WO2018011419A2 - Pharmaceutical use of alpha-l-guluronic acid - Google Patents

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WO2018011419A2
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uronic acid
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guluronic
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Definitions

  • the invention relates to a uronic acid monomer for use in the treatment of disorders of the immune system, inflammatory diseases, kidney diseases, allergies and neurodegenerative diseases, wherein the uronic acid monomer is ⁇ -L-guluronic acid, a derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof and the uronic acid Monomer is administered in a dose of less than 50 mg / kg / d.
  • Rheumatoid arthritis is an inflammatory systemic disease that predominantly affects the joints.
  • An older term for rheumatoid arthritis that is still commonly used is chronic polyarthritis. Over one million people in Germany suffer from rheumatoid arthritis. Around 2,000 new people fall ill each year.
  • rheumatoid arthritis is still not well known. It is believed that this is a so-called autoimmune disease, in which it comes to a false control of the body's defense system (the immune system) and this attacks cells of the body. The causes of the initial dysregulation of the immune system are still unknown. scientistss suspect that several factors are involved in the development of the disease. Infections with bacteria or viruses may play a role. Basically, the disease is not curable until today and accompanies the patient for the rest of his life.
  • rheumatoid arthritis For the treatment of rheumatoid arthritis currently preferred long-term drugs are used.
  • the active ingredients used are combined due to the slow onset of their action with a faster-acting drug.
  • cortisone-free anti-inflammatory drugs so-called non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs or non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAID, which are among the aspirin-like drugs or cortisone.
  • the NSAIDs include, among others, the following active ingredients acetylsalicylic acid, diclofenac, indomethacin, piroxicam, rofecoxib, cefecoxib and meloxicam, which are marketed under different trade names.
  • NSAIDs have an anti-inflammatory and analgesic effect because they inhibit the function of all prostaglandins.
  • a typical side effect of NSAIDs is that they cause the Gastric mucosa attack, which can lead to stomach and intestinal diseases, in the worst case to gastric and intestinal bleeding.
  • EP 0506325 describes oligomers or polymers of L-guluronic acid and their epimer D-mannuronic acid in order to inhibit the production of cytokines such as interleukins IL-1, IL-6 and TNF.
  • IL-1 is known to inhibit the production of prostaglandins.
  • the polysaccharides used were from the algae Laminaria digitata (copolymers "G-blocks” containing more than 90% L-guluronic acid), from the cells of Ascophyllum nodosum fruiting bodies (copolymers "M-blocks", more than 95% D -Mannannonic acid) or from cultures of Pseudomonas aeruginosa (polymannuronic acid).
  • the block copolymer alginic acid which consists of varying proportions of mannuronic acid and guluronic acid, has long been used in the food and pharmaceutical industries because of its gelling properties. Its preparation and the preparation of the individual monomers is known in the art.
  • WO 01/661 19 describes a further application for the treatment of mucous membrane inflammations in the stomach.
  • US 5,952,308 describes a pharmaceutical composition which may include, inter alia, a mannuronic acid monomer as a complexing agent for a mineral to promote uptake of these minerals.
  • WO 01/56404 describes a process for the preparation of low molecular weight polymannuronates from marine algae, which is used against obesity and excessive cholesterol levels.
  • DE 10247073 A describes the preparation and use of ⁇ -L-guluronic acid as an active ingredient in the treatment of diverse Diseases such as rheumatic diseases and kidney diseases. Nevertheless, these studies do not show optimized applications of ⁇ L-guluronic acid, eg with respect to the dose to be administered.
  • the inventors of the present application solve this need by their surprising discovery that low-dose ⁇ -L-guluronic acid achieves comparable and / or improved effects as a higher dose in the treatment of immune system disorders, inflammatory diseases, kidney diseases, allergies and neurodegenerative diseases. It has been found that a dose of less than 50 mg / kg / d a-L-guluronic acid is sufficient to elicit this improved action of a-L-guluronic acid in patients.
  • Figure 1 shows the effect of ⁇ -L-guluronic acid (G2013) on the clinical score of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).
  • G2013 ⁇ -L-guluronic acid
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • mice in treatment groups A and B were administered intraperitoneally with ⁇ -L-guluronic acid at 40 and 80 mg / kg / d from day 7 to day 20 post-immunization.
  • the degree of the disease was assessed by a visual cumulative scoring system. Cumulative scores from day 10 to day 21 are reported as the mean + SEM. * P ⁇ 0.05 is indicated at each data point by Mann-Whitney U test by comparing precautionary group and treatment groups against the control group.
  • FIG. 2 shows representative light micrographs of histological samples of the central nervous system.
  • H & E staining Hematoxylin-eosin staining
  • LLB staining Luxol fast blue staining
  • N normal
  • C control group
  • P prevention group
  • TA treatment group A
  • TB Treatment Group B
  • Figure 3 shows a table of comparative values of inflammatory criteria obtained from histological samples of the central nervous system from EAE mice.
  • Figure 4 shows the effect of ⁇ -L-guluronic acid (G2013) on the clinical score of collagen-induced arthritis (CIA) in therapeutic groups.
  • Figure 5 shows the effect of ⁇ -L-guluronic acid (G2013) on the expression of miR-155 in HEK-293hTLR4 cells.
  • Figure 6 shows the effect of ⁇ -L-guluronic acid (G2013) on the expression of SHIP-1 in HEK-293hTLR4 cells.
  • Figure 7 shows the effect of ⁇ -L-guluronic acid (G2013) on the expression of SOCS-1 in HEK-293hTLR4 cells.
  • the present invention is directed to a uronic acid monomer for use in the treatment of immune system disorders, inflammatory diseases, kidney diseases, allergies and neurodegenerative diseases, wherein the uronic acid monomer is ⁇ -gluluronic acid, a derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof and the uronic acid monomer is administered at a dose of less than 50 mg / kg / d.
  • uronic acid monomer is based on carboxylic acids which have formally been formed by oxidation of the primary hydroxyl group of monosaccharides (-CH 2 -OH) to the carboxy group (-COOH) They belong to the sugar acids.
  • a uronic acid monomer is ⁇ -L-guluronic acid.
  • ⁇ -Guluronic acid is a compound according to formula (I):
  • the dose to be administered is less than 50 mg of uronic acid monomer (eg, ⁇ L-guluronic acid) per kilogram of body weight of a given patient per day (50 mg / kg / d).
  • the dose is less than 49 mg / kg / d, 48 mg / kg / d, 47 mg / kg / d, 46 mg / kg / d, 45 mg / kg / d, 44 mg / kg / d, 43 mg / kg / d, 42 mg / kg / d, 41 mg / kg / d, 40 mg / kg / d, 35 mg / kg / d, 30 mg / kg / d, 25 mg / kg / d, 20 mg / kg / d, 15 mg / kg / d or 10 mg / kg / d.
  • uronic acid monomer eg, ⁇ L-guluronic acid
  • the dose is 0.1-49.9 mg / kg / d, 1 -49.8 mg / kg / d, 3-48.5 mg / kg / d, 5-47 mg / kg / d , 8-45 mg / kg / d, 10-42.5 mg / kg / d or 15-39.9 mg / kg / d.
  • a patient according to the present invention may be a mammal, such as a rodent, a carnivore, a cloven-hoofed dog, an odd-toed ungulate, or a primate.
  • the patient is a human.
  • Preferred pharmaceutically acceptable salts of ⁇ -L-guluronic acid are sodium ⁇ -L-guluronic acid, potassium ⁇ -L-guluronic acid, magnesium ⁇ -L-guluronic acid, calcium ⁇ -L-guluronic acid or a combination thereof.
  • uronic acid monomer eg, ⁇ L-guluronic acid
  • ⁇ L-guluronic acid refers to a chemical substance or compound derived directly or by modification or partial substitution of ⁇ -L-guluronic acid substituents may be at most 4, at most 3, at most 2 or a substituent.
  • Inflammatory diseases as referred to in the application include autoimmune diseases, acute and chronic inflammations and osteoarthritis.
  • Autoimmune diseases as defined in the application include rheumatoid arthritis, juvenile arthritis, systemic lupus erythematosus, Sjogren's syndrome, progressive systemic scleroderma (PSS), polymyositis dermatomyositis, Behget's disease, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, Reiter's syndrome, and recurrent polychondritis.
  • PSS progressive systemic scleroderma
  • Kidney diseases as referred to in the application include glomerulonephritis and glomerulosclerosis.
  • Disorders of the immune system include rejection reactions in transplants, allergic contact dermatitis and type I-IV hypersensitivity.
  • Neurodegenerative diseases include multiple sclerosis (MS) and Alzheimer's disease.
  • the uronic acid monomer of the present invention is used in combination therapy for use with substances having hepatotoxic side effects.
  • hepatotoxic side effects refers to the properties of chemicals that are toxic to hepatocytes (hepatic epithelial cells), which are known as hepatotoxic substances (hepatotoxic substances, hepatotoxins, liver toxins or liver toxins) and hepatotoxic substances that can damage liver hepatitis to necrosis or liver toxicity Cause liver dystrophy.
  • the uronic acid monomer is administered intraperitoneally, orally, buccally, rectally, intramuscularly, topically, subcutaneously, by inhalation, intraarticularly or intravenously.
  • the uronic acid monomer is as ointment, cream, gel, paste, emulsion, tablet, Zäpfen, powder, powder, granules, lozenge, patch, patch, solution, foam, lotion, oil, shampoo, aerosol or spray in front.
  • the total active ingredient content of the abovementioned (drug) compositions according to the invention is preferably in the range from 0.05 to 90% by weight, preferably in the range from 0.1 to 50% by weight, particularly preferably 0.5 to 20% by weight. %, in each case based on the total weight of the (drug) agent.
  • the proportion of active substance is determined in the manner known to the person skilled in the art, depending on the respectively selected dosage form, of the selected active ingredient (s), and the dose suitable for the respective therapeutic purpose.
  • the therapeutically suitable dosages of the individual active ingredients are known to the person skilled in the art.
  • Said (drug) agents may contain known in the art additional ingredients such as excipients (carriers, skin protectants, disinfectants, surfactants, etc.).
  • Suitable adjuvants are, for example, the following: particulate carriers (eg talc, zinc oxide, starch, starch derivatives, diatomaceous earth); gel-forming substances (eg gelatin, tragacanth, cellulose derivatives, alginates, polyacrylic acid); Humectants (eg urea, glycerol, propylene glycol), pressure-sensitive adhesive polymers (eg polyacrylates, as well as adhesive resins); Ointment bases (eg vaseline, fats, cellulose derivatives, polyacrylic acid, polyethylene glycols); Emulsifiers (eg wool wax, sorbitan esters, monoglycerides); Preservatives (eg benzalkonium chloride), antioxidants (eg butylhydroxyanisole), thickeners (eg hydroxypropylmethylcellulose), pH
  • uronic acid monomers according to the invention can be carried out together with other, preferably chemically pure, drugs and / or herbal medicines, or the pharmaceutical preparation of the invention may contain such other, preferably chemically pure, drugs or drugs.
  • EAE Experimental autoimmune encephalomyelitis
  • MS multiple sclerosis
  • mice were randomly divided into five groups (6 mice each) as follows: I: normal group (PBS treated); II: control group (MOG 35 -55-induced EAE and PBS treated); III: Prevention group (MOG 3 5-55-induced EAE and 40 mg / kg / d G2013 treated from day 0-20); IV: Treatment group A (MOG 35 -55-induced EAE and 40 mg / kg / d G2013 treated by day 7-20) and V: treatment group B (MOG 35 -55-induced EAE and 80 mg / kg / d G2013 treated by Day 7-20).
