WO2017209426A1 - Fam188b의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 항암 또는 항암보조제 조성물 - Google Patents

Fam188b의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 항암 또는 항암보조제 조성물 Download PDF

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fam188b
cancer
protein
gene
expression level
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고성호
국명철
김영우
최은석
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국립암센터
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • the present invention relates to an anticancer or anticancer adjuvant composition
  • an anticancer or anticancer adjuvant composition comprising an expression inhibitor or an activity inhibitor of FAM188B (family with sequence similarity 188 member B).
  • the ubiquitin-proteasome system is a key protein that is highly efficient at the level of post-translational regulation of the gene into proteins. It is known as a stability regulator. Ubiquitylation is caused by the chain action of E1 (ubiquitin activation), E2 (ubiquitin binding), and E3 (ubiquitin binding), and various combinations of these three ubiquitin enzymes result in specific ubiquitination for various proteins.
  • the de-ubiquitination mechanism which removes ubiquitin from proteins, is caused by a protein called de-ubiquitinase (ubiquitin isopeptidase), which has 98 species in all six strains.
  • the protein ubiquitination of p53 protein is MDM2.
  • one protein de-ubiquitination is USP7 (HAUSP).
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising an inhibitor or activity inhibitor of FAM188B (family with sequence similarity 188 member B) as an active ingredient.
  • FAM188B family with sequence similarity 188 member B
  • Still another object of the present invention is to provide an anticancer adjuvant composition
  • an anticancer adjuvant composition comprising an inhibitor or an activity inhibitor of FAM188B (family with sequence similarity 188 member B) as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing cancer, including an agent for measuring the expression level of FAM188B (family with sequence similarity 188 member B) gene or the expression level of protein.
  • FAM188B family with sequence similarity 188 member B
  • Still another object of the present invention is to measure the expression level of FAM188B (family with sequence similarity 188 member B) gene or protein expression from biological samples isolated from cancer patients; And it provides a method for providing information for diagnosing cancer and predicting prognosis, comprising the step of comparing the expression level with a reference value obtained from a control sample.
  • FAM188B family with sequence similarity 188 member B
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising an inhibitor or activity inhibitor of FAM188B (family with sequence similarity 188 member B) as an active ingredient.
  • FAM188B family with sequence similarity 188 member B
  • FAM188B is a family with sequence similarity 188 member B.
  • the mRNA sequence (cDNA) for the gene is SEQ ID NO: 1 (NM_032222), and the amino acid sequence encoded by the gene is SEQ ID NO: 2 (NP_115598). It may be as described.
  • the expression inhibitor is composed of an antisense oligonucleotide, siRNA (small interfering RNA), shRNA (Short Hairpin RNA) and ribozyme complementary to the mRNA of the FAM188B gene It is any one selected from the group, but is not limited thereto.
  • the siRNA complementarily binding to the mRNA of the FAM188B gene may be a siRNA complementary to the base sequence consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 (2219 to 2240 nt of NM_032222). have.
  • siRNA is "small interfering RNA", which is a kind of RNA involved in RNA interference.
  • siRNA regulates the expression of genes by binding complementarily to mRNA and preventing the mRNA from being encoded into a protein.
  • the inventors carried out experiments using siRNA complementarily binding to the nucleotide sequence of the FAN188B gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the activity inhibitor is any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, matrix analogs, aptamers and antibodies specifically binding to the protein encoded by the FAM188B gene But is not limited thereto.
  • the antibody specifically binding to the protein encoded by the FAM188B gene may be an antibody prepared using an antigen consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • expression of a protein refers to a protein encoded by mRNA
  • activity of a protein refers to a structure capable of functioning of a protein by phosphorylation or other structural change.
  • antibody refers to an antibody having a specific structure capable of binding with FAM188B as an antigen, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antigen consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 means an amino acid sequence recognized by the antigen-binding site in the antibody, the inventors produced an antibody using the antigen of SEQ ID NO: 4, the antibody is specific for the FAM188B protein May bind to and inhibit the activity of the FAM188B protein.
  • the cancer is gastric cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head cancer, head and neck cancer, melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, colon cancer, small intestine cancer , Rectal cancer, cervical cancer, bladder cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocyte lymphoma, kidney cancer, hematologic cancer and brain cancer may be any one selected from the group consisting of.
  • the present invention also provides an anticancer adjuvant composition
  • an anticancer adjuvant composition comprising an inhibitor or an activity inhibitor of FAM188B (family with sequence similarity 188 member B) as an active ingredient.
  • anticancer adjuvant of the present invention may be used to enhance the anticancer effect of an anticancer agent, to suppress or ameliorate the side effects of an anticancer agent, and may be administered to a patient in combination with an anticancer agent.
  • the anticancer agent is preferably etoposide, cisplatin or methyl methane-sulfonate, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for predicting anticancer drug resistance comprising measuring the expression level of the FAM188B (family with sequence similarity 188 member B) gene or the expression level of a protein present in a biological sample isolated from a cancer patient.
  • FAM188B family with sequence similarity 188 member B
  • the expression level of the FAM188B gene may be measured by RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) or qRT-PCR (Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction).
  • the expression level of the FAM188B protein may be measured by Western blot, immunoblot or immunocytochemistry.
  • the method may further comprise the step of determining that the resistance to the anticancer agent is higher when the expression level of the FAM188B gene or the protein expression level is higher than the control group.
  • the biological sample may be any one selected from the group consisting of tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva and urine.
  • the present invention also provides a composition for diagnosing cancer, which comprises an agent for measuring the expression level of FAM188B (family with sequence similarity 188 member B) gene or the expression level of protein.
  • FAM188B family with sequence similarity 188 member B
  • the agent for measuring the expression level of the FAM188B gene may be a primer or probe complementary to the mRNA for the gene.
  • the agent for measuring the expression level of the FAM188B protein may be an antibody that specifically binds to the protein.
  • the present invention comprises the steps of measuring the expression of the FAM188B (family with sequence similarity 188 member B) gene or protein expression from biological samples isolated from cancer patients; And it provides an information providing method for cancer diagnosis and prognosis prediction comprising the step of comparing the expression level with a reference value obtained from a control sample.
  • FAM188B family with sequence similarity 188 member B
  • if the expression level of the FAM188B gene or the expression level of the protein is higher than the reference value may be to further add a step of determining that the likelihood of the cancer is likely to be high or the prognosis is not good. have.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering an expression inhibitor or an activity inhibitor of FAM188B to a cancer-causing subject.
  • the expression inhibitor is a group consisting of antisense oligonucleotides, siRNA (small interfering RNA), shRNA (Short Hairpin RNA) and ribozyme complementary to the mRNA of the FAM188B gene It may be any one selected from.
  • the activity inhibitor is any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, matrix analogs, aptamers and antibodies specifically binding to the protein encoded by the FAM188B gene Can be.
  • the cancer is gastric cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head cancer, head and neck cancer, melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, colon cancer, small intestine cancer , Rectal cancer, cervical cancer, bladder cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocyte lymphoma, kidney cancer, hematologic cancer and brain cancer may be any one selected from the group consisting of.
  • the method of treating cancer of the present invention comprises administering to a subject a therapeutically effective amount of an inhibitor of expression or activity of FAM188B.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular individual can be determined by the specific composition, including the type and severity of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health, sex and diet, time of administration, It is desirable to apply differently depending on the route of administration and the rate of release of the composition, the duration of treatment, and the various factors and similar factors well known in the medical arts, including drugs used with or concurrent with the specific composition. Therefore, the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the above matters.
  • the subject is applicable to any mammal, and the mammal includes humans and primates, as well as domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs, and cats.
  • Figure 2 (a) siRNA treatment to the AGS cell line to determine the effect of FAM188B down-regulation of the expression of FAM188B mRNA by qRT-PCR, (b) is the FAM188B protein in Western blot under the same conditions (a) The expression level of is measured. In this case, FAM188B downregulation was confirmed at 24 hours, 48 hours, 72 hours and 96 hours after siRNA transduction. (c) shows microscopic analysis showing that siFAM188B-treated cells had slower cell proliferation than NC siRNA-treated cells. (d) shows the results of cell cycle analysis in NC siRNA-treated cells and siFAM188B-treated AGS cells by flow cytometry.
  • Figure 3 is a FAG188B-interacting protein immunoprecipitated with FLAG-tagged FAM188B confirmed by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis), LC / MS-MS (liquid chromatography / tandem mass-spectrometry ).
  • the interaction protein was searched by String-DB, an "Evidence View” was made, and the arrow represents the interaction protein identified by immunoprecipitation.
  • (c) confirms p53 binding to FAM188B in HEK-293 cells, and
  • (d) confirms p53 binding to FAM188B in HCT-116 cells.
  • (e) shows the results of confirming CDC73 and CTR9 complexes of Paf1 (pol II association factor).
  • Figure 5 shows FAM188B "High” (left panel) and “Low” (right panel) as a result of analysis by immunohistochemistry in gastric cancer tissue.
