WO2017217887A1 - Тканеинженерный биодеградируемый сосудистый имплант - Google Patents

Тканеинженерный биодеградируемый сосудистый имплант Download PDF

Info

Publication number
WO2017217887A1
WO2017217887A1 PCT/RU2017/000315 RU2017000315W WO2017217887A1 WO 2017217887 A1 WO2017217887 A1 WO 2017217887A1 RU 2017000315 W RU2017000315 W RU 2017000315W WO 2017217887 A1 WO2017217887 A1 WO 2017217887A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tissue
vascular
pcl
polymer
electrospinning
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/000315
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Лариса Валериевна АНТОНОВА
Юлия Александровна КУДРЯВЦЕВА
Леонид Семенович БАРБАРАШ
Ольга Леонидовна БАРБАРАШ
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" (НИИ КПССЗ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" (НИИ КПССЗ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" (НИИ КПССЗ)
Publication of WO2017217887A1 publication Critical patent/WO2017217887A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F2/00—Filters implantable into blood vessels; Prostheses, i.e. artificial substitutes or replacements for parts of the body; Appliances for connecting them with the body; Devices providing patency to, or preventing collapsing of, tubular structures of the body, e.g. stents
    • A61F2/02—Prostheses implantable into the body
    • A61F2/04—Hollow or tubular parts of organs, e.g. bladders, tracheae, bronchi or bile ducts
    • A61F2/06—Blood vessels