  • the EAE was tested by the Hooke kit (Hooke Laboratories, Inc., USA) to study the induced pathogenesis and treatment of MS in the animal model.
  • the kit consists of two components; Antigen (MOG35-55) in an emulsion with complete Freund's adjuvant (CFA) in two pre-filled syringes and a vial of lyophilized pertussis toxin (PTX).
  • the freeze-dried PTX was dissolved in PBS on day 0.
  • the mice were each injected with an emulsion of 0.1 ml subcutaneously on the upper and lower back. About 2 hours after injection of the emulsion, the first dose of PTX (0.1 ml / mouse) was injected intraperitoneally (IP). This was repeated 24 hours later as a second dose of PTX (0.1 ml / mouse).
  • the ⁇ L-guluronic acid (G2013) (manufactured in the Pathobiology Department of the TUMS) was administered to the precaution group from day 0 to day 20 after immunization in the specific dose of 40 mg / kg / d IP.
  • the mice of treatment groups A and B were given 40 and 80 mg / kg / d G2013 from day 7 post-immunization until day 20 IP.
  • the mice of the normal and control groups received PBS (0.1 ml of each mouse, daily). IP injection into the mice of all groups was done on six consecutive days per week. Mice were monitored daily and scored for clinical scores.
  • Clinical score of EAE mice was defined as follows: 0: no clinical signs; 1: flabby tail; 2: flaccid tail and weakness of the hind legs; 3: flaccid tail and complete hindleg paralysis (most common) or flaccid tail with paralysis of anterior and posterior leg; 4: flaccid tail, complete hind leg and partially frontal paralysis; 5: Mouse rolls spontaneously in the cage or was found dead because of paralysis.
  • mice were anesthetized and blood samples taken from their hearts.
  • the mice were killed after their anesthesia and brains and cerebellum removed to fix them then in neutral 10% formalin, as well as paraffin embedded, cut (8 ⁇ thickness) and stained with hematoxylin-eosin (H & E) to assess the inflammatory criteria in meningeal and parenchymal tissue and to stain with Luxol-fast-blue (LFB) to differentiate demyelination. All stained samples were analyzed blindly on a slide by an expert pathologist.
  • H & E hematoxylin-eosin
  • LLB Luxol-fast-blue
  • N0 2 in the serum samples was examined by the Griess method based on the assessment of the N0 2 final product.
  • the Griess method uses a colorimetric reaction for the measurement of N0 2 (nitrite) in an aqueous solution.
  • Gries's reagent was mixed by dissolving 1 g of sulfanilamide in 100 ml of 5% phosphoric acid prepared with 0.1 g of naphthylethylenediamine HCl (NED) in 100 ml of distilled water.
  • the serum sample (50 ⁇ ) was mixed with 50 ⁇ Griess reagent for 10 min at room temperature.
  • the absorbance was measured on an ELISA reader instrument at 540 nm.
  • the concentration of nitrite was determined by a standard curve of 0.1 M sodium nitrite in distilled water.
  • Example 2 Therapeutic effect of ⁇ -L-guluronic acid (G2013) in an experimental model of rheumatoid arthritis
  • FCA Freund's adjuvant
  • strain H37Ra Mycobacterium tuberculosis
  • FCA Freund's adjuvant
  • strain H37Ra Mycobacterium tuberculosis
  • FCA Freund's Complete Adjuvant
  • mice received an intraperitoneal (ip) booster injection of 100 ⁇ g CM dissolved in phosphate buffered saline (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the onset of arthritis usually occurred a few days before or after the booster injection.
  • Mice were examined visually three times per week visually for arthritis manifestations in the peripheral joints, and disease activity ratings were assigned as previously described (van den Berg WB, et al, 1994).
  • the clinical grade of arthritis was graded on a scale of 0-2 for each paw, consistent with changes in redness and swelling in the toes or in other parts of the paws.
  • G2013 treatment was started before the onset of clinical symptoms of the disease (day 21) or during established arthritis (macroscopic arthritis scores of 0.25 to 1, 25 on a scale of 0-8) and continued for 14 days.
  • Treatment with G2013 was administered at a dose of 25 or 50 mg / kg / d by intraperitoneal (ip) injection.
  • Anti-TNF Enbrel was used as a positive control of the treatment and injected IP 3 times a week.
  • Luminex multi-analyte technology was used in combination with the Miliplex Cytokine / Chemokine Magnetic Bead Panel kit (Millipore) according to the manufacturer's protocol to measure the levels of IL-1, IL-6, IL-10 and KC to measure cytokines in treated and untreated mouse sera.
  • Miliplex Cytokine / Chemokine Magnetic Bead Panel kit (Millipore) according to the manufacturer's protocol to measure the levels of IL-1, IL-6, IL-10 and KC to measure cytokines in treated and untreated mouse sera.
  • isolated joints were fixed in 10% formalin, 5% decalcified formic acid for 4 days and then dehydrated and embedded in paraffin. Standard 7 mm frontal sections were mounted on SuperFrost microscope slides (Menzel-Gläser, Braunschweig, Germany).
  • Hematoxylin and eosin (H & E) staining and safranine O staining were performed to study joint pathology.
  • Example 3 Immunosuppressive effects of ⁇ -L-guluronic acid (G2013) on the expression of microRNA 155 and its cytosolic targets
  • HEK293 hTLR4 cells a human embryonic kidney line, were transfected into RPMI 1640 medium (Gibco, USA) with 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA), 1X penicillin-streptomycin antibiotic and 2 mM L-glutamine at 37 ° C cultured under a humidified atmosphere at 95% air and 5% C0 2 . Counting and determining viability were done using trypan blue.
  • RNA purity was checked ND-1000 (Isogen Life Science) per NanoDrop® to ensure spectrophotometric ratios of A 2 A 2 6o nm 8o nm ⁇ 2 and A 2 6o nm / A 23 nm o ⁇ . 2
  • cDNA was prepared using the RT-for-RCR kit (Gene All, South Korea).
  • the relative mRNA abundance was determined by normalizing to ß-actin mRNA using 2 A -AACT method determines (Ct refers to the threshold value).
  • the miRNA cDNA was generated using MystiCq® MicroRNA cDNA Synthesis Mix (Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions.
  • the qPCR was performed using a specific miR-155 primer, 5'-UUA AUG CUA AUC GUG AUA GGG GU-3 '(Sigma-Aldrich), and SYBR Premix EX Tq (Takara, Japan).
  • the conditions for the qPCR were as follows: 95 ° C for 30 s, 94 ° C for 5 s, 60 ° C for 30 s, and 70 ° C for 15 s (40 cycles).
  • the One-Step Real Time (Applied Biosystem) thermocycler was used for the qPCR and the data was analyzed using GraphPad Prisma 5 software based on the one-way Anova variance method and Student's t-test. Relative miRNA frequency was determined by normalization against U6 snRNA using the 2 ⁇ - ⁇ method.
  • Example 4 Effect of ⁇ -L-guluronic acid (G2013) on the differentiation, maturation and function of human dendritic cells
  • the monocytes (> 95% purity) were incubated at 37 ° C in 24-well plates (700,000 cells per well) in 3 ml serum-free AIM V medium (Invitrogen) containing 100 ng / ml human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) (PeproTechs) and human interleukin-4 (IL-4, 20 ng / ml, R & D Systems).
  • the cells were cultured with two different dosages of G2013. On the one hand a 6 ⁇ g well low dosage solution and on the other hand a 12 ⁇ g well high dosage solution. 6 wells were selected as control (not treated with G2013).
  • LPS lipopolysaccharide
  • G2013 aL-guluronic acid
  • BSA bovine serum albumin
  • the cells were incubated for 10 minutes at room temperature with an Fc receptor blocking solution (BioLegend, San Diego, USA). The cells were then incubated at 4 ° C for 30 min with the following mouse monoclonal anti-human antibodies (MAb): FITC-conjugated mAbs against the cell surface molecules CD83, CD14 and PE-conjugated mAbs against CD1a, CD86 and PECY5- conjugated mAbs to MHCII (eBiosciences, USA). In all experiments, isotype controls were used that were appropriate mAbs of the same Ig class or subclass.
  • MAb mouse monoclonal anti-human antibodies
  • CD14 and CD1a (as a differentiation marker) was studied in monocytes and immature dendritic cells with two different doses (6 and 12 ⁇ g) of ⁇ -L-guluronic acid (G2013). The results show that there are no significant differences between the control group and the groups treated with G2013 solution.
  • the supernatants of cultured DCs were collected and cytokine concentrations were measured by the ELISA method.
  • G2013 aL-guluronic acid

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Abstract

The invention relates to a uronic acid monomer for use in the treatment of immune system disturbances, inflammatory diseases, kidney diseases, allergies and neurodegenerative diseases, wherein the uronic acid monomer is α-L-guluronic acid or a derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof, and said uronic acid monomer is administered at a dose of less than 50 mg/kg/day.

Description

Pharmazeutische Verwendung von alpha-L-Guluronsäure  Pharmaceutical use of alpha-L-guluronic acid
Hintergrund background
Die Erfindung betrifft ein Uronsäure-Monomer zur Verwendung in der Behandlung von Störungen des Immunsystems, Entzündungskrankheiten, Nierenerkrankungen, Allergien und neurodegenerativen Krankheiten, wobei das Uronsäure-Monomer α-L-Guluronsäure, ein Derivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist und das Uronsäure-Monomer in einer Dosis von weniger als 50 mg/kg/d verabreicht wird.  The invention relates to a uronic acid monomer for use in the treatment of disorders of the immune system, inflammatory diseases, kidney diseases, allergies and neurodegenerative diseases, wherein the uronic acid monomer is α-L-guluronic acid, a derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof and the uronic acid Monomer is administered in a dose of less than 50 mg / kg / d.
Die rheumatoide Arthritis ist eine entzündliche Systemerkrankung, die überwiegend die Gelenke befällt. Eine ältere Bezeichnung für die rheumatoide Arthritis, die noch häufig benutzt wird, ist chronische Polyarthritis. Über eine Million Menschen leiden in Deutschland an rheumatoider Arthritis. Jährlich erkranken rund weitere 2000 Menschen neu daran. Rheumatoid arthritis is an inflammatory systemic disease that predominantly affects the joints. An older term for rheumatoid arthritis that is still commonly used is chronic polyarthritis. Over one million people in Germany suffer from rheumatoid arthritis. Around 2,000 new people fall ill each year.
Die Ursache der rheumatoiden Arthritis ist bis heute noch nicht genau bekannt. Man geht davon aus, dass es sich um eine sogenannte Autoimmunerkrankung handelt, bei der es zu einer Fehlsteuerung des körpereigenen Abwehrsystems (des Immunsystems) kommt und dieses Zellen des eigenen Körpers angreift. Die Ursachen für die anfängliche Fehlsteuerung des Immunsystems sind bis heute unbekannt. Seitens der Wissenschaft wird vermutet, dass mehrere Faktoren bei der Entstehung der Krankheit beteiligt sind. Möglicherweise spielen Infektionen mit Bakterien oder Viren eine Rolle. Grundsätzlich ist die Erkrankung bis heute nicht heilbar und begleitet den Patienten sein restliches Leben lang. The cause of rheumatoid arthritis is still not well known. It is believed that this is a so-called autoimmune disease, in which it comes to a false control of the body's defense system (the immune system) and this attacks cells of the body. The causes of the initial dysregulation of the immune system are still unknown. Scientists suspect that several factors are involved in the development of the disease. Infections with bacteria or viruses may play a role. Basically, the disease is not curable until today and accompanies the patient for the rest of his life.
