WO2017220668A1 - Mikroskopieverfahren unter nutzung zeitlicher fokusmodulation und mikroskop - Google Patents

Mikroskopieverfahren unter nutzung zeitlicher fokusmodulation und mikroskop Download PDF

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WO2017220668A1
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focus
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detection
modulation
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Ralf Netz
Thomas Kalkbrenner
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    • G02B21/008—Details of detection or image processing, including general computer control

Definitions

  • the invention relates to a microscopy method using temporal
  • the invention further relates to a microscope according to the preamble of claim 9.
  • the temporal focus modulation is characterized by a fast switching of different focus fields.
  • the phase position and / or the polarization of the illumination radiation are or are modulated, for example shifted or rotated.
  • the focus modulation is particularly applicable when the
  • Illumination radiation should only be influenced in the focus of a lens. At the same time occurring background radiation should be discriminated.
  • Modulation frequency is phase-modulated and the illumination beam is focused by means of a lens in a sample or is focused.
  • a detection beam path By means of a detection beam path and using a means for demodulation, a detection radiation caused in the sample is detected.
  • a detection radiation caused in the sample is detected. In the beam path of the
  • Illumination radiation is provided at least one polarization-changing element, which is followed by a phase plate, which has at least two regions with different phase influence.
  • the sample is illuminated with the illumination beam, wherein the illumination beam is split alternately on at least two beam paths. In one of the beam paths, a field mode different from the other beam path is generated. The two beam paths are superimposed in focus with the different field modes.
  • the detection radiation is demodulated in the detection beam path.
  • a microscope and a microscopy method using the focus modulation are also known from WO 2013/170940 A1.
  • WO 2013/170940 A1 A microscope and a microscopy method using the focus modulation are also known from WO 2013/170940 A1.
  • the illumination beam is present as a pulsed illumination beam and projects in the illumination beam path the lens by means of a first polarization beam splitter divided into at least a first and second partial beam path having different light paths.
  • a second pole divider By means of a second pole divider, the partial beam paths are reunited, wherein in one of the partial beam paths, a phase element is provided which has at least two regions with different phase influence.
  • the invention is based on the object, an evolved
  • the object is achieved with regard to the microscopy method by a method having the features of claim 1 and with regard to the microscope by the features of claim 9.
  • a lighting radiation is generated.
  • the illumination radiation is modulated and directed into a focus.
  • the modulated illumination radiation is switched in time between at least two modes, so that a focus modulation is effected, in which temporal fields with mutually different modes of the illumination radiation are generated in the focus.
  • the microscopy method is characterized in that the focus is point-shaped in the sense of a diffraction-limited Airy disk, also referred to as a spot, and is guided over at least areas of a sample to be examined, wherein the illumination radiation in the focus at least one origin a detection radiation in the sample is effected or effected and the detection radiation is detected associated with the at least one place of origin.
  • at least one beam of depletion radiation is directed into the focus, wherein the depletion radiation effects the effect of the detection radiation in that of the Abgestungsstrahlung illuminated area is completely or substantially prevented.
  • the focus is scanned across the sample in an advantageous embodiment, thereby illuminating at least portions of the sample completely or in a designated pattern.
  • the detection radiation is an emitted radiation, which originate for example from fluorophores, for example fluorescent molecules.
  • the place of origin of the detection radiation is through to a
  • Detection time at which the respective detection radiation is detected determines existing focus position.
  • the place of origin is determined by the depth of focus, ie the depth of focus in the sample.
  • the term of the detection radiation is also used in this description for variants of the microscopy method in which a detection radiation in the form of reflected and / or emitted radiation is suppressed by the effect of the illumination radiation and a non-occurrence of the
  • the occurrence and / or the expression of a property for example the emission of fluorescence radiation, which is generated entirely or essentially in focus, is influenced in time such that this property is not modulated outside of the focus.
  • the focus modulation may be effected by rapidly switching the optical phase in the pupil of an objective, as known to those skilled in the art.
  • the phase was switched to two half-pupils. Similar to the
  • FIG. 1 shows an example according to the prior art for two modes in a cross-sectional focus, between which it is possible to switch.
  • One of the modes has a zero on the optical axis.
  • FIG. 2 shows an example according to the prior art in which a focus modulation based on an electro-optical polarization rotator or an electro-optical modulator (EOM).
  • EOM electro-optical modulator
  • Illuminating radiation is focused.
  • Phase strokes in different spatial areas preferably in one
  • the invention is based on the consideration that the techniques of FMM
  • the focus modulation is integrated into a method by means of which an image with a high resolution is advantageously achieved.
  • Advantages of the microscopy method according to the invention is an increase in the penetration depth, ie a possible greater depth of focus.
  • parts of the excitation laser beam (laterally) are phase modulated with respect to other parts of the excitation beam.
  • Microscope lens leads this spatial phase modulation to a
  • Excitation modulation varies. This intensity modulation can be after the
  • Confocal pinhole can be detected for example by lock-in detection.
  • the advantage of the method is that only the ballistic, so
  • unscattered or weakly scattered photons contribute to this modulation signal insofar as they produce a modulation of the light distribution in focus, which then leads to a temporal intensity modulation of the signal photons; For example, multiply scattered photons in strongly scattering media lose the fixed phase relationship and do not contribute to the time-dependent interference structure in the focus. Accordingly, the scattered excitation photons do not contribute to the lock-in demodulated signal (which is emitted from the sample in focus and may be in the focus).
  • scattered signal photons may well contribute to the signal), thereby the background is greatly reduced by scattered light (in both excitation and in detection) and the depth, in which a relatively accurate imaging of the sample is possible with a laser confocal microscope elevated.
  • the microscopy method according to the invention is carried out by scanning the focus over the sample or at least over regions of the sample, the increased penetration depths can be achieved without the need to reduce the scanning speed.
  • Scanning speed can be further increased by using parallelepiped microscopy parallelization of the scanning process is achieved.
  • the illumination radiation is guided and focused as at least one illumination beam.
  • the microscopy method is designed so that a modulation of the illumination radiation over the cross section of the
  • Lighting beam is modulated, whereby a small cross-sectional area of the illumination beam can be realized.
  • the illumination radiation and the depletion radiation can be directed into the focus with divergent spatial distributions, wherein the illumination radiation and the de-excitation radiation can overlap in regions.
  • STED and RESOLFT methods are high-resolution point-scanning methods that achieve a resolution below the Abbe 's resolution limit.
  • Microscopy method used to enable a stimulable by the illumination radiation molecule, in particular a molecule of the sample, from a ground state in an excited state.
  • a molecule which has been set into the excited state by means of the illumination radiation is stimulated to emit the detection radiation. It is caused a so-called stimulated emission. The emitted thereby
  • Fluorescence radiation can be detected as detection radiation.
  • an adjustable by means of the illumination radiation activation state of a molecule of the sample is adjusted.
  • the molecule can be transferred from an activated state to a deactivated state, and vice versa.
  • the molecule is, for example, capable of fluorescence in an activated state. After successful excitation, the molecule thus activated can be converted from a ground state to an excited state with a higher energy than the ground state. From the excited state, the molecule can return to the ground state under spontaneous emission or under stimulated emission.
  • the method according to the invention can comprise an additional illumination step, in which a further illumination step
  • Abregungsstrahlenbündel generated, directed to the sample area and possibly existing detection radiation is detected.
  • the illumination of the sample area with the further Abregungsstrahlenbündel occurs at a time after the
  • the temporal offset is dimensioned such that the emission of detection radiation by the currently excited sample areas, for example by fluorophores excited there, has already decayed and only unwanted detection radiation of incompletely excited sample areas and / or spontaneously (re-excited) sample areas occurs.
