WO2018015595A2 - Compuestos para el tratamiento de las enfermedades causadas por parásitos del género leishmania - Google Patents

Compuestos para el tratamiento de las enfermedades causadas por parásitos del género leishmania Download PDF

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José Antonio GÓMEZ VIDAL
Mónica Díaz Gavilán
Francisco Franco Montalbán
Francisco MORILLAS MÁRQUEZ
Victoriano CORPAS LÓPEZ
Joaquina MARTÍN SÁNCHEZ
Margarita LÓPEZ-VIOTA GALLARDO
Julián López-Viota Gallardo
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Universidad de Granada
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Definitions

  • the present invention is generally framed in the field of biomedicine and in particular refers to a new compound useful as a medicament, preferably useful for the treatment of diseases caused by parasites of the genus Leishmania.
  • Leishmaniosis is a vector-borne disease caused by parasitic protozoa of the genus Leishmania (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) and transmitted by the female bite of sandflies (Insecta, Diptera, Phiebotomidae) belonging to the genera Phiebotomus and Lutzomyia. It is one of the most important diseases within tropical diseases and is included in the "Neglected Tropical Diseases" or forgotten tropical diseases. Despite this, it is not limited to tropical and subtropical areas, and it is also endemic in temperate zones such as our country.
  • leishmaniasis The dynamic spectrum of leishmaniasis is broad and ranges from a strict cutaneous form that can heal spontaneously leaving a scar, to a serious and deadly form without treatment such as visceral leishmaniasis.
  • World Health Organization up to 350 million people are at risk of leishmaniasis in 98 countries in temperate and tropical areas of the planet. Approximately 12 million people are considered to be currently infected, and every year 2 million new cases occur, of which 500,000 cases are visceral.
  • Leishmania species show two morphological phases during their life cycle:
  • L. donovani and L. infantum cause visceral Ieishmaniosis.
  • L infantum is the only species identified that causes both visceral and cutaneous disease. In addition, it has also been identified as the causative agent of cutaneous-mucosa and mucosa ieishmaniosis.
  • L infantum is the most widely distributed species, being present in 81 of the 98 endemic countries of ieishmaniosis. L. infantum is endemic in all the countries of the Mediterranean Basin. Unlike L. donovani, Ieishmaniosis due to L.
  • infantum is a zoonosis, the dog being the main reservoir.
  • the prevalence of canine Ieishmaniasis in random sampling using serological techniques varies between 5 and 30%, and can reach 100% in some foci if the PCR technique is used [Mart ⁇ n-Sánchez J, Morales-Yuste M , Acedo-Sánchez C, Barón S, D ⁇ az V, Morillas- Márquez F. Canine leishmaniasis in southeastern Spain. Emerg Infect Dis. 2009 May; 15 (5): 795-8. doi: 10.3201 / eid1505.080969]. These high prevalence of infection are a considerable risk factor for the emergence of the disease in humans.
  • canine Ieishmaniosis which is a multisystemic syndrome of very difficult cure due to the lack of collaboration of the animal's immune system.
  • none of the drugs used for the treatment of canine Ieishmaniosis (which are the same used in man) allows the complete elimination of the parasite in the animal.
  • Spain there can be between 6 and 13 million dogs.
  • canine Ieishmaniasis varies between regions and according to the technique used, we can estimate that 30% of them are infected; this would give us 2.8 million dogs with canine Ieishmaniosis as potential drug receptors against the leishmaniosis, only in Spain.
  • cutaneous leishmaniasis is endemic in more than 70 countries, with an incidence of 1.2 million cases per year. It is caused by various species of Leishmania, mainly by L tropic and L major. Also L. ⁇ nfantum (synonym L. chagasi) cause cutaneous leismaniosis although in the latter case, leishmaniosis usually visceralizes in animals. L. tropic is the leading cause of cutaneous leishmaniasis in the Middle East and some areas of North Africa. In Morocco, it is the most geographically widespread species and is a frequent cause of epidemic outbreaks.
  • pentavalent antimony derivatives such as meglumine antimoniate or methylglucamine antimony (Glucantime®) have been considered first choice for a long period of time, despite their high toxicity.
  • meglumine antimoniato is not suitable for oral administration because it is poorly absorbed and is extremely irritating to the gastrointestinal tract, so it must be administered parenterally or by local injection.
  • Pentamidine, amphotericin B and paromomycin have been considered as second-choice drugs, although lately liposomal amphotericin B is replacing antimony derivatives as the drug of choice in some geographic areas.
  • pentamidine and amphotericin B have a high toxicity that can be reduced with the latter's lipid formulations but raising the price considerably.
  • paromomycin is not absorbed orally, so it must be administered by parenteral or topical route; it is excreted by the kidney without metabolizing and induces nephrotoxicity and ototoxicity, as well as other aminoglycosides [Ramos, J. and Segovia, M. - Spanish Journal of Chemotherapy, 1997. p 26].
  • miltefosine which initially conceived as an antineoplastic drug, has the advantage of allowing oral administration but is not exempt from toxicity, has resistance problems [Mondelaers A, and others. "Genomic and Molecular Characterization of Miltefosine Resistance in Leishmania infantum Strains with Either Natural or Acquired Resistance through Experimental Selection of Intracellular Amastigotes.” PLoSOne. 2016 Apr 28; 11 (4): e0154101. doi: 10.1371 / journal. puts 0154101] and causes gastrointestinal adverse effects, in addition to being potentially teratogenic and abortive. As for cutaneous leishmaniasis, there is currently no satisfactory treatment.
  • Liposomal amphotericin B is less toxic although its cost has limited its use in cutaneous leishmaniasis.
  • topical paromomycin (Leshcutan®) is not available in Spain or the United States and should be reserved for cases without risk of mucosal involvement.
  • the drug vorinostat also called SAHA
  • HDAC histone deacetylase inhibitor
  • Vorinostat has as its main disadvantage its toxicity at high concentrations.
  • the patent ES 2 402 252 requested by the University of Granada, describes a structure with formula that has activity against Leishmania.
  • compound II is not suitable for oral administration since it is not chemically stable at low pH.
  • the trifyl chemical group, present in compound II is a known unstable protective group at acidic pH (4 and less).
  • the present invention provides a family of compounds effective against Leishmaniosis or diseases caused by parasites of the genus Leishmania, preferably caused by L. infantum, L. major or L. tropic.
  • the present invention relates to the compound of formula III:
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the compound of formula III as described above and pharmaceutically acceptable excipients.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising the compound of formula III supported on pharmaceutically acceptable nanoparticles, preferably gold nanoparticles.
  • the present invention relates to the use of the compound of formula III or of the pharmaceutical compositions comprising it as a medicament.
  • the invention relates to its use as a medicament for the treatment of Leishmaniosis or diseases caused by parasites of the genus Leishmania, more preferably L. infantum, L. majoro L. tropic.
  • the invention relates to the use of the compound of formula III or of the pharmaceutical compositions comprising it for the treatment or for the manufacture of a medicament for the treatment of cutaneous leishmaniasis.
  • the invention relates to the use of the compound of formula III or of the pharmaceutical compositions comprising it for the treatment or for the manufacture of a medicament for the treatment of visceral leishmaniasis or canine leismaniosis.
  • the invention relates to combined preparations of compounds of formula III and other compounds or drugs used for the treatment of diseases caused by parasites of the genus Leishmania, as well as to a method of treatment of said diseases employing one of these Combined preparations BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES Figure 1.- Synthesis scheme of compound III.
  • Figure 2. Image obtained by microscopy of the nanoparticles. In the image above, only the gold nuclei without compound are observed; in the lower one, the nanoparticles are vehiculizing the compound and a crown is observed around the gold nuclei that almost doubles the hydrodynamic size of the particles in the upper image.
  • nanoparticles refers to particles of less than 1 micrometer in any of its dimensions, preferably in a range of 10 to 900 nanometers.
  • treatment refers to the administration of a compound or a composition according to the invention to improve or eliminate a disease, pathological condition or one or more symptoms associated with said disease or condition in a mammal, preferably in canines or humans, more preferably in dogs.
  • Treatment also covers the improvement or elimination of the physiological sequelae of the disease. Specifically, the concept “treat” can be interpreted as:
  • the present invention relates to compounds ("compounds of the invention”), of formula III
  • Ph is a phenyl of formula:
  • R1 H, F, Cl, Br, I, Me, OMe or N02.
  • R2 H, F, Cl, Br, I, Me, OMe or NO2
  • R3 H, F, Cl, Br, I, Me, OMe or NO2
  • the compounds of the invention are presented in crystalline form as free or solvated compounds (for example hydrates) or as enantiomers, isomers, or salts of said compounds, all of these forms being within the scope of protection of the present invention .
  • Solvation methods are generally known in the state of the art.
  • prodrugs of the compounds of the invention are also included within the scope of the present invention.