Zur Behandlung der rheumatoiden Arthritis kommen derzeit bevorzugt langfristig wirkende Medikamente zum Einsatz. Die verwendeten Wirkstoffe werden aufgrund des langsamen Eintretens ihrer Wirkung mit einem schneller wirkenden Medikament kombiniert. Dabei handelt es sich um sogenannte „cortisonfreie Entzündungshemmer", sogenannte nicht steroidale Antirheumatika, NSAR, beziehungsweise non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAID, die zu den Aspirin-ähnlichen Medikamenten zählen oder um Cortison. For the treatment of rheumatoid arthritis currently preferred long-term drugs are used. The active ingredients used are combined due to the slow onset of their action with a faster-acting drug. These are so-called "cortisone-free anti-inflammatory drugs", so-called non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs or non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAID, which are among the aspirin-like drugs or cortisone.
Zu den NSAR gehören unter anderem die folgenden Wirkstoffe Acetylsalicylsäure, Diclofenac, Indomethacin, Piroxicam, Rofecoxib, Cefecoxib sowie Meloxicam, die unter verschiedenen Handelsnamen vertrieben werden. The NSAIDs include, among others, the following active ingredients acetylsalicylic acid, diclofenac, indomethacin, piroxicam, rofecoxib, cefecoxib and meloxicam, which are marketed under different trade names.
NSAR's wirken entzündungshemmend und schmerzstillend, weil sie alle Prostaglandine in ihrer Funktion hemmen. Eine typische Nebenwirkung der NSAR ist, dass sie die Magenschleimhaut angreifen, was zu Magen- und Darmerkrankungen, im schlimmsten Fall zu Magen- und Darmblutungen führen kann. NSAIDs have an anti-inflammatory and analgesic effect because they inhibit the function of all prostaglandins. A typical side effect of NSAIDs is that they cause the Gastric mucosa attack, which can lead to stomach and intestinal diseases, in the worst case to gastric and intestinal bleeding.
Ein Einfluss auf diese Prostaglandine wird auch anderen Substanzen zugeschrieben. So werden gemäss der EP 0506325 Oligomere oder Polymere von L-Guluronsäure und deren Epimer D-Mannuronsäure beschrieben, um die Produktion von Cytokinen wie Interleukinen IL-1 , IL-6 und TNF zu hemmen. An influence on these prostaglandins is also attributed to other substances. Thus, EP 0506325 describes oligomers or polymers of L-guluronic acid and their epimer D-mannuronic acid in order to inhibit the production of cytokines such as interleukins IL-1, IL-6 and TNF.
IL-1 ist dafür bekannt, dass es die Produktion von Prostaglandinen hemmt. Die verwendeten Polysaccharide wurden dafür aus der Algen Laminaria digitata (Copolymere "G-blocks", die mehr als 90% L-Guluronsäure enthalten), aus den Zellen von Ascophyllum nodosum Fruchtkörpern (Copolymere "M-blocks", die mehr als 95% D-Mannuronsäure enthalten) bzw. aus Kulturen von Pseudomonas aeruginosa (Polymannuronsäure) isoliert. IL-1 is known to inhibit the production of prostaglandins. The polysaccharides used were from the algae Laminaria digitata (copolymers "G-blocks" containing more than 90% L-guluronic acid), from the cells of Ascophyllum nodosum fruiting bodies (copolymers "M-blocks", more than 95% D -Mannannonic acid) or from cultures of Pseudomonas aeruginosa (polymannuronic acid).
Das Block-Copolymer Alginsäure, das aus wechselnden Anteilen von Mannuronsäure und Guluronsäure besteht, wird schon seit langem aufgrund der gelierenden Eigenschaften in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie eingesetzt. Seine Herstellung sowie die der Herstellung der einzelnen Monomere ist im Stand der Technik bekannt. The block copolymer alginic acid, which consists of varying proportions of mannuronic acid and guluronic acid, has long been used in the food and pharmaceutical industries because of its gelling properties. Its preparation and the preparation of the individual monomers is known in the art.
Zur medizinischen Verwendung von Alginaten wird in der WO 01/661 19 eine weitere Anwendung zur Behandlung von Schleimhautentzüngungen im Magen beschrieben. For the medical use of alginates, WO 01/661 19 describes a further application for the treatment of mucous membrane inflammations in the stomach.
Guan (Chem. Abstracts 1991 , 1 14:69045) beschreibt die Verwendung von Propylmannuronatnatriumsulfat als antithrombotisches, hypolipämisches, oder zur Behandlung von ischämischen kardiovaskulären Erkrankungen geeignetes Mittel. Guan (Chem. Abstracts 1991, 1 14: 69045) describes the use of propylmannuronate sodium sulphate as an antithrombotic, hypolipidemic or as an agent suitable for the treatment of ischemic cardiovascular diseases.
US 5,952,308 beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die unter anderem ein Mannuronsäuremonomer als Komplexierungsagens für ein Mineral enthalten kann, um die Aufnahme dieser Mineralien zu fördern. US 5,952,308 describes a pharmaceutical composition which may include, inter alia, a mannuronic acid monomer as a complexing agent for a mineral to promote uptake of these minerals.
Die WO 01/56404 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Polymannuronaten aus marinen Algen, das gegen Fettleibigkeit und überhöhten Cholesterinspiegel eingesetzt wird. WO 01/56404 describes a process for the preparation of low molecular weight polymannuronates from marine algae, which is used against obesity and excessive cholesterol levels.
In Bezug auf die Monomere der Alginsäure, beschreibt DE 10247073 A die Herstellung und Verwendung von α-L-Guluronsäure als Wirkstoff in der Behandlung von vielfältigen Erkrankungen, wie rheumatischen Erkrankungen und Nierenerkrankungen. Nichtsdestotrotz zeigen diese Untersuchungen keine optimierten Applikationen von a-L-Guluronsäure, z.B. bezüglich der zu verabreichenden Dosis. With respect to the monomers of alginic acid, DE 10247073 A describes the preparation and use of α-L-guluronic acid as an active ingredient in the treatment of diverse Diseases such as rheumatic diseases and kidney diseases. Nevertheless, these studies do not show optimized applications of αL-guluronic acid, eg with respect to the dose to be administered.
Es besteht daher ein Bedarf an verbesserten Verfahren zur Verabreichung und pharmazeutischen Verwendung von a-L-Guluronsäure. There is therefore a need for improved methods of administration and pharmaceutical use of α-L-guluronic acid.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung lösen diesen Bedarf durch ihre überraschende Entdeckung, dass niedrig dosierte α-L-Guluronsäure bei der Behandlung von Störungen des Immunsystems, Entzündungskrankheiten, Nierenerkrankungen, Allergien und neurodegenerativen Krankheiten vergleichbare und/oder verbesserte Effekte erzielt als eine höhere Dosis. Hierbei wurde festgestellt, dass eine Dosis von weniger als 50 mg/kg/d a-L- Guluronsäure ausreichend ist um diese verbesserten Wirkeigenschaften von a-L- Guluronsäure in Patienten hervorzurufen. The inventors of the present application solve this need by their surprising discovery that low-dose α-L-guluronic acid achieves comparable and / or improved effects as a higher dose in the treatment of immune system disorders, inflammatory diseases, kidney diseases, allergies and neurodegenerative diseases. It has been found that a dose of less than 50 mg / kg / d a-L-guluronic acid is sufficient to elicit this improved action of a-L-guluronic acid in patients.
Beschreibung der Abbildungen Description of the pictures
Abbildung 1 zeigt den Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf den klinischen Score von experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE). In der Vorsorge-Gruppe wurde weiblichen C57BL/6-Mäusen (n=6) intraperitoneal (IP) von Tag 0 bis Tag 20 nach Immunisierung 40 mg/kg/d α-L-Guluronsäure verabreicht. Den Mäusen in den Behandlungsgruppen A und B wurde α-L-Guluronsäure intraperitoneal mit 40 und 80 mg/kg/d verabreicht und zwar von Tag 7 bis Tag 20 nach Immunisierung. Der Grad der Krankheit wurde durch ein visuelles kumulatives Scoringsystem bewertet. Kumulative Noten von Tag 10 bis Tag 21 werden als Mittelwert+SEM angegeben. *P<0,05 ist an jedem Datenpunkt durch Mann-Whitney-U-Test durch Vergleich von Vorsorgegruppe und Behandlungsgruppen gegen die Kontrollgruppe angegeben. Figure 1 shows the effect of α-L-guluronic acid (G2013) on the clinical score of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). In the screening group, female C57BL / 6 mice (n = 6) were intraperitoneally administered (IP) from day 0 to day 20 after immunization with 40 mg / kg / d α-L-guluronic acid. The mice in treatment groups A and B were administered intraperitoneally with α-L-guluronic acid at 40 and 80 mg / kg / d from day 7 to day 20 post-immunization. The degree of the disease was assessed by a visual cumulative scoring system. Cumulative scores from day 10 to day 21 are reported as the mean + SEM. * P <0.05 is indicated at each data point by Mann-Whitney U test by comparing precautionary group and treatment groups against the control group.
Abbildung 2 zeigt repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von histologischen Proben des Zentralennervensystems. (A) Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H&E Färbung) von Gehirnen zeigt, dass G2013 Therapie das Fortschreiten von Entzündungen signifikant durch begrenzen von Leukozyten-Infiltration unterdrücken kann. (B) Luxol-fast-blue-Färbung (LFB- Färbung) zeigt weniger Demyelination-Stellen in G2013 behandelten Mäusen im Vergleich zur Kontrollgruppe. N :normal; C: Kontrollgruppe; P: Vorsorgegruppe; TA: Behandlungsgruppe A; TB: Behandlungsgruppe B. Abbildung 3 zeigt eine Tabelle mit Vergleichswerten zu Entzündungskriterien, die aus histologischen Proben des Zentralennervensystems aus EAE Mäusen erhalten wurden. Figure 2 shows representative light micrographs of histological samples of the central nervous system. (A) Hematoxylin-eosin staining (H & E staining) of brains shows that G2013 therapy can significantly suppress the progression of inflammation by limiting leukocyte infiltration. (B) Luxol fast blue staining (LFB staining) shows fewer demyelination sites in G2013 treated mice compared to the control group. N: normal; C: control group; P: prevention group; TA: treatment group A; TB: Treatment Group B. Figure 3 shows a table of comparative values of inflammatory criteria obtained from histological samples of the central nervous system from EAE mice.
Abbildung 4 zeigt den Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf den klinischen Score von Kollagen-induzierter Arthritis (CIA) in therapeutischen Gruppen. Figure 4 shows the effect of α-L-guluronic acid (G2013) on the clinical score of collagen-induced arthritis (CIA) in therapeutic groups.
Abbildung 5 zeigt den Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf die Expression von miR-155 in HEK-293hTLR4 Zellen. Figure 5 shows the effect of α-L-guluronic acid (G2013) on the expression of miR-155 in HEK-293hTLR4 cells.
Abbildung 6 zeigt den Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf die Expression von SHIP-1 in HEK-293hTLR4 Zellen. Figure 6 shows the effect of α-L-guluronic acid (G2013) on the expression of SHIP-1 in HEK-293hTLR4 cells.
Abbildung 7 zeigt den Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf die Expression von SOCS-1 in HEK-293hTLR4 Zellen. Figure 7 shows the effect of α-L-guluronic acid (G2013) on the expression of SOCS-1 in HEK-293hTLR4 cells.