  • the unwanted detection radiation is detected and used for the correction of the detected radiation which is excited and detected by the first de-excitation beam. So can one by means of the detected
  • Detection radiation after the illumination with the first Abregungsstrahlenbündel obtained first image can be corrected by means of the detected
  • the object is further provided by a microscope having a first radiation source for providing an illumination radiation, an optical mode switch in the beam path of an illumination beam of the illumination radiation for their temporal modulation and switching between at least two modes, a focusing optics for focusing the illumination beam into a focus and a detection unit Detection of originating from a place of origin in the focus detection radiation at a detection time the
  • Focusing optics for focusing the illumination beam is formed in a focus, means are provided for the controlled guidance of the focus at least over areas of a sample to be examined and the detection unit for
  • Assignment of detected at a detection time detection radiation is formed to a place of origin of the detection radiation in the sample. Furthermore, a second radiation source for providing a de-excitation radiation present, wherein the Abregungsstrahlung zusannnnen with the illumination radiation directed into the focus or can be directed into the focus.
  • the second radiation source is, optionally together with the second
  • Radiation source downstream optical elements designed to provide circularly polarized light as Abregungsstrahlung.
  • the optical mode switch is for example by an optical
  • the optical modulator is, for example, an acousto-optical modulator (AOM), an acousto-optical adjustable filter (AOTF) or an electro-optical modulator (EOM).
  • AOM acousto-optical modulator
  • AOTF acousto-optical adjustable filter
  • EOM electro-optical modulator
  • the phase element is formed for example as a phase plate having different polarization-changing areas.
  • the phase element is preferably arranged in an objective pupil.
  • the microscope has at least one means for demodulating the detection radiation, in particular in a beam path of the detection radiation (detection beam path), which is designed, for example, in the form of an electronic means, in particular as a lock-in reinforcement.
  • the microscope is in at least one
  • a beam-directing means is, for example, a mirror, an arrangement of a plurality of mirrors, such as a micromirror array, a reflective surface for at least one wavelength component, and / or combinations of said beam-directing means.
  • at least one beam influencing means is arranged in further embodiments of the microscope, through which a spatial distribution of the Abregungsstrahlenbündels is adjustable in focus. In this case, the spatial distribution of the Abregungsstrahlenbündels of a spatial distribution of the excitation beam in the focus is different adjustable.
  • the beam-influencing means is a spiral phase element in one possible embodiment of the microscope.
  • a so-called donut mode of the Abregungsstrahlenbündels is advantageously generated, in which around the optical axis, ie in the center of the Abregungsstrahlenbündels, a zero occurs (see also Fig. 1).
  • Further possible beam-influencing means are top-hat-phase elements and spatial light modulators (SLM).
  • SLM spatial light modulators
  • the polarization state can be varied in time, for example, either sinusoidally or rectangularly or in another advantageous waveform. As a result, the transition between the spatial field distributions in the focus of the microscope is influenced differently in time.
  • Microscopes according to the invention consist in an increase in the penetration depth by reducing the extra-focal scattered light, an improvement of the optical
  • Fig. 1 a an embodiment of the temporal focus modulation with a
  • FIG. 1b shows an embodiment of the temporal focus modulation with an Airy mode according to the prior art
  • FIG. 2 shows an exemplary embodiment of a microscope designed for focus modulation according to the prior art
  • Fig. 4 is a schematic representation of a first embodiment of the invention microscope.
  • FIGS. 1 a and 1 b show a temporal switching between two focus states (modes) known from the prior art.
  • FIG. 1 a of a donut mode DM or a zero-mode NM of an illumination radiation 4 has in its center the optical axis of a
  • Illuminating beam 5 corresponds to a zero point.
  • the respective position in the focal plane is plotted on the abscissa, while the ordinate indicates the associated intensity of the illuminating radiation 4.
  • Fig. 1b shows an Airy mode AM, also referred to as (diffraction) slice mode.
  • Fig. 2 is a from the prior art, in particular from
  • WO 2013/0170940 A1 known embodiment of a microscope 1 shown schematically.
  • an illumination radiation 4 is generated with an Airy mode AM and by means of an optics not shown in detail as a
  • the Lighting beam 4.1 is in an optical mode switch 6, which is arranged by an arranged in the illumination beam path 5 of the illumination beam 4.1 electro-optic modulator EOM and a passive
  • Phase element PP is formed, modulated.
  • the phase element PP is in
  • a transmission element 19 is optionally present, which is formed, for example, as a polarization-maintaining fiber. Alternatively, a free-space beam guide is realized and no transmission element 19 is present.
  • Phase element PP extends the illumination beam 4.1, via a scanning unit 7, not shown, (see FIG. 4) to an objective 2, by means of which the illumination beam 4.1 is focused into a focus 9 in a sample 10.
  • the illumination radiation 4 of the illumination beam 4.1 undergoes a
  • Illumination radiation 4 in focus 9 is also referred to as field modulation.
  • the phase element PP is formed, for example, as a phase plate, of which four phase elements PP_1 to PP_4 are shown by way of example in FIG. 3, which in other embodiments may also have other geometries.
  • the phase elements PP_1 to PP_4 each consist of a combination of a birefringent crystal and a phase
  • phase elements PP_1 to PP_4 in the form of split phase plates, in particular as ⁇ / 2 plates.
  • the phase plates are oriented so that the fast direction of the crystal, by which a ⁇ / 2 change in the polarization is effected, advantageously parallel, perpendicular or at a further optimized angle to the polarization of incident on the phase element PP illumination radiation 4 passes.
  • Fig. 3 various modifications of the phase element PP are shown.
  • a half-sided division into a ⁇ / 2 region K / 2 and a region of glass G in the first phase element PP_1 a quarter division into opposite K / 2 regions K / 2 in the form of quarters and quarters of glass G in the second
  • Phase element PP_2 an outermost ring-shaped ⁇ / 2 region K / 2 and a core of glass G in the third phase element PP_3 and an outside region of glass G and an internal ⁇ / 2 region K / 2 (core) in the fourth
  • glass can also be amorphous quartz
  • phase element PP_1 is the example of the orientation of
  • Phase element PP_1 a phase shift is generated in the ⁇ / 2 range K / 2 by half a wavelength relative to the region of glass G. However, if the polarization of the radiation is oriented perpendicular to the direction of the arrow, no relative
  • nematic crystals or structures which produce a different polarization via a path distribution.
  • AOTF acousto-optic tunable filter; adjustable acousto-optic filter
  • Microscope 1 according to the invention or used for a microscopy method according to the invention.
  • FIG. 4 schematically shows an exemplary embodiment of a microscope 1 according to the invention.
  • the microscope 1 has a first radiation source 3 for providing a
  • Illumination radiation 4 which is formed by means of a non-illustrated optics, for example by means of collimating optics and / or by means of lenses and / or mirrors, in an illumination beam 4.1 and directed along an optical axis of the microscope 1 and guided.
  • an electro-optical modulator EOM and a phase element PP are arranged in the form of a phase plate, through which an optical modulator 6 is formed.
  • electro-optical modulator EOM and phase element PP is a
  • Transmission element 19 in the form of a polarization-maintaining fiber present.
  • Transmission element 19 is optional and can be used in further embodiments of
  • Microscopes 1 may be different or missing.
  • optical mode switch 6 or the electro-optical modulator EOM or the phase element PP are used for temporal modulation of
  • Illumination radiation 4 of the illumination beam bundle 4.1 and their
  • a focusing optics simplified represented by a lens 2, for focusing the
  • Illuminating beam 4.1 in a focus 9 available.
  • the lens 2 is for Focusing the illumination beam 4.1 into a focus 9
  • the Abregungsstrahlung 7 available, the Abregungsstrahlung 7 is directed together with the illumination radiation 4 in the focus 9 or in the focus 9 can be directed.
  • the depletion radiation 7 is provided by the second radiation source 14 circularly polarized with an Airy mode AM, by means of a not closer
  • Abregungsstrahlengang 8 is a beam steering element 12 in the form of a controlled adjustable mirror and a beam-changing element 13 in the form of a
  • the Abregungsstrahlenbündel 7.1 is reflected by the dichroic beam splitter 1 1 along the optical axis of the microscope 1 and directed together with the illumination beam 4.1 along the optical axis of the microscope 1 in the focus 9 or directable.
  • the beam changing element 13 By action of the beam changing element 13, the mode of the
  • Abregungsstrahlung 7 of the Abregungsstrahlenbündel 7.1 changed, in particular from a Gaussian mode or an Airy mode AM transferred in a donut mode DM.