Definitions

  • the invention relates to the field of medicine and tissue engineering and can be used in cardiovascular surgery when performing reconstructive operations on the vessels.
  • vascular surgery aimed at creating tissue-engineered vascular grafts "ready to use” that can support cell viability and function in the body.
  • matrices or so-called substrates, from natural or synthetic polymers has already led to significant success in tissue engineering of blood vessels.
  • An important characteristic of such substrates is the porosity of the material, which promotes cell migration, signal transmission, nutrient delivery, and removal of metabolic products.
  • the matrices used provide mechanical support to the cells forming the tissue of the future vessel.
  • Electrospinning makes it possible to obtain nanofibers from a wide variety of materials (polymers, composites, semiconductors, metals, and even ceramics), forming highly porous vascular grafts of different diameters and with different strength characteristics [Hasan A, Memic A, Annabi N et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts.
  • a blood vessel should consist of three layers: a functional endothelium; copper formed by smooth muscle cells; as well as adventitia formed by fibroblasts.
  • biologically active molecules are stimulators of the formation of new tissues in the polymer framework.
  • growth factors have found their application, affecting the functions of fibroblasts, as well as endothelial and smooth muscle cells. Growth factors are able to regulate cell migration, their proliferation, differentiation, apoptosis and dedifferentiation. [Briggs T., Arinzeh TL Growth factor delivery from electrospun materials // J. Biomater. Tissue Eng. - 2011 .-- Vol. 1, Jfe 2. - P. 129-138.].
  • growth factors are unstable and have a short half-life as a result of proteolytic degradation, which makes their introduction into the systemic circulation ineffective and leads to the need for delivery to the tissue regeneration site.
  • a synthetic vascular prosthesis is known, containing biologically active molecules and extracellular matrix proteins, while polylactic acid, a copolymer of polylactic and polyglycoic acid, polycaprolactone, and mixtures thereof are proposed as structure-forming polymers (Appl. US2010 / 0125330 A1: Int. CI. A61F2 / 82 , B05D7 / 00. Synthetic vascular prosthesis and method of preparation / Bronislava G. Belenkaya (US); Edward C. Kwok (US); appl.no. 12/620403, filed 11/17/2009; pub. Date 05/20/2010.) .
  • At least one additional ingredient which can be any vascular growth factors, such as: TGF 1, PDGF-BB and VEGF, any natural component of the extracellular matrix, namely proteins for cell adhesion, proteoglycans, is incorporated into the polymer structure , hyaluronic acid or peptides containing amino acid a sequence that stimulates cell adhesion (e.g., RGD).
  • vascular growth factors such as: TGF 1, PDGF-BB and VEGF
  • any natural component of the extracellular matrix namely proteins for cell adhesion, proteoglycans
  • the disadvantage of this technical solution is the method of manufacturing a prosthesis, in which there is no selective layered introduction of biologically active components (growth factors and extracellular matrix proteins) into the polymer matrices, which prevents the differentiated involvement of progenitor cells in the wall thickness of the polymer structure for subsequent modeling of the vascular wall, by structure close to natural.
  • vascular graft made of bioresorbable polymer compositions with incorporated biologically active molecules in the thickness of the matrix wall
  • the main polymers used are polylactic and polyglycolic acids, polyurethanes, polycaprolactone, polyhydroxyalkanoates, polyanhydrides and their combinations, mixtures or their copolymers.
  • cytokines and chemokines which help to attract cells into the implantation zone from the bloodstream or surrounding tissues. These included the monocytic chemoattractant protein MCP-1, IL- ⁇ and granulocyte colony stimulating factor G-CSF. Moreover, the selected cytokines were previously enclosed in microspheres or capsules and locally introduced into the vascular graft.
  • the disadvantage of the proposed approach is the method of incorporation of biologically active components in the composition of the graft - the dispersion method, which is not able to provide a long and uniform output of these substances into the graft location zone over time.
  • G-CSF Granulocyte colony-stimulating growth factor G-CSF stimulates the proliferation and differentiation of late progenitor cells into neutrophils, which are not only unable to form de novo tissue in place of the polymer scaffold, which is similar in structure to the natural tissue of the vascular wall, but can also stimulate the development of a local inflammatory reaction in graft location zone.
  • the presented vascular graft contains an inner layer made of a biodegradable polyester compound - polyglycerolsebacate (PGS), and an outer shell made of polycaprolactone (PCL) and / or polymers or copolymers of glycoic and lactic acid.
  • PPS biodegradable polyester compound - polyglycerolsebacate
  • PCL polycaprolactone
  • the inner surface of the graft is coated with heparin, and the outer shell is impregnated with any biologically active components that promote tissue regeneration (stem cell growth factor (SCF), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor (TGF ), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), platelet growth factor (PDGF), colony stimulating factor (CSF), insulin-dependent growth factor (IGF), chemoattractant molecules (SDF), extracellular matrix proteins - collagen, elastin, fibronectin, laminin, etc.).
  • tissue regeneration stem cell growth factor (SCF), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor (TGF ), fibroblast growth factor (FGF), epidermal growth factor (EGF), platelet growth factor (PDGF), colony stimulating factor (CSF), insulin-dependent growth factor (IGF), chemoattractant molecules (SDF), extracellular matrix proteins - collagen, elastin, fibronectin, lamin
  • the disadvantage of this method is the lack of selectivity of the introduction into the outer shell of biologically active components and extracellular matrix proteins.
  • the feasibility of using the proposed abundance of growth factors and extracellular matrix proteins is doubtful, since it can lead to uncontrolled tissue regeneration at the site of biodegradable vascular graft and, as a result, undesirable morphological manifestations (mismatch of the normal morphological structure of the vascular wall of the newly formed hyperplasia against the background of similar tissue stimulation, tissue with impaired patency of the vascular graft, etc.).
  • there is no justification for the dose of administered substances which is a very important aspect in stimulating the growth of new tissues and their formation.
  • the technical result of the invention is the creation of a biodegradable polymer tissue-engineered vascular graft corresponding to the layered structure of the vessel wall of a living organism while maintaining the functional activity of biologically active components up to a given period of degradation of the polymer matrix.
  • the technical result is achieved due to the differentiated and layer-by-layer incorporation of biologically active molecules in a given concentration in the manufacture of a porous vascular implant by electrospinning.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • VEGF endothelial progenitor cells Being a chemoattractant for VEGF endothelial progenitor cells, it attracts them from the bloodstream to recreate a monolayer of endothelial cells on the inner surface of biodegradable vascular implants. However, there is no need to incorporate VEGF over the entire thickness of the graft wall.
  • bFGF The main fibroblast growth factor
  • the angiogenic function of bFGF is the ability to stimulate dormant endothelial cells, causing them to proliferate and organize into tubular structures [Yun Y.-R. Fibroblast growth factors: biology, function, and application for tissue regeneration // J. Tissue Eng. - 2010 .-- Vol. 2010. - 218142.].
  • bFGF stimulates the proliferation of smooth muscle cells in the blood vessel wall and contributes to their survival [Kapo M.R.