Detaillierte Beschreibung Detailed description
In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Uronsäure-Monomer zur Verwendung in der Behandlung von Störungen des Immunsystems, Entzündungskrankheiten, Nierenerkrankungen, Allergien und neurodegenerativen Krankheiten, wobei das Uronsäure-Monomer a-L-Guluronsäure, ein Derivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist und das Uronsäure-Monomer in einer Dosis von weniger als 50mg/kg/d verabreicht wird.  In a first aspect, the present invention is directed to a uronic acid monomer for use in the treatment of immune system disorders, inflammatory diseases, kidney diseases, allergies and neurodegenerative diseases, wherein the uronic acid monomer is α-gluluronic acid, a derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof and the uronic acid monomer is administered at a dose of less than 50 mg / kg / d.
Der Ausdruck„Uronsäure-Monomer", im Sinne der vorliegenden Erfindung, richtet sich auf Carbonsäuren, die formal durch Oxidation der primären Hydroxygruppe von Monosacchariden (-CH2-OH) zur Carboxygruppe (-COOH) entstanden sind. Sie gehören zu den Zuckersäuren. Ein solches Uronsäure-Monomer ist α-L-Guluronsäure. a-L-Guluronsäure ist eine Verbindung gemäß Formel (I): The term "uronic acid monomer", for the purposes of the present invention, is based on carboxylic acids which have formally been formed by oxidation of the primary hydroxyl group of monosaccharides (-CH 2 -OH) to the carboxy group (-COOH) They belong to the sugar acids. Such a uronic acid monomer is α-L-guluronic acid. Α-Guluronic acid is a compound according to formula (I):
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Formel (I)  Formula (I)
-L-Guluronsäure  -L-guluronic
(GulUA) Die zu verabreichende Dosis ist weniger als 50 mg Uronsäure-Monomers (z.B. a-L- Guluronsäure) pro Kilogramm Körpergewicht eines gegebenen Patienten pro Tag (50 mg/kg/d). In bevorzugten Ausführungsformen ist die Dosis weniger als 49 mg/kg/d, 48 mg/kg/d, 47 mg/kg/d, 46 mg/kg/d, 45 mg/kg/d, 44 mg/kg/d, 43 mg/kg/d, 42 mg/kg/d, 41 mg/kg/d, 40 mg/kg/d, 35 mg/kg/d, 30 mg/kg/d, 25 mg/kg/d, 20 mg/kg/d, 15 mg/kg/d oder 10 mg/kg/d. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die Dosis 0,1 -49,9 mg/kg/d, 1 -49,8 mg/kg/d, 3-48,5 mg/kg/d, 5-47 mg/kg/d, 8-45 mg/kg/d, 10-42,5 mg/kg/d oder 15-39.9 mg/kg/d. (Gulua) The dose to be administered is less than 50 mg of uronic acid monomer (eg, αL-guluronic acid) per kilogram of body weight of a given patient per day (50 mg / kg / d). In preferred embodiments, the dose is less than 49 mg / kg / d, 48 mg / kg / d, 47 mg / kg / d, 46 mg / kg / d, 45 mg / kg / d, 44 mg / kg / d, 43 mg / kg / d, 42 mg / kg / d, 41 mg / kg / d, 40 mg / kg / d, 35 mg / kg / d, 30 mg / kg / d, 25 mg / kg / d, 20 mg / kg / d, 15 mg / kg / d or 10 mg / kg / d. In other preferred embodiments, the dose is 0.1-49.9 mg / kg / d, 1 -49.8 mg / kg / d, 3-48.5 mg / kg / d, 5-47 mg / kg / d , 8-45 mg / kg / d, 10-42.5 mg / kg / d or 15-39.9 mg / kg / d.
Ein Patient, im Sinne der vorliegenden Erfindung, kann ein Säugetier, wie beispielsweise ein Nagetier, ein Carnivore, ein Paarhufer, ein Unpaarhufer oder ein Primat sein. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Patient ein Mensch. A patient according to the present invention may be a mammal, such as a rodent, a carnivore, a cloven-hoofed dog, an odd-toed ungulate, or a primate. In particularly preferred embodiments, the patient is a human.
Bevorzugte pharmazeutisch annehmbare Salze der a-L-Guluronsäure sind Natrium-a-L- Guluronsäure, Kalium-a-L-Guluronsäure, Magnesium-a-L-Guluronsäure, Calcium-a-L- Guluronsäure oder eine Kombination davon. Preferred pharmaceutically acceptable salts of α-L-guluronic acid are sodium α-L-guluronic acid, potassium α-L-guluronic acid, magnesium α-L-guluronic acid, calcium α-L-guluronic acid or a combination thereof.
Der Ausdruck„Derivat", wie hierin in Bezug auf Uronsäure-Monomer (z.B. a-L-Guluronsäure) verwendet, bezeichnet eine chemische Substanz oder Verbindung, die sich direkt oder durch Modifikation oder durch partielle Substitution von α-L-Guluronsäure abgeleitet. Bezüglich der Anzahl an Substituenten kann es sich um höchstens 4, höchstens 3, höchstens 2 oder einen Substituenten handeln. The term "derivative" as used herein in reference to uronic acid monomer (eg, αL-guluronic acid) refers to a chemical substance or compound derived directly or by modification or partial substitution of α-L-guluronic acid substituents may be at most 4, at most 3, at most 2 or a substituent.
Entzündungskrankheiten, im Sinne der Anmeldung, umfassen Autoimmunkrankheiten, akute und chronische Entzündungen und Osteoarthritis. Inflammatory diseases as referred to in the application include autoimmune diseases, acute and chronic inflammations and osteoarthritis.
Autoimmunkrankheiten, im Sinne der Anmeldung, umfassen rheumatische Arthritis, juvenile Arthritis, systemisches Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom, progressive systemische Sklerodermie (PSS), Polymyositis-Dermatomyositis, Morbus Behget, Spondylitis ankylosans, Psoriasisarthritis, Reiter-Syndrom und rezidivierende Polychondritis. Autoimmune diseases as defined in the application include rheumatoid arthritis, juvenile arthritis, systemic lupus erythematosus, Sjogren's syndrome, progressive systemic scleroderma (PSS), polymyositis dermatomyositis, Behget's disease, ankylosing spondylitis, psoriatic arthritis, Reiter's syndrome, and recurrent polychondritis.
Nierenerkrankungen, im Sinne der Anmeldung, umfassen Glomerulonephritis und Glomerulosclerosis. Störungen des Immunsystems, im Sinne der Anmeldung, umfassen Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen, allergisches Kontaktekzem und Hypersensivität Typ l-IV. Kidney diseases as referred to in the application include glomerulonephritis and glomerulosclerosis. Disorders of the immune system, in the sense of the application, include rejection reactions in transplants, allergic contact dermatitis and type I-IV hypersensitivity.
Neurodegenerativen Krankheiten, im Sinne der Anmeldung, umfassen Multiple Sklerose (MS) und Alzheimer-Krankheit. Neurodegenerative diseases, as defined in the application, include multiple sclerosis (MS) and Alzheimer's disease.
In bevorzugten Ausführungsformen wird das erfindungsgemäße Uronsäure-Monomer zur Verwendung mit Substanzen, die hepatotoxische Nebenwirkungen aufweisen, in einer Kombinationstherapie eingesetzt. Der Ausdruck „hepatotoxische Nebenwirkungen" bezeichnet die Eigenschaft chemischer Stoffe, die für die Hepatozyten (Leberepithelzellen) giftig sind. Diese Stoffe werden als hepatotoxische Substanzen (Lebertoxische Substanzen, Hepatotoxine, Lebertoxine oder Lebergifte) bezeichnet. Hepatotoxische Substanzen können Schädigungen der Leberepithelzelle bis zur Nekrose oder Leberdystrophie verursachen. In preferred embodiments, the uronic acid monomer of the present invention is used in combination therapy for use with substances having hepatotoxic side effects. The term "hepatotoxic side effects" refers to the properties of chemicals that are toxic to hepatocytes (hepatic epithelial cells), which are known as hepatotoxic substances (hepatotoxic substances, hepatotoxins, liver toxins or liver toxins) and hepatotoxic substances that can damage liver hepatitis to necrosis or liver toxicity Cause liver dystrophy.
In weiter bevorzugten Ausführungsformen wird das Uronsäure-Monomer intraperitoneal, oral, bukkal, rektal, intramuskulär, topisch, subkutan, inhalativ, intraartikulär oder intravenös verabreicht. In further preferred embodiments, the uronic acid monomer is administered intraperitoneally, orally, buccally, rectally, intramuscularly, topically, subcutaneously, by inhalation, intraarticularly or intravenously.
In ferner weiteren bevorzugten Ausführungsformen liegt das Uronsäure-Monomer als Salbe, Creme, Gel, Paste, Emulsion, Tablette, Zäpfen, Puder, Pulver, Granulat, Pastille, Patch, Pflaster, Lösung, Schaum, Lotion, Öl, Shampoo, Aerosol oder Spray vor. In further further preferred embodiments, the uronic acid monomer is as ointment, cream, gel, paste, emulsion, tablet, Zäpfen, powder, powder, granules, lozenge, patch, patch, solution, foam, lotion, oil, shampoo, aerosol or spray in front.
Der gesamte Wirkstoffgehalt der oben genannten erfindungsgemäßen (Arznei)Mittel liegt vorzugsweise im Bereich von 0,05 bis 90 Gew.-%, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,5 bis 20 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht des (Arznei)Mittels. Der Wirkstoffanteil wird auf die dem Fachmann bekannte Weise in Abhängigkeit von der jeweils gewählten Darreichungsform, des/der jeweils ausgewählten Wirkstoffe, und der für den jeweiligen therapeutischen Zweck geeigneten Dosis festgelegt. Die therapeutisch geeigneten Dosierungen der einzelnen Wirkstoffe sind dem Fachmann bekannt. The total active ingredient content of the abovementioned (drug) compositions according to the invention is preferably in the range from 0.05 to 90% by weight, preferably in the range from 0.1 to 50% by weight, particularly preferably 0.5 to 20% by weight. %, in each case based on the total weight of the (drug) agent. The proportion of active substance is determined in the manner known to the person skilled in the art, depending on the respectively selected dosage form, of the selected active ingredient (s), and the dose suitable for the respective therapeutic purpose. The therapeutically suitable dosages of the individual active ingredients are known to the person skilled in the art.
