DE10253514A1 - Production of new or known monomeric uronic acid compounds, useful e.g. as immunosuppressive or antiarthritic agents, by hydrolyzing bacterially produced polyuronic acid - Google Patents

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Hidenori Matsuo Md
Salvatore Dr. Cuzzocrea
Abbas Prof. Dr. Mirshafiev
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    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Abstract

Production of monomeric uronic acids (or their derivatives) (I) involves (a) fermenting a bacterial strain producing a polyuronic acid (II) formed from (I) units, (b) isolating (II) from the supernatant of the fermentation broth, (c) hydrolyzing (II) and (d) isolating (I) from the hydrolysis product. Some compounds (I) are new. Independent claims are included for: (a) new monomeric uronic acids (or derivatives) of formulae (IA) and (IB); and (b) the use of (IA) and/or (IB) (where; R1, R4 = OH; R3, R4 = OH, 1-20C carboxylate, acyl (sic) or 1-20C alpha-aminocarboxylate (or an N-acylated derivative); R5 = OH, O-alkali metal or O-quaternary ammonium (optionally substituted by one or more groups Q'), and where the proviso that R1 - R5 are not all simultaneously OH does not apply) for the production of pharmaceutical or cosmetic compositions. In the new compounds (IA/IB): R1 - R4 = OH or -O-Pg; Pg = protecting group selected from -Q, -CO-Q, -CO-aryl, -SO2-Q, N-acylamino compound, P(O)(OH)w(OQ)2-w or P(O)(OH)w(O-aryl)2-w; or two Pg groups together form -(CH2)n-; w = 0-2; Q = linear, branched or cyclic 1-30C alkyl, optionally substituted by one or more of NH2 or heteroatoms (specifically halogen); n = 1-4; R5 = OH, O-alkali metal, O-quaternary ammonium (optionally substituted by one or more groups Q'), OQ' or NR6R7; Q' = linear, branched or cyclic 1-20C alkyl, optionally substituted by one or more heteroatoms (specifically halogen); R6, R7 = 1-30C alkyl, (1-30C) alkylcarbonyl or arylcarbonyl; provided that R1 - R5 are not all simultaneously OH.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monomeren Uronsäuren, insbesondere Mannuronsäure und Guluronsäure, bevorzugt aus mikrobiell hergestelltem Polymannuronat oder Polyguluronat. Ferner wird die Verwendung dieser Substanzen zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung beschrieben, die antiphlogistisch wirkt und zur Behandlung von Störungen des Immunsystems, insbesondere von Gelenkentzündungen verwendet werden kann.The invention relates to a method for the production of monomeric uronic acids, in particular mannuronic acid and guluronic, preferably made of microbially produced polymannuronate or polyguluronate. Furthermore, the use of these substances for the production of a described pharmaceutical composition that has an anti-inflammatory effect and to treat disorders of the immune system, especially inflammation of the joints.

Die rheumatoide Arthritis ist eine entzündliche Systemerkrankung, die überwiegend die Gelenke befällt. Eine ältere Bezeichnung für die rheumatoide Arthritis, die noch häufig benutzt wird, ist chronische Polyarthritis. Über eine Million Menschen leiden in Deutschland an rheumatoider Arthritis. Jährlich erkranken rund weitere 2000 Menschen neu daran.Rheumatoid arthritis is one inflammatory Systemic disease, the predominant the joints affected. An older one Term for rheumatoid arthritis, which is still widely used, is chronic Polyarthritis. about One million people in Germany suffer from rheumatoid arthritis. Yearly Around 2,000 more people develop it.

Die Ursache der rheumatoiden Arthritis ist bis heute noch nicht genau bekannt. Man geht davon aus, dass es sich um eine sogenannte Autoimmunerkrankung handelt, bei der es zu einer Fehlsteuerung des körpereigenen Abwehrsystems (des Immunsystems) kommt und dieses Zellen des eigenen Körpers angreift. Die Ursachen für die anfängliche Fehlsteuerung des Immunsystems sind bis heute unbekannt. Seitens der Wissenschaft wird vermutet, dass mehrere Faktoren bei der Entstehung der Krankheit beteiligt sind. Möglicherweise spielen Infektionen mit Bakterien oder Viren eine Rolle. Grundsätzlich ist die Erkrankung bis heute nicht heilbar und begleitet den Patienten sein restliches Leben lang.The cause of rheumatoid arthritis is still not exactly known. One assumes that it is a so-called autoimmune disease in which it leads to a misregistration of the body's own Defense system (the immune system) comes and this cells of its own Body attacks. The causes of the initial Malfunctioning of the immune system is still unknown. by Science is believed to have several factors in its genesis are involved in the disease. possibly infections with bacteria or viruses play a role. Basically is the disease is still not curable and accompanies the patient the rest of his life.

Zur Behandlung der rheumatoiden Arthritis kommen derzeit bevorzugt langfristig wirkende Medikamente zum Einsatz. Die verwendeten Wirkstoffe werden aufgrund des langsamen Eintretens ihrer Wirkung mit einem schneller wirkendem Medikament kombiniert. Dabei handelt es sich um sogenannte „cortisonfreie Entzündungshemmer", sogenannte nicht steroidale Antirheumatika, NSAR, beziehungsweise non steroidal antiinflammatory drugs, NSAID, die zu den Aspirinähnlichen Medikamenten zählen oder um Cortison.Come to the treatment of rheumatoid arthritis Currently, long-term drugs are preferred. The active ingredients used are due to the slow onset their effects combined with a faster-acting drug. These are so-called "cortisone-free anti-inflammatories", so-called not steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs, or non steroidal anti-inflammatory drugs, NSAID that are similar to aspirin Count drugs or around cortisone.

Zu den NSAR gehören unter anderem die folgenden Wirkstoffe Acetylsalicylsäure, Diclofenac, Indomethacin, Piroxicam, Rofecoxib, Cefecoxib sowie Meloxicam, die unter verschiedenen Handelsnamen vertrieben werden.The NSAIDs include the following Active ingredients acetylsalicylic acid, Diclofenac, indomethacin, piroxicam, rofecoxib, cefecoxib as well Meloxicam, which are sold under various trade names.

NSAR's wirken entzündungshemmend und schmerzstillend, weil sie alle Prostaglandine in ihrer Funktion hemmen. Eine typische Nebenwirkung der NSAR ist, dass sie die Magenschleimhaut angreifen, was zu Magen- und Darmerkrankungen, im schlimmsten Fall zu Magen- und Darmblutungen führen kann.NSAIDs have anti-inflammatory and analgesic effects, because they inhibit all prostaglandins in their function. A typical one Side effect of NSAIDs is what they attack the gastric mucosa to stomach and intestinal diseases, in the worst case to stomach and Lead to intestinal bleeding can.

Ein Einfluss auf diese Prostaglandine wird auch anderen Substanzen zugeschrieben. So werden gemäss der EP 0 506 325 Oligomere oder Polymere von L-Guluronsäure und deren Epimer D-Mannuronsäure beschrieben, um die Produktion von Cytokinen wie Interleukinen IL-1, IL-6 und TNF zu hemmen.An influence on these prostaglandins is also attributed to other substances. According to the EP 0 506 325 Oligomers or polymers of L-guluronic acid and their epimer D-mannuronic acid are described in order to inhibit the production of cytokines such as interleukins IL-1, IL-6 and TNF.

IL-1 ist dafür bekannt, dass es die Produktion von Prostaglandinen hemmt. Die verwendeten Polysaccharide wurden dafür aus der Algen Laminaria digitata (Copolymere "G-blocks" die mehr als 90% L-Guluronsäure enthalten), aus den Zellen von Ascophyllum nodosum Fruchtkörpern (Copolymere "M-blocks" die mehr als 95% D-Mannuronsäure enthalten) bzw. aus Kulturen von Pseudomonas aeruginosa (Polymannuronsäure) isoliert.IL-1 is known for producing Inhibits prostaglandins. The polysaccharides used were from the Algae Laminaria digitata (copolymers "G-blocks" containing more than 90% L-guluronic acid), from the cells of Ascophyllum nodosum fruiting bodies (copolymers "M-blocks" which more than 95% D-mannuronic included) or isolated from cultures of Pseudomonas aeruginosa (polymannuronic acid).

Das Block-Copolymer Alginsäure, dass aus wechselnden Anteilen von Mannuronsäure und Guluronsäure besteht, wird schon seit langem aufgrund der gelierenden Eigenschaften in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie eingesetzt.The block copolymer alginic acid that consists of varying proportions of mannuronic acid and guluronic acid, has long been used in gelling properties used in the food and pharmaceutical industries.

Zur medizinischen Verwendung von Alginaten wird in der WO 01/66119 eine weitere Anwendung zur Behandlung von Schleimhautentzüngungen im Magen beschrieben.For medical use of Alginates is a further application for treatment in WO 01/66119 of mucosal inflammation in the Stomach described.

Die WO 01/56404 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Polymannuronaten aus marinen Algen, das gegen Fettleibigkeit und überhöhten Cholesterinspiegel eingesetzt wird.WO 01/56404 describes a method for Production of low molecular weight polymannuronates from marine algae, against obesity and high cholesterol is used.

Zur Zeit werden viele alginathaltige oder alginatähnliche Produkte hergestellt. Die in diesen Produkten enthaltenen Alginate werden durch Extraktion aus Algen oder Mikroorganismen erhalten und sind in der Regel hochmolekular.Many are currently containing alginate or alginate-like Products manufactured. The alginates contained in these products are obtained by extraction from algae or microorganisms and are usually high molecular weight.

