WO2017207844A1 - PRODUCCIÓN DE ESTEROIDES 11α HIDROXILADOS MEDIANTE BIOTRANSFORMACIÓN CON BACTERIAS RECOMBINANTES - Google Patents

PRODUCCIÓN DE ESTEROIDES 11α HIDROXILADOS MEDIANTE BIOTRANSFORMACIÓN CON BACTERIAS RECOMBINANTES Download PDF

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WO2017207844A1
WO2017207844A1 PCT/ES2017/070363 ES2017070363W WO2017207844A1 WO 2017207844 A1 WO2017207844 A1 WO 2017207844A1 ES 2017070363 W ES2017070363 W ES 2017070363W WO 2017207844 A1 WO2017207844 A1 WO 2017207844A1
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hydroxylated
bacterial cell
cell according
add
prog
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PCT/ES2017/070363
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Carmen FELPETO SANTERO
Beatriz GALÁN SICILIA
José Luis GARCÍA LÓPEZ
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention falls within the field of the chemical, pharmaceutical and food industry, particularly within the production processes of hydroxylated spheroids and derivatives thereof by microbial biotransformations, both from natural sterols and from non-tuned tuners. hydroxylated spheroids and derivatives thereof by microbial biotransformations, both from natural sterols and from non-tuned tuners. hydroxylated spheroids and derivatives thereof by microbial biotransformations, both from natural sterols and from non-tuned tuners. hydroxylated spheroids and derivatives thereof by microbial biotransformations, both from natural sterols and from non-tuned tuners. hydroxylated spheroids and derivatives thereof by microbial biotransformations, both from natural sterols and from non-tuned tuners. hydroxylated spheroids and derivatives thereof by microbial biotransformations, both from natural sterols and from non-tuned tun
  • Spheroids are terpenic lipids with a defined structure, which contain a cyclopentaneperhydrophenanthrene or gonane nucleus with four fused rings (A-D); This basic structure is modified by the addition of various functional groups, such as carbonyls and hydroxyls (hydrophilic) or hydrocarbon chains (hydrophobic).
  • the physiological activity of the spheroids depends on their structure, that is, on the type, number and position of the functional groups attached to the spheroid nucleus, as well as on their configurational and structural isomerism, that is, stereoisomer ⁇ a and regioisomer ⁇ a, and on the oxidation state of the rings
  • Spheroids are widespread in nature and are present in all types of organisms. Thus, hundreds of sterols and related compounds that occur in plants, such as phytosterols, have been identified; in insects, such as ecdysteroids; in vertebrates, such as cholesterol, corticosteroids or steroid hormones; and in lower eukaryotes (yeasts and fungi), such as ergosterol.
  • insects such as ecdysteroids
  • vertebrates such as cholesterol, corticosteroids or steroid hormones
  • yeasts and fungi such as ergosterol.
  • steroidal pharmaceutical products are of great importance to maintain our quality of life, as many spheroids are used as anti-tumor, anti-inflammatory, anti-microbial, anti-viral, anti-fungal, anti-fungal agents. estrogenic, anti-convulsant and antiallergic.
  • others are used as agents for the prevention and therapy of many other diseases, such as hormone-dependent breast and prostate cancers, certain forms of cancer. colon, obesity, diabetes, rheumatoid arthritis, hypertension, asthma, eczema, inflammations, metabolic disorders, neurodegenerative diseases in the elderly, or diseases of the central nervous system, among many others. Androgens, anabolic spheroids, estrogens, and corticosteroids, among others, are included here.
  • spheroids used as drugs are chemically synthesized, but it has long been known that the microbial transformation of spheroids is a powerful tool for the generation of new steroidal drugs, as well as for the efficient production of key intermediates (precursors) for Chemical synthesis of such drugs.
  • the bioconversions allow the spheroid to be modified in positions of the molecule that are hardly available or accessible to chemical agents, and the functionalization of the molecule can be carried out regio- and stereo-specifically. Moreover, through the bioconversion several reactions can be completed in one step.
  • the main intermediate products or precursors for the industrial synthesis of steroidal drugs are 4-androsten-3, 17-dione (hereinafter, AD) and 1, 4- androstadien-3, 17-dione (hereinafter, ADD); however, hydroxylated spheroids often express greater biological activity compared to their less polar non-hydroxy analogs.
  • 11 a-hydroxy-progesterone (hereinafter, 11 a-OH-PROG), 11 a-hydroxy-deoxycorticosterone (hereinafter, 11 a-OH-DOC), 11 a-hydroxy-testosterone (hereinafter, 11 a-OH-TEST), 11 a-hydroxy-4-androsten-3.17-dione (hereinafter, 1 a-OH-AD) and 11 a-hydroxy-1, 4-androstadien-3, 17-dione ( onwards, H cs-OH-ADD) are necessary tunings for obtaining glucocorticoids that, in addition to being used in replacement therapy, possess pharmacological properties and are used as anti-allergens, anti-inflammatories, immunosuppressants and contraceptives. Therefore, the economical and efficient production of these precursors or tuners, preferably 11 to hydroxylates, is a prevailing need in the pharmaceutical industry.
  • one of the main raw materials used in the chemical industry of spheroids are sapogenins, such as diosgenin.
  • some natural sterols are also used as starting materials in the spheroid industry, such as 3 ⁇ -alcohols spheroids, which contain a double bond at position 5-6 and an aliphatic side chain at C-17.
  • these spheroids are cholesterol, which is known as animal steral, or phytosterols, which are mixtures of plant-derived sterols, mainly of soy origin, such as sitosterol, stigmasterol, campesterol, and brasicasterol. Since the 1980s, the microbial transformation of phytosterol has been a focus of research in the field of spheroids.
