WO2018016674A1 - 미드카인 저해제를 포함하는 뇌종양 치료 또는 예방용 약학 조성물 - Google Patents

미드카인 저해제를 포함하는 뇌종양 치료 또는 예방용 약학 조성물 Download PDF

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Definitions

  • composition for the treatment or prevention of brain tumors containing a midkine inhibitor containing a midkine inhibitor
  • compositions for the treatment and / or prevention of brain tumors comprising a midkine inhibitor or a combination of midkine inhibitors and temozolomide 3 ⁇ 4111020101 ⁇ (16), and the treatment of temozolomide of midkine inhibitors and / or Or use for overcoming resistance to radiation therapy.
  • a brain tumor is a tumor in the brain tissue or the membrane tissue surrounding it.
  • the tumor is a secondary brain tumor that has spread from the primary brain tumor to the brain tissue or the meninges in other parts.
  • Brain tumors found in adults include glioma (Gl ioma), glioblastoma (Gl ioblastoma), meningioma (meningoma), pituitary adenoma (adenomas), and schwannoma.
  • glioblastoma (Gl ioblastoma) is a tumor originating from glial cells of brain tissue, which accounts for 12-15% of all brain tumors, and is the most common primary brain tumor in adults (3.19 / 100, 000; Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2014 Oct; 23 (10): 1985-96).
  • Glioblastomas unlike other tumors, are densely stretched between cells and tissues and are relatively fast in growth and fast in metastasis. Increasing brain pressure causes severe headaches, nausea and vomiting in the morning. Symptoms include epileptic seizures, memory loss and behavioral changes. Neural function may be reduced due to the tumor itself or brain edema accompanying the tumor, resulting in symptoms such as limb movement or sensory impairment, facial paralysis, speech impairment, cognitive impairment, and left and right disability.
  • Glioblastoma treatment similar to other brain tumors, is mainly performed by surgical removal of the tumor as much as possible, combined with radiation therapy and temodal chemotherapy.
  • the prognosis is around 15 months and the prognosis with a 5 year survival rate of 7% is extremely poor (N Engl J Med 2008; 359: 492-507).
  • glioblastoma and / or conventional therapies eg, temozolomide and / or radiation therapy
  • midkine inhibitors alone or in combination with midkine inhibitors and temozolomide
  • the use of midkine to overcome resistance to is provided.
  • One example provides a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of brain tumors, including a midkine (Mi dkine) inhibitor as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of brain tumors including a midkine (Mi dkine) inhibitor as an active ingredient.
  • Mi dkine midkine
  • Another example provides a pharmaceutical composition for preventing and / or treating brain tumors comprising a midkine inhibitor and temozolomide as an active ingredient.
  • Other examples include a midcaine inhibitor (or a pharmaceutical composition comprising a midcaine inhibitor as an active ingredient) or a combination of a midcaine inhibitor and temozolomide (or a pharmaceutical composition comprising a midcaine inhibitor and temozolomide as an active ingredient).
  • Another example provides a method of preventing and / or treating a brain tumor, comprising administering a midkine inhibitor to a subject in need of the prevention and / or treatment of a brain tumor.
  • the method of preventing and / or treating the brain tumor may further include irradiating before, simultaneously or after administering the midkine inhibitor.
  • Another example is the prevention of brain tumors with midkine inhibitors and temozolomide.
  • the method of preventing and / or treating the brain tumor may further include irradiating before, simultaneously or after the step of concurrently administering the midkine inhibitor and temozolomide.
  • Brain tumors targeted for the prophylaxis and / or treatment may be glioblastomas or brain tumors (eg, glioblastomas) resistant to existing anticancer therapies such as temozolomide and / or radiation therapy.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for inhibiting tumor stem cells of brain tumors, including the midkine inhibitor as an active ingredient, inhibiting stem cell function of tumor cells, or preventing recurrence of brain tumors.
  • Other examples include administering a midkine inhibitor to a subject in need of inhibiting tumor stem cells of a brain tumor or inhibiting stem cellization of tumor cells, inhibiting tumor stem cells of a brain tumor, inhibiting stem cell capacity of tumor cells, or Provides a method for preventing recurrence of brain tumors.
  • midkine inhibitors to overcome resistance to or enhance resistance to existing anticancer therapies, such as anticancer therapies for brain tumors (eg, radiation therapy and / or temozolomide therapy, etc.).
  • one embodiment provides a pharmaceutical composition for overcoming resistance or enhancing resistance to radiation therapy and / or temozolomide containing a midkine inhibitor as an active ingredient.
  • Another example is a method of overcoming resistance to temozolomide and / or radiation treatment comprising administering a midkine inhibitor to a subject in need of overcoming resistance or enhancing resistance to radiation therapy and / or temozolomide, and Provide a method of promoting response.
  • Another example provides the use of a midkine inhibitor for overcoming or enhancing resistance to radiation therapy and / or temozolomide.
  • the resistance to temozolomide and / or radiation treatment may be resistance to temozolomide and / or radiation treatment of brain tumors (eg, glioblastoma). And / or pharmaceutical compositions for enhancing the efficacy of radiation therapy.
  • Another example provides a method of enhancing the efficacy of temozolomide and / or radiation treatment comprising administering a midkine inhibitor to a subject in need of enhancing the efficacy of temozolomide and / or radiation therapy.
  • Another example provides the use of a midcaine inhibitor for enhancing the efficacy of temozolomide and / or radiation therapy.
  • the subject in need of enhancing the efficacy of the temozolomide and / or radiation treatment may be a brain tumor patient, eg, glioblastoma patient, or a brain tumor patient, such as glioblastoma patient, resistant to temozolomide and / or radiation therapy. have.
  • Another example includes contacting a candidate compound with a brain tumor test group cell, and measuring the expression amount (m NA amount) of the midkine protein and / or the midkine gene of the test group cell after contacting the candidate compound, wherein the candidate compound
  • An agent or temozolo for overcoming resistance to temozolomide in brain tumors which comprises comparing the amount of midkine protein and / or the expression of midkine genes in the brain tumor comparison group cells which did not come into contact with the candidate compound or before contact.
  • the candidate compound overcomes the resistance to temozolomide of the brain tumor. It may further comprise the step of selecting as a candidate for the preparation for the therapeutic agent or temozolomide resistant brain tumor.
  • the brain tumor test group cells and brain tumor comparison group cells may be (isolated) from the same brain tumor patient.
  • the brain tumor may be glioblastoma
  • the brain tumor cells may be glioblastoma .cell line.
  • the expression level of midkine increases, and the higher the expression level of midkine, the worse the prognosis of the brain tumor.
  • temozolomide administration and / or radiation treatment which is a typical conventional brain tumor treatment
  • temozolomide administration or radiation therapy alone or temozolomide administration and radiation treatment Compared with the combined case, it was confirmed that a significant brain tumor treatment effect can be obtained and anticancer effect can be obtained even for brain tumors resistant to temozolomide and / or radiation therapy.
  • Midkine (MDK), also called neurite growth-promoting factor 2 (NEGF2), is a protein encoded by the MDK gene.
  • Midcaine is a cell's self-secreting growth factor.
  • Midkine is a low molecular weight heparin-binding growth factor and a nonglycosylated protein consisting of two domains linked by disulfide bridges.
  • the midkine or its subcutaneous gene described herein may be (isolated from mammals) derived from mammals such as humans, primates such as primates, or rodents such as mice and rats.
  • the midkine may be a human midkine (e.g., NCBI Accession Numbers.
  • mRNA human midkine gene
  • mouse midkine gene e.g., NCBI Accession Numbers. .1, ⁇ _001291482.1, ⁇ _001291483.1, etc.
  • the midkine gene is human midkine (eg, NCBI Accession Numbers.
  • Temozolomide 1 ⁇ 21! 1020101 ⁇ (16; TNZ) is also known as Temodar, Temodal, Temcad, etc., and the IUPAC name is 4-methyl-5-oxo-2,3,4,6,8-pentazabicyclo. [4.3.0] nona-2, 7, 9-triene-9-carboxamide (4-methy 1-5-0X0-2,3,4,6,8-pent azab i eye 1 is 4.3.0 ] nona-2, 7, 9-tr i ene—9—car boxam i de).
  • Temozolomide is a kind of alkylating agent and is an anticancer agent widely used in the treatment of brain tumors.
  • the brain tumor refers to all tumors generated in the brain tissue or the membrane tissue surrounding it, and may be a primary brain tumor or a metastatic brain tumor.
  • the brain tumor can be glioma (Gl ioma), glioblastoma (Ml ioblastoma), meningioma (meningoma), pituitary adenoma (adenomas), or schwannomas, for example glioblastoma.
  • One embodiment of the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of brain tumors comprising a midkine inhibitor as an active ingredient.
  • the midkine inhibitor may be included in a pharmaceutically effective amount to achieve the desired effect.
  • Another example provides a method of preventing and / or treating a brain tumor, comprising administering a midkine inhibitor to a subject in need of the prevention and / or treatment of a brain tumor.
  • the midkine inhibitor can be administered in a pharmaceutically effective amount to achieve the desired effect.
  • the method may further comprise identifying a subject in need of prevention and / or treatment of brain tumors prior to the administering step.
  • tumor cells of brain tumors eg, glioblastoma
  • midkine at the protein and / or gene levels.
  • Effective and fundamental cancer treatment is possible, and it is also excellent in preventing cancer from recurring.
  • temozolomide administration and / or radiation treatment which is a typical conventional brain tumor treatment
  • temozolomide administration or radiation therapy alone when temozolomide administration or radiation therapy alone is performed, or when temozolomide administration and radiation treatment are combined
  • anticancer effect can be obtained for brain tumors resistant to temozolomide and / or radiation therapy, and the concentration of temozolomide and / Alternatively, it is possible to reduce the radiation dose or to increase the administration and / or the interval between irradiation, thereby reducing the side effects appearing in the patient.
  • the prevention and / or treatment of the brain tumor may further comprise a step of administering temozolomide and / or irradiation to the subject to obtain a more elevated effect.
  • a pharmaceutical composition for preventing and / or treating brain tumors comprising a midkine inhibitor and temozolomide as an active ingredient.
  • the midkine inhibitor and temozolomide pharmaceutical composition may be a form for simultaneous administration of two drugs including a single formulation (combinator) in which the midcaine inhibitor and temozolomide are mixed.
  • the midkine inhibitor and temozolomide pharmaceutical composition may be formulated with a midkine inhibitor and temozolomide, respectively, to simultaneously or sequentially administer the two drugs.
  • the pharmaceutical composition comprises a first pharmaceutical composition comprising a midkine inhibitor as an active ingredient and a second pharmaceutical composition comprising temozolomide as an active ingredient, the pharmaceutical composition for concurrent administration for simultaneous or sequential administration Can be.
  • sequential administration the order may be interchanged.
  • kits may include the drug and the irradiation device in one connected state or as a series of treatments and separated from each other so that radiation can be continuously irradiated simultaneously with or without the administration of the drug.
  • the irradiation apparatus can be selected and used among all conventional apparatuses used to irradiate radiation of a desired radiation dose (e.g., radiation dose applied to the treatment of brain tumors).
  • the irradiation device may emit a radiation dose of about lGy to about 6Gy, about lGy to about 4Gy, about lGy to about 2Gy, about 2Gy to about 6Gy, about 2Gy to about 4Gy, or about 4Gy to about 6Gy at a time. It may be possible to investigate, but is not limited thereto.
  • devices that can be used for irradiation include, but are not limited to, IBL 437C blood irradiator (CIS US, Inc., Bedford, MA).
  • midkine inhibitors are administered to patients with brain tumors, such as glioblastoma
  • stem cells of brain tumors eg, glioblastoma
  • brain tumor tumor stem cells are reduced (killing, inhibiting proliferation, etc.).
  • the effects can be obtained, and the recurrence rate of brain tumors can be remarkably reduced by such tumor stem cell inhibition.
  • another example provides a pharmaceutical composition for inhibiting tumor stem cells of brain tumors or inhibiting stem cell capacity of tumor cells comprising a midkine inhibitor as an active ingredient.
  • Other examples include inhibiting tumor stem cells of brain tumors, inhibiting stem cellization of tumor cells, comprising administering a midkine inhibitor to a subject in need of inhibiting tumor stem cells of a brain tumor or inhibiting stem cellization of tumor cells, or Provides a method for preventing brain tumor recurrence.
  • the tumor stem cell inhibition refers to the induction of death, suppression of proliferation, etc. of tumor stem cells of brain tumors (eg, glioblastomas) to be reduced or eliminated numerically or quantitatively.
  • Inhibiting stem cellization means inhibiting stem cell tumor cells of a brain tumor (eg, glioblastoma).
  • Prevention of recurrence of brain tumors means preventing the formation or worsening after treatment or improvement of brain tumors (eg, glioblastoma).
  • Temozolomide can each be included in a pharmaceutically effective amount to achieve the desired pharmacological effect.
  • the method of preventing and / or treating a brain tumor comprising administering the midkine inhibitor to a subject in need of the prevention and / or treatment of a brain tumor, the radiation before, concurrently or after the step of administering the midkine inhibitor It may be to further include the step of examining.
  • Another example provides a method of preventing and / or treating a brain tumor, comprising co-administering a midkine inhibitor and temozolomide to a subject in need of prevention and / or treatment of a brain tumor.
  • the concomitant administration may be performed simultaneously or sequentially in the order of administering the midkine inhibitor and temozolomide (for example, administering the first step including the midkine inhibitor and temozolomide, simultaneously or in any order). May be performed sequentially).
  • the method of preventing and / or treating the brain tumor may further include irradiating before, simultaneously or after the step of concurrently administering the midkine inhibitor and temozolomide.
  • the midkine inhibitor and temozolomide can be administered in a pharmaceutically effective amount, respectively.
  • the method may further comprise identifying a subject in need of prevention and / or treatment of brain tumors prior to the administering step.
  • the cerebral tumor targeted by the prophylaxis and / or treatment may be a brain tumor (eg, glioblastoma) resistant to conventional anticancer treatments such as glioblastoma or temozolomide and / or radiation therapy.
  • the treatment of brain tumors may include the action associated with the reduction or disappearance of tumor cells of brain tumors (inhibition of tumor cell proliferation, apoptosiosis, etc.), and / or inhibition of stem cell capacity of brain tumors and / or prevention of recurrence of brain tumors, and / or existing It can be interpreted as meaning including overcoming resistance to anticancer therapy (eg, radiation therapy and / or temozolomide therapy, etc.) (increasing the therapeutic reaction sensitivity).
  • anticancer therapy eg, radiation therapy and / or temozolomide therapy, etc.
  • the administration and / or radiation subject may be a patient with a brain tumor (e.g. glioblastoma) or a human, monkey, etc. at risk of suffering from a brain tumor (e.g. glioblastoma).
  • Primates including At least one selected from the group consisting of cells and tissues and cultures thereof.
  • the subject may be isolated from mammals, including temozolomide and / or primates including humans, monkeys, etc., innate or acquired (acquired) resistance to radiation therapy, rodents including mice, rats, and the like. Cells and tissues and cultures thereof.
  • midkine inhibitor may be used as a generic term for all compounds and compositions that target and act to decrease and / or lose binding and / or activity by targeting a midkine protein or gene.