  • VEGF-A and FGF-2 synergistically promote neoangiogenesis through enhancement of endogenous PDGF-B-PDGFR signaling // Journal of Cell Science. - 2005. - N ° 118. - P. 3759-3768.].
  • SDF-1 is not a growth factor, however, this chemoattractant molecule has pronounced angiogenic activity and helps to attract progenitor cells of mesenchymal origin (MMSC) into the wall of a future vessel. Isoforms of SDF-la and SDF- ⁇ inhibit apoptosis of endothelial cells and stimulate their proliferation and capillary tube formation.
  • the last two biomolecules can help migrate into the thickness of the graft wall and proliferate in it fibroblasts and MMSCs - cells that form new tissue in place of the bioresorbable tubular skeleton.
  • PHBV polyhydroxybutyrate-valerate
  • PCL polycaprolactone
  • the preliminary introduction of growth factors into the solution of the biodegradable polymer allows them to be encapsulated in a polymer fiber and isolated from the environment.
  • the exit of growth factors from this type of matrix is carried out in the process of passive diffusion from the pores penetrating the fiber, as well as as a result of biodegradation of the polymer.
  • VEGF, bFGF, SDF-la Dilution of biologically active components (VEGF, bFGF, SDF-la) was carried out with physiological saline (0.9% Na C1) or phosphate-buffered saline.
  • physiological saline 0.9% Na C1
  • phosphate-buffered saline phosphate-buffered saline.
  • the final concentration of VEGF, bFGF and SDF-la ranged from 12.5 to 500 ng per 1 ml of polymer solution, which corresponds to the effective effect of biologically active molecules with a bioresorption period of polymer fibers of up to 3 years.
  • the choice of this concentration is also due to the need to promptly stimulate cell migration and proliferation in the area of location of vascular grafts, taking into account the decrease in the reparative functions of the human body with age, especially against the background of existing chronic diseases.
  • the resulting polymer solutions in an organic solvent and an aqueous solution of biomolecules were mixed until a suspension was obtained. Being in a polar solvent - water or phosphate buffer, the growth factor molecules do not come into contact with a non-polar solvent and, therefore, do not undergo denaturation.
  • Two-phase electrospinning was carried out in the following mode: the needle voltage was from 15 to 23 kV, the polymer solution feed rate was from 0.3 to 1 ml / h, the collector rotation speed was from 100 to 250 rpm, the distance from the needle to the winding collector is 15 cm, the size of the needle is from 22 to 27G. Under the selected mode, complete polymer fibers with a diameter of up to 500 nm were formed along with the formation of micron-sized filaments.
  • the method is as follows. 2 types of mixtures of a polymer solution on chloroform with biomolecules in a ratio of 20-40: 1 are preliminarily prepared.
  • the mixture jV l includes from 20 to 40 parts of a solution of PGBV / PCL in chloroform and 1 part of VEGF in phosphate-buffered saline or 0.9% solution NaCl in a concentration of 1 to 20 ⁇ g per 1 ml of an aqueous solution, which is equivalent to a final concentration of 12.5 to 500 ng per 1 ml of a polymer solution;
  • a mixture of N »2 consists of 20 - 40 parts of polymer solution in chloroform and 1 part of an aqueous composition comprising a mixture of bFGF and SDF-la from 1 to 20 g of each of the differentiating factor on 1 ml of an aqueous solution, which is equivalent to a final concentration of 12.5 to 500 ng of each differentiation factor per 1 ml of polymer solution, depending on the ratio of the growth factor solution to the polymer solution used.
  • the vascular implant is electroformed using the Nel mixture for 1/3 of the total graft production time, and the remaining 2/3 of the time is performed by two-phase electrospinning with mixture 2.
  • the advantages of the proposed method of incorporating differentiating factors into a biodegradable vascular implant is not only taking into account the specificity of the effect of incorporated bioactive molecules in the context of the layered formation of the future vascular wall on the basis of a temporary biodegradable tubular scaffold, but also a sufficient concentration of VEGF, bFGF and SDF-la activity of the final product after its implantation in the body, despite the long periods of bioresorption (up to 3 years).
  • Example 1 To incorporate VEGF onto the inner surface of a biodegradable vascular graft, mix 1 is prepared, for which a weighed sample of dry polymers based on polyhydroxybutyrate / valerate (PHBV) and polycaprolactone (PCL) is calculated at the rate of 0.5 g PHBV (with the inclusion of 8% oxyvalerate) and 1.0 g of PCL, 10.0 ml of chloroform was added as solvent.
  • PHBV polyhydroxybutyrate / valerate
  • PCL polycaprolactone
  • a mixture 2 is prepared for incorporating bFGF and SDF-la.
  • 10.0 ml of polymer PHBV / PCL solution is prepared previously (description above).
  • 20 ⁇ g of each differentiation factor is taken and added to 0.5 ml of physiological saline (0.9% NaCl).
  • two prepared solutions are mixed on a magnetic stirrer.
  • the resulting ratio of polymer solution to aqueous phase will be 20: 1.
  • the final concentrations of bFGF and SDF-la per 1 ml of the obtained polymer solution are 500 ng.
  • 1/3 of the entire production time of a small diameter vascular graft (1 hour) is electrospinning using mixture 1 in the following mode: the voltage on the needle is 23 kV, the feed rate of the polymer solution is 0.3 ml / h, the rotation speed of the collector is 200 rpm, the distance from the needle to the winding collector is 15 cm, the size of the needle is 27G.
  • Example 2 To incorporate VEGF onto the inner surface of a biodegradable vascular graft, a mixture of 1 is prepared, for which a weight of dry polymers based on
  • a mixture 2 is prepared for incorporating bFGF and SDF-la.
  • 20.0 ml of polymer PHBV / PCL solution (previously described) is pre-prepared.
  • 10 ⁇ g of each differentiation factor is taken and added to 0.5 ml of physiological saline (0.9% NaCl).
  • two prepared solutions (mixture 1 and mixture 2) are mixed on a magnetic stirrer.
  • the resulting ratio of polymer solution to aqueous phase will be 40: 1.
  • the final concentrations of bFGF and SDF-la per 1 ml of the obtained polymer solution are 125 ng.
  • 1/3 of the entire production time of a small diameter vascular graft (1 hour) is electrospinning using mixture 1 in the following mode: the voltage on the needle is 23 kV, the feed rate of the polymer solution is 0.3 ml / h, the rotation speed of the collector is 200 rpm, the distance from the needle to the winding collector is 15 cm, the size of the needle is 27G.
  • the resulting vascular graft has a porous wall structure and consists of two interconnected layers (inner and outer), each of which contains the corresponding components necessary for complete tissue regeneration at the site of the temporary bioresorbable tubular skeleton and the formation of its own vessel.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области медицины и тканевой инженерии и может быть использовано в сердечно-сосудистой хирургии при выполнении реконструктивных операций на сосудах. Предложен тканеинженерный биодеградируемый сосудистый имплант, изготовленный из биодеградируемых полимеров методом электроспиннинга с послойным введением в стенку сосуда биологически активных молекул, таких как - сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста фибробластов (bFGF) и хемоаттрактантная молекула (SDF-1α). При этом полимерная композиция является смесью PGBV/PCL в соотношении 1:2, и растворенная в хлороформе до концентрации 5% PHBV и 10% PCL. Биодеградируемый графт получают при смешивании раствора полимеров с водной частью дифференцировочных молекул до итоговой концентрации последних от 12,5 до 500 нг на 1 мл раствора. Составом, содержащим полимерную композицию с молекулами VEGF, выполняют электроспиннинг в течение 1/3 от общего времени электроформования графта, а 2/3 времени, раствором полимеров с водной фракцией биологически активных молекул - bFGF и SDF-1a. Изготовленный таким образом тканеинженерный графт, соответствует послойному строению стенки сосуда живого организма, при сохранении жизнеспособности и функциональной активности биологически активных компонент до срока деградации полимерного матрикса.