  • steroidal compounds 1 1a-hydroxylated species belonging to the genera Aspergillus or Rhizopus are used; in particular A. ochraceus, R. oryzae and R. nigricans. These fungi are capable of hydroxylating several steroidal compounds in position 11 a, including AD or ADD; but they also modify and hydroxylate to a greater or lesser extent in other positions of the molecule, which drastically lowers production yields.
  • the enzyme responsible for carrying out the 11 a-hydroxylations has been identified. It is a cytochrome P450 called Cyp509C12 (European Nucleotide Archive - EBI EIE80372.1) and the cytochrome reductase protein called RoCPRI, which transfers the NADPH necessary for hydroxylase activity ⁇ European Nucleotide Archive - EBI EIE89541.1) (Petric et al., 2010, J Biotechnol., 150 (3): 428-437; WO201 1042143A1).
  • the 11 a-hydroxylase Cyp509C12 performs the hydroxylation in position 11 ⁇ and 6 ⁇ of various tunings of pharmacological and / or industrial interest, including progesterone (hereinafter, PROG), deoxycorticosterone (hereinafter, DOC), testosterone (hereinafter, TEST ), and deoxicortisol (hereinafter, Reichstein's Substance S, RSS).
  • PROG progesterone
  • DOC deoxycorticosterone
  • TEST testosterone
  • RSS deoxicortisol
  • Cytochrome 11 a-hydroxylase (GenBank DD180525.1) and the cytochrome reductase protein (GenBank AR838156.1) from A. ochraceus have also been identified (US7033807).
  • This 11 a-hydroxylase uses as a substrate various tunings of pharmacological and / or industrial interest, including PROG, TEST, AD, ADD, aldone, canrenone, mexrenone and derivatives of the latter.
  • the cytochrome CYP509C12 and cytochrome reductase RoCPRI proteins of R. oryzae have been produced heterologously in Schizosaccharomyces pombe yeast and the hydroxylated products in position 1 1a and 6 ⁇ have been identified, as well as other unidentified compounds, from PROG, DOC , TEST and RSS, (Petric et al., 2010, J Biotechnol., 150 (3): 428-437; WO2011042143A1).
  • these yeasts are not currently used for industrial production due to the low yields for the hydroxylation of these tuners.
  • the cytochrome P450 11 a-hydroxylase from A. ochraceus has been expressed in insect cells from a cDNA library. Its enzymatic activity (measured in the microsomal fraction) has been obtained in coexpression with the cytochrome reductase (CPR) of A. ochraceus found by similarity with that already identified of A. niger or in coexpression with a human CPR (US7033807).
  • CPR cytochrome reductase
  • Corynebacterium glutamicum is an actinobacterium widely studied for its use as an industrial producer of amino acids, which is why today there are numerous molecular tools for its modification.
  • the production spectrum of C. glutamicum has been extended in recent decades to different chemicals, materials and fuels through multiple genetic and metabolic engineering strategies.
  • this bacterium does not use spheroids as a source of carbon and energy, since it lacks the majority of the genes related to their catabolism.
  • Its genome is sequenced and has been extensively studied, becoming a bacterial chassis for industrial biotransformations, with characteristics that make it an ideal platform for this type of biotransformations such as the multitude of molecular tools for handling, robustness and metabolic vigor
  • Mycobacterium smegmatis mc 2 155 is an actinobacterium capable of metabolizing spheroids and using them as a source of carbon and energy.
  • mutants of this strain were developed for the production of tuners such as AD and ADD from phytosterols. In these strains the pathway of degradation of cholesterol or phytosterols was blocked, so the degradation of the compound does not follow and ADD (M. smegmatis mc 2 155 ⁇ 6039, CECT 8331) and AD (M. smegmatis mc 2 155 ⁇ 6039 ⁇ 5941, CECT 8332) (WO2015128534).
  • the present invention provides recombinant bacteria capable of efficiently hydroxylating compounds with steroid structure in position 11 a. These bacteria allow, therefore, to carry out microbial biotransformation processes in which steroidal compounds are efficiently and economically generated 1 1a hydroxylated and intermediate products precursors thereof (tuned) 11a hydroxylated.
  • These precursors are, for example, but not limited to, 11 a-hydroxyprogesterone (11a-OH-PROG), 1 1a-hydroxy-deoxycorticosterone (11a-OH-DOC), 11 a-hydroxy-testosterone (11a-OH-TEST ), 11 a-hydroxy-dehydroepiandrosterone (11 ⁇ - ⁇ -DHEA), 11a-hydroxy-4-androsten-3,17-dione (11 -OH-AD) and 11 a-hydroxy-1, 4- androstadien-3 , 17-diona (11a-OH-ADD).
  • 11 a-hydroxyprogesterone 11a-OH-PROG
  • 1 1a-hydroxy-deoxycorticosterone 11a-OH-DOC
  • 11 a-OH-TEST 11 a-hydroxy-testosterone
  • 11 a-OH-DHEA 11 a-hydroxy-dehydroepiandrosterone
  • 11 -OH-AD 11a-hydroxy-4-and
  • hydroxylated compounds could not be synthesized directly from low-cost raw materials, such as natural sterols, in a single step, since hydroxylation was performed from an intermediate syntone (AD, ADD, TEST, PROG, etc. .) in a process carried out by fungal CYP / CPR systems such as Rhizopus oryzae or Aspergillus ochraceus.
  • One of the advantages of the present invention is that it allows to obtain hydroxylated spheroids 11 from natural sterols in a single fermentation process.
  • the present invention represents a solution to this problem, since the developed recombinant bacteria are capable of hydroxylating in a 1 1 position to compounds with a steroid structure, both from syntones and natural sterols, generating high hydroxylated steroidal compounds 1 1a purity with high production performance thanks to a drastic reduction of secondary products.