  • the midkine inhibitor may be a midkine protein or a protein (specifically binding) to a gene (a molecule comprising more than loo amino acids; eg, an antibody), a peptide (a molecule comprising 1 to 100 amino acids)
  • a gene a molecule comprising more than loo amino acids; eg, an antibody
  • a peptide a molecule comprising 1 to 100 amino acids
  • it may be at least one selected from the group consisting of aptamers, oligonucleotides (eg, siRNAs, shRNAs, microRNAs, aptamers, etc.), small molecule compounds, and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the antibody comprises at least one contiguous, at least two, at least three, at least four, or at least five (eg, 1 to 30) contiguous to the outside of the primary, secondary or tertiary structure of the midkine protein. , 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 5, 2 to 30, 2 to 25, 2 to 20, 2 to 15, 2 to 10 , 2 to 5, 3 to 30, 3 to 25, 3 to 20, 3 to 15, 3 to 10, 3 to 5, 4 to 30, 4 to 25, 4 to 20 , 4 to 15, 4 to 10, 4 to 5, 5 to 30, 5 to 25, 5 to 20, 5 to 15, 5 to 10, or 5 to 7 amino acid residues)
  • Antibodies in the form of all subtypes of immunoglobulins eg, IgA, IgD, IgE, IgG (IgGl, I G2, IgG3, IgG4), IgM, etc.
  • epitopes antigenic determinants
  • antigen binding fragments thereof ScFv, (scF v) 2
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the antibody may be a mouse antibody, chimeric antibody, humanized antibody or human antibody.
  • the antibody may be derived from a hybridoma or recombinantly or chemically synthesized.
  • the aptamer is 5 to 100 that specifically binds to a specific site of the midkine protein or gene Peptide molecules comprising 5 to 40, 5 to 30, or 5 to 20 amino acids or 5 to 10nt (nucleotides) (e.g.
  • oligonucleotide molecules may be three or more, four or more or five or more contiguous exposed to the primary, secondary or tertiary structure of the midkine gene (eg, 3 to 50, 3 to 45, 3 40 to 40, 3 to 35, 3 to 30, 3 to 25, 3 to 20, 3 to 15 3 to 10, 3 to 5, 4 to 50, 4 to 45 4 to 40 Dog, 4 to 35, 4 to 30, 4 to 25 ⁇ 4 to 20, 4 to 15 4 to 10, 4 to 5, 5 to 50, 5 to 45, 5 to 40 , 5 to 35, 5 to 30, 5 to 25, 5 to 20, 5 to 15, 5 to 10, or 5 to 7 nucleotide sites specifically binding to 3 to 100 , 3 to 90, 3 to 80, 3 to 70, 3 to 60, 3 to 50, 5 to 100
  • the midkine inhibitor is an RNA aptamer (see, for example, Br iti sh Journal of Pharmacology (2014) 896-904), a midkine target anti sense (eg, US 2011). -0159022 Al), anti-midcaine antibodies (e.g. CELLMID limited products (e.g. US 9163081), midkine inhibitory compounds (e.g. AMDon Medchem iMDK (CAS no.
  • Another example is pharmaceuticals for overcoming resistance to radiation therapy and / or enhancing resistance to temozolomide comprising a midkine inhibitor as an active ingredient.
  • Another example is a method of overcoming resistance to temozolomide and / or radiation treatment comprising administering a midkine inhibitor to a subject in need of overcoming resistance or enhancing resistance to radiation therapy and / or temozolomide, and Provide a method of promoting response.
  • the temozolomide and / or resistance to radiation therapy is brain tumor
  • temozolomide Resistance to temozolomide and / or radiation therapy (eg, glioblastoma).
  • the resistance to temozolomide and / or radiation treatment has anti-cancer effects such as reduction of tumor cells, annihilation, reduction of tumor size / volume and / or disappearance during treatment of brain tumors by administration of temozolomide and / or irradiation. It may mean that it does not appear or does not appear therapeutically significant, or does not show anticancer effects depending on the dose and / or dose of temozolomide.
  • Overcoming resistance to the temozolomide and / or radiation treatment is not resistant to the anti-cancer effects such as reduction of tumor cells, annihilation, reduction of tumor size / volume during treatment of brain tumors through administration of temozolomide and / or irradiation It may mean that the tumor is present at a similar or therapeutically significant level as in brain tumors, or that anticancer effects occur depending on the dose and / or radiation dose of temozolomide (ie, proportional to dose and / or dose). have.
  • overcoming resistance to temozolomide and / or radiation treatment may be used in the same sense as enhancing semi-acuity (sensitivity) to temozolomide and / or radiation treatment.
  • Another example provides a pharmaceutical composition for enhancing the efficacy of temozolomide and / or radiation treatment containing a midkine inhibitor as an active ingredient.
  • Another example provides a method of enhancing the efficacy of temozolomide and / or radiation treatment comprising administering a midkine inhibitor to a subject in need of enhancing the efficacy of temozolomide and / or radiation therapy.
  • the improvement of efficacy may be achieved when the anticancer efficacy of brain tumors, such as glioblastoma, is performed by temozolomide administration or radiotherapy alone, respectively.
  • Reduction of tumor cells (glioblastoma) proliferation inhibition and / or increased apoptosis), annihilation, reduction of tumor size / volume and / or abolishment, stem cell capacity inhibition, prevention of recurrence of brain tumors (eg glioblastoma), etc. It may mean any one or more selected from.
  • the subject in need of enhancing the efficacy of the temozolomide and / or radiation treatment may be a brain tumor patient, eg, glioblastoma patient, or a brain tumor patient, such as glioblastoma patient, resistant to temozolomide and / or radiation therapy. have.
  • the radiation treatment refers to radiation treatment applied to conventional brain tumor treatment, and the radiation dose may be various factors such as the patient's age, the patient's health condition, the type of brain tumor, the lesion site, the lesion size, the tumor grade, the disease, and the like. It may be prescribed in consideration of.
  • the radiation treatment may include about lGy to about 6Gy, about lGy to about 4Gy, about lGy to about 2Gy, about 2Gy to about 6Gy, about 2Gy to about 4Gy, or about 4Gy to about 6 Gy and / or one cycle total radiation dose from about 10 Gy to about 60 Gy, about 10 Gy to about 55 Gy, about lOGy to about 50 Gy, about 10 Gy to about 45 Gy, about 10 Gy to about 40 Gy, about lOGy to about 35 Gy, About lOGy to about 30Gy, about lOGy to about 25Gy, or about lOGy to about 20Gy, but is not limited thereto. .
  • the pharmaceutical composition, the combination agent, the first pharmaceutical composition, and / or the second pharmaceutical composition may be used in addition to the active ingredient (midcaine inhibitor and / or temozolomide) such as a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, and / or excipient. It may further include an additive.
  • active ingredient midcaine inhibitor and / or temozolomide
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as a pharmaceutically acceptable carrier, diluent, and / or excipient. It may further include an additive.
  • the pharmaceutically acceptable carrier which is commonly used in the formulation of drugs, lactose, textose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, fine 1 type selected from the group consisting of crystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, etc.
  • It can be more than It may be one or more selected from the group consisting of diluents, excipients, lubricants, wetting agents, sweeteners, flavors, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like commonly used in the preparation of the composition.
  • the combination or pharmaceutical composition may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration and rectal administration.
  • oral administration because proteins or peptides are digested, oral compositions should be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount in which a drug can produce a pharmaceutically meaningful effect.
  • the pharmacologically effective amount of the midkine inhibitor and the pharmaceutically effective amount of temozolomide for single administration can be determined by the method of formulation, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, interval of administration, It may be prescribed in various ways depending on factors such as route of administration, rate of excretion and reaction.
  • the pharmaceutically effective amount of the midkine inhibitor and temozolomide for single administration may range from 0.001 to 100 rag / kg, or 0.01 to 10 mg / kg, but is not limited thereto.
  • compositions for single administration may be formulated into one formulation in unit dosage form, may be formulated in appropriate quantities or may be prepared within a multi-dose container.
  • a pharmaceutically effective amount of a midkine inhibitor for one administration and a pharmaceutically effective amount of temozolomide may be included in the packaging containers in basic units, respectively.
  • the interval between the co-administrations is between 6 hours and 30 days, such as between 8 hours and 30 days, 12 hours and 30 days. It may be 24 hours to 30 days, 3 days to 30 days, or 7 days to 14 days, but is not limited thereto.
  • the combination administration sequentially comprises a first pharmaceutical composition comprising a midkine inhibitor as an active ingredient and a second pharmaceutical composition comprising temozolomide as an active ingredient. Concurrently or from 0.1 minute to 60 minutes (eg, from 0.1 minute to 30 minutes, from 0.1 minute to 10 minutes, from 1 minute to 30 minutes, or from 1 to 10 minutes) and the order of administration may be interchanged. Do.
  • the combination or pharmaceutical composition may be formulated in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of axic powders, powders, granules, tablets or capsules, and the like for the formulation of dispersants or It may further comprise a stabilizer.
  • Another example is
  • It provides a method for screening an agent for overcoming the resistance to radiation therapy and / or temozolomide of a brain tumor, or a brain tumor therapy agent resistant to radiation therapy and / or temozolomide.
  • the screening method may further comprise the step of measuring the amount of midkine protein and / or the amount of expression of the midkine gene (mRNA amount) of the brain tumor comparison group cells.
  • the candidate compound is treated with radiotherapy and / or temozole of brain tumor. Selecting as an agent for overcoming resistance to amide or as a candidate for radiation therapy and / or temozolomide resistant brain tumor therapeutic agent.
  • the brain tumor test group cells and brain tumor comparison group cells may be (isolated) brain tumor cells or cultures derived from the same brain tumor patient. remind have.
  • the candidate compound may be selected from the group consisting of various compounds such as proteins, polytide, oligopeptides, polynucleotides, oligonucleotides, various other chemicals, extracts and the like.
  • the amount of the midkine protein or the expression level of the midkine gene can be measured by conventional methods.
  • the amount of the midkine protein can be measured by conventional enzyme reaction, fluorescence, luminescence and / or radiation detection using a compound, antibody, aptamer or the like that binds to the midkine protein, and specifically, immunochromatography Io-unochromatography, immunohistochemical staining, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (Floresence immunoassay (FIA), luminescence i ⁇ unoassay (LIA), Western blotting, microarray, etc.), but may be measured by a method selected from the group consisting of, but not limited thereto. no.
  • the expression level of the gene encoding the midkine can be measured by the mRNA level
  • mRNA level can be measured using a conventional genetic analysis method, for example, with the gene Measured using conventional genetic analysis methods, such as polymerizable primers, probes, or aptamers, such as polymerase chain reaction (PCR), f luorescent in si tu hybr idizat ion (FISH), microarray method, and the like. It may be, but is not limited thereto.
  • the primers detect contiguous 5 to 100 bp, such as 10 to 500 bp, 20 to 200 bp, or 50 to 200 bp gene fragments in the sequencing of the gene encoding the midkine (full length DNA, cDNA, or mRNA). It may be possible to hybridize (eg, complementary to) the contiguous 5-100 bp, e.g., 5-50 bp, 5-30 bp, or 10-25 bp region of each of the 3'-end and 5 1 -end of the gene fragment. ) May be a primer pair including a nucleotide sequence.
  • the probe or aptamer has a total length of 5 to 100 bp
  • Binding or hybridizing e.g., complementary
  • a contiguous sequence of 5 to 100 bp, 5 to 50 bp, 5 to 30 bp, or 5 to 25 bp gene fragment in the nucleotide sequence of the gene encoding (full length DNA, cDNA, or mRNA) ) May have a nucleotide sequence.
  • the term 'combinable' may mean that the gene region may be bound by chemical and / or physical bonds such as covalent bonds, and the term “saturable” may refer to a nucleotide sequence of the gene region. As described above, for example, by 90% or more, 95% or more, 98% or more, 99% or more, or 100% by sequence complementarity, it may mean that complementary binding is possible.
  • ⁇ Effects of the Invention e.g., complementary to a contiguous sequence of 5 to 100 bp, 5 to 50
  • midcaine a self-secreting growth factor of glioblastoma cells, on the proliferation of tumor cells, we suggest the utility as a target for new glioblastoma treatment, thereby providing a new use of midcaine as a target for new drug development. do.
  • the use of midkine inhibitors in the treatment of brain tumors, such as glioblastoma, alone or in combination with temozolomide and / or radiation therapy can achieve an elevated anticancer effect, and treatment of conventional brain tumors such as temozolomide and / or radiation therapy. Treatment or life extension of brain tumors (eg, glioblastoma) that are resistant to is possible. [Brief Description of Drawings]
  • 1 is an image showing the results of staining the midkine protein by immunohistochemical staining (I ⁇ unohi stochemi stry) in tumor tissue and normal tissue of glioblastoma patients (bar: 100 ⁇ ).
  • FIG. 2 is an image showing the results of observing midkine protein expression levels in tumor cells of glioblastoma patients with West blot.
  • Figure 3 is a graph showing the relative absorbance of N827 glioblastoma cell cultures in the midkine (MDK) neutralizing antibody and IgG (control) treatment according to the antibody treatment concentration.
  • Figure 4 is the MDK neutralization in three glioblastoma cell cultures N131, 047T, and N827 It is a graph.
  • Figure 5 shows the results of microscopic observation of the cell appearance on the 11th day after treatment with MDK neutralizing antibody and IgG (control) to N131, 047T, and N827 three glioblastoma cells (photo; right) and the number of tumor cells Graph (left).
  • Figure 6 shows the Western blot results upon shRNA treatment for MDK in N131 and N827 two glioblastoma cells.
  • FIG. 7 is a graph showing the cell proliferation rate (expressed as Relative ATP) when N827 glioblastoma cells were treated with shRNA against MDK compared with that without treatment with shRNA (NT).
  • FIG. 8 shows the tumor cell formation (top), the graph showing the number of cells without tumor cell formation (middle), and the result of quantification thereof (bottom) upon shRNA treatment for MDK in N131 glioblastoma cells.
  • FIG. 9 shows tumor cell formation (top), graph showing the number of cells without tumor cell formation (middle), and numerical results (bottom) upon shRNA treatment for MDK in N827 glioblastoma cells.
  • 10A to 10C show cell proliferation result graphs and microscopic observation images when the cells of N131, 047T, and N827 glioblastoma cells were treated with MDK-targeting neutralizing antibody and temozolomide (TMZ) alone. Not very good.
  • FIG. 11 is a photograph showing the cell-formation of the glioblastomas by the irradiation dose (control) and the combination of the irradiation and the midkine target antibody (ant i-MDK).
  • FIG. 12 is a graph showing the cell number of each glioblastoma by irradiation dose (control) and the combination of irradiation and midkine target antibody (ant i-MDK).