  • Figure 6 shows the effect of FAM188B in the stressor condition, (a) confirms the nuclear position of p53 at 0 hours, 24 hours and 48 hours under serum starvation conditions in HCT-116 cells. (b) examined the protein expression levels of FAM188B and p53 under serum starvation conditions. (c) measured cell survival (%) after treatment with low concentrations of etoposide (0.5 ⁇ M) and cisplatin (5 ⁇ M) in NC siRNA-treated and siFAM188B-treated cells (* P ⁇ 0.05). Cell viability was measured from three independent experiments and expressed as standard error of the mean (SEM).
  • FIG. 1 shows the hypothesis of FAM188B action under normal and stress conditions, where FAM188B blocks DUB for p53 deubiquitination and p53 blocks proteosome degradation pathway in order to maintain proliferation at steady state. Going through. Under stress conditions, FAM188B decreases, and DUB is released from FAM188B so that deubiquitinated p53 is located in the nucleus and activates apoptosis genes. In tumors, however, elevated FAM188B allows cells to tolerate stress conditions such as DNA damaging drugs.
  • siRNA treatment of HCT-116 cells results in the expression of mRNA by qRT-PCR. The amount was measured, and (b) is a Western blot to measure the expression level of the protein. In this case FAM188B downregulation was confirmed at 24 hours, 28 hours, 72 hours and 96 hours after siRNA transduction.
  • (c) shows microscopic analysis showing that siFAM188B-treated cells had slower cell proliferation than NC siRNA-treated cells.
  • (d) shows the results of cell cycle analysis in NC siRNA-treated cells and siFAM188B-treated HCT-116 cells by flow cytometry.
  • FAM188B protein is reduced by treatment of siFAM188B (or NC siRNA) to colon cancer cell lines HCT-116 cells and HCT-116 p53 ⁇ / ⁇ cells, gastric cancer cell lines AGS cells and SNU-638 cells, Expression of proteins related to cell growth and cell proliferation (beta-catenin, FoxM1 and Cyclin D1) is analyzed by Western blotting.
  • siFAM188B or NC siRNA
  • Human cell lines were purchased from ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) or Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). All cells were 37 ° C. using designated cultures (Corning, Manassas, VA, USA) containing 10% FBS (fetal bovine serum, Corning) and 1 ⁇ Phenylcillin-Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). , Incubated in a 5% CO2 incubator.
  • FBS fetal bovine serum, Corning
  • Phenylcillin-Streptomycin Invitrogen, Carlsbad, CA, USA.
  • FAM188B family with sequence similarity 188 member B
  • FAM188B family with sequence similarity 188 member B
  • a hemocyanin-binding peptide having an antigenically predicted sequence as well as specific for the C-terminus of the FAM188B protein
  • Serum isolated by peptide-affinity chromatography was used for immunoblot by diluting 1: 1,000 in 5% skim milk / 1x Tri-buffered saline (TBS) buffer.
  • FLAG M2 FLAG M2
  • ⁇ -actin A1978
  • PUMA # 4976, P53 Up-Regulated Modulator Of Apoptosis
  • HAUSP USP7
  • p21 # 2947
  • BAX # 2772, BCL2-Associated X Protein
  • PARP # 9542, Poly (ADP-Ribose) Polymerase
  • CTR9 (ab84487) was purchased from Abcam (Cambridge, UK), p53 (DO-1) (sc-126), phospho-p53 (ser15) (sc-101762) and ⁇ -tubulin (sc-8035) were Santa Purchased from Cruz Biotechnology (Dallas, TX).
  • Immunoprecipitation of the interacting protein of FAM188B was carried out with 10 ⁇ g of pFLAG-FAM188B plasmid and then used 1.5 ⁇ 10 6 cells of HEK-293 cells incubated for 48 hours, and 40 ⁇ g of anti-FLAG-M2 agarose affinity gel (Sigma-Aldrich) was used.
  • the analysis was performed using an LTQ XL TM linear ion trap mass spectrometer (MS) system (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA). All MS / MS samples were analyzed using Proteome Discover software (version v.1.4; Thermo Fisher Scientific) to search the Uniprot_sprot database and the International Protein Index (IPI) human database.
  • MS LTQ XL TM linear ion trap mass spectrometer
  • FAM188B was inhibited in AGS gastric cancer cells and HCT-116 colon cancer cells transduced with FAM188B-specific siFAM188B (SI04333014, Qiagen).
  • Allstar negative control siRNA NC siRNA, # 1027281, Qiagen
  • Cells inoculated in 6-well culture plates (8 ⁇ 10 4 cells / well) were transduced with 5 nM siRAM188B or NC siRNA using HiPerfect transfection reagent (Qiagen).
  • the cell cycle was analyzed by flow cytometry after staining cells transduced with siFAM188B or siFAM188B expression vectors with PI (propidium iodide, P4170, Sigma-Aldrich). Nuclear fragmentation in siRNA-treated cells stained with Hoechst33342 (Sigma-Aldrich) was observed by confocal microscopy at 400 ⁇ magnification.
  • Annexin V assay for the identification of apoptosis groups was performed using BD FITC annexin V apoptosis detection kit I (# 556547, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA).
  • Cell proliferation assays inoculate 5 ⁇ 10 3 cells / well of cell numbers in 96-well plates, and at the indicated concentrations of cisplatin (cisplatin, Calbiochem, San Diego, CA) or etoposide (Sigma-Aldrich). ) was processed. After incubation for 72 hours, the cells were washed, and then 100 ⁇ L of MTT ([3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide, 0.5 mg / mL) was added thereto, and 37 ° C and 5 It was left for 2 hours in a% CO2 incubator. Absorbance was measured at 540 nm using a VersaMax TM Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif., USA).
  • Dual luciferase assay (E1910, Promega) was performed according to the manufacturer's protocol. Briefly, HCT-116 cells were transduced with a final concentration of 5 nM NC siRNA or siFAM188B with pGL2-p21- luc (Addgene, Cambridge, Mass.) And pGL4.70 hRluc (Promega) plasmid. After 24 and 48 hours, cells were collected and washed twice with cold 1x PBS (phosphate-buffered saline) and lysed using passive lysis buffer. The lysate was added to the layered LARII solution at the bottom of the 96-well plate. Then, a second measurement of Renilla luciferase activity was performed by adding the Stop & Go solution. All measurements were done using Victor3 reader (Perkin Elmer, Waltham, Mass., USA).
  • ChIP assays were performed using HCT-116 cells transduced with 5 nM final concentration of NC siRNA or siFAM188B and incubated for 48 hours. Cells were fixed by treatment with 1 ⁇ PBS and 1% formaldehyde at 37 ° C. for 10 minutes, and finished with glycine at a final concentration of 0.125 M. Fixed cells were lysed with Igepal CA630 (I8896, Sigma-Aldrich) containing Lysis buffer and centrifuged for 5 min at 2,500 x g to collect nuclei. The collected nuclei were sonicated for 7.5 minutes (0.5 minute on, 1 minute off cycle) using a Bioruptor sonicator (Diagenode, Denville, NJ, USA).
  • Segmented genomic DNA was in turn immunoprecipitated using protein A / G agarose beads (Santacruz Biotech) and anti-p53 antibody (DO-1). Immunoprecipitated DNA was isolated by phenol / chloroform / isoamyl alcohol extraction. Amplification of the BAX and PUMA genes was performed by p53-RE primers (Laptenko O, Beckerman R, Freulich E, Prives C. p53 binding to nucleosomes within the p21 promoter in vivo leads to nucleosome loss and transcriptional activation.Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108 : 10385-10390) and SYBR green master mix were performed on an LC480 real-time PCR machine (Roche). Amplification signals from immunoprecipitation were normalized to control DNA.
  • Paraffin-immobilized tissue from 107 patients was used to analyze the relationship between FAM188B expression and clinicopathological characteristics. Samples were obtained from patients enrolled in clinical trials undergoing gastrectomy surgery as stages 2 to 3 of the National Cancer Center and evaluating the effectiveness of adjuvant chemotherapy. Thus, all patients were treated with the same procedure and their clinicopathological features were randomly distributed.
  • TMA tissue microarray
  • TMA blocks were cut to 3 ⁇ m thickness and immunostained FAM188B using an automated staining instrument (BenchMark XT, Ventana, Arlington, AZ).
  • the immunoreactive protein was identified as FAM188B rabbit polyclonal antibody (HPA030130, Atlas Antibodies AB, Sweden) and DAB (3,3'-), a horseradish peroxidase (HRP) substrate for 8 minutes using the UltraView Universal DAB kit (Ventana). diaminobenzidine tetrahydrochloride) and counterstained with hematoxylin.
  • Staining intensity is defined as follows: 0, no signal or ⁇ 10% positive tumor cells; 1, visible but weak signal at 100x power; 2, clear signal at 100x power; And 3, apparent signal at 40 ⁇ power.
  • the percentage of benign tumor cells was determined as follows: 0, none; 1, ⁇ 10%; 2, 10-50%; 3, 50-90%; And 4,> 90%. To obtain a total score, the staining intensity and the percentage value were multiplied, and the expression level of FAM188B was divided into two groups, 'Low' expression (score ⁇ 4) and 'High' expression (score ⁇ 5).