Die genannten (Arznei)Mittel können im Stand der Technik bekannte zusätzliche Inhaltsstoffe, wie Hilfsstoffe (Trägerstoffe, Hautschutzmittel, Desinfektionsmittel, Tenside usw.) enthalten. Als Hilfsstoffe kommen beispielsweise folgende in Betracht: partikuläre Trägerstoffe (z.B. Talk, Zinkoxid, Stärke, Stärkederivate, Kieselgur); gelbildende Substanzen (z.B. Gelatine, Tragant, Cellulosederivate, Alginate, Polyacrylsäure); Befeuchtungsmittel (z.B. Harnstoff, Glycerin, Propylenglykol), haftklebende Polymere (z.B. Polyacrylate, sowie Klebharze); Salbengrundlagen (z.B. Vaselin, Fette, Cellulosederivate, Polyacrylsäure, Polyethylenglykole); Emulgatoren (z.B. Wollwachs, Sorbitanester, Monoglyceride); Konservierungsmittel (z.B. Benzalkoniumchlorid), Antioxidantien (z.B. Butylhydroxyanisol), Verdickungsmittel (z.B. Hydroxypropylmethylcellulose), pH-Wert-Korrigenzien; Bindemittel (z.B. Polyvinylpyrrolidon, Stärke, Hydroxypropylmethylcellulose, Polyethylenglykole), Füllstoffe (z.B. mikrokristalline Cellulose, Sorbitol), Farbstoffe, Aromastoffe, Süßstoffe (z.B. Sorbitol, Aspartam); Lösemittel (z.B. Wasser, Ethanol, Ethanol-Wasser-Gemische); Lösungsvermittler (z.B. Glycerol, Propylenglykol); Haut-Penetrationsverbesserer (z.B. Propylenglykol); Weichmacher (z.B. Sorbitol, Glycerin, Phthalsäureester); Netzmittel (z.B. Natriumlaurylsulfat, Polysorbate); synthetische und natürliche Öle (z.B. mittelkettige Triglyceride); Treibmittel für Aerosol oder Schaum-Sprays (z.B. Norfluran, Cryofluran, Dichlorfluormethan, Trichlorfluormethan, Propan, Butan, Isobutan, Stickstoff). Said (drug) agents may contain known in the art additional ingredients such as excipients (carriers, skin protectants, disinfectants, surfactants, etc.). Suitable adjuvants are, for example, the following: particulate carriers (eg talc, zinc oxide, starch, starch derivatives, diatomaceous earth); gel-forming substances (eg gelatin, tragacanth, cellulose derivatives, alginates, polyacrylic acid); Humectants (eg urea, glycerol, propylene glycol), pressure-sensitive adhesive polymers (eg polyacrylates, as well as adhesive resins); Ointment bases (eg vaseline, fats, cellulose derivatives, polyacrylic acid, polyethylene glycols); Emulsifiers (eg wool wax, sorbitan esters, monoglycerides); Preservatives (eg benzalkonium chloride), antioxidants (eg butylhydroxyanisole), thickeners (eg hydroxypropylmethylcellulose), pH corrigents; Binders (for example polyvinylpyrrolidone, starch, hydroxypropylmethylcellulose, polyethylene glycols), fillers (eg microcrystalline cellulose, sorbitol), dyes, flavorings, sweeteners (eg sorbitol, aspartame); Solvents (eg water, ethanol, ethanol-water mixtures); Solubilizers (eg glycerol, propylene glycol); Skin penetration enhancers (eg, propylene glycol); Plasticizers (eg sorbitol, glycerol, phthalic acid esters); Wetting agents (eg, sodium lauryl sulfate, polysorbates); synthetic and natural oils (eg medium chain triglycerides); Propellants for aerosol or foam sprays (eg norflurane, cryoflurane, dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, propane, butane, isobutane, nitrogen).
Die Verwendung von erfindungsgemäßen Uronsäure-Monomeren kann zusammen mit anderen, vorzugsweise chemisch reinen, Arzneistoffen und/oder pflanzlichen Arzneimitteln erfolgen, bzw. die erfindungsgemäße pharmazeutische Zubereitung kann solche anderen, vorzugsweise chemisch reine, Arzneistoffe oder Arzneimittel enthalten. The use of uronic acid monomers according to the invention can be carried out together with other, preferably chemically pure, drugs and / or herbal medicines, or the pharmaceutical preparation of the invention may contain such other, preferably chemically pure, drugs or drugs.
Beispiele: Examples:
Beispiel 1 : Induktion von Multipler Sklerose (MS) und therapeutische Behandlung  Example 1 Induction of Multiple Sclerosis (MS) and Therapeutic Treatment
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist das meist genutzte experimentelle Modell zur Untersuchung von Multipler Sklerose (MS). Diese wurde in C57BL/6-Mäusen induziert, indem sie mit einem Hooke-Kit immunisiert wurden. Zu diesem Zweck wurden dreißig weibliche C57BL/6-Mäuse (10 Wochen alt), mit einem Gewicht von 18-20 g, vom Experimental Animal Center des Pasteur Institut des Iran erworben. Die Mäuse wurden mit Zugang zu Nahrung (Pellets) und Wasser nach Richtlinien des Instituts gehalten. Die Mäuse wurden per Zufallsprinzip in fünf Gruppen (je 6 Mäuse) wie folgt aufgeteilt: I: normale Gruppe (PBS behandelt); II: Kontrollgruppe (MOG35-55-induzierte EAE und PBS behandelt); III: Vorsorgegruppe (MOG35-55-induzierte EAE und 40 mg/kg/d G2013 behandelt von Tag 0-20); IV: Behandlungsgruppe A (MOG35-55-induzierte EAE und 40 mg/kg/d G2013 behandelt von Tag 7-20) und V: Behandlungsgruppe B (MOG35-55-induzierte EAE und 80 mg/kg/d G2013 behandelt von Tag 7-20). Die EAE wurde durch das Hooke-Kit (Hooke Laboratories, Inc., USA) induziert, um im Tiermodell die induzierte Pathogenese und Behandlung von MS zu untersuchen. Das Kit besteht aus zwei Komponenten; Antigen (MOG35-55) in einer Emulsion mit komplettem Freund'schem Adjuvans (CFA) in zwei vorgefüllten Spritzen und ein Fläschchen mit lyophilisiertem Pertussis Toxin (PTX). Das gefriergetrocknete PTX wurde in PBS am Tag 0 gelöst. Den Mäusen wurde jeweils eine Emulsion von 0,1 ml subkutan am oberen und unteren Rücken injiziert. Etwa 2 Stunden nach der Injektion der Emulsion wurde die erste Dosis von PTX (0,1 ml/Maus) intraperitoneal (IP) injiziert. Dies wurde 24 Stunden später als zweite Dosis von PTX (0,1 ml/Maus) wiederholt. Die a-L-Guluronsäure (G2013) (hergestellt in der Pathobiologie Abteilung des TUMS) wurde der Vorsorgegruppe von Tag 0 bis zum Tag 20 nach der Immunisierung in der spezifischen Dosis 40 mg/kg/d IP verabreicht. Den Mäusen der Behandlungsgruppen A und B wurde 40 und 80 mg/kg/d G2013 von Tag 7 nach der Immunisierung bis zum Tag 20 IP verabreicht. Die Mäuse der normalen und Kontrollgruppe erhielten PBS (0,1 ml jeder Maus, täglich). IP- Injektion in die Mäuse aller Gruppen wurde an sechs aufeinanderfolgenden Tagen pro Woche durchgeführt. Die Mäuse wurden täglich überwacht und nach klinischen Scores beurteilt. Klinische Score von EAE Mäusen wurde wie folgt definiert: 0: keine klinischen Zeichen; 1 : schlaffer Schwanz; 2: schlaffer Schwanz und Schwäche der Hinterbeine; 3: schlaffer Schwanz und komplette Lähmung der Hinterbeine (am häufigsten) oder schlaffer Schwanz mit Lähmung eines vorderen und eines hinteren Beins; 4: schlaffer Schwanz, komplette Hinterbein- und teilweise Vorderbeinlähmung; 5: Maus rollt sich spontan im Käfig oder wurde wegen Lähmung tot aufgefunden. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most widely used experimental model for the study of multiple sclerosis (MS). This was induced in C57BL / 6 mice by immunization with a Hooke kit. To this end, thirty female C57BL / 6 mice (10 weeks old), weighing 18-20 g, were purchased from the Experimental Animal Center of the Pasteur Institute of Iran. The mice were kept with access to food (pellets) and water according to the Institute's guidelines. The mice were randomly divided into five groups (6 mice each) as follows: I: normal group (PBS treated); II: control group (MOG 35 -55-induced EAE and PBS treated); III: Prevention group (MOG 3 5-55-induced EAE and 40 mg / kg / d G2013 treated from day 0-20); IV: Treatment group A (MOG 35 -55-induced EAE and 40 mg / kg / d G2013 treated by day 7-20) and V: treatment group B (MOG 35 -55-induced EAE and 80 mg / kg / d G2013 treated by Day 7-20). The EAE was tested by the Hooke kit (Hooke Laboratories, Inc., USA) to study the induced pathogenesis and treatment of MS in the animal model. The kit consists of two components; Antigen (MOG35-55) in an emulsion with complete Freund's adjuvant (CFA) in two pre-filled syringes and a vial of lyophilized pertussis toxin (PTX). The freeze-dried PTX was dissolved in PBS on day 0. The mice were each injected with an emulsion of 0.1 ml subcutaneously on the upper and lower back. About 2 hours after injection of the emulsion, the first dose of PTX (0.1 ml / mouse) was injected intraperitoneally (IP). This was repeated 24 hours later as a second dose of PTX (0.1 ml / mouse). The αL-guluronic acid (G2013) (manufactured in the Pathobiology Department of the TUMS) was administered to the precaution group from day 0 to day 20 after immunization in the specific dose of 40 mg / kg / d IP. The mice of treatment groups A and B were given 40 and 80 mg / kg / d G2013 from day 7 post-immunization until day 20 IP. The mice of the normal and control groups received PBS (0.1 ml of each mouse, daily). IP injection into the mice of all groups was done on six consecutive days per week. Mice were monitored daily and scored for clinical scores. Clinical score of EAE mice was defined as follows: 0: no clinical signs; 1: flabby tail; 2: flaccid tail and weakness of the hind legs; 3: flaccid tail and complete hindleg paralysis (most common) or flaccid tail with paralysis of anterior and posterior leg; 4: flaccid tail, complete hind leg and partially frontal paralysis; 5: Mouse rolls spontaneously in the cage or was found dead because of paralysis.
Für die histopathologische Analyse wurden am Tag 21 nach der Immunisierung alle Mäuse anästhesiert und Blutproben aus ihren Herzen entnommen. Zur histopathologischen Beurteilung wurden die Mäuse nach ihrer Betäubung getötet und Gehirne und Kleinhirne entfernt, um diese anschließend in neutralem 10%igen Formalin zu fixieren, sowie in Paraffin einzubetten, zu schneiden (8 μηη Dicke) und mit Hämatoxilin-Eosin (H&E) zu färben um die Entzündungskriterien in meningealem und parenchymalem Gewebe zu beurteilen und mit Luxol-fast-blue (LFB) zu färben, um Demyelinisierung zu unterscheiden. Alle gefärbten Proben wurden auf einem Objektträger blind durch einen Sachverständigen Pathologen analysiert. For histopathological analysis, on day 21 after immunization, all mice were anesthetized and blood samples taken from their hearts. For histopathological assessment, the mice were killed after their anesthesia and brains and cerebellum removed to fix them then in neutral 10% formalin, as well as paraffin embedded, cut (8 μηη thickness) and stained with hematoxylin-eosin (H & E) to assess the inflammatory criteria in meningeal and parenchymal tissue and to stain with Luxol-fast-blue (LFB) to differentiate demyelination. All stained samples were analyzed blindly on a slide by an expert pathologist.
Zur Nitrit-Beurteilung wurde N02 in den Serumproben durch das Griess-Verfahren, das auf der Beurteilung des N02 Endprodukts basiert, untersucht. Das Griess-Verfahren nutzt eine kolorimetrische Reaktion für die Messung von N02 (Nitrit) in einer wässrigen Lösung. Griess- Reagenz wurde durch Lösung von 1 g Sulfanilamid in 100 ml Phosphorsäure 5% gemischt mit 0,1 g Naphtylethylendiamine-HCI (NED) in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Serumprobe (50 μΙ) wurde mit 50 μΙ Griess-Reagenz für 10 min bei Raumtemperatur gemischt. Die Absorption wurde an einem ELISA-Reader Instrument bei 540 nm gemessen. Die Konzentration von Nitrit wurde bestimmt durch eine Standardkurve von 0,1 M Natriumnitrit in destilliertem Wasser. For nitrite evaluation, N0 2 in the serum samples was examined by the Griess method based on the assessment of the N0 2 final product. The Griess method uses a colorimetric reaction for the measurement of N0 2 (nitrite) in an aqueous solution. Gries's reagent was mixed by dissolving 1 g of sulfanilamide in 100 ml of 5% phosphoric acid prepared with 0.1 g of naphthylethylenediamine HCl (NED) in 100 ml of distilled water. The serum sample (50 μΙ) was mixed with 50 μΙ Griess reagent for 10 min at room temperature. The absorbance was measured on an ELISA reader instrument at 540 nm. The concentration of nitrite was determined by a standard curve of 0.1 M sodium nitrite in distilled water.