Derartige hochmolekulare Blockpolymere haben eine hohe Viskosität und sind in Wasser schwerlöslich. Dadurch ist die Verwendung dieser hochmolekularen Polymere, z.B. in hohen Konzentrationen in Lebensmitteln, sehr eingeschränkt.Such high molecular weight block polymers have high viscosity and are sparingly soluble in water. This makes the use of these high molecular weight polymers, e.g. in high concentrations in food, very limited.

Herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Polymannuronat oder Polyguluronat mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10-900 kDa beinhalten eine saure/alkalische Hydrolyse [Haug, A., Larsen, B. und Smidsrod, O. (1966); Acta Chem. Scand., 20(1):183-190 and Hirst, E. and Rees, D.A. (1965); J. Chem. Soc.; 8:1493-1499], die Hydrolyse unter Druck und Hitze [Kimura, Y., Watanabe, K. und Okuda, H. (1996); J. Ethnopharmacology; 54:47-54] sowie die Hydrolyse unter Verwendung von Enzymen [Romeo. T. and Preston, J. (1986); Biochemistry; 25(26):8385-8391 und Yonemoto, Y. et al. (1991) Fermen. and Bioengin.; 72(3):152-157].Conventional manufacturing processes of polymannuronate or polyguluronate with a molecular weight in the 10-900 kDa range include acidic / alkaline hydrolysis [Haug, A., Larsen, B. and Smidsrod, O. (1966); Acta Chem. Scand., 20 (1): 183-190 and Hirst, E. and Rees, D.A. (1965); J. Chem. Soc .; 8: 1493-1499] hydrolysis under pressure and heat [Kimura, Y., Watanabe, K. and Okuda, H. (1996); J. Ethnopharmacology; 54: 47-54] and hydrolysis using enzymes [Romeo. T. and Preston, J. (1986); Biochemistry; 25 (26): 8385-8391 and Yonemoto, Y. et al. (1991) Fermen. and Bioengin .; 72 (3): 152-157].

Bei dem Verfahren der sauer/alkalischen Hydrolyse kommt es im industriellen Maßstab zur Minderung der Produktqualität sowie zur Korrosion im Reaktor. Ferner werden große Mengen an Neutralisierungsreagentien eingesetzt, und die Handhabung der eingesetzten starken Säuren ist umständlich.In the process of acidic / alkaline Hydrolysis occurs on an industrial scale to reduce product quality as well for corrosion in the reactor. It also uses large amounts of neutralizing reagents used, and the handling of the strong acids used is laborious.

Die Nachteile bei der Hydrolyse unter Druck und Hitze (100-200°C) sind die lange Reaktionszeit und die hohen Kosten, da der Prozess bei hohen Temperaturen und Drücken ausgeführt wird. Die enzymatische Hydrolyse ist aufgrund der hohen Kosten und der langen Reaktionszeit für den industriellen Maßstab ungeeignet.The disadvantages of hydrolysis under pressure and heat (100-200 ° C) are the long reaction time and the high costs, since the process is carried out at high Temperatures and pressures is executed. The enzymatic hydrolysis is unsuitable for the industrial scale due to the high cost and the long reaction time.

Es besteht daher ein Bedarf an einem verbesserten Verfahren zur Herstellung von niedermolekularen Polyuronsäuren, das sich durch einfache Handhabung und verbesserte Verfahrensergebnisse auszeichnet.There is therefore a need for one improved process for the preparation of low molecular weight polyuronic acids, the is characterized by simple handling and improved process results.

Seitens der Erfinder wurde überraschenderweise gefunden, dass Monomere von Polyuronsäuren auf einfache Weise hergestellt, in dem Verfahren zur Herstellung einer monomeren Uronsäuren, das die folgenden Schritte umfasst:

  • a. Fermentieren eines Polyuronsäure produzierenden Bakterienstammes;
  • b. Isolieren der Polyuronsäure aus dem Überstand der Fermentationsbrühe;
  • c. Hydrolysieren der Polyuronsäure von Schritt b.;
  • d. Isolieren des Uronsäuremonomers aus dem Verfahrensprodukt von Schritt c.,
wobei die Polyuronsäure aus einem Monomeren aufgebaut ist.It has surprisingly been found on the part of the inventors that monomers of polyuronic acids are prepared in a simple manner, in the process for preparing a monomeric uronic acid, which comprises the following steps:
  • a. Fermenting a bacterial strain producing polyuronic acid;
  • b. Isolating the polyuronic acid from the supernatant of the fermentation broth;
  • c. Hydrolyzing the polyuronic acid from step b .;
  • d. Isolating the uronic acid monomer from the process product of step c.,
wherein the polyuronic acid is composed of a monomer.

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es erstmals möglich, pyrogenfreie Monomere der Polyuronsäuren und anderer Polysaccharide herzustellen.By means of the method according to the invention it is possible for the first time pyrogen-free monomers of polyuronic acids and other polysaccharides manufacture.

Bevorzugt ist als Ausgangsmaterial der Polyuronsäure dabei Polymannuronsäure oder Polyguluronsäure. Das nach dem Verfahren hergestellte Monomer ist dabei bevorzugt D-Mannuronsäure, bzw. L-Guluronsäure.Preferred is as the starting material polyuronic acid thereby polymannuronic acid or polyguluronic acid. The monomer produced by the process is preferred D-mannuronic acid or L-guluronic acid.

Zur Verbesserung der Verfahrens, insbesondere zur Erhöhung der Ausbeuten und der Verbesserung der Aufarbeitung, weist die Polyuronsäure Schutzgruppen auf. Mit den Schutzgruppen sind die an der Uronsäure vorhandenen Hydroxylgruppen vor einer unerwünschten Nebenreaktion geschützt. Die Schutzgruppen werden bevorzugt aus der Gruppe, die aus C1-C20-Carboxylat, insbesondere Acetat, Sulfonat besteht, ausgewählt.To improve the process, in particular to increase the yields and improve the workup, the polyuronic acid has protective groups. The protective groups protect the hydroxyl groups present on the uronic acid from an undesirable side reaction. The protective groups are preferably selected from the group consisting of C 1 -C 20 carboxylate, in particular acetate, sulfonate.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Polyuronsäuren werden bevorzugt aus einer pflanzlichen oder mikrobiellen Quelle gewonnen. Dabei kommen u.a. Alginate und insbesondere Zellüberstände von Bakterienkulturen als Quellen in Betracht. Bevorzugt sind die Polyuronsäure produzierende Bakterienstämme, deren Epimerase-Gen inaktiviert wurde. Bevorzugt ist der die Polyuronsäure produzierende Epimerasenegative Pseudomonas-Stamm die Spezies Pseudomonas putida.Those used in the process according to the invention polyuronic are preferred from a plant or microbial source won. Among other things, Alginates and in particular cell supernatants from Bacterial cultures are considered as sources. The polyuronic acid producing are preferred Bacterial strains whose epimerase gene has been inactivated. The one which produces the polyuronic acid is preferred Epimerase negative Pseudomonas strain the species Pseudomonas putida.

Zur Steigerung der Ausbeute kann der Epimerase-negative Pseudomonas-Stamm in einem Fermenter kultiviert werden, und die Fermentationsbrühe einer Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile unterzogen werden.Can increase the yield the epimerase-negative Pseudomonas strain is cultivated in a fermenter and the fermentation broth subjected to a treatment to remove the insoluble matter become.

Die Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile umfasst dabei Filtrieren, insbesondere eine Ultrafiltration, Zentrifugieren und Kombinationen der vorgenannten Verfahren.The treatment to separate the insoluble Components include filtration, especially ultrafiltration, Centrifugation and combinations of the above methods.

Nach der Abtrennung der unlöslichen Bestandteile wird das Filtrat einer Präzipitationsbehandlung, bevorzugt einer alkoholischen Präzipitationsbehandlung, unterzogen. Hierdurch wird eine nahezu vollständige Fällung der Polyuronsäure erzielt, wobei das Polymer nach dem Ausfällen zur weiteren Behandlung durch Lyophilisieren getrocknet werden kann.After the insoluble separation Ingredients, the filtrate of a precipitation treatment is preferred alcoholic precipitation treatment, subjected. This results in an almost complete precipitation of the polyuronic acid, the polymer after the precipitation can be dried for further treatment by lyophilization.

Danach wird die Polyuronsäure unter sauren Bedingungen hydrolysiert, wobei die Hydrolyse bevorzugt bei 100-140°C in einer sauren Lösung, bevorzugt verdünnte HCl, bei einem pH-Wert von 1-5 durchgeführt wird.Then the polyuronic acid is under hydrolysed acidic conditions, the hydrolysis being preferred 100-140 ° C in an acidic solution, preferably diluted HCl, at a pH performed from 1-5 becomes.

Wenn eine Polyuronsäure eingesetzt wird, deren Hydroxylgruppen durch Schutzgruppen, beispielsweise Acetatgruppen ganz oder teilweise in der 2- und/oder 3-Stellung geschützt sind, werden diese Schutzgruppen vor der sauren Hydrolyse des Polymers unter alkalischen Bedingungen, bevorzugt schwach alkalischen Bedingungen im Bereich zwischen bei einem pH-Wert von 9 bis 13, abgespalten und die erhaltene Lösung dialysiert, um die Aufarbeitung und Reinigung des Polymers zu erleichtern.If a polyuronic acid is used is, whose hydroxyl groups by protective groups, for example Acetate groups in whole or in part in the 2- and / or 3-position protected are these protecting groups from acidic hydrolysis of the polymer under alkaline conditions, preferably weakly alkaline conditions in the range between at a pH of 9 to 13, split off and the solution obtained dialyzed to facilitate processing and purification of the polymer.