  • Phylogeny.fr robust phylogenetic analysis for The phlogram using the non-specialist.Nucleic Acids Res 2008; 36 (Web Server Issue): W465-W469) was determined by P. abelii in human FAM188B .
  • the orangutan FAM188B protein was found to be the most relevant, and the cow FAM188B protein was also related to (Fig. 7b).
  • the 3'UTR (untranslated region) sequence of FAM188B mRNA was examined and found to have a poly (A) signal (FIG. 7C).
  • FAM188B FAM188B in tumor tissues
  • 75 patients with gastric cancer were subjected to qRT-PCR and immunoblot, and in fold changes from tumor / normal to mRNA and protein expression levels.
  • FAM188B expression was increased.
  • t- test showed a significant difference.
  • qRT-PCR was performed in several cancer cell lines and non-cancer cell lines (FIG.
  • FAM188B mRNA expression was detected in all samples tested, and expression levels varied from sample to sample.
  • a C-terminal specific polyclonal antibody against FAM188B was made and used to examine cell lines by Western blot. This assay confirmed the expression of FAM188B in all cell lines tested (FIG. 1D).
  • the sub-G0 / G1 cell population was significantly increased in siFAM188B-treated HCT-116 cells, with 29.28-40.34% of cells belonging to the sub-G0 / G1 cell population compared to 1% in NC siRNA-treated cells (FIG. 8D).
  • Microscopic analysis of siRNA-treated cells showed increased nuclei fragmentation in AGS (FIG. 2E) and HCT-116 (FIG. 8E).
  • Annexin V assay showed increased numbers of killed cells in siRNA-treated AGS cells (FIG. 2F) and HCT-116 cells (FIG. 8F) as compared to NC siRNA-treated cells.
  • FAM188B binding partner In order to investigate the mechanism involved in FAM188B in cell death, a potential FAM188B binding partner was investigated.
  • a FLAG-tagged FAM188B expression construct was made and transduced with HEK-293 cells.
  • the FLAG-tagged FAM188B protein with binding protein was down by immunoprecipitation, and the isolated protein was analyzed by liquid chromatography / tandem mass-spectrometry (LC / MS-MS) (FIG. 3A). Mass peak from MS search for database identified 104 proteins bound to FAM188B.
  • the protein is a DAVID server (Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources.Nature Protoc) to collect proteins according to their association in biological processes and evidence-related interaction groups. 2009; 41: 44-57) and String-DB (Szklarczyk D, Franceschini A, Wyder S, Forslund K, Heller D, Huerta-Cepas J, Simonovic M, Roth A, Santos A, Tsafou KP, Kuhn M, Bork. P, Jensen LJ et al .
  • DAVID server Human DW, Sherman BT, Lempicki RA.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources.Nature Protoc
  • p53 and CDC73 / CTR9 were cross-immunoprecipitated with FLAG-tagged FAM188B protein and their binding was confirmed by immunoblotting (FIG. 3C).
  • p53 protein was identified by immunoprecipitation from FAM188B-overexpression (FIG. 3C) and epitope-treated HCT-116 / p53 wt cells (FIG. 3D).
  • FAM188B protein precipitated not only CTR9 but also CDC73 (FIG. 3E).
  • FAM188B downregulation activates p53 and enhances downstream signaling.
  • p53 increased migration to the nucleus with increasing siRNA treatment time (FIG. 4A).
  • An immunoblot for cytoplasmic and nuclear fractions of siRNA-treated cells revealed an increase in p53 of the nucleus (FIG. 4A).
  • the phosphorylated and stable p53 at Ser15 and its downstream target, p21 were increased by siFAM188B treatment.
  • BAX and PUMA were induced at 48 hours in siRNA-treated cells (FIG. 4B).
  • the promoter-reporter construct was used to confirm that siFAM188B treatment increased the transcriptional activity of p53 and the downstream target p21 by twofold (FIG. 4C). Moreover, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays in siFAM188B-treated cells showed that p53 increased binding to the BAX and PUMA promoters (FIG. 4D).
  • ChoIP chromatin immunoprecipitation
  • FAM188B-interacting protein revealed by LC / MS-MS, focusing on protein motifs and domains in the FAM188B protein sequence that appear to regulate p53 Matched. Since FAM188B interacts with p53, several p53-interacting proteins were tested.
  • ubiquitin-specific protein 7 (USP7), a deubiquitinase, was identified as FAM188B-binding protein (Table 1).
  • “Eukaryotic Linear Motif resources” (Dinkel H, Van Roey K, Michael S, Kumar M, Uyar B, Altenberg B, Milchevskaya V, Schneider M, Kuhn H,), which can predict protein domain sites online, Behrendt A, Dahl SL, Damerell V, Diebel S et al.ELM 2016-data update and new functionality of the eukaryotic linear motif resource.Nucleic Acids Res 2016; 44 (D1): D294-300) of the USP7 binding motif to FAM188B. It was expected to exist.
  • USP7 protein identified in FAM188B immunoprecipitation was increased by FAM188B overexpression and decreased by FAM188B knockdown when identified in p53 immunoprecipitation (FIG. 4E). Since USP7 is involved in the deubiquitination of p53, the ubiquitination pattern of p53 was compared after co-transduction of the ubiquitin expression structure with p53 expression structure and NC siRNA or siFAM188B. SiFAM188B treatment reduced p53 ubiquitination, despite a slight increase in p53 expression in lanes in siFAM188B-treated conditions when compared to NC siRNA treatment conditions (FIG. 4F).
  • FAM188B has been shown to regulate p53 stabilization.
  • FAM188B protein was analyzed in gastric cancer lesions of 107 gastric cancer patients (Table 2).
  • the fundic glands were strong and clear, with moderately weak signals in the pyloric glands, foveolar epithelium and intestinal metaplasia.
  • the staining pattern was mainly cytoplasmic and by luminal surface staining. Representative immunostaining images shown at "high” and "low” in gastric cancer are shown in FIG. 5A.
  • FAM188B expression can be used as a predictive marker of chemotherapeutic effect.
  • FAM188B inhibits p53 activity by interfering with deubiquitination of p53.
  • FAM188B inhibits p53 activity by interfering with deubiquitination of p53.
  • p53 was found to be activated by deubiquitination and moved to the nucleus to activate downstream genes (FIG. 6D).
  • the present inventors conducted an experiment to analyze the role of FAM188B involved in tumorigenic signaling in colorectal cancer and gastric cancer cells by suppressing FAM188B expression, and for this, HCT-116 cells and HCT-116 p53- /
  • FAM188B protein was reduced by treatment of siFAM188B to cells, gastric cancer cell lines AGS cells and SNU-638 cells, the expression levels of proteins related to cell growth and cell proliferation were analyzed by Western blotting.
  • FAM188B contributes to tumor formation by controlling the expression levels of beta-catenin, FOXM1 and cyclin D1 in colorectal cancer cells and gastric cancer cells, and it was confirmed that tumor treatment is possible through FAM188B inhibitors.

Abstract

본 발명은 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 상기 유전자에 대한 mRNA 발현량 또는 단백질 발현량을 억제함으로써 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

FAM188B의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 항암 또는 항암보조제 조성물
본 발명은 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 포함하는 항암 또는 항암보조제 조성물에 관한 것이다.
인간의 유전체 정보는 지난 30여년간 연구되고 조사되고 있으며, 이와 더불어 암의 복잡한 발암기전을 이해하기 위해 The Cancer Genome Atlas 등의 노력을 통해, 많은 종류의 암에 대한 유전체 및 전사체 정보를 수집하고 분석하는 작업이 수행되고 있다. 그런데, 이렇게 방대한 양의 전사체 정보가 축적되어 각각의 유전자에 대해 동정한 주석이 달리고 있음에도 불구하고, 59% 정도에 해당하는 유전자는 아직 유전자의 구성요소만 갖춘 “가상의 유전자 (hypothetical gene)”로 혹은 “기능이 알려져 있지 않은 유전자 (gene of unknown function)”로 기재되어 있다. 이러한 기재상의 불분명함으로 인하여 암에서 그 발현이 현저하게 증가되어 있음에도 불구하고 발암기전에 대한 기여도 및 그 기능에 대한 연구는 원활하게 이루어 지지 않고 있으며, 이러한 신규유전자의 동정을 회피함으로써 새로운 항암타겟 발굴의 기회는 소실되고 있다.
단백질의 안정성을 유지하여 세포 내에서의 활성을 조절하는 기전에는 여러 가지가 있지만, UPS(ubiquitin-proteasome system)은 유전자의 단백질로의 해독 후 조절과정(post-translational regulation) 수준에서 매우 효율적인 주요 단백질 안정성 조절기전으로 알려져 있다. Ubiquitylation은 E1(유비퀴틴 활성화), E2(유비퀴틴 결합), E3(유비퀴틴 결합)의 연쇄적인 작용에 의해 일어나며, 이러한 세 종류의 ubiquitin 효소의 다양한 조합으로 인해 다양한 단백질들에 대해 특이적인 ubiquitination이 이루어진다. 이와 반대방향으로 단백질에서 ubiquitin을 제거하는 de-ubiquitination기작은 de-ubiquitinase(ubiquitin isopeptidase)라는 단백질에 의해 일어나게 되는데, 인간의 de-ubiquitinase는 모두 6 계통에 걸쳐 98종에 이르고 있다. 이러한 UPS 시스템에서 p53 단백질을 ubiquitination하는 단백질은 MDM2이며, 반대로 de-ubiquitination하는 단백질 중 하나는 USP7 (HAUSP)라는 단백질이다.