  • compositions of the invention comprising as active ingredient a therapeutically effective amount of at least one compound of the invention, in particular a compound of those detailed in the Preferred embodiments of the first aspect of the invention.
  • Said formulations may contain any other active ingredient in the treatment of leishmaniosis or be characterized as containing only one compound of the invention or a combination of compounds of the invention as active ingredient.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to that amount of a compound of the invention that when administered to a mammal, preferably canids and humans, and among canines, more preferably dogs, is sufficient. to produce the treatment, as defined below, of a disease or pathological condition of interest in the mammal, preferably canids and humans, and among canines, more preferably dogs.
  • the amount of a compound of the invention that constitutes a therapeutically effective amount will vary, for example, depending on the activity of the specific compound employed; the metabolic stability and duration of action of the compound; the species (preferably human or canine), the clinical form of the human disease (preferably visceral, cutaneous or mucous), age, body weight, general state of health, sex and diet of the patient; the route of administration, given the possibility of oral or systemic administration; the mode and time of administration; the rate of excretion, the combination of drugs; the severity of the particular disorder or pathological condition; and the subject who undergoes therapy, but can be determined by a specialist in the art according to their own knowledge and that description.
  • the "pharmaceutical form” is the individualized arrangement to which drugs (active ingredients) and excipients (pharmacologically inactive matter) are adapted to constitute a medicament.
  • the compounds of the invention, III by their hydrophobic nature, make their use in vivo unfeasible unless they are vehiculized. In particular, compound III in aqueous medium quickly adds, making parenteral administration impossible.
  • compositions comprise one or more pharmaceutically acceptable carriers.
  • pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the formulations of the invention are the vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • An example of a pharmaceutically acceptable carrier is a gold nanoparticle with a size suitable for administration.
  • the pharmaceutical composition may comprise another active ingredient.
  • therapeutic efficacy which may require the use of therapeutic agents
  • therapeutic agents in addition to the compounds of the invention, there may be additional fundamental reasons that compel or strongly recommend the use of a combination of a compound of the invention and another agent therapeutic, as in the treatment of diseases or conditions that directly or indirectly modulate the function of the substance.
  • the formulations may also contain excipients.
  • compositions or formulations include those that are suitable for oral or parenteral administration (including subcutaneous, intradermal, intramuscular and intravenous), although the best route of administration depends on the condition of the patient.
  • the formulations can be in the form of single doses.
  • the formulations are prepared according to methods known in the field of pharmacology.
  • the amounts of active substances to be administered may vary depending on the particularities of the therapy.
  • compositions of the invention are prepared using standard methods such as those described or referred to in the Spanish and US Pharmacopoeias and similar reference texts.
  • compositions of the invention the compound of the invention III is supported on pharmaceutically acceptable nanoparticles, more preferably on gold nanoparticles.
  • the gold nanoparticles used as transport vehicles of the compound of the invention are coated by sodium citrate.
  • the gold nanoparticles used as transport vehicles of the compound of the invention have an approximate size of between 20 and 30 nm, preferably between 22 and 26 nm.
  • topical route means the route of administration of drugs used by the skin and mucous membranes.
  • compositions of the invention are compositions suitable for topical administration.
  • the compositions of the invention comprise a therapeutically effective amount of compound III, preferably a concentration of III equal to or greater than 0.5% w / w), more preferably in a concentration of compound III equal to or greater than 2%.
  • compositions of the invention are lipophilic.
  • combined preparation or also called “juxtaposition”, herein, means that the components of the combined preparation need not be present as a joint, for example in a true composition, in order to be available for combined, separate or sequential.
  • juxtaposed implies that it is not necessarily a true combination, in view of the physical separation of the components.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition, preparation or form, hereinafter “combined preparation of the invention", comprising:
  • the combined preparation of the invention comprises a) a compound of general formula III, and
  • Kit of the invention in another aspect, relates to a kit ("kit-of-parts") for the preparation of the composition or the combined preparation of the invention.
  • kit refers to a combination of a set of components suitable for obtaining the composition or the combined preparation of the invention, which may or may not be packaged together, together with its appropriate containers and containers for commercial sale, etc.
  • suitable component for obtaining the composition or the combined preparation of the invention any compound that can be used for obtaining them, and includes, without limitation, aqueous solutions, preparations solids, buffers, syrups, preservation solutions, flavorings, pH correctors, thickeners, etc.
  • kit components can be provided in separate vials (in the form of "part-kit") or in a single vial.
  • the kit of the present invention is intended for the preparation of the composition or of the combined preparation or of the pharmaceutical form (for example, of the oral solution, mouthwash, rinse, gargle, elixir, etc.) of the invention.
  • the kit components of the present invention are ready to be used to prepare the combined composition or preparation or the pharmaceutical form of the present invention.
  • the kit preferably contains explanatory instructions on how to prepare the composition or the combined preparation or the pharmaceutical form of the present invention. Instructions can be provided to users electronically or on paper.
  • the invention provides a kit for the preparation of the composition of the invention or of the combined preparation of the invention a container comprising a container with the compound of general formula III in any pharmaceutically acceptable formulation, together with components suitable for obtaining the composition or the combined preparation of the invention.
  • the kit of the invention further comprises a container with the compound of general formula II in any pharmaceutically acceptable formulation.
  • the compound of general formula III is supported on pharmaceutically acceptable nanoparticles, more preferably on gold nanoparticles.
  • a third aspect of the invention consists in the use of the compounds and / or the compositions and / or the combined preparations and / or the kit of the invention as a medicament or for the preparation of a medicament.
  • said medicament is suitable for the treatment of Leishmaniosis or diseases caused by parasites of the genus Leishmania, more preferably L. infantum, L. major or L. tropic., And more preferably for the treatment of visceral Leishmaniosis, canine Leishmaniosis and / o Cutaneous leishmaniasis.
  • the present invention relates to a method for the treatment of patients affected by Leishmaniosis, hereinafter "method of treatment of the invention” by the use of the compounds and / or the compositions and / or the combined preparations and / or the kit of the invention.
  • method of treatment of the invention include, but are not limited to, the effects of disease elimination, the increase in disease progression time and the index of survival.
  • the effects of treatment include longer term disease control.
  • This treatment consists in the administration to the individuals affected by these diseases of therapeutically effective amounts of a compound of the invention, or a pharmaceutical composition that includes it.
  • the disease that is treated using compounds and / or the compositions and / or the combined preparations and / or the kit of the invention and / or the method of treatment of the invention is visceral leishmaniosis, canine leishmaniosis and / or Cutaneous leishmaniasis
  • the disease that is treated using the compounds and / or the compositions and / or the combined preparations and / or the kit of the invention and / or the method of treatment of the invention is cutaneous leishmaniasis.
  • composition suitable for topical administration comprising a therapeutically effective amount of compound III, preferably a concentration of III equal to or greater than 0.5% w / w), more preferably in a concentration of compound III equal to or greater than 2%.
  • composition suitable for topical use is lipophilic.
  • Administration of the compounds of the invention, in pure form or in an appropriate pharmaceutical composition, or in combination with other compounds, compositions or medicaments, can be carried out by means of the administration modes of agents accepted to serve similar utilities. .
  • the method used to synthesize the compounds of the invention comprises [ Figure 1] reacting in an solution an acid of formula IV, with benzylhydroxy amine of formula V.
  • R1 H, F, Cl, Br, I, Me, OMe or N02
  • R2 H, F, Cl, Br, I, Me, OMe or N02
  • R3 H, F, Cl, Br, I, Me, OMe or NO2
  • the solution will be carried out in anhydrous methanol / THF maintaining the reaction in an argon atmosphere.
  • the compound of general formula III is obtained from a solution with the carboxylic acid derivative of general formula IV (1 equiv.) Ethyl chloroformate (1.35 equiv.), Triethylamine (3.5 equiv.) And benzylhydroxyl. amine (1.7 equiv.) in THF / methanol.
  • the reaction should be maintained at 0 o C and argon atmosphere.
  • compositions of the invention comprise compound III functionalized with gold nanoparticles.
  • the suspension of gold particles is added dropwise to the solution of the dimethylsulfoxide compound (DMSO), preferably 0.5%, and Triton X100, preferably 0.1 %. Then, the suspension obtained is added dropwise onto a solution. Bovine Serum Albumin (Bovine Serum Albumin or BSA), preferably 1%. After incubation for at least 2 hours, the particles are concentrated by centrifugation and resuspended in phosphate buffered saline or phosphate buffered saline (Phosphate Buffered Saline or PBS) pH 7.2.
  • DMSO dimethylsulfoxide compound
  • Triton X100 preferably 0.1 %.
  • BSA Bovine Serum Albumin
  • the particles are concentrated by centrifugation and resuspended in phosphate buffered saline or phosphate buffered saline (Phosphate Buffered Saline or PBS) pH 7.2.