  • the depletion radiation 7 acts in the focus 9 of the emergence of a
  • Detection radiation 20 counter. Since the depletion radiation 7 is directed into the focus 9 in the donut mode DM, no detection radiation 20 can be caused by the illumination radiation 4 in the region of its annular distribution about the optical axis. Only in a narrowly circumscribed area about the optical axis, in which no depletion radiation 7 is directed into the focus 9, the detection radiation 20 is effected by means of the illumination radiation 4, if to a
  • Detection time in the focus 9 at least one by the
  • Illumination radiation 4 excitable atom or a stimulable molecule and / or a molecule with an excitable group, for example a
  • Fluorophore is located. Due to the position of such a molecule in the sample is the Place of origin of the detection radiation 20 is given, which is detected and described by a focus position of the lens 2 and a depth of focus.
  • a detection unit 18 which as a CCD camera, a CMOS camera or a
  • Photoelectron multiplier photomultiplier tube, PMT is formed.
  • the detection unit 18 is designed to associate the detection radiation 20 detected at a detection time point with the place of origin of the detection radiation 20 in the sample 10.
  • the detection radiation 20 is connected via a non-illustrated
  • Detection beam detected in which a demodulator 17 is arranged.
  • a scanning unit 15 is present, which is like the demodulator 17 with a control unit 16 in a suitable for the exchange of data, in particular control data connection.
  • the control unit 16 is also in communication with the optical modulator 6
  • Microscope 1 of the invention achieved modulation of
  • Illumination radiation 4 and / or depletion radiation 7 is in high-resolution point-scanning methods, for example for the excitation of a molecule
  • the atom is raised from an energy level of a ground state SO to an energy level of an excited state S1. From the excited state S1, the atom under spontaneous emission of a
  • Focus modulation can be further used to induce stimulated emissions of excited molecules. If there are molecules which can be switched by radiation between different states, in particular between states in which the molecules are excitable or non-excitable, fluorescent or non-fluorescent, the focus modulation can additionally or alternatively be used to switch these molecules.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Mikroskopieverfahren, bei dem eine Beleuchtungsstrahlung (4) erzeugt und in einen Fokus (9) gerichtet wird, wobei die modulierte Beleuchtungsstrahlung (4) zeitlich zwischen mindestens zwei Moden(AM, NM) geschaltet wird, so dass eine Fokusmodulation bewirkt wird, bei der in dem Fokus (9) zeitlich variierende und sich voneinander unterscheidende Moden-Felder (AM, NM) der Beleuchtungsstrahlung (4) erzeugt werden, dadurch gekennzeichnet, dass der Fokus (9) mindestens über Bereiche einer zu untersuchenden Probe (10) geführt wird, wobei durch die Beleuchtungsstrahlung (4) in dem Fokus (9) an mindestens einem Ursprungsort eine Detektionsstrahlung (20) in der Probe (10) bewirkt wird oder bewirkbar ist und die Detektionsstrahlung (20) dem mindestens einen Ursprungsort zugeordnet erfasst wird und zusätzlich zur Beleuchtungsstrahlung (4) mindestens ein Abregungsstrahlenbündel (7.1) einer Abregungsstrahlung (7) in den Fokus gerichtet wird, wobei durch die Abregungsstrahlung (7) das Bewirken der Detektionsstrahlung (20) in dem von der Abregungsstrahlung (7) beleuchteten Bereich verhindert wird. Die Erfindung betrifft ferner ein zur Durchführung des Mikroskopieverfahren geeignetes Mikroskop(1).

Description

Mikroskopieverfahren unter Nutzung zeitlicher Fokusmodulation und Mikroskop
Die Erfindung betrifft ein Mikroskopieverfahren unter Nutzung zeitlicher
Fokusmodulation gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 . Die Erfindung betrifft weiterhin ein Mikroskop gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 9.
Die zeitliche Fokusmodulation (FMM) ist durch ein schnelles Schalten verschiedener Fokusfelder charakterisiert. Bei der Fokusmodulation werden beziehungsweise wird die Phasenlage und/oder die Polarisation der Beleuchtungsstrahlung moduliert, beispielsweise verschoben beziehungsweise gedreht.
Die Fokusmodulation ist insbesondere dann anwendbar, wenn die
Beleuchtungsstrahlung nur im Fokus eines Objektivs beeinflusst werden soll. Dabei soll zugleich auftretende Hintergrundstrahlung diskriminiert werden.
Aus der DE 10 201 1 013 613 A1 sind ein Mikroskop und ein Mikroskopieverfahren bekannt, bei denen wenigstens ein Beleuchtungsstrahl mit einer
Modulationsfrequenz phasenmoduliert wird und der Beleuchtungsstrahl mittels eines Objektivs in eine Probe fokussierbar ist beziehungsweise fokussiert wird. Über einen Detektionsstrahlengang und unter Nutzung eines Mittels zur Demodulation wird eine in der Probe bewirkte Detektionsstrahlung erfasst. In dem Strahlengang der
Beleuchtungsstrahlung ist mindestens ein polarisationsänderndes Element vorgesehen, dem eine Phasenplatte nachgeordnet ist, welche mindestens zwei Bereiche mit unterschiedlicher Phasenbeeinflussung aufweist. Die Probe wird mit dem Beleuchtungsstrahl beleuchtet, wobei der Beleuchtungsstrahl abwechselnd auf mindestens zwei Strahlengänge aufgeteilt wird. In einem der Strahlengänge wird eine zum anderen Strahlengang unterschiedliche Feldmode erzeugt. Die beiden Strahlengänge werden im Fokus mit den unterschiedlichen Feldmoden überlagert. Die Detektionsstrahlung wird in dem Detektionsstrahlengang demoduliert.
Ein Mikroskop und ein Mikroskopieverfahren unter Nutzung der Fokusmodulation sind auch aus der WO 2013/170940 A1 bekannt. Über die bereits zur
DE 10 201 1 013 613 A1 angeführten Merkmale hinaus, liegt der Beleuchtungsstrahl als ein gepulster Beleuchtungsstrahl vor und wird im Beleuchtungsstrahlengang vor dem Objektiv mittels eines ersten Polarisationsstrahlenteilers in mindestens einen ersten und zweiten Teilstrahlengang geteilt, die unterschiedliche Lichtwege aufweisen. Mittels eines zweiten Polteilers sind die Teilstrahlengänge wieder vereint, wobei in einem der Teilstrahlengänge ein Phasenelement vorgesehen ist das mindestens zwei Bereiche mit unterschiedlicher Phasenbeeinflussung aufweist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein weiterentwickeltes
Mikroskopieverfahren mit einer verbesserten Auflösung und ein Mikroskop mit einem gegenüber dem Stand der Technik verbesserten Auflösungsvermögen
vorzuschlagen.
Die Aufgabe wird hinsichtlich des Mikroskopieverfahrens durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und hinsichtlich des Mikroskops durch die Merkmale des Anspruchs 9 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Bei der Ausführung des Mikroskopieverfahrens wird eine Beleuchtungsstrahlung erzeugt. Die Beleuchtungsstrahlung wird moduliert und in einen Fokus gerichtet. Dabei wird die modulierte Beleuchtungsstrahlung zeitlich zwischen mindestens zwei Moden geschaltet, so dass eine Fokusmodulation bewirkt wird, bei der in dem Fokus zeitlich Felder mit voneinander verschiedenen Moden der Beleuchtungsstrahlung erzeugt werden. Gekennzeichnet ist das Mikroskopieverfahren dadurch, dass der Fokus punktförmig im Sinne eines beugungsbegrenzten Airy-Scheibchens, auch als Spot bezeichnet, ausgebildet ist und mindestens über Bereiche einer zu untersuchenden Probe geführt wird, wobei durch die Beleuchtungsstrahlung in dem Fokus an mindestens einem Ursprungsort eine Detektionsstrahlung in der Probe bewirkt wird oder bewirkbar ist und die Detektionsstrahlung dem mindestens einen Ursprungsort zugeordnet erfasst wird. Zusätzlich zur Beleuchtungsstrahlung wird mindestens ein Strahlenbündel einer Abregungsstrahlung in den Fokus gerichtet, wobei durch die Abregungsstrahlung das Bewirken der Detektionsstrahlung in dem von der Abregungsstrahlung beleuchteten Bereich vollständig oder im Wesentlichen verhindert wird.