본 발명의 목적은 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 환자로부터 분리한 생물학적 시료에 존재하는 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B) 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 항암제 내성 예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B) 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 환자로부터 분리한 생물학적 시료로부터 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B) 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 발현량을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 및 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암이 유발된 개체에 FAM188B의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "FAM188B"은 family with sequence similarity 188 member B로서, 상기 유전자에 대한 mRNA 서열(cDNA)은 서열번호 1(NM_032222)이고, 상기 유전자가 코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 2(NP_115598)로 기재된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발현 억제제는 상기 FAM188B 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA((small interfering RNA), shRNA(Short Hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 FAM188B 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 서열번호 3(NM_032222의 2219 내지 2240 nt)의 염기서열로 이루어진 염기서열에 상보적으로 결합하는 siRNA인 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "siRNA"는 "small interfering RNA"로서, RNA 간섭(RNA interference)에 관여하는 RNA의 일종이다. siRNA는 mRNA에 상보적으로 결합하여 mRNA가 단백질로 코딩되는 것을 방해함으로써, 유전자의 발현을 조절한다. 본 발명자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 FAN188B 유전자의 염기서열에 상보적으로 결합하는 siRNA를 사용하여 실험을 수행하였다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 활성 억제제는 상기 FAM188B 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 FAM188B 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 항원을 사용하여 제조된 항체인 것일 수 있다.
본 발명의 용어, 단백질의 발현(expression)이란 mRNA에서 코딩되는 단백질을 의미하며, 단백질의 활성(activity)이란 인산화 또는 다른 구조적인 변화에 의하여 단백질의 기능을 할 수 있는 구조가 되는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "항체(antibody)"는 FAM188B를 항원으로 하여 결합할 수 있는 특이적 구조를 가진 항체로서, 다중클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 항원은 항체에서 antigen-binding site에 의해 인식되는 아미노산 서열을 의미하며, 본 발명자는 서열번호 4인 항원을 사용하여 항체를 제작하였고, 상기 항체는 FAM188B 단백질에 특이적으로 결합하여 FAM188B 단백질의 활성을 억제하는 기능을 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 두경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 혈액암 및 뇌암으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "항암보조제"는 항암제의 항암효과를 증대시키고, 항암제의 부작용을 억제하거나 개선시키 위하여 사용될 수 있으며, 항암제와 병용하여 환자에게 투여될 수 있다.
상기 항암제는 에토포사이드(etoposide), 시스플라틴(cisplatin) 또는 메틸메탄설포네이트(Methyl methane-sulfonate)인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 암 환자로부터 분리한 생물학적 시료에 존재하는 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B) 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 항암제 내성 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 FAM188B 유전자의 발현량은 RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction) 또는 qRT-PCR (Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)로 측정되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 FAM188B 단백질의 발현량은 웨스턴블럿(western blot), 면역블럿(immunoblot) 또는 면역세포화학법(immunocytochemistry)으로 측정되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 대조군에 비하여 FAM188B 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량이 높은 경우에는 항암제에 대한 내성이 높을 것으로 판단하는 단계를 더 추가하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B) 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 FAM188B 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 FAM188B 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 암 환자로부터 분리한 생물학적 시료로부터 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B) 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 발현량을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 및 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 FAM188B 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량이 기준치에 비하여 높은 경우에는 암의 발병가능성이 높거나 예후가 좋지 않을 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 추가하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 암이 유발된 개체에 FAM188B의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
발명의 일실시예에 있어서, 상기 발현 억제제는 상기 FAM188B 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA((small interfering RNA), shRNA(Short Hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
발명의 일실시예에 있어서, 상기 활성 억제제는 상기 FAM188B 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 두경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 혈액암 및 뇌암으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 암의 치료 방법은 FAM188B의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
본 발명에 따른 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B)의 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량을 억제하여 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있고, 상기 유전자 및 단백질의 발현량을 측정하여 항암제 내성을 예측할 수 있다.
도 1은 (a)는 위암환자(n=75)의 정상 및 종양조직에서 FAM188B mRNA 발현이 유의하게 달라졌음을 보여주고(P<0.0001, paired t-test), (b)는 GAPDH에 의해 표준화된 FAM188B 단백질 발현이 많은 수의 위암 조직에서 유의적으로 상승되었다는 결과이며(P=0.0004, paired t-test; n=75), (c)는 위암 세포주(AGS, MKN-28, KATO-III, SNU-216 및 SNU-638), 대장암세포주(HCT-116) 및 비-암세포주(HDF and HEK-293)에서의 FAM188B mRNA 발현량을 측정한 결과이고, (d)는 (c)에 기재된 세포에서의 FAM188B 단백질의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 (a)는 AGS 세포주에 siRNA 처리하여 FAM188B 하향 조절의 효과를 qRT-PCR에 의해 FAM188B mRNA의 발현량을 측정한 것이고, (b)는 (a)와 같은 조건에서 웨스턴블럿으로 FAM188B 단백질의 발현량을 측정한 것이다. 이 경우 FAM188B 하향 조절은 siRNA 형질도입 후 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 확인되었다. (c)는 siFAM188B-treated 세포가 NC siRNA-treated 세포보다 세포 증식이 지연되었음을 보여주는 현미경 분석을 나타낸 것이다. (d)는 flow cytometry에 의해 NC siRNA-treated 세포와 siFAM188B-treated AGS 세포에서의 세포주기 분석한 결과이다. (e)는 NC siRNA-treated 세포와 siFAM188B-treated AGS 세포에서 핵의 분절을 비교한 것이다. (f)는 48시간에서 NC siRNA-treated 세포와 siFAM188B-treated AGS 세포에서의 아넥신 V 어세이에 대한 분석을 나타낸 것이다.
도 3은 (a)는 FLAG-tagged FAM188B로 면역침적된 FAM188B-상호작용 단백질을 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide gel electrophoresis) 에서 확인하고, LC/MS-MS(liquid chromatography / tandem mass-spectrometry)으로 검출하였다. (b) 상호작용 단백질은 String-DB로 검색되었고, "Evidence View"가 만들어졌고, 화살표는 면역침전으로 확인된 상호작용 단백질을 나타낸다. (c)는 FAM188B 에 결합되는 p53을 HEK-293 세포에서 확인한 것이고, (d)는 FAM188B 에 결합되는 p53을 HCT-116 세포에서 확인한 것이다. (e)는 Paf1(pol II association factor) 복합체인 CDC73 와 CTR9를 확인한 결과이다.
도 4는 FAM188B 하향 조절이 p53 활성을 유도한다는 결과로서, (a)는 24시간과 48시간에 p53의 핵 위치화를 면역세포화학법에 의해 확인하였고, 24시간과 48시간에 untreated (-), NC siRNA-treated 및 siFAM188B-treated 세포에서 핵과 세포질 분획에서의 활성화된 p53의 발현을 웨스턴블럿으로 확인하였다. PARP와 α-tubulin 은 각각 핵과 세포질 마커로서 사용되었다. (b)는 24시간과 48시간에 NC siRNA-treated 및 siFAM188B-treated 세포에서 p53 다운스트림 요소(Ser15-인산화된 p53, BAX, p21 및 PUMA)에서의 변화를 웨스턴블럿으로 확인하였다. (c)는 24시간(n=3, ***P=3.05x10- 7)과 48시간(n=3, ***P=8.37x10-7)에 NC siRNA-treated 및 siFAM188B-treated 세포에서 p21 프로모터의 전사적 활성을 dual luciferase assay로 측정하였다. (d)는 24시간과 48시간에 NC siRNA-treated 및 siFAM188B-treated 세포에서 BAX 와 PUMA 프로모터에 p53의 증가된 결합을 ChIP-qPCR 어세이로 측정한 것이다. BAX 의 경우에는 48시간 (*P=0.45x10- 2)에 유의적으로 증가되었고, PUMA의 경우에는 24시간(**P=3.38x10-3)과 48시간(***P=3.38x10-3)에서 모두 증가되었다. (e)는 FAM188B 과발현 및 FAM188B 하향 조절에서 USP7의 면역침전 결과를 나타낸 것이다. (f)는 NC siRNA-treated 및 siFAM188B-treated 세포에서 유비퀴틴화된 p53의 면역침전 결과를 나타낸 것이다. short expose 는 X-ray film 에서 3분 노출한 것이고, long expose 는 5분 노출한 것이다.