Die Lösung des nach der Abspaltung der Schutzgruppen erhaltenen Uronsäurepolymers wird nach der Dialyse anschließend neutralisiert und die Hydrolyse des Polymers unter sauren Bedingungen, bevorzugt schwach sauren Bedingungen im Bereich zwischen bei einem pH-Wert von 1 bis 5, abgespalten und das monomerenreine Uronsäure-Monomer aus der neutralen Lösung isoliert. Unter monomerenrein wird. erfindungsgemäß eine Reinheit von mehr als 99 %, bevorzugt 100% eines Monomeren verstanden.The solution of the after the split the protective groups obtained uronic acid polymer is then neutralized after dialysis and hydrolysis of the polymer under acidic conditions is preferred weakly acidic conditions in the range between at pH from 1 to 5, split off and the monomer-pure uronic acid monomer the neutral solution isolated. Under monomeric. a purity according to the invention understood by more than 99%, preferably 100% of a monomer.

Als Alternative zur Herstellung der monomeren Uronsäure können auch Polymere eingesetzt werden, die aus unterschiedlichen Monomeren aufgebaut sind. Allerdings sind dann solche Polymere bevorzugt, die mehr als 50% eines Monomeren enthalten. So können beispielsweise auch verschiedene Alginate verwendet werden, die dann zur Herstellung der Monomere dienen. Beispielweise können Alginate von Braunalgen mit einem Gehalt an Guluronsäureanteil von 50% und mehr eingesetzt werden. Allerdings müssen diese Monomerenmischungen nach der Hydrolyse einem weiteren Reinigungsschritt unterzogen werden, beispielsweise in Form einer Trennung über säulenchromatographische Verfahren unter Verwendung von chiralen Säulenmaterialien.As an alternative to making the monomeric uronic acid can Polymers are also used that are made of different monomers are built up. However, such polymers are preferred which contain more than 50% of a monomer. For example, different alginates are used, which then serve to prepare the monomers. For example, you can Alginates from brown algae containing guluronic acid of 50% and more can be used. However, these monomer mixtures must undergo a further cleaning step after the hydrolysis, for example in the form of a separation using column chromatography processes using chiral column materials.

Seitens der Erfinder wurde festgestellt, dass das so erhaltene Uronsäuremonomer günstige Eigenschaften bei der Behandlung verschiedener Krankheiten hervorruft, insbesondere Entzündungskrankheiten, ohne dass die bekannten Nebenwirkungen der NSAR beobachtet werden. Dies ist vermutlich mit der Struktur der einfach gebauten Uronsäuremonomere zu erklären. Diese Zuckerderivate dienen im tierischen Körper als wichtige Bausteine von Proteoglykanen und anderen wichtigen Polysacchariden. Sie werden vom Körper also nicht wie Fremdstoffe behandelt wie die NSARs. Dies ermöglicht sowohl die Langzeitapplikation als auch die Verabreichung in hohen Dosen, was bei den bisherigen kortisonsfreien Entzündungshemmern (NSAR) aufgrund der Nebenwirkungen nicht möglich gewesen ist.The inventors have found that the uronic acid monomer thus obtained has favorable properties in the treatment of various diseases, in particular inflammatory diseases, without the known side effects of NSAIDs being observed. This is probably due to the structure of the simple uronic acid explain monomers. These sugar derivatives serve as important building blocks of proteoglycans and other important polysaccharides in the animal body. So the body doesn't treat them like foreign substances like NSAIDs. This enables both long-term administration and administration in high doses, which was not possible with the previous cortisone-free anti-inflammatory drugs (NSAIDs) due to the side effects.

Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der Uronsäuremonomere, insbesondere D-Mannuronsäure und L-Guluronsäure oder Mischungen davon als pharmazeutisch wirksame Substanz bei der Behandlung von Störungen des Immunsystems einschließlich der Wirkung als Immunsuppressivum, rheumatischen Erkrankungen, Nierenerkrankungen, Entzündungen des Urogenitalsystems, Multipler Sklerose, Allergien, Alzheimer sowie Herz- und Gefäßerkrankungen.The invention therefore also relates the use of the uronic acid monomers, especially D-mannuronic acid and L-guluronic acid or Mixtures thereof as a pharmaceutically active substance in the treatment of disorders of the immune system including the effect as an immunosuppressant, rheumatic diseases, kidney diseases, inflammation of the genitourinary system, multiple sclerosis, allergies, Alzheimer's as well as heart and vascular diseases.

Die rheumatischen Erkrankungen umfassen insbesondere rheumatische Arthritis, juvenile Arthritis, systemisches und Lupus erythematodes.The rheumatic diseases include in particular rheumatic arthritis, juvenile arthritis, systemic and lupus erythematosus.

Die Nierenerkrankungen umfassen Glomerulonephritis, Glomerulosklerose und Nierenvenenthrombose.The kidney diseases include glomerulonephritis, Glomerulosclerosis and renal vein thrombosis.

Die Störungen des Immunsystems umfassen Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen und Autoimmunerkrankungen.Immune system disorders include rejection reactions in transplants and autoimmune diseases.

Die Uronsäuremonomere lassen sich zur Kombinationstherapie mit Substanzen, die hepatotoxische Nebenwirkungen aufweisen einsetzen.The uronic acid monomers can be used for combination therapy with substances that have hepatotoxic side effects.

Die Epimerisierung von Guluronsäure z.B. durch Epimerasen liefert Glucuronsäure. Die Glycoside der Glucuronsäure, die Glucuronide, können im tierischen Stoffwechsel viele körpereigene (z.B. Steroidhormone und Bilirubin) sowie körperfremde Stoffe, besonders die phenolisch aufgebauten Verbindungen (z.B. Pharmaka), nach Kopplung an Glucuronsäure (sog. Glucuronidierung bzw. Bildung sog. Glucuronsäurekonjugate) durch den Harn ausscheiden. Aufgrund dieser detoxifizierenden Eigenschaften können die Uronsäuremonomere, insbesondere Guluronsäure nach Epimerisierung, auch zur Krebsprävention eingesetzt werden.Epimerization of guluronic acid e.g. by Epimerase provides glucuronic acid. The glycosides of glucuronic acid, the glucuronides, can in animal metabolism, many of the body's own (e.g. steroid hormones and bilirubin) and foreign body Substances, especially the phenolic compounds (e.g. Pharmaceuticals), after coupling to glucuronic acid (so-called glucuronidation or formation of so-called glucuronic acid conjugates) excreted in the urine. Because of these detoxifying properties can the uronic acid monomers, especially guluronic acid after epimerization, can also be used for cancer prevention.

Die gute Verträglichkeit bei höherer Dosierung und Langzeitapplikationen ermöglicht weiterhin den präventiven Einsatz der Uronsäuremonomere bei gesunden Individuen, um Erkrankungen vorzubeugen und damit die Lebenserwartung des Individuums zu erhöhen. Diese vorbeugende Applikation ist besonders für die Personengruppen geeignet, die ein erhöhtes Erkrankungsrisiko aufweisen, sei es durch außergewöhnliche Belastungen des Körpers in der Jugend oder durch eine genetische Veranlagung für bestimmte Krankheiten, wie z.B. Krebs, insbesondere Brustkrebs oder Parkinson.The good tolerance at higher doses and long-term applications continue the preventive Use of the uronic acid monomers in healthy individuals to prevent diseases and thus life expectancy of the individual to increase. This preventive application is particularly suitable for groups of people which is an elevated Have disease risk, be it due to extraordinary stress on the body of youth or through a genetic predisposition to certain Diseases such as Cancer, especially breast cancer or Parkinson's.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.The invention is illustrated by the following examples explained further.

Verfahren zur Herstellung von Mannuronsäure aus gereinigtem bakteriellen Polymannuronatmethod for the production of mannuronic acid made of purified bacterial polymannuronate

Eine 0,5%ige Polymannuronat-Lösung wurde hergestellt und auf eine Endkonzentration von 0,1 M NaOH eingestellt. Diese Lösung wurde 3 h bei 20°C gerührt, um die Acetylgruppen zu entfernen. Anschließend wurde ein pH-Wert von 10 mit HCl eingestellt und eine Dialyse gegen 100-faches Volumen destilliertes Wasser durchgeführt. Das so deacetylierte Polymannuronat wurde nun vollständig hydrolysiert. Hierzu wurde der pH-Wert auf 2,3 mit HCl eingestellt und eine Inkubation von 4 h bei 135°C durchgeführt. Nach der anschließenden Neutralisierung mit Salzsäure wurde die Probe lyophilisiert und der erhaltene Rückstand für weiterführende Experimente zur Verfügung gestellt. Der Rückstand wurde. mittels TLC und Anionenaustauscherchromatographie analysiert.A 0.5% polymannuronate solution was made prepared and adjusted to a final concentration of 0.1 M NaOH. This solution was 3 h at 20 ° C touched, to remove the acetyl groups. Then a pH of 10 adjusted with HCl and distilled dialysis against 100 times the volume Water performed. The polymannuronate thus deacetylated was now completely hydrolyzed. For this, the pH was adjusted to 2.3 with HCl and an incubation from 4 h at 135 ° C carried out. After the subsequent one Neutralization with hydrochloric acid the sample was lyophilized and the residue obtained for further experiments on disposal posed. The residue has been. analyzed by TLC and anion exchange chromatography.