  • HPLC method Solution A (H20: ACN 70:30 + 0.1% HCOOH), solution B (ACN 100% + 0.1% HCOOH); Socratic solution 2 min .; gradient from A B 13 min; Socratic solution B 5 min.
  • the Illa compound can be stored at 4 ° C for at least 6 months without apparent changes in its physical-chemical characteristics or loss of activity.
  • the Illa compound is chemically stable at pH 2 and pH 5, which allows oral administration.
  • the compound was first dissolved at a concentration of 0.25% in a solution composed of 0.5% Dimethisulfoxide (DMSO) and 0.1% Triton X100. Once the Illa compound has dissolved, 20 ml of gold particle suspension is added dropwise. Immediately afterwards, the suspension of gold particles functionalized with the Illa compound on a 1% BSA solution is added dropwise. It is allowed to incubate for a minimum of 2 hours in the presence of BSA, and then thereafter, centrifuged at 14000 rpm to remove excess BSA present in the medium of the conjugated particles. Once the particles have been centrifuged, the supernatant is removed and resuspended in PBS pH 7.2 prior to use.
  • DMSO Dimethisulfoxide
  • the adsorption of the drug Illa on the surface of the gold particles shows changes in the surface electric charge of the gold particles.
  • Gold particles at physiological pH show surface electric charge (-36 ⁇ 7) mV
  • gold particles coated with Illa and BSA under the same pH conditions show a surface electric charge of (-10 ⁇ 4) mV. From the electrokinetic point of view, any difference determined on the surface electric charge is attributed to the adsorption of any entity on the surface of the particles, in this case, the drug Illa and the BSA.
  • BMDM bone marrow derived macrophages
  • the BMDM plates were left overnight at a temperature of 37 ° C to 5% C02 for the cells to adhere.
  • Infections were performed as established by [Zauli-Nascimento, RC, Miguel, D. C, Yokoyama-Yasunaka, JK; Pereira, LI, Pe ⁇ li de Oliveira, MA, Ribeiro-Dias, F., Doria, ML Liliana, SR
  • Promastigotes were added to the wells by keeping them for 2 hours at 37 ° C and 5% C02 in RPMI-1640 with 10% FCS. After this time the medium was removed and the macrophages were washed with RPMI-1640 medium to remove the promastigotes.
  • a new RPMI-1640 medium enriched with 10% SBF and 5% conditioned medium of L929 cells and containing the drug in its different concentrations was added. After 48 h of incubation at 37 ° C, 5% C02, the covers were fixed with methanol and stained with 20% Giemsa. 200 macrophages distributed across all fields of the cover were counted and the percentage of infected and non-infected macrophages was calculated. Macrophages containing at least one amastigote were considered infected. Each experiment was performed in triplicate. After treatment at various concentrations of each compound, the response observed in the form of% infection becomes% reduction of infection.
  • a multiple linear regression analysis (SPSS 150 software) is performed to calculate the IC50 (concentration of the compound that reduces the parasite load by 50%) and CC50 (concentration of the compound that kills 50% of the mammalian cells) of the product evaluated.
  • the results obtained for the Illa compound are shown in Table 1, after their in vitro evaluation against intracellular L. infantum (IC50) and its cytotoxicity in mammalian cells (CC50).
  • the drugs vorinostat (I), pentamidine (Pl) and meglumine antimony agent (MA) or Glucantime ® were used as control.
  • Table LCIso and CC50 of the compound Illa Activity against amastigotes of L infantum in macrophages and cytotoxicity in mammalian cells.
  • the compound Illa showed an IC50 against intracellular amastigotes of L. infantum approximately 5 times higher than that of compound (II) and also showing an activity superior to the drugs used as control. This fact, together with its low cytotoxicity (CC50> 100 ⁇ ), gives it a selectivity index greater than 100. Like compound II, the Illa compound showed no activity against L. infantum promastigotes in the concentration range 1 - 100 ⁇ .
  • the compound (Illa) vehiculized on gold nanoparticles was administered to a group of 10 6-week-old Swiss ICR (CD-1) mice at a dose of 500 mg / kg / day for 10 days. After the treatment, an additional observation of the animals was carried out for two weeks. The appearance of signs of pain, suffering, diarrhea, weight loss, hepato or splenomegaly was evaluated. During treatment and subsequent follow-up, no animal died or any of the signs indicated above appeared, indicating that the compound lacks acute or subacute toxicity (lethal dose 50% (LD50)> 500 mg / kg).
  • LD50 lethal dose 50%
  • mice 35 female 6-week-old female Balb / c mice were infected with 10 million promastigotes of L. infantum in a stationary phase of intraperitoneal growth in a volume of 0.4 ml_ of isotonic saline. After 28 days post-infection, the animals were divided into five groups of 7 mice each that underwent different daily intraperitoneal treatments for 10 days.
  • the treatments used in vivo are as follows:
  • the compound Illa vehiculized in gold nanoparticles was very effective at 25 mg / kg, reducing parasitic loads by 99% in liver and 93% in spleen, compared to 83% reductions in liver and 52% in spleen using as meglumine antimoniate control drug.
  • Table 2 shows a comparison, in terms of reduction of parasitic load, of compounds II and Illa, both vehiculized in gold nanoparticles.
  • the compound was administered using two different types of ointments, one more hydrophilic and one more lipophilic (indicate specific composition), and with two different concentrations of Illa (0.5% and 2% w / w).
  • the efficacy in the treatment of cutaneous leishmaniasis was measured by determining the reduction of the parasitic load and the size of the lesion.
  • Glucantime was administered by intralesional injections of 100 mg Sb v / kg.
  • the reduction in parasite load of hamsters treated with this drug was 61.6%
  • the most effective ointment was the most lipophilic with the highest concentration of compound III.
  • the ointment with 2.5% compound III reduces the parasitic load by up to 75% and the size of the lesions is progressively reduced without showing any toxicity or side effects in animals.
  • the activity was higher than the reference compound (pentavalent antimony) which only showed a reduction of the parasite load of 62%.
  • Potential drug interactions can be predicted by evaluating in vitro cytochrome P450.

Landscapes

  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere auna familia de compuestos que resultan efectivos frente a parásitos del género Leishmania, preferentemente causadas por L. infantum, L. major o L. tropica, y que presentan una baja toxicidad incluso a dosis altas del compuesto. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas, preferentemente aptas para administración oral o tópica,que comprenden esos compuestos y a su uso como medicamento para el tratamiento de leishmaniosis visceral, canina o cutánea.

Description

COMPUESTOS PARA EL TRATAMIENTO DE LAS ENFERMEDADES CAUSADAS POR PARÁSITOS DEL GÉNERO LEISH MANIA
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se encuadra en general en el campo de la biomedicina y en particular se refiere a un nuevo compuesto útil como medicamento, preferentemente útil para el tratamiento de enfermedades causadas por parásitos del genero Leishmania.
ESTADO DE LA TECNICA
Leishmaniosis La leishmaniosis es una enfermedad de transmisión vectorial causada por protozoos parásitos del género Leishmania (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) y transmitida por la picadura de la hembra de flebótomos (Insecta, Díptera, Phiebotomidae) pertenecientes a los géneros Phiebotomus y Lutzomyia. Es una de las enfermedades más importantes dentro de las enfermedades tropicales y está incluida dentro de las "Neglected Tropical Diseases" o enfermedades tropicales olvidadas. A pesar de ello no está limitada a zonas tropicales y subtropicales, y se da también con carácter endémico en zonas templadas como nuestro pais. El espectro dinico de la leishmaniosis es amplio y abarca desde una forma cutánea estricta que puede curar de forma espontánea dejando cicatriz, hasta una forma grave y mortal sin tratamiento como es la leishmaniosis visceral. Según la Organización Mundial de la Salud, hasta 350 millones de personas se encuentran en riesgo de padecer leishmaniosis en 98 países de zonas templadas y tropicales del planeta. Se considera que aproximadamente 12 millones de personas están actualmente infectadas, y cada año se producen 2 millones de casos nuevos, de los cuales 500.000 casos son de tipo visceral.
Las especies de Leishmania muestran dos fases morfológicas durante su ciclo de vida:
* Promastigote, con forma alargada y móvil con un flagelo anterior, en el intestino del vector. » Amastigote, con forma esférica u ovoide y sin flagelo visible al microscopio óptico, que se reproduce de forma obligada dentro de las células del sistema retículo endoteiial del hospedador vertebrado (hombre y diversas especies de animales en función de la especie de Leishmania).