  • FIG. 13 shows midkine knockdown (shMDK infection) N827 cells and N827 cells
  • Example 1 Confirmation of midkine (MDK) expression in glioblastoma patient tissue
  • glioblastoma patients The level of midkine protein expression in cancerous and normal tissues of glioblastoma patients was confirmed by immunohistochemistry (I ⁇ unohistochemistry). Cancer tissue obtained from glioblastoma patients (named NS234 Tumor & NS320 Tumor; provided by Samsung Seoul Hospital) and normal tissues (named NS234 Normal & NS320 Normal; provided by Samsung Seoul Hospital) were fixed in paraffin and treated with deylene for 15 minutes of xylene. After the f inizat ion, the mixture was hydrated by treating with 100% (v / v) ethanol for 10 minutes, 95% (v / v) ethanol for 10 minutes, and dH20 for 5 minutes. Antigen masking was performed by boiling the hydrated tissue for 10 minutes.
  • FIG. 1 shows MDK expression levels in normal brain tissues and brain tumor tissues of the same patient through immunochemical staining, and it can be seen that MDK levels are specifically increased in brain tumor tissues.
  • the Western blotting was performed by loading each cell lysate in an amount of 30 ug on a 12% SDS page gel and gel running 100V), and then blocking 1 hour at room temperature with 53 ⁇ 4) (v / v) BSA after 1 hour of transfer (100V).
  • Midkine (Abeam, ab52637) and GAPDH cell signaling, 2118) were treated with primary antibody for 2 hours at room temperature, washed three times for 10 minutes with 1XTBST, and then anti-rabbit HRP linked secondary antibody (cell signaling, 7074S) was stored at room temperature. 1 hour of treatment. Subsequently, it was developed by spraying a solution of Super Signal West Dura Extended Duration Substrate CTermo scientific (34075) on a membrane washed three times for 10 minutes with 1XTBST.
  • Example 2 Effect of Midcaine Neutralizing Antibody Treatment on Glioblastoma Tumor Cells In order to determine the concentration of midcaine neutralizing antibody, the above Example
  • ELISA was performed using the culture medium of N827 glioblastoma cells prepared in step 2. ELISA was conducted using the Human Midkine Standard ELISA Development Kit (PeproTech, 900-K190; reagents used in the following tests and antibodies included in the kit).
  • the capture antibody When preparing an ELISA plate, the capture antibody was diluted to 1 / ml in PBS, dispensed with 100 ⁇ per lwell, sealed, and incubated overnight at room temperature. After incubation, Suction was carried out, and 300 ⁇ wash buffer (0.05% (v / v) Tween-20 in PBS) was added per lwell and washed four times. After the final washing was finished, placed on a paper towel and dried to remove the buffer completely, 300 blocks of buffer buffer (1% ( ⁇ / ⁇ ) BSA in PBS) was added to each well and incubated at room temperature for 1 hour. Then, after the suction again, washed four times with 300 ⁇ wash buffer per lwell.
  • 300 ⁇ wash buffer 0.05% (v / v) Tween-20 in PBS
  • the experimental group is to calculate the absorbance of pure cells themselves, except for Standard (2ng, lng, 0.5ng, 0.25ng, 0.125ng, Ong) and media only ), IgG (Normal Rabbit IgG (cat. AB-105-C, R & D Systems)) treatment group (control; 0, 0.156, 0.625, 2.5, 10zg / ml), and Midkine target neutralizing antibody (MK (H-65) Antibody (cat.sc-20715, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) treatment group (0, 0.156, 0.625, 2.5, 10 g / ml), each group of samples on a 96well plate with 100 ⁇ per lwell (for each sample) 3 wells prepared) was dispensed and incubated at room temperature for 2 hours. After completion of the incubation, the sample was suctioned and washed four times with 300 id wash buffer per lwell.
  • Standard 2ng, lng, 0.5ng, 0.25ng, 0.
  • the detection antibody was diluted with 1 g / ml and dispensed at 100 ⁇ / lwell and incubated at room temperature for 2 hours. After 2 hours, suction and washing were performed 4 times with 300 ⁇ wash buffer per lwell. 5.5 After diluting Avidin-HRP 1: 2000 in 11 ml dilution, 100 ⁇ for each well. After the sample was suctioned and washed four times with 300 f wash buffer per lwell, 100 wells of substrate solution was dispensed into each well to confirm color development (ELISA plate reader at 405 nm with wavelength correction set at ' 650 nm).
  • N131 (labeled 'N131' in FIG. 4, 047T (labeled '047' in FIG. 4)) and N827 (FIG.
  • glioblastoma cells (labeled as 'N827') were seeded by 3 wells for each cell line, each containing 5000 cells in lOOul cell culture per lwell, and IgG (10 // g / ml) and Midkine target neutralizing antibodies ( MKCH—65) Antibody (cat.sc-20715, SANTA CRUZ ⁇ (: ⁇ ⁇ ⁇ / / ⁇ , respectively) were treated.
  • EZ-Cytox (EZ-cytox Cell Viability Assay Kit; Note) Daeil Biotech) was treated in an amount of 10ul per lwell, incubated at 37 ° C for 1 hour, and the degree of cell proliferation was measured by measuring absorbance at 450nm.
  • N131 Neurogenital-A Medium (cat. 10888-022, gibco) + N-2 Supplement (100X) (cat. 17502-048, life technologies) + B-27 Supplement (50X) (cat. 17504-044, life technologies) + human FGF-basic (cat.AF-100-18B, Peprotech) + human EGF (cat.AF-100-15, Peprotech) + Penicillin-Streptomycin (cat. 15140-163, gibco) + L-glut amine 200mM (cat.
  • FIG. 5 The results are shown in FIG. 5.
  • the right photograph is a photomicrograph of the formed tumor cells (200 ⁇ )
  • the left graph is a graph showing the number of tumor cells observed per well.
  • the midkine gene was knocked down to test how the reduction in the gene level of midcaine affects glioblastoma cells. Specifically, after infecting Midkine knockdown virus to N131 and N827 cells (infected with 40ul of virus in 5X10 6 cells), the degree of protein expression was confirmed by Western blot.
  • the Midkine knockdown virus contains two kinds of shRNAs, respectively:
  • shRNA 210 (denoted shRNA1): ShRNA252 (denoted shRNA2):
  • the Midkine knockdown virus was purchased from Sigma-Aldrich in the form of shRNA Glycerol stock (shRNA 210 (denoted shRNA1; TRCN0000331210) and ShRNA252 (denoted shRNA2; TRCN0000331252)).
  • the obtained midkine gene was knocked down on N827 glioblastoma cells and N827 cells not knocked down (NT) on a 384well plate.
  • the measured cell number results were statistically analyzed using the SPSS statistical program (Statistical Package for the Social Sciences; IBM) to determine how many cells should exist in each group to form tumor cells.
  • SPSS statistical program Statistical Package for the Social Sciences; IBM
  • FIG. 8 shows the results obtained for the N131 cell line (top: micrograph (200 ⁇ ); middle: graph showing the number of cells without tumor cells; bottom: statistical analysis results).
  • top micrograph (200 ⁇ ); middle: graph showing the number of cells without tumor cells; bottom: statistical analysis results.
  • tumor cell formation ability after treatment of MDK gene target inhibitor (shRNA for MDK) is significantly reduced compared to the comparison group (shRNA untreated group for MDK: NT).
  • 'Estimate' in the lower table means the average number of cells that can form tumor cells.
  • shRNA-untreated group (NT) for MDK only 61.7 cells can form tumor cells, while shRNA-treated group (MDK Because cells must be present to form tumor cells, tumor cell formation ability when treated with shRNA against MDK (ie, when inhibition of MDK expression) is significantly reduced compared to the non-treated group (NT). Can be.
  • Figure 9 shows the results obtained for the N827 cell line (top: micrograph (200X); middle: graph showing the number of cells without tumor cells; bottom: statistical analysis results).
  • top micrograph (200X); middle: graph showing the number of cells without tumor cells; bottom: statistical analysis results.
  • NT comparison group
  • Prol i ferat ion assay was performed. Three glioblastoma cells of N131, 047, and N827 were placed on a 96wel l plate per lwell lOOul cell culture solution (Neurobasal-A Medium (cat 10888-022, gibco) + N-2 Supp 1 ement (50X) (cat .17504-044, life technologies) + human FGF-basic (cat.AF-100-18B, Peprotech) + human EGF (cat .AF-100-15, Peprotech) + Penici 11 in -Streptomycin (cat.
  • the test group included only culture medium (control: in this case, IgG was treated with a control antibody at a concentration of 5 ug / ml) and temozolomide ⁇ 10201011 ⁇ (16 (0; 12577, Sigma-Aldr ich) alone treatment) Group (treatment concentration: 0, 1, 3.9, 15.6, 62.5, 250, lOOOOmol; in this case, IgG was treated with a concentration of 5 ug / ml as a control antibody), midkine target antibody (MK (H-65) Antibody ( cat.sc-20715, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)) alone treatment group (treatment concentration: 5ug / ml), and temozolomide and midcaine target antibody treatment group (temozolomide treatment concentration: 0, 1, 3.9, 15.6, 62.5 , 250,
  • the antibody was treated at lOug / ml (see Example 2).
  • the midkine target antibody was co-treated with temozolomide, the proliferation of glioblastoma cells was reduced.
  • the antibody throughput was adjusted to 5 ug / ml to take into account the effect on.
  • EZ-Cytox EZ-cytox Cell Viability Assay Kit; ⁇ Daily Biotech
  • FIGS. 10A (N131), 10B (047), and 10C (N827) show the absorbance ratios (relative values) of each experimental group relative to the absorbance ('1') of the control (treated with control IgG only).
  • 10A to 10C show graphs showing the degree of cell proliferation for each cell line and micrographs of the cells.
  • the cancer cells were dose-dependently depending on the concentration of temozolomide compared with the administration of the midkine target neutralizing antibody and temozolomide (TMZ) and administration of temozolomide alone (indicated by control IgG). It can be seen that the killing ability is increased (see the graph provided for each cell line).
  • the cells were stabilized by incubating N827 glioblastoma cells at 5 ⁇ 10 5 cel l per wel l in 6weil cel l culture p 1 at e (cat. 140675, Termo scient if ic) and incubating for 24 hours. After 24 hours, the prepared cells were transferred to IBL 437C blood irradiator CCIS US, Inc. , Bedford, MA) to obtain OGy, 2Gy, 4Gy, 6Gy radiation, respectively. Midkine target antibody (cat. Sc-20715, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) was treated at a concentration of 5 ng / ml.
  • Figure 11 is a microscopic observation of the tumor cell formation obtained in the test, the degree of the formation of the cell sphere of glioblastoma cells can be said to show the stem cell capacity. As shown in the upper part of FIG. 11 (control; only radiation treatment), radiation treatment alone did not reduce stem cell function of glioblastoma cells, but the radiation treatment and midkine target antibody administration were performed. In parallel (ant i-MDK), it can be seen that the stem cell capacity of glioblastoma cells is significantly reduced.
  • FIG. 12 is a graph showing the number of obtained cell cells. As shown in FIG. 12, only glioblastoma cells were treated with radiotherapy (control), but no cell death (reduction) effect was observed regardless of the radiation dose (ie, resistance to radiation treatment). When the antibody was administered in parallel (Ant i-MDK), it can be seen that a significant cancer cell death (reduction) effect is shown, the cancer cell death is increased in proportion to the radiation dose. In particular, even when the radiation dose was 0 and only administration of the midkine target antibody showed about 40% reduction of cancer cells, the anticancer effect on the cancer cells resistant to the radiation treatment by the midkine target treatment (tumor formation inhibitory effect). It was confirmed that can be obtained).
  • Example 6 Confirmation of In Vivo Tumor Suppression Capability by Midkine Gene Knockdown
  • a cerebral stereotactic mouse model was prepared to confirm the decrease of tumor formation ability when the midkine gene was knocked down.
  • a BALB / c-nude mouse (Oriental Bio, female) was used with a brain stereotactic injector (coordinate AP 0.5 mm, ML + 1.7 ⁇ s, DV-3.2 ⁇ s) to express N827 cells (hereinafter referred to as N827) 1 ⁇ 10 4 cels per subject.
  • the amount of l was injected for 10 minutes using a Hami lton syringe. At this time, as the N827 cells N827 cells were used.
  • mice were injected with N827 cells infected with a non target vector (cat. SHC016, Sigma-Aldrich) virus.
  • a total of 20 animals were prepared, with 10 animals in each group.
  • the prepared brain stereotactic mouse model was measured once daily weight, and when the weight of the control group is reduced by more than 20%, the brain by sacrificing two heads each of the experimental group (shM infection N827 cell injection) brain stereotype mouse model and control mouse model Extracted, fixed with 4% Paraformaldehyde Solution (cat.HP2031, Bio World), and confirmed the size of the tumor by H & E (Hematoxylin and Eosin) staining.
  • H & E Hematoxylin and Eosin
  • Hematoxylin and Eosin (H & E) staining methods are as follows:
  • the remaining cerebral stereotactic mouse models were sacrificed continuously at 20% or more weight loss, and brains were extracted and stored in 4% Paraformaldehyde Solution (cat.HP2031, Bio World Co., Ltd.) for later experiments.
  • FIG. 13 As a result of confirming the tumor size through the H & E (Hematoxylin and Eosin) staining (two heads for each group) are shown in FIG. 13 (bar: 2 ms). As shown in FIG. 13, as a result of confirming the size of the tumor throughout the year, the size of the tumor formed in the brain was significantly reduced in the shMDK-treated group (shMDK) compared to the control group (NT) (ie, tumor formation ability was suppressed).
  • shMDK shMDK-treated group
  • NT control group
  • the survival period of each mouse model (the period until the weight of the last surviving mouse is reduced by 20%) is measured and shown in FIG. 14. As shown in FIG. I can see that.

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Abstract

미드카인 (Midkine) 저해제 또는 미드카인 저해제와 테모졸로마이드 (Temozolomide)의 조합을 유효성분으로 포함하는 뇌종양의 치료 및 /또는 예방을 위한 약학 조성물, 및 미드카인 저해제의 테모졸로마이드 치료 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성 극복을 위한 용도가 제공된다.

Description

【발명의 설명】
【발명의 명칭】
미드카인 저해제를 포함하는 뇌종양 치료 또는 예방용 약학 조성물 【기술분야】
미드카인 (Midkine) 저해제 또는 미드카인 저해제와 테모졸로마이드 ¾111020101^(16)의 조합을 유효성분으로 포함하는 뇌종양의 치료 및 /또는 예방을 위한 약학 조성물， 및 미드카인 저해제의 테모졸로마이드 치료 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성 극복을 위한 용도가 제공된다.
【배경 기술】
뇌종양 (brain tumor)는 뇌 조직이나 이를 둘러싸고 있는 막 조직에 생긴 종양을 일컫는 것으로， 원발성 뇌종양과 다른 부위에서 뇌 조직이나 뇌막으로 전이된 이차성 뇌종양을 통를어 일컫는다
성인에서 발견되는 뇌종양에는 신경교종 (Gl ioma) , 교모세포종 (Gl ioblastoma) , 수막종 (뇌막종)， 뇌하수체 선종 (샘종)， 신경초종 등이 있다.
이 중에서 교모세포종 (Gl ioblastoma)은 뇌조직의 신경교세포에서 시작하는 종양으로, 전체 뇌종양의 12~15%를 차지하며， 성인에서 가장 흔한 원발성 뇌종양이다 (3. 19/100 ,000 ; Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2014 Oct；23( 10) : 1985-96) .
교모세포종은 다른 종양과 다르게 세포와 조직 사이 사이에 촘촘히 뻗어 있으며 성장 속도도 비교적 빠르고 전이 속도도 빠르다. 뇌압 상승으로 주로 아침에 심한 두통， 오심， 구토 등이 있으며， 간질 발작, 기억력 상실 및 행동양식 변화 등의 증상이 나타난다. 종양 자체 또는 종양에 동반된 뇌 부종으로 인해 신경 기능이 저하되어 사지 운동 또는 감각 저하, 얼굴마비， 언어장애, 인지기능 저하, 좌우 구분장애 등 증상이 나타날 수도 있다.
교모세포종의 치료는, 다른 뇌종양과 유사하게， 주로 외과적 수술로 최대한 종양을 제거하고 방사선 치료 및 테모달 항암화학요법을 병행하여 15개월 내외이며， 5년 생존률이 7%인 예후가 극히 나쁜 악성종양이다 (N Engl J Med 2008； 359 :492-507) .
또한， 방사선 치료 및 항암화학요법에 따른 다양한 부작용과 저항성 등이 뇌종양 치료에 장애가 되고 있다. 또한， 뇌종양의 재발시 표준 치료법이 없다는 문제도 있다.
따라서， 항암효과가 우수하면서 부작용이 낮고 기존 항암제에 대한 저항성의 극복이 가능한새로운 뇌종양 치료법의 개발이 요구된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
미드카인 (Midkine) 저해제 단독 또는 미드카인 저해제와 테모졸로마이드 (Temozolomide)의 병용에 의한 뇌종양， 예컨대, 교모세포종 (Gl iobl astoma)의 치료 및 기존의 치료법 (예컨대， 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료)에 대한 저항성 극복을 위한 미드카인의 용도가 제공된다.
일 예는 미드카인 (Mi dkine) 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌종양의 예방 및 /또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
다른 예는 미드카인 저해제 및 테모졸로마이드 (Temozolomide )를 유효성분으로 포함하는 뇌종양의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 미드카인 저해제 (또는 미드카인 저해제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물) 또는 미드카인 저해제와 테모졸로마이드의 조합 (또는 미드카인 저해제와 테모졸로마이드를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물)을 포함하는 약물; 및 방사선 조사 장치를 포함하는 뇌종양의 예방 및 /또는 치료용 키트를 제공한다.
다른 예는 미드카인 저해제를 뇌종양의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는， 뇌종양의 예방 및 /또는 치료 방법을 제공한다. 상기 뇌종양의 예방 및 /또는 치료 방법은 상기 미드카인 저해제를 투여하는 단계 이전, 동시 또는 이후에 방사선을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 미드카인 저해제 및 테모졸로마이드를 뇌종양의 예방 뇌종양의 예방 및 /또는 치료 방법을 제공한다. 상기 뇌종양의 예방 및 /또는 치료 방법은 상기 미드카인 저해제 및 테모졸로마이드를 병용 투여하는 단계 이전， 동시 또는 이후에 방사선을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 예방 및 /또는 치료의 대상이 되는 뇌종양은 교모세포종 또는 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료와 같은 기존의 항암 치료에 대하여 저항성을 갖는 뇌종양 (예컨대，. 교모세포종)일 수 있다.
다른 예는 미드카인 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌종양의 종양줄기세포 저,해용, 종양세포의 줄기세포능 억제용， 또는 뇌종양의 재발 방지용 약학조성물을 제공한다.
다른 예는 미드카인 저해제를 뇌종양의 종양줄기세포 저해용 또는 종양세포의 줄기세포화 억제를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양의 종양줄기세포 저해, 종양세포의 줄기세포능 억제, 또는 뇌종양의 재발 방지 방법을 제공한다.
다른 예는 미드카인 저해제의 기존의 항암 치료， 예컨대 뇌종양에 대한 항암 치료 (예컨대， 방사선 치료 및 /또는 테모졸로마이드 치료 등)에 대한 저항성 극복 또는 반웅성 증진 용도를 제공한다.
구체적으로， 일 예는 미드카인 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 치료 및 /또는 테모졸로마이드에 대한 저항성 극복 또는 반웅성 증진을 위한 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 미드카인 저해제를 방사선 치료 및 /또는 테모졸로마이드에 대한 저항성 극복 또는 반웅성 증진을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는， 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성 극복 방법 및 /또는 반웅성 증진 방법을 제공한다.
다른 예는 미드카인 저해제의 방사선 치료 및 /또는 테모졸로마이드에 대한 저항성 극복 또는 반웅성 증진을 위한용도를 제공한다.
상기 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성은 뇌종양 (예컨대, 교모세포종)의 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성일 수 있다. 및 /또는 방사선 치료의 효능 증진을 위한 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 미드카인 저해제를 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료의 효능 증진을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료의 효능 증진 방법을 제공한다.
다른 예는 미드카인 저해제의 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료의 효능 증진을 위한 용도를 제공한다.
상기 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료의 효능 증진을 필요로 하는 대상은 뇌종양 환자， 예컨대， 교모세포종 환자， 또는 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성을 갖는 뇌종양 환자， 예컨대 교모세포종 환자일 수 있다.
다른 예는 후보 화합물을 뇌종양 시험군 세포에 접촉시키는 단계， 및 상기 후보 화합물 접촉 후의 시험군 세포의 미드카인 단백질 양 및 /또는 미드카인 유전자의 발현량 (m NA 양)을 측정하여， 상기 후보 화합물 접촉 전 또는 상기 후보 화합물과 접촉하지 않은 뇌종양 비교군 세포의 미드카인 단백질 양 및 /또는 미드카인 유전자의 발현량과 비교하는 단계를 포함하는， 뇌종양의 테모졸로마이드에 대한 저항성 극복을 위한 제제 또는 테모졸로마이드 저항성 뇌종양 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법은 상기 비교하는 단계 이후에， 시험군 세포의 미드카인 단백질 양 및 /또는 미드카인 유전자의 발현량이 비교군 세포와 비교하여 감소한 경우， 상기 후보 화합물을 뇌종양의 테모졸로마이드에 대한 저항성 극복을 위한 제제 또는 테모졸로마이드 저항성 뇌종양 치료제의 후보 물질로 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 뇌종양 시험군 세포와 뇌종양 비교군 세포는 동일한 뇌종양 환자로부터 유래한 (분리된) 것일 수 있다. 상기 뇌종양은 교모세포종일 수 있으며， 뇌종양 세포는 교모세포종 .세포주일 수 있다.
【과제의 해결 수단】
본 명세서에서， 뇌종양의 악성도가 증가할수록 미드카인 (midkine ; MDK) 의 발현량이 증가하고， 미드카인의 발현량이 높을수록 뇌종양의 예후가 나쁜 저해함으로써 뇌종양 (예컨대， 교모세포종)의 종양세포의 성장을 억제할 수 있을 뿐 아니라 줄기세포능 (sternness)을 저해할 수 있음이 확인되었다. 또한， 미드카인 저해제를 기존의 대표적인 뇌종양 치료법인 테모졸로마이드 (Temozolomide) 투여 및 /또는 방사선 처리와 병행하는 경우, 테모졸로마이드 투여 또는 방서선 처리를 단독으로 수행하거나 테모졸로마이드 투여와 방사선 처리는 병행 하는 경우와 비교하여， 현저한 뇌종양 치료 효과를 거둘 수 있음과 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대하여 저항성이 있는 뇌종양에 대해서도 항암 효과를 얻을 수 있음이 확인되었다.
미드카인 (Midkine; MDK)은 신경돌기 성장 촉진 인자 (neurite growth- promoting factor 2； NEGF2)라고도 불리며, MDK 유전자에 의하여 암호화되는 단백질이다. 미드카인은 세포의 자가 분비 생장 인자이다. 미드카인은 저분자량의 헤파린 -결합 성장인자 (hepar in-binding growth factor)이며， 이황화결합 (disulfide bridges)에 의하여 연결된 두 개의 도메인으로 구성된 비글라이코실화 단백질 (nonglycosylated protein)이다. 본 명세서에서 기재되는 미드카인 또는 이의 암화하 유전자는 인간， 원승이 등의 영장류， 또는 마우스， 래트 등의 설치류와 같은 포유류 유래의 (포유류로부터 분리된) 것일 수 있다. 예컨대， 상기 미드카인은 인간 미드카인 (예컨대， NCBI Accession Numbers. NP— 001012333.1， NP— 001012334.1， NP_001257479.1, NP_001257480.1, NP_001257481.1, NP— 002382.1 등)， 마우스 미드카인 (예컨대， CBI Accession Numbers. NP_001012335.1, NP_001012336.1, NP_001278410.1, NP_034914.1 등), 인간 미드카인 유전자 (mRNA) (예컨대， NCBI Accession Numbers. 匪 _001012333.2， NM_001012334.2, NM_001270550.1, 匪 _001270551.1， NM— 001270552.1， NM— 002391.4 등)에 의하여 암호화 되는 인간 미드카인， 마우스 미드카인 유전자 (mRNA) (예컨대， NCBI Accession Numbers. 匪 _001012335.2， 匪 _001012336.2, 匪 _010784.4， 匪 _001291481.1， 丽_001291482.1， 匪 _001291483.1 등)에 의하여 암호화되는 마우스 미드카인 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한 상기 미드카인 유전자는 인간 미드카인 (예컨대， NCBI Accession Numbers. NP— 001012333.1， NP_001012334.1, NP_001257479.1, NP_001257480.1, NP_001257481.1 , Accession Numbers . NP_001012335. 1 , NP_001012336.1 , NP_001278410. 1 , P_034914. 1 등)을 암호화하는 유전자， 인간 미드카인 유전자 (mRNA) (예컨대， NCBI Accession Numbers . 匪 _001012333.2， 丽_001012334.2， 匪_001270550. 1， 匪 _001270551. 1， 匪_001270552. 1， 醒 _002391.4 등)， 마우스 미드카인 유전자 (mRNA) (예컨대， NCBI Accession Numbers . NM_001012335.2 , 匪—001012336.2， 匪 _010784.4, NM_001291481. 1 , 圈 _001291482. 1， 丽 _001291483. 1 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
테모졸로마이드 ½1!1020101^(16； TNZ)는 Temodar , Temodal , Temcad 등의 상표명으로 불리기도 하며， IUPAC 명칭은 4-메틸 -5-옥소 -2，3，4，6，8- 펜타자바이사이클로 [4.3.0]노나 -2， 7， 9-트리엔 -9-카르복사마이드 (4-methy 1-5- 0X0-2 ,3 ,4, 6 , 8-pent azab i eye 1이 4.3.0 ] nona-2 , 7 , 9-tr i ene—9—car boxam i de )이다. 테모졸로마이드는 알킬레이팅제의 일종으로 뇌종양 치료에 널리 사용되는 항암제이다.
본 명세서에 기재된 바로서， 뇌종양은 뇌 조직이나 이를 둘러싸고 있는 막 조직에 생긴 종양을 모두 의미하는 것으로， 원발성 뇌종양 또는 전이성 뇌종양일 수 있다. 일 예에서, 뇌종양은 신경교종 (Gl ioma) , 교모세포종 (Gl ioblastoma) , 수막종 (뇌막종)， 뇌하수체 선종 (샘종)， 또는 신경초종일 수 있으며， 예컨대, 교모세포종일 수 있다.
본 발명의 일 예는 미드카인 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌종양의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 미드카인 저해제는 소망하는 효과를 얻기 위한 약학적 유효량으로 포함될 수 있다.
다른 예는 미드카인 저해제를 뇌종양의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는， 뇌종양의 예방 및 /또는 치료 방법을 제공한다. 상기 미드카인 저해제는 소망하는 효과를 얻기 위한 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 뇌종양의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이， 또한， 미드카인을 단백질 및 /또는 유전자 수준에서 저해함으로써 뇌종양 (예컨대， 교모세포종)의 종양세포의 성장을 효과적이고 근본적인 암 치료가 가능하며， 암의 재발 방지에도 우수한 효과가 있다.
또한, 미드카인 저해제를 기존의 대표적인 뇌종양 치료법인 테모졸로마이드 투여 및 /또는 방사선 처리와 병행하는 경우， 테모졸로마이드 투여 또는 방서선 처리를 단독으로 수행하거나 테모졸로마이드 투여와 방사선 처리는 병행 하는 경우와 비교하여， 상승된 뇌종양 치료 효과 (항암효과)를 거둘 수 있을 뿐 아니라， 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대하여 저항성이 있는 뇌종양에 대해서도 항암 효과를 얻을 수 있으며， 테모졸로마이드 투여 농도 및 /또는 방사선 조사량을 감소시키거나 투여 및 /또는 조사 간격을 증가시킬 수 있고， 이를 통해 환자에게 나타나는 부작용을 줄일 수 있다는 이점이 있다.
이와 같이， 상기 뇌종양의 예방 및 /또는 치료는 상기 대상에게 테모졸로마이드 투여 및 /또는 방사선 조사 단계를 추가로 포함하여 보다 상승된 효과를 얻을 수 있다.
따라서， 다른 예는 미드카인 저해제 및 테모졸로마이드를 유효성분으로 포함하는 뇌종양의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 일 구체예에서， 상기 미드카인 저해제 및 테모졸로마이드를 약학 조성물은 미드카인 저해제와 테모졸로마이드는 흔합되어 하나의 제형 (흔합제 )를 포함하는 두 약물의 동시 투여를 위한 형태일 수 있다. 다른 구체예에서， 상기 미드카인 저해제 및 테모졸로마이드를 약학 조성물은 미드카인 저해제 및 테모졸로마이드가 각각 제제화되어， 두 약물을 동시적 또는 순차적으로 투여하기 위한 형태일 수 있다. 이 경우， 상기 약학 조성물은 유효 성분으로 미드카인 저해제를 포함하는 제 1 약학 조성물 및 유효성분으로 테모졸로마이드를 포함하는 제 2 약학 조성물을 포함하는， 동시적 또는 순차적 투여를 위한 병용 투여용 약학 조성물일 수 있다. 순차적 투여의 경우 그 순서는 서로 바뀌어도 무방하다.
다른 예는 미드카인 저해제 (또는 미드카인 저해제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물) 또는 미드카인 저해제와 테모졸로마이드의 조합 (또는 미드카인 저해제와 테모졸로마이드를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물)을 치료용 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 약물과 상기 방사선 조사 장치를 하나의 연결된 상태로 포함하거나， 일련의 치료법으로서 상기 약물의 투여와 동시 .또는 순서에 무관하게 연속적으로 방사선을 조사할 수 있도록 서로 분리된 상태로 포함할 수 있다. 상기 방사선 조사 장치는 소망하는 방사선량 (예컨대, 뇌종양 치료에 적용되는 방사선량)의 방사선을 조사하는데 사용되는 통상적인 모든 장치 중에서 선택하여 사용할 수 있다. 예컨대， 상기 방사선 조사 장치는 1회에 약 lGy 내지 약 6Gy, 약 lGy 내지 약 4Gy, 약 lGy 내지 약 2Gy, 약 2Gy 내지 약 6Gy, 약 2Gy 내지 약 4Gy, 또는 약 4Gy 내지 약 6Gy의 방사선량을 조사할 수 있는 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서， 방사선 조사에 사용 가능한 장치는 IBL 437C blood Irradiator (CIS US, Inc . , Bedford, MA) 등이 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
앞서 설명한 바와 같이， 미드카인 저해제를 뇌종양， 예컨대， 교모세포종 환자에게 투여시， 뇌종양 (예컨대， 교모세포종)의 종양세포의 줄기세포능이 억제되고 뇌종양 종양줄기세포가 감소 (사멸， 증식억제 등)하는 효과를 얻을 수 있으며， 이와 같은 종양줄기세포 저해에 의하여 뇌종양의 재발률을 현저하게 줄일 수 있다.
따라서， 다른 예는 미드카인 저해제를 유효성분으로 포함하는 뇌종양의 종양줄기세포 저해용 또는 종양세포의 줄기세포능 억제용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 미드카인 저해제를 뇌종양의 종양줄기세포 저해용 또는 종양세포의 줄기세포화 억제를 필요로하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양의 종양줄기세포 저해， 종양세포의 줄기세포화 억제， 또는 뇌종양 재발 방지 방법을 제공한다.
상기 종양줄기세포 저해는 뇌종양 (예컨대， 교모세포종)의 종양줄기세포의 사멸， 증식 억제 등을 유도하여 수적 /양적으로 감소시키거나 소멸시키는 것을 의미한다. 상기 줄기세포화 억제는 뇌종양 (예컨대， 교모세포종)의 종양세포가 줄기세포화하는 것을 저해하는 것을 의미한다. 뇌종양의 재발 방지는 뇌종양 (예컨대， 교모세포종)의 치료 또는 호전 후 다시 형성 또는 악화되는 것을 방지하는 것을 의미한다. 테모졸로마이드는 각각 소망하는 약리학적 효과를 얻기 위한 약학적 유효량으로 포함될 수 있다.
또한， 상기 미드카인 저해제를 뇌종양의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 뇌종양의 예방 및 /또는 치료 방법은 상기 미드카인 저해제를 투여하는 단계 이전， 동시 또는 이후에 방사선을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
다른 예는 미드카인 저해제 및 테모졸로마이드를 뇌종양의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 대상에게 병용 투여하는 단계를 포함하는， 뇌종양의 예방 및 /또는 치료 방법을 제공한다. 상기 병용 투여는 미드카인 저해제 및 테모졸로마이드를 동시에 투여하거나 순서에 무관하게 연속적으로 투여 (예컨대 미드카인 저해제를 포함하는 제 1 단계 및 테모졸로마이드를 투여하는 게 2 투여 단계를 동시 또는 순서에 무관하게 순차적으로 수행)하는 것일 수 있다. 상기 뇌종양의 예방 및 /또는 치료 방법은 상기 미드카인 저해제 및 테모졸로마이드를 병용 투여하는 단계 이전， 동시 또는 이후에 방사선을 조사하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 미드카인 저해제 및 테모졸로마이드는 각각 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 뇌종양의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 예방 및 /또는 치료의 대상이 되는 뇌총양은 교모세포종 또는 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료와 같은 기존의 항암 치료에 대하여 저항성을 갖는 뇌종양 (예컨대， 교모세포종)일 수 있다. 상기 뇌종양의 치료는 뇌종양의 종양세포의 감소 또는 소멸과 관련된 작용 (종양세포의 증식 억제， apoptosi s 증 등)， 및 /또는 뇌종양의 줄기세포능 저해 및 /또는 뇌종양의 재발 방지， 및 /또는 기존의 항암 치료 (예컨대， 방사선 치료 및 /또는 테모졸로마이드 치료 등)에 대한 저항성 극복 (치료 반웅성 (민감성) 증가) 등을 포함하는 의미로 해석될 수 있다.
상기 투여 및 /또는 방사선 조사 대상 (즉， 뇌종양의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 대상)은 뇌종양 (예컨대， 교모세포종) 환자 또는 뇌종양 (예컨대, 교모세포종)을 앓을 위험이 있는 인간， 원숭이 등을 포함하는 영장류， 세포 및 조직 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 특히， 상기 대상은 테모졸로마이드 및 /도는 방사선 치료에 대하여 선천적 또는 후천적 (획득) 저항성을 갖는 인간， 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스， 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류， 이로부터 분리된 세포 및 조직 및 이의 배양물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 명세서에서， 용어 "미드카인 저해제 "는 미드카인 단백질 또는 유전자를 표적으로 하여 결합 및 /또는 활성을 저하 및 /또는 상실시키는 모든 화합물 및 조성물을 총칭하는 의미로 사용된 것일 수 있다.
■ 예컨대， 상기 미드카인 저해제는 미드카인 단백질 또는 유전자에 대한 (특이적으로 결합하는) 단백질 (loo개 초과하는 아미노산을 포함하는 분자; 예컨대， 항체) , 펩타이드 (1 내지 100개의 아미노산을 포함하는 분자; 예컨대， 압타머)， 을리고뉴클레오타이드 (예컨대， siRNA, shRNA, microRNA, 압타머 등) , 소분자 화합물 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 항체는 미드카인 단백질의 1차구조， 2차구조 또는 3차구조상 외부에 노출된 연속하는 1개 이상， 2개 이상， 3개 이상， 4개 이상 또는 5개 이상 (예컨대, 1 내지 30개， 1 내지 25개， 1 내지 20개, 1 내지 15개， 1 내지 10개， 1 내지 5개, 2 내지 30개， 2 내지 25개， 2 내지 20개, 2 내지 15개， 2 내지 10개， 2 내지 5개， 3 내지 30개， 3 내지 25개， 3 내지 20개， 3 내지 15개， 3 내지 10개, 3 내지 5개， 4 내지 30개， 4 내지 25개， 4 내지 20개， 4 내지 15개， 4 내지 10개， 4 내지 5개， 5 내지 30개， 5 내지 25개, 5 내지 20개， 5 내지 15개， 5 내지 10개， 또는 5 내지 7개)의 아미노산 잔기를 에피토프 (항원결정부위)로 하는 모든 서브타입의 면역글로불린 (예컨대， IgA, IgD, IgE, IgG ( IgGl, I G2 , IgG3, IgG4) , IgM, 등) 형태의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 (예컨대， scFv, (scFv)2, scFv-Fc , Fab, Fab' , F(ab ' )2 등)일 수 있다. 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 상기 항체는 마우스 항체， 키메라 항체， 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 상기 항체는 하이브리도마로부터 유래하거나 재조합적 또는 화학적으로 합성된 것일 수 있다. 상기 압타머는 미드카인 단백질 또는 유전자의 특정 부위에 특이적으로 결합하는 5 내지 100개 5 내지 40개， 5 내지 30개， 또는 5 내지 20개)의 아미노산을 포함하는 펩타이드 분자 또는 5 내지 10nt (뉴클레오타이드) (예컨대， 5 내지 90nt , 5 내지 80nt , 5 내지 70nt , 5 내지 60nt， 5 내지 50nt , 5 내지 40nt， 5 내지 30nt , 또는 5 내지 20nt )의 올리고뉴클레오타이드 분자일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 미드카인 유전자의 1차구조, 2차구조 또는 3차구조상 외부에 노출된 연속하는 3개 이상， 4개 이상 또는 5개 이상 (예컨대， 3 내지 50개， 3 내지 45개, 3 내지 40개， 3 내지 35개， 3 내지 30개, 3 내지 25개， 3 내지 20개， 3 내지 15개 3 내지 10개， 3 내지 5개， 4 내지 50개， 4 내지 45개 4 내지 40개, 4 내지 35개, 4 내지 30개, 4 내지 25개 ᅳ 4 내지 20개， 4 내지 15개 4 내지 10개, 4 내지 5개， 5 내지 50개, 5 내지 45개， 5 내지 40개， 5 내지 35개， 5 내지 30개， 5 내지 25개， 5 내지 20개, 5 내지 15개, 5 내지 10개， 또는 5 내지 7개)의 뉴클레오타이드 부위에 특이적으로 결합하는 3 내지 100개, 3 내지 90개， 3 내지 80개, 3 내지 70개， 3 내지 60개， 3 내지 50개， 5 내지 100개， 5 내지 90개， 5 내지 80개, 5 내지 70개， 5 내지 60개， 5 내지 50개， 10 내지 100개， 10 내지 90개, 10 내지 80개， 10 내지 70개， 10 내지 60개, 또는 10 내지 50개의 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 분자일 수 있다.
일 예에서， 상기 미드카인 저해제는 RNA 압타머 (Aptamer) (예컨대， ' Br i t i sh Journal of Pharmacology (2014) 896-904 ' 참조)， 미드카인 표적 안티 센스 (Ant i sense) (예컨대， US 2011-0159022 Al 참조)， 항 미드카인 항체 (예컨대， CELLMID l imi ted 제품 (예컨대， US 9163081참조)， 미드카인 저해 화합물 (예컨대， Axon Medchem의 iMDK (CAS no . 881970-80-5) , Calbiochem의 i MDK ( 3- ( 2- ( 4-F 1 uorobenzy 1 ) imidazo[2 , l-b] thi azol -6-y 1 ) -2H-chr omen-2-one , 3-(2-( 4-F 1 uorobenzy 1 ) i m i dazo [ 2 , 1一 b ] [ 1， 3 ] t h i azo 1ᅳ 6_y 1 )ᅳ 2H_chr omenᅳ 2ᅳ one ) 등)， 미드카인 유전자에 대한 shRNA (예컨대， 서열번호 1 , 서열번호 2 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예는 미드카인 저해제를 유효성분으로 포함하는 방사선 치료 및 /또는 테모졸로마이드에 대한 저항성 극복 또는 반응성 증진을 위한 약학 다른 예는 미드카인 저해제를 방사선 치료 및 /또는 테모졸로마이드에 대한 저항성 극복 또는 반웅성 증진을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는， 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성 극복 방법 및 /또는 반웅성 증진 방법을 제공한다.
상기 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성은 뇌종양
(예컨대， 교모세포종)의 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성일 수 있다.
상기 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성은 테모졸로마이드 투여 및 /또는 방사선 조사를 통한 뇌종양 치료시에 종양 세포의 감소， 소멸， 종양 크기 /부피의 감소 및 /또는 소멸 등의 항암 효과가 나타나지 않거나 나타나더라도 치료적으로 유의미한 수준으로 나타나지 않거나， 테모졸로마이드의 투여량 및 /또는 방사선 조사량에 의존적으로 항암 효과가 나타나지 않는 것을 의미할 수 있다.
상기 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성 극복은 테모졸로마이드 투여 및 /또는 방사선 조사를 통한 뇌종양 치료시에 종양 세포의 감소， 소멸， 종양 크기 /부피의 감소 등의 항암 효과가 저항성이 없는 뇌종양에서와 유사한 수준 또는 치료적으로 유의미한 수준으로 나타나거나， 테모졸로마이드의 투여량 및 /또는 방사선 조사량에 의존적으로 (즉， 투여량 및 /또는 조사량에 비례하여) 항암 효과가 나타나는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서， 별도의 언급이 없는 한， 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성 극복은 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 반웅성 (민감성) 증진과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
다른 예는 미드카인 저해제를 유효성분으로 포함하는 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료의 효능 증진을 위한 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 미드카인 저해제를 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료의 효능 증진을 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료의 효능 증진 방법을 제공한다.
상기 효능 증진은 뇌종양， 예컨대 교모세포종에 대한 항암 효능이 테모졸로마이드 투여 또는 방사선 치료를 각각 단독으로 수행하는 경우와 교모세포종)의 종양세포의 감소 (증식 억제 및 /또는 apoptosis 증가)， 소멸， 종양 크기 /부피의 감소 및 /또는 소멸， 줄기세포능 저해， 뇌종양 (예컨대, 교모세포종)의 재발 방지 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 의미하는 것일 수 있다.
상기 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료의 효능 증진을 필요로 하는 대상은 뇌종양 환자, 예컨대， 교모세포종 환자， 또는 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료에 대한 저항성을 갖는 뇌종양 환자, 예컨대 교모세포종 환자일 수 있다.
상기 방사선 치료는 통상적인 뇌종양 치료에 적용되는 방사선 치료를 의미하는 것으로, 방사선 조사량은 환자 연령， 환자의 건강 상태， 뇌종양 종류， 병변 부위， 병변 크기， 병기 (tumor grade) , 병세, 등의 다양한 요인을 고려하여 처방될 수 있다. 예컨대， 상기 방사선 치료는 병변 부위의 1회 조사되는 방사선량이 약 lGy 내지 약 6Gy, 약 lGy 내지 약 4Gy, 약 lGy 내지 약 2Gy, 약 2Gy 내지 약 6Gy, 약 2Gy 내지 약 4Gy, 또는 약 4Gy 내지 약 6Gy이거나， 및 /또는 한 cycle의 조사되는 총 방사선량이 약 10Gy내지 약 60Gy, 약 10Gy 내지 약 55Gy, 약 lOGy 내지 약 50Gy, 약 10Gy 내지 약 45Gy, 약 10Gy 내지 약 40Gy, 약 lOGy내지 약 35Gy, 약 lOGy 내지 약 30Gy, 약 lOGy내지 약 25Gy 또는 약 lOGy 내지 약 20Gy인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. .
상기한 약학 조성물， 흔합제， 제 1 약학 조성물， 및 /또는 제 2 약학 조성물은 유효성분 (미드카인 저해제 및 /또는 테모졸로마이드) 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체， 희석제， 및 /또는 부형제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용 가능한 담체는， 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 텍스트로스， 수크로스， 솔비를， 만니를, 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈， 셀를로스， 물， 시럽， 메틸 샐를로스， 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석， 스테아르산 마그네슘， 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제， 부형제, 윤활제， 습윤제， 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제， 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 흔합제 또는 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하 주입， 근육 주입， 복강 주입, 내피 투여， 국소 투여, 비내 투여， 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시， 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한， 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 명세서에 있어서 "약학적 유효량 "은 약물이 약학적으로 의미있는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미한다. 1회 투여를 위한 미드카인 저해제의 약학적 유효량과 테모졸로마이드의 약학적 유효량은 각각의 약물의 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중, 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간， 투여 간격, 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감웅성.과 같은 요인들에 따라서 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대， 1회 투여를 위한 상기 미드카인 저해제와 테모졸로마이드의 각각의 약학적 유효량은 0.001 내지 100rag/kg, 또는 0.01 내지 10mg/kg 범위일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 1회 투여를 위한 약학적 유효량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나， 적절하게 분량하여 제제화되거나， 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 상기 키트에 있어서， 1회 투여를 위한 미드카인 저해제의 약학적 유효량 및 테모졸로마이드의 약학적 유효량이 기본단위로 각각포장용기에 포함되어 있는 것일 수 있다.
미드카인 저해제와 테모졸로마이드의 의 병용 투여시， 병용 투여 후 다음 병용 투여까지의 기간으로 정의되는 병용 투여간 투여 간격은 6 시간 내지 30일, 예컨대， 8 시간 내지 30일, 12 시간 내지 30일， 24시간 내지 30일 3일 내지 30일， 또는 7일 내지 14일일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 병용 투여가 유효 성분으로 미드카인 저해제를 포함하는 제 1 약학 조성물 및 유효성분으로 테모졸로마이드를 포함하는 제 2 약학 조성물을 순차적으로 동시， 또는 0. 1분 내지 60분 (예컨대， 0. 1분 내지 30분， 0. 1분 내지 10분， 1분 내지 30분 또는 1 내지 10분)일 수 있으며 그 투여 순서는 서로 바뀌어도 무방하다.