Description

Тканеинженерный биодеградируе ый сосудистый и плант
Изобретение относится к области медицины и тканевой инженерии и может быть использовано в сердечно-сосудистой хирургии при выполнении реконструктивных операций на сосудах.
В последние годы для нужд сосудистой хирургии активно ведутся исследования, направленные на создание «готовых к использованию» тканеинженерных сосудистых графтов, способных поддерживать жизнеспособность и функции клеток в условиях организма. Использование матриксов, или так называемых подложек, из природных или синтетических полимеров уже привело к существенным успехам в тканевой инженерии кровеносных сосудов. Важной характеристикой таких подложек является пористость материала, которая способствует миграции клеток, передаче сигналов, доставке питательных веществ и удалению продуктов метаболизма. Кроме того, используемые матриксы, обеспечивают механическую поддержку клеткам, формирующим ткань будущего сосуда.
На сегодняшний день наиболее перспективным является способ изготовление сосудистых матриксов методом электроформования (электроспиннинг) из биосовместимых биорезорбируемых полимерных композиций. Электроспиннинг позволяет получить нановолокна из самых различных материалов (полимеров, композитов, полупроводников, металлов и даже керамики), формируя высокопористые сосудистые графты разного диаметра и с различными прочностными характеристиками [Hasan A, Memic A, Annabi N et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta Biomater.;W, 11-25 (2014).] Известно, что полноценный тканеин енерный кровеносный сосуд должен состоять из трех слоев: функционального эндотелия; меди, образованной гладкомышечными клетками; а так же адвентиции, сформированной фибробластами. При этом стимуляторами образования новых тканей в полимерном каркасе являются биологически активные молекулы. В тканевой инженерии кровеносных сосудов нашли свое применение ростовые факторы, оказывающие влияние на функции фибробластов, а так же эндотелиальных и гладкомышечных клеток. Ростовые факторы способны регулировать миграцию клеток, их пролиферацию, дифференцировку, апоптоз и дедифференцировку. [Briggs Т., Arinzeh T.L. Growth factor delivery from electrospun materials // J. Biomater. Tissue Eng. - 2011. - Vol. 1, Jfe 2. - P. 129-138.].
Однако ростовые факторы нестабильны и имеют короткий период полураспада в результате протеолитической деградации, что делает неэффективным их введение в системный кровоток и приводит необходимости осуществления доставки в место регенерации тканей.
Известен синтетический сосудистый протез, содержащий биологически активные молекулы и белки внеклеточного матрикса, при этом в качестве структурообразующих полимеров предложено использовать полимолочную кислоту, сополимер полимолочной и полигликоевой кислоты, поликапролактон и их смеси (Appl. US2010/0125330 А1 : Int. CI. A61F2/82, B05D7/00. Synthetic vascular prosthesis and method of preparation / Bronislava G. Belenkaya (US) ; Edward C. Kwok (US); appl. no. 12/620403, filed 11.17.2009 ; pub. date 20.05.2010.). При выполнении электроспиннинга в полимерную конструкцию инкорпорируют, по меньшей мере, один дополнительный ингредиент, которыми могут быть любые сосудистые факторы роста, такие как: TGF 1, PDGF-BB и VEGF, любой природный компонент внеклеточного матрикса, а именно белки для клеточной адгезии, протеогликаны, гиалуроновую кислоту или пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, которая стимулирует клеточную адгезию (например, RGD).
Недостатком данного технического решения является методика изготовления протеза, при которой отсутствует послойное избирательное введении в состав полимерных матриксов биологически активных компонент (ростовых факторов и белков внеклеточного матрикса), что препятствует дифференцированному привлечению клеток предшественников в толщу стенки полимерной конструкции для последующего моделирования сосудистой стенки, по строению близкой к естественной.
Известен сосудистый графт, изготовленный из биорезорбируемых полимерных композиций с инкорпорированными биологически активными молекуами, в толщу стенки матрикса (PCT US2009/030407 ; Int. С1. A61L27/14, A61F2/06. Compositions and methods for promoting patency of vascular grafts / Breuer Chistopher (US), Kryiakides Themis (US), Ron J ason (US) ;assign Yale University (US) Fil. 08.01.2008; Pub. Date 16.07.2009). В качестве основных полимеров используют полимолочную и полигликолевую кислоты, полиуретаны, поликапролактон, полигидроксиалканоаты, полиангидриды и их комбинации, смеси или их сополимеры. Для обеспечения ремоделирования тканей на месте полимерных сосудистых трансплантатов предложено использовать цитокины и хемокины, способствующие привлечению клеток в зону имплантации из кровотока или окружающих тканей. К ним отнесли моноцитарный хемоаттрактантный протеин МСР-1, IL-Ιβ и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор G-CSF. При этом, выбранные цитокины предварительно заключали в микросферы либо капсулы и местно вводили в сосудистый трансплантат.
Недостатком предлагаемого подхода является методика инкорпорировнаия биологически активных компонент в состав графта - метод дисперсии, который не способен обеспечить длительный и равномерный выход данных веществ в зону локации графта во времени.
Помимо этого, использование МСР-1, IL-Ιβ, которые являются
з провоспалительными агентами, может спровоцировать излишнее привлечение к сосудистому графту моноцитарно-макрофагальной фракции, способной стимулировать развитие местной воспалительной реакции и гиперплазии неоинтимы. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор роста G-CSF стимулирует пролиферацию и дифференцировку поздних клеток-предшественников в нейтрофилы, которые не только не способны сформировать на месте полимерного каркаса ткань de novo, близкую по строению к естественной ткани сосудистой стенки, но и могут стимулировать развитие местной воспалительной реакции в зоне локации графта.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению, является двухслойный биодеградируемый сосудистый графт, изготавливаемый методом электроспиннига и введением в полимерный каркас биологически активных веществ (Appl. US2014/0309726 А 1: Int. CI. A61F2/06, A61L27/20, A61L27/54, A61L27/50. Biodegradable vascular grafts / Yadong Wang (US) ; appl. no. 14/6365987, filed 16.06.2014 ; pub. date 16.10.2014.). Представленный сосудистый трансплантат содержит внутренний слой, выполненный из биоразлагаемого полиэфирного соединения - полиглицеролсебаката (PGS), и наружную оболочку, выполненную из поликапролактона (PCL) и/или полимеров или сополимеров гликоевой и молочной кислоты. Для снижения тромбогенных свойств импланта и повышения его биосовместимости, внутреннюю поверхность графта покрывают гепарином, а наружную оболочку пропитывают любыми биологически активным компонент, способствующих регенерации тканей (фактор роста стволовых клеток (SCF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), трансформирующий фактор роста (TGF), фактор роста фибробластов (FGF), эпидермальный фактор роста (EGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), колониестимулирующий фактор (CSF), инсулинзависимый фактор роста (IGF), хемоаттрактантную молекулу (SDF), белки внеклеточного матрикса - коллаген, эластин, фибронектин, ламинин и др.). Недостатком способа является отсутствие избирательности введения во внешнюю оболочку биологически активных компонент и белков внеклеточного матрикса. Целесообразность использования предлагаемого изобилия ростовых факторов и белков внеклеточного матрикса сомнительна, так как может привести к неконтролируемой регенерации тканей на месте биодеградируемого сосудистого графта и, как следствие, нежелательным морфологическим проявлениям (несоответствие вновь образованной на фоне подобной стимуляции ткани нормальному морфологическому строению сосудистой стенки, гиперплазия новообразованной ткани с нарушением проходимости сосудистого графта и прочее). Также отсутствует обоснование дозы вводимых веществ, что является очень важным аспектом при стимуляции роста новых тканей и их формировании.