Seitens der Erfinder wurden Versuche durchgeführt, um die pharmazeutische Wirksamkeit des so erhaltenen D-Mannuronsäure-Monomers zu untersuchen.Attempts have been made by the inventors carried out, the pharmaceutical effectiveness of the D-mannuronic acid monomer thus obtained to investigate.

Jüngste Untersuchungen der Erfinder zeigen, dass die Behandlung mit D-Mannuronsäure im Gegensatz zu NSAR kein nephrotisches Syndrom induzierte, was bei der Behandlung mit NSAR oftmals als Nebenwirkung zu beobachten war. Entsprechend ist so die pharmazeutische Wirksamkeit der D-Mannuronsäure erhöht, da die Verabreichung auch in höheren Dosen und über längere Zeiträume erfolgen kann, ohne dass die beschriebenen Nebenwirkungen auftreten. Weitere Untersuchungen der Erfinder werden hierzu durchgeführt.recent Investigations by the inventors show that treatment with D-mannuronic acid is in contrast to NSAIDs induced no nephrotic syndrome, which in treatment with NSAIDs was often seen as a side effect. Is accordingly so the pharmaceutical effectiveness of D-mannuronic acid increases since the Administration also in higher Cans and over longer periods can be done without the side effects described. Further investigations by the inventors are carried out for this.

Im folgenden Anwendungsbeispiel soll die Wirksamkeit von D-Mannuronsäure bei der Behandlung von an Arthritis erkrankten Ratten verdeutlicht werden. Als Referenzsubstanz wird der Wirkstoff Indomethacin (im folgenden nur als Indomethacin bezeichnet) verwendet, der bereits seid langem als NSAR bekannt und als Amuno® und Indomet-ratiopharm® auf dem Markt erhältlich ist.The following application example is intended to illustrate the effectiveness of D-mannuronic acid in the treatment of rats suffering from arthritis. The active ingredient indomethacin (hereinafter referred to only as indomethacin) is used as a reference substance, which has long been known as NSAID and is available on the market as Amuno ® and Indomet-ratiopharm ® .

Anwendungsbeispiel 1Application example 1

Arthritis wurde bei Lewis Ratten (125-150 g Körpergewicht) durch eine 0.1 ml intradermale Injektion mit 0.3 mg hitzegetöteten Mycobacterium tuberculosis in Freund's Incomplete Adjuvanz in die rechte Pfote induziert. Nach 14 Tagen wurden die Tiere mit einem Pfotenvolumen, dass mindestens um 0.37 ml größer ist (gemessen mit Hilfe eines Plethysmographen) als ursprünglich, in drei verschiedene Versuchsgruppen aufgeteilt.Arthritis was found in Lewis rats (125-150 g body weight) by a 0.1 ml intradermal injection with 0.3 mg heat-killed Mycobacterium tuberculosis in Freund's Incomplete adjuvant induced in the right paw. After 14 days animals with a paw volume that was at least 0.37 ml is larger (measured using a plethysmograph) as original, divided into three different test groups.

Die erste Behandlung der Versuchsgruppen erfolgte nach 15 Tagen nach der Induktion. Die erste Versuchsgruppe blieb unbehandelt. Der zweiten Versuchsgruppe wurden 40 mg/kg D-Mannuronsäure intraperitoneal verabreicht. Der dritten Versuchsgruppe wurde Indomethacin in einer Konzentration von 2 mg/kg in einer Suspension aus 0.5% Methylcellulose und 0.025 Tween 80 verabreicht.The test groups were treated for the first time 15 days after induction. The first test group remained untreated. The second test group was administered 40 mg / kg D-mannuronic acid intraperitoneally. The third experimental group was indomethacin in a concentration of 2 mg / kg in a suspension of 0.5% methyl cellulose and 0.025 tween 80 administered.

Die Behandlung mit D-Mannuronsäure bzw. Indomethacin wurde bis zum 25. Tag als letztem Versuchstag täglich wiederholt. Während dieser Zeit wurden im zweitägigen Rhythmus Volumenmessungen der Pfoten sowohl der behandelten rechten Pfote als auch der unbehandelten kontralateralen Pfote (negativ Kontrolle) durchgeführt. Zusätzlich wurden einige Tiere für histologische Untersuchungen der kontralateralen Pfote getötet.Treatment with D-mannuronic acid or indomethacin was repeated daily until the 25th day as the last trial day. During this Time was up in the two days Rhythm volume measurements of the paws of both the treated right Paw as well as the untreated contralateral paw (negative Control). additionally were some animals for histological examination of the contralateral paw killed.

1 zeigt den Effekt von Indomethacin (Indo) und D-Mannuronsäure (M-2000) verglichen mit der unbehandelten Kontrolle. Nach nur 10 Behandlungstagen war das Pfotenvolumen der mit D-Mannuronsäure behandelten Tiere im Verhältnis zu der unbehandelten Pfote um 57% gesunken. Die entzündungshemmende Wirkung der Behandlung mit D-Mannuronsäure ist somit vergleichbar mit der Wirkung bei der Behandlung mit Indomethacin, bei der das Pfotenvolumen (PAW Oedema) um 60% gesunken war (P < 0.01). 1 shows the effect of indomethacin (Indo) and D-mannuronic acid (M-2000) compared to the untreated control. After only 10 days of treatment, the paw volume of the animals treated with D-mannuronic acid decreased by 57% compared to the untreated paw. The anti-inflammatory effect of the treatment with D-mannuronic acid is therefore comparable to the effect of the treatment with indomethacin, in which the paw volume (PAW Oedema) was reduced by 60% (P <0.01).

Zusätzlich wurden sowohl die Pfoten von Tieren aus der zweiten und dritten Versuchsgruppe als auch Tiere, bei denen die Arthritis nicht induziert worden war, histologisch untersucht. Dazu wurden die hinteren Extremitäten unter dem Kniegelenk abgetrennt, enthäutet und in 1% Formaldehyd-Lösung fixiert. Die Extremitäten wurden entkalkt, zerschnitten und mit Hematoxylin zur Purpurrot-Färbung des Zellkerns und mit Eosin zur Rosa-Färbung des Collagens und des Cytoskeletts der Zellen angefärbt. Die Gelenkverbindungen der tarsalen und metatarsophalangealen Gelenke wurden mikroskopisch untersucht. In jedem Gelenk wurden das Synovium, der Knorpel und das Weichgewebe auf synoviale Hyperplasie, Entzündungen, Ödeme sowie Knochen- und Knorpelabbau untersucht.In addition, both the paws of animals from the second and third experimental groups as well as animals, in which the arthritis had not been induced, histologically examined. To do this, the rear extremities were separated under the knee joint, skinned and fixed in 1% formaldehyde solution. The extremities were decalcified, cut up and with hematoxylin for purple coloring of the Nucleus and with eosin for pink coloring of the collagen and the Cytoskeletons of the cells stained. The articular connections of the tarsal and metatarsophalangeal joints were examined microscopically. In each joint the synovium, the cartilage and soft tissue on synovial hyperplasia, inflammation, edema as well Bone and cartilage degradation examined.

Anhand dieser Untersuchungen sollte der entzündungshemmende Effekt der D-Mannuronsäure histologisch verdeutlicht werden. Die Ergebnisse sind in den 2a-2c (im Uhrzeigersinn) dargestellt.Based on these studies, the anti-inflammatory effect of D-mannuronic acid should be clarified histologically. The results are in the 2a-2c (clockwise).

Die unbehandelte Versuchsgruppe 1 (2a) zeigt 25 Tage nach der Induktion der Arthritis deutliche morphologische Merkmale einer Arthritis in zahlreichen Gelenken (2b). Eine signifikante zelluläre Infiltration der Gelenke war bereits am 14 Tag, ohne ein Anzeichen von Knochen- oder Knorpelabbau sichtbar (Ergebnisse nicht dargestellt).The untreated test group 1 ( 2a ) shows clear morphological features of arthritis in numerous joints 25 days after the induction of arthritis ( 2 B ). Significant cellular infiltration of the joints was already evident on day 14 without any signs of bone or cartilage degradation (results not shown).

Am 25 Versuchstag werden schwere Entzündungen im Hartgewebe des Knochens, dem Gelenk und dem umliegenden Weichgewebe sichtbar. Die Schädigung des Weichgewebes wird durch extensive Infiltration von Neutrophilen und Macrophagen sowie Knorpel- und Muskelabbau deutlich. Der unter dem Knorpel liegende Knochen ist in den meisten Gelenken durch eine Vielzahl von Osteoclasten stark abgebaut worden.On the 25th day of the trial, severe inflammation in the hard tissue of the bone, the joint and the surrounding soft tissue visible. The injury of the soft tissue is caused by extensive infiltration of neutrophils and macrophages as well as cartilage and muscle breakdown. The under Bone lying in the cartilage is in most joints by a Variety of osteoclasts have been severely degraded.

Die Pfoten von Lewis-Ratten aus der 2. Versuchsgruppe (Behandlung mit D-Mannuronsäure 2c) zeigten sowohl eine verringerte entzündliche Zellinfiltration als auch eine verringerte Anzahl von Osteoclasten im unter dem Knorpel liegenden Knochen. Auch die Schädigung des Ödems und der Knochenabbau in den Pfoten sind weitestgehend reduziert.The paws of Lewis rats from the 2 , Experimental group (treatment with D-mannuronic acid 2c ) showed both a decreased inflammatory cell infiltration and a reduced number of osteoclasts in the bone beneath the cartilage. Damage to the edema and bone loss in the paws are largely reduced.