상기 흔합제 또는 약학 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 액스제 산제， 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며， 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
다른 예는
후보 화합물을 뇌종양 시험군 세포에 접촉시키는 단계;
상기 후보 화합물 접촉 후의 시험군 세포의 미드카인 단백질 양 및 /또는 미드카인 유전자의 발현량 (mRNA 양)을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 미드카인 단백질 양 및 /또는 미드카인 유전자의 발현량올 상기 후보 화합물 접촉 전 또는 상기 후보 화합물과 접촉하지 않은 뇌종양 비교군 세포의 미드카인 단백질 양 및 /또는 미드카인 유전자의 발현량과 비교하는 단계
를 포함하는， 뇌종양의 방사선 치료 및 /또는 테모졸로마이드에 대한 저항성 극복을 위한 제제 또는 방사선 치료 및 /또는 테모졸로마이드에 대하여 저항성을 갖는 뇌종양 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 스크리닝 방법은 뇌종양 비교군 세포의 미드카인 단백질 양 및 /또는 미드카인 유전자의 발현량 (mRNA 양)을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 스크리닝 방법은 상기 비교하는 단계 이후에， 시험군 세포의 미드카인 단백질 양 및 /또는 미드카인 유전자의 발현량이 비교군 세포와 비교하여 감소한 경우, 상기 후보 화합물을 뇌종양의 방사선 치료 및 /또는 테모졸로마이드에 대한 저항성 극복을 위한 제제 또는 방사선 치료 및 /또는 테모졸로마이드 저항성 뇌종양 치료제의 후보 물질로 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 뇌종양 시험군 세포와 뇌종양 비교군 세포는 동일한 뇌종양 환자로부터 유래한 (분리된) 뇌종양 세포 또는 이의 배양물일 수 있다. 상기 있다.
상기 후보 화합물은 각종 화합물， 예컨대， 단백질， 폴리템타이드， 올리고펩타이드， 폴리뉴클레오타이드， 올리고뉴클레오타이드， 이외의 각종 화학 물질， 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것이 수 있다.
일 구체예에서， 상기 미드카인 단백질 양 또는 미드카인 유전자의 발현량은 통상적인 방법에 의하여 측정될 수 있다.
예컨대， 상기 미드카인 단백질의 양은 상기 미드카인 단백질에 결합하는 화합물， 항체， 압타머 등을 이용하는 통상적인 효소 반웅， 형광， 발광 및 /또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며， 구체적으로， 면역크로마토그래피 ( I隱 unochromatography) , 면역조직화학염색， 효소결합 면역톱착 분석 (enzyme l inked immunosorbent assay: ELISA) , 방사선 면역즉정법 (radioimmunoassay: RIA) , 효소 면역분석 (enzyme immunoassay: EIA) , 형광면역분석 (Floresence immunoassay: FIA) , 발광면역분석 ( luminescence i醒 unoassay: LIA) , 웨스턴블라팅 (Western blott ing) , 마이크로어레이법， 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 상기 미드카인을 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA 또는 mR A)의 발현량은 mRNA 수준에 의하여 측정 가능하며, mRNA 수준은 통상의 유전자 분석 방법을 이용하여 측정할 수 있으며， 예컨대 상기 유전자와흔성화 가능한 프라이머， 프로브， 또는 앱타머를 사용하는 통상적인 유전자 분석 방법， 예컨대， 폴리머레이즈 연쇄 반웅법 (PCR) , FISH( f luorescent in si tu hybr idizat ion) , 마이크로어레이법， 등을 이용하여 측정할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 프라이머는 미드카인을 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 lOOObp 예컨대 10 내지 500bp , 20 내지 200bp , 또는 50 내지 200bp의 유전자 단편을 검출할 수 있는 것으로， 상기 유전자 단편의 3 ' -말단 및 51 - 말단 각각의 연속하는 5 내지 100bp , 예컨대， 5 내지 50bp , 5 내지 30bp , 또는 10 내지 25bp 부위와 흔성화 가능한 (예컨대， 상보적인) 염기서열을 포함하는 프라이머쌍일 수 있다. 상기 프로브 또는 앱타머는 총 길이가 5 내지 100 bp , 암호화하는 유전자 (전장 DNA, cDNA, 또는 mRNA)의 염기서열 중 연속하는 5 내지 100 bp , 5 내지 50bp , 5 내지 30bp , 또는 5 내지 25bp의 유전자 단편과 결합 가능 또는 흔성화 가능한 (예컨대， 상보적) 염기서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 '결합 가능'하다 함은 상기 유전자 부위와 공유 결합 등의 화학적 및 /또는 물리적 결합에 의하여 결합할 수 있음을 의미할 수 있고， 상기 '흔성화 가능'하다 함은 상기 유전자 부위의 염기서열과 이상， 예컨대 90% 이상， 95% 이상， 98% 이상， 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 가짐으로써 상보적 결합이 가능함을 의미할 수 있다. 【발명의 효과】
교모세포종 세포의 자가 분비 생장 인자인 미드카인이 종양 세포의 증식에 미치는 영향을 규명함으로써 새로운 교모세포종 치료의 표적으로서의 활용성을 제시하며 , 이를 통하여 신약 개발을 의한 타겟으로서 미드카인의 새로운 용도를 제공한다. 또한， 미드카인 저해제를 뇌종양， 예컨대 교모세포종의 치료에 단독 또는 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료와 함께 사용함으로써 상승된 항암 효과을 얻을 수 있으며, 테모졸로마이드 및 /또는 방사선 치료와 같은 기존의 뇌종양 치료에 저항성이 있는 뇌종양 (예컨대， 교모세포종)의 치료 또는 생명 연장이 가능하다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 교모세포종 환자의 종양 조직과 정상 조직에서 미드카인 단백질을 면역조직화학염색법 ( I隱 unohi stochemi stry)을 통하여 염색하여 관찰한 결과를 보여주는 이미지이다 (bar : 100而) .
도 2는 교모세포종 환자의 종양세포에서의 미드카인 단백질 발현 수준을 웨스트블랏으로 관찰한 결과를 보여주는 이미지이다.
도 3은 N827 교모세포종 세포 배양액에 미드카인 (MDK) 중화 항체 및 IgG (대조군) 처리시 상대적 흡광도를 항체 처리 농도에 따라 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 4는 N131 , 047T, 및 N827 3종의 교모세포종 세포 배양액에 MDK중화 그래프이다.
도 5는 N131 , 047T, 및 N827 3종의 교모세포종 세포에 MDK 중화 항체 및 IgG (대조군)를 각각 처리 후 11일째에 세포 모습을 현미경으로 관찰한 결과 (사진; 우측) 및 종양구 개수를 나타낸 그래프 (좌측)이다.
도 6은 N131 및 N827 2종의 교모세포종 세포에서 MDK에 대한 shRNA 처리시의 웨스턴블럿 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 N827 교모세포종 세포에 MDK에 대한 shRNA를 처리한 경우의 세포 증식률 (Relat ive ATP로 표시)을 shRNA를 처리하지 않은 경우 (NT)와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 8은 N131 교모세포종 세포에 MDK에 대한 shRNA 처리시 종양구 형성 모습 (상단)， 종양구가 형성되지 않은 세포 수를 나타낸 그래프 (중간)， 및 이를 수치화한 결과 (하단)을 보여준다.
도 9는 N827 교모세포종 세포에 MDK에 대한 shRNA 처리시 종양구 형성 모습 (상단)， 종양구가 형성되지 않은 세포 수를 나타낸 그래프 (중간)， 및 이를 수치화한 결과 (하단)을 보여준다.
도 10a 내지 10c는 N131 , 047T, 및 N827 3종의 교모세포종 세포에 MDK 표적 중화 항체와 테모졸로마이드 (TMZ)를 단독 처리한 경우와 병용한 경우의 세포 증식 결과 그래프 및 현미경 관찰 이미지를 각 세포별로 보여준다.
도 11은 교모세포종에 방사선 조사만 수행한 경우 (control )와 방사선 조사와 미드카인 표적 항체 투여를 병용한 경우 (ant i-MDK)의 세포구 형성 모습을 방사선 조사량 별로 보여주는사진이다.
도 12는 교모세포종에 방사선 조사만 수행한 경우 (control )와 방사선 조사와 미드카인 표적 항체 투여를 병용한 경우 (ant i-MDK)의 세포구 수를 방사선 조사량 별로 보여주는 그래프이다.
도 13은 미드카인 넉다운 (shMDK 감염) N827 세포 및 N827 세포
(미드카인 넉다운 없음)가 각각 주입된 뇌정위 마우스 모델의 뇌를
H&E(Hematoxyl in and Eosin) 염색을 통하여 관찰한 결과를 보여주는 이미지이다 ·
도 14는 미드카인 넉다운 (shMDK 감염) N827 세포 및 N827 세포 나타낸 그래프이다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 실시예 1: 교모세포종환자조직 내 미드카인 (MDK) 발현 확인
교모세포종 환자의 암 조직과 정상 조직에서의 미드카인 단백질 발현 수준을 면역화학염색법 (I隱 unohistochemistry)을 통해 확인하였다. 교모세포종 환자로부터 얻은 암 조직 (NS234 Tumor & NS320 Tumor 로 명명 ; 삼성서울병원 제공)과 정상 조직 (NS234 Normal & NS320 Normal 로 명명; 삼성서울병원 제공)을 파라핀에 고정시키고， xylene 15분 처리하여 deparaf f inizat ion 시킨 후, 100%(v/v) ethanol 로 10분， 95%(v/v) ethanol 로 10분, 및 dH20 로 5분 처리하여 수화 (hydration)시켰다. 상기 수화시킨 조직을 10분간 끓여줌으로써 antigen unmasking을 진행하였다.
그 후， dH20에 5분씩 3번 washing하고， 3¾(v/v) hydrogen peroxide를 10분간 처리한후， dH20로 5분 동안 1회 washing 하고， wash buffer 로 5분간 washing 하였다. 상기 Wash buffer 로 1XTBS/0.1%(ν/ν) Tween-20(1XTBST)를 사용하였다. Washing 이 끝난 조직은 Blocking solution (1%(ν/ν) BSA (Bovine Serum Albumin, cat. A2153-100G, Sigma-Aldr ich) in PBS (cat. 10- 010-049, Gibco) + 0.025%(v/v) TritonXlOO (cat. T8787, Sigma-Aldr ich) + 5 (v/v) 2' Ab host serum (normal goat serum, cat . S— 1000， vector) 300ul 로 상온에서 30분간 blocking 하였다. 그 후, Blocking solution 을 제거한 후， Midkine primary ant i body (Abeam, ab52637)를 1%(ν/ν) BSA in PBS + 0.025%(v/v) TritonXlOO에 1:250으로 희석하여 4°C 에서 하룻밤 동안 처리하였다.
Primary antibody 처리 단계가 끝난 후， 기존 antibody 를 제거하고， wash buffer 로 5분 3번 washing 한 早， goat ant i -rabbit antibody (vector, 1:1000으로 희석하여 상온에서 1시간동안 처리하였다. 1시간 후 wash buffer 로 5분 간 3번 washing을 진행하고， SignalStain Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit, #8114)를 각 조직에 1-2방울씩 떨어뜨려 상온에서 30분간 incubation 하였다. Incubation 이 끝나면 상기 detection reagent 를 제거하고 wash buffer 에 5분간 3번 washing 한 뒤， 1/10 희석한 DAB (diaminobenzidine) solution 을 각 조직에 200ul 의 양으로 뿌려주었다. Staining 이 잘 되었는지 확인한 후 dH20 로 washing 하고， hematoxylin 에 30초간 staining 한 후， 다시 dH20 에 5분 간 2번 washing 하였다. 이후 80%(v/v) ethanol 로 10초간 2번， 95%(v/v) ethanol 로 10초간 2번， 100%(v/v) ethanol 10초간 2번， xylene 로 10초간 2번 처리하여 dehydration 시키고 mounting을 진행하였다.
상기 얻어진 면역화학염색 (I隱 unohistochemistry) 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 면역화학염색법을 통해 동일 환자의 정상 뇌조직 및 뇌종양 조직에서 MDK 발현 수준을 보여주는 것으로, MDK 이 뇌종양 조직에서 특이적으로 수준이 증가되어 있음을 확인할 수 있다.
또한， 교모세포종환자 유래 종양 세포 11종 (각각 N131, 096, 047, 022, 783, 464, 352-1, 352-2, 559, 448， 및 N827로 각각 명명; 삼성서울병원 제공)에 대하여 웨스턴블럿을 수행하였다.
상기 웨스턴블럿은 12% SDS page gel 에 각 세포 lysate 를 30ug 의 양으로 loading 하여 Gel running 100V)하였으며， Transfer (100V) 1시간 진행 후 5¾)(v/v) BSA 로 상온에서 1시간 Blocking 하였다. Midkine( Abeam, ab52637)과 GAPDH cell signaling, 2118) 1차 항체를 상온에서 2시간 처리하고， 1XTBST 로 10분씩 3번 washing 후, Anti-rabbit HRP linked 2차 항체 (cell signaling, 7074S)를 상온에서 1시간 처리하였다. 그 후, 1XTBST 로 10분씩 3번 washing 한 푸， membrane 에 Super Signal West Dura Extended Duration SubstrateCTermo scientific, 34075)용액을 분사하여 develop시켰다.
상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보여지는 바와 같이， 상기 11종의 종양 세포 중 464와 352-2 세포를 제외한 9종의 세포에서 MDK 가 발현됨을 확인하여， MDK 발현과 교모세포종과 높은 연관성이 있음을 실시예 2: 교모세포종종양세포에 대한 미드카인 중화항체 처리 효과 미드카인 중화 항체를 처리 농도를 결정하기 위하여， 상기 실시예
2에서 준비된 N827 교모세포종 세포의 배양액을 이용해 ELISA 를 진행하였다. ELISA 는 Human Midkine Standard ELISA Development Kit (PeproTech, 900- K190; 하기 시험에 사용된 시약은 및 항체는 본 키트에 포함된 것을 사용함)를 이용하여 진행하였다.
ELISA plate준비 시 Capture antibody를 PBS에 1 /ml로 희석한후, lwell 당 100 ^씩 분주하고 sealing 하여， 상온에서 하룻밤동안 incubation 하였다. Incubation 후， Suction 하고， lwell 당 300 μί wash buffer(0.05%(v/v) Tween-20 in PBS)를 넣어 4번 washing 하였다. 마지막 washing 이 끝난 후， paper towel 위에 엎어놓고 buffer 가 완전히 제거되도록 말린 후， 각 well 에 block buffer (1%(ν/ν) BSA in PBS)를 300 씩 넣고 상온에서 1시간동안 incubation하였다. 그 후, 다시 Suction한 후， lwell 당 300 βί wash buffer로 4번 washing하였다.
실험 그룹은 Standard (2ng, lng, 0.5ng, 0.25ng, 0.125ng, Ong) , media only (흡광도 측정 시 세포가 아닌 media 에서 기본적으로 측정되는 값을 제외하고 순수한 세포 자체의 흡광도만을 계산하기 위한 것임), IgG (Normal Rabbit IgG (cat. AB-105-C, R&D Systems)) 처리군 (control; 0， 0.156, 0.625， 2.5， 10zg/ml), 및 Midkine 표적 중화 항체 (MK(H- 65)Antibody(cat.sc-20715, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)) 처리군 (0， 0.156, 0.625， 2.5， 10 g/ml)로 구성하였으며， 96well plate 에 각 그룹의 샘플들을 lwell 당 100 ^씩 (각 샘플당 3 well 준비) 분주하여 상온에서 2시간 incubation 하였다. Incubation 이 끝난 후， 샘플을 suction 하고， lwell 당 300 id wash buffer로 4번 washing하였다.
Detection을 위해 Detection antibody를 1 g/ml로 회석하여 lwell당 100 ^씩 분주하고 상온에서 2시간동안 incubation 하였다. 2시간 후 suction 하고 lwell 당 300 μί wash buffer 로 4번 washing 하였다. 5.5 Avidin-HRP 를 11ml 희석 용액에 1:2000으로 희석한 후， 각 well 당 100 ^씩 샘플을 Suction 하고 lwell 당 300 f wash buffer 로 4번 washing 한 후， 각 well 에 substrate solution 을 100 씩 분주하여 Color development 를 확인하였다 (ELISA plate reader at 405nm with wavelength correction set at' 650nm).
상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 Y 축은 (Relative
Absorbance)를 나타내는 것으로， 상기 시험에서 측정된 각 그룹의 흡광도를 IgG Oug/rnl 처리시의 흡광도 ('1'로 산정)에 대한 상대값으로 나타낸 것이다. 도 3에서 보여지는 바와 같이， IgG 처리군과 미드카인 중화항체 처리군에서의 상대적 흡광도 차이가 가장 많이 나는 경우가 항체 처리 농도 lOug/ml 인 경우임을 확인하여， 이후 세포 실험에 적용할 중화 항체의 처리 농도를 lOug/ml로 결정하였다.
이어서, 미드카인의 중화가 교모세포종 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 96well plate 에 N131 (도 4에서 'N131' 로 표시， 047T (도 4에서 '047' 로 표시 ) 및 N827 (도 4에서 'N827'로 표시 )의 3종의 교모세포종 세포를 각각 lwell 당 lOOul 세포 배양액에 5000개 세포가 포함되도록 각 세포주당 3well 씩 seeding 하였으며， IgG(10//g/ml )와 Midkine 표적 중화 항체 (MKCH— 65)Antibody(cat.sc-20715, SANTA CRUZ ^( ：丽^^^ ^/ /^^를 각각 처리하였다. Seeding 직후와 4일 후 EZ-Cytox(EZ-cytox Cell Viability Assay Kit; (주)대일바이오텍)를 lwell 당 10ul 의 양으로 처리하고， 37°C 1시간동안 incubation 한 후， 450nm 에서 흡광도를 측정하여 세포 증식 정도를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이， 미드카인 중화항체를 처리하여 미드카인의 발현을 억제한 경우 (anti— MDK Ab: □ ), IgG 를 처리한 대조군 (Control: 國)과 비교하여, 교모세포종 세포의 단기 생존률 (4일간 생존률)이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 미드카인이 교모세포종 종양세포의 생장에 직접적 관련성이 있음을 의미하는 것이다.
또한， 종양세포의 줄기세포능 (sternness)과 관련된 종양구 형성능 (Neurosphere formation)을 측정하기 위하여， 96well plate 에 N131, (Neurobasal-A Medium (cat. 10888-022, gibco) + N-2 Supplement (100X) (cat. 17502-048, life technologies) + B-27 Supplement (50X) (cat. 17504-044, life technologies) + human FGF-bas i c (cat . AF-100-18B, Peprotech) + human EGF (cat. AF-100-15, Peprotech) + Penicillin-Streptomycin (cat. 15140-163, gibco) + L-glut amine 200mM (cat. 25030， gibco))에 N131 (N131) 세포 및 N827 (N827) 세포는 각각 100개， 047 (047) 세포는 500개 세포가 포함되도록 seeding 하였으며 (각 세포 당 5well 씩 준비)， IgG(10 g/ml； Control 로 표시)와 Midkine 표적 중화 항체(^((11-65)^^1)0(1 :^ .3(:-20715， SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)) (10/g/ml; MDK Ab 로 표시)를 각각 처리하였다. 11일 후에 현미경으로 관찰하여 형성된 종양구의 수를 확인하여 비교 분석하였다.
상기 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 우측 사진은 상기 형성된 종양구를 현미경으로 관찰한 사진이고 (200X), 좌측 그래프는 각 웰당 관찰된 종양구 수를 나타낸 그래프이다.
도 5에서 보여지는 바와 같이, MDK 중화항체항체 처리에 의하여 MDK 의 발현이 저해된 경우， IgG 가 처리된 경우 (control)와 비교하여， 교모세포종 환자유래 세포의 종양구 형성능이 감소하고， 형성된 종양구의 크기도 감소함을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 MDK 발현이 종양세포의 종양구 형성능에 영향을 미침을 보여주는 것이며， MDK 표적 항체 처리에 의하여 교모세포종 치료， 특히 교모세포종의 줄기세포능 저해를 통한 교모세포종의 보다 근본적인 치료 및 /또는 재발 방지에 활용될 수 있음을 제안하는 것이다. 실시예 3: 교모세포종세포에서의 미드카인 유전자의 넉다운 효과
미드카인의 유전자 수준에서의 감소가 교모세포종 세포에 어떠한 영향을 미치는지 시험하기 위하여， 미드카인 유전자를 넉다운 시켰다. 구체적으로， Midkine knockdown virus 를 N131 및 N827 세포에 infection 시킨 후 (5X106 cell 에 virus를 40ul 의 양으로 infect ion시킴)， Western Blot으로 단백질 발현 정도를 확인하였다. 상기 Midkine knockdown virus (Lentivirus)는 아래의 두 종류의 shRNA를 각각 포함한다:
shRNA 210 (shRNA①로 표기): ShRNA252 (shRNA②로 표기):
CCGGAG MGGG編 GGACTAGACCTCGAGGTCTAGTCCmCCC^ (서열번호 2). 상기 Midkine knockdown virus 는 shRNA Glycerol stock (shRNA 210 (shRNA①로 표기; TRCN0000331210) 및 ShRNA252( shRNA②로 표기; TRCN0000331252)) 형태로 Sigma-Aldrich로부터 구입하여 사용하였다.
Western Blot 은 12%(w/v) SDS page gel 에 각 샘플 lysate 를 30ug 의 양으로 loading 하여 Gel running(lOOV)하였으며， Transfer (100V) 1시간 진행 후 5%(v/v) BSA 로 상온에서 1시간 Blocking 하였다. Midkine(Abcam, ab52637)과 GAPDH(cell signaling, 2118) 1차항체를 상온에서 2시간 처리하고， 1XTBST 로 10분씩 3번 washing 후， Anti-rabbit HRP linked 2차 항체 (cell signaling, 7074S)를 상온에서 1시간 처리하였다. 그 후， 1XTBST 로 10분씩 3번 washing 한 후, membrane 에 SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate(Termo scientific, 34075)용액을 분사하여 develop시켰다.
상기 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이， 미드카인에 대한 shRNA 가 처리된 세포주 (shMDK① 및 shMDK②로 표시)에서 미드카인의 발현이 저해됨을 확인할 수 있으며， 이러한 결과는 MDK 유전자가 성공적으로 knock down되었음을 의미하는 것이다.
이어서， 미드카인의 유전자 수준에서의 발현 저해가 교모세포종 세포의 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해， 384well plate 에 상기 얻어진 미드카인 유전자가 knock down 된 N827 교모세포종 세포와 knock down 되지 않은 N827세포 (NT 로 표시)를 lwell 당 4ul 세포 배양액 (Neurobasal_A Medium cat 10888-022， gibco) + N-2 Supp 1 ement ( 100X) ( cat .17502-048 , life technologies) + B-27 Supp 1 ement ( 50X ) ( cat .17504-044 , life technologies) + human FGF-basic(cat .AF-100-18B, Peprotech) + human EGF ( cat .AF— 100-15， Peprotech) + Penici 11 in-Streptomycin(cat .15140-163, gibco) + L-glut amine 200mM(cat.25030, gibco))에 각각 1000개 세포가 포함되도록 seeding 하였다 (각 세포주 별로 3well 씩 준비함). Seeding 직후와 4일 후， 및 8일 후 ATPliteCATPlite IStep 1,000 ML luminescent reagent , cat.6016739, PerkinElmer)를 이용하여 상대적 ATP 양을 측정함으로써 세포 증식 정도를 상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다 (shRNA①: shRNA① (서열번호 1) 처리하여 미드카인 유전자 knock down; shRNA②: shRNA② (서열번호 2) 처리하여 미드카인 유전자 knock down) . 도 7에서 보여지는 바와 같이， 미드카인 유전자가 knock down 된 경우， 그렇지 않은 경우와 비교하여， 교모세포종 세포의 생존률이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있다.
교모세포종 세호의 줄기세포능과 관련된 종양구 형성능을 측정하기 위하여， Midkine 이 . knockdown 된 세포 (상기 Midkine knockdown virus 감염된 세포)와 knockdown 되지 않은 (Midkine knockdown virus 감염되지 않은 세포) N131 및 N827 교모세포종 세포를 이용하여 Limiting Dilution Assay 를 진행하였다. lwell 당 lOOul 세포 배양액 (Neurobasal-A Medium cat 10888-022， gibco) + N-2 Sup 1 ement ( lOOX) (cat .17502-048 , life technologies) + B-27 Sup 1 ement ( 50X) ( cat .17504-044 , life technologies) + human FGF- basic(cat.AF-100-18B, Peprotech) + human EGFCcat .AF-100-15, Peprotech) + Penici 11 in-Streptomycin(cat .15140-163, gibco) + L-glut amine 200mM( cat.25030, gibco))에 각각 12， 25， 50， 100개 세포가 포함되도록 그룹당 lOwell 씩 96well plate 에 seeding 하였으며 13일 후 현미경으로 종양구가 형성되지 않은 well의 수를 확인하여 비교 분석하였다.
또한， 상기 측정된 세포수 결과를 SPSS 통계 프로그램 (Statistical Package for the Social Sciences; IBM)을 사용하여 통계 분석하여， 각 그룹별로 평균 몇 개의 세포가 있어야 종양구를 형성할 수 있는지를 확인하였다.
도 8은 N131 세포주에 대하여 얻어진 결과 (상단: 현미경 관찰 사진 (200X); 중간: 종양구가 형성되지 않은 세포 수를 나타낸 그래프; 하단: 통계 분석 결과)를 보여준다. 도 8의 상단 및 중간에서 알 수 있는 바와 같이， MDK 유전자 표적 저해게 (MDK 에 대한 shRNA)를 처리 후의 종양구 형성능은 비교군 (MDK 에 대한 shRNA 무처리군: NT)과 비교하여 현저하게 감소됨을 확인할 수 있다. 또한， 하단의 표의 'Estimate'는 종양구를 형성할 수 있는 평균 세포수를 의미한다. MDK 에 대한 shRNA 무처리군 (NT)의 경우 61.7개의 세포만 있어도 종양구를 형성할 수 있는 반면， shRNA①을 처리한 군 (MDK 세포가 있어야 종양구를 형성할 수 있기 때문에， MDK 에 대한 shRNA를 처리한 경우 (즉， MDK 발현을 저해한 경우)의 종양구 형성능은 무처리군 (NT)과 비교하여 현저하게 감소한다고 판단할 수 있다.
도 9는 N827 세포주에 대하여 얻어진 결과 (상단: 현미경 관찰 사진 (200X) ; 중간: 종양구가 형성되지 않은 세포 수를 나타낸 그래프; 하단: 통계 분석 결과)를 보여준다. 도 9의 상단 및 중간에서 알 수 있는 바와 같이 , MDK 유전자 표적 저해게 (MDK 에 대한 shRNA)를 처리 후의 종양구 형성능은 비교군 (MDK 에 대한 shRNA 무처리군: NT)과 비교하여 현저하게 감소됨을 확인할 수 있다. 또한， 하단의 표의 종양구를 형성할 수 있는 평균 세포수를 의미하는 ' Est imate '의 결과를 보면 MDK 에 대한 shRNA무처리군 (NT)의 경우 53.3개의 세포만 있어도 종양구를 형성할 수 있는 반면， shRNA①을 처리한 군 (MDK K/D①)와 shRNA②을 처리한 군 (MDK K/D②)은 모두 575.7개의 세포가 있어야 종양구를 형성할 수 있기 때문에， MDK 에 대한 shRNA 를 처리한 경우 (즉， MDK 발현을 저해한 경우)의 종양구 형성능은 무처리군 (NT)과 비교하여 현저하게 감소한다고 판단할 수 있다.
도 8 및 도 9에서 알 수 있는 바와 같이， MDK 유전자 표적 저해제 (MDK에 대한 shRNA)를 처리 후， 종양세포 생장능이 비교군 (MDK에 대한 shRNA무처리군)과 비교하여， 종양구 형성능이 현저하게 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과는, 교모세포종의 종양세포에 MDK 유전자 수준 저해 (예컨대， MDK에 대한 shRNA 처리)에 의하여 교모세포종 종양세포의 줄기세포능이 감소됨을 의미하는 것으로， MDK 유전자 수준 저해제가 교모세포종의 보다 근본적인 치료 및 /또는 재발 방지에 활용될 수 있음을 제안하는 것이다. 실시예 4: 교모세포종 세포에서의 미드카인 표적 중화 항체와 테모졸로마이드 병용효과 .
미드카인 표적 중화 항체와 테모졸로마이드의 병용 처리가 교모세포종 세포의 생장에 미치는 효과를 비교하기 위하여 Prol i ferat ion assay 를 진행하였다. 96wel l plate 에 N131 , 047 및 N827의 3종의 교모세포종 세포를 lwel l 당 lOOul 세포 배양액 (Neurobasal-A Medium (cat 10888-022 , gibco) + N-2 Supp 1 ement ( 50X) ( cat .17504-044 , life technologies) + human FGF- basic(cat.AF-100-18B, Peprotech) + human EGF( cat .AF-100-15, Peprotech) + Penici 11 in-Streptomycin(cat .15140-163, gibco) + L-glut amine 200mM( cat.25030, gibco))에 5000개 세포가 포함되도록 씩 seeding 하였다 (각 세포군 당 3well 씩 준비함). 시험군은 배양 배지만 포함하는 군 (control: 이 경우 control 항체로서 IgG 를 5ug/ml 의 농도로 함께 처리함)， 테모졸로마이드 ^10201011^(16(0 ；12577， Sigma-Aldr ich 社) 단독 처리군 (처리 농도: 0， 1， 3.9, 15.6， 62.5, 250, lOOOumol； 이 경우 control 항체로서 IgG 를 5ug/ml 의 농도로 함께 처리함)， 미드카인 표적 항체 (MK(H- 65)Antibody(cat.sc-20715, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)) 단독 처리군 (처리농도: 5ug/ml), 및 테모졸로마이드 및 미드카인 표적 항체 처리군 (테모졸로마이드 처리 농도: 0， 1， 3.9, 15.6, 62.5， 250， lOOOumol; 미드카인 표적 항체 처리 농도: 5ug/ml)으로 구성하였다.
미드카인 표적 항체 단독 처리시에는 ELISA 결과를 바탕으로 하여 · 항체를 lOug/ml 농도로 처리하였으나 (실시예 2 참조)， 미드카인 표적 항체를 테모졸로마이드와 병용 처리하는 경우 교모세포종 세포의 증식 감소에 미칠 영향을 고려하여 항체 처리량을 5ug/ml로 조정하였다. Seeding직후， 4일 후， 및 6일 후에 각각 EZ-Cytox(EZ-cytox Cell Viability Assay Kit; ^대일바이오텍)를 lwell 당 lOul처리하고， 37°C에서 1시간동안 incubation한 후， 세포 증식 정도를 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 10a (N131), 도 10b (047)， 및 도 10c (N827)에 각각 나타내었다. 도 10a 내지 10c 은 control (배지에 control IgG 만 처리)의 흡광도 ('1')에 대한 각 실험군의 흡광도 비율 (상대값)을 나타낸다. 도 10a 내지 10c 에는 각 세포주 별로 세포증식 정도를 나타내는 그래프와 세포의 현미경 사진이 나타나 있다. 도 10a 내지 10c 에 나타난 바와 같이， 미드카인 표적 중화 항체와 테모졸로마이드 (TMZ)의 병용 투여시， 테모졸로마이드 단독 투여시 (control IgG 로 표시)와 비교하여， 테모졸로마이드 농도 의존적으로 암 세포 사멸 능력이 높아짐을 알 수 있다 (각 세포주 별로 제시된 그래프 참조). 특히， N827와 047 세포주의 경우， 일정 구간에서 테모졸로마이드 농도가 증가함에 따른 암세포 사멸 효과 증가 양상이 보여지지 않는 것에 비추어， 테모졸로마이드에 대한 저항성을 갖는 암세포주인 것으로 판단되며， 이와 같은 테모졸로마이드에 대한 저항성을 갖는 암세포주에 미드카인 표적 항체를 처리하는 경우 테모졸로마이드 농도 의존적인 암세포 사멸 효과 증진 양상이 회복되거나 테모졸로마이드 단독 처리시보다 현저한 암세포 사멸 효과는 나타냄을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 테모졸로마이드와 미드카인 표적 치료제를 병용처리함으로써 상승된 항암 효과는 물론이고 테모졸로마이드에 대한 저항성을 갖는 암세포주에도 항암 효과를 얻을 수 있음을 보여주며， 테모졸로마이드 저항성 극복을 위한 미드카인 표적 치료제의 용도를 제안하는 것이라고 할수 있다 .
또한， 각 세포주 결과의 하단에 표시된 세포의 현미경 사진에서 알 수 있는 바와 같이， control 및 테모졸로마이드와 미드카인 표적 항체가 각각 처리된 시험군과 비교하여， 테모졸로마이드와 미드카인 표적 항체가 병용 처리된 시험군에서 종양구 형성이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있으며, 이러한 결과는 테모졸로마이드와 미드카인 표적 항체의 병용 처리에 의하여 교모세포종 세포의 줄기세포능이 현저하게 저해됨을 나타낸다. 이러한 병용 처리에 의한 교모세포종 세포의 줄기세포능 저해 효과는 테모졸로마이드에 대하여 저항성을 나타낸 N827와 047 세포주에서도 현저하게 나타났다. 실시예 5: 교모세포종 세포에서의 미드카인 표적 중화 항체와 방사선 치료 병용 효과
미드카인 발현 조절이 교모세포종 세포의 방사선 저항성을 감소시킬 수 있는지 확인하고자 교모세포종 세포에 방사선만을 조사하였을 경우와 방사선 조사 및 미드카인 표적 항체를 병용 투여하였을 경우의 세포구 형성능을 비교 실험하였다.
N827 교모세포종 세포를 6weil cel l cul ture p 1 at e( cat . 140675 , Termo scient i f ic)에 한 wel l당 5X105 cel l씩 분주한 후 24시간동안 incubat ion하여 세포를 안정화시켰다. 24시간 후， 상기 준비된 세포에 IBL 437C blood Irradiator CCIS US, Inc . ,Bedford,MA)로 OGy, 2Gy, 4Gy, 6Gy 의 방사선을 각각 미드카인 표적 항체 (cat . sc-20715, SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY)를 5ng/ml 농도로 처리하였다. 이후 7일간 incubat ion 하여 생성된 세포구를 관찰하였으며 각 실험군별로 생성된 세포구 수를 세어 방사선 단독 조사량이 OGy 인 경우 (방사선 및 미드카인 표적항체 모두 처리하지 않은 실험군)군의 세포구 수를 1로 기준 삼아 다른 실험군의 상대적인 세포구 수를 비교하였다. 도 11은 상기 시험에서 얻어진 종양구 형성 모습을 현미경으로 관찰한 이미지로， 교모세포종 세포의 세포구 형성 정도는 줄기세포능을 나타낸다고 할 수 있다. 도 11의 상단 (control ; 방사선 치료만 수행함)에 나타난 바와 같이 방사선 치료만 하는 경우， 방사선 세기가 증가하여도 교모세포종 세포의 줄기세포능은 감소하지 않는 반면， 방사선 치료와 미드카인 표적 항체 투여를 병행한 경우 (ant i-MDK) , 교모세포종 세포의 줄기세포능이 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있다.
도 12는 상기 얻어진 세포구 수를 나타낸 그래프이다. 도 12에 나타난 바와 같이， 교모세포종 세포에 방사선 치료만 한 경우 (control ) , 방사선 조사량과 무관하게 세포구 사멸 (감소) 효과가 나타나지 않았으나 (즉， 방사선 치료에 대한 저항성을 보임)， 미드카인 표적 항체 투여를 병행한 경우 (Ant i- MDK) , 현저한 암세포구 사멸 (감소) 효과가 나타남을 확인할 수 있으며， 이때의 암세포구 사멸 효과는 방사선 조사량에 비례하여 증가함을 확인할 수 있다. 특히， 방사선 조사량이 0이고 미드카인 표적 항체 투여만 진행한 경우에도 약 40% 정도의 암세포구 감소 효과를 보여서， 미드카인 표적 치료에 의하여 방사선 치료 저항성을 갖는 암세포에 대한 항암 효과 (종양 형성능 저해 효과)를 얻을 수 있음을 확인하였다. 실시예 6: 미드카인 유전자 넉다운에 의한 in vivo종양 억제능 확인 미드카인 유전자가 넉다운되었을 경우 종양 형성능 감소를 확인하기 위해 뇌정위 마우스 모델을 제작하였다. BALB/c-nude 마우스 (오리엔트 바이오, female)에 뇌정위 주입장치를 이용하여 (좌표 AP 0.5mm, ML + 1.7隱， DV - 3.2隱) N827 세포 (이하 N827로 기재)를 개체당 1X104 cel l의 양으로 10분간 Hami lton syringe를 이용하여 주입하였다. 이 때, 상기 N827 세포로서 N827 세포를 사용하였다. 대조군으로, Non target vector(cat. SHC016, Sigma- Aldrich) virus를 감염시킨 N827 세포를 주입한 마우스를 준비하였다. 각 군별 개체수는 10마리씩으로 총 20마리를 준비하였다. 상기 준비된 제작된 뇌정위 마우스 모델은 매일 1회씩 몸무게를 측정하였으며 대조군 개체의 몸무게가 20%이상 감소하였을 때 실험군 (shM 감염 N827 세포 주입) 뇌정위 마우스 모델과 대조군 마우스 모델을 각각 2두씩 희생하여 뇌를 추출하고， 4% Paraformaldehyde Solution (cat.HP2031, 바이오세상)으로 고정 후, H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 통해 종양의 크기를 확인함.
H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색 방법은 다음과 같다:
샘플 슬라이드를 60 °C Slide warmer에 20분간 incubation한 후 Xylene
I， II， III를 각 10분간 처리하고， 10OT(v/v) ethanol, 90% ethanol, 80% ethan 순으로 10분씩 처리; dH20로 5분간 washing해준 뒤 Harris hematoxylin (영동제약， #S 2-1)을 3분 처리하고， 다시 dH20로 5분간 washing; 0.3%(w/v) HC1 in ethanol에 5번 dipping한 후 다시 dH20로 5분간 washing; 0.5%(w/v) a隱 onia in dH20에 5번 dipping한 후 다시 dH20로 5분간 washing; Eosin YCpolyscience, #09859)를 3초간 처리한 후 dH20에 10회 dipping; 다음으로 8 (v/v) ethanol, 90% ethanol, 100% ethar l순으로 5회 dipping후 Xylene I, II， 111를 각 10분간 처리하고， Mounting (permount ： xylene = 3:1) 진행.
나머지 뇌정위 마우스 모델은 각각 몸무게 20% 이상 감소 시 지속적으로 희생하여， 뇌를 추출하고 추후 실험을 위해 4% Paraformaldehyde Solution (cat.HP2031, 바이오세상 社)에 고정 보관하였다.
상기 H&E(Hematoxylin and Eosin) 염색을 통해 종양의 크기를 확인한 결과 (각 군별로 2두씩 표시함)를 도 13에 나타내었다 (bar: 2隱). 도 13에 나타난 바와 같이 올 통해 종양의 크기를 확인한 결과 대조군 (NT)과 비교하여 shMDK 처리군 (shMDK)에서 뇌에 형성된 종양의 크기가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있다 (즉, 종양 형성능 억제됨)，
각 마우스 모델의 생존 기간 (마지막 생존 마우스의 몸무게가 20% 감소시까지의 기간)을 측정하여 도 14에 나타내었다. 도 14에 나타난 바와 것올 확인할수 있다.

Claims

【청구범위】
【청구항 1】
미드카인 (Midkine) 저해제를 유효성분으로 포함하고， 방사선 치료 또는 테모졸로마이드에 대하여 저항성을 갖는 뇌종양에 대하여 항암 효과를 갖는， 뇌종양의 예방또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 약학 조성물은 뇌종양의 종양줄기세포를 저해하는 것인， 약학 조성물.
【청구항 3】
제 1항 또는 계 2항에 있어서， 상기 뇌종양은 교모세포종인， 약학 조성물.
【청구항 4】
게 1항 또는 게 2항에 있어서， 상기 미드카인 저해제는 미드카인 단백질 또는 유전자에 결합하는 항체， 압타머， siRNA, shRNA, mi croR A, 소분자 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인， 약학 조성물.
【청구항 5]
미드카인 저해제 및 테모졸로마이드를 유효성분으로 포함하는 뇌종양의 예방또는 치료용 약학조성물.
【청구항 6]
제 5항에 있어서， 상기 뇌종양은 방사선 치료 또는 테모졸로마이드에 대한 저항성을 갖는 것인， 약학조성물.
【청구항 7】
제 5항에 있어서, 상기 뇌종양은 교모세포종인， 약학 조성물.
【청구항 8】
게 6항에 있어서， 상기 뇌종양은 방사선 치료 또는 테모졸로마이드에 대한 저항성을 갖는 교모세포종인, 약학 조성물.
【청구항 9】
겨 15항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 미드카인 저해제는 미드카인 단백질 또는 유전자에 결합하는 항체, 압타머， siRNA, shRNA, microRNA, 소분자 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인， 약학 조성물.
【청구항 10】
미드카인 저해제, 또는 미드카인 저해제와 테모졸로마이드의 조합을 포함하는 약물; 및
방사선 조사 장치
를 포함하는 뇌종양의 예방 또는 치료용 키트.
【청구항 11】
제 10항에 있어서， 상기 뇌종양은 방사선 치료 또는 테모졸로마이드에 대한 저항성을 갖는 것인， 키트.
【청구항 12]
제 10항에 있어서， 상기 뇌종양은 교모세포종인， 키트.
【청구항 13】
제 11항에 있어서， 상기 뇌종양은 방사선 치료 또는 테모졸로마이드께 대한 저항성을 갖는 교모세포종인， 키트.
【청구항 14]
제 10항에 있어서, 상기 미드카인 저해제는 미드카인 단백질 또는 유전자에 결합하는 항체， 압타머， siRNA, shRNA, microRNA, 소분자 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인， 키트.
【청구항 15】
제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 방사선 조사 장치는 1회에 lGy 내지 6Gy의 방사선량을 조사할 수 있는 것인， 키트.
【청구항 16】
미드카인 저해제를 유효성분으로 포함하는， 방사선 치료 또는 테모졸로마이드에 대한 저항성 극복을 위한 약학조성물.
【청구항 17】
미드카인 저해제를 유효성분으로 포함하는， 방사선 치료 또는 테모졸로마이드의 뇌종양에 대한 항암 효능 증진용 약학조성물. 후보 화합물을 뇌종양 시험군 세포에 접촉시키는 단계， 상기 후보 화합물 접촉 후의 시험군 세포의 미드카인 단백질 양 또는 미드카인 유전자의 발현량을 측정하는 단계 ;
상기 측정된 시험군 세포의 미드카인 단백질 양 또는 미드카인 유전자의 발현량을 상기 후보 화합물 접촉 전 또는 상기 후보 화합물과 접촉하지 않은 뇌종양 비교군 세포의 미드카인 단백질 양 또는 미드카인 유전자의 발현량과 비교하는 단계; 및
시험군 세포의 미드카인 단백질 양 또는 미드카인 유전자의 발현량이 비교군 세포와 비교하여 감소한 경우， 상기 후보 화합물을 방사선 치료 또는 테모졸로마이드에 대하여 저항성을 갖는 뇌종양 치료제의 후보 물질로 선택하는 단계를 포함하는，
방사선 치료 또는 테모졸로마이드에 대하여 저항성을 갖는 뇌종양 치료제의 스크리닝 방법 .
【청구항 19】
제 18항에 있어서， 상기 뇌종양은 교모세포종인， 방법.
【청구항 20】
미드카인 (Midkine) 저해제를 뇌종양의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는， 뇌종양의 예방또는 치료 방법.
【청구항 21]
제 20항에 있어서， 상기 뇌종양은 방사선 치료 또는 테모졸로마이드에 대하여 저항성을 갖는 것인， 방법.
【청구항 22】
제 20항에 있어서， 상기 미드카인 저해제는 뇌종양와 종양줄기세포를 저해하는 것인， 방법.
【청구항 23】
제 20항에 있어서， 상기 뇌종양은 교모세포종인， 방법 .
【청구항 24]
제 20항에 있어서， 상기 미드카인 저해제는 미드카인 단백질 또는 유전자에 결합하는 항체， 압타머， siRNA, shRNA, microRNA, 소분자 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인， 방법 .
【청구항 25】
제 20항에 있어서， 상기 대상에게 테모졸로마이드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법 .
【청구항 26]
제 20항에 있어서， 상기 대상에게 방사선을 조사하는 단계를 추가로 포함하는， 방법 .
【청구항 27】
제 26항에 있어서， 방사선을 IGy 내지 6Gy 의 방사선량으로 조사하는， 방법.
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