Техническим результатом изобретения является создание биодеградируемого полимерного тканеинженерного сосудистого графта соответствующего послойному строению стенки сосуда живого организма с сохранением функциональной активности биологически активных компонент до заданного срока деградации полимерного матрикса.
Технический результат достигается, за счет дифференцированного и послойного инкорпорирования биологически активных молекул в заданной концентрации при изготовлении пористого сосудистого импланта методом электроспиннинга.
С учетом механизмов ангиогенеза и стимулирующего влияния ростовых факторов на определенные клетки-предшественники, были выбраны наиболее эффективные комбинации биологически активных компонент [Lee К., Silva Е.А., Mooney D.J. Growth factor delivery-based tissue engineering: general approaches and a review of recent developments // J. R. Soc. Interface. - 2011. - Ns 8. - P. 153-170.]. Так, для стимуляции эндотелизации графтов использовали сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который выступает главным регулятором развития сосудов в эмбриогенезе (васкулогенезе), а так же их формирования во взрослом организме (ангиогенезе). Являясь хемоаттрактантом для эндотелиальных прогениторных клеток VEGF, привлекает их из кровотока для воссоздания монослоя эндотелиальных клеток на внутренней поверхности биодеградитуемых сосудистых имплантов. При этом необходимость инкорпорировать VEGF по всей толще стенки графта отсутствует.
Основной фактор роста фибробластов (bFGF) оказывает влияние на широкий спектр клеток и тканей. Он является митогеном для фибробластов, в результате чего играет значимую роль в процессах ремоделирования тканей и регенерации. Ангиогенная функция bFGF заключается в способности стимулировать покоящиеся эндотелиальные клетки, вызывая их пролиферацию и организацию в трубчатые структуры [Yun Y.-R. Fibroblast growth factors: biology, function, and application for tissue regeneration // J. Tissue Eng. - 2010. - Vol. 2010. - 218142.]. Кроме того, bFGF стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток стенки кровеносного сосуда и способствует их выживанию [Капо M.R. VEGF-A and FGF-2 synergistically promote neoangiogenesis through enhancement of endogenous PDGF-B-PDGFR signaling // Journal of Cell Science. - 2005. - N° 118. - P. 3759-3768.].
SDF-1 не является ростовым фактором, однако данная хемоаттрактантная молекула обладает выраженной ангиогенной активностью и способствует привлечению в стенку будущего сосуда клеток- предшественников мезенхимального происхождения (ММСК). Изоформы SDF-la и SDF-Ιβ препятствуют апоптозу эндотелиальных клеток, стимулируют их пролиферацию и формирование капиллярной трубки.
Таким образом, две последние биомолекулы способны помочь миграции в толщу стенки графта и пролиферации в ней фибробластов и ММСК - клеток, формирующих новую ткань на месте биорезорбируемого трубчатого каркаса.
С учетом особенностей влияния на различные типы клеток VEGF, bFGF и хемоаттрактантной молекулы SDF-la нами разработаны б оригинальные технологии совокупного инкорпорирования данных биомолекул в состав полимерной композиции.
В качестве полимеров для изготовления тканеинженерного матрикса использовали смесь полигидроксибутирата-валерата (PHBV) и поликапролактона (PCL) в соотношении 1 :2, растворенную в хлороформе до получения 5% концентрации PHBV и 10% PCL.
Предварительное введение в раствор биодеградируемого полимера ростовых факторов позволяет инкапсулировать их в полимерное волокно и изолировать от окружающей среды. В таком случае, выход ростовых факторов из такого вида матриксов осуществляется в процессе пассивной диффузии из пор, пронизывающих волокно, а также в результате биодеградации полимера.
Разведение биологически активных компонент (VEGF, bFGF, SDF-la) осуществляли физиологическим раствором (0,9% Na С1) или фосфатно- солевым буфером. При этом, итоговая концентрация VEGF, bFGF и SDF-la составила от 12,5 до 500 нг на 1 мл полимерного раствора, что соответствует эффективному влиянию биологически активных молекул при сроке биорезорбции полимерных волокон до 3 лет. Выбор данной концентрации также обусловлен необходимостью скорейшей стимуляции клеточной миграции и пролиферации в зоне локации сосудистых графтов с учетом снижения репаративных функций человеческого организма с возрастом, особенно на фоне имеющихся хронических заболеваний.
Полученные растворы полимера в органическом растворителе и водного раствора биомолекул смешивали до получения суспензии. Находясь в полярном растворителе - воде или фосфатном буфере, молекулы ростового фактора не контактируют с неполярным растворителем и, следовательно, не подвергаются денатурации.
Двухфазный электроспиннинг проводили при следующем режиме: напряжение на игле - от 15 до 23 kV, скорость подачи раствора полимера - от 0,3 до 1 мл/ч, скорость вращения коллектора - от 100 - 250 rpm, расстояние от иглы до намоточного коллектора - 15 см, размер иглы - от 22 до 27G. При выбранном режиме формировались полноценные волокна полимера диаметром до 500 нм наряду с формированием нитей микронного размера.
Отмечено, что введение в состав полимерных матриксов водной фазы снижало прочность и относительное удлинение графта, но при этом уменьшалась и жесткость изделия. Достоверной разницы в изменении физико-механических свойств сосудистого импланта при использовании долевого соотношения полимерного раствора и водной фазы, содержащей 1 или несколько дифференцировочных факторов, в диапазоне от 20:1 до 40:1 не выявлено, что позволило использовать данные разведения полимера при изготовлении графта (таблица 1).
Таблица 1
Физико-механические свойства сосудистых графтов на основе PHBV/PCL с введением в их состав водной фазы, при различном соотношении
полимерного раствора и водной фазы
Figure imgf000010_0001
Примечание: *- достоверное отличие от аналогичного показателя одноименного графта без включения водной фазы; # - достоверное отличие от аналогичного показателя аутовен.
Способ осуществляют следующим образом. Предварительно подготавливают 2 вида смесей полимерного раствора на хлороформе с биомолекулами в соотношении 20-40: 1.