Die Ergebnisse in Verbindung mit klinischen Befunden zeigen, dass sich der klinische Verlauf und der Grad der Erkrankung zwischen der Vorsorgegruppe, den Behandlungsgruppen und der Kontrollgruppe unterscheiden. Der mittlere Score-Wert der Krankheit war in den Kontrollmäusen höher als in der Vorsorge- und den Behandlungsgruppen (Abbildung 1 ). Auch war die EAE-Inzidenz geringer und der Beginn der EAE war in der Vorsorgegruppe und den Behandlungsgruppen im Vergleich zu den Kontrollmäusen verzögert. Diese Effekte führten zu einer signifikanten klinischen Verbesserung und einer verzögerten Progression der Erkrankung während der 21 Tage der Beobachtung, was anzeigt, dass a-L-Guluronat (G2013) die Progression von EAE inhibiert. The results in conjunction with clinical findings indicate that the clinical course and the degree of the disease differ between the prevention group, the treatment groups and the control group. The mean scores of the disease were higher in the control mice than in the preventive and treatment groups (Figure 1). Also, the EAE incidence was lower and the onset of EAE was delayed in the screening group and treatment groups compared to the control mice. These effects resulted in significant clinical improvement and delayed disease progression during the 21 days of observation, indicating that α-L-guluronate (G2013) inhibits the progression of EAE.
Die repräsentativen Bilder der H&E- und der LFB-gefärbten Gewebeschnitte aus allen Gruppen zeigen, dass EAE-Mäuse, die G2013 erhalten haben, signifikant verringerte Entzündungskriterien und Demyelinisierung aufweisen verglichen mit Kontrollmäusen (Abbildung 2). Die Ergebnisse in Abbildung 3 veranschaulichen, dass der Grad der Entzündung, die in den histopathologischen Studien des Zentralennervensystems (CNS) beobachtet wurde, mit dem klinischen Grad von EAE korreliert. Representative images of H & E and LFB stained tissue sections from all groups show that EAE mice receiving G2013 have significantly reduced inflammatory criteria and demyelination compared to control mice (Figure 2). The results in Figure 3 illustrate that the degree of inflammation observed in histopathological studies of the central nervous system (CNS) correlates with the clinical grade of EAE.
Die NO-Produktion wurde signifikant in der Vorsorgegruppe (10,61 ± 1 ,80 μΜ/dL, p>0,05) und Behandlungsgruppe B (10.71 ± 1.47μΜ/άΙ_, p>0,05) verringert im Verglich mit den Kontrollmäusen (13,00 ± 1 ,00 μΜ/dL), jedoch die NO-Produktion in der Behandlungsgruppe A nicht signifikant reduziert (1 1.16 ± 2.15μΜ / dl, p>0,05). In der normalen Gruppe war die NO-Produktion 5,85 ± 0.53μΜ. Daher bewirkt G2013 eine Verringerung der NO- Konzentration in Serum und dies war in Übereinstimmung mit den klinischen Befunden. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die a-L-Guluronsäure (G2013) Therapie das Fortschreiten der Krankheit in einem Versuchsmodell von MS verringern kann. NO production was significantly reduced in the precautionary group (10.61 ± 1, 80 μΜ / dL, p> 0.05) and treatment group B (10.71 ± 1.47μΜ / άΙ_, p> 0.05) compared to the control mice (13.00 ± 1.00 μΜ / dL), but did not significantly reduce NO production in treatment group A (1 1.16 ± 2.15μΜ / dl, p> 0.05). In the normal group, NO production was 5.85 ± 0.53μΜ. Therefore, G2013 causes a decrease in NO concentration in serum and this was consistent with the clinical findings. In summary, these data indicate that a-L-guluronic acid (G2013) therapy can reduce the progression of the disease in an experimental model of MS.
Beispiel 2: Therapeutischer Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) in einem experimentellen Model von rheumatoider Arthritis Example 2: Therapeutic effect of α-L-guluronic acid (G2013) in an experimental model of rheumatoid arthritis
Die Kollagen-induzierte Arthritis (CIA) als experimentelles Modell der rheumatoiden Arthritis wurde in DBA/1 J Mäusen induziert und die therapeutische Wirksamkeit von a-L- Guluronsäure (G2013) wurde in diesen Tieren in Radboudumc, Experimentelle Rheumatologie Abteilung von Radboudumc, Niederlande getestet. Männliche DBA/1 J Mäuse wurden erhalten von Janvier-Elevage (Le Genest St. Isle, Frankreich). Alle Mäuse wurden in Filter-Top-Käfigen unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Standardnahrung und Wasser wurden ihnen ad libitum zur Verfügung gestellt. Die verwendeten Mäuse waren zwischen 10 und 14 Wochen alt. Alle Tierverfahren wurden von der institutionellen Ethikkommission in Radboudumc, Nijmegen, genehmigt. Freund- Adjuvans (FCA) und Mycobacterium tuberculosis (Stamm H37Ra) wurden von Difco, Detroit, MI erhalten. Rindercollagen vom Typ II (CM) wurde von den Erfindern hergestellt, wie beschrieben von Joosten (Joosten LAB, et al, 1996). Um CIA zu induzieren wurde Rinderkollagen Typ II (CM) in 0,05 M Essigsäure in einer Konzentration von 2 mg/ml verdünnt und in gleichen Volumina mit Freund'schem Komplett-Adjuvans (FCA) emulgiert (2 mg/ml M. tuberculosis). Die DBA/1 J Mäuse wurden intradermal an der Basis des Schwanzes mit 100 μg CM immunisiert. An Tag 21 erhielten die Mäuse eine intraperitoneale (i.p.) Booster- Injektion von 100 μg CM, das in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gelöst war. Der Beginn der Arthritis trat in der Regel ein paar Tage vor oder nach der Booster-Injektion auf. Die Mäuse wurden sorgfältig drei Mal pro Woche visuell nach Erscheinungen von Arthritis in den peripheralen Gelenken untersucht und Bewertungen für die Krankheitsaktivität wurden wie zuvor beschrieben vergeben (van den Berg WB, et al, 1994). Der klinische Grad der Arthritis (Arthritis-Score) wurde auf einer Skala von 0-2 für jede Pfote benotet, entsprechend den Veränderungen in Rötung und Schwellung in den Zehen oder in anderen Teilen der Pfoten. Die G2013-Behandlung wurde vor dem Auftreten klinischer Symptome der Krankheit begonnen (Tag 21 ) oder während der etablierten Arthritis (makroskopische Arthritis-Scores von 0,25 bis 1 ,25 auf einer Skala von 0-8) und für 14 Tage fortgesetzt. Die Behandlung mit G2013 wurde bei einer Dosis von 25 oder 50 mg/kg/d durch intraperitoneale (i.p.) Injektion verabreicht. Anti-TNF (Enbrel) wurde als positive Kontrolle der Behandlung verwendet und 3 mal pro Woche IP injiziert. Für die Messung der Zytokine wurde die Luminex Multianalyt- Technologie in Kombination mit dem Miliplex Zytokin/Chemokin-Magnetic-Bead-Panel-Kit (Millipore) nach dem Herstellerprotokoll verwendet, um die Mengen von IL-1 , IL-6, IL-10 und KC Zytokinen in behandelten und nicht-behandelten Maus-Seren zu messen. Für die histologische Analyse wurden isolierte Gelenke in 10% Formalin, 5% entkalkter Ameisensäure für 4 Tage fixiert und anschließend entwässert und in Paraffin eingebettet. Standard Frontalschnitte von 7 mm wurden auf SuperFrost-Objektträgern (Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland) montiert. Hämatoxylin und Eosin (H&E)-Färbung und Safranin- O-Färbung wurden durchgeführt, um die Gelenkpathologie zu studieren. Der pathologische Grad in den Gelenken wurde auf einer Skala von 0-3 (0 = keine Pathologie, 3 = maximal Zellularität) wie zuvor beschrieben (Lubberts, Arthritis Rheum 2004) für die folgenden fünf Parameter bewertet: Gelenkentzündung, Proteoglycan (PG) Erschöpfung aus der Knorpelmatrix, Chondrozyten-Tod, Knorpel-Oberflächenerosion und Knochenerosion. Histopathologische Veränderungen wurden auf fünf semiseriellen Abschnitten mit einem Abstand von 140 mm bewertet. Die Bewertung erfolgte blind in durch zwei unabhängige Beobachter. Collagen-induced arthritis (CIA) as an experimental model of rheumatoid arthritis was induced in DBA / 1J mice and the therapeutic efficacy of aL Guluronic acid (G2013) was tested in these animals in Radboudumc, Experimental Rheumatology Department of Radboudumc, The Netherlands. Male DBA / 1J mice were obtained from Janvier-Elevage (Le Genest St. Isle, France). All mice were maintained in filter-top cages under specific pathogen-free conditions. Standard food and water were provided to them ad libitum. The mice used were between 10 and 14 weeks old. All animal procedures were approved by the Institutional Ethics Committee in Radboudumc, Nijmegen. Freund's adjuvant (FCA) and Mycobacterium tuberculosis (strain H37Ra) were obtained from Difco, Detroit, MI. Type II bovine collagen (CM) was prepared by the inventors as described by Joosten (Joosten LAB, et al, 1996). To induce CIA, bovine type II collagen (CM) was diluted in 0.05 M acetic acid at a concentration of 2 mg / ml and emulsified in equal volumes with Freund's Complete Adjuvant (FCA) (2 mg / ml M. tuberculosis). , The DBA / 1J mice were immunized intradermally at the base of the tail with 100 μg CM. On day 21, the mice received an intraperitoneal (ip) booster injection of 100 μg CM dissolved in phosphate buffered saline (PBS). The onset of arthritis usually occurred a few days before or after the booster injection. Mice were examined visually three times per week visually for arthritis manifestations in the peripheral joints, and disease activity ratings were assigned as previously described (van den Berg WB, et al, 1994). The clinical grade of arthritis (arthritis score) was graded on a scale of 0-2 for each paw, consistent with changes in redness and swelling in the toes or in other parts of the paws. G2013 treatment was started before the onset of clinical symptoms of the disease (day 21) or during established arthritis (macroscopic arthritis scores of 0.25 to 1, 25 on a scale of 0-8) and continued for 14 days. Treatment with G2013 was administered at a dose of 25 or 50 mg / kg / d by intraperitoneal (ip) injection. Anti-TNF (Enbrel) was used as a positive control of the treatment and injected IP 3 times a week. For measurement of cytokines, Luminex multi-analyte technology was used in combination with the Miliplex Cytokine / Chemokine Magnetic Bead Panel kit (Millipore) according to the manufacturer's protocol to measure the levels of IL-1, IL-6, IL-10 and KC to measure cytokines in treated and untreated mouse sera. For histological analysis, isolated joints were fixed in 10% formalin, 5% decalcified formic acid for 4 days and then dehydrated and embedded in paraffin. Standard 7 mm frontal sections were mounted on SuperFrost microscope slides (Menzel-Gläser, Braunschweig, Germany). Hematoxylin and eosin (H & E) staining and safranine O staining were performed to study joint pathology. The pathological grade in the joints was on a scale of 0-3 (0 = no pathology, 3 = maximum Cellularity) as previously described (Lubberts, Arthritis Rheum 2004) for the following five parameters: arthritis, proteoglycan (PG) depletion from the cartilage matrix, chondrocyte death, cartilage surface erosion and bone erosion. Histopathological changes were evaluated on five semiserial sections with a distance of 140 mm. The evaluation was done blind in by two independent observers.