De la veintena de especies responsables de la ieishmaniosis, únicamente dos, L. donovani y L. infantum (sinónimo L. chagasí) causan Ieishmaniosis visceral. L infantum es la única especie identificada que causa tanto la enfermedad visceral como la cutánea. Además, también se ha identificado como agente causal de ieishmaniosis cutáneo-mucosa y mucosa. Mientras en la Ieishmaniosis visceral el parásito prolifera en la médula ósea, el hígado y el bazo, órganos en ios que abundan las células del sistema retículo endoteiial, en la forma cutánea el parásito permanece en el sitio de picadura del flebotomo, lo que puede causar úlceras de larga duración que terminan por dejar cicatrices desfigurantes. Como decíamos anteriormente, la enfermedad en su forma visceral es mortal sí no es tratada correctamente. L infantum es la especie con distribución más amplia estando presente en 81 de los 98 países endémicos de ieishmaniosis. L. infantum es endémica en todos los países de la Cuenca Mediterránea. A diferencia de L. donovani, la Ieishmaniosis debida a L. infantum es una zoonosis, siendo el principal reservorio el perro. En España, la prevalencia de Ieishmaniosis canina en muéstreos aleatorios usando técnicas serológicas, varía entre el 5 y 30%, y pueden alcanzar valores del 100% en algunos focos si se usa la técnica de PCR [Martín- Sánchez J, Morales-Yuste M, Acedo-Sánchez C, Barón S, Díaz V, Morillas- Márquez F. Canine leishmaniasis in southeastern Spain. Emerg Infect Dis. 2009 May; 15 (5):795-8. doi: 10.3201/eid1505.080969]. Estas elevadas prevalencias de infección son un considerable factor de riesgo para la emergencia de la enfermedad en humanos. En el perro, L infantum causa la Ieishmaniosis canina que es un síndrome multisistémico de muy difícil curación por la falta de colaboración del sistema inmune del animal. Hasta ahora, ninguno de los fármacos utilizados para el tratamiento de la Ieishmaniosis canina (que son los mismos usados en el hombre) permite la eliminación completa del parásito en el animal. En España puede haber entre 6 y 13 millones de perros. Aunque las prevalencias de Ieishmaniosis canina varían entre regiones y según la técnica empleada, podemos estimar que el 30% de ellos están infectados; esto nos daría 2,8 millones de perros con Ieishmaniosis canina como potenciales receptores de fármacos frente a la leishmaniosis, sólo en España. A ellos habría que sumar los existentes en otros países endémicos como Portugal, Francia, Italia, Brasil, etc., además de otros no endémicos. Por ejemplo, en Alemania, a pesar de no ser un país endémico de leishmaniosis, se estima que hay 20.000 perros con leishmaniosis canina adquirida durante las vacaciones en los países de la Cuenca Mediterránea que serían también potenciales receptores.
Por otro lado, la leishmaniosis cutánea es endémica en más de 70 países, con una incidencia de 1 ,2 millones de casos por año. Está causada por diversas especies de Leishmania, principalmente por L trópica y L major. También L. ¡nfantum (sinónimo L. chagasi) causan leismaniosis cutánea aunque en este último caso, la leishmaniosis suele visceralizar en los animales. L. trópica es la principal causa de leishmaniosis cutánea en Oriente Medio y algunas zonas del norte de África. En Marruecos, es la especie más extendida geográficamente y es causa frecuente de brotes epidémicos.
Tratamiento de la Leishmaniosis
Los fármacos actualmente utilizados para el tratamiento de la leishmaniosis presentan diversos problemas, incluida la toxicidad para el hospedador, los efectos adversos, la aparición de resistencias y el elevado coste. Entre ellos, los derivados de antimonio pentavalente, como antimoniato de meglumina o metilglucamina antimoniato (Glucantime®) han sido considerados de primera elección durante un largo periodo de tiempo, a pesar de su elevada toxicidad. No obstante, el antimoniato de meglumina no es apto para administración oral dado que se absorbe mal y es sumamente irritante para el tracto gastrointestinal, por lo que hay que administrarlo por vía parenteral o por inyección local.
La pentamidina, la anfotericina B y la paromomicina han sido considerados como fármacos de segunda elección, aunque últimamente la anfotericina B liposomal está sustituyendo a los derivados del antimonio como fármaco de elección en algunas zonas geográficas. No obstante, la pentamidina y la anfotericina B tienen una toxicidad elevada que se consigue reducir con las formulaciones lipídicas de ésta última pero elevando considerablemente el precio. Por otro lado, la paromomicina tampoco se absorbe por vía oral, por lo que debe administrarse por vía parenteral o por vía tópica; se excreta por el riñon sin metabolizarse e induce nefrotoxicidad y ototoxicidad, al igual que otros aminoglucósidos [Ramos, J. y Segovia, M. - Revista española de Quimioterapia, 1997. p 26]. El último fármaco incorporado al arsenal terapéutico de la leishmaniosis es la miltefosina, que concebida inicialmente como fármaco antineoplásico, tiene la ventaja de permitir una administración oral pero no está exenta de toxicidad, tiene problemas de resistencias [Mondelaers A, y otros. "Genomic and Molecular Characterization of Miltefosine Resistance in Leishmania infantum Strains with Either Natural or Acquired Resistance through Experimental Selection of Intracellular Amastigotes". PLoSOne. 2016 Apr 28; 11 (4):e0154101. doi: 10.1371/journal. pone.0154101] y provoca efectos adversos gastrointestinales, además de ser potencialmente teratogénico y abortivo. En cuanto a la leishmaniosis cutánea, no existe actualmente un tratamiento satisfactorio. La evolución de las lesiones tiende a la cronicidad, curando espontáneamente en varios meses aunque dejando cicatriz que en algunos casos puede llegar a la desfiguración o requerir cirugía ya que la zona más afectada suele ser la cara. Entre otras medidas existentes se emplean antimoniales pentavalentes, parenterales o intralesionales, con numerosos efectos secundarios, o crioterapia aplicando nitrógeno líquido sobre la lesión. Recientemente se está probando la paromomicina tópica y la anfotericina B tópica. La amfotericina B deoxicolato es activa frente a Leishmania, pero los efectos adversos son frecuentes (hiperpirexia, malestar general, hipotensión, tromboflebitis, daño renal, hipopotasemia, anemia y hepatitis). La anfotericina B liposomal es menos tóxica aunque su coste ha limitado su uso en leishmaniasis cutánea. Por otro lado, la paromomicina tópica (Leshcutan®) no está disponible en España ni en Estados Unidos y debe reservarse para los casos sin riesgo de afectación mucosa.
Inhibidores de HDAC con actividad frente a la Leishmaniosis
El fármaco vorinostat (también denominado SAHA) (Fórmula I) es un inhibidor de historias desacetilasas (HDAC) que posee actividad frente a Leishmania [9, 10].
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I
Vorinostat presenta como principal desventaja su toxicidad a concentraciones elevadas. Por otra parte, la patente ES 2 402 252, solicitada por la Universidad de Granada, describe una estructura con fórmula ¡l ue posee actividad frente a Leishmania.
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Al igual que ocurre con antimoniato de meglumina, el compuesto II no es apto para administración oral ya que no es químicamente estable a pH bajo. El grupo químico trifilo, presente en el compuesto II, es un conocido grupo protector inestable a pH ácido (4 y menor).
Existe pues la necesidad de encontrar un medicamento para el tratamiento de la infección por Leishmania, que solucione los problemas descritos en el estado de la técnica, especialmente que aporte una mayor eficacia en la eliminación del parásito, menor toxicidad y efectos adversos para el paciente (hospedador) y que permita la posibilidad de administración oral y tópica. El uso de sistemas de vehiculización y liberación tales como nanopartículas puede resolver problemas de solubilidad de compuestos de naturaleza hidrofóbica cuya utilización in vivo sería inviable, además de mejorar la eficacia y disminuir efectos adversos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una familia de compuestos efectivos frente a Leishmaniosis o enfermedades causadas por parásitos del genero Leishmania, preferentemente causadas por L. infantum, L. major o L. trópica. Así pues, en un primer aspecto, la presente invención se refiere al compuesto de fórmula III:
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En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al compuesto de fórmula III según se ha descrito anteriormente y excipientes farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende al compuesto de fórmula III soportado sobre nanopartículas farmacéuticamente aceptables, preferentemente nanopartículas de oro.
En un tercer aspecto la presente invención se refiere al uso del compuesto de fórmula III o de las composiciones farmacéuticas que lo comprenden como medicamento. De forma particular la invención se refiere a su uso como medicamento para el tratamiento de Leishmaniosis o enfermedades causadas por parásitos del genero Leishmania, más preferentemente L. infantum, L. majoro L. trópica.
En una realización particular, la invención se refiere al uso del compuesto de fórmula III o de las composiciones farmacéuticas que lo comprenden para el tratamiento o para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de Leishmaniosis cutánea. En otra realización particular, la invención se refiere al uso del compuesto de fórmula III o de las composiciones farmacéuticas que lo comprenden para el tratamiento o para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de Leishmaniosis visceral o Leismaniosis canina.