Diese Ergebnisse galten auch für die 3. Versuchsgruppe, die mit Indomethacin behandelt worden war. Die Behandlung mit D-Mannuronsäure als auch Indomethacin erhält das Hyalin im Gelenksknorpel, und es ist eine saubere Trennlinie zwischen Gelenkknorpel und verkalktem Knorpel zu erkennen.These results also applied to the 3 , Experimental group that had been treated with indomethacin. Treatment with D-mannuronic acid as well as indomethacin maintains the hyalin in the articular cartilage, and a clean dividing line can be seen between the articular cartilage and the calcified cartilage.

Durch Mittelung der Ergebnisse der histologischen Untersuchungen aller Versuchstiere in den einzelnen Gruppen konnte ein Durchschnittswert für den histologischen Schaden (Histological damage score) ermittelt werden, der es erlaubt, die Ergebnisse der Gruppen darzustellen (3).By averaging the results of the histological examinations of all test animals in the individual groups, an average value for the histological damage score was determined, which makes it possible to present the results of the groups ( 3 ).

Der Vergleich der Versuchsgruppen 2. (behandelt mit D-Guluronsäure) und 3. (behandelt mit Indomethacin) mit der Versuchsgruppe 1. (unbehandelt) zeigte deutlich geringere histologisch detektierbare Gewebsschädigungen in den Versuchsgruppen 2. und 3.The comparison of the test groups 2 , (treated with D-guluronic acid) and 3 , (treated with indomethacin) with the experimental group 1 , (untreated) showed significantly less histologically detectable tissue damage in the test groups 2 , and 3 ,

Ein weiteres Ergebnis der Versuche spiegelt sich in den Gewichtsveränderungen der Versuchstiere wieder. Diese Gewichtsmessungen sind vom 15. bis zum 25. Versuchstag durchgeführt worden. Die Versuchsgruppe 1. (unbehandelt) wies einen deutlichen Gewichtsverlust gegenüber Lewis-Ratten auf, bei denen keine Arthritis induziert worden ist.Another result of the tests is reflected in the changes in weight of the test animals. These weight measurements were carried out from the 15th to the 25th day of the experiment. The experimental group 1 , (untreated) showed significant weight loss compared to Lewis rats in which no arthritis was induced.

Dagegen ist der Gewichtsverlust bei den Tieren aus den Versuchsgruppen 2. (behandelt mit D-Guluronsäure) und 3. (behandelt mit Indomethacin) deutlich geringer (Ergebnisse nicht dargestellt).In contrast, the weight loss in the animals from the test groups 2 , (treated with D-guluronic acid) and 3. (treated with indomethacin) significantly lower (results not shown).

Anwendungsbeispiel 2Example of use 2

Anhand des folgenden Beispiels wird demonstriert, dass die entzündungshemmende Wirkung von D-Mannuronsäure bei langfristiger Verabreichung keine der bekannten Nebenwirkungen von NSAIDs aufweist.Using the following example demonstrated that the anti-inflammatory Effect of D-mannuronic acid with long-term administration none of the known side effects of NSAIDs.

Dazu werden die Biokompatibilität, die pharmakologisch toxikologischen sowie die inhibitorischen Eigenschaften von D-Mannuronsäure im Vergleich zu den NSAIDs Dexamethason, Piroxicam und Diclofenac auf die Aktivität der Matrix Metalloproteinase Typ 2 (MMP-2) untersucht.This will be the biocompatibility, the pharmacological Comparison of toxicological and inhibitory properties of D-mannuronic acid on the NSAIDs dexamethasone, piroxicam and diclofenac on the activity of the matrix Metalloproteinase type 2 (MMP-2) examined.

Um die Verträglichkeit und die MMP-2 Aktivität einschätzen zu können, wird zunächst eine Fibrosarcoma Zellinie (WEHI 164) mit einer Anfangsdichte von 2·104 Zellen/Kammer in RPMI-1640 Basismedium (5% CO2, 37°C, Feuchtigkeits-gesättigte Atmosphäre) herangezogen. Dem Basismedium werden unter anderem 5% Fetales-Kälber Serum, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin zugesetzt.In order to be able to assess the tolerance and the MMP-2 activity, a Fibrosarcoma cell line (WEHI 164) with an initial density of 2 · 10 4 cells / chamber in RPMI-1640 base medium (5% CO 2 , 37 ° C, moisture saturated atmosphere). 5% Fetal calf serum, 100 U / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin are added to the base medium.

Für die Dosis-Wirkungsanalyse werden D-Mannuronsäure sowie die Arzneimittel Dexamethason, Piroxicam und Diclofenac in unterschiedlichen Dosierungen (10 bis 200 μg/ml) zu Übernachtkulturen der zuvor beschriebenen Zellinie gegeben. Für die Kontrollansätze werden unbehandelte Zellkulturen verwendet (alle Versuchsansätze dreifach). Die behandelten (Versuchsgruppe) und unbehandelten (Kontrollgruppe) Zellen werden über Nacht unter den oben beschriebenen Bedingungen kultiviert. Danach werden mit den Gruppen kolorimetrische Untersuchungen und eine Zymoanalyse durchgeführt.D-mannuronic acid and the drugs dexamethasone, piroxicam and diclofenac are differentiated for the dose-effect analysis Chen dosages (10 to 200 ug / ml) to overnight cultures of the cell line described above. Untreated cell cultures are used for the control batches (all test batches in triplicate). The treated (test group) and untreated (control group) cells are cultivated overnight under the conditions described above. The groups are then subjected to colorimetric studies and zymoanalysis.

Für die kolorimetrischen Untersuchungen werden die Zellen aus den oben beschriebenen Übernachtkulturen drei mal mit eiskalter Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und anschließend in 5% Formaldehyd-Lösung fixiert. Die fixierten Zellen werden drei mal mit eiskalter Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und danach mit 1% Kristallviolett-Lösung gefärbt. Die gefärbten Zellen werden wiederum gewaschen, dann lysiert und in 33% Essigsäurelösung solubilisiert. Die Färbeintensität wird anschließend bei 580 nm ausgelesen.For The colorimetric studies are from the cells above described overnight cultures three times with ice-cold phosphate-buffered saline (PBS) washed and then in 5% formaldehyde solution fixed. The fixed cells are buffered three times with ice-cold phosphate saline solution (PBS) washed and then stained with 1% crystal violet solution. The stained cells are washed again, then lysed and solubilized in 33% acetic acid solution. The color intensity is then at 580 nm read out.

Zur Detektion von Gelatinase (Collagenase Typ IV oder MMP-2) und MMP-9 wird nach einer modifizierten Methode von Heussen und Dowdle gearbeitet (gelatin zymography). Die Proben aus den einzelnen Versuchsansätzen werden in einer Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel Elektrophorese (SDS-Page) unter nicht reduzierenden Bedingungen für 3 Stunden bei konstant 80 Volt analysiert, wobei das Gel 2 mg/ml Gelantine enthält. Um das SDS aus dem Gel zu entfernen wird das Gel nach der Elektrophorese dreimal in 2,5% TritonX100-Lösung gewaschen. Danach wird das Elektrophoresegel bei 37°C Übernacht im 0,1 M Tris-HCl Gelatinase-Aktivierungspuffer (pH 7,4) der 10 mM CaCl2 enthält, inkubiert und danach mit 0,5% Coomassie-Blau Lösung gefärbt. Nach intensivem Entfärben erscheinen die proteolysierten Bereiche im Gel als klare Banden gegenüber einem blauen Hintergrund.A modified Heussen and Dowdle method is used to detect gelatinase (collagenase type IV or MMP-2) and MMP-9 (gelatin zymography). The samples from the individual test batches are analyzed in a sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-Page) under non-reducing conditions for 3 hours at a constant 80 volts, the gel containing 2 mg / ml of gelatin. To remove the SDS from the gel, the gel is washed three times in 2.5% TritonX100 solution after electrophoresis. The electrophoresis gel is then incubated at 37 ° C. overnight in 0.1 M Tris-HCl gelatinase activation buffer (pH 7.4) which contains 10 mM CaCl 2 , and then stained with 0.5% Coomassie blue solution. After intensive decolorization, the proteolyzed areas in the gel appear as clear bands against a blue background.

Für die quantitative Auswertung sowohl der Oberfläche als auch der Intensität der lysierten Bereiche als Maßstab für die Enzymaktivität wird ein UVI Pro-Gel-Dokumentationssystem auf der Basis von Graustufenvergleichen verwendet. Die sich daraus ergebenden Werte für die Graustufen von behandelten Zellkulturen werden mit denen von unbehandelten Zellkulturen verglichen und als "relative Expression" der gelatinolytischen Aktivität ausgedrückt.For the quantitative evaluation of both the surface and the intensity of the lysed Areas as a benchmark for the enzyme activity becomes a UVI Pro-Gel documentation system based on grayscale comparisons used. The resulting values for the grayscale of treated Cell cultures are compared to those of untreated cell cultures and as "relative Expression "of gelatinolytic activity expressed.