Die Ergebnisse in der therapeutischen Gruppe mit niedriger Dosis (25 mg/kg, G2013) IP Injektion zeigen eine therapeutische Wirksamkeit von a-L-Guluronsäure (G2013) durch das Abmildern des Fortschreitens der Krankheit im experimentellen Modell der rheumatoiden Arthritis (RA) im Vergleich zur Kontrollgruppe und den anti-TNF behandelten Tieren durch in der Behandlung von RA (Abbildung 3). The results in the low dose (25 mg / kg, G2013) IP injection therapeutic group demonstrate a therapeutic efficacy of αL-guluronic acid (G2013) by mitigating the progression of the disease in the experimental model of rheumatoid arthritis (RA) compared to the control group and the anti-TNF treated animals in the treatment of RA (Figure 3).
Beispiel 3: Immunsuppressive Effekte von α-L-Guluronsäure (G2013) auf die Expression von microRNA 155 und seinen zytosolischen Zielen Example 3: Immunosuppressive effects of α-L-guluronic acid (G2013) on the expression of microRNA 155 and its cytosolic targets
In Entzündungserkrankungen und Autoimmunerkrankungen ist die Genexpression von microRNA 155 und seiner zytosolischen Ziele, die die Signaltransduktion von miR-155 vermitteln (z.B. SHIP-1 und SCOS-1 ), nützlich für die Bestimmung des Grads der Krankheitsprogression und therapeutischer Wirkungen von Arzneimitteln. HEK293 hTLR4- Zellen, eine humane embryonale Nierenzeillinie, wurden in RPMI 1640 Medium (Gibco, USA) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Gibco, USA), 1X Penicillin-Streptomycin-Antibiotikum und 2 mM L-Glutamin bei 37° C unter einer befeuchteten Atmosphäre bei 95% Luft und 5% C02 kultiviert. Zählen und bestimmen der Lebensfähigkeit erfolgten unter Verwendung von Trypan-Blau. Zellen wurden in 6-Well-Platten bei einer Dichte von 1x106 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Nach 24-stündiger Kultivierung in normalem Wachstumsmedium wurden die Zellen mit α-L-Guluronsäure (G2013) für 24 h wie folgt behandelt: niedrige Dosis (5 Mg/ml), hohe Dosis (15 Mg/ml) und pures Medium (Kontrolle). Gesamt-RNA wurde aus der Kontrollprobe und behandelten Proben unter Verwendung des Hybrid-R-Mini-Kits (GeneAll, Süd-Korea) nach Angaben des Herstellers extrahiert. Die Reinheit der isolierten RNA wurde per NanoDrop® ND-1000 (Isogen Life Science) geprüft, um spektrophotometrische Verhältnisse von A26o nm A28o nm ~ 2 und A26o nm/A23o nm ^ 2 zu gewährleisten. Nach der Isolierung der RNA aus den Zellen wurde unter Verwendung des RT-for-RCR-Kit (GeneAll, Süd-Korea) cDNA präpariert. Die Amplifikation von SHIP1 (vorwärts: 5'-GCC TAC ACC AAG CAG AAA GC-3'; revers: 5'-GGA CCG TTC TTG GAG ACA AA-3') und SOCS1 (vorwärts: 5'- AGA GCT TCG ACT GCC TCT TC-3'; revers: 5'-GAT GCG CTG GCG GCA CAG CT-3') mRNA wurde mittels quantitativer PCR (QPCR) (Applied Biosystem) mit SYBR Premix Ex Tq (Takara, Japan) durchgeführt. Die Bedingungen für die PCR waren wie folgt: 95° C für 3 Minuten (1 Zyklus) und 94° C für 20 s, 60° C für 30 s und 72 ° C für 40 s (40-Zyklen). Die relative mRNA-Häufigkeit wurde durch Normalisierung gegen ß-Actin-mRNA unter Verwendung des 2A-AACT-Verfahrens bestimmt (Ct bezieht sich auf den Schwellenwert). Die miRNA cDNA wurde unter Verwendung von MystiCq® MikroRNA cDNA Synthesis Mix (Sigma-Aldrich) gemäß den Herstellerangaben erzeugt. Die qPCR wurde unter Verwendung eines spezifischen miR-155 Primers, 5'-UUA AUG CUA AUC GUG AUA GGG GU-3' (Sigma- Aldrich), und SYBR Premix EX Tq (Takara, Japan) durchgeführt. Die Bedingungen für die qPCR waren wie folgt: 95° C für 30 s, 94° C für 5 s, 60° C für 30 s und 70° C für 15 s (40- Zykluen). Der Thermocycler One-Step Real Time (Applied Biosystem) wurde für die qPCR verwendet und die Daten wurden analysiert unter Verwendung von GraphPad Prisma 5- Software basierend auf der Methode von One-Way-Anova-Varianz und des Student-t-Test. Relative miRNA-Häufigkeit wurde durch Normalisierung gegen U6 snRNA mit der 2Λ- ΔΔΟΤ- Methode bestimmt. In inflammatory and autoimmune diseases, gene expression of microRNA 155 and its cytosolic targets that mediate signal transduction of miR-155 (eg, SHIP-1 and SCOS-1) is useful for determining the degree of disease progression and therapeutic effects of drugs. HEK293 hTLR4 cells, a human embryonic kidney line, were transfected into RPMI 1640 medium (Gibco, USA) with 10% fetal bovine serum (FBS) (Gibco, USA), 1X penicillin-streptomycin antibiotic and 2 mM L-glutamine at 37 ° C cultured under a humidified atmosphere at 95% air and 5% C0 2 . Counting and determining viability were done using trypan blue. Cells were seeded in 6-well plates at a density of 1x10 6 cells per well. After culturing in normal growth medium for 24 hours, the cells were treated with α-L-guluronic acid (G2013) for 24 hours as follows: low dose (5 μg / ml), high dose (15 μg / ml), and pure medium (control). , Total RNA was extracted from the control and treated samples using the Hybrid R Mini Kit (GeneAll, South Korea) according to the manufacturer's instructions. The purity of the isolated RNA was checked ND-1000 (Isogen Life Science) per NanoDrop® to ensure spectrophotometric ratios of A 2 A 2 6o nm 8o nm ~ 2 and A 2 6o nm / A 23 nm o ^. 2 After isolation of the RNA from the cells, cDNA was prepared using the RT-for-RCR kit (Gene All, South Korea). The amplification of SHIP1 (forward: 5'-GCC TAC ACC AAG CAG AAA GC-3 '; reverse: 5'-GGA CCG TTC TTG GAG ACA AA-3') and SOCS1 (forward: 5'-AGA GCT TCG ACT GCC TCT TC-3 '; reverse: 5'-GAT GCG CTG GCG GCA CAG CT-3') mRNA was amplified by quantitative PCR (QPCR) (Applied Biosystem) with SYBR Premix Ex Tq (Takara, Japan). The conditions for the PCR were as follows: 95 ° C for 3 minutes (1 cycle) and 94 ° C for 20 s, 60 ° C for 30 s and 72 ° C for 40 s (40 cycles). The relative mRNA abundance was determined by normalizing to ß-actin mRNA using 2 A -AACT method determines (Ct refers to the threshold value). The miRNA cDNA was generated using MystiCq® MicroRNA cDNA Synthesis Mix (Sigma-Aldrich) according to the manufacturer's instructions. The qPCR was performed using a specific miR-155 primer, 5'-UUA AUG CUA AUC GUG AUA GGG GU-3 '(Sigma-Aldrich), and SYBR Premix EX Tq (Takara, Japan). The conditions for the qPCR were as follows: 95 ° C for 30 s, 94 ° C for 5 s, 60 ° C for 30 s, and 70 ° C for 15 s (40 cycles). The One-Step Real Time (Applied Biosystem) thermocycler was used for the qPCR and the data was analyzed using GraphPad Prisma 5 software based on the one-way Anova variance method and Student's t-test. Relative miRNA frequency was determined by normalization against U6 snRNA using the 2 Λ - ΔΔΟΤ method.
Die Ergebnisse der a-L-Guluronsäure behandelten Zellen zeigen eine signifikante Abnahme der Expression von microRNA 155 im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 4) und eine signifikante Erhöhung der Genexpression von SHIP-1 (Abbildung 5) und SOCS-1 (Abbildung 6) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dies zeigt die immunsuppressiven Eigenschaften von o L-Guluronsäure (G2013). The results of aL-guluronic acid treated cells show a significant decrease in expression of microRNA 155 compared to the control group (Figure 4) and a significant increase in gene expression of SHIP-1 (Figure 5) and SOCS-1 (Figure 6) compared to control group. This shows the immunosuppressive properties of o L-guluronic acid (G2013).