도 5는 (a)는 위암조직에서 면역조직화학법에 의한 분석 결과로서 FAM188B "High" (왼쪽 패널)과 "Low" (오른쪽 패널)을 나타낸다. (b)는 DFS(disease-free survival)군과 OS(overall survival)군에서 FAM188B "Low" 환자와 FAM188B "High" 환자에서의 통계적 차이를 살펴본 것이다(DFS에서는 P=0.585, OS에서는 P=0.388). (c)는 FAM188B "Low" 환자의 DFS(P=0.0031)과 OS(P=0.0015)에서 보조 화학요법에서의 차이를 본 것이다. (d)는 FAM188B "High" 환자의 DFS(P=0.4562)과 OS(P=0.4256)에서 보조 화학요법에서의 차이를 본 것이다.
도 6은 스트레서 조건에서 FAM188B 효과를 본 것으로서, (a)는 HCT-116 세포에 혈청기아 조건으로 하여 0시간, 24시간 및 48시간에서 p53의 핵 위치를 확인한 것이다. (b)는 혈청기아 조건에서 FAM188B 과 p53의 단백질 발현량을 살펴본 것이다. (c)는 NC siRNA-treated 및 siFAM188B-treated 세포에 낮은 농도의 에토포사이드(0.5μM)와 시스플라틴(5μM)를 처리한 후 세포생존률(cell survival (%))을 측정하였고 (*P<0.05), 세포생존률은 세 개의 독립된 실험으로부터 측정되고 평균±SEM(standard error of the mean)으로 표시하였다. (d)는 정상 및 스트레스 조건에서 FAM188B 작용에 대한 가설을 나타낸 것으로서, 정상 조건에서는 세포가 안정된 단계에서 증식을 유지하기 위하여 FAM188B는 p53 탈유비퀴틴화를 위해 DUB을 막고 p53은 프로테오솜 분해 경로를 거치게 된다. 스트레스 조건에서는 FAM188B가 줄어들고, DUB가 FAM188B로부터 방출되어 탈유비퀴틴화된 p53이 핵으로 위치화되고 세포사멸 유전자를 활성화시킨다. 그러나, 종양에서는 상승된 FAM188B에 의해 세포가 DNA 손상 약물과 같은 스트레스 조건에서 견디게 된다.
도 7은 (a)는 Homo sapiens (Hs, 인간), pongo abelii (Pa, 오랑우탄), Bos taurus (Bt, 소), Mus musculus (Mm, 마우스) 및 Xenopus tropicalis (Xt, 개구리)를 포함하는 4종의 척추동물에서 mRNA RefSeq entries로부터 예측되는 단백질 서열을 ClustalW (EBI)을 사용하여 나열한 것을 나타낸다. 매우 보존된 아미노산 서열은 *으로 표시되었다. (b)는 "Phylogeny.fr" 으로부터 만든 계통도를 나타내고, 인간(Homo sapiens)과 오랑우탄(Pongo abelii)이 같은 가지(branch)이고(branch support value = 1), 소가 영장류와 매우 가까웠다 (branch support value = 0.96). (c)는 FAM188B mRNA의 3'-UTR(untranslated region)에서 Poly(A) signal(밑줄)을 확인한 것이다.
도 8은 HCT-116 대장암세포에서 FAM188B 유전자의 하향 조절에 의해 유도되는 세포사멸에 대한 것으로서, (a)는 HCT-116 세포에 siRNA 처리하여 FAM188B 하향 조절의 효과를 qRT-PCR에 의해 mRNA의 발현량을 측정한 것이고, (b)는 웨스턴블럿으로 단백질의 발현량을 측정한 것이다. 이 경우 FAM188B 하향 조절은 siRNA 형질도입 후 24시간, 28시간, 72시간 및 96시간에서 확인되었다. (c)는 siFAM188B-treated 세포가 NC siRNA-treated 세포보다 세포 증식이 지연되었음을 보여주는 현미경 분석을 나타낸 것이다. (d)는 flow cytometry에 의해 NC siRNA-treated 세포와 siFAM188B-treated HCT-116 세포에서의 세포주기 분석한 결과이다. (e)는 NC siRNA-treated 세포와 siFAM188B-treated HCT-116 세포에서 핵의 분절(화살표로 표시)를 비교한 것이다. (f)는 72시간에서 NC siRNA-treated 세포와 siFAM188B-treated HCT-116 세포에서의 아넥신 V 어세이에 의한 분석을 나타낸 것이다. NC siRNA의 경우에는 UR(upper right)에서 4.13%이고, LR(low right)에서 8.29%인 것에 반해, siFAM188B의 경우에는 UR(upper right)에서 12.49%이고, LR(low right)에서 22.34%인 것으로 확인되었다.
도 9는 대장암 세포주인 HCT-116 세포와 HCT-116 p53-/- 세포, 위암 세포주인 AGS 세포와 SNU-638 세포에 siFAM188B(또는 NC siRNA)를 처리하여 FAM188B 단백질의 발현을 감소시켰을 때, 세포 성장 및 세포 증식에 관련된 단백질(베타-카테닌, FoxM1 및 Cyclin D1)의 발현량을 웨스턴블럿으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험재료 및 방법
1.1. 세포주 및 인간의 조직샘플
인간 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA) 또는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 구입되었다. 모든 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, Corning) 및 1x 페닐실린-스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 포함하는 지정된 배양액((Corning, Manassas, VA, USA)을 사용하여 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 배양되었다.
인간의 위장 조직샘플은 수술을 진행한 환자로부터 얻었고, total RNA 추출을 위하여 RNA Later solution (Qiagen, Hilden, Germany)이나 단백질 추출을 위해 액체질소에 저장하였다(표 1). 모든 환자들로부터 조직 제공에 대해 동의를 얻었으며, 본 연구는 국립암센터의 윤리심의위원회(Institutional Review Board of National Cancer Center, Korea, NCCNCS13732)에 의해 승인되었다.
1.2. RT- PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) 및 qRT - PCR (정량 RT-PCR)
total RNA는 TRIzol reagent(Invitrogen)를 사용하여 추출되었고, RNase-free DNase I이 처리된 RNeasy column(Qiagen)을 사용하여 분리되었다. 첫번째 가닥의 cDNA는 Transcriptor cDNA Synthesis kit (Roche, Mannheim, Germany) 및 poly-d(T)18-21 프라이머를 사용하여 1 mg의 total RNA를 합성하였다. RT-PCR 및 qRT-PCR에 사용된 2개의 연속된 엑손(exon)을 지나는 프라이머와 프로브는 Primer3 software (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)를 사용하여 디자인되었다. qRT-PCR 반응은 LC480 real-time PCR machine (Roche)을 사용하여 수행되었다.
1.3. 면역블롯(immunoblot) 및 면역세포화학법(immunocytochemistry)
FAM188B(family with sequence similarity 188 member B)의 확인을 위하여, FAM188B 단백질의 C-말단에 특이적인 것뿐만 아니라 항원성으로 예측되는 서열을 가진 헤모시아닌-결합의 펩타이드를 이용한 면역법(immunization)에 의해 다중클론성 항체(polyclonal antibody)를 생산하였다. 펩타이드-친화 크로마토그래피(peptide-affinity chromatography)에 의해 분리된 혈청은 5% 탈지유(skim milk)/1x TBS (Tris-buffered saline) 버퍼에서 1:1,000 희석화하여 면역블롯에 사용되었다.
하기의 항체는 다른 종류의 단백질을 확인하기 위하여 사용되었다. FLAG M2 (F1804) 및 β-actin (A1978)는 Sigma-Aldrich(ST. Louis, MO)에서 구입하였고, CDC73 (#8126), PUMA (#4976, P53 Up-Regulated Modulator Of Apoptosis), HAUSP (USP7)(#3277), p21 (#2947), BAX (#2772, BCL2-Associated X Protein), 및 PARP (#9542, Poly (ADP-Ribose) Polymerase)는 Cell Signaling Technologies (Danvers, MA)에서 구입하였으며, CTR9 (ab84487)은 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였고, p53 (DO-1) (sc-126), phospho-p53 (ser15) (sc-101762) 및 α-tubulin (sc-8035)은 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX)에서 구입하였다.
1.4. 단백체 분석 및 이의 상호작용하는 파트너의 프로파일링
FAM188B의 상호작용 단백질의 면역침전은 10μg의 pFLAG-FAM188B 플라스미드로 형질도입시킨 후 48시간 동안 배양된 1.5 x 106 세포수의 HEK-293 세포를 사용하였고, 40μg의 anti-FLAG-M2 agarose affinity gel (Sigma-Aldrich)을 사용하여 진행되었다. 분석은 LTQ XLTM linear ion trap mass spectrometer (MS) system (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)을 사용하여 수행되었다. 모든 MS/MS 샘플은 Uniprot_sprot 데이터베이스 및 IPI(International Protein Index) 인간 데이터베이스를 검색하기 위해 Proteome Discover software (version v.1.4; Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 분석되었다.
1.5. 형질도입(Transfection)
FAM188B는 FAM188B-specific siFAM188B (SI04333014, Qiagen)로 형질도입된 AGS 위암 세포(gastric cancer cells)와 HCT-116 대장암 세포(colon cancer cells)에서 발현이 저지되었다. 대조군으로는 Allstar negative control siRNA (NC siRNA, #1027281, Qiagen)이 사용되었다. 6-well 배양 플레이트 (8x104 cells/well)에 접종된 세포는 HiPerfect transfection reagent (Qiagen)를 사용하여 5 nM의 siRAM188B 또는 NC siRNA로 형질도입되었다.