  • the recombinant bacteria of the invention has been started from actinobacteria cells, preferably from Corynebacterium glutamicum R31 or Mycobacterium smegmatis me 2 155, where the DNA sequences encoding the cells have been heterologously expressed by means of a synthetic operon.
  • Enzymes involved in the 1 1a-hydroxylase activity in the R. oryzae fungus are a cytochrome P450 (CYP509C12) and its corresponding NADPH-dependent cytochrome reductase (RoCPRI).
  • Both enzymes have been expressed in said bacteria through the design and construction of an operon comprising the DNA encoding said cytochrome and said reductase and in which they have also been introduced certain modifications / improvements for its expression in bacteria, such as codon optimization, restriction sites, consensus sequences, etc.
  • the M. smegmatis host strains employed in the present invention as starting cells are preferably mutants that produce AD and ADD tunings from cholesterol and phytosterols.
  • recombinant bacterial biocatalysts capable of hydroxylating steroids in position 11 have been developed by a one-step biotransformation process, in which both non-hydroxylated and natural sterols can be used as starting material, which You can't get it with mushrooms or yeasts.
  • the modified strain of C. glutamicum of the present invention is capable of producing the 1 1a-hydroxylated tunings: 1 1 a-OH-PROG, 1 1 a-OH-DOC, 1 1 a-OH-TEST, 11 a -OH-DH EA, 11 a-OH-AD and 1 1 a-OH-ADD substantially pure, from their corresponding non-hydroxylated precursors (tuners) PROG, DOC, TEST, DHEA, AD and ADD, respectively.
  • the modified strain of M. smegmatis CECT 8331 of the present invention is capable of producing substantially pure 1 1 a-hydroxylated 1 1 a-OH-ADD from natural sterols.
  • the modified strain of M. smegmatis CECT 8332 of the present invention is capable of producing substantially pure, ⁇ - ⁇ -AD 11-a-hydroxylated mannone, from natural sterols.
  • a first aspect of the present invention relates to a gene or genetic construct comprising a nucleotide sequence encoding the cytochrome CYP509C12 of Rhizopus oryzae and a nucleotide sequence encoding the RoCPRI reductase of R. oryzae. From now on, this aspect will be referred to as the "gene construct of the invention”.
  • the nucleotide sequence encoding the cytochrome CYP509C12 and the nucleotide sequence encoding the RoCPRI reductase from R. oryzae are in the form of an operon.
  • "Operon” means a functional genetic unit formed by a group or complex of genes capable of exerting a regulation of their own expression by means of substrates with ios that interact the proteins encoded by their genes. In the present invention, this operon will also be referred to as "FU operon".
  • the gene construct of the invention may further comprise other regulatory elements of gene expression, such as, for example, but not limited to, promoters, regulators, operators, terminators, inductors, etc.
  • a "promoter” is a control element that is a region of DNA with a sequence that is recognized by RNA polymerase to begin transcription. It is found immediately before the structural genes coding for CYP509C12 and RoCPRI.
  • the promoter referred to in the present invention may be constitutive or inducible, preferably inducible.
  • prokaryotic promoters include, for example, but not limited to, promoters of the genes trp, hps, recA, lacZ, lacl, tet, gal, trc, or tac of Escherichia coli, or the promoter of the ⁇ -amylase gene of Bacillus subtilis.
  • An "operator is another control element that is a region of DNA with a sequence that is recognized by the regulatory protein. The operator is located between the promoter region and structural genes.
  • a “regulator” is a DNA sequence that encodes the regulatory protein that recognizes the sequence of the operator region. The regulatory gene is close to the structural genes of the operon but is not immediately next.
  • An Inductor is the substrate or compound whose presence / absence induces the expression of the rest of the genes that make up the operon. It can act by activating the expression, calling itself” activator “or repressing it, calling itself” repressor. "
  • the gene construct of the present invention preferably comprises nucleotide sequences in the form of an inducible operon, meaning "inducible operon" which is not normally expressed and is activated in response to an inducing agent that functions as an activator, of so that at the moment when the inductor joins the operator, the promoter is activated and transcription of the structural genes begins.
  • the classic model of this type of operon is the lactose operon.
  • Other examples of inducible operons are, but not limited to, those that code for enzymes that participate in the metabolism of substrates such as maltose, arabinose operon, etc.
  • the operon is preferably inducible by IPTG.
  • the gene construct of the invention is comprised in an expression vector.
  • expression vector refers to a DNA molecule in which another DNA fragment can be integrated without losing the capacity for self-replication.
  • expression vector refers to a cloning vector suitable for expressing a nucleic acid that has been cloned therein after being introduced into a host cell. Said nucleic acid is generally operatively linked to control sequences.
  • the vector is selected from the group consisting of: plasmids, phages, cosmids, phagemids, artificial yeast chromosomes (YAC), artificial bacterial chromosomes (BAC), artificial human chromosomes (HAC), viral vectors, such as adenovirus, retrovirus or any other type of DNA molecule capable of replicating inside a cell, preferably prokaryotic.
  • the gene construct of the invention is comprised in a plasmid.
  • Examples of plasmids into which the gene construct of the invention can be introduced are, but not limited to, pGH, pMV261, pECXK-99E, etc., preferably pMV261 and pECXK-99E. Due to the degeneracy of the genetic code, in which several nucleotide triplets give rise to the same amino acid, there are several nucleotide sequences that give rise to the same amino acid sequence.
  • nucleotide sequence refers to a polymeric form of nucleotides of any length that may or may not be chemical or biochemically modified. They refer, therefore, to any polyiribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, both single-stranded and double-stranded.
  • nucleotide sequences comprised in the gene construct of the invention may comprise, in addition to the coding sequence, other elements, such as, but not limited to, non-coding sequences at the 5 'or 3' ends, ribosome binding sites, or sequences stabilizers
  • These polynucleotides can additionally also include coding sequences for additional amino acids that may be useful, for example, but not limited to increasing the stability of the peptide generated from it or allowing a better purification thereof.