Beispiel 4: Effekt von α-L-Guluronsäure (G2013) auf die Differenzierung, die Reifung und die Funktion von menschlichen dendritischen Zellen Example 4: Effect of α-L-guluronic acid (G2013) on the differentiation, maturation and function of human dendritic cells
Herkömmliche DC-basierte Immunsuppressiva haben nennenswerte Nebeneffekte das Risiko von Infektionskrankheiten und Krebs zu erhöhen. Das Ziel dieser Experimente ist es die sichere Anwendung von α-L-Guluronsäure zu zeigen, so dass sich keine Effekte auf die Differenzierung, Reifung und Funktion von dendritischen Zellen ergeben. Die in vitro Differenzierung von menschlichen Monozyten in dendritische Zellen (DCs) wurde wie von Sreevalsan beschrieben mit geringen Modifikationen durchgeführt [Sreevalsan T, 2009]. Sechs menschliche periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden durch eine Ficoll- Hypaque (Mediatech Cellgro) Dichtegradienten-Zentrifugation isoliert. Monozyten wurden aus peripheren mononukleären Blutzellen unter Verwendung von anti-CD14 Microbeads (Miltenyi Biotec) gereinigt. Die Monozyten (> 95% Reinheit) wurden bei 37° C in 24-well Platten (700000 Zellen pro Vertiefung) in 3 ml serumfreiem AIM V Medium (Invitrogen), enthaltend 100 ng/ml Human-Granulocyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) (PeproTechs) und Human-lnterleukin-4 (IL-4, 20 ng/ml, R&D Systems), kultiviert. Die Zellen wurden mit zwei verschiedenen Dosierungen von G2013 kultiviert. Zum einen einer 6 μg well niedrig Dosierungslösung und zum anderen einer 12 μg well hoch Dosierungslösung. 6 Vertiefungen wurden als Kontrolle ausgewählt (nicht behandelt mit G2013). Insgesamt 0,5 ml frisches Medium mit GM-CSF und IL-4 wurde den Zellkulturen am dritten Tag hinzugefügt. Um die DC-Reifung zu induzieren wurden am fünften Tag die Zellkulturen über 24 Stunden mit Lipopolysaccharid (LPS, 1 μg ml, Katalog-Nr. L2654, Sigma-Aldrich) in Kontakt gebracht. Zwei Dosen von a-L-Guluronsäure (G2013)-Lösung wurden 4 Stunden vor der LPS Zugabe in die Vertiefungen gegeben. Die geernteten Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und in 100 μΙ PBS, das mit 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,1 % Natriumazid zur Färbung supplementiert wurde, resuspendiert. Die Zellen wurden für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Fc-Rezeptor-Blockierungslösung (BioLegend, San Diego, USA) inkubiert. Die Zellen wurden dann bei 4° C für 30 min mit den folgenden monoklonalen Maus-anti-human-Antikörper inkubiert (MAb): FITC-konjugierte mAbs gegen die Zelloberflächenmoleküle CD83, CD14 und PE-konjugierte mAbs gegen CD1 a, CD86 und PECY5-konjugierte mAbs gegen MHCII (eBiosciences, USA). In allen Experimenten wurden Isotyp-Kontrollen verwendet, die geeignete mAb der gleichen Ig- Klasse oder Unterklasse waren. Nach der Färbung wurden die Zellen zweimal in PBS, das mit 0,5% BSA und 0,1 % Natriumazid supplementiert war, gewaschen und in PBS mit 0,99% Paraformaldehyd resuspendiert. Durchflusszytometrie wurde auf einem Cytomics FC-500- Zytometer (Beckman Coulter) durchgeführt und alle nachfolgenden Analysen wurden durch die FlowJo Software (Tree Star) analysiert. DC Cytokin-Produktion wurde jeweils in den Überständen der DCs Kulturen (IL-12p70 und IL-10) nachgewiesen. Überstände wurden gesammelt und bei -70° C bis zur Verwendung eingefroren. Zytokin-Konzentrationen wurden durch ein Enzym-gebundenes Immunosorbent Assay (ELISA) Kit (BenderMed System, Österreich) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Conventional DC-based immunosuppressants have notable side effects to increase the risk of infectious diseases and cancer. The aim of these experiments is to demonstrate the safe use of α-L-guluronic acid, so that there are no effects on the differentiation, maturation and function of dendritic cells. The in vitro differentiation of human monocytes into dendritic cells (DCs) was performed as described by Sreevalsan with minor modifications [Sreevalsan T, 2009]. Six human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated by Ficoll-Hypaque (Mediatech Cellgro) density gradient centrifugation. Monocytes were purified from peripheral blood mononuclear cells using anti-CD14 microbeads (Miltenyi Biotec). The monocytes (> 95% purity) were incubated at 37 ° C in 24-well plates (700,000 cells per well) in 3 ml serum-free AIM V medium (Invitrogen) containing 100 ng / ml human granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) (PeproTechs) and human interleukin-4 (IL-4, 20 ng / ml, R & D Systems). The cells were cultured with two different dosages of G2013. On the one hand a 6 μg well low dosage solution and on the other hand a 12 μg well high dosage solution. 6 wells were selected as control (not treated with G2013). A total of 0.5 ml of fresh medium with GM-CSF and IL-4 was added to the cell cultures on the third day. To induce DC maturation, on the fifth day, the cell cultures were contacted with lipopolysaccharide (LPS, 1 μg ml, Catalog No. L2654, Sigma-Aldrich) for 24 hours. Two doses of aL-guluronic acid (G2013) solution were added to the wells 4 hours prior to LPS addition. The harvested cells were washed twice in PBS and resuspended in 100 μM PBS supplemented with 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 0.1% sodium azide for staining. The cells were incubated for 10 minutes at room temperature with an Fc receptor blocking solution (BioLegend, San Diego, USA). The cells were then incubated at 4 ° C for 30 min with the following mouse monoclonal anti-human antibodies (MAb): FITC-conjugated mAbs against the cell surface molecules CD83, CD14 and PE-conjugated mAbs against CD1a, CD86 and PECY5- conjugated mAbs to MHCII (eBiosciences, USA). In all experiments, isotype controls were used that were appropriate mAbs of the same Ig class or subclass. After staining, the cells were washed twice in PBS supplemented with 0.5% BSA and 0.1% sodium azide and resuspended in PBS with 0.99% paraformaldehyde. Flow cytometry was performed on a Cytomics FC-500 cytometer (Beckman Coulter) and all subsequent analyzes were analyzed by the FlowJo software (Tree Star). DC cytokine production was detected in each of the supernatants of DC cultures (IL-12p70 and IL-10). Supernatants were collected and frozen at -70 ° C until use. Cytokine concentrations were measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (BenderMed System, Austria) according to the manufacturer's instructions.
Die Expression von CD14 und CD1 a (als Differenzierungsmarker) wurde in Monozyten und unreifen dendritischen Zellen mit zwei unterschiedlichen Dosen (6 und 12 μgA ertiefung) von α-L-Guluronsäure (G2013) untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den Gruppen, die mit G2013-Lösung behandelt wurden, gibt. The expression of CD14 and CD1a (as a differentiation marker) was studied in monocytes and immature dendritic cells with two different doses (6 and 12 μg) of α-L-guluronic acid (G2013). The results show that there are no significant differences between the control group and the groups treated with G2013 solution.
Um zu bestimmen, ob die Wirkung von zwei verschiedenen Dosen (6 und 12 μgA ertiefung) einer G2013-Lösung Auswirkungen auf die Expression von CD83, CD86 und MHC II (als Reifungsmarker) hat, wurden DCs in der Anwesenheit dieser zwei verschiedenen Dosen kultiviert. Die Expression von MHC-II und der co-stimulierenden Moleküle wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten zeigen, dass die Expressionen der co- stimulierenden Moleküle und von MHC-II keine signifikanten waren Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und den Gruppen, die mit G2013 behandelt wurden, aufzeigen. In order to determine if the effect of two different doses (6 and 12 μg / well) of a G2013 solution has effects on the expression of CD83, CD86 and MHC II (as maturation markers), DCs were cultured in the presence of these two different doses. The expression of MHC-II and the co-stimulatory molecules was assessed by means of Flow cytometry analyzed. The data show that the expressions of the co-stimulatory molecules and MHC-II were not significant differences between the control group and the groups treated with G2013.
Die Überstände von kultivierten DCs wurden gesammelt und Zytokin-Konzentrationen durch das ELISA-Verfahren gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass es keinen signifikanten Unterschied in Zytokin-Konzentrationen (IL-12p70 und IL-10) zwischen Kontrollgruppe und den Gruppen, die mit G2013 behandelt wurden (z.B. 6 g/Vertiefung (P=0,068) bzw. 12 μgA ertiefung (P=1 ,4) in reifen dendritischen Zellen gibt. Die Ergebnisse zeigen, dass a-L- Guluronsäure (G2013) als sicheres Medikament keine nachteilige Wirkung auf die Differenzierung, die Reifung und die Funktion von dendritischen Zellen hat und als neuartiges Immunsuppressivum verwendet werden kann, das keine oder weniger Nebenwirkungen (z.B. das Risiko von Infektionskrankheiten und Krebs zu erhöhen) hat als vergleichbare auf dem Markt befindliche Produkte. The supernatants of cultured DCs were collected and cytokine concentrations were measured by the ELISA method. The results show that there was no significant difference in cytokine concentrations (IL-12p70 and IL-10) between the control group and the groups treated with G2013 (eg 6 g / well (P = 0.068) and 12 μg A well, respectively ( P = 1, 4) in mature dendritic cells.The results show that aL-guluronic acid (G2013), as a safe drug, has no detrimental effect on the differentiation, maturation, and function of dendritic cells and can be used as a novel immunosuppressant. that has no or fewer side effects (eg increasing the risk of infectious diseases and cancer) than comparable products on the market.

Claims

Ansprüche: Claims:
1 . Uronsäure-Monomer zur Verwendung in der Behandlung von Störungen des 1 . Uronic acid monomer for use in the treatment of disorders of the
Immunsystems, Entzündungskrankheiten, Nierenerkrankungen, Allergien und neurodegenerativen Krankheiten, wobei das Uronsäure-Monomer a-L-Guluronsäure, ein Derivat oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ist und das Uronsäure- Monomer in einer Dosis von weniger als 50 mg/kg/d verabreicht wird.  Immune system, inflammatory diseases, renal diseases, allergies and neurodegenerative diseases, wherein the uronic acid monomer is α-L-guluronic acid, a derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and the uronic acid monomer is administered at a dose of less than 50 mg / kg / d.
2. Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1 , wobei die 2. The uronic acid monomer for use according to claim 1, wherein the
Entzündungskrankheiten Autoimmunkrankheiten, akute und chronische Entzündungen und Osteoarthritis umfassen.  Inflammatory diseases include autoimmune diseases, acute and chronic inflammation and osteoarthritis.
3. Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 2, wobei die 3. The uronic acid monomer for use according to claim 2, wherein the
Autoimmunkrankheiten rheumatische Arthritis, juvenile Arthritis, systemisches Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom, progressive systemische Sklerodermie (PSS), Polymyositis-Dermatomyositis, Morbus Behget, Spondylitis ankylosans,  Autoimmune Diseases Rheumatoid Arthritis, Juvenile Arthritis, Systemic Lupus Erythematosus, Sjogren's Syndrome, Progressive Systemic Scleroderma (PSS), Polymyositis Dermatomyositis, Behget's Disease, Ankylosing Spondylitis,
Psoriasisarthritis, Reiter-Syndrom und rezidivierende Polychondritis umfassen.  Include psoriatic arthritis, Reiter's syndrome, and recurrent polychondritis.
4. Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1 , wobei die 4. The uronic acid monomer for use according to claim 1, wherein the
Nierenerkrankungen Glomerulonephritis und Glomerulosclerosis umfassen.  Renal diseases include glomerulonephritis and glomerulosclerosis.
5. Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1 , wobei die Störungen des Immunsystems Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen, allergisches 5. The uronic acid monomer for use according to claim 1, wherein the disorders of the immune system rejection reactions in transplants, allergic
Kontaktekzem und Hypersensivität Typ l-IV umfassen.  Contact dermatitis and hypersensitivity include Type I-IV.
6. Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1 , wobei die 6. The uronic acid monomer for use according to claim 1, wherein the
neurodegenerativen Krankheiten Multiple Sklerose (MS) und Alzheimer-Krankheit umfassen.  neurodegenerative diseases include multiple sclerosis (MS) and Alzheimer's disease.
7. Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach Anspruch 1 zur Kombinationstherapie mit Substanzen, die hepatotoxische Nebenwirkungen aufweisen. 7. The uronic acid monomer for use according to claim 1 for combination therapy with substances having hepatotoxic side effects.
8. Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 -7, wobei das Uronsäure-Monomer aus der Gruppe bestehend aus Natrium-a-L-Guluronsäure, Kalium-a-L-Guluronsäure, Magnesium-a-L-Guluronsäure, Calcium-a-L-Guluronsäure und einer Kombination davon ausgewählt ist. 8. The uronic acid monomer for use according to any one of claims 1-7, wherein the uronic acid monomer is selected from the group consisting of sodium αL-guluronic acid, potassium αL-guluronic acid, magnesium αL-guluronic acid, calcium αL-guluronic acid and a combination thereof is selected.
9. Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 -8, wobei das Uronsäure-Monomer intraperitoneal, oral, bukkal, rektal, intramuskulär, topisch, subkutan, inhalativ, intraartikulär oder intravenös verabreicht wird. The uronic acid monomer for use according to any one of claims 1-8, wherein the uronic acid monomer is administered intraperitoneally, orally, buccally, rectally, intramuscularly, topically, subcutaneously, inhalatively, intraarticularly or intravenously.
10. Das Uronsäure-Monomer zur Verwendung nach einem der Ansprüche 1 -9, wobei das Uronsäure-Monomer als Salbe, Creme, Gel, Paste, Emulsion, Tablette, Zäpfen, Puder, Pulver, Granulat, Pastille, Patch, Pflaster, Lösung, Schaum, Lotion, Öl, Shampoo, Aerosol oder Spray vorliegt. The uronic acid monomer for use according to any one of claims 1 to 9, wherein the uronic acid monomer is an ointment, cream, gel, paste, emulsion, tablet, suppository, powder, powder, granule, lozenge, patch, patch, solution, Foam, lotion, oil, shampoo, aerosol or spray is present.
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