En otro aspecto, la invención se refiere a preparaciones combinadas de compuestos de fórmula III y otros compuestos o fármacos empleados para el tratamiento de enfermedades causadas por parásitos del género Leishmania, , así como a un método de tratamiento de dichas enfermedades que emplea una de estas preparaciones combinadas. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1.- Esquema de síntesis del compuesto III.
Figura 2.- Imagen obtenida por microscopía de ¡as nanoparticulas. En la imagen superior se observan sólo los núcleos de oro sin compuesto; en la inferior, las nanoparticulas están vehiculizando el compuesto y se observa una corona alrededor de los núcleos de oro que casi duplica el tamaño hidrodinámico de las partículas de la imagen superior.
DESCRIPICION DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
El término "nanoparticulas" como se describe en la presente invención se refiere a partículas de menos de 1 micrómetro en alguna de sus dimensiones, preferentemente en un rango de 10 a 900 nanómetros.
El término "tratamiento" o "tratar" en el contexto de este documento se refiere a la administración de un compuesto o una composición según la invención para mejorar o eliminar una enfermedad, condición patológica o uno o más síntomas asociados con dicha enfermedad o condición en un mamífero, preferentemente en cánidos o humanos, más preferentemente en perros. "Tratamiento" también abarca la mejora o eliminación de las secuelas fisiológicas de la enfermedad. Concretamente, el concepto "tratar" se puede interpretar como:
i. Inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;
¡i. Aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causa la regresión de la enfermedad o la condición patológica; Ni. Estabilizar la enfermedad o la condición patológica.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones el término "comprende", que también podrá interpretarse como "consiste en", y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
Compuestos de la invención
En un primer aspecto de la invención, la presente invención se refiere a compuestos ("compuestos de la invención"), de fórmula III
Figure imgf000009_0001
Donde Ph es un fenilo de fórmula:
Figure imgf000009_0002
Siendo:
R1 = H, F, Cl, Br, I, Me, OMe ó N02.
R2 = H, F, Cl, Br, I, Me, OMe ó NO2
R3 = H, F, Cl, Br, I, Me, OMe ó NO2
En una realización particular, los compuestos de la invención se presentan en forma cristalina como compuestos libres o solvatados (por ejemplo hidratos) o como enantiómeros, isómeros, o sales de dichos compuestos estando todas estas formas comprendidas en el ámbito de protección de la presente invención. Los métodos de solvatación son generalmente conocidos en el estado de la técnica.
También quedan comprendidos en el ámbito de la presente invención los profármacos de los compuestos de la invención.
En una realización particular los compuestos de la invención son compuestos de fórmula III caracterizados por que R1 =H o R2=H o R3=H. En una realización aún más particular, los compuestos de la invención son compuestos de fórmula III caracterizados porque al menos dos de los tres radicales del fenilo están formados por hidrógeno. Es decir, compuestos de fórmula III caracterizados por que R1 =R2=H o R1 =R3=H o R2=R3=H.
En una realización preferente, la invención se refiere a compuestos de fórmula Illa consistentes en compuestos de fórmula III caracterizados por que los tres radicales del fenilo están formados por hidrógeno. Es decir, compuestos de fórmula III caracterizados por qu =H, R2=H y R3=H.
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Illa
Composiciones farmacéuticas
En un segundo aspecto, la invención proporciona formulaciones, formas o composiciones farmacéuticas, en adelante "composiciones de la invención" que comprenden como ingrediente activo una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un compuesto de la invención, en particular un compuesto de los detallados en las realizaciones preferidas del primer aspecto de la invención. Dichas formulaciones puede contener cualquier otro ingrediente activo en el tratamiento de leishmaniosis o bien caracterizarse por contener como principio activo únicamente un compuesto de la invención o una combinación de compuestos de la invención.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a aquella cantidad de un compuesto de la invención que cuando se administra a un mamífero, preferentemente cánidos y humanos, y entre los cánidos, más preferentemente perros, es suficiente para producir el tratamiento, tal como se define más abajo, de una enfermedad o condición patológica de interés en el mamífero, con preferencia cánidos y humanos, y entre los cánidos, más preferentemente perros. La cantidad de un compuesto de la invención que constituye una cantidad terapéuticamente efectiva variará, por ejemplo, según la actividad del compuesto específico empleado; la estabilidad metabólica y duración de la acción del compuesto; la especie (preferentemente humana o canina), la forma clínica de la enfermedad humana (preferentemente visceral, cutánea o mucosa), la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del paciente; la vía de administración, dada la posibilidad de administración oral o sistémica; el modo y el tiempo de administración; la velocidad de excreción, la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o la condición patológica particulares; y el sujeto que se somete a terapia, pero puede ser determinada por un especialista en la técnica según su propio conocimiento y esa descripción.
Po otro lado, de acuerdo con la presente invención, la "forma farmacéutica" es la disposición individualizada a la que se adaptan los fármacos (principios activos) y excipientes (materia farmacológicamente inactiva) para constituir un medicamento.
Los compuestos de la invención, III, por su naturaleza hidrofóbica, hacen que sea inviable su utilización in vivo a menos que estén vehiculizados. En particular, el compuesto III en medio acuoso agrega rápidamente, imposibilitando su administración parenteral.
Así, dichas composiciones farmacéuticas comprenden uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en las formulaciones de la invención son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas. Un ejemplo de vehículo farmacéuticamente aceptable es una nanopartícula de oro con un tamaño adecuado para su administración.
Opcionalmente la composición farmacéutica puede comprender otro principio activo. Además del requerimiento de la eficacia terapéutica, que puede necesitar el uso de agentes terapéuticos, además de los compuestos de la invención, pueden existir razones fundamentales adicionales que obligan o recomiendan en gran medida el uso de una combinación de un compuesto de la invención y otro agente terapéutico, tal y como en el tratamiento de enfermedades o afecciones que directa o indirectamente modulan la función de la sustancia.
Las formulaciones pueden contener además excipientes.
Los excipientes y los vehículos empleados tienen que ser farmacéutica y farmacológicamente tolerables, de modo que puedan ser combinados con otros componentes de la formulación o preparación y no ejerzan efectos adversos en el organismo tratado. Las composiciones farmacéuticas o formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas para la administración oral o parenteral (incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular e intravenosa), aunque la mejor vía de administración depende del estado del paciente. Las formulaciones pueden ser en forma de dosis sencillas. Las formulaciones se preparan de acuerdo con métodos conocidos en el campo de la farmacología. Las cantidades de sustancias activas para administrarse pueden variar en función de las particularidades de la terapia.
Las composiciones de la invención se preparan utilizando métodos habituales tales como aquéllos descritos o a los que se hace referencia en las Farmacopeas Española y Estadounidense y textos de referencia similares.
Formulación en nanopartículas
En una realización preferente de las composiciones de la invención el compuesto de la invención III está soportado sobre nanopartículas farmacéuticamente aceptables, más preferentemente sobre nanopartículas de oro.
En una realización particular, las nanopartículas de oro empleadas como vehículos transportadores del compuesto de la invención están recubiertas por citrato sódico. En otra realización particular las nanopartículas de oro empleadas como vehículos transportadores del compuesto de la invención tienen un tamaño aproximado de entre 20 y 30 nm, preferentemente entre 22 y 26 nm.
El compuesto III así funcionalizado ha demostrado tener unas características de solubilidad mucho mejores que el compuesto solo, sin que su efectividad disminuya. Composiciones tópicas
En el contexto de la presente invención, por "vía tópica" se entiende la vía de administración de fármacos que utiliza la piel y las mucosas.
Para su administración por vía tópica, preferentemente sobre el tejido lesionado o las lesiones producidas por parásitos del género Leishmania, en particular Leishmaniosis cutánea, las composiciones de la invención son composiciones adecuadas para su administración tópica. De forma preferente, las composiciones de la invención comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto III, preferentemente una concentración de III igual o superior al 0.5% p/p), más preferentemente en una concentración del compuesto III igual o superior al 2%.
De forma preferente las composiciones de la invención son lipófilas.
Preparaciones combinadas Los compuestos III no actúan sobre las enzimas del citocromo P450 por lo que no debe interaccionar/'n vivo sobre otros fármacos y admitiría su uso combinado con otros fármacos en el tratamiento de la leishmaniosis.
El término "preparación combinada" o también denominada "yuxtaposición", en esta memoria, significa que los componentes de la preparación combinada no necesitan encontrarse presentes como unión, por ejemplo en una composición verdadera, para poder encontrarse disponibles para su aplicación combinada, separada o secuencial. De esta manera, la expresión "yuxtapuesta" implica que no resulta necesariamente una combinación verdadera, a la vista de la separación física de los componentes.
Así, en otro aspecto, la invención se refiere a una composición, preparación o forma farmacéutica, de ahora en adelante "preparación combinada de la invención", que comprende:
a) un compuesto de fórmula general III, y b) otro principio activo frente a Leishmaniosis.