  • the cytochrome Cyp509C12 is that described in the European Nucleotide Archive - EBI EIE80372.1 and the cytochrome reductase protein RoCPRI is that described in the European Nucleotide Archive - EBI EIE89541.1.
  • nucleotide sequences encoding the cytochrome CYP509C12 and the RoCPRI reductase of Rhizopus oryzae are optimized for expression in bacteria, that is, the codons of said nucleotide sequences are optimized.
  • nucleotide sequence encoding the cytochrome CYP509C12 is SEQ ID NO: 1.
  • nucleotide sequence encoding the RoCPRI reductase is SEQ ID NO: 2.
  • the gene construct of the invention further comprises a consensus sequence for a ribosome binding site or sequence.
  • Shine Dalgarno upstream (“upstream") of each of the start codons (ATG) of each nucleotide sequence to achieve optimal translation of mRNA in bacteria.
  • this consensus sequence is located 6 bp (6 nucleotides) upstream of each of the start codons of each nucleotide sequence.
  • this consensus sequence is SEQ ID NO: 3.
  • the gene construct of the invention further comprises at least two restriction sites to facilitate different cloning options.
  • restriction sites that can be introduced into the gene construct of the invention are, but are not limited to, f ⁇ amHI, Pstl, Sac ⁇ , Nco ⁇ , PvuW, ⁇ ⁇ , Mfe ⁇ , Nde ⁇ , EcoR ⁇ and / or Xba ⁇ .
  • the gene construct of the invention further comprises a codon that results in an alanine located in the second position of each of the two translated proteins. In this way, the translation of recombinant proteins in bacterial ribosomes is increased. Codons that give rise to alanine are GCU, GCC, GCA or GCG. An example of a structural arrangement of the gene construct of the invention is shown in Fig. 1.
  • the gene construct of the invention can be introduced into a bacterial cell such that said construct is maintained as a chromosomal integrant or as a self-replicating extrachromosomal vector, for example, a plasmid, a minichromosome, or an artificial chromosome.
  • the gene construct of the invention may comprise any means or element to ensure its self-replication.
  • the gene construct of the invention may be one that, when introduced into the host cell, is integrated into the genome and replicated together with the chromosome (s) in which it has been integrated .
  • bacterial cell of the invention expresses cytochrome CYP509C12 and RoCPRI reductase from Rhizopus oryzae because it comprises the gene construct of the invention, in a self-replicating form or integrated in its chromosome.
  • expression includes any stage involved in the production of these enzymes that includes, but is not limited to, transcription, post-transcriptional modification, translation, post-translational modification, and secretion.
  • the bacterial cell must be transformed into a competent cell, preferably electrocompetent, for the subsequent introduction of the gene construct of the invention.
  • Methods for producing electrocompetent cells are well known to those skilled in the art.
  • the method employed in the present invention is RbCI and thermal shock or that described in Parish and Stoker (1998, Mycobacteria Protocols. Totowa, NJ, Humana Press).
  • Various methods for the transformation of bacterial cells with gene constructs are well known in the art.
  • the method preferably used in the present invention for the introduction of the gene construct of the invention into a bacterial cell is electroporation.
  • the bacterial cell of the invention is an actinobacteria cell.
  • said cell is a cell of the Corynebacterium glutamicum species, even more preferably C. glutamicum R31.
  • said cell is a cell of the species Mycobacterium smegmatis, even more preferably M. smegmatis me 2 155.
  • the bacterial cell of the invention of the species Mycobacterium smegmatis further comprises functionally inactivated or totally or partially deleted at least one endogenous nucleotide sequence encoding the reductase component of the enzyme 3-ketosteroid-9a-hydroxylase.
  • this cell comprising functionally inactivated or totally or partially deleted at least one endogenous nucleotide sequence encoding the reductase component of the 3- ketosteroid 9a-hydroxylase enzyme is M. smegmatis CECT 8331 cell.
  • this cell of the invention of the Mycobacterium smegmatis species which further comprises functionally inactivated or totally or partially deleted at least one endogenous nucleotide sequence encoding the reductase component of the enzyme 3-ketosteroid-9a-hydroxylase, further comprises functionally inactivated or totally or partially deleted at least one endogenous nucleotide sequence encoding the 3-ketosteroid-A1-dehydrogenase enzyme.
  • this cell comprising functionally inactivated or totally or partially deleted at least one endogenous nucleotide sequence encoding the reductase component of the 3- ketosteroid 9a-hydroxylase enzyme and which further comprises functionally inactivated or totally or partially deleted at least one endogenous nucleotide sequence encoding the 3-ketosteroid-A1-dehydrogenase enzyme is the cell of M. smegmatis CECT 8332. These strains CECT 8331 and CECT 8332, described in WO2015128534, have blocked the pathway of cholesterol or phytosterols degradation , so that the degradation of the compound does not follow and ADD (M.
  • strains are preferably used as starting cells in this invention for the development of the bacterial cell of the invention comprising the gene construct of the invention.
  • the wild bacteria M. smegmatis me 2 155 cannot use substances AD and ADD as a carbon source when these substances are added to a culture medium, despite being intermediaries of bacterial cholesterol catabolism. In this way, the M. smegmatis me 2 155 bacteria is an ideal bacterium for the production of the intermediate AD and ADD necessary for the production of their corresponding hydroxylated derivatives, since once secreted to the medium they cannot be catabolized by the metabolism of bacterium.
  • deletion of a gene refers to the total or partial elimination of a gene by total or partial elimination of the DNA sequence that characterizes that gene in the genome of a bacterium.