Der Fokus wird in einer vorteilhaften Ausführung scannend über die Probe geführt, wodurch mindestens Bereiche der Probe vollständig oder in einem vorgesehenen Muster beleuchtet wird.
Von Vorteil ist, wenn die Detektionsstrahlung eine emittierte Strahlung ist, die beispielsweise von Fluorophoren, beispielsweise fluoreszierenden Molekülen, stammen.
Der Ursprungsort der Detektionsstrahlung ist durch die zu einem
Erfassungszeitpunkt, zu dem die jeweilige Detektionsstrahlung erfasst wird, vorliegende Fokusposition bestimmt. Zusätzlich ist der Ursprungsort durch die Fokustiefe, also die Tiefe des Fokus in der Probe, bestimmt.
Der Begriff der Detektionsstrahlung wird in dieser Beschreibung auch für Varianten des Mikroskopieverfahrens verwendet, in denen im Fokus durch Wirkung der Beleuchtungsstrahlung eine Detektionsstrahlung in Form reflektierter und/oder emittierter Strahlung unterbunden wird und ein Nichtauftreten der
Detektionsstrahlung im Fokus erfasst und dem Ursprungsort zugeordnet wird, wie dies bei einer sogenannten Negativbildgebung beispielsweise unter Nutzung des RESOLFT-Verfahrens (reversible saturable optical fluorescence transitions;
reversibel sättigbare optische Fluoreszenzübergänge) erfolgt.
Um eine Fokusmodulation zu erzeugen wird das Auftreten und/oder die Ausprägung einer Eigenschaft, beispielsweise der Emission von Fluoreszenzstrahlung, welche gänzlich oder im Wesentlichen im Fokus generiert wird, zeitlich derart beeinflusst, dass diese Eigenschaft außerhalb des Fokus nicht moduliert wird.
Die Fokusmodulation kann durch schnelles Schalten der optischen Phase in der Pupille eines Objektivs bewirkt werden, wie dies dem Fachmann bekannt ist. Dabei wurde die Phase in zwei Halbpupillen geschaltet. Ähnlich der
Halbpupillenschaltung kann vorteilhaft auch die Schaltung zwischen den optischen Phasen anderer Teilstrahlen in der Pupille zur Erzeugung der Fokusmodulation genutzt werden.
Aus dem Stand der Technik, beispielsweise aus der WO 2013/170940 A1 , ist ein zeitliches Schalten zwischen zwei Fokuszuständen (Moden), die eine Modulation der Fluoreszenz lediglich im Fokus bewirken, bekannt.
Beispielhaft ist in der Fig. 1 ein Beispiel gemäß dem Stand der Technik für zwei Moden in einem Fokus im Querschnitt dargestellt, zwischen denen geschaltet werden kann. Eine der Moden besitzt eine Nullstelle auf der optischen Achse.
Außerhalb des Fokus verschwindet die Nullstelle.
Neben einer reinen Phasenschaltung in der Pupille ist zudem die Schaltung der Polarisation in Kombination mit einer Phasenplatte bekannt, um die aus dem
Fokalvolumen kommende Strahlung zu modulieren. In der Fig. 2 ist ein Beispiel gemäß dem Stand der Technik dargestellt, in dem eine Fokusmodulation auf der Basis eines elektro-optischen Polarisationsdrehers oder eines elektro-optischen Modulators (EOM). Das Fokalvolumen ist dasjenige Volumen, in dem die
Beleuchtungsstrahlung fokussiert ist.
Wegen der vorteilhaften hohen Modulationsfrequenzen kommen im Wesentlichen schnell schaltende opto-elektronische Elemente wie zum Beispiel AOMs (akusto- optische Modulatoren) und EOMs in Frage. Mittels dieser Elemente ist die
Polarisation zeitlich sehr schnell schaltbar, wodurch polarisationsabhängige
Phasenhübe in verschiedenen räumlichen Bereichen, vorzugsweise in einer
Objektivpupille, eingeführt werden.
Es ist also möglich, durch eine Schaltung des Polarisationszustandes einer
Strahlung, insbesondere einer Beleuchtungsstrahlung, eine Umschaltung der Phasen der Strahlung zu erzielen. Mit diesen Lösungen kann eine Eigenschaft der Strahlung moduliert werden, die sich am Ende im Wesentlichen auf ein (Teil-)Feld im Fokus auswirkt, d.h. moduliert wird, während die wesentlichen außerfokalen Anteile nicht signifikant moduliert werden. Mögliche und aus dem Stand der Technik bekannte Ausführungen einer Phasenplatte, die zu einer Fokusmodulation führen, sind in der Fig. 3 dargestellt.
Der Erfindung liegt die Überlegung zugrunde, dass die Techniken der FMM
Modulationsfrequenzen von mehreren MHz erlauben.
Erfindungsgemäß wird die Fokusmodulation in ein Verfahren integriert, mittels dem vorteilhaft eine Abbildung mit einer hohen Auflösung erreicht wird. Vorteile des erfindungsgemäßen Mikroskopieverfahrens ist eine Erhöhung der Eindringtiefe, also einer möglichen größeren Tiefe des Fokus.
Bei FMM werden Teile des Anregungslaserstrahls (lateral) gegenüber anderen Teilen des Anregungsstrahls phasenmoduliert. Bei Fokussierung durch ein
Mikroskopobjektiv führt diese räumliche Phasenmodulation zu einer
Intensitätsmodulation im Fokalvolumen. Diese resultiert aus der Tatsache, dass ein „flacher Phasenverlauf, d.h. eine über die Pupille nahezu konstante laterale Phase dazu führt, dass die PSF (point spread function; Punktverteilungsfunktion) in der Fokusebene eine beugungsbegrenzte laterale Ausdehnung annimmt. Laterale Phasenverläufe dagegen erzeugen eine PSF mit einer größeren räumlichen
Ausdehnung. Zum Beispiel führt ein Pi-Phasensprung einer Halbpupille gegenüber der anderen Halbpupille zu einem Streifen mit der Intensität Null im Fokus, sowie im gesamten Lichtkegel zum Fokus hin. Andererseits ist die PSF in der senkrechten Richtung ausgedehnter als die beugungsbegrenzte PSF mit flacher Phase. In der konfokalen Mikroskopie ergibt sich die effektive PSF als Produkt aus Beleuchtungsund Detektions-PSF. Die Detektions-PSF hängt wiederum von der Pinholegröße ab. Die nun zeitlich und räumlich variierende Intensitätsverteilung der Anregung führt dazu, dass die Intensität nach dem Pinhole mit der Frequenz der
Anregungsmodulation variiert. Diese Intensitätsmodulation kann nach dem
konfokalen Pinhole beispielsweise durch Lock-In-Detektion erfasst werden.
Der Vorteil des Verfahrens besteht darin, dass nur die ballistischen, also
ungestreuten, oder schwach gestreuten Photonen zu diesem Modulationssignal insofern beitragen, als sie eine Modulation der Lichtverteilung im Fokus erzeugen, die dann zu einer zeitlichen Intensitätsmodulation der Signalphotonen führt; die z.B. in stark streuenden Medien mehrfach gestreuten Photonen verlieren die feste Phasenbeziehung und tragen nicht zur zeitabhängigen Interferenzstruktur im Fokus bei. Dementsprechend tragen die gestreuten Anregungsphotonen nicht zum Lock-In- demodulierten Signal bei (die von der Probe im Fokus emittierten und evtl.
gestreuten Signalphotonen können allerdings sehr wohl zum Signal beitragen), dadurch wird der Hintergrund durch gestreutes Licht (sowohl in Anregung als auch in Detektion) stark reduziert und die Tiefe, in welcher mit einem Laser- Konfokalmikroskop eine relativ genaue Abbildung der Probe möglich ist, dadurch erhöht.