Für die pharmazeutisch-toxikologischen Untersuchungen werden 28 weibliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 160-200 g eingesetzt. Sie werden vor den Experimenten für 1 Woche bei 20±2 °C, einer Feuchtigkeit von ~55%, einem 12 stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und unbegrenzter Wasser und Futterversorgung gehalten.For the pharmaceutical-toxicological examinations 28 female Sprague-Dawley rats weighing 160-200 g were used. They are kept for 1 week at 20 ± 2 ° C, a humidity of ~ 55%, a 12 hour light-dark cycle and unlimited water and feed supply before the experiments.

Eine Bestimmung der Serum- und Urin-Determinanten dient der Untersuchung der Nebenwirkungen von D-Mannuronsäure auf die Nierenfunktion, wie sie bei NSAIDs häufig auftreten. Dafür werden die Nierenfunktionen der Versuchstiere nach 12 Injektionen von D-Mannuronsäure (30mg/kg/48h) in die Bauchhöhle anhand von Messungen des Serum-Kreatinin-(S. Creat)-Gehaltes, des Harnstoffstickstoffes (BUN), der Proteinsekretion durch den Harn (U. Pro), des Harnstoffgehaltes (U. Urea) als auch der Plasmakonzentration von Triglyceriden (S. Trig) und Cholesterol (S. Chol), bestimmt.A determination of the serum and urine determinants is used to investigate the side effects of D-mannuronic acid renal function, as is common in NSAIDs. For that be the kidney functions of the test animals after 12 injections of D-mannuronic acid (30mg / kg / 48h) into the abdominal cavity based on measurements of the serum creatinine (S. Creat) content, the Urea nitrogen (BUN), the protein secretion by the urine (U. Pro), the urea content (U. Urea) and the plasma concentration of triglycerides (S. Trig) and cholesterol (S. Chol).

Für die histologischen Untersuchungen werden die gefärbten Gewebsschnitte vom Nierengewebe mit einem Lichtmikroskop untersucht. Das Nierengewebe wird dazu zuvor in 10% Formalin-Lösung fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet. Mit einem Ultramikrotom werden Schnitte des Gewebes hergestellt, die mit Hämatoxilin-Eosin und Schiff-Reagens gefärbt werden. Glomeruläre Läsionen werden dann auf einer Skala von 0-3 (0, negative; 1, leicht; 2, mittel; 3, stark) anhand folgender Parameter eingeordnet: Hyperzellularität, glomeruläre Infiltration durch polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN), hydropische Veränderungen des kapillaren Netzwerkes innerhalb des Nierenkortexes und die Bildung von tubulären Zylindern.For The histological examinations are the stained tissue sections from the kidney tissue examined with a light microscope. The kidney tissue becomes this previously fixed in 10% formalin solution and subsequently embedded in paraffin. With an ultramicrotome, cuts are made of tissue made with hematoxilin-eosin and Schiff's reagent colored become. glomerular lesions are then on a scale of 0-3 (0, negative; 1, easy; 2, medium; 3, strongly) classified according to the following parameters: hypercellularity, glomerular infiltration through polymorphonuclear neutrophil granulocytes (PMN), hydropic changes of the capillary network within the renal cortex and formation of tubular Cylinders.

Für die Untersuchungen auf ulzerogene Effekte im Magen von Ratten werden ihnen 14 intraperitoneal Injektionen von D-Mannuronsäure-Lösung in einer Konzentration von 30 mg/kg/48h verabreicht. Nach Beendigung des Versuches werden die Tiere getötet und der Magen sowie der Zwölffingerdarm herausseziert. Die Bewertung der Ergebnisse erfolgte auf Basis von wenigstens einem gastrischem Ulkus oder einer hämorrhagischen Erosion.For studies on ulcerogenic effects in the stomach of rats will be carried out them 14 intraperitoneal injections of D-mannuronic acid solution in one concentration of 30 mg / kg / 48h administered. After the trial is over the animals killed and the stomach and duodenum are dissected out. The results were evaluated on the basis of at least one gastric ulcer or hemorrhagic Erosion.

Die Veränderungen der Körpertemperatur wird während zwölfmaliger Injektion von D-Mannuronsäure-Lösung in einer Konzentration von 30 mg/kg/48h kontinuierlich mit Hilfe von Thermoelementen verfolgt. Die Ergebnisse der Temperaturmessungen werden mit denen von unbehandelten Tieren verglichen.The changes in body temperature will while twelve times Injection of D-mannuronic acid solution into a concentration of 30 mg / kg / 48h continuously with the help of Thermocouples tracked. The results of the temperature measurements are compared with those of untreated animals.

Für die statistischen Analysen der einzelnen Versuchsergebnisse wird der Student's T-test verwendet (P < 0,05).For the statistical analysis of the individual test results the student's t-test used (P <0.05).

Die Ergebnisse der Proliferationsversuche mit Fibrosarcoma Zellinien (WEHI 164) sind in 4 dargestellt. Der Vergleich der Zellzahl bei den Zellkulturen, die mit D-Mannuronsäure behandelt worden sind mit denen, die mit steroidalen und nichtsteroidalen Medikamenten (Dexamethason, Piroxicam und Diclofenac) behandelt worden sind, zeigt die gute Verträglichkeit von D-Mannuronsäure bei hohen Dosierungen und eignet sich daher im Vergleich zu anderen entzündungshemmenden Medikamenten auch für langfristige Applikationen. Die Ergebnisse der Dosis-Wirkungsanalyse 5. zeigen den Effekt von D-Mannuronsäure, Dexamethason, Piroxicam und Diclofenac behandelten Zellkulturen auf die gelantinolytischen Aktivität von MMP-2. Der inhibitorische Effekt von D-Mannuronsäure auf die Aktivität von MMP-2 zeigt einen möglichen Wirkungsmechanismus der D-Mannuronsäure bei der Bekämpfung von entzündlichen Reaktionen auf.The results of the proliferation experiments with Fibrosarcoma cell lines (WEHI 164) are in 4 shown. The comparison of the cell number in the cell cultures that have been treated with D-mannuronic acid with those that have been treated with steroidal and non-steroidal drugs (dexamethasone, piroxicam and diclofenac) shows the good tolerability of D-mannuronic acid at high doses and is suitable therefore, in comparison to other anti-inflammatory drugs, also for long-term applications. The results of the dose-response analysis 5 , show the effect of D-mannuronic acid, dexamethasone, piroxicam and diclofenac treated cell cultures on the gelantinolytic activity of MMP-2. The inhibitory effect of D-mannuronic acid on the activity of MMP-2 shows a possible mechanism of action of D-mannuronic acid in combating inflammatory reactions.

Die Ergebnisse bei der Bewertung der Nebenwirkungen auf die Nierenfunktion anhand der Serum und Urin Determinanten (6) zeigen, dass die Verabreichung von D-Mannuronsäure keine signifikanten Effekte auf die untersuchten Parameter (Serum-Kreatinin-Gehalt, Harnstoffstickstoffgehalt, Proteinsekretion durch den Harn, Harnstoffgehalt, Plasmakonzentration von Triglyceriden und Cholesterol) hat. Die histologischen Untersuchungen von Ratten, die mit D-Mannuronsäure behandelt worden sind, zeigen keine Veränderungen der Nierenhistologie (Ergebnisse nicht dargestellt).The results when evaluating the side effects on renal function using the serum and urine determinants ( 6 ) show that the administration of D-mannuronic acid has no significant effects on the parameters examined (serum creatinine content, urea nitrogen content, protein secretion by urine, urea content, plasma concentration of triglycerides and cholesterol). Histological examinations in rats treated with D-mannuronic acid show no changes in kidney histology (results not shown).

Auch die Körpertemperatur hat sich durch die Verabreichung von D-Mannuronsäure nicht verändert (Ergebnisse nicht dargestellt). Dahingegen ist bei einigen NSAIDs wie Paracetamol, Dipyron und Aminophenazon eine dosisabhängige Verringerung der Körpertemperatur im Stand der Technik bekannt. Die Verabreichung von D-Mannuronsäure hat auch nicht zur Ausbildung von Läsionen in der Magenschleimhaut der Versuchstiere geführt.The body temperature has also changed through that Administration of D-mannuronic acid not changed (Results not shown). In contrast, some NSAIDs such as paracetamol, dipyrone and aminophenazone a dose-dependent reduction in body temperature known in the art. The administration of D-mannuronic acid has also not for the formation of lesions in the gastric mucosa of the test animals.

Anwendungsbeispiel 3Example of use 3

Dieses Beispiel verdeutlicht den therapeutischen Effekt von D-Mannuronsäure bei Nierenerkrankungen anhand von künstlich induzierten nephrotischen Syndromen bei Ratten.This example illustrates the therapeutic effect of D-mannuronic acid in kidney diseases based on artificial induced nephrotic syndromes in rats.

40 Sprague-Dawley Ratten, die bereits unter dem Anwendungsbeispiel 1 beschrieben worden sind, werden in 5 Gruppen aufgeteilt: N = unbehandelte Kontrollgruppe (n = 8); P = erkrankte aber unbehandelte Patientengruppe (n = 8); T1 und T2 = Patientengruppe, die mit D-Mannuronsäure (T1) bzw. Piroxicam (T2) behandelt werden (n = 2 × 8) und eine unbehandelte Kontrollgruppe, die D-Mannuronsäure verabreicht bekommt (H).40 Sprague-Dawley rats already have been described under application example 1 are in 5 groups divided: N = untreated control group (n = 8); P = sick but untreated patient group (n = 8); T1 and T2 = Patient group with D-mannuronic acid (T1) or piroxicam (T2) treated (n = 2 × 8) and an untreated control group that administers D-mannuronic acid gets (H).