  • functionally inactivated nucleotide sequence refers to a nucleotide sequence that is not capable of exerting its functionality, that is, it is not capable of providing a functional enzyme.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the bacterial cell of the invention for the production of hydroxylated spheroids 1, hydroxylated steroidal compounds 11a or derivatives thereof, or hydroxylated 1 1a syntheses.
  • hydroxylated spheroids 11a or hydroxylated tuners 1a are produced from non-hydroxylated tuners.
  • the 11 to hydroxylated tuners produced are 11 a-OH-PROG, 11 a-OH-DOC, 11 a-OH-TEST, 11 a-OH-DHEA, 11 a-OH-AD and / or 11 a-OH-ADD and the non-hydroxylated syntones from which the former are produced are PROG, DOC, TEST, DHEA, AD and / or ADD, respectively.
  • the producer cell of these indicated 11 to hydroxylated tuners, preferably 11 a-OH-PROG from PROG is the cell of the invention of the species C. glutamicum.
  • the hydroxylated syntone 11 produced is 11 a-OH-ADD and is produced from natural sterols.
  • the bacterial cell that produces this indicated 11 to hydroxylated syntone is the cell of the invention of the species M. smegmatis which also comprises functionally inactivated or totally or partially deleted at least one endogenous nucleotide sequence encoding the component 3-ketosteroid-9a-hydroxylase enzyme reductase, preferably strain CECT 8331.
  • the 1 to 1 hydroxylated syntone produced is 11 a-OH-AD and is produced from natural sterols.
  • the bacterial cell that produces this indicated 11 to hydroxylated syntone is the cell of the invention of the species M. smegmatis which also comprises functionally inactivated or totally or partially deleted at least one endogenous nucleotide sequence encoding the component 3-ketosteroid-9a-hydroxylase enzyme reductase and at least one endogenous nucleotide sequence encoding the 3-ketosteroid-A1-dehydrogenase enzyme, preferably strain CECT 8332.
  • the "natural sterols" referred to in the present invention are preferably cholesterol or phytosterols, although other steroids 3- ⁇ alcohols could also be used as starting material.
  • phytosterols are, but are not limited to, sitosterol, stigmasterol, campesterol or brasicasterol.
  • the natural sterols used in the present invention may be only cholesterol or a phytosterol, or a mixture of phytosterols.
  • hydroxylated steroids 11 are those compounds with hydroxylated steroid structure in position 1 1a, preferably those that are part of the families of Estrogens, Androgens, Progestogens and Glucocorticoids; for example, estrone, estradiol, testosterone or fluoxymestrone, among others.
  • Another aspect of the invention relates to a method of microbial (bacterial) biotransformation of steroidal substrates in their corresponding hydroxylated derivatives 1 or a process for the production of steroids 11 to hydroxylated or synthesized 1 to hydroxylated comprising the steps of: a. contacting a culture of the bacterial cell of the invention with a steroidal substrate,
  • step (b) incubate the mixture from step (a) under fermentation conditions, and c. separate from the culture medium the hydroxylated steroids 1 or 1a hydroxylated ones produced after the incubation of step (b).
  • the process of the invention can be carried out both at the laboratory and at the industrial level, although preferably it is carried out at the industrial level in a bioreactor.
  • the culture medium of step (a) comprises an additional carbon source, more preferably glycerol.
  • the culture medium of step (a) comprises a surfactant.
  • Said surfactant is selected, but not limited to, from polysorbate 80 (Tween 80 TM) or polysorbate 20 (Tween 20 TM).
  • the culture medium of step (a) may also comprise phosphate buffer.
  • the culture medium of step (a) comprises at least one antibiotic.
  • Said antibiotic is selected, but not limited to, from among kanamycin, gentamicin, or any combination thereof.
  • step (a) can be carried out, for example, but not limited to, in liquid medium or solid medium.
  • Culture media and conditions for bacterial cell growth are widely known to those skilled in the art.
  • the culture medium comprises all the elements and nutrients necessary for the growth and survival of the bacterial cell of the invention and to favor its fermentation activity.
  • said culture medium may comprise, but not limited to, carbon sources (for example, glucose, sucrose, glycerol or mannitol), sources of vitamins, amino acids, inorganic salts, etc.
  • the bacterial cell of the invention In order for the bacterial cell of the invention to grow properly in the culture medium, it must meet a series of conditions such as temperature, agitation, humidity, and adequate oxygen pressure, as well as a correct degree of acidity or alkalinity (pH ). Likewise, the culture medium must be free of all contaminating microorganisms.
  • said conditions include stirring and incubation at a temperature between 30 and 37 ° C. More preferably, T a is 30 ° C when the bacterial cell of the invention is of the species C. glutamicum and 37 ° C when the bacterial cell of the invention is of the species M. smegmatis.
  • the incubation is preferably carried out for a time between 25 and 35 h, more preferably for 30 h when the bacterial cell of the invention is of the species C. glutamicum. Cultures of the bacterial cell of the invention must be induced by the corresponding activator compound if the promoter employed in the gene construct of the invention is inducible.
  • the bacterial culture in the method of the invention is induced with IPTG.
  • the steroidal substrate of step (a) is selected from the list consisting of: phytosterols, cholesterol, PROG, DOC, TEST, DHEA, AD or ADD, or any combination thereof.
  • the starting steroidal substrate of step (a) is phytosterols and / or cholesterol
  • the hydroxylated syntone 1 1a produced is 1-OH-AD
  • the bacterial cell used for production is the cell of the invention of the species M.
  • smegmatis which further comprises functionally inactivated or totally or partially deleted at least one endogenous nucleotide sequence encoding the reductase component of the 3- ketosteroid 9a-hydroxylase enzyme and at least one endogenous nucleotide sequence encoding the enzyme 3-ketosteroid-A1-dehydrogenase, preferably strain CECT 8332.