При этом, смесь jV l включает от 20 до 40 частей раствора PGBV/PCL в хлороформе и 1 часть VEGF в фосфатно-солевом буфере или 0,9% растворе NaCl в концентрации от 1 до 20 мкг на 1 мл водного раствора, что эквивалентно итоговой концентрации от 12,5 до 500 нг на 1 мл полимерного раствора;
Смесь N»2 состоит из 20 - 40 частей раствора полимера в хлороформе и 1 части водной композиции, содержащей смесь bFGF и SDF-la от 1 до 20 мкг каждого дифференцировочного фактора на 1 мл водного раствора, что эквивалентно итоговой концентрации от 12,5 до 500 нг каждого дифференцировочного фактора на 1 мл полимерного раствора в зависимости от используемого соотношения раствора ростовых факторов с полимерным раствором.
После подготовки смесей выполняют электроформование сосудистого импланта с использованием смеси Nel в течение 1/3 от общего времени изготовления графта, а оставшиеся 2/3 времени выполняют двухфазный электроспиннинг со смесью 2.
Преимуществами предлагаемого метода инкорпорирования дифференцировочных факторов в состав биодеградируемого сосудистого импланта является не только учет специфичности действия инкорпорируемых биоактивных молекул в разрезе послойного формирования будущей сосудистой стенки на базе временного биодеградируемого трубчатого каркаса, но и достаточная концентрация VEGF, bFGF и SDF-la, которая позволит сохранить функциональную активность конечного изделия после его имплантации в организм, несмотря на длительные сроки биорезорбции (до 3 лет).
Ниже приведены примеры реализации предложенного способа.
Пример 1. Для инкорпорирования VEGF на внутреннюю поверхность биодеградируемого сосудистого графта, приготавливают смесь 1 , для чего выполняют навеску сухих полимеров на основе полигидроксибутирата/валерата (PHBV) и поликапролактона (PCL) из расчета 0,5г PHBV (с включением оксивалериата 8%) и 1,0г PCL, в качестве растворителя вводят 10,0 мл хлороформа. Для приготовления водного раствора VEGF 20 мкг ростового фактора разводят в 0,5 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) и добавляют к готовому полимерному раствору PHBV/PCL. Получаем соотношение раствора полимера к водной фазе 20:1. Перемешивание ингредиентов выполняют на магнитной мешалке. Итоговая концентрация VEGF на 1 мл полученного полимерного раствора составляет 500 нг.
Одновременно подготавливают смесь 2, предназначенную для инкорпорирования bFGF и SDF-la. Вновь предварительно готовится 10,0 мл полимерного PHBV/PCL раствора (описание выше). Для водного раствора, содержащего bFGF и SDF-la, берется по 20 мкг каждого дифференцировочного фактора и вносится в 0,5 мл физиологического раствора (0,9% NaCl). Затем два приготовленных раствора (смесь 1 и смесь 2) смешивают на магнитной мешалке. Полученное соотношение раствора полимера к водной фазе составит 20:1. Итоговые концентрации bFGF и SDF- la на 1 мл полученного полимерного раствора составляют 500 нг.
Процесс двухфазного электроспиннинга осуществляют в следующем порядке:
Сначала 1/3 от всего времени изготовления сосудистого графта малого диаметра (1 час) электроспиннинг осуществляют, используя смесь 1, в следующем режиме: напряжение на игле - 23 kV, скорость подачи раствора полимера - 0,3 мл/ч, скорость вращения коллектора - 200 rpm, расстояние от иглы до намоточного коллектора - 15 см, размер иглы - 27G.
После чего 2/3 от всего времени изготовления сосудистого графта малого диаметра (2 часа) электроспиннинг осуществляют, используя смесь 2, в следующем режиме: напряжение на игле - 23 kV, скорость подачи раствора полимера - 0,3 мл/ч, скорость вращения коллектора - 200 rpm, расстояние от иглы до намоточного коллектора - 15 см, размер иглы - 27G.
Пример 2. Для инкорпорирования VEGF на внутреннюю поверхность биодеградируемого сосудистого графта, приготавливают смесь 1, для чего выполняют навеску сухих полимеров на основе
ю полигвдроксибутирата/валерата (PHBV) и поликапролактона (PCL) из расчета 1,0г PHBV (с включением оксивалериата 8%) и 2,0г PCL, в качестве растворителя вводят 20,0 мл хлороформа. Для приготовления водного раствора VEGF 10 мкг ростового фактора разводят в 0,5 мл физиологического раствора (0,9% NaCl) и добавляют к готовому полимерному раствору PHBV/PCL. Получаем соотношение раствора полимера к водной фазе 40:1. Перемешивание ингредиентов выполняют на магнитной мешалке. Итоговая концентрация VEGF на 1 мл полученного полимерного раствора составляет 125 нг.
Одновременно подготавливают смесь 2, предназначенную для инкорпорирования bFGF и SDF-la. Вновь предварительно готовится 20,0 мл полимерного PHBV/PCL раствора (описание выше). Для водного раствора, содержащего bFGF и SDF-la, берется по 10 мкг каждого дифференцировочного фактора и вносится в 0,5 мл физиологического раствора (0,9% NaCl). Затем два приготовленных раствора (смесь 1 и смесь 2) смешивают на магнитной мешалке. Полученное соотношение раствора полимера к водной фазе составит 40:1. Итоговые концентрации bFGF и SDF- la на 1 мл полученного полимерного раствора составляют 125 нг.
Процесс двухфазного электроспиннинга осуществляют в следующем порядке:
Сначала 1/3 от всего времени изготовления сосудистого графта малого диаметра (1 час) электроспиннинг осуществляют, используя смесь 1, в следующем режиме: напряжение на игле - 23 kV, скорость подачи раствора полимера - 0,3 мл/ч, скорость вращения коллектора - 200 rpm, расстояние от иглы до намоточного коллектора - 15 см, размер иглы - 27G.
После чего 2/3 от всего времени изготовления сосудистого графта малого диаметра (2 часа) электроспиннинг осуществляют, используя смесь 2, в следующем режиме: напряжение на игле - 23 kV, скорость подачи раствора полимера - 0,3 мл/ч, скорость вращения коллектора - 200 rpm, расстояние от иглы до намоточного коллектора - 15 см, размер иглы - 27G. Таким образом, полученный сосудистый графт имеет пористую структуру стенки и состоит из двух взаимосвязанных слоев (внутреннего и наружного), каждый из которых содержит соответствующие компоненты, необходимые для полноценной регенерации тканей на месте временного биорезорбирумого трубчатого каркаса и формирования собственного сосуда.
В экспериментах in vivo (околосердечная имплантация полимерных матриксов на основе PHBV/PCL, PHBV PCL + VEGF, PHBV/PCL + SFD-la, PHBV/PCL + bFGF сроком на 3 месяца) было выявлено, что имплантация пустых и биофункционализированных полимерных матриксов не вызывала местной воспалительной реакции. Через 3 месяца имплантации в матриксах с VEGF и прилежащих к ним тканях отмечали активный неоангиогенез. Толща PHBV/PCL + bFGF- матриксов была значительно заселена фибробластами и окружена наиболее выраженной соединительнотканной капсулой. В матриксах с инкорпорированным SDF-la наблюдали активную инфильтрацию клетками, синтезирующими внеклеточный матрикс, и неоангиогенез с образованием более крупных кровеносных сосудов относительно всех исследуемых образцов. Таким образом, инкорпорированные молекулы после высвобождения из матрикса проявляли биологическую активность в окружающих тканях в течение всего эксперимента.
Полученные результаты подтверждают биологическую активность инкорпорируемых молекул, в состав биодеградируемого графта для послойного формирования in situ (на месте) ткани de novo (новообразованной).