En una realización particular, la preparación combinada de la invención comprende a) un compuesto de fórmula general III, y
b) un compuesto de fórmula general II.
Kit de la invención En otro aspecto, la presente invención se refiere a un kit ("kit-de-partes", del inglés "kit of parís") para la preparación de la composición o de la preparación combinada de la invención.
El término "kit", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una combinación de un conjunto de componentes adecuados para la obtención de la composición o de la preparación combinada de la invención, que pueden estar o no empaquetados juntos, junto con sus contenedores y envases apropiados para su venta comercial, etc. En la presente invención, se entiende como "componente adecuado para la obtención de la composición o de la preparación combinada de la invención", a cualquier compuesto que puede usarse para la obtención de las mismas, e incluye, sin limitación, soluciones acuosas, preparados sólidos, tampones, jarabes, soluciones de preservación, aromatizantes, correctores de pH, espesantes, etc.
Los componentes del kit se pueden proporcionar en viales separados (en forma de "kit- de-partes") o en un único vial. Además, se entiende que el kit de la presente invención está destinado a la preparación de la composición o de la preparación combinada o de la forma farmacéutica (por ejemplo, de la solución oral, colutorio, enjuague, gargarismo, elixir, etc.) de la invención. Preferiblemente, los componentes del kit de la presente invención están listos para ser usados para preparar la composición o la preparación combinada o la forma farmacéutica de la presente invención. Además, el kit contiene preferiblemente instrucciones explicativas acerca de cómo preparar la composición o la preparación combinada o la forma farmacéutica de la presente invención. Las instrucciones se pueden proporcionar a los usuarios en forma electrónica o en papel.
Por lo tanto, la invención proporciona un kit para la preparación de la composición de la invención o de la preparación combinada de la invención un recipiente que comprende un envase con el compuesto de fórmula general III en cualquier formulación farmacéuticamente aceptable, junto con componentes adecuados para la obtención de la composición o de la preparación combinada de la invención. De forma particular, el kit de la invención comprende, además, un envase con el compuesto de fórmula general II en cualquier formulación farmacéuticamente aceptable.
En una realización preferente, el compuesto de fórmula general III se encuentra soportado sobre nanopartículas farmacéuticamente aceptables, más preferentemente sobre nanopartículas de oro.
Uso de los compuestos de la invención
Un tercer aspecto de la invención consiste en el uso de los compuestos y/o las composiciones y/o las preparaciones combinadas y/o el kit de la invención como medicamento o para la elaboración de un medicamento. En una realización particular dicho medicamento es apto para el tratamiento de Leishmaniosis o enfermedades causadas por parásitos del genero Leishmania, más preferentemente L. infantum, L. major o L. trópica., y más preferentemente para el tratamiento de Leishmaniosis visceral, Leishmaniosis canina y/o Leishmaniosis cutánea.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de pacientes afectados por Leishmaniosis, en adelante "método de tratamiento de la invención" mediante el uso de los compuestos y/o las composiciones y/o las preparaciones combinadas y/o el kit de la invención. Los efectos de este método de tratamiento incluyen, pero no se limitan, a los efectos de eliminación de la enfermedad, el incremento del tiempo de progresión de la enfermedad y al índice de supervivencia. Los efectos del tratamiento incluyen a más largo plazo el control de la enfermedad.
Este tratamiento consiste en la administración a los individuos afectados por estas enfermedades de cantidades terapéuticamente efectivas de un compuesto de la invención, o una composición farmacéutica que lo incluya.
En una realización preferente, la enfermedad que se trata empleando compuestos y/o las composiciones y/o las preparaciones combinadas y/o el kit de la invención y/o el método de tratamiento de la invención es Leishmaniosis visceral, Leishmaniosis canina y/o Leishmaniosis cutánea.
En otra realización preferente, la enfermedad que se trata empleando los compuestos y/o las composiciones y/o las preparaciones combinadas y/o el kit de la invención y/o el método de tratamiento de la invención es leishmaniosis cutánea.
Para el tratamiento de leishmaniosis cutánea se emplea, preferentemente, una composición adecuada para su administración tópica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto III, preferentemente una concentración de III igual o superior al 0.5% p/p), más preferentemente en una concentración del compuesto III igual o superior al 2%. De forma preferente dicha composición adecuada para ser utilizada de forma tópica es lipófila.
La administración de los compuestos de la invención, en forma pura o en una composición farmacéutica apropiada, o en combinación con otros compuestos, composiciones o medicamentos, se puede llevar a cabo por medio de los modos de administración de agentes aceptados para servir a similares utilidades.
Procedimiento de síntesis de los compuestos de la invención
El procedimiento empleado para sintetizar los compuestos de la invención comprende [Figura 1] hacer reaccionar en una disolución un ácido de formula IV, con bencilhidroxil amina de formula V.
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Donde Ph es un fenilo de fórmula
Figure imgf000017_0002
Ph
Siendo:
R1 = H, F, Cl, Br, I, Me, OMe ó N02
R2 = H, F, Cl, Br, I, Me, OMe ó N02
R3 = H, F, Cl, Br, I, Me, OMe ó NO2
Preferentemente la disolución se realizará en metanol/THF anhidro manteniendo la reacción en atmosfera de argón.
En una realización preferente, el compuesto de formula general III se obtiene a partir de una disolución con el derivado del ácido carboxílico de fórmula general IV (1 equiv.) cloroformiato de etilo (1.35 equiv.), trietilamina (3.5 equiv.) y bencilhidroxil amina (1.7 equiv.) en THF/metanol. La reacción debe mantenerse a 0o C y atmosfera de argón.
Funcionalización de III con nanopartículas de oro
En una realización preferente, las composiciones de la invención comprende el compuesto III funcionalizado con nanopartículas de oro.
Para llevar a cabo la funcionalización de las partículas de oro con el compuesto III, se añade gota a gota la suspensión de partículas de oro a la solución del compuesto en dimetilsulfóxido (DMSO), preferentemente al 0.5%, y Tritón X100, preferentemente al 0.1 %. A continuación, la suspensión obtenida se añade gota a gota sobre una solución de Albúmina de Suero Bovino (Bovine Serum Albúmina o BSA), preferentemente al 1 %. Tras una incubación durante al menos 2 horas, se concentran las partículas por centrifugación y se resuspenden en lampón fosfato salino o buffer fosfato salino (Phosphate Buffered Saline o PBS) pH 7.2.
MODOS DE REALIZACIÓN Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención:
Ejemplo de síntesis de compuestos de la invención El compuesto O-bencilhidroxamato, Illa, fue obtenido según un esquema de reacción (Figura 1) que deriva del procedimiento para síntesis de ácidos hidroxámicos. Así, el compuesto de formula Illa se obtiene a partir de una disolución con el derivado del ácido carboxílico de fórmula IV (1 equiv.), en THF anhidro bajo argón. La solución se enfría y se adiciona el cloroformiato de etilo (1.35 equiv.) seguido de trietilamina (3.5 equiv.). La mezcla se agita a baja temperatura en atmósfera de argón. El sólido precipitado obtenido se filtra y el líquido filtrado se adiciona a una disolución que contiene el compuesto de fórmula Va (1.7 equiv.) disuelto en metanol anhidro.
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Se mantiene en agitación durante 1.5 h a temperatura ambiente, tiempo tras el cual la reacción se diluye con acetato de etilo y se realiza un lavado con agua destilada (3x 15 mL). La fase orgánica resultante se seca sobre Na2S04 anhidro, se filtra y se concentra a presión reducida. El residuo obtenido se purifica por cromatografía flash utilizando una mezcla de diclorometano y metanol como eluyente para obtener Illa (sólido blanco, 28 mg, 40% rendimiento).
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Illa
Mp 130-131 °C. 1 H RMN (500 MHz, CD30D) δ 7.54 (m, 2H), 7.33-7.25 (m, 7H), 7.08 (m, 1 H), 4.75 (s, 2H), 2.52 (m, 2H), 2.36 (m, 2H), 1.70-1.65 (m, 4H), 1.41 (m, 4H); 13C RMN (125 MHz, CD30D) δ 176.1 , 174.6, 139.9, 138.0, 129.7, 129.5, 129.3, 128.5, 125.1 , 121.3, 52.9, 37.9, 33.1 , 30.1 , 30.0, 26.8, 25.8; HRMS (ESI) m/z calculado para C21 H27N203 [M + H]+ 355.2022, encontrado 355.2025. Pureza según HPLC (λ=254): 100%, tR= 11.14 min.
Método HPLC: Solución A (H20:ACN 70:30 + 0.1 % HCOOH), solución B (ACN 100% + 0.1 % HCOOH); solución ¡socrática A 2 min.; gradiente desde A B 13 min; solución ¡socrática B 5 min.