Wird das erfindungsgemäße Mikroskopieverfahren durchgeführt, indem der Fokus scannend über die Probe oder wenigstens über Bereiche der Probe geführt wird, sind die erhöhten Eindringtiefen erreichbar, ohne das die Scangeschwindigkeit reduziert werden muss.
In einer weiteren möglichen Ausgestaltung des Verfahrens kann die
Scangeschwindigkeit weiter erhöht werden, indem mittels Multispotmikroskopie eine Parallelisierung des Scanvorgangs erreicht wird.
Eine Modulation mit Modulationsfrequenzen unter dem oben genannten MHz- Bereich ist in weiteren Ausgestaltungen des Verfahrens möglich und kann
entsprechend ausgewählt und eingestellt werden. Die Beleuchtungsstrahlung wird als mindestens ein Beleuchtungsstrahlenbündel geführt und fokussiert.
Das Mikroskopieverfahren ist in einer möglichen Variante so ausgestaltet, dass eine Modulation der Beleuchtungsstrahlung über den Querschnitt des
Beleuchtungsstrahlenbündels moduliert wird, wodurch eine kleine Querschnittsfläche des Beleuchtungsstrahlenbündels realisiert werden kann.
Die Beleuchtungsstrahlung und die Abregungsstrahlung können mit voneinander abweichenden räumlichen Verteilungen in den Fokus gerichtet werden, wobei sich die Beleuchtungsstrahlung und die Abregungsstrahlung bereichsweise überlappen können.
Diese Möglichkeit ist beispielsweise dann vorteilhaft, wenn die Fokusmodulation in ein RESOLFT-Verfahren, insbesondere in ein STED-Verfahren (STED = Stimulated Emission Depletion), integriert wird, wobei hier das STED-Verfahren als eine spezifische Variante des RESOLFT-Verfahrens angesehen wird.
STED- und RESOLFT- Verfahren sind hochauflösende punktscannende Verfahren, mittels denen eine Auflösung unterhalb der Abbe'schen Auflösungsgrenze erreicht wird.
Die Fokusmodulation wird in einer möglichen Ausgestaltung des
Mikroskopieverfahrens dazu verwendet, um ein mittels der Beleuchtungsstrahlung anregbares Molekül, insbesondere ein Molekül der Probe, aus einem Grundzustand in einen angeregten Zustand zu versetzen.
In einer weiteren möglichen Ausgestaltung des Mikroskopieverfahrens wird mittels der Fokusmodulation ein mittels der Beleuchtungsstrahlung in den angeregten Zustand versetztes Molekül zur Emission der Detektionsstrahlung stimuliert. Es wird eine sogenannte stimulierte Emission hervorgerufen. Die dabei emittierte
Fluoreszenzstrahlung kann als Detektionsstrahlung erfasst werden.
Es ist in einer weiteren Ausgestaltung möglich, dass mittels der Fokusmodulation ein mittels der Beleuchtungsstrahlung einstellbarer Aktivierungszustand eines Moleküls der Probe eingestellt wird. Das Molekül kann dabei von einem aktivierten Zustand in einen deaktivierten Zustand überführt werden, und umgekehrt.
Das Molekül ist in einem aktivierten Zustand beispielsweise fluoreszenzfähig. Nach einer erfolgten Anregung ist das derart aktivierte Molekül aus einem Grundzustand in einen angeregten Zustand mit einer höheren Energie als der Grundzustand überführbar. Aus dem angeregten Zustand kann das Molekül unter spontaner Emission oder unter stimulierter Emission wieder in den Grundzustand zurückkehren. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einer weiteren Ausgestaltung einen zusätzlichen Beleuchtungsschritt umfassen, bei dem ein weiteres
Abregungsstrahlenbündel erzeugt, auf den Probenbereich gerichtet und eventuell vorhandene Detektionsstrahlung erfasst wird. Die Beleuchtung des Probenbereichs mit dem weiteren Abregungsstrahlenbündel erfolgt zeitlich versetzt nach der
Beleuchtung mit dem ersten Abregungsstrahlenbündel. Der zeitliche Versatz ist dabei so bemessen, dass die Aussendung von Detektionsstrahlung durch die aktuell angeregten Probenbereiche, beispielsweise durch dort angeregte Fluorophore, bereits abgeklungen ist und nur noch unerwünschte Detektionsstrahlung von unvollständig abgeregten Probenbereichen und/oder spontan (erneut) angeregten Probenbereichen auftritt. Die unerwünschte Detektionsstrahlung wird erfasst und zur Korrektur der mit dem ersten Abregungsstrahlenbündel abgeregten und erfassten Detektionsstrahlung verwendet. So kann ein mittels der erfassten
Detektionsstrahlung nach der Beleuchtung mit dem ersten Abregungsstrahlenbündel gewonnenes erstes Bild korrigiert werden, indem ein mittels der erfassten
Detektionsstrahlung nach der Beleuchtung mit dem weiteren
Abregungsstrahlenbündel gewonnenes weiteres Bild von dem ersten Bild abgezogen wird. Vorteilhaft wird mit diesem Vorgehen ein großer Teil derjenigen Bilddaten eliminiert, die lediglich erfasstes Hintergrundrauschen wiedergeben.
Die Aufgabe wird ferner durch ein Mikroskop mit einer ersten Strahlungsquelle zur Bereitstellung einer Beleuchtungsstrahlung, einem optischen Modenschalter in dem Strahlengang eines Beleuchtungsstrahlenbündels der Beleuchtungsstrahlung zu deren zeitlichen Modulierung und Schaltung zwischen mindestens zwei Moden, einer Fokussieroptik zur Fokussierung des Beleuchtungsstrahlenbündels in einen Fokus und einer Erfassungseinheit zur Erfassung einer aus einem Ursprungsort in dem Fokus stammenden Detektionsstrahlung zu einem Erfassungszeitpunkt die
Fokussieroptik zur Fokussierung des Beleuchtungsstrahlenbündels in einen Fokus ausgebildet ist, Mittel zur gesteuerten Führung des Fokus mindestens über Bereiche einer zu untersuchenden Probe vorhanden sind und die Erfassungseinheit zur
Zuordnung der zu einem Erfassungszeitpunkt erfassten Detektionsstrahlung zu einem Ursprungsort der Detektionsstrahlung in der Probe ausgebildet ist. Weiterhin ist eine zweite Strahlungsquelle zur Bereitstellung einer Abregungsstrahlung vorhanden, wobei die Abregungsstrahlung zusannnnen mit der Beleuchtungsstrahlung in den Fokus gerichtet oder in den Fokus richtbar ist.
Die zweite Strahlungsquelle ist, gegebenenfalls zusammen mit der zweiten
Strahlungsquelle nachgeordneten optischen Elementen, zur Bereitstellung zirkulär polarisierten Lichts als Abregungsstrahlung ausgebildet.
Der optische Modenschalter ist beispielsweise durch einen optischen
Modulator und/oder ein Phasenelement gebildet.
Der optische Modulator ist beispielsweise ein akusto-optischer Modulator (AOM), ein akusto-optisches einstellbares Filter (AOTF) oder ein elektro-optischer Modulator (EOM). Das Phasenelement ist beispielsweise als eine Phasenplatte ausgebildet, die unterschiedlich polarisationsändernde Bereiche aufweist.
Das Phasenelement ist vorzugsweise in einer Objektivpupille angeordnet. Das Mikroskop weist in einer weiteren möglichen Ausführung mindestens ein Mittel zur Demodulation der Detektionsstrahlung, insbesondere in einem Strahlengang der Detektionsstrahlung (Detektionsstrahlengang) auf, das beispielsweise in Form eines elektronischen Mittels, insbesondere als eine lock-in Verstärkung ausgebildet ist. In einer weiteren Ausführung des Mikroskops ist in mindestens einem
Abregungsstrahlengang eines Abregungsstrahlenbündels der Abregungsstrahlung wenigstens ein strahllenkendes Mittel angeordnet, mittels dem das
Abregungsstrahlenbündel zusammen mit dem Beleuchtungsstrahlenbündel in den Fokus gerichtet oder richtbar ist. Ein strahllenkendes Mittel ist beispielsweise ein Spiegel, eine Anordnung mehrerer Spiegel wie zum Beispiel ein Mikrospiegelarray, eine für wenigstens einen Wellenlängenanteil auftreffender Abregungsstrahlung reflektierende Oberfläche und/oder Kombinationen der genannten strahllenkenden Mittel. In dem Strahlengang des Abregungsstrahlenbündels ist in weiteren Ausführungen des Mikroskops mindestens ein strahlbeeinflussendes Mittel angeordnet, durch das eine räumliche Verteilung des Abregungsstrahlenbündels im Fokus einstellbar ist. Dabei ist die räumliche Verteilung des Abregungsstrahlenbündels von einer räumlichen Verteilung des Anregungsstrahlenbündels im Fokus abweichend einstellbar.