Claims

Формула изобретения
1. Тканеинженерный биодеградируемый сосудистый имплант, состоящий из полимерного матрикса, изготовленного из биодеградируемых полимеров методом электроспиннинга и включающий послойное введение биологически активных молекул, таких как - сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фактор роста фибробластов (bFGF) и хемоаттрактантная молекула (SDF-l a), отличающийся тем, что во внутренний слой импланта инкорпорируют эндотелиальный фактор роста (VEGF), смешивая водный раствор, содержащий молекулы VEGF в концентрации от 1 мкг до 20 мкг на 1 мл раствора, с полимерной композицией на основе PGBV/PCL до соотношения частей в диапазоне от 20: 1 до 40: 1 , и выполняя электроспиннинг полученным составом в течение 1 /3 от общего времени электроформования графта; а в наружный слой импланта инкорпорируют фактор роста фибробластов (bFGF) и хемоаттрактантную молекулу (SDF- l a), для чего смешивают полимерную композицию на основе PGBV/PCL с водной фракцией биологически активных молекул bFGF и SDF-l a, где на 1 мл водного раствора приходится от 1 мкг до 20 мкг каждой из дифференцировочных молекул, и продолжают электроспиннинг течение 2/3 оставшегося времени электроформования.
2. Тканеинженерный сосудистый имплант по п. 1 , отличается тем, что в состав полимерной композиции входит смесь полигидроксибутирата- валерата (PHBV) и поликапролактона (PCL) в соотношении 1 :2, растворенные в хлороформе до концентрации 5% PHBV и 10% PCL.
3. Тканеинженерный сосудистый имплант по п. 1 , отличающийся тем, что итоговая концентрация каждой из дифференцировочных молекул на 1 мл полимерного раствора составляет от 12,5 до 500 нг.
13
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2017/000315 2016-06-14 2017-05-17 Тканеинженерный биодеградируемый сосудистый имплант WO2017217887A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2016123645A RU2642259C2 (ru) 2016-06-14 2016-06-14 Тканеинженерный биодеградируемый сосудистый имплант
RU2016123645 2016-06-14