Conservación de los compuestos
El compuesto Illa se puede conservar a 4°C durante al menos 6 meses sin que se produzcan cambios aparentes en sus características físico-químicas ni pérdidas de actividad. Por otro lado, el compuesto Illa es químicamente estable a pH 2 y pH 5, lo que permite su administración oral.
Síntesis de partículas inorgánicas de oro-fármaco del compuesto Illa Inicialmente, las nanopartículas de oro fueron sintetizadas de acuerdo con el método descrito por Turkevich [J. Turkevich, P.C. Stevenson, J. Hillier, Discuss. Trans. Faraday Soc. 11 (1951) 55], basado en la reducción de sales de oro en presencia de citrato a altas temperaturas. De acuerdo con el mismo, se preparó una solución de 4.5mg de tetracloroaurato (III) sódico dihidratado en un volumen de 25 ml_. Bajo agitación magnética constante se sometió a la solución a temperatura de 180 °C bajo reflujo. Alcanzada esta condición, se añadió a la solución de oro, 1ml_ de una solución al 1 % de citrato de sodio. Se dejó crecer a las partículas en presencia de los iones citrato durante un tiempo nunca inferior a 20 minutos. Posteriormente se dejó que la suspensión de partículas alcanzase temperatura ambiente antes de ser empleada. El resultado es una suspensión estable de partículas de oro, de color rojo vino.
Para llevar a cabo la funcionalización de las partículas de oro con el compuesto Illa, en primer lugar se disolvió el compuesto a una concentración 0.25 % en una solución compuesta por Dimetiisulfoxido (DMSO) al 0.5 % y Tritón X100 al 0.1 %. Una vez disuelto el compuesto Illa se le añade gota a gota 20 ml_ de suspensión de partículas de oro. Inmediatamente después, se añade gota a gota la suspensión de partículas de oro funcionalizadas con el compuesto Illa sobre una solución al 1 % de BSA. Se deja incubar durante un mínimo de 2 horas en presencia de BSA, y seguidamente después, se centrifuga a 14000 rpm para eliminar el exceso de BSA presente en el medio de las partículas conjugadas. Una vez centrifugadas las partículas, se retira el sobrenadante y se resuspenden en PBS pH 7.2 previo a su utilización.
Se ha comprobado que las suspensiones iniciales que tienen un color rosáceo, tienden a cambiar de color hacia el azul, cuando el volumen en el que se resuspenden las partículas es bajo. Por esta razón, con el fin de evitar la agregación de las partículas, se procede a resuspender en volúmenes superiores a 5 ml_.
Mediante medidas realizadas por técnicas de dispersión de luz (dynamic light scattering) y por microfotografías obtenidas por Microscopía de Transmisión de electrones como las mostradas en la imagen inferior, se ha determinado un tamaño aproximado para las partículas de oro empleadas como vehículos transportadores del fármaco Illa, de (24 ± 2) nm. La presencia de Illa y BSA se observa claramente mediante técnicas de dispersión de luz, como una corona alrededor de los núcleos de oro, llegando a duplicarse el tamaño hidrodinámico de las partículas (47 ± 8) nm [Figura 2]. Las suspensiones tienen un color rosáceo.
La adsorción del fármaco Illa sobre la superficie de las partículas de oro, muestra cambios en la carga eléctrica superficial de las partículas de oro. Las partículas de oro a pH fisiológico muestra carga eléctrica superficial (-36 ± 7) mV, mientras que las partículas de oro recubiertas de Illa y BSA en las mismas condiciones de pH, muestran una carga eléctrica superficial de (-10 ± 4) mV. Desde el punto de vista electrocinético, cualquier diferencia determinada sobre la carga eléctrica superficial es atribuida a la adsorción de cualquier ente sobre la superficie de las partículas, en este caso, el fármaco Illa y la BSA.
Ejemplos de ensayos con los compuestos de la invención
Evaluación de la actividad in vitro del compuesto Illa sobre infección causada por L. infantum Para ensayar el porcentaje de infección por L. infantum se utilizaron macrofagos derivados de médula ósea (BMDM) de ratones tipo Swiss ICR (CD-1). Estas células se extrajeron conforme a lo establecido por [Zamboni, D, S,;Rabinovitch, M. Nitric oxide partially controls Coxiellaburnetii phase II infection in mouse primary macrophages. Infecí. Immun. 2003, 71(3), 1225-1233]. Los BMDM se cultivaron sobre cubreobjetos en pocilios de placas de microtitulación de 24 pocilios, a una concentración de 4x105 BMDM en cada pocilio conteniendo medio RPMI-1640 con suero bovino fetal (FCS) al 10% y 5% de medio de células L929. Las placas con BMDM se dejaron toda la noche a una temperatura de 37°C a 5% de C02 para que las células se adhieran. Las infecciones se realizaron conforme a lo establecido por [Zauli-Nascimento, R C, Miguel, D. C, Yokoyama-Yasunaka, J. K.; Pereira, L. I., Peí li de Oliveira, M. A., Ribeiro-Dias, F., Doria, M. L. Liliana, S. R. In vitro sensitivity of Leishmania (Viannia) braziliensis isolates to meglumine antimoniate and amphotericin B. Trop. Med. Int. Health 2010 15(1) 68-76] ajustadas a la proporción de 5 promastigotes en fase estacionaria de L. infantum por cada macrófago. Los promastigotes se adicionaron a los pocilios manteniéndolos durante 2 horas a 37°C y 5% de C02 en RPMI-1640 con 10% de FCS. Pasado este tiempo el medio se retiró y los macrofagos se lavaron con medio RPMI-1640 para eliminar los promastigotes.
Se adicionó un nuevo medio RPMI-1640 enriquecido con 10% SBF y 5% de medio condicionado de células L929 y que contuviera el fármaco en sus distintas concentraciones. Tras 48 h de incubación a 37°C, 5% C02, los cubres se fijaron con metanol y tiñeron con Giemsa 20%. Se contaron 200 macrofagos distribuidos por todos los campos del cubre y se calculó el porcentaje de macrofagos infectados y no infectados. Se consideraron como infectados los macrofagos que contuvieran al menos un amastigote. Cada experimento se realizó por triplicado. Tras el tratamiento a diversas concentraciones de cada compuesto, la respuesta observada en forma de % de infección se convierte en % de reducción de infección. Por último se realiza un análisis de regresión lineal múltiple (software SPSS 150) para calcular la CI50 (concentración del compuesto que reduce al 50% la carga parasitaria) y CC50 (concentración del compuesto que mata al 50% de las células de mamífero) del producto evaluado. La actividad del compuesto Illa frente al parásito responde a un patrón de doble inversa con la siguiente fórmula: RP= 1/(0.0118124 + 0.00044687/C) (R2=97%), donde RP es la reducción en el porcentaje de infección y C es la concentración del compuesto Illa. Los resultados obtenidos para el compuesto Illa se muestran en la Tabla 1 , tras su evaluación in vitro frente a L. infantum intracelular (CI50) y su citotoxicidad en células de mamíferos (CC50). Como control se utilizaron los fármacos vorinostat (I), pentamidina (Pl) y antimoniato de meglumina (MA) o Glucantime ®.
Figure imgf000022_0001
Tabla LCIso y CC50 del compuesto Illa: Actividad frente a amastigotes de L infantum en macrófagos y citotoxicidad en células de mamífero.
(a) CC50 sobre macrófagos derivados de médula ósea de ratones (BMDM)
(b) CC50 sobre fibroblastos de ratón L929
(c) NR: No realizado
Eficacia y toxicidad in vitro
El compuesto Illa mostró una CI50 frente a amastigotes intracelulares de L. infantum aproximadamente 5 veces superior a la del compuesto (II) y mostrando, además, una actividad superior a los fármacos utilizados como control. Este hecho unido a su baja citotoxicidad (CC50 >100 μΜ), le confiere un índice de selectividad mayor a 100. Al igual que el compuesto II, el compuesto Illa no mostró actividad frente a promastigotes de L. infantum en el rango de concentraciones 1- 100 μΜ.
Evaluación de la actividad in vivo del compuesto Illa en un modelo animal infectado con L. infantum En este ensayo se han empleado ratones Balb/c hembra de 6 semanas de edad
Toxicidad subaguda in vivo
El compuesto (Illa) vehiculizado sobre nanopartículas de oro se administró a un grupo de 10 ratones Swiss ICR (CD-1) de 6 semanas de edad a una dosis de 500 mg/kg/día durante 10 días. Finalizado el tratamiento, se realizó una observación adicional de los animales durante dos semanas. Se evaluó la aparición de signos de dolor, sufrimiento, diarrea, pérdida de peso, hepato o esplenomegalia. Durante el tratamiento y posterior seguimiento, ningún animal murió ni apareció ninguno de los signos anteriormente indicados, lo que indica que el compuesto carece de toxicidad aguda o subaguda (dosis letal 50% (DL50) >500 mg/kg).
Procedimiento de infección y tratamiento
Se infectaron 35 ratones Balb/c hembra de 6 semanas de edad con 10 millones de promastigotes de L. infantum en fase estacionaria de crecimiento por vía intraperitoneal en un volumen de 0,4 ml_ de solución salina isotónica. Tras 28 días post-infección, los animales se dividieron en cinco grupos de 7 ratones cada uno que se sometieron a diferentes tratamientos diarios por vía intraperitoneal durante 10 días. Los tratamientos utilizados in vivo son los siguientes:
- Grupo control tratado con nanopartículas de oro sin fármaco; grupo tratado con compuesto (Illa) a 10 mg/kg;
- Grupo tratado con compuesto (Illa) vehiculizado en nanopartículas de oro a 25 mg/kg;
- Grupo control de referencia tratado con antimoniato de meglumina a 104 mg SbV/kg;
- Grupo tratado con una combinación de antimoniato de meglumina a 104 mg SbV/kg y compuesto (Illa) vehiculizado en nanopartículas de oro a 10 mg/kg. Para la cuantificación de la carga parasitaria en los órganos de los ratones sacrificados tras el tratamiento, se pesan 20 mg de tejido, se homogeniza y se extrae el ADN con un kit comercial adecuado, quedando éste resuspendido en un volumen de 20 microL. A continuación se realiza una PCR cuantitativa (a tiempo real). Esta PCR utiliza sondas TaqMan y es especifica de L. infantum. Se calcula el número de parásitos presentes en cada muestra interpolando el Ct obtenido en una curva patrón previamente establecida usando diluciones seriadas de parásitos. A partir del número de parásitos presentes en la muestra y conociendo el peso del órgano utilizado para la extracción del ADN, se estima el número de parásitos/mg de órgano. Resultados obtenidos in vivo
El compuesto Illa vehiculizado en nanopartículas de oro resultó muy eficaz a 25 mg/kg, reduciendo las cargas parasitarias en un 99% en hígado y un 93% en bazo, frente a la reducciones del 83% en hígado y 52% en bazo utilizando como fármaco control el antimoniato de meglumina.
En la Tabla 2 se muestra una comparación, en términos de reducción de carga parasitaria, de los compuestos II y Illa, ambos vehiculizados en nanopartículas de oro.
Figure imgf000024_0001
Tabla 2. Reducción en el porcentaje de infección por L infantum con respecto al control sin tratamiento tras 14 días de tratamiento a una dosis de 25 mg/kg/día del compuesto II o 10 días de tratamiento a la misma dosis del compuesto Illa. La dosis de antimoniato de meglumina (MA) fue de 390 mg/kg (equivalente a 104 mg/kg/día de antimonio SbV) y el tratamiento duró 14 días.
Evaluación de la toxicidad en animales infectados
En el tratamiento con el compuesto Illa de los animales infectados experimentalmente con L. infantum no se observaron efectos adversos gastrointestinales, pérdida de peso, dolor u otros síntomas generales. Tampoco se observaron alteraciones en los valores bioquímicos y enzimáticos evaluados en suero o sangre, como transaminasas (GPT y GOT), urea, fosfatasa alcalina y creatinina. Tampoco se encontró hepato o esplenomegalia asociadas al tratamiento. Por tanto, el fármaco tampoco muestra toxicidad en ratones infectados.
El compuesto Illa ha resultado ser un potente fármaco frente a los amastigotes de L. infantum siendo la actividad dosis dependiente. Existe una relación positiva entre la concentración administrada y el porcentaje de reducción de la infección encontrado. Además, no ha mostrado a las dosis evaluadas actividad sobre la forma promastigote. La dosis a la que se evidencian efectos citotóxicos es muy superior a la dosis antiparasitaria. El índice de selectividad es también superior al encontrado para pentamidinaisetianato (IS = 4) y la meglumina antimoniato (IS = 2) que constituyen los fármacos control (fármacos habitualmente utilizados en el tratamiento de la leishmaniosis).
Evaluación de la actividad in vivo del compuesto Illa en un modelo animal infectado con L. trópica
En otro ensayo se evaluó la eficacia del compuesto Illa frente a la leishmaniosis cutánea usando hamsters sirios de 80-100 g infectados por Leishmania trópica. Los hamsters se inocularon en la planta del pie izquierdo con 3 χ 107 parásitos/50 L phosphate buffer saline (PBS).
El compuesto se administró usando dos tipos de pomadas distintas, una más hidrófila y otra más lipófila (indicar composición concreta), y con dos concentraciones de Illa diferentes (0.5% y 2% p/p). La eficacia en el tratamiento de la leishmaniosis cutánea se midió determinando la reducción de la carga parasitaria y del tamaño de la lesión.
Como tratamiento comparativo se administró Glucantime mediante inyecciones intralesionales de.100 mg Sbv/kg. La reducción en la carga parasitaria de los hamsters tratados con este fármaco fue del 61.6%
Aunque las 4 composiciones ensayadas reducían la carga parasitaria, la pomada más eficaz fue la más lipófila con la concentración más elevada de compuesto III. La pomada con compuesto III al 2,5% reduce la carga parasitaria hasta en un 75% y el tamaño de las lesiones se va reduciendo progresivamente sin mostrar ninguna toxicidad ni efecto secundario en los animales. La actividad fue mayor que el compuesto de referencia (antimonio pentavalente) que sólo mostró una reducción de la carga parasitaria del 62%. Tipo de pomada Concentración de Illa Reducción de carga parasitaria
Hidrófila 0.5% 41.5%
Hidrófila 2% 59.7%
Lipófila 0.5% 55%
Lipófila 2% 74.8%
Ensayo de interacción entre fármacos
Las potenciales interacciones entre fármacos se pueden predecir evaluando in vitro el citocromo P450.
Se ha podido comprobar que el compuesto Illa, al igual que anteriormente se comprobó para el compuesto II, no actúa sobre las enzimas del citocromo P450 por lo que no debe interaccionar/'n vivo sobre otros fármacos y admitiría su uso combinado con otros fármacos en el tratamiento de la leishmaniosis. En particular, la combinación entre los fármacos II y III es viable desde este punto de vista.

Claims

REIVINDICACIONES
Un compuesto de fórmula general III
Figure imgf000027_0001
así como compuestos racémicos, estereoisómeros, sales o solvatos del mismo;
donde Ph es un fenilo de fórmula
Figure imgf000027_0002
R1 = H, F, Cl, Br, I, Me, OMe ó N02.
R2 = H, F, Cl, Br, I, Me, OMe ó N02
R3 = H, F, Cl, Br, I, Me, OMe ó N02
Compuesto según reivindicación anterior caracterizado por que R1=H o R2=H o R3=H.
Compuesto según reivindicación anterior caracterizado porque al menos dos de los tres radicales del fenilo están formados por hidrógeno
Compuesto según reivindicación anterior caracterizado por que R1 =H, R2=H y R3=H (Compuesto Illa).
Figure imgf000027_0003
Illa Composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 como principio activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
6. Composición farmacéutica que comprende como único principio activo un compuesto, o una combinación de compuestos, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, junto un vehículo farmacéuticamente aceptable.
7. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 caracterizado porque los compuestos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 están funcionalizados en nanopartículas de oro. 8. Composición según reivindicación anterior caracterizada porque las nanopartículas de oro están compuestas por núcleo de oro y recubrimiento con citrato sódico.
Composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 caracterizada porque las nanopartículas tienen un diámetro de entre 20 y 30 nm, preferentemente entre 22 y 26 nm.
10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 apta para administración oral.
1 1. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9 apta para administración tópica
12. Composición según reivindicación anterior en la que la concentración de compuesto III es igual o superior al 0.5% p/p, preferentemente igual o superior al 2%.
13. Preparación combinada que comprende:
a) un compuesto de fórmula general III, y
b) otro principio activo frente a Leishmaniosis.
14. Preparación combinada según reivindicación anterior que comprende a) un compuesto de fórmula general III, y
b) un compuesto de fórmula eneral II
Figure imgf000029_0001
15. Preparación combinada según reivindicaciones 13 o 14 caracterizada por que el compuesto de fórmula general III se encuentra soportado sobre nanopartículas farmacéuticamente aceptables, más preferentemente sobre nanopartículas de oro.
16. Kit para la preparación de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12 o de la preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15. 17. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, o preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 o el kit según reivindicación 16 para la elaboración de un medicamento. 18. Uso según la reivindicación anterior para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de Leishmaniosis.
19. Uso según la reivindicación anterior caracterizado por que la Leishmaniosis es Leishmaniosis canina o Leishmaniosis visceral.
20. Uso según la reivindicación 18 caracterizado por que la Leishmaniosis es Leishmaniosis cutánea.
21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 caracterizado por que la Leishmaniosis está causada por L. Infantum.
22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 18 o 20 caracterizado por que la Leishmaniosis está causada por L trópica.
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