Das strahlbeeinflussende Mittel ist in einer möglichen Ausführung des Mikroskops ein Spiralphasenelement. Durch dieses ist vorteilhaft eine sogenannte Donut-Mode des Abregungsstrahlenbündels erzeugbar, bei dem um die optische Achse, also im Zentrum des Abregungsstrahlenbündels, eine Nullstelle auftritt (siehe auch Fig. 1 ). Weitere mögliche strahlbeeinflussende Mittel sind Top-HatPhasenelemente und räumliche Modulatoren für Licht (spatial light modulator, SLM). Generell kann der Polarisationszustand zeitlich beispielsweise entweder sinusförmig oder rechteckförmig oder in einer anderen vorteilhaften Wellenform variiert werden. Hierdurch wird der Übergang zwischen den räumlichen Feldverteilungen im Fokus des Mikroskops zeitlich verschieden beeinflusst.
Die Vorteile des erfindungsgemäßen Mikroskopieverfahrens und des
erfindungsgemäßen Mikroskops bestehen in einer Erhöhung der Eindringtiefe durch Reduzierung des außerfokalen Streulichts, einer Verbesserung des optischen
Schneidens (Sectioning) durch Reduzierung des Fluoreszenzvolumens und in einer Erhöhung der optischen Auflösung.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 a ein Ausführungsbeispiel der zeitlichen Fokusmodulation mit einer
Donut- beziehungsweise einer Nullstellenmode gemäß dem Stand der
Technik;
Fig. 1 b ein Ausführungsbeispiel der zeitlichen Fokusmodulation mit einer Airy- Mode gemäß dem Stand der Technik; Fig. 2 ein Ausführungsbeispiel eines zur Fokusmodulation ausgebildeten Mikroskops gemäß den Stand der Technik;
Fig. 3 Ausführungsbeispiele einer λ/2-Phasenplatte gemäß dem Stand der
Technik und
Fig. 4 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels erfindungsgemäßen Mikroskops.
In den Fig. 1 a und Fig. 1 b ist ein aus dem Stand der Technik bekanntes zeitliches Schalten zwischen zwei Fokuszuständen (Moden) dargestellt.
Der in der Fig. 1 a dargestellte Querschnitt einer Donut-Mode DM beziehungsweise einer Nullstellen-Mode NM einer Beleuchtungsstrahlung 4 (siehe auch Fig. 2 und 4) weist in seinem Zentrum, das der optischen Achse eines
Beleuchtungsstrahlenbündels 5 (siehe Fig. 2 und 4) entspricht, eine Nullstelle auf. Auf der Abszisse ist die jeweilige Position in der Fokusebene abgetragen während die Ordinate die zugehörige Intensität der Beleuchtungsstrahlung 4 angibt.
Die Fig. 1 b zeigt eine Airy-Mode AM, die auch als (Beugungs-)Scheibchen-Mode bezeichnet wird.
Bei der Ausführung der Fokusmodulation wird lediglich in einem Fokus 9 (siehe Fig. 2 und 5) eine Modulation der Fluoreszenz bewirkt.
In der Fig. 2 ist ein aus dem Stand der Technik, insbesondere aus der
WO 2013/0170940 A1 , bekanntes Ausführungsbeispiel eines Mikroskops 1 schematisch dargestellt.
Von einer ersten Strahlungsquelle 3 ist eine Beleuchtungsstrahlung 4 mit einer Airy- Mode AM erzeugt und mittels einer nicht näher dargestellten Optik als ein
Beleuchtungsstrahlenbündel 4.1 geformt und entlang einer optischen Achse (beide durch eine unterbrochene Linie symbolisiert) geführt. Das Beleuchtungsstrahlenbündel 4.1 wird in einen optischen Modenschalter 6, der durch einen im Beleuchtungsstrahlengang 5 des Beleuchtungsstrahlenbündels 4.1 angeordneten elektro-optischen Modulator EOM und einem passiven
Phasenelement PP gebildet ist, moduliert. Das Phasenelement PP steht in
Wirkverbindung mit dem elektro-optischen Modulator EOM, der durch eine entsprechende Ansteuerung eine schnelle Drehung der Polarisationsrichtung der Beleuchtungsstrahlung 4 des einfallenden Beleuchtungsstrahlenbündel 4.1 , meist eines linear polarisierten Laserstrahls, bewirkt. Zwischen dem elektro-optischen Modulator EOM und dem Phasenelement PP ist optional ein Übertragungselement 19 vorhanden, das beispielsweise als eine polarisationserhaltende Faser ausgebildet ist. Alternativ ist eine Freiraum- Strahlführung realisiert und kein Übertragungselement 19 vorhanden. Nach dem Durchgang des Beleuchtungsstrahlenbündel 4.1 durch das
Phasenelement PP verläuft das Beleuchtungsstrahlenbündel 4.1 , über eine nicht dargestellte Scaneinheit 7 (siehe Fig. 4) zu einem Objektiv 2, mittels dem das Beleuchtungsstrahlenbündel 4.1 in einen Fokus 9 in einer Probe 10 fokussiert ist. Infolge einer halbseitigen Phasenänderung durch das Phasenelement PP erfährt die Beleuchtungsstrahlung 4 des Beleuchtungsstrahlenbündels 4.1 eine
Fokusmodulation.
In Abhängigkeit der aktuellen Fokusmodulation ist das
Beleuchtungsstrahlenbündel 4.1 im Fokus 9 in der Nullstellen-Mode NM oder in der Airy-Mode AM ausgebildet. Aufgrund der räumlichen Verteilung der
Beleuchtungsstrahlung 4 im Fokus 9 (Feld) wird auch von einer Feldmodulation gesprochen.
Das Phasenelement PP ist beispielsweise als Phasenplatte ausgebildet, von der in der Fig. 3 beispielhaft vier Phasenelemente PP_1 bis PP_4 dargestellt sind, die in weiteren Ausführungen auch andere Geometrien aufweisen können. Die Phasenelemente PP_1 bis PP_4 bestehen jeweils aus einer Kombination eines doppelbrechenden Kristalls und einer bezüglich der Phase
polarisationsrichtungsunabhängigen Komponente, beispielweise aus Glas. Dargestellt sind die Phasenelemente PP_1 bis PP_4 in Form geteilter Phasenplatten, insbesondere als λ/2-Platten. Die Phasenplatten sind so ausgerichtet, dass die schnelle Richtung des Kristalls, durch den eine λ/2-Veränderung der Polarisation bewirkt ist, vorteilhaft parallel, senkrecht oder in einem weiteren optimierten Winkel zur Polarisation der auf das Phasenelement PP fallenden Beleuchtungsstrahlung 4 verläuft.
In der Fig. 3 sind verschiedene Modifikationen des Phasenelements PP dargestellt. So ist eine halbseitige Teilung in einen λ/2-Bereich K/2 und einen Bereich aus Glas G in dem ersten Phasenelement PP_1 , eine Viertelteilung in gegenüberliegende K/2- Bereiche K/2 in Form von Vierteln und Viertel aus Glas G in dem zweiten
Phasenelement PP_2, ein außenliegender ringfömiger λ/2-Bereich K/2 und ein Kern aus Glas G in dem dritten Phasenelement PP_3 sowie ein außenliegender Bereich aus Glas G und ein innenliegender λ/2-Bereich K/2 (Kern) in dem vierten
Phasenelement PP_4 ausgebildet. Statt Glas können auch amorphes Quarz
(Suprasil) oder andere nicht doppelbrechende Materialien verwendet sein.