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017217887A1 true WO2017217887A1 (ru) 2017-12-21

Family

ID=60664117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/000315 WO2017217887A1 (ru) 2016-06-14 2017-05-17 Тканеинженерный биодеградируемый сосудистый имплант

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2642259C2 (ru)
WO (1) WO2017217887A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111714248A (zh) * 2020-05-08 2020-09-29 南开大学 一种促进细胞快速增殖及促进其细胞外基质沉积的血管支架及脱细胞基质人工血管

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2702239C1 (ru) * 2019-06-25 2019-10-07 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" (НИИ КПССЗ) Технология изготовления функционально активных биодеградируемых сосудистых протезов малого диаметра с лекарственным покрытием

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014081345A1 (ru) * 2012-11-21 2014-05-30 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Научно-Исследовательский Институт Комплексных Проблем Сердечно-Сосудистых Заболеваний" Со Рамн Способ изготовления биорезорбируемого гибридного сосудистого импланта малого диаметра
US20140309726A1 (en) * 2011-12-22 2014-10-16 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Biodegradable vascular grafts
WO2016205462A1 (en) * 2015-06-19 2016-12-22 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Biodegradable vascular grafts

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140309726A1 (en) * 2011-12-22 2014-10-16 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Biodegradable vascular grafts
WO2014081345A1 (ru) * 2012-11-21 2014-05-30 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Научно-Исследовательский Институт Комплексных Проблем Сердечно-Сосудистых Заболеваний" Со Рамн Способ изготовления биорезорбируемого гибридного сосудистого импланта малого диаметра
WO2016205462A1 (en) * 2015-06-19 2016-12-22 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Biodegradable vascular grafts

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111714248A (zh) * 2020-05-08 2020-09-29 南开大学 一种促进细胞快速增殖及促进其细胞外基质沉积的血管支架及脱细胞基质人工血管

Also Published As

Publication number Publication date
RU2016123645A (ru) 2017-12-19
RU2642259C2 (ru) 2018-01-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fahimipour et al. 3D printed TCP-based scaffold incorporating VEGF-loaded PLGA microspheres for craniofacial tissue engineering
Sperling et al. Advantages and challenges offered by biofunctional core–shell fiber systems for tissue engineering and drug delivery
De Witte et al. Bone tissue engineering via growth factor delivery: from scaffolds to complex matrices
Wang et al. Functional modification of electrospun poly (ε-caprolactone) vascular grafts with the fusion protein VEGF–HGFI enhanced vascular regeneration
Yahia et al. Sandwich-like nanofibrous scaffolds for bone tissue regeneration
Cheng et al. Promoting osteogenic differentiation in pre-osteoblasts and reducing tibial fracture healing time using functional nanofibers
Garcia Garcia et al. Poly (ε-caprolactone)/hydroxyapatite 3D honeycomb scaffolds for a cellular microenvironment adapted to maxillofacial bone reconstruction
Wang et al. Effect of electrospun silk fibroin–silk sericin films on macrophage polarization and vascularization
Li et al. Functional microspheres for tissue regeneration
Zhan et al. The review on electrospun gelatin fiber scaffold
EP2897659B1 (en) New scaffold for cardiac patch
Ziemba et al. Coating topologically complex electrospun fibers with nanothin silk fibroin enhances neurite outgrowth in vitro
Zhang et al. Bilayer membrane composed of mineralized collagen and chitosan cast film coated with berberine-loaded PCL/PVP electrospun nanofiber promotes bone regeneration
Mi et al. Three-dimensional electrodeposition of calcium phosphates on porous nanofibrous scaffolds and their controlled release of calcium for bone regeneration
Keshaw et al. Assessment of polymer/bioactive glass-composite microporous spheres for tissue regeneration applications
Kanmaz et al. Electrospun polylactic acid based nanofibers for biomedical applications
Ladd et al. Electrospun nanofibers in tissue engineering
US11147901B1 (en) Method for repairing living tissue with a hollow fiber scaffold
Zhang et al. Poly-ε-caprolactone/Whitlockite electrospun bionic membrane with an osteogenic–angiogenic coupling effect for periosteal regeneration
Ryu et al. Synergistic effect of porous hydroxyapatite scaffolds combined with bioactive glass/poly (lactic-co-glycolic acid) composite fibers promotes osteogenic activity and bioactivity
RU2504406C1 (ru) Способ изготовления биорезорбируемого гибридного сосудистого импланта малого диаметра
Zhao et al. Electrospun nanofibers for bone regeneration: from biomimetic composition, structure to function
Nan et al. Tantalum and magnesium nanoparticles enhance the biomimetic properties and osteo-angiogenic effects of PCL membranes
RU2642259C2 (ru) Тканеинженерный биодеградируемый сосудистый имплант
Zhu et al. Interactions at engineered graft–tissue interfaces: A review

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17813672

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17813672

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1