1.6. 세포주기 분석
세포주기는 siFAM188B 또는 siFAM188B 발현 벡터로 형질도입된 세포를 PI (propidium iodide, P4170, Sigma-Aldrich)으로 염색한 후, 유동세포계수법(flow cytometry)으로 분석되었다. Hoechst33342 (Sigma-Aldrich)로 염색된 siRNA가 처리된 세포에서의 핵 분절(nuclear fragmentation)은 400x 확대로 공초점현미경(confocal microscopy)으로 관찰되었다. 세포사멸군의 확인을 위한 아넥신 V 어세이는 BD FITC annexin V apoptosis detection kit I (#556547, BD Pharmingen, San Jose, CA, USA)을 사용하여 수행되었다.
1.7. 세포증식 어세이(cell proliferation assay)
세포증식 어세이(cell proliferation assay)는 96-well 플레이트에 5x103 cells/well의 세포수를 접종하고, 표시된 농도의 시스플라틴(cisplatin, Calbiochem, San Diego, CA) 또는 에토포사이드(etoposide, Sigma-Aldrich)를 처리한 후 수행되었다. 72시간 동안 배양한 후, 세포를 씻은 후 100μL의 MTT([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, 0.5 mg/mL)를 넣고 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 놓아두었다. 흡광도(absorbance)는 VersaMax™ Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 nm에서 측정되었다.
1.8. 듀얼 루시퍼라제 어세이(Dual luciferase assay)
Dual luciferase assay (E1910, Promega)는 제조자의 프로토콜에 따라 수행되었다. 간단하게는, HCT-116 세포는 pGL2-p21-luc (Addgene, Cambridge, MA) 및 pGL4.70hRluc (Promega) 플라스미드와 함께 최종농도 5nM의 NC siRNA 또는 siFAM188B가 형질도입되었다. 24시간과 48시간 후에, 세포는 모아지고 차가운 1x PBS(phosphate-buffered saline)으로 2번 씻어지고, passive lysis buffer를 사용하여 용해시켰다. 용해물은 96-well 플레이트의 바닥에 층을 형성한 LARII solution에 더해졌다. 그 뒤, Renilla 루시퍼라제 활성의 두 번째 측정은 Stop&Go solution이 더해짐으로써 수행되었다. 모든 측정은 Victor3 reader (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하였다.
1.9. ChIP 어세이 (chromatin immunoprecipitation assay)
ChIP 어세이는 최종농도 5nM의 NC siRNA 또는 siFAM188B가 형질도입되고 48시간 동안 배양된 HCT-116 세포를 사용하여 수행되었다. 세포는 37°C 에서 10분간 1x PBS 및 1% 포름알데히드(formaldehyde)를 처리하여 고정시켰고, 최종농도 0.125 M의 글리신(glycine)을 넣어 마무리하였다. 고정된 세포는 라이시스 버퍼를 포함하는 Igepal CA630 (I8896, Sigma-Aldrich)으로 용해되었고, 핵(nuclei)을 모으기 위해 2,500 xg에서 5분간 원심분리시켰다. 모아진 핵은 Bioruptor sonicator (Diagenode, Denville, NJ, USA)를 사용하여 7.5분 (0.5분 on, 1분 off 주기) 동안 초음파 분해(sonication)되었다. 분절된 게놈 DNA(genomic DNA)는 차례로 protein A/G agarose beads (Santacruz Biotech)와 anti-p53 antibody (DO-1)를 사용하여 면역침전되었다. 면역침전된 DNA는 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 추출법에 의해 분리되었다. BAX 및 PUMA 유전자의 증폭은 p53-RE 프라이머(Laptenko O, Beckerman R, Freulich E, Prives C. p53 binding to nucleosomes within the p21 promoter in vivo leads to nucleosome loss and transcriptional activation. Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: 10385-10390)와 SYBR green master mix를 사용하여 LC480 real-time PCR machine (Roche)으로 수행되었다. 면역침전으로부터의 증폭신호는 대조군 DNA로 표준화하였다.
1.10. 면역조직학적 분석(Immunohistochemical analysis)
107명의 환자로부터 얻어진 파라핀에 고정된 조직은 FAM188B 발현과 임상병리학적 특성 간의 관계를 분석하기 위하여 사용되었다. 샘플은 국립암센터의 위암 2기 내지 3기로서 위절제(gastrectomy) 수술을 받고, 보조항암화학요법(adjuvant chemotherapy)의 효과를 평가하기 위하여 임상시험에 등록된 환자로부터 획득되었다. 따라서, 모든 환자들은 같은 절차로 치료받았고, 그들의 임상병리학적 특성은 무작위로 분포되어 있다.
HE(hematoxylin-eosin)로 염색된 슬라이드 중에서 3개의 대표적인 부위가 조직유전자미세배열(tissue microarray, TMA)를 위해 선택되었다. TMA 블럭은 3μm의 두께로 절단되었고, automated staining instrument(BenchMark XT, Ventana, Tucson, AZ)를 사용하여 FAM188B을 면역염색하였다. 면역반응성 단백질은 FAM188B rabbit polyclonal antibody (HPA030130, Atlas Antibodies AB, Stockholm, Sweden)로 확인되었고, UltraView Universal DAB kit (Ventana)을 사용하여 8분 동안 HRP(horseradish peroxidase) 기질인 DAB(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)으로 보여지도록 하였으며, hematoxylin으로 대비염색되었다.
모든 확인된 FAM188B 신호는 염색 패턴과 관계없이 양성으로 간주되었다. 염색 강도는 다음과 같이 정의된다: 0, 신호없음 또는 <10% 양성 종양세포; 1, 100x power에서 visible but weak signal; 2, 100x power에서 clear signal; 및 3, 40x power에서 apparent signal. 양성 종양세포의 퍼센트는 다음과 같이 결정되었다: 0, 없음; 1, <10%; 2, 10-50%; 3, 50-90%; 및 4, >90%. 전체 점수(total score)를 얻기 위해 염색 강도와 퍼센트 값이 곱해졌고, FAM188B의 발현량은 'Low' expression (score ≤4)와 'High' expression (score ≥5)의 두 그룹으로 나누었다.
1.11. 통계적 분석
그룹 간의 차이에 대한 통계적 유의성은 Chi-square test 및 Student's t-test를 사용하여 결정하였다. 0.05보다 적은 P-values(<0.05)를 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 생존 분석(survival analysis)은 statistical computing (ver.3.2.3)을 위한 R-project를 위해 CRAN package를 사용하였다. Cox 비례위험모형(Cox proportional hazard model)이 DFS(disease-free survival) 군과 OS(overall survival) 군에 대하여 환자의 특성에 대한 효과를 평가하는데 사용되었다. 생존 곡선(survival curves)은 Kaplan-Meire method를 사용하여 예측되었고, 생존 곡선에서의 차이는 log-rank test를 사용하여 테스트되었다.
실시예 2. FAM188B의 진화적 보존 여부
기존 연구에서, Affymetrix Exon 1.0ST microarray (NCBI Gene Expression Omnibus GSE30727)를 사용하여 전사체(transcriptomes)의 비교를 근거로 30명의 위암 환자에서 위암 조직과 정상조직 간의 유의적으로 차이가 나는 엑손 사용을 하는 유전자로서 FAM188B 을 확인하였다. 그러나, FAM188B은 공용 데이터베이스에서 전사체가 기능성에 대한 유일하게 뒷받침되는 증거라는 이유로 "hypothetical protein"으로 주석이 달렸다. FAM188B 가 진화적으로 보존된 것인지 결정하기 위하여, GenBank 뉴클레오티드 데이터베이스를 검색하였고, Pongo abelii (오랑우탄), Bos taurus (소), Mus musculus (마우스) 및 Xenopus tropicalis (개구리)를 포함하는 척추동물에서 상동성(homologue)을 확인하였다. EBI ClustalW2를 사용하여 다수의 예측되는 단백질 서열의 정렬(alignment)에서 FAM188B가 척추동물에서 매우 보존되었음을 확인하였다(도 7a). "Phylogeny.fr" (Dereeper A, Guignon V, Blanc G, Audic S, Buffet S, Chevenet F, Dufayard JF, Guindon S, Lefort V, Lescot M, Claverie JM, Gascuel O. Phylogeny.fr: robust phylogenetic analysis for the non-specialist. Nucleic Acids Res 2008; 36(Web Server Issue): W465-W469)를 사용한 계통도(phylogram)는 인간 FAM188B이 P. abelii (오랑우탄)의 FAM188B 단백질과 가장 관련도가 높게 나타났고, 소의 FAM188B 단백질과도 관련도가 있었다(도 7b). FAM188B의 발현을 확인하기 위하여, FAM188B mRNA의 3'UTR(untranslated region) 서열을 살펴보았고, poly(A) signal이 있음을 밝혔다(도 7c).