  • the starting steroidal substrate of step (a) is phytosterols and / or cholesterol
  • syntone 1 1a- hydroxylated produced is 11 a-OH-ADD
  • the bacterial cell used for production is the cell of the invention of the species M.
  • smegmatis which also comprises inactive Functionally or totally or partially deleted at least one endogenous nucleotide sequence encoding the reductase component of the 3- ketosteroid 9a-hydroxylase enzyme, preferably strain CECT 8331.
  • the starting steroidal substrate of step (a) is AD, ADD, PROG, DOC, DHEA and / or TEST, preferably PROG
  • the hydroxylated syntone 11 produced is 11 a-OH- PROG, 11 a-OH-DOC, 11 a-OH-TEST, 11 a-OH-DHEA, 11 a-OH-AD and / or 11 a-OH-ADD, preferably 11 a-OH-PROG
  • the cell Producer bacterial is the bacterial cell of the invention, more preferably the cell of the invention of the species C. glutamicum.
  • the process of the invention may comprise other additional steps or steps, such as a previous step of preparing and sterilizing a mixture of tuners or natural sterols or both, preferably in a polyalcohol or vegetable oil, with or without the addition of salts. minerals and / or a step of preparing and growing a culture of the bacterial cell of the invention prior to its exposure to the steroidal substrate.
  • the hydroxylated 11 ⁇ steroids or hydroxylated 11 ⁇ syntheses produced by the process of the invention are secreted, together with other metabolites or compounds, in the culture medium, and these can be recovered directly from the medium.
  • the cell pellet can be separated to obtain a solution comprising the hydroxylated steroid / s 1 s or the syntone / s 11 to hydroxylated / s produced / s.
  • a solution comprising the hydroxylated steroid / s 1 s or the syntone / s 11 to hydroxylated / s produced / s.
  • step (b) of the process of the invention an extraction step takes place in which the sediments are discarded and the supernatants are selected. Said supernatants are subsequently used to obtain the 1 1 to hydroxylated steroids or 1 1 to hydroxylated steroids present therein.
  • These compounds secreted to the culture medium by the bacterial cell of the invention can be recovered from the medium using methods known in the art. For example, by conventional procedures including, but not limited to, centrifugation, filtration, extraction, evaporation and / or precipitation.
  • These compounds produced by the bacterial cell of the invention in culture can be purified by a variety of methods known in the art including, but not limited to, chromatography (eg, HPLC, HPLC-DAD, TLC, LC-MS, ion exchange, affinity , hydrophobic, chromato-focus, and molecular exclusion), electrophoretic procedures (for example, preparatory isoelectric focusing), differential solubility (for example, precipitation with ammonium sulfate), SDS-PAGE, precipitation or extraction, in order to obtain steroids 11 to hydroxylates or substantially pure hydroxylated 1,1a tunes.
  • chromatography eg, HPLC, HPLC-DAD, TLC, LC-MS, ion exchange, affinity , hydrophobic, chromato-focus, and molecular exclusion
  • electrophoretic procedures for example, preparatory isoelectric focusing
  • differential solubility for example, precipitation with ammonium sulfate
  • SDS-PAGE precipitation or extraction
  • These compounds produced by the bacterial cell of the invention in culture can be detected using methods known in the art. These detection procedures may include, for example, but not limited to, chromatography, NMR, mass spectrometry, or the like.
  • the present invention thus relates to genetically modified strains of M. smegmatis me 2 155 containing a synthetic operon (FUN) encoding the cytochrome CYP509C12 and the cytochrome reductase RoCPRI of R. oryzae, as well as to the processes to produce 1 a-OH-AD and 11 a-OH-ADD from natural sterols, such as cholesterol or phytosterols, using said modified strains.
  • FUN synthetic operon
  • the present invention also relates to genetically modified strains of C. glutamicum R31 containing a synthetic operon (FUN) encoding the cytochrome CYP509C12 and the cytochrome reductase RoCPRI of R. oryzae, as well as the processes for producing 1 1 a-OH -PROG, H a-OH-DOC, 11 a-OH-DHEA and / or 11 a-OH-TEST, among others, substantially pure from the corresponding tunings.
  • the invention relates to the use of the recombinant strain M. smegmatis CECT 8331, which is a mutant strain derived from M.
  • smegmatis me 2 155 comprising at least one nucleotide sequence encoding the reductase component of the 3-ketosteroid enzyme 9a -hydroxylase functionally inactivated or totally or partially deleted, which carries a plasmid comprising the FUN operon, which is capable of producing 11 a-OH-ADD in a substantially pure manner.
  • the invention relates to the use of said bacterial strain for the production of 11 a-OH-ADD in substantially pure form by fermentation of natural sterols.
  • the invention relates to the use of the recombinant strain M. smegmatis CECT 8332, which is a mutant strain derived from M. smegmatis me 2 155 which comprises at least one nucleoid sequence encoding the reductive component of the 3-ceiosyeroid enzyme.
  • the invention relates to the use of said bacterial strain for the production of 1,1-OH-AD in substantially pure form by fermentation of natural sterols.
  • the invention relates to the use of the recombinant strain C. glutamicum R31 which carries a plasmid comprising the FUN operon, which is capable of producing hydroxylated spheroids in position 11 a (H a-OH-PROG, Ha-OH-DOC, 11 a-OH-TEST, 11 a-OH-DHEA, 11 a-OH-AD and 1 1 a-OH-ADD) from their corresponding tunes (PROG, DOC, TEST, DHEA, AD and ADD, respectively) in a substantially pure way.
  • the invention relates to the use of said bacterial strain for the production of 11 a-OH- PROG, H a-OH-DOC, 11 a-OH-TEST, 1 a-OH-DHEA, 11 a-OH-AD and 11 a-OH-ADD in substantially pure form from their corresponding tunes: PROG, DOC , TEST, DHEA, AD and ADD, respectively.
  • the word "comprises” and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
  • other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention.
  • the following examples and figures are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
  • FIG. 1 Scheme of the FUN operon.
  • FIG. 2. Biotransformation of PROG in 11 a-OH-PROG using strain C. glutamicum R31 (pXKFUN). The consumption of PROG (gray dotted line) and the appearance of 1 1a-OH-PROG (continuous black line) are represented.
  • FIG. 3 Crómate-grammes of LC-MS showing the production of 11 aOH-progesterone from progesterone in strain C. glutamicum R31 (pECXK-99E) used as a negative control (A) and strain C. glutamicum R31 (pXKFUN) (B).
  • PROG, 11 a-OH-PROG and TEST which has been used as an internal standard (ISTD). Mass spectra obtained from the m / z ions between 150-400 (full sean) present in the sample (above line). Mass spectrum of the characteristic 315 ion of the PROG compound (middle line). Mass spectrum of ion 331.3 characteristic of compound 11a-OH-PROG (bottom line).
  • FIG. 4 Biotransformation of cholesterol (CHO) in 11 a-OH-ADD using strain M. smegmatis CECT 8331 (pMVFUN). CHO consumption and the appearance of 11 ⁇ - ⁇ -ADD and other by-products are shown: ADD and 1 1 a-OH-AD.
  • FIG. 5 Biotransformation of phytosterols (FITO) in 11 a-OH-ADD using strain M. smegmatis CECT 8331 (pMVFUN). It shows the consumption of phytosterols and the appearance of 11 a-OH-ADD and other by-products: ADD.
  • FIG. 6. Biotransformation of cholesterol (CHO) in 11 a-OH-AD using strain M. smegmatis CECT 8332 (pMVFUN). CHO consumption and the appearance of 11 a-OH-AD and other by-products are shown: AD, 11 a-OH-ADD and 4-HBC (220H-23.24-bisnorchol-4-en-3-one).
  • FIG. 7 Biotransformation of phytosterols (FITO) in 11 a-OH-AD using strain M. smegmatis CECT 8332 (pMVFUN). The consumption of FITO and the appearance of 11 a-OH-AD and other by-products are shown: AD and 4-HBC (220H-23,24-bisnorchol-4-en-3- ona).
  • FITO phytosterols
  • EXAMPLE 1 Bacteria used and culture methods.
  • the bacterial strains used in this invention are:
  • Plasmid pMV261 (Expression vector in mycobacteria, under the control of the promoter Pns eo, KmR).
  • Plasmid pECXK-99E (Bifunctional vector E. coli / C. Glutamicum, which contains the gene lacl q , KmR).
  • the rich medium used to grow E. coli cells was the Lysogenic Broth (LB) medium. Cultures in solid medium were performed with LB medium to which Bacto Agar (Pronadisa) was added at 1.5% (w / v). If necessary antibiotics were added at the following final concentrations: ampicillin (100 ⁇ g mi "1 ) , kanamycin (50 ⁇ g mi " 1 ), chloramphenicol (20 ⁇ g mi " 1 ). E. coli cells were grown at 37 ° C. Cultures in liquid medium were carried out on an orbital shaker at 250 rpm. Growth in liquid medium was followed by turbidimetry at 600 nm (D0 6 oo) using a UVMini-1240 spectrophotometer (Shimadzu).
  • the rich medium Bacto Middiebrook 7H10 Agar (7H10) (Difco) was used as a solid medium, and Middiebrook 7H9 Broth (7H9) (Difco) as a liquid medium.
  • Media 7H9 and 7H10 were supplied with 0.2% (v / v) of glycerol and 10% (v / v) of Middiebrook ADC Enrichment (ADC) (Difco) (7H9 / GN / ADC and 7H 10 / Gli / ADC ).
  • TSA Tryptic Soy Agar
  • TTB Tryptic Soy Broth
  • C glutamicum cells were grown at 30 ° C. Cultures in liquid medium were carried out on an orbital shaker at 250 rpm. Growth in liquid medium. It was followed by 600 nm turbidimetry (D0 6 oo) using a UVMini-1240 spectrophotometer (Shimadzu).
  • EXAMPLE 2 Methods of genetic transformation for the construction of recombinant strains.
  • E. coli cells were genetically modified by transformation after making them competent by the method of RbCI and thermal shock.
  • Fresh medium is inoculated with D0 6 oo 0.01 (200 ml 7H9 / Gli / ADC / Tween in 11 flask) and incubated with stirring (200 rpm) at 30 ° C until a D0 6 oo of 0.8-1 (18 h of culture approximately). The culture is then maintained 1.5 h on ice and centrifuged in 4 50 ml conical tubes at 3000 xga at 4 ° C for 10 min.
  • the cells are resuspended by gently turning in 200 ml of a 10% (v / v) solution of glycerol and 0.05% (v / v) of Tween-80 (Gli / Tween) cooled in ice.
  • the cell suspension is then centrifuged, the supernatant is removed and resuspended again in 100 ml of the same Gli / Tween solution. After a third centrifugation step, 25 ml of Gli / Tween are added.
  • the cells are resuspended by turning and allowed to stand to settle the aggregates.
  • the cells are resuspended by gently turning in 200 ml of a 10% (v / v) solution of ice-cold glycerol.
  • the cell suspension is then centrifuged, the supernatant is removed and resuspended again in 100 ml of the same solution.
  • 25 ml of 10% (v / v) glycerol are added.
  • the cells are resuspended by turning and allowed to settle to settle the aggregates. Subsequently, the suspension is taken without the aggregates with a sterile pipette. The suspension is taken to a clean ice-cold conical tube and centrifuged.
  • EXAMPLE 3 Design and construction of the FUN operon and the recombinant plasmids that carry it.
  • the synthetic operon called FUN was designed, which contains the genes cyp509C12 and roCPRI of R. oryzae, which encode the cytochrome CYP509C12 with 11 a-hydroxylase activity and the Cytochrome reductase protein RoCPRI necessary for its activity, respectively.
  • the use of codons was optimized manually for the Mycobacterium and Rhodococcus bacteria, while maintaining a 82.8% nucleotide identity percentage for cytochrome and 83.24% for CPR.
  • a Shine Dalgarno / RBS sequence (SEQ ID NO. 3: AAAGGGAG) 6 nucleotides was added upstream from the respective start codons of each gene.
  • Various restriction sites were also added to facilitate different cloning options.
  • alanine was added as the second amino acid to increase protein translation.
  • the designed operon was synthesized by chemical synthesis and was initially cloned into plasmid pGH generating the recombinant plasmid pGH-FUN that was used to transform competent E. coli DH10B cells. Plasmid pGH-FUN was sequenced to verify that the cloned operon sequence was correct.
  • the scheme of the FUN operon can be seen in Figure 1.
  • Plasmid pGH-FUN was digested with fiam and EcoRI to release the fragment containing the FUN operon and this was subcloned into plasmid pMV261, with double origin of replication for E. coli / Mycobacterium; resulting in the vector pMVFUN that will express the genes under control of the constitutive promoter P hps .
  • Plasmid pMVFUN was initially cloned into E. coli DH10B where it was sequenced to verify that the construction was correct. Plasmids pMV261 and pMVFUN were subsequently isolated from carrier E. coli strains and transformed into M. smegmatis by electroporation.
  • Plasmid pGH-FUN was digested with Sac ⁇ and Xba ⁇ to release the fragment containing the FUN operon and this was subcloned into plasmid pECXK-99E, with double origin of replication for E. coli / C. glutamicum resulting in the pXKFUN vector that will express the genes under control of the Ptrc promoter, inducible by IPTG.
  • Plasmid pXKFUN was initially cloned in E. coli DH 10B where it was sequenced to verify that the construction was correct. Plasmids pECXK-99E and pXKFUN were subsequently isolated from carrier E. coli strains and transformed into C. glutamicum by electroporation.
  • EXAMPLE 4 Steroid analysis techniques. 1.- Extraction methods A.- Steroid extraction in reaction systems with resting cells.
  • the extraction of the steroids to be analyzed from reaction systems with resting cells was carried out by collecting aliquots (1 ml) of the reaction to which the corresponding internal standards (testosterone) were added to the concentration of interest (250 ⁇ ) before starting the extraction process.
  • Samples with the internal standard are extracted in 10 ml of chloroform and homogenized using a Bullet Blender 50-DX-CE homogenizer at speed 12, for 3 min. After rupture, the cells are centrifuged 10 min at 4000 x g at 4 ° C and subsequently the tubes are frozen at -80 ° C for 10-15 min to properly separate the two phases.
  • the organic phase is collected, passed into 50 ml conical tubes and evaporated completely at 70 ° C.
  • B.- Steroid extraction in reaction systems with cells in culture The steroid extraction to be analyzed by the different chromatographic techniques in reaction systems with cells in culture was carried out by collecting aliquots (0.2 ml) of the different cultures to which the corresponding internal standards were added to the concentration of interest , indicated in each case, before starting the extraction process. Samples with the internal standard are extracted in 0.5 ml of chloroform and homogenized using a vortex for 30 s. The samples are frozen at -80 ° C for 10-15 min to properly separate the two phases. The organic phase is collected, transferred to 2 ml eppendorf tubes and evaporated at 70 ° C.
  • A. - FINE LAYER CHROMATOGRAPH (FTA).
  • the TLC plates used (Silica gel 60 F254 20 x 20 cm, Merck) are trimmed leaving 1 cm of margin on each side, 8 cm of stroke and 1 cm of separation between sample and sample.
  • the different samples taken are resuspended in acetonitrile in a volume between 10-20 ⁇ depending on the expected concentration in each case.
  • 10 ⁇ of each sample is loaded onto the TLC plate and a mixture of chloroform: ethanol (95: 5) (Merck) is used as the mobile phase.
  • the different steroids of biotransformations are revealed with a solution of 20% (v / v) of H 2 S0 4 .
  • the detection and quantification of the products generated in the steroid biotransformation reactions was performed by HPLC-DAD-MS using a liquid chromatography equipment (Surveyor Plus LC) equipped with an automatic injector coupled in series to a DAD detector that allowed to monitor elution at DO245 and with an ionic trap (LXQ) equipped with a source of atmospheric pressure chemical ionization (APCI) and a source of isoelectronebulization (IES), all supplied by Thermo Electron (San Jose, CA, USA).
  • the data was processed with the Xcalibur software (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA). The separation is done by means of a C18 reverse phase column and a specific gradient in each case.
  • EXAMPLE 5 Biotransformation of PROG in 11 a-OH-PROG using strain C. glutamicum R31 (pXKFUN).
  • PROG progesterone biotransformation
  • glutamicum R31 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) was used, to which the spheroids were added at a final concentration of 0.5 mM, from a steroid solution prepared at 5 mM in 10% (v / v) of Tyloxapol, the final concentration thereof being therefore 1% (v / v).
  • Samples were taken to analyze the biotransformation of spheroids for 72 h. To obtain the biomass used in biotransformation, a total volume of 200 ml of C.
  • glutamicum cells grown in TSB medium was grown for 30 h at 30 ° C and 250 rpm in 1 I flask from a D0 6 oo of 0, 1, using a 48 h pre-circle grown in TSB medium, at 30 ° C and stirred at 250 rpm. If necessary, kanamycin (25 ⁇ g mi "1 ) and 0.5 mM ⁇ -aminolevulinic acid were added. Cultures were induced with 1 mM IPTG when they reached an OD600 of 1.5. These cells were collected by centrