution from the respective reservoir, and the timing and amount of addition of the rinse solution by the controller. Also, the pumps that transport the tissue digestion suspension to a subsequent density gradient centrifuge after mechanical dissociation and enzymatic digestion and / or a means to expand the isolated stem cells may be controlled by the controller.
  • the fetal tissue that can be processed with the device according to the invention is selected, for example, from umbilical cord tissue, placental tissue, fetal lung tissue, etc.
  • the device according to the invention processes fetal tissue from umbilical cord.
  • the stem cells which can be isolated by means of the device according to the invention are mesenchymal stem cells, such as, for example, mesenchymal stem cells, which can be isolated from the aforementioned tissues.
  • the mesenchymal stem cells are MSCs from umbilical cord tissue.
  • the isolation of the stem cells is carried out with the device according to the invention in a batch process, wherein each batch of an entire umbilical cord is used as starting material for the isolation of the stem cells.
  • a product batch isolated and / or expanded stem cells
  • the stem cells in particular primary MSCs, which have been isolated from an umbilical cord and possibly subsequently expanded.
  • the invention also relates to the use of the device according to the invention for isolating stem cells from other fetal and / or adult tissues.
  • the invention further provides a method for isolating stem cells from fetal tissue, which is specifically adapted to the device according to the invention, and in particular their execution as a closed system.
  • the method according to the invention for isolating stem cells comprises the following steps:
  • the advantage of the method according to the invention is that the mechanical dissociation and the enzymatic digestion can be carried out simultaneously in the incubation chamber of the device according to the invention.
  • the process according to the invention is carried out in an oxygen-depleted atmosphere which contains, for example, an oxygen concentration in the range from 2 to 21%, preferably 2 to 15% or 2 to 10%, particularly preferably 2 to 5%.
  • an oxygen concentration in the range from 2 to 21%, preferably 2 to 15% or 2 to 10%, particularly preferably 2 to 5%.
  • the method according to the invention further comprises, after the expansion of the stem cells Harvesting the culture supernatant.
  • the culture supernatant can subsequently be processed and used as a therapeutic cell-free product.
  • the product thus obtained (culture supernatant) is concentrated inline by means of conventional filtration and dialysis techniques. This has the advantage that with the device according to the invention and the method according to the invention also cell-free products, eg conditioned, purified
  • the method according to the invention also comprises the harvesting of the stem cells, in particular of the primary MSCs.
  • the method according to the invention for isolating stem cells from fetal tissue comprises the steps
  • FIG. 1 shows the device 10 according to the invention as a closed system.
  • the device comprises an incubation chamber 11 with lid 28, a reservoir for the tissue digestion solution 12 and a reservoir for the rinsing solution 13.
  • the reservoirs for the tissue digestion solution 12 and the rinse solution 13 are connected via hoses 20 and the connections 16 and 17 to the incubation chamber 11 ,
  • the tissue digestion solution can be delivered from the reservoir 12 into the incubation chamber 11 by means of the peristaltic pump 14.
  • the rinsing solution can be filled from the reservoir 13 by means of the peristaltic pump 15 into the incubation chamber 11.
  • the incubation chamber 11 contains a rotating cutting blade 21 for mechanical dissociation of the fetal tissue.
  • the temperature in the incubation chamber 11 can be regulated by means of an electric heating rod 24 and a temperature sensor 23. Alternatively, the temperature in the incubation chamber may also be regulated by means of a Peltier element provided with a sterilizable or disposable envelope.
  • the pH of the tissue digestion solution in the incubation chamber 11 may be monitored by the optional pH probe 22.
  • the incubation chamber 11 also has an outlet 18 of the Fa. Corning ® via hoses 20 with a HyperStack system for subsequent adherent cell expansion connected. After mechanical dissociation and enzymatic digestion the GewebeaufInstitutsuspension can be transferred by means of the peristaltic pump 19 from the incubation chamber 11 in the HYPERStack ® System 25.
  • the device 10 may be connected to a smartphone or tablet PC 29 as Controlled control unit. This control unit may, for example, be wirelessly connected to the device 10.
  • FIG. 2 shows a device according to the invention which, as in FIG. 1, is designed as a closed system.
  • the device according to FIG 2 comprises a Dichtegradientenzentrifuge 26 in place of the Hyper stack ® system 25.
  • the device according to the invention may also be a Dichtegradientenzentrifuge 26 and a HyperStack ® system contain 25th
  • FIG. 3 shows an embodiment of the device according to the invention as a closed system, as shown in FIG.
  • the temperature in the incubation chamber 11 is adjusted by means of a heating plate 27 instead of an electric heating rod 24.
  • the temperature in the incubation chamber may also be regulated by means of a Peltier element provided with a sterilizable or disposable envelope.
  • the device 10 can be controlled with a PC 30 as a control unit, wherein PC 30 and device 10 are wired, for example via the cable 31.
  • Exemplary Embodiment Isolation of a Batch of Primary MSCs from an Umbilical Cord
  • a batch of MSCs was obtained from an umbilical cord with the device according to the invention and the method according to the invention Invention won.
  • the storage was carried out at a temperature of 4 ° C and in a specific medium, which was composed of a citrate-phosphate-dextrose-adenine solution (CPDA1) and PBS (CDPA1 / PBS).
  • CPDA1 citrate-phosphate-dextrose-adenine solution
  • CDPA1 / PBS PBS
  • the transport to the device 10 according to the invention was also carried out under controlled conditions at a temperature of 4 ° C in the medium CPDA1 / PBS.
  • the isolation of the MSCs from the umbilical cord was then carried out in the device 10 according to the invention.
  • the whole umbilical cord was placed in the incubation container 11, which was 29los sen with the lid 28.
  • the entire device 10 was sterilized prior to performing the MSC isolation.
  • the mechanical digestion of the umbilical cord was carried out automatically after closing the cover 28 in the incubation chamber 11 by means of the rotating blade system 21.
  • the enzymatic dissociation was carried out with an AoF enzyme mixture containing recombinant collagenase, hyaluronidase and DNAse of eukaryotic origin.
  • the DNAse was Pulmozyme (Roche Diagnostics).
  • the collagenase used was Collagenase NB IV / VI (SERVA Electrophoresis).
  • the tissue disruption solution (50 ml) further contained Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • the tissue disruption solution also contained glucose and HEPES.
  • the tissue disruption solution was introduced from the reservoir 12 by means of peristaltic pump 14 via the inlet 16 into the incubation chamber 11.
  • a density gradient separation was carried out in a CEPA centrifuge (Carl Padberg, Zentrifugenbau GmbH) 26.
  • the incubation chamber 11 was first prepared by introducing 50 ml of rinsing solution (Dulbeccoo's Phosphate Buffered Saline (PBS)). flushed from the reservoir 13 by means of the peristaltic pump 15. Via the outlet 18 and by means of the peristaltic pump 19, the tissue disruption solution was then transferred via the tubes 20 into the density gradient centrifuge 26.
  • the density gradient centrifugation was carried out using Ficoll ® tube.
  • the target cells of the thus prepared MSC-Batches carry the surface markers CD73, CD90 and CD105, but do not carry the surface markers CD14, CD34 and CD45.
  • the purification of a batch of MSCs from an umbilical cord carried out by means of the device 10 according to the invention, it was possible to achieve a purity of greater than 95% of the target cells, which the Wear surface markers CD73, CD90 and CD105. Less than 2% of the purified cells carried the unwanted markers CD14, CD34 and CD45.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben, die eine Inkubationskammer, mindestens eine Pumpe, mindestens einen Vorratsbehälter für eine Gewebeaufschlusslösung, mindestens einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung, optional eine Steuereinheit, optional ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen und optional ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen aufweist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Isolierung von Stammzellen aus fötalem Gewebe, das unter anderem die mechanische Dissoziation und den enzymatischen Verdau des fötalen Gewebes sowie optional eine Dichtegradientenzentrifugation zur Abtrennung von Verunreinigungen umfasst. Die Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung sind besonders dazu geeignet, mesenchymale Stammzellen aus fötalen Geweben, wie Nabelschnurgewebe, Plazentagewebe oder fötalem Lungengewebe zu isolieren.

Description

Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben die eine Inkubationskammer, mindestens eine Pumpe, einen Vorratsbehälter für eine Gewebeaufschlusslösung, einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung, optional eine Steuereinheit, optional ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen und optional ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen aufweist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Isolierung von Stammzellen aus fötalem Gewebe, das unter anderem die mechanische Dissoziation und den enzymatischen Verdau des fötalen Gewebes sowie optional eine
Dichtegradientenzentrifugation zur Abtrennung von
Verunreinigungen umfasst. Die Vorrichtung und das Verfahren der Erfindung sind besonders dazu geeignet, mesenchymale Stammzellen aus fötalen Geweben, wie Nabelschnurgewebe, Plazentagewebe oder fötalem Lungengewebe, zu isolieren.
Hintergrund der Erfindung Stammzellen, insbesondere mesenchymale Stromazellen (MSCs) werden auf Grund ihrer immunmodulatorischen und die Geweberegeneration fördernden Eigenschaften erfolgreich in vielen präklinischen und klinischen Studien getestet (Heathman et al . , 2015). Die überwiegende Mehrzahl der eingesetzten Zellen stammt jedoch aus dem Knochenmark (sogenannte „Bone Marrow MCSs", BM-MSCs) . Diese sind auf Grund des Spenderalters, der geringen Menge des verwertbaren Knochenmarks und der daraus resultierenden Notwendigkeit einer massiven Zellexpansion qualitativ inhomogen (Mendicino et al . , 2014; Wuchter et al . , 2015) und somit für die breite Anwendung im Rahmen regenerativer Therapieansätze nur sehr eingeschränkt geeignet. Um BM-MSCs zu gewinnen, muss außerdem eine invasive Maßnahme (Knochenmarkpunktion) , die eine kleine Operation mit lokaler Betäubung und Sedierung umfasst, vorgenommen werden. Die Nabelschnur hingegen ist ein Abfallprodukt, aus dem fötale Stammzellen ohne diese Risiken für den Spender gewonnen werden können .
MSCs sind mesenchymale Vorläuferzellen, die in nahezu allen mesodermalen Geweben und der Nabelschnur beziehungsweise der Plazenta vorkommen. MSCs sind potent anti-inflammatorisch und stimulieren das Wachstum sowie die Regeneration verschiedener Gewebe (Gefäße, Lunge usw.) . Sie können daher zur Behandlung von Erkrankungen mit überschießender entzündlicher Reaktion, beeinträchtigter Gefäßbildung und/oder daraus folgender Gewebeschädigung eingesetzt werden. Weltweit wurden bisher weit über 1.000 Patienten mit autologen oder allogenen MSCs aus verschiedenen Geweben behandelt (Lalu et al . , 2012), nahezu 1.000 klinische Studien sind bereits abgeschlossen oder in Durchführung (Monsarrat et al . , 2016). MSCs können zum Beispiel als Zelltherapeutika bei gestörter Funktion oder Unterfunktion der frühgeborenen Lunge eingesetzt werden (van Haaften 2009, Chang 2014). Die Verabreichung exogener MSCs führte zur Interaktion mit dem Lungengewebe und zum „bedarfsgerechten" Sezernieren von Proteinen, kleinen Molekülen und zellulären Bestandteilen (zum Beispiel Exosomen, Mitochondrien) . Die Folge ist ein Schutz der endogenen Lungenzellen sowie eine Stimulierung des Lungenwachstums (Möbius 2016) . Die Verwendung von MSCs als pharmazeutisches Produkt stellt sich jedoch problematisch dar. Keine der bislang in klinischen Studien angewandten MSC-Populationen entsprachen in ihrer Herstellung einem klassischen pharmazeutischen Produkt. Jedes Zellprodukt, jede Charge bzw. jedes Batch ist unterschiedlich und die Ergebnisse der klinischen Studien sind nicht vergleichbar. Gleiches gilt für konventionell hergestellte zellfreie Produkte, z.B. konditioniertes, aufgereinigtes Zellkulturmedium; Exosomen usw.
Zudem stellen MSCs eine inhomogene Zellpopulation dar. Die von einem Spender gewonnenen MSCs differenzieren in Kultur auf Grund verschiedener Faktoren teilweise in therapeutisch inaktive Zellen, zum Teil in transdifferenzierte Zellen und zum Teil in therapeutisch aktive Zellen. Das geerntete und bisher angewandte Zellprodukt ist eine variable Mischung aus therapeutisch aktiven, weniger aktiven bzw. nicht aktiven Zellen .
Nabelschnur MSCs stellen eine Alternative zu den MSCs aus „klassischen" Quellen wie Knochenmark (BM-MSCs)und Fettgewebe (AT-MSCs) dar. Diese klassisch gewonnenen MSCs haben verschiedene Nachteile. So sind BM-MSCs oftmals stark expandierte Zellen älterer Spender. Der Anteil therapeutisch aktiver Zellen sowohl im Ausgangsmaterial als auch im Endprodukt ist gering. Die Isolation von MSCs aus Knochenmark und Fettgewebe ist immer mit einem invasiven Eingriff (Punktion) verbunden. Dem gegenüber weisen MSCs aus Nabelschnur Vorteile auf. Die Nabelschnur ist eine de facto unendliche Quelle von „jungen" MSCs. Bei der Behandlung von Herzinfarkten sind MSCs aus der Nabelschnur den BM-MSCs therapeutisch überlegen (Yannarelli et al . , 2013) .
Ansätze, um MSCs aus bisher verworfenen Geweben zu isolieren (unter anderem Nabelschnurgewebe), existieren (Hass et al . , 2011), weisen aber Probleme auf, welche die breite Anwendung dieser MSCs verhindern. Bisherige Verfahren beruhen entweder auf der graduellen Migration oder dem Auswachsen von MSCs aus kleingeschnittenem Nabelschnurgewebe (Majore et al . , 2011) oder der enzymatischen Dissoziation des mechanisch vorbehandelten Gewebes (Sarugaser et al . , 2005; Tsagias et al . , 2011) .
Keines der konventionell angewandten Verfahren liefert eine ausreichend große Anzahl qualitativ hochwertiger MSCs für klinische Anwendungen, da die Populationsverdopplungsanzahl (population doubling number) der individuellen Zellen zu hoch ist und/oder der Verdau bzw. das nachfolgende Weiterverarbeiten des Zellproduktes nicht mit einer geschlossenen Umgebung vereinbar ist, die dem Standard der „Good Manufacturing Practice" (GMP) gerecht wird.
Die WO 2006/094286 stellt ein Verfahren zur Isolierung von Stromazellen aus Pankreasgewebe bereit. Das Verfahren umfasst sowohl die mechanische Dissoziation als auch einen Enzymverdau des Donorgewebes aus Pankreas. Die isolierten Stromazellen aus dem Pankreas können in vitro zur Differenzierung in komplette oder teilweise differenzierte Pankreaszellen für die Transplantation in einem Patienten induziert werden. Alternativ können die isolierten Stromazellen aus Pankreas direkt in einen Patienten transplantiert werden und in vivo in die gewünschten Zelltypen differenzieren.
EP 2 433 713 stellt ein System zur Verarbeitung und Separation von Proben bereit, das eine Probenverarbeitungseinheit und eine Probentrennungseinheit aufweist. In dem in EP 2 433 713 offenbarten System erfolgt die Trennung der Proben mittels Magnetseparation . Dazu müssen biologische Materialien, wie zum Beispiel Zellen aus verschiedenen Organen und Geweben, mit einem geeigneten spezifischen Bindungsliganden magnetisch markiert werden. WO 2015/170347 offenbart ein Verfahren zur Trennung, Anreicherung und Co-Kultur einer Mischung von fötalen Zellen, die eine oder mehrere verschiedene Arten von mesenchymalen Stammzellen enthält, die aus Plazenta, Amnion, Fruchtwasser, Chorion und Nabelschnur und/oder anderen Produkten der Empfängnis unter hypoxischen oder normoxischen Bedingungen gewonnen wurden und die für die Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen, die von angeborenen über degenerative bis hin zu malignen Erkrankungen reichen, geeignet ist. Die aus dem Stand der Technik bekannten Vorrichtungen und Verfahren sind aber mit dem Nachteil behaftet, dass qualitativ hochwertige MSCs nicht in ausreichender Anzahl für klinische Anwendungen bereit gestellt werden können und dass die hergestellten Chargen von MSCs nicht den Anforderungen an die „Good Manufacturing Practice" (GMP) gerecht werden. Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht deshalb darin, eine Vorrichtung bereitzustellen, die die GMP-konforme Herstellung qualitativ hochwertiger, therapeutisch einsetzbarer
Stammzellen, insbesondere MSCs aus fötalen Geweben für insbesondere regenerative und immunmodulatorische Anwendungen in der Erwachsenen- und Kindermedizin ermöglicht. Weitere Anwendungsmöglichkeiten der isolierten MSCs bestehen in der Tiermedizin, der Arzneimittelentwicklung (MSCs als in vitro Testsystem für pädiatrische oder adulte Medikamente), in der Forschung im Allgemeinen usw. Die erfindungsgemäße Vorrichtung soll insbesondere dazu geeignet sein, die MSCs aus fötalen Geweben GMP-konform und in großen Mengen bereitzustellen.
Fötales Gewebe im Sinne der vorliegenden Erfindung ist Gewebe, welches aus der befruchteten Eizelle und dem daraus entstandenen Embryoblasten plus Trophoblasten hervorgegangen ist, und sich damit vom mütterlichen Gewebe abgrenzt. Fötales Gewebe ist vorzugsweise Gewebe, welches unmittelbar nach der Geburt gewonnen wurde (i) von einem im Mutterleib verstorbenen Fetus (Totgeburt), (ii) vor dem Erreichen der extra-uterinen Lebensfähigkeit geborenen Fetus (Abort) oder (iii) Gewebe, welches von dem Neugeborenen unmittelbar nach der Geburt abgetrennt wird (insbesondere die Eihäute, die Plazenta und die Nabelschnur) .
Die Aufgabe der Erfindung wird gelöst durch Bereitstellung einer Vorrichtung, die die Merkmale gemäß Anspruch 1 aufweist. Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben weist insbesondere
• eine Inkubationskammer,
• mindestens eine Pumpe,
• mindestens einen Vorratsbehälter für eine GewebeaufSchlusslösung,
• mindestens einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung,
• optional eine Steuereinheit,
• optional ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen, beispielsweise in einem Dichtegradienten, und
• optional ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen auf. Die erfindungsgemäße Vorrichtung hat den Vorteil, dass, verglichen zu herkömmlich verwendeten Vorrichtungen, die Isolation von Stammzellen, insbesondere MSCs, in einer deutlich höheren Ausbeute von Stammzellen, insbesondere primären MSCs resultiert. Besonders vorteilhaft ist die Vorrichtung für die Isolierung von primären MSCs aus der Nabelschnur. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung können Ausbeuten, die um einen Faktor >10 gegenüber herkömmlich verwendeten Vorrichtungen erhöht sind, erreicht werden. Resultierend daraus kann in einer kürzeren Expansionsphase ein preiswerteres sowohl quantitativ als auch qualitativ höherwertiges Zellprodukt generiert werden.
Der Inkubationsbehälter besteht vorzugsweise aus einem Material, das sterilisierbar, insbesondere autoklavierbar ist. Geeignete Materialien zum Beispiel Glas, Edelstahl oder autoklavierbare Kunststoffe. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Inkubationskammer ein heizbarer Behälter. Dies hat den Vorteil, dass der Aufschluss der fötalen Gewebe, der enzymatisch erfolgen kann, bei für die verwendeten Enzyme optimalen Temperaturen durchgeführt werden kann. Die Temperatur in der Inkubationskammer wird beispielsweise auf einen Bereich von 30 °C bis 42 °C eingestellt, vorzugsweise auf einen Bereich zwischen 35 °C und 40 °C. Insbesondere bevorzugt ist es, wenn die Temperatur in der Inkubationskammer auf eine Temperatur von 37 °C eingestellt wird. Diese Temperatur stellt die optimale Temperatur für Enzyme in der Gewebeaufschlusslösung dar, die humanen Ursprungs sind. Die Temperatur in der Inkubationskammer kann mittels eines Thermostaten, einem Temperaturfühler oder Temperatursensor, der beispielsweise mit der Steuereinheit verbunden ist, geregelt werden. Das Temperieren des Inhalts der Inkubationskammer kann auch extern mit Hilfe einer elektrischen Heizplatte erfolgen. Denkbar ist, dass die Inkubationskammer 11 doppelwandig gestaltet ist, so dass das Erwärmen des Inhalts der Inkubationskammer mittels eines flüssigen Mediums, wie zum Beispiel Wasser, und eines Thermostaten erfolgen kann. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Temperatur in der Inkubationskammer mittels eines Peltier-Elements , welches mit einer sterilisierbaren oder Einweg-Umhüllung versehen ist, regelbar ist. In einer anderen Ausführungsform kann die Inkubationskammer auch ein nichtheizbarer Behälter sein.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Inkubationskammer eine pH-Sonde enthalten. Vorzugsweise ist die pH-Sonde mit der Steuereinheit verbunden, so dass Signale der pH-Sonde in der Steuereinheit verarbeitet werden können und dadurch Zeitpunkt und Menge der Zugabe der Spüllösung in die Inkubationskammer gesteuert werden können. Zusätzlich ermöglicht diese Ausführungsform auch die Steuerung der Zugabe weiterer Lösungen, wie etwa die Zugabe einer Waschlösung und/oder weiterer Enzymlösungen zu einem oder mehreren bestimmten Zeitpunkten . Die Inkubationskammer ist vorzugsweise so ausgestaltet, dass es möglich ist, in der Inkubationskammer eine Atmosphäre zu erzeugen, in der der Sauerstoffgehalt abgereichert ist. Dabei wird der Sauerstoffgehalt in der Atmosphäre der Inkubationskammer auf einen Anteil im Bereich von 2-21%, vorzugsweise 2-15% oder 2-10%, besonders bevorzugt von 2-5% eingestellt. Hierfür kann die Inkubationskammer weitere Anschlüsse aufweisen, die es ermöglichen, einen Gasaustausch der Atmosphäre des Inkubationsbehälters durchzuführen. In einer weiteren Ausführungsform enthält die Inkubationskammer ein Mittel zur Zerkleinerung des fötalen Gewebes. Das Mittel zur Zerkleinerung wird dazu benutzt, das fötale Gewebe, aus dem die Stammzellen, vorzugsweise MSCs, isoliert werden sollen, mechanisch aufzuschließen bzw. zu dissoziieren. Dies resultiert in einer
Oberflächenvergrößerung des fötalen Gewebes, was wiederum einen sich anschließenden enzymatischen Aufschluss des fötalen Gewebes erleichtert, da der Zugang der verwendeten Enzyme zu dem aufzuschließenden Gewebe verbessert wird. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel zur Zerkleinerung des fötalen Gewebes ein mechanisches Mittel, zum Beispiel ein Schneidgerät. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Mittel zur Zerkleinerung des fötalen Gewebes ein rotierendes Messersystem. Mit dem in der Inkubationskammer enthaltenen Mittel zur Zerkleinerung ist es möglich, die mechanische Zerkleinerung des fötalen Gewebes automatisiert durchzuführen. Vorteile dieser Ausgestaltung sind eine Erhöhung der Ausbeute an den zu isolierenden Stammzellen, insbesondere primären MSCs, sowie die Vermeidung bzw. Minimierung von Kontaminationen. Ein weiterer Vorteil dieser Ausgestaltung besteht darin, dass die
Reproduzierbarkeit der Isolierung von Stammzellen, insbesondere von primären MSCs, aus fötalen Geweben verbessert werden kann. Durch die automatisierte mechanische Zerkleinerung wird außerdem die GMP-Konformität der erfindungsgemäßen Vorrichtung sowie eines Verfahrens zur Isolierung von Stammzellen, das mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wird, verbessert. Die Inkubationskammer enthält in einer weiteren Ausführungsform ein Mittel zum Durchmischen der Gewebeaufschlusssuspension, vorzugsweise ein Mittel zum Rühren der Gewebeaufschlusssuspension, insbesondere bevorzugt einen Rührer oder Rotor. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Durchmischen der
Gewebeaufschlusssuspension mit dem rotierenden Messersystem erreicht, das zur mechanischen Dissoziation des Gewebes benutzt wird. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Gewebeaufschlusssuspension mit Hilfe des rotierenden Messersystems in der Inkubationskammer kontinuierlich gerührt. Dadurch kann erreicht werden, dass die Substrat zugänglichkeit der zum Gewebeaufschluss eingesetzten Enzyme jederzeit gewährleistet ist.
In einer weiteren Ausführungsform weist die Inkubationskammer Öffnungen / Anschlüsse für Leitungen und Schläuche auf. Vorzugsweise weist die Inkubationskammer mindestens zwei Öffnungen für Anschlüsse und Leitungen auf. Die Inkubationskammer kann auch noch weitere, das heißt mehr als zwei Öffnungen / Anschlüsse für Leitungen und Schläuche aufweisen.
In einer Ausführungsform der Erfindung können über die Öffnungen / Anschlüsse eine Gewebeaufschlusslösung und/oder eine Spüllösung in die Inkubationskammer gegeben werden.
Die Gewebeaufschlusslösung enthält vorzugsweise ein Enzymgemisch, bevorzugt ein Gemisch von Enzymen, besonders bevorzugt Enzyme eukaryotischen Ursprungs, insbesondere bevorzugt Enzyme, die frei von potentiellen Kontaminationen durch tierische Produkte (sog. „animal origin free" (AoF) Enzyme bzw. Produkte) sind. Solche AoF-Enzyme können zum Beispiel als chromatographisch aufgereinigtes
Fermentationsprodukt aus, beispielsweise gentechnisch veränderten Mikroorganismen, industriell gewonnen werden. Ganz besonders bevorzugt sind rekombinante Enzyme humanen Ursprungs . Vorzugsweise wird der enzymatische Verdau mit einem Enzymgemisch durchgeführt, wobei die Zusammensetzung des Enzymgemisches speziell an die extrazelluläre Matrixzusammensetzung des fötalen Gewebes angepasst ist. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Zusammensetzung des Enzymgemisches speziell an die extrazelluläre
Matrixzusammensetzung von Nabelschnurgewebe angepasst ist. Insbesondere bevorzugt ist es, wenn die Gewebeaufschlusslösung ein Gemisch aus den Enzymen Hyaluronidase und/oder neutraler Protease und/oder Collagenase und/oder DNAse enthält.
Ganz besonders bevorzugt ist es, wenn die Gewebeaufschlusslösung ein Enzymgemisch aus Collagenase, Hyaluronidase und einer DNAse aufweist. Ebenfalls ganz besonders bevorzugt ist es, wenn die Gewebeaufschlusslösung ein Enzymgemisch aus Collagenase, neutraler Protease und einer DNAse enthält.
Die in der Gewebeaufschlusslösung verwendete DNAse ist vorzugsweise DNAse I, zum Beispiel Pulmozyme (Roche Diagnostics ) . Die in der Gewebeaufschlusslösung verwendete DNAse dient der Viskositätsminderung, was zu einer optimalen Separation von Zielzellen (beispielsweise primären MSCs) und Verunreinigungen in einer nachfolgenden
Dichtegradiententrennung führt. Besonders bevorzugt ist es, wenn in der Gewebeaufschlusslösung Enzyme eingesetzt werden, die frei von tierischen Verunreinigungen sind. Die in der Gewebeaufschlusslösung verwendete Collagenase ist zum Beispiel Collagenase NB IV/VI (SERVA Electrophoresis ) .
Weitere Bestandteile der Gewebeaufschlusslösung sind chemisch definierte Pufferlösungen oder chemisch definierte Kulturmedien, wie beispielsweise Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) oder Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) . Diese können zusätzlich mit spezifischen Salzen und chemisch definierten Stoffen (Cofaktoren bzw. Cosubstraten) versetzt sein, um in ihrer Zusammensetzung den enzymatischen Verdau bestmöglich zu unterstützen und die einzusetzende Enzymmenge so gering wie möglich zu halten. Weiterhin sollten Substrate für den aeroben oder anaeroben Stoffwechsel der Zellen enthalten sein, bevorzugt Glucose oder Natrium-Pyruvat. Die Pufferlösung sollte bevorzugt ein C02~unabhängiges Puffersystem enthalten (z.B. HEPES oder Natriumbiphosphat ) .
In einer alternativen Ausführungsform könnten auch normale, bereits GMP-konforme (C02-gepufferte) Medien, wie DMEM, verwendet werden. In dieser alternativen Ausführungsform ist allerdings die Kontrolle der CO2 Konzentration in der Inkubationskammer zusätzlich zur Kontrolle der O2 Konzentration notwendig. Die Spüllösung dient der Neutralisation bzw. dem Umpuffern sowie der Viskositätsverringerung der Zellsuspension nach mechanischer Zerkleinerung und nach dem enzymatischen Gewebeverdau. Die Spüllösung ist vorzugsweise eine chemisch definierte Pufferlösung oder ein chemisch definiertes Kulturmedium, wie beispielsweise Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) oder Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) .
In einer weiteren Ausführungsform weist die Inkubationskammer mindestens einen Auslass auf. Die Inkubationskammer kann auch mehrere Auslässe aufweisen. Der mindestens eine Auslass dient dazu, die nach der mechanischen Dissoziation und dem enzymatischen Verdau erhaltene Gewebeaufschlusssuspension in andere Behälter oder andere Bestandteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu übertragen.
Solch ein weiterer Bestandteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann zum Beispiel ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung deshalb eine Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben bereit, wobei die Vorrichtung
- eine Inkubationskammer,
- mindestens eine Pumpe,
- einen Vorratsbehälter für eine Gewebeaufschlusslösung,
- einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung,
- optional eine Steuereinheit,
- ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten, und
- optional ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen
aufweist . Das Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten kann zum Beispiel eine Zentrifuge sein. Geeignet hierfür ist jeder herkömmliche Typ von Zentrifugen, die dazu geeignet sind, eine Dichtegradientenzentrifugation durchzuführen. Vorzugsweise wird die
Dichtegradientenzentrifugation unter Verwendung eines Saccharose-Epichlorhydrin-Copolymers durchgeführt, das Beispielsweise unter dem Markennamen Ficoll®, Histopaque® oder Polysucrose® erhältlich ist. Diese Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung hat den Vorteil, dass für die spätere Expansion eine sehr homogene Ausgangspopulation an Stammzellen, insbesondere primären MSCs, bereitgestellt werden kann, da Verunreinigungen, wie Endothelzellen, Epithelzellen und Blutzellen in der
Dichtegradientenzentrifugation abgetrennt werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Vorrichtung kein Mittel zur Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten auf.
In einer weiteren Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Vorrichtung ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen, insbesondere von primären MSCs auf.
Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung wird deshalb eine Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben bereitgestellt, wobei die Vorrichtung
- eine Inkubationskammer,
- mindestens eine Pumpe,
- mindestens einen Vorratsbehälter für eine GewebeaufSchlusslösung,
- mindestens einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung,
- optional eine Steuereinheit, - optional ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten, und
- ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen aufweist .
Das Mittel zur Expansion der Stammzellen, insbesondere primären MSCs kann beispielsweise ein Mittel zur Adhärenzanreicherung sein. Solch ein Mittel zur Adhärenzanreicherung stellt typischerweise eine Kulturoberfläche für die isolierten Zellen bereit, auf der die isolierten Zellen aufwachsen und sich vermehren können. Vorzugsweise ist diese Kulturoberfläche eine
KunststoffOberfläche . Ein Mittel zur Adhärenzanreicherung ist zum Beispiel das HYPERStack® System (Corning) . Alternativ kann die Adhärenzanreicherung der isolieren Zellen in einem Bioreaktor erfolgen, wobei der Bioreaktor Kügelchen (Beads) enthält und die Kulturoberfläche für die isolierten Zellen von den Kügelchen bereitgestellt wird. Vorzugsweise wird die Adhärenzanreicherung der isolierten Zellen in selektiven Medien für Stammzellen, insbesondere primäre MSCs, durchgeführt. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Expansion der isolierten Stammzellen, insbesondere primäre MSCs, in einem Kulturmedium durchgeführt wird, das Zusatzstoffe enthält, die spezifisch das Wachstum von Stammzellen, insbesondere der primären MSCs, unterstützen. Das Kulturmedium für die Expansion der isolierten Stammzellen ist außerdem vorzugsweise chemisch definiert, frei von potentiellen Kontaminationen durch tierische Produkte (AoF) und GMP- konform. Solche Zusatzstoffe können beispielsweise humanes Blutplättchen-reiches Plasma oder humanes Blutplättchenlysat sein . Das Mittel zur Adhärenzanreicherung der isolierten Stammzellen, insbesondere der isolierten primären MSCs, ist vorzugsweise mit einem Schlauch mit dem Auslass der Inkubationskammer für den Gewebeaufschluss verbunden. Vorzugsweise erfolgt also die Verbindung des HYPERStack® Systems mit dem Inkubationsbehälter über einen Schlauch. Durch diese Ausgestaltung kann sichergestellt werden, dass der Aufschluss von fötalen Geweben bis hin zur Expansion der isolierten Zellen in einem geschlossenen System erfolgen kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind auch der Vorratsbehälter für die Gewebeaufschlusslösung und/oder der Vorratsbehälter für die Spüllösungen mittels Schläuchen über Öffnungen / Anschlüsse mit dem Inkubationsbehälter verbindbar.
Die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthaltene mindestens ein Pumpe, vorzugsweise zwei, drei oder mehr Pumpen, je nach den Anforderungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung, können jede Art von herkömmlich erhältlichen Pumpen sein. Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthaltenen Pumpen Peristaltikpumpen sind. Besonders bevorzugt ist es also, wenn die Gewebeaufschlusslösung aus dem entsprechenden Vorratsbehälter und/oder die Spüllösung aus dem entsprechenden Vorratsbehälter mittels je einer separaten Peristaltikpumpe in den Inkubationsbehälter eingefüllt werden können. Ebenso bevorzugt ist es, wenn die Gewebeaufschlusssuspension nach erfolgter mechanischer Zerkleinerung und enzymatischem Verdau mittels einer Peristaltikpumpe in entweder das nachgelagerte Mittel zur Abtrennung von Verunreinigungen im Dichtegradienten, zum Beispiel eine
Dichtegradientenzentrifuge, und/oder in das nachfolgende Mittel zur Adhärenzanreicherung, zum Beispiel ein HYPERStack® Gefäß oder einen Bead-basierten Bioreaktor übertragen werden können. Diese Ausgestaltung hat den Vorteil, dass die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthaltenen Pumpen keinen direkten Kontakt mit den in der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthaltenen Flüssigkeiten haben. Damit wird sichergestellt, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung ein komplett geschlossenes System zur Isolierung von Stammzellen, insbesondere primären MSCs, darstellt.
Die Dichtegradientenzentrifuge kann beispielsweise nach dem Prinzip einer Peeler-Zentrifuge arbeiten oder kann eine kontinuierlich laufende Zentrifuge sein (z.B. eine modifizierte, langsam laufende CEPA-Zentrifuge, Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH) . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die erfindungsgemäße Vorrichtung also ein geschlossenes System dar .
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Vorrichtung als geschlossenes System desinfizierbar oder sterilisierbar, zum Beispiel autoklavierbar .
In einer alternativen Ausführungsform ist die Vorrichtung ganz oder teilweise als prästerilisiertes Einwegsystem zur einmaligen Verwendung ausgestaltet. Insbesondere die Schläuche und Vorratsbehälter, gegebenenfalls auch die Inkubationskammer, und das HYPERStack® System sind dazu geeignet, als prästerilisiertes Einwegsystem ausgestaltet zu sein . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass sie keine Mittel zur Magnetseparation von Zielzellen (Stammzellen, insbesondere MSCs) und Verunreinigungen, wie zum Beispiel Endothelzellen, Blutzellen oder Epithelzellen, enthält.
In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben ein geschlossenes System, dass
- eine Inkubationskammer,
- einen Vorratsbehälter für eine Gewebeaufschlusslösung,
- eine Pumpe, insbesondere eine Peristaltikpumpe, zur Übertragung der Gewebeaufschlusslösung in die Inkubationskammer ,
- einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung,
- eine Pumpe, insbesondere eine Peristaltikpumpe, für die
Übertragung der Spüllösung in die Inkubationskammer,
- ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten, vorzugsweise eine Dichtegradientenzentrifuge,
- und/oder ein Mittel zur Expansion der isolierten
Stammzellen
umfasst, wobei diese als geschlossenes System ausgeführte Vorrichtung sterilisierbar, vorzugsweise autoklavierbar , ist, oder alternativ teilweise als prästerilisiertes Einwegsystem zur einmaligen Verwendung ausgestaltet ist. In dieser Ausführungsform sind der Vorratsbehälter für die Gewebeaufschlusslösung, der Vorratsbehälter für die Spüllösung und das Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen im Dichtegradienten und/oder das Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen über autoklavierbare Schläuche oder vorzugsweise über Einwegschläuche mit der Inkubationskammer verbunden.
Diese Ausgestaltung als geschlossenes System hat zahlreiche Vorteile. Die Zellernte und Zellausbeute ist im Vergleich zu herkömmlichen, offenen Systemen und Verfahren (SERVA, Miltenyi Biotec) deutlich verbessert. Mit diesem geschlossenen System kann ein geschlossenes und automatisiertes
Isolationsverfahren der Stammzellen, insbesondere primären MSCs, durchgeführt werden. Manuelle Tätigkeiten an diesem geschlossenen System können auf ein Minimum reduziert werden. Im Falle der Isolierung von primären MSCs wird eine sehr hohe initiale Menge an MSCs durch einen besonders effizienten Gewebeverdau, insbesondere bei Verwendung von Nabelschnurgewebe, erzielt. Das so gestaltete komplett geschlossene System ermöglicht außerdem den Einsatz bzw. Anschluss eines ebenfalls geschlossenen Systems zur Expansion der Zellen (beispielsweise HYPERStack®, Corning) . Da auf Grund der Geschlossenheit des Systems jeglicher Kontakt der Anwender mit den isolierten Zellen vermieden werden kann, ist das Risiko der Kontamination stark reduziert. Letztlich ist die erfindungsgemäße Vorrichtung, insbesondere wenn sie als geschlossenes System ausgeführt ist, besonders vorteilhaft, da sie hohe Mengen an jungen, gering expandierten Zellen für klinische Anwendungen bereitstellen kann. Optional kann die erfindungsgemäße Vorrichtung weiterhin eine Steuereinheit enthalten. Diese Steuereinheit ist optional von der erfindungsgemäßen Vorrichtung abkoppelbar, insbesondere wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung als geschlossenes System desinfiziert oder sterilisiert, wie zum Beispiel autoklaviert , werden soll oder als geschlossenes System mit teilweise sterilisierbaren Komponenten (Isolationskammer,
Zerkleinerungseinrichtung usw. ) und teilweise als Einweg- Produkt ausgeführten Komponenten, wie zum Beispiel Schläuchen und Beutelsystemen, die steril vor Beginn der Isolation der MSCs zu einem geschlossenen System verbunden werden können, verwendet werden soll.
Die Steuereinheit kann ein Prozessrechner sein oder ein konventionell erhältliches Computersystem, wie zum Beispiel ein Laptop oder ein Personalcomputer. Es ist auch möglich, dass die Steuereinheit ein Smartphone oder ein Tablet-Computer ist. In diesem Fall ist die Steuereinheit vorzugsweise drahtlos (zum Beispiel über WLAN oder Bluetooth®) mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung verbunden. Die Steuereinheit dient dazu, alle notwendigen Prozesse in der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu steuern und zu regeln, bzw. die einzelnen Komponenten der erfindungsgemäßen Vorrichtung anzusteuern. So kann mittels der Steuereinheit, vorzugsweise mittels einer auf der Steuereinheit installierten Prozesssoftware, die Drehzahl des rotierenden Messersystems für die mechanische Dissoziation des fötalen Gewebes geregelt werden. Das rotierende Messersystem arbeitet beispielweise bei einer Drehzahl im Bereich von 1.000 bis 10.000 min-1, vorzugsweise im Bereich von 1.000 bis 9.000 min-1, 1.000 bis 8.000 min-1, 1.000 bis 7.000 min-1, 1.000 bis 6.000 min-1, 1.500 bis 5.000 min-1 oder 1.500 bis 4.000 min-1, besonders bevorzugt im Bereich von 2.000 bis 3.000 min-1. Mit der Steuereinheit kann außerdem die Temperatur in der Inkubationskammer während des Gewebeaufschlusses gesteuert werden. Die Steuereinheit kann auch die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthaltenen Pumpen ansteuern. So ist es zum Beispiel möglich, dass Zeitpunkt und Menge der Zugabe der Gewebeaufschlusslösung aus dem entsprechenden Vorratsbehälter bzw. Zeitpunkt und Menge der Zugabe der Spüllösung durch die Steuereinheit geregelt werden. Auch die Pumpen, die die Gewebeaufschlusssuspension nach mechanischer Dissoziation und enzymatischem Verdau in eine nachfolgende Dichtegradientenzentrifuge und/oder ein Mittel zur Expansion der isolierten Stammzellen befördern, können mittels der Steuereinheit gesteuert bzw. geregelt werden.
Das fötale Gewebe, das mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung verarbeitet werden kann, ist beispielsweise ausgewählt aus Nabelschnurgewebe, Plazentagewebe, fötalem Lungengewebe usw. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung fötales Gewebe aus Nabelschnur verarbeitet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die Stammzellen, die mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung isoliert werden können, mesenchymale Stammzellen, wie zum Beispiel mesenchymale Stammzellen, die aus den zuvor genannten Geweben isoliert werden können. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den mesenchymalen Stammzellen um MSCs aus Nabelschnurgewebe. Die Isolierung der Stammzellen aus fötalen Geweben mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann im Batch-Verfahren oder in kontinuierlichen Verfahren erfolgen. Vorzugsweise wird die Isolierung der Stammzellen, insbesondere von MSCs, mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Batch-Verfahren durchgeführt, wobei pro Batch jeweils eine ganze Nabelschnur als Ausgangsprodukt für die Isolierung der Stammzellen eingesetzt wird. Ein Produktbatch (isolierte und/oder expandierte Stammzellen) besteht dann jeweils aus den Stammzellen, insbesondere primären MSCs, die aus einer Nabelschnur isoliert wurden und ggf. danach expandiert worden sind.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus anderen fötalen und/oder adulten Geweben.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Isolierung von Stammzellen aus fötalem Gewebe bereit, das speziell an die erfindungsgemäße Vorrichtung, und insbesondere deren Ausführung als geschlossenes System, adaptiert ist.
In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von Stammzellen, insbesondere primären MSCs aus fötalem Gewebe folgende Schritte:
a. mechanische Dissoziation des fötalen Gewebes, b. enzymatischer Verdau des fötalen Gewebes,
c. optional Dichtegradientenzentrifugation zur Abtrennung von Verunreinigungen, und
d. optional Expansion der isolierten Stammzellen,
insbesondere der primären MSCs. Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die mechanische Dissoziation und der enzymatische Verdau gleichzeitig in der Inkubationskammer der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden können.
Zum enzymatischen Verdau des fötalen Gewebes kommt vorzugsweise ein Enzymgemisch zum Einsatz, das bereits oben für die erfindungsgemäße Vorrichtung beschrieben worden ist. Vorzugsweise wird bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Inkubationskammer der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Mischung zum enzymatischen Verdau kontinuierlich gerührt und/oder erwärmt. In einer weiteren Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren in einer Sauerstoff-abgereicherten Atmosphäre, die beispielsweise eine Sauerstoffkonzentration im Bereich von 2- 21%, vorzugsweise 2-15% oder 2-10%, besonders bevorzugt von 2-5% enthält, durchgeführt. Dadurch kann oxidativer Stress für die normalerweise in hypoxischen Kompartimenten residierenden Stammzellen, insbesondere primäre MSCs, die isoliert werden sollen, vermieden werden. Dadurch kann die Qualität des Zellprodukts nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens deutlich erhöht werden. Bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Isolation spezieller Zellen, wie z.B. adulter Lungenzellen, ist es vorteilhaft, die Sauerstoffkonzentration in der Atmosphäre der
Inkubationskammer auf 21% einzustellen. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren nach der Expansion der Stammzellen weiterhin das Ernten des Kulturüberstands. Der Kulturüberstand kann nachfolgend verarbeitet und als therapeutisches zellfreies Produkt verwendet werden. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es möglich, dass das so erhaltene Produkt (Kulturüberstand) mittels herkömmlicher Filtrations- und Dialysetechniken inline konzentriert wird. Dies hat den Vorteil, dass mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren auch zellfreie Produkte, z.B. konditioniertes, aufgereinigtes
Zellkulturmedium; Exosomen usw. GMP-konform hergestellt werden können.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren auch das Ernten der Stammzellen, insbesondere der primären MSCs .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Isolierung von Stammzellen aus fötalem Gewebe die Schritte
a. Entnehmen einer Probe aus fötalem Gewebe,
b . mechanische Dissoziation des fötalen Gewebes,
c. enzymatischer Verdau des fötalen Gewebes,
d. optional Dichtegradientenzentrifugation zur Abtrennung von Verunreinigungen, und
e. optional Expansion der isolierten Stammzellen,
f. optional inline Konzentrierung des Kulturüberstands nach der Ernte der expandierten Zellen
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von drei Figuren und einem Ausführungsbeispiel erläutert. Figur 1 zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung 10 als geschlossenes System. Die Vorrichtung umfasst eine Inkubationskammer 11 mit Deckel 28, einen Vorratsbehälter für die Gewebeaufschlusslösung 12 und einen Vorratsbehälter für die Spüllösung 13. Die Vorratsbehälter für die Gewebeaufschlusslösung 12 und die Spüllösung 13 sind jeweils über Schläuche 20 und die Anschlüsse 16 und 17 mit der Inkubationskammer 11 verbunden. Die Gewebeaufschlusslösung kann mittels der Peristaltikpumpe 14 aus dem Vorratsbehälter 12 in die Inkubationskammer 11 befördert werden. Die Spüllösung kann aus dem Vorratsbehälter 13 mittels der Peristaltikpumpe 15 in die Inkubationskammer 11 eingefüllt werden. Die Inkubationskammer 11 enthält ein rotierendes Schneidmesser 21 zur mechanischen Dissoziation des fötalen Gewebes. Die Temperatur in der Inkubationskammer 11 kann mittels eines elektrischen Heizstabes 24 und einem Temperatursensor 23 geregelt werden. Alternativ kann die Temperatur in der Inkubationskammer auch mittels eines Peltier-Elements , welches mit einer sterilisierbaren oder Einweg-Umhüllung versehen ist, geregelt werden. Der pH-Wert der Gewebeaufschlusslösung in der Inkubationskammer 11 kann mittels der optionalen pH-Sonde 22 überwacht werden. Die Inkubationskammer 11 verfügt weiterhin über einen Auslass 18 der über Schläuche 20 mit einem HYPERStack® System der Fa. Corning zur nachfolgenden adhärenten Zellexpansion verbunden ist. Nach erfolgter mechanischer Dissoziation und enzymatischem Verdau kann die Gewebeaufschlusssuspension mittels der Peristaltikpumpe 19 aus der Inkubationskammer 11 in das HYPERStack® System 25 überführt werden. Die Vorrichtung 10 kann mit einem Smartphone oder Tablet-PC 29 als Steuereinheit gesteuert werden. Diese Steuereinheit kann beispielsweise drahtlos mit der Vorrichtung 10 verbunden sein.
Die Figur 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung, die, wie in Figur 1, als geschlossenes System ausgeführt ist. Im Unterschied zu der Ausführungsform in Figur 1 enthält die Vorrichtung gemäß Figur 2 eine Dichtegradientenzentrifuge 26 anstelle des HYPERStack® Systems 25. Alternativ kann die erfindungsgemäße Vorrichtung auch eine Dichtegradientenzentrifuge 26 und ein HYPERStack® Systems 25 enthalten .
Figur 3 zeigt eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung als geschlossenes System, wie in Figur 1 gezeigt. Im Unterschied zu Figur 1 wird die Temperatur in der Inkubationskammer 11 mittels einer Heizplatte 27 anstelle eines elektrischen Heizstabes 24 eingestellt. Alternativ kann die Temperatur in der Inkubationskammer auch mittels eines Peltier-Elements , welches mit einer sterilisierbaren oder Einweg-Umhüllung versehen ist, geregelt werden.
Die Vorrichtung 10 kann mit einem PC 30 als Steuereinheit gesteuert werden, wobei PC 30 und Vorrichtung 10 beispielsweise über das Kabel 31 kabelgebunden sind.
Ausführungsbeispiel: Isolation eines Batches primärer MSCs aus einer Nabelschnur Ein Batch MSCs wurde aus einer Nabelschnur mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem Verfahren gemäß der Erfindung gewonnen. Dazu erfolgte zunächst die kontrollierte Lagerung der Nabelschnur bis zum Transport zur erfindungsgemäßen Vorrichtung 10. Die Lagerung erfolgte bei einer Temperatur von 4°C und in einem spezifischen Medium, dass zusammengesetzt war aus einer Citrat-Phosphat-Dextrose- Adenin Lösung (CPDA1) und PBS (CDPA1/PBS) .
Der Transport zur erfindungsgemäßen Vorrichtung 10 erfolgte ebenfalls unter kontrollierten Bedingungen bei einer Temperatur von 4°C im Medium CPDA1/PBS.
Die Isolation der MSCs aus der Nabelschnur wurde dann in der erfindungsgemäßen Vorrichtung 10 durchgeführt. Dazu wurde die ganze Nabelschnur in den Inkubationsbehälter 11 gegeben, der mit dem Deckel 28 verschlos sen wurde. Die gesamte Vorrichtung 10 wurde vor der Durchführung der MSC-Isolation sterilisiert. Der mechanische Aufschluss der Nabelschnur erfolgte nach Schließen des Deckels 28 in der Inkubationskammer 11 mittels dem rotierenden Messersystem 21 automatisch.
Anschließend erfolgte die enzymatische Dissoziation mit einem AoF-Enzymgemisch, das rekombinante Collagenase, Hyaluronidase und DNAse eukaryotischen Ursprungs enthielt. Bei der DNAse handelte es sich um Pulmozyme (Roche Diagnostics) . Bei der verwendeten Collagenase handelte es sich um Collagenase NB IV/VI (SERVA Electrophoresis ) . Die Gewebeaufschlusslösung (50 ml) enthielt weiterhin Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) . In der Gewebeaufschlusslösung waren außerdem Glukose und HEPES enthalten. Die Gewebeaufschlusslösung wurde aus dem Vorratsbehälter 12 mittels Peristaltikpumpe 14 über den Einlass 16 in die Inkubationskammer 11 eingebracht. Nach der enzymatischen Dissoziation, die für 3 h durchgeführt wurde, erfolgte eine Dichtegradientenseparation in einer CEPA- Zentrifuge (Carl Padberg, Zentrifugenbau GmbH) 26. Hierzu wurde die Inkubationskammer 11 zunächst durch Einleiten von 50 ml Spüllösung (Dulbeccoo's Phosphate Buffered Saline (PBS)) aus dem Vorratsbehälter 13 mittels der Peristaltikpumpe 15 gespült. Über den Auslass 18 und mittels der Peristaltikpumpe 19 wurde die Gewebeaufschlusslösung dann über die Schläuche 20 in die Dichtegradientenzentrifuge 26 übertragen. Die Dichtegradientenzentrifugation wurde unter Verwendung von Ficol® Röhrchen durchgeführt. Nach Durchführung der Dichtegradientenseparation erfolgte die Übertragung und Aussaat der Primärkultur in ein geschlossenes Zellkultursystem der Firma HYPERStack® (Corning) 25. Die Ausbeute vor Expansion der Zielzellen betrug ca. 1 x 106 Zellen pro Nabelschnur. Die anschließende Zellexpansion, notwendige Medienwechsel und die Zellernte erfolgte mit AoF-Reagenzien in dem geschlossenen System der Vorrichtung 10. Es waren insgesamt nur zwei Passagen nötig, um eine Zielzellzahl von 1 x 109 Zellen zu erreichen. Nach der Zellernte erfolgte die Kryokonservierung. Zur Qualitätsprüfung wurden eine Sterilitätsprüfung, eine FACS-Analyse und ein Wirksamkeitstest (Potency-Assay ) durchgeführt .
Die Zielzellen des so aufgebarbeiteten MSC-Batches tragen die Oberflächenmarker CD73, CD90 und CD105, tragen aber nicht die Oberflächenmarker CD14, CD34 und CD45. Mit der mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung 10 durchgeführten Aufreinigung eines Batches MSCs aus einer Nabelschnur konnte eine Reinheit von größer als 95 % der Zielzellen erreicht werden, die die Oberflächenmarker CD73, CD90 und CD105 tragen. Weniger als 2 % der aufgereinigten Zellen trugen die unterwünschten Marker CD14, CD34 und CD45.
Die nachfolgende Tabelle veranschaulicht den
Herstellungsprozess eines Batches MSCs aus Nabelschnurgewebe unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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Bezugszeichenliste
10 Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben
11 Inkubationskammer
12 Vorratsbehälter für Gewebeaufschlusslösung
13 Vorratsbehälter für Spüllösung
14 Peristaltikpumpe zum Pumpen der Gewebeaufschlusslösung
15 Peristaltikpumpe zum Pumpen der Spüllösung
16 Anschluss für die Gewebeaufschlusslösung
17 Anschluss für die Spüllösung
18 Auslass
19 Peristaltikpumpe zum Pumpen der Gewebeaufschluss¬ suspension
20 Schläuche
21 rotierendes Messersystem
22 pH-Sonde
23 Temperatursensor
24 elektrischer Heizstab oder Peltier-Element
25 HYPERStack® System
26 Dichtegradientenzentrifuge
27 elektrische Heizplatte
28 Deckel
29 Smartphone, Tablet-PC
30 PC
31 Kabel Referenzen
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Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur Isolierung von Stammzellen aus fötalen Geweben, dadurch charakterisiert, dass die Vorrichtung
- eine Inkubationskammer,
- mindestens eine Pumpe,
- mindestens einen Vorratsbehälter für eine Gewebeauf schlusslösung,
- mindestens einen Vorratsbehälter für eine Spüllösung,
- optional eine Steuereinheit,
- optional ein Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen, beispielsweise in einem Dichtegradienten, und
- optional ein Mittel zur Expansion der isolierten
Stammzellen
aufweist .
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationskammer ein heizbarer oder ein nicht heizbarer
Behälter ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationskammer ein Mittel zur Zerkleinerung des fetalen Gewebes aufweist.
4. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Zerkleinerung des fetalen Gewebes ein Schneidgerät, zum Beispiel ein rotierendes Messersystem, ist.
5. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet dass Mittel für die Abtrennung von Verunreinigungen in einem Dichtegradienten eine Zentrifuge ist.
6. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationskammer Öffnungen/Anschlüsse für Leitungen und Schläuche aufweist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass über die Öffnungen/Anschlüsse die Gewebeaufschlusslösung und/oder die Spüllösung in die Inkubationskammer gegeben werden können .
8. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubationskammer mindestens einen Auslass aufweist.
9. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeaufschlusssuspension über den Auslass in andere Behälter übertragen werden kann.
10. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein geschlossenes
System darstellt, das optional sterilisierbar ist.
11. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Pumpe eine Peristalt ikpumpe ist.
12. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Vorratsbehälter für die Gewebeaufschlusslösung und/oder der Vorratsbehälter für die Spüllösung über die Öffnungen/Anschlüsse durch Schläuche mit dem Inkubationsbehälter verbunden sind.
13. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Auslass durch Schläuche mit dem Mittel für die Expansion der isolierten Zellen verbunden ist.
14. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung weiterhin ein Mittel zur inline-Konzentrierung des Kulturüberstand nach dem Ernten der expandierten Zellen enthält.
15. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das fötale Gewebe ausgewählt ist aus Nabelschnurgewebe, Plazentagewebe, Gewebe aus den Eihäuten und fötalem Lungengewebe.
16. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das fötale Gewebe mindestens eine ganze Nabelschnur ist.
17. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen mesenchymale
Stammzellen sind.
18. Verwendung der Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 zur Isolierung von Stammzellen, insbesondere mesenchymalen Stammzellen, aus fötalem Gewebe.
19. Verfahren zur Isolierung von Stammzellen aus fötalem Gewebe, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Schritte
a. Entnehmen einer Probe aus fötalem Gewebe,
b. mechanische Dissoziation des fötalen Gewebes,
c. enzymat ischer Verdau des fötalen Gewebes,
d. optional Dichtegradientenzentrifugat ion zur Abtrennung von Verunreinigungen, und
e. optional Expansion der isolierten Stammzellen, f. optional inline Konzentrierung des Kulturüberstands nach dem Ernte der expandierten Zellen
aufweist .
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet dass das gesamte Verfahren in einem geschlossenen System durchgeführt wird .
21. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 17 oder Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass zellfreie Produkte, wie beispielsweise konditioniertes, aufgereinigtes Zellkulturmedium oder Exosomen, gewonnen werden.
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