Die nephrotischen Syndrome werden durch eine intravenöse Injektion von Adriamycin (7,5 mg/kg Adriablastina; Farmitalia, Mailand, Italien) durch die Schwanzvene induziert. Sechs Tage nach der Induktion wird mit der Behandlung der Gruppen T1 und T2 begonnen. Die Versuchstiere der Gruppe T1 bekommen D-Mannuronsäure in einer Dosis von 30 mg/kg Körpergewicht verabreicht, während die Versuchstiere der Gruppe T2 0,3 mg/kg Piroxicam verabreicht bekommen. T1 und T2 bekommen 14 Tage lang jeden Tag 5 Injektionen der oben beschriebenen Zusammensetzung. Zusätzlich bekommen sie 9 Injektionen der gleichen Art, die alle 48 Stunden verabreicht werden, so dass die Behandlung nach 28 Tagen beendet wird. Für die weiteren Untersuchungen werden die Tiere 43 Tage nach dem Beginn der Behandlung getötet. Die Bestimmung der Nebenwirkungen auf die Nierenfunktion werden anhand der Serum und Urin-Determinanten (Serum-Kreatinin-Gehalt, des Harnstoffstickstoffgehaltes, der Proteinsekretion durch den Harn, des Harnstoffgehaltes als auch der Plasmakonzentration von Triglyceriden und Cholesterol) bestimmt, wie es bereits im Ausführungsbeispiel 2 beschrieben worden ist. Auch die histologischen Untersuchungen auf glomeruläre Läsionen erfolgten nach der bereits beschriebenen Methode im Anwendungsbeispiel 1.The nephrotic syndromes are through an intravenous Injection of adriamycin (7.5 mg / kg adriablastina; Farmitalia, Milan, Italy) induced by the tail vein. Six days after induction treatment of groups T1 and T2 is started. The experimental animals Group T1 received D-mannuronic acid at a dose of 30 mg / kg body weight administered while the experimental animals in group T2 were given 0.3 mg / kg piroxicam. T1 and T2 are given 5 injections of the above every day for 14 days described composition. They also get 9 injections the same kind that are administered every 48 hours so that the treatment is stopped after 28 days. For further investigation the animals were sacrificed 43 days after the start of treatment. The Determination of side effects on kidney function are based on the serum and urine determinants (serum creatinine content, urea nitrogen content, the protein secretion through the urine, the urea content as well the plasma concentration of triglycerides and cholesterol) as already in the embodiment 2 has been described. Also the histological examinations on glomerular lesions took place according to the method already described in the application example 1.

Die Ergebnisse der Untersuchungen werden in den 7 und 8 dargestellt. Dabei kann festgestellt werden, dass die Behandlung des nephrotischen Syndroms bei Ratten durch D-Mannuronsäure vergleichbare Effekte zeigt, wie das bereits auf dem Markt befindliche Piroxicam. Die Proteinsekretion durch den Harn (U.Prot) liegt bei den mit D-Mannuronsäure behandelten Tieren (T1) deutlich niedriger als bei der unbehandelten Patientengruppe (P) und der Gruppe, die mit Piroxicam behandelt worden ist (T2) (7). Die histologischen Untersuchungen des Nierengewebes anhand der oben genannten Parameter zeigen im Vergleich zur unbehandelten Patientengruppe (P) eine deutliche Verringerung der glomerulären Veränderungen in der Versuchsgruppe, die mit D-Mannuronsäure behandelt worden ist, (8).The results of the investigations are published in the 7 and 8th shown. It can be seen that the treatment of nephrotic syndrome in rats with D-mannuronic acid shows effects comparable to those of piroxicam already on the market. Protein secretion by urine (U.Prot) is significantly lower in the animals treated with D-mannuronic acid (T1) than in the untreated patient group (P) and the group treated with piroxicam (T2) ( 7 ). The histological examinations of the kidney tissue using the parameters mentioned above show a significant reduction in the glomerular changes in the test group treated with D-mannuronic acid compared to the untreated patient group (P) ( 8th ).

Anwendungsbeispiel 4Example of use 4

Anhand dieses Beispiels soll der Gebrauch des entzündungshemmenden Wirkstoffes D-Mannuronsäure zur Behandlung von T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen am Beispiel des Einflusses auf multiple Sklerose abgeschätzt werden. Dies wird anhand der Behandlung der Autoimmun-Encephalomyelitis (EAE) bei Ratten demonstriert, die durch das Myelin-Basis-Protein (MBP) induziert wird und als Tiermodell für multiple Sklerose (MS) dient.Using this example, the Use of the anti-inflammatory Active ingredient D-mannuronic acid for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases on Example of the influence on multiple sclerosis can be estimated. This is demonstrated in the treatment of autoimmune encephalomyelitis (EAE) in rats, which is induced by the myelin base protein (MBP) and as an animal model for multiple Sclerosis (MS) is used.

Zur Induktion von EAE werden sechs Wochen alten, weiblichen Lewis-Ratten 50 μg MBP in 0,2 ml CFA (Complete Freund's Adjuvant), daß 500 μg Mycobacterium tuberculosis enthält, in die hintere Pfote injiziert.Six are used to induce EAE Week-old female Lewis rats 50 μg MBP in 0.2 ml CFA (Complete Freund's adjuvant), that 500 ug Mycobacterium contains tuberculosis, injected into the back paw.

Für die klinische Bewertung von EAE werden die Ratten täglich gewogen und auf neurologische Besonderheiten hin untersucht. Die Beurteilung und Einteilung erfolgt nach folgenden Kriterien: 0 = keine Erkrankung; 1 = verringerte Schwanzbewegungen oder leicht schwerfällige Gangart; 2 = Atonie des Schwanzes und/oder mäßig schwerfällige Gangart; 3 = Querlähmung (Paraplagie); 4 = Paraplegie mit Vorderarmschwäche; 5 = im sterbenden Zustand oder bereits tot. Die Daten werden als "durchschnittliches klinisches Bild" (mean clinical score) dargestellt.For the clinical evaluation of EAE, the rats are weighed daily and examined for neurological peculiarities. The assessment and classification is based on the following criteria: 0 = no illness; 1 = reduced tail movements or slightly sluggish gait; 2 = atony of the tail and / or moderately cumbersome gait; 3 = transverse paralysis (paraplagia); 4 = paraplegia with weak arm; 5 = dying or already dead. Data are given as "average clinical Image "(mean clinical score).

Für die Behandlung werden zwei Versuchsgruppen gebildet. Die erste Gruppe (n = 7) bekommt D-Mannuronsäure in Salzlösung gelöst und täglich intraperitoneal in Dosen von 40 mg/kg Körpergewicht injiziert (EAE-Gruppe). Die zweite Gruppe (n = 8) bekommt reine Salzlösung injiziert (EAE-Kontrollgruppe). Beiden Gruppen werden insgesamt 18 Injektionen (i.p.) der beschriebenen Lösungen verabreicht. Dabei wird mit den Injektionen einen Tag vor der Immunisierung begonnen (Tag -1) und bis zum 16. Tag nach der Immunisierung fortgefahren (Tag +16) .For the treatment consists of two experimental groups. The first group (n = 7) gets D-mannuronic acid in saline solved and intraperitoneal daily injected at doses of 40 mg / kg body weight (EAE group). The second group (n = 8) is injected with pure saline (EAE control group). Both groups will receive a total of 18 injections (i.p.) of the solutions described administered. The injections are given one day before the immunization started (day -1) and continued until day 16 after immunization (Day +16).

Am 21. Tag nach der Immunisierung werden 4 Ratten aus jeder Gruppe die Lymphknoten entnommen und in Hank's-Lösung gegeben. Danach werden sie durch ein Maschensieb gepresst, um eine Lymphknoten-Zellsuspension zu erhalten. In Wachstumsversuchen wird die Reaktion der Zellsuspension auf MBP und dem Mitogen ConA getestet. Um das MBP spezifische T-Zell Wachstum zu messen, werden die Zellen der Lymphknoten gewaschen und in Mikrotiterplatten Kulturen mit einer Konzentration von 2·105 Zellen/Kammer angeimpft. Zu den Zellen werden 5 oder 10 μg/ml MBP oder 2 μg/ml Con A gegeben. Die Versuchsansätze werden jeweils 4-fach durchgeführt und zu jedem Versuchsansatz werden zusätzlich 200 μl Stimulationsmedium gegeben, das 1 mM L-Glutamin; 5·10-5 M 2-Mercaptoethanol (ME) und 1% frisches gen-identisches Serum, das mit und ohne Antikörper angesetzt worden ist, enthält. Nach 72 h Kultivierung bei 37°C und unter 5% CO2, wird den Kulturen 5-Bromo-2'-desoxyuridin (BrdU) zugeführt. 2 Stunden nach der Zugabe wird das Zellwachstums in den einzelnen Versuchsansätzen mit einem Standard Zellwachstums ELISA-Kit (Boehringer Mannheim, Deutschland) quantifiziert. Die resultierende Farbentwicklung ist dabei proportional zur Konzentration von BrdU in den DNS synthetisierenden Zellen der einzelnen Zellkulturen. Die Absorption wird mit einem optischen Densitometer bestimmt.Be on the 21st day after immunization The lymph nodes were removed from 4 rats from each group and placed in Hank's solution. Then they are pressed through a mesh sieve to obtain a lymph node cell suspension. The reaction of the cell suspension to MBP and the Mitogen ConA is tested in growth experiments. In order to measure the MBP-specific T cell growth, the cells of the lymph nodes are washed and inoculated in microtiter plate cultures with a concentration of 2 × 10 5 cells / chamber. 5 or 10 μg / ml MBP or 2 μg / ml Con A are added to the cells. The test batches are carried out 4 times each, and 200 μl of stimulation medium, the 1 mM L-glutamine; Contains 5 · 10 -5 M 2-mercaptoethanol (ME) and 1% fresh gene-identical serum, which has been prepared with and without antibody. After 72 h of cultivation at 37 ° C. and under 5% CO 2 , 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) is added to the cultures. 2 hours after the addition, the cell growth in the individual test batches is quantified using a standard cell growth ELISA kit (Boehringer Mannheim, Germany). The resulting color development is proportional to the concentration of BrdU in the DNA-synthesizing cells of the individual cell cultures. The absorption is determined using an optical densitometer.

Die Ergebnisse zeigen, daß D-Mannuronsäure den Krankheitsverlauf von EAE zu beeinflussen vermag. Die ersten neurologischen Besonderheiten treten 10 Tage nach der Immunisierung von EAE (9) auf und erreichen ihr Maximum 13 Tage nach der Immunisierung. Auch das mittlere Körpergewicht reduziert sich ab dem 12. Tag nach der Immunisierung in der EAE-Kontrollgruppe stärker als in der EAE-Gruppe (10). Drei Ratten aus der EAE-Gruppe haben keinerlei Symptome von EAE während der Beobachtungszeit entwickelt, während alle Versuchstiere aus der EAE-Kontrollgruppe deutliche Symptome von EAE aufzeigen (durchschnittliches klinisches Bild > 4; 9). Am 11. und 19. Tag nach der Immunisierung ist das durchschnittliche klinische Bild der EAE-Gruppe deutlich geringer als das der EAE-Kontrollgruppe. Bei den Wachstumsversuchen auf die Reaktion der Zellsuspension auf MBP und dem Mitogen ConA zeigte die EAE-Gruppe im Vergleich zur EAE-Kontrollgruppe ein verringertes Wachstum bei MBP Zugabe (11). Hingegen sind die Reaktionen der Zellsuspensionen auf das Mitogen Con A in beiden Gruppen nahezu gleich.The results show that D-mannuronic acid can influence the course of EAE. The first neurological peculiarities occur 10 days after the immunization of EAE ( 9 ) and reach their maximum 13 Days after immunization. From the 12th day after immunization, the mean body weight also decreased more in the EAE control group than in the EAE group ( 10 ). Three rats from the EAE group developed no symptoms of EAE during the observation period, while all test animals from the EAE control group showed clear symptoms of EAE (average clinical picture>4; 9 ). On the 11th and 19th days after the immunization, the average clinical picture of the EAE group was significantly lower than that of the EAE control group. In the growth experiments on the reaction of the cell suspension to MBP and the Mitogen ConA, the EAE group showed reduced growth compared to the EAE control group when adding MBP ( 11 ). In contrast, the reactions of the cell suspensions to the Mitogen Con A are almost the same in both groups.

Claims (24)

Verfahren zur Herstellung von monomeren Uronsäuren, das die folgenden Schritte umfasst: a. Fermentieren eines Polyuronsäure produzierenden Bakterienstammes; b.Isolieren der Polyuronsäure aus dem Überstand der Fermentationsbrühe; c. Hydrolysieren der Polyuronsäure von Schritt b.; d. Isolieren des Uronsäuremonomers aus dem Verfahrenprodukt von Schritt c., wobei die Polyuronsäure aus einem Monomeren aufgebaut ist.Process for the preparation of monomeric uronic acids, the includes the following steps: a. Fermenting a polyuronic acid producing Bacterial strain; b.Isolate the polyuronic acid from the supernatant of the Fermentation broth; c. Hydrolyze the polyuronic acid from step b .; d. Isolate the uronic acid monomer from the process product from step c., the polyuronic acid being built up from a monomer is. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Polyuronsäure Polymannuronsäure oder Polyguluronsäure ist.The method of claim 1, wherein the polyuronic acid or polymannuronic acid polyguluronic is. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Polyuronsäure Schutzgruppen aufweist.The method of claim 1 or 2, wherein the polyuronic acid protecting groups having. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Schutzgruppen aus der Gruppe, die aus Carboxylat, insbesondere Acetat, Sulfonat besteht, ausgewählt werden.The method of claim 3, wherein the protecting groups from the group consisting of carboxylate, especially acetate, sulfonate exists become. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der die Polyuronsäure produzierende Bakterienstamm ein Epimerase-negativer Pseudomonas-Stamm ist.Method according to one of the preceding claims, wherein which is the polyuronic acid producing bacterial strain an epimerase-negative Pseudomonas strain is. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der die Polyuronsäure produzierende Epimerase-negative Pseudomonas-Stamm die Spezies Pseudomonas putida ist.The method of claim 5, wherein the polyuronic acid producing Epimerase-negative Pseudomonas strain the species Pseudomonas putida is. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Isolierung der Polyuronsäure die Fermentationsbrühe einer Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile unterzogen wird.Method according to one of the preceding claims, wherein to isolate the polyuronic acid Fermentation broth one Treatment to separate the insoluble Components is subjected. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile Filtrieren, Zentrifugieren, und Kombinationen umfasst.The method of claim 7, wherein the treatment for Detach the insoluble Filtering, centrifuging, and combinations. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei nach der Behandlung zum Abtrennen der unlöslichen Bestandteile das Filtrat einer Präzipitationsbehandlung, bevorzugt einer alkoholischen Präzipitationsbehandlung, unterzogen wird.A method according to claim 7 or 8, wherein according to the Treatment to separate the insoluble Components the filtrate of a precipitation treatment, preferred alcoholic precipitation treatment, is subjected. Verfahren nach einem vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polyuronsäure unter sauren Bedingungen hydrolysiert wird.A method according to any preceding claim, wherein the polyuronic acid is hydrolyzed under acidic conditions. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Hydrolyse bei 100-140°C in einer sauren Lösung bei einem pH-Wert von 1-5 durchgeführt wird.The method of claim 10, wherein the hydrolysis at 100-140 ° C in one acidic solution is carried out at a pH of 1-5. Verfahren nach einem Ansprüche 9 bis 11, wobei vor der Hydrolyse die Schutzgruppen unter alkalischen Bedingungen abgespalten werden.A method according to any one of claims 9 to 11, wherein before Hydrolysis cleaves the protecting groups under alkaline conditions become. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verfahrensprodukt von Schritt c. neutralisiert wird und das Uronsäure-Monomer aus der neutralen Lösung isoliert wird.Method according to one of the preceding claims, wherein the process product of step c. is neutralized and that Uronic acid monomer from the neutral solution is isolated. Verwendung des Uronsäure-Monomers, erhältlich nach dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung.Use of the uronic acid monomer, available after the method according to any one of the preceding claims Manufacture of a pharmaceutical composition. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Uronsäure-Monomer Mannuronsäure oder Guluronsäure ist.Use according to claim 14, wherein the uronic acid monomer mannuronic or guluronic acid is. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Uronsäure-Monomer, erhältlich nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, als pharmazeutisch wirksamen Bestandteil.Pharmaceutical composition containing a Uronic acid monomer, available by the method according to any one of claims 1 to 13, as pharmaceutical effective ingredient. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei das Uronsäure-Monomer D-Mannuronsäure oder L-Guluronsäure ist.Pharmaceutical composition according to claim 16, wherein the uronic acid monomer D-mannuronic acid or L-guluronic is. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16 oder 17, zur Behandlung von Störungen des Immunsystems einschließlich der Wirkung als Immunsuppressivum, rheumatischen Erkrankungen, Nierenerkrankungen, Entzündungen des Urogenitalsystems, multipler Sklerose, Allergien, Alzheimer sowie Herz- und Gefäßerkrankungen.Pharmaceutical composition according to claim 16 or 17, to treat disorders of the Immune system including the effect as an immunosuppressant, rheumatic diseases, kidney diseases, inflammation of the genitourinary system, multiple sclerosis, allergies, Alzheimer's as well as heart and vascular diseases. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die rheumatischen Erkrankungen rheumatische Arthritis, juvenile Arthritis und systemisches Lupus erythematodes umfassen.Pharmaceutical composition according to claim 18, where the rheumatic diseases rheumatic arthritis, juvenile Arthritis and systemic lupus erythematosus include. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Nierenerkrankungen Glomerulonephritis, Glomerulo sklerose und Nierenvenenthrombose umfassen.Pharmaceutical composition according to claim 18, with kidney disease glomerulonephritis, glomerulosclerosis and renal vein thrombosis. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Störungen des Immunsystems Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen und Autoimmunerkrankungen umfassen.Pharmaceutical composition according to claim 18, being the glitches of the immune system rejection reactions in transplants and autoimmune diseases. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18 zur Kombinationstherapie mit Substanzen, die hepatotoxische Nebenwirkungen aufweisen.Pharmaceutical composition according to claim 18 for combination therapy with substances that have hepatotoxic side effects exhibit. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16 zur Verwendung als Medikament, das bei gesunden Menschen lebensverlängernde Eigenschaften hat.Pharmaceutical composition according to claim 16 for use as a medication that prolongs life in healthy people Has properties. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 16 zur Verwendung als Medikament zur Krebsprophylaxe.Pharmaceutical composition according to claim 16 for use as a cancer prophylaxis drug.
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