In dem ersten Phasenelement PP_1 ist beispielhaft die Orientierung der
außerordentlichen Achse des jeweiligen λ/2-Bereichs des Phasenelements PP durch einen Pfeil veranschaulicht. Tritt eine parallel zu dieser Pfeilrichtung polarisierte Strahlung, beispielsweise die Beleuchtungsstrahlung 4, durch das erste
Phasenelement PP_1 , wird im λ/2-Bereich K/2 eine Phasenverschiebung um eine halbe Wellenlänge relativ zum Bereich aus Glas G erzeugt. Ist die Polarisation der Strahlung hingegen senkrecht zur Pfeilrichtung orientiert, wird keine relative
Phasenverzögerung erzeugt.
Es können beispielsweise auch nematische Kristalle oder Aufbauten, die über eine Wegaufteilung eine unterschiedliche Polarisation erzeugen, verwendet werden. Die Wege werden zum Beispiel durch Schalten eines AOM oder eines AOTF (AOTF = acousto-optic tunable filter; einstellbares akusto-optischer Filter) schnell gewechselt, so dass es zur gewünschten Veränderung der Polarisation kommt.
Die in den Fig. 1 bis 3 dargestellten Elemente und die zu den Fig. 1 bis 3
beschriebenen Ausführungen und Ausgestaltungen können auch für ein
erfindungsgemäßes Mikroskop 1 beziehungsweise für ein erfindungsgemäßes Mikroskopieverfahren verwendet sein.
In der Fig. 4 ist schematisch ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Mikroskops 1 dargestellt.
Das Mikroskop 1 weist eine erste Strahlungsquelle 3 zur Bereitstellung einer
Beleuchtungsstrahlung 4, die mittels einer nicht näher dargestellten Optik, beispielsweise mittels einer Kollimationsoptik und/oder mittels Linsen und/oder Spiegeln, in ein Beleuchtungsstrahlenbündel 4.1 geformt und entlang einer optischen Achse des Mikroskops 1 gerichtet und geführt ist. Entlang der optischen Achse sind ein elektro-optischer Modulator EOM und ein Phasenelement PP in Form einer Phasenplatte angeordnet, durch die ein optischer Modulator 6 gebildet ist. Zwischen elektro-optischem Modulator EOM und Phasenelement PP ist ein
Übertragungselement 19 in Form einer polarisationserhaltenden Faser vorhanden.
In weiteren Ausführungen des Mikroskops 1 ist nur der elektro-optische
Modulator EOM oder das Phasenelement PP angeordnet. Das
Übertragungselement 19 ist optional und kann in weiteren Ausführungen des
Mikroskops 1 anders gestaltet sein oder fehlen.
Der optische Modenschalter 6 beziehungsweise der elektro-optische Modulator EOM oder das Phasenelement PP dienen zur zeitlichen Modulierung der
Beleuchtungsstrahlung 4 des Beleuchtungsstrahlungsbündels 4.1 und deren
Schaltung zwischen mindestens zwei Moden. Weiterhin ist eine Fokussieroptik, vereinfachend dargestellt durch ein Objektiv 2, zur Fokussierung des
Beleuchtungsstrahlenbündels 4.1 in einen Fokus 9 vorhanden. Das Objektiv 2 ist zur Fokussierung des Beleuchtungsstrahlenbündels 4.1 in einen Fokus 9
beziehungsweise ein sehr kleines Fokusvolumen, ausgebildet.
Weiterhin ist eine zweite Strahlungsquelle 14 zur Bereitstellung einer
Abregungsstrahlung 7 vorhanden, wobei die Abregungsstrahlung 7 zusammen mit der Beleuchtungsstrahlung 4 in den Fokus 9 gerichtet oder in den Fokus 9 richtbar ist.
Die Abregungsstrahlung 7 wird mittels der zweiten Strahlungsquelle 14 zirkulär polarisiert mit einer Airy-Mode AM bereitgestellt, mittels einer nicht näher
dargestellten Optik zu einem Abregungsstrahlenbündel 7.1 geformt und entlang eines Abregungsstrahlengangs 8 gerichtet und geführt. In dem
Abregungsstrahlengang 8 ist ein strahllenkendes Element 12 in Form eines gesteuert verstellbaren Spiegels und ein strahlveränderndes Element 13 in Form eines
Spiralphasenelements angeordnet. Das Abregungsstrahlenbündel 7.1 ist mittels des dichroitischen Strahlteilers 1 1 entlang der optischen Achse des Mikroskops 1 reflektiert und zusammen mit dem Beleuchtungsstrahlenbündel 4.1 entlang der optischen Achse des Mikroskops 1 in den Fokus 9 gerichtet oder richtbar. Durch Wirkung des strahlverändernden Elements 13 wird die Mode der
Abregungsstrahlung 7 des Abregungsstrahlenbündel 7.1 verändert, insbesondere aus einer Gauß-Mode oder einer Airy-Mode AM in einer Donut-Mode DM überführt.
Die Abregungsstrahlung 7 wirkt in dem Fokus 9 der Entstehung einer
Detektionsstrahlung 20 entgegen. Da die Abregungsstrahlung 7 im Donut-Mode DM in den Fokus 9 gerichtet ist, kann in dem Bereich ihrer ringförmigen Verteilung um die optische Achse keine Detektionsstrahlung 20 durch die Beleuchtungsstrahlung 4 bewirkt werden. Lediglich in einem eng umgrenzten Bereich um die optische Achse, in der keine Abregungsstrahlung 7 in den Fokus 9 gerichtet ist, wird mittels der Beleuchtungsstrahlung 4 die Detektionsstrahlung 20 bewirkt, falls sich zu einem
Erfassungszeitpunkt in dem Fokus 9 mindestens ein durch die
Beleuchtungsstrahlung 4 anregbares Atom beziehungsweise ein anregbares Molekül und/oder ein Molekül mit einer anregbaren Gruppe, beispielsweise einem
Fluorophor, befindet. Durch die Position eines solchen Moleküls in der Probe ist der Ursprungsort der Detektionsstrahlung 20 gegeben, der durch eine Fokusposition des Objektivs 2 und eine Fokustiefe erfasst und beschrieben wird.
Zur Erfassung der aus einem Ursprungsort in dem Fokus 9 stammenden
Detektionsstrahlung 20 zu einem Erfassungszeitpunkt ist eine Erfassungseinheit 18 vorhanden, die als eine CCD-Kamera, eine CMOS-Kamera oder ein
Photoelektronenvervielfacher (photomultiplier tube, PMT) ausgebildet ist.
Die Erfassungseinheit 18 ist zur Zuordnung der zu einem Erfassungszeitpunkt erfassten Detektionsstrahlung 20 zu dem Ursprungsort der Detektionsstrahlung 20 in der Probe 10 ausgebildet.
Die Detektionsstrahlung 20 wird über einen nicht näher dargestellten
Detektionsstrahlengang erfasst, in dem auch ein Demodulator 17 angeordnet ist.
Zur gesteuerten Führung des Fokus 9 mindestens über Bereiche einer zu
untersuchenden Probe 10 ist eine Scaneinheit 15 vorhanden, die ebenso wie der Demodulator 17 mit einer Steuerungseinheit 16 in einer zum Austausch von Daten, insbesondere von Steuerdaten, geeigneten Verbindung steht.
Die Steuerungseinheit 16 steht außerdem mit dem optischen Modulator 6 in
Verbindung, um mindestens eines der Elemente des optischen Modulators 6 anzusteuern. Die mittels der Fokusmodulation, insbesondere unter Verwendung des
erfindungsgemäßen Mikroskops 1 , erreichte Modulation von
Beleuchtungsstrahlung 4 und/oder Abregungsstrahlung 7 ist in hochauflösenden punktscannenden Verfahren beispielsweise zur Anregung eines Moleküls
verwendbar, bei dem das Atom aus einem Energieniveau eines Grundzustands SO auf ein Energieniveau eines angeregten Zustands S1 gehoben wird. Aus dem angeregten Zustand S1 kann das Atom unter spontaner Emission einer
Detektionsstrahlung auf ein niedrigeres Energieniveau springen. Die
Fokusmodulation kann weiter dazu verwendet werden, um stimulierte Emissionen angeregter Moleküle hervorzurufen. Liegen Moleküle vor, die durch Strahlung zwischen verschiedenen Zuständen, insbesondere zwischen Zuständen in denen die Moleküle anregbar oder nicht- anregbar beziehungsweise fluoreszenzfähig oder nicht-fluoreszenzfähig sind, geschalten werden können, kann die Fokusmodulation zusätzlich oder alternativ zum Schalten dieser Moleküle verwendet werden.
Bezugszeichen
1 Mikroskop
2 Objektiv
3 erste Strahlungsquelle
4 Beleuchtungsstrahlung
4.1 Beleuchtungsstrahlenbündel
5 Beleuchtungsstrahlengang
6 optischer Modenschalter
7 Abregungsstrahlung
7.1 Abregungsstrahlenbündel
8 Abregungsstrahlengang
9 Fokus
10 Probe
1 1 Strahlteiler
12 strahllenkendes Element
13 strahlbeeinflussendes Element
14 zweite Strahlungsquelle
15 Scaneinheit
16 Steuerungseinheit
17 Demodulator
18 Erfassungseinheit
19 Übertragungselement
20 Detektionsstrahlung
PP Phasenelement
PP_ .1 erstes Phasenelement
PP_ 2 zweites Phasenelement
PP_ 3 drittes Phasenelement
PP_ 4 viertes Phasenelement
EOM elektro-optischer Modulator
AM Airy-Mode
DM Donut-Mode
NM Nullstellen-Mode
G Glas
K/2 λ/2-Bereich

Claims

Patentansprüche
1 . Mikroskopieverfahren, bei dem eine Beleuchtungsstrahlung (4) erzeugt und in einen Fokus (9) gerichtet wird, wobei die Beleuchtungsstrahlung (4) moduliert und zeitlich zwischen mindestens zwei Moden (AM, NM) geschaltet wird, so dass eine Fokusmodulation bewirkt wird, bei der in dem Fokus (9) zeitlich Felder mit voneinander verschiedenen Moden (AM, NM) der
Beleuchtungsstrahlung (4) erzeugt werden, dadurch gekennzeichnet, dass der Fokus (9) mindestens über Bereiche einer zu untersuchenden Probe (10) geführt wird, wobei durch die Beleuchtungsstrahlung (4) in dem Fokus (9) an mindestens einem Ursprungsort eine Detektionsstrahlung (20) in der
Probe (10) bewirkt wird oder bewirkbar ist und die Detektionsstrahlung (20) dem mindestens einen Ursprungsort zugeordnet erfasst wird und zusätzlich zur Beleuchtungsstrahlung (4) mindestens ein Abregungsstrahlenbündel (7.1 ) einer Abregungsstrahlung (7) in den Fokus gerichtet wird, wobei durch die Abregungsstrahlung (7) das Bewirken der Detektionsstrahlung (20) in dem von der Abregungsstrahlung (7) beleuchteten Bereich verhindert wird.
2. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsstrahlung (4) über den Querschnitt des
Beleuchtungsstrahlenbündels (4.1 ) moduliert wird.
3. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsstrahlung (4) und die Abregungsstrahlung (7) mit
voneinander abweichenden räumlichen Verteilungen in den Fokus (9) gerichtet werden.
4. Mikroskopieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokusmodulation in ein STE D-Verfahren integriert ist.
5. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein weiteres Abregungsstrahlenbündel erzeugt, auf Bereiche der zu
untersuchenden Probe (10) gerichtet und Detektionsstrahlung erfasst wird, wobei die Beleuchtung des jeweiligen Probenbereichs mit dem weiteren Abregungsstrahlenbündel zeitlich versetzt nach der Beleuchtung mit dem ersten Abregungsstrahlenbündel erfolgt und der zeitliche Versatz dabei so bemessen ist, dass die Aussendung von Detektionsstrahlung durch die aktuell angeregten Probenbereiche, beispielsweise durch dort angeregte
Fluorophore, bereits abgeklungen ist und nur noch unerwünschte
Detektionsstrahlung von unvollständig abgeregten Probenbereichen und/oder spontan (erneut) angeregten Probenbereichen auftritt.
6. Mikroskopieverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fokusmodulation in ein RESOLFT-Verfahren integriert ist.
7. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass mittels der Fokusmodulation ein mittels der Beleuchtungsstrahlung (4) anregbares Molekül aus einem Grundzustand in einen angeregten Zustand versetzt wird.
8. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass mittels der Fokusmodulation ein mittels der Beleuchtungsstrahlung (4) in den angeregten Zustand versetztes Molekül zur Emission der
Detektionsstrahlung (20) stimuliert wird.
9. Mikroskopieverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass mittels der Fokusmodulation ein mittels der Beleuchtungsstrahlung (4) einstellbarer Aktivierungszustand eines Moleküls eingestellt wird.
10. Mikroskop (1 ) mit einer ersten Strahlungsquelle (3) zur Bereitstellung einer Beleuchtungsstrahlung (4), einem optischen Modenschalter (6) in dem
Beleuchtungsstrahlengang (5) eines Beleuchtungsstrahlenbündels (4.1 ) der Beleuchtungsstrahlung (4) zu deren zeitlichen Modulierung und Schaltung zwischen mindestens zwei Moden (AM, NM), einer Fokussieroptik mit einem Objektiv (2) zur Fokussierung des Beleuchtungsstrahlenbündels (4.1 ) in einen Fokus (9) und einer Erfassungseinheit (18) zur Erfassung einer aus einem Ursprungsort in dem Fokus (9) stammenden Detektionsstrahlung (20) zu einem Erfassungszeitpunkt, dadurch gekennzeichnet, dass das Objektiv (2) zur Fokussierung des
Beleuchtungsstrahlenbündels (4.1 ) in einen Fokus (9) ausgebildet ist, Mittel zur gesteuerten Führung des Fokus (9) mindestens über
Bereiche einer zu untersuchenden Probe (10) vorhanden sind, die Erfassungseinheit (18) zur Zuordnung der zu einem
Erfassungszeitpunkt erfassten Detektionsstrahlung (20) zu einem Ursprungsort der Detektionsstrahlung in der Probe (10) ausgebildet ist und
eine zweite Strahlungsquelle (14) zur Bereitstellung einer Abregungsstrahlung (7) vorhanden ist, wobei die
Abregungsstrahlung (7) zusammen mit der Beleuchtungsstrahlung (4) in den Fokus (9) gerichtet oder in den Fokus (9) richtbar ist.
1 1 . Mikroskop (1 ) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens in einem Abregungsstrahlengang (8) eines Abregungsstrahlenbündels (7.1 ) der Abregungsstrahlung (7) strahllenkende Mittel (12) angeordnet sind, mittels denen das Abregungsstrahlenbündel (7.1 ) in den Fokus (9) gerichtet oder richtbar ist.
12. Mikroskop (1 ) nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Abregungsstrahlengang (7.1 ) mindestens ein strahlbeeinflussendes Mittel (13) angeordnet ist, durch das eine räumliche Verteilung des
Abregungsstrahlenbündels (7.1 ) im Fokus (9) einstellbar ist, wobei die räumliche Verteilung des Abregungsstrahlenbündels (7.1 ) von einer räumlichen Verteilung des Beleuchtungsstrahlenbündels (4.1 ) im Fokus (9) abweicht.
13. Mikroskop (1 ) nach einem der Ansprüche 9 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Strahlungsquelle (14) zur Bereitstellung zirkulär polarisierten Lichts ausgebildet ist.
14. Mikroskop (1 ) nach einem der Ansprüche 1 1 oder 12, dadurch
gekennzeichnet, dass das strahlbeeinflussende Mittel (13) ein
Spiralphasenelement, ein Top-Hat Phasenelement oder ein SLM ist.
15. Mikroskop (1 ) nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der optische Modenschalter (6) ein elektro-optischer Modulator (EOM) und/oder ein Phasenelement (PP) ist.
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