실시예 3. 위암 조직에서 FAM188B의 발현
종양 조직에서 FAM188B의 발현을 확인하기 위하여, 75명의 위암 환자에서 qRT-PCR과 면역블롯을 수행하였고, mRNA와 단백질의 발현량에서 종양/정상(Tumor/normal)으로 한 배수 변화(fold change)에서는 많은 위암 환자에서 FAM188B 발현이 증가되었다. 통계적 분석에서도 FAM188B 발현은 75명의 암환자의 종양조직과 정상조직 간의 mRNA 발현량(도 1a, P-value =0.0004, paired t-test)과 단백질 발현량(도 1b, P-value =0.0004, paired t-test)에서 유의한 차이가 있었음을 확인하였다. 또한, 여러 암세포주와 비-암세포주에서 qRT-PCR을 수행하였고(도 1c), FAM188B mRNA 발현은 테스트된 모든 샘플에서 검출되었으며, 발현량은 샘플마다 달랐다. 내재적 단백질 발현을 확인하기 위해, FAM188B에 대한 C-말단 특이적인 polyclonal antibody를 만들었고, 웨스턴블롯에 의해 세포주를 조사하는데 사용하였다. 이러한 분석으로 테스트된 모든 세포주에서 FAM188B 발현을 확신하였다(도 1d).
실시예 4. in vitro 에서 세포사멸을 유도하는 FAM188B의 효과
종양조직과 암세포주에서의 FAM188B의 상승된 발현에 대한 역할을 알아보기 위하여, FAM188B 발현의 하향조절시킨 후 세포의 표현형(phenotype)을 분석하였다. 위암 세포주인 AGS(도 2)와 대장암 세포주인 HCT-116(도 8)에 각각 5nM의 siFAM188B(FAM188B-specific) 또는 NC siRNA(negative control, 대조군)를 형질도입시키고, 96시간 동안 표현형적인 변화를 관찰하였다. 그 결과, siFAM188B를 처리했을 때에는 AGS 위암세포(도 2a)와 HCT-116 대장암세포(도 8a)에서 24시간 뒤부터 FAM188B mRNA의 발현량이 유의적으로 줄어들었음을 확인되었다. 면역블롯에서도 AGS 위암세포(도 2b)와 HCT-116 대장암세포(도 8b)에서 단백질 발현량이 줄어들었음을 확인하였다. 특히, siFAM188B 로 형질도입된 AGS 및 HCT-116 세포는 NC siRNA로 처리된 세포와 비교할 때, 24시간부터 세포 성장과 증식의 지연을 보였고, 96시간까지는 회복되지 않았다 (도 2c 및 도 8c). 또한, 본 발명자들은 세포주기에서 FAM188B 하향조절의 효과를 분석하였다. siFAM188B-treated AGS 세포에서, 세포사멸에 대응되는 sub-G0/G1의 세포군은 96시간 뒤에 NC siRNA-treated 세포가 4.14%인 것과 비교할 때 19.55%으로 증가되었다 (도 2d). sub-G0/G1 세포군은 siFAM188B-treated HCT-116 세포에서 더 크게 증가되었고, NC siRNA-treated 세포에서 1%인 것에 비하여 29.28-40.34% 의 세포가 sub-G0/G1 세포군에 속했다(도 8d). siRNA-treated 세포의 현미경에서의 분석에서는 AGS (도 2e)와 HCT-116 (도 8e)에서 핵의 분절이 증가했음을 보여주었다. 아넥신 V 어세이에서는 siRNA-treated AGS 세포(도 2f)와 HCT-116 세포(도 8f)에서 NC siRNA-treated 세포와 비교할 때 사멸된 세포군이 증가했음을 보여주었다.
따라서, 이러한 결과로부터 암세포에서 FAM188B 발현의 하향 조절은 세포사멸을 유도한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. FAM188B과 p53과의 상호작용
세포사멸에서 FAM188B 관련된 메커니즘을 조사하기 위하여, 가능성이 있는 FAM188B 결합파트너를 조사하였다. FLAG-tagged FAM188B 발현 구조(expression construct)를 만들었고, HEK-293 세포로 형질도입시켰다. 결합단백질과 함께 FLAG-tagged FAM188B 단백질은 면역침전에 의해 다운되었고, 분리된 단백질은 LC/MS-MS(liquid chromatography/ tandem mass-spectrometry)로 분석되었다(도 3a). 데이터베이스에 대한 MS 검색으로부터의 질량 피크(peak)는 FAM188B 에 결합되는 104 개의 단백질을 확인하였다. 상기 단백질은 세포 내의 생물학적 과정과 증거-관련된 상호작용 그룹에서의 관련성에 따른 단백질을 모으기 위해 DAVID server(Huang DW, Sherman BT, Lempicki RA. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc. 2009;41:44-57)와 String-DB (Szklarczyk D, Franceschini A, Wyder S, Forslund K, Heller D, Huerta-Cepas J, Simonovic M, Roth A, Santos A, Tsafou KP, Kuhn M, Bork P, Jensen LJ et al. STRING v10: protein-protein interaction networks, integrated over the tree of life. Nucleic Acids Res 2015; 43(Database issue): D447-452)를 사용하여 분석되었다. FAM188B 발현을 하향 조절함으로써 얻어진 결과에서와 같이, 많은 FAM188B 결합단백질은 세포주기 조절과 세포사멸에 관련이 있었다 (표 1). 결합단백질의 상호작용 지도는 몇 개의 클러스터로 나왔고(도 3b), 특히, 종양억제 단백질 p53과 CDC73 뿐만 아니라 이들의 상호작용하는 단백질을 포함하는 클러스터가 확인되었다(도 3b, 화살표). LC/MS-MS 결과를 증명하기 위하여, FLAG-tagged FAM188B 단백질로 p53 과 CDC73/CTR9를 상호-면역침전시키고, 면역블럿으로 이들의 결합을 확인하였다(도 3c). p53 단백질은 FAM188B-과발현 (도 3c) 및 에피토프-처리된 HCT-116/p53wt 세포(도 3d)로부터 면역침전에 의해 확인되었다. 또한, FAM188B 단백질은 CTR9 뿐만 아니라 CDC73를 침전시켰다 (도 3e).
[표 1]
Figure PCTKR2017005308-appb-I000001
Figure PCTKR2017005308-appb-I000002
실시예 6. 핵으로의 p53의 이동 및 탈유비퀸틴화
세포사멸에서 FAM188B 하향 조절의 효과를 알아보기 위하여, FAM188B 하향 조절이 p53을 활성화하고 다운스트림 신호를 향상시키는지 여부를 확인하였다. p53은 siRNA 처리시간이 증가함에 따라 핵으로 이동하는 것이 증가되었다 (도 4a). siRNA-treated 세포의 세포질 및 핵 분획에 대한 면역블럿으로부터 핵의 p53이 증가되었음을 밝혀졌다(도 4a). 또한, Ser15에서 인산화되고 안정된 p53과 이의 다운스트림 타겟인 p21은 siFAM188B 처리에 의해 증가되었다. 면역블럿에서도 siRNA-treated 세포에서 48시간에 BAX와 PUMA가 유도됨을 확인하였다(도 4b). promoter-reporter 구조를 사용하여 siFAM188B 처리가 p53 및 다운스트림 타겟인 p21의 전사적 활성을 2배 정도 증가시켰음을 확인하였다 (도 4c). 더욱이, siFAM188B-treated 세포에서 ChIP(chromatin immunoprecipitation) 어세이는 p53이 BAX 및 PUMA 프로모터에 결합을 증가시킴을 보여주었다 (도 4d). FAM188B이 p53 단백질 발현이 어떻게 관련되는지를 확인하기 위해, LC/MS-MS에서 밝힌 FAM188B-상호작용 단백질로부터 얻어진 정보를 사용하였고, p53을 조절할 것으로 보여지는 FAM188B 단백질 서열에 있는 단백질 모티브와 도메인에 초점을 맞추었다. FAM188B가 p53과 상호작용을 하기 때문에, 몇 가지의 p53-상호작용 단백질을 실험하였다. 흥미롭게도, 탈유비퀴티나제(deubiquitinase)인 USP7(ubiquitin-specific protein 7)이 FAM188B-결합 단백질로서 확인되었다 (표 1). 이에 부합하게, 온라인상으로 단백질 도메인 부위를 예상할 수 있는 "Eukaryotic Linear Motif resources" (Dinkel H, Van Roey K, Michael S, Kumar M, Uyar B, Altenberg B, Milchevskaya V, Schneider M, Kuhn H, Behrendt A, Dahl SL, Damerell V, Diebel S et al. ELM 2016-data update and new functionality of the eukaryotic linear motif resource. Nucleic Acids Res 2016; 44(D1): D294-300)에서 FAM188B에 USP7 결합 모티브의 존재가 예상되었다. FAM188B 면역침전에서 확인된 USP7 단백질은 FAM188B 과발현에 의해 증가되었고, p53 면역침전에서 확인된 경우에는 FAM188B 넉다운에 의해 감소되었다(도 4e). USP7이 p53의 탈유비퀴틴화와 관련되기 때문에, p53 발현 구조 및 NC siRNA 또는 siFAM188B와 함께 유비퀴틴 발현 구조를 공동-형질도입시킨 후 p53의 유비퀴틴화 패턴을 비교하였다. NC siRNA 처리 조건과 비교했을 때, siFAM188B-treated 조건에 있는 레인에서 p53 발현량에서 약간 증가되었음에도 불구하고, siFAM188B 처리는 p53 유비퀴틴화를 감소시켰다 (도 4f).
따라서, FAM188B은 p53 안정화를 조절하는 것으로 보여진다.
실시예 7. 화학요법에서 FAM188B 발현량에 따른 효과
tissue microarray의 면역조직화학법을 사용하여, 총 107명의 위암환자의 위암 병소에서 FAM188B 단백질의 발현을 분석하였다(표 2). 위저부샘(fundic glands)은 강한 확실하게 나타났고, 유문샘(pyloric glands), 소와표피(foveolar epithelium) 및 장상피화생(intestinal metaplasia)에서는 중간에서 약한 신호를 보였다. 염색 패턴은 주로 세포질로서 루미널 표면 염색에 의한 것이었다. 위암에서 "높음(high)"와 "낮음(low)"에서 보여지는 대표적인 면역염색 이미지는 도 5a에서 제시되었다.
통계적 분석에서는 FAM188B 발현이 환자의 성별 및 병소의 크기와 병리학적 분류가 유의하게 관련되는 것으로 밝혀졌다(표 2). 높은 발현은 여성(13.9%, n=5), P=0.014)보다는 남성(86.1%, n=31)에서 자주 나타났고 (P=0.014), 병소는 FAM188Bd의 높은 발현 그룹(4.88±1.87 cm)보다 낮은 발현 그룹(5.95±2.84 cm)에서 더 넓게 나타났다(P=0.045). 특히, Lauren classification에 의한 differentiation status를 근거로, FAM188B의 "low"와 "high" 그룹 간의 병리학적 특성에서의 차이는 유의하였다(FAM188B high: 61.1% in intestinal type, 25.0% in diffuse type; P<0.001). 그러나, 예후인자로서 FAM188B 발현 자체는 DFS(disease-free survival) 군(P=0.585)과 OS(overall survival) 군(P=0.388)에서 어떠한 차이는 없었다 (도 5b). 그러므로, 화학요법의 효과가 FAM188B 발현에 의하는 것인지를 평가했고, 흥미롭게도, DFS(disease-free survival) 군과 OS(overall survival) 군 모두에서 FAM188B "low" 그룹인 경우에는 보조 화학요법에 의하여 향상되었다(도 5c). 그러나, 화학요법의 혜택이 FAM188B "high" 군에서는 관찰되지 않았다 (도 5d). 다른 예후 인자의 효과를 조절한 후에도 이와 일치된 결과가 발견되었다.
따라서, 이러한 발견으로부터 FAM188B 발현은 화학치료 효과의 예측 마커로서 사용될 수 있다고 할 수 있다.
[표 2]
Figure PCTKR2017005308-appb-I000003
실시예 8. 스트레스 조건에서 FAM188B 발현
FAM188B 하향 조절은 세포사멸 경로의 활성을 유도하기 때문에, 배양액에서 혈청을 제거함으로써 실험적으로 가능한 스트레스 조건에서 FAM188B의 기능적인 효과를 살펴보았다. 혈청 기아(serum starvation)는 p53 안정화와 핵으로의 이동을 야기한다 (도 6a). 흥미롭게도, 계속되는 혈청기아의 조건에서 p53 단백질이 증가할 때, FAM188B 단백질 발현량은 감소되었다 (도 6b). 이것은 FAM188B 발현이 p53 발현과 반대로 관련이 있다는 것이다. 또한, 약물 처리 효과에서 FAM188B 발현의 효과를 검사하였다. siFAM188B-treated HCT-116 암세포는 적은 농도의 시스플라틴 또는 에토포사이드에 민감했으나, NC siRNA-transfected 세포의 생존은 같은 농도에서 높게(~90%) 유지되었다(도 6c).
따라서, 정상 성장 조건에서 FAM188B는 p53의 탈유비퀴틴화를 방해함으로써 p53 활성을 억제한다는 것으로 보여진다. 그러나, 스트레스 조건에서는 FAM188B 단백질이 감소하기 때문에 p53은 탈유비퀴틴화에 의해 활성화되며, 다운스트림 유전자를 활성화하기 위해 핵으로 이동된다는 것을 밝혔다(도 6d).
실시예 9. 종양형성 신호전달에 관여하는 FAM188B의 효과
본 발명자들은 FAM188B 발현억제를 통해 대장암 및 위암세포에서 종양형성 신호전달에 관여하는 FAM188B의 역할을 분석하기 위한 실험을 진행하였고, 이를 위해 대장암 세포주인 HCT-116 세포와 HCT-116 p53-/- 세포, 위암 세포주인 AGS 세포와 SNU-638 세포에 siFAM188B를 처리하여 FAM188B 단백질의 발현을 감소시켰을 때, 세포 성장 및 세포 증식에 관련된 단백질의 발현량을 웨스턴블럿으로 분석하였다.
그 결과, siFAM188B 처리에 의한 FAM188B 단백질 발현량이 감소된 시점과 p53 wild type 세포주에서, 세포 성장 및 세포 증식에 관련된 베타-카테닌(beta-catenin)과 FoxM1(Forkhead box M1)의 단백질 발현량이 줄어들었음을 확인하였다(도 9). 더불어 그들의 발현에 의해 조절되는 Cyclin D1의 단백질 발현도 감소됨을 증명하였다. 그러나, p53 유전자가 결핍된 HCT116 p53-/- 세포에서는 베타-카테닌과 Cyclin D1의 단백질 발현량에 큰 차이를 보이지 않았다(도 9).
따라서, FAM188B는 대장암세포 및 위암세포에서 베타-카테닌, FOXM1 및 cyclin D1의 발현량 조절에 관여하여 종양형성에 기여함을 확인하였고, FAM188B 억제제를 통해 종양치료가 가능함을 확인할 수 있었다.

Claims (20)

  1. FAM188B(family with sequence similarity 188 member B)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 상기 FAM188B 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA((small interfering RNA), shRNA(Short Hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 FAM188B 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 염기서열에 상보적으로 결합하는 siRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 활성 억제제는 상기 FAM188B 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 FAM188B 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 항원을 사용하여 제조된 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부암, 두경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 자궁경부암, 방광암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 혈액암 및 뇌암으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. FAM188B(family with sequence similarity 188 member B)의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 항암보조제 조성물.
  8. 암 환자로부터 분리한 생물학적 시료에 존재하는 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B) 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 항암제 내성 예측 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 FAM188B 유전자의 발현량은 RT-PCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction) 또는 qRT-PCR (Quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction)로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 FAM188B 단백질의 발현량은 웨스턴블럿(western blot), 면역블럿(immunoblot) 또는 면역세포화학법(immunocytochemistry)으로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 방법은 대조군에 비하여 FAM188B 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량이 높은 경우에는 항암제에 대한 내성이 높을 것으로 판단하는 단계를 더 추가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 8 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. FAM188B(family with sequence similarity 188 member B) 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 FAM188B 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자에 대한 mRNA에 상보적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 FAM188B 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 암 환자로부터 분리한 생물학적 시료로부터 FAM188B(family with sequence similarity 188 member B) 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계; 및
    상기 발현량을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단 및 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 FAM188B 유전자의 발현량 또는 단백질의 발현량이 기준치에 비하여 높은 경우에는 암의 발병가능성이 높거나 예후가 좋지 않을 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 더 추가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 암이 유발된 개체에 FAM188B의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 발현 억제제는 상기 FAM188B 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA((small interfering RNA), shRNA(Short Hairpin RNA) 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 활성 억제제는 상기 FAM188B 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120100637A1 (en) * 2008-09-25 2012-04-26 Mark David Brennan Genetic markers of schizophrenia endophenotypes
KR20120121161A (ko) * 2011-04-26 2012-11-05 사회복지법인 삼성생명공익재단 Ｒｒｐ12 억제제를 포함하는 항암 및 항암감작 조성물
WO2014201516A2 (en) * 2013-06-20 2014-12-24 Immunexpress Pty Ltd Biomarker identification

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120100637A1 (en) * 2008-09-25 2012-04-26 Mark David Brennan Genetic markers of schizophrenia endophenotypes
KR20120121161A (ko) * 2011-04-26 2012-11-05 사회복지법인 삼성생명공익재단 Ｒｒｐ12 억제제를 포함하는 항암 및 항암감작 조성물
WO2014201516A2 (en) * 2013-06-20 2014-12-24 Immunexpress Pty Ltd Biomarker identification

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FAM188B, THE HUMAN PROTEIN ATLAS, 22 June 2015 (2015-06-22), Retrieved from the Internet <URL:http://www.proteinatlas.org/ENSG0000010625-FAM188B/cancer> *
GOH, SUNG-HO: "Functions of Alternative Splice Variant Genes on Tumorigenesis and their Regulation", GRIS' INSTITUTIONAL RESEARCH BUSINESS FINAL REPORT, 2013, pages 1 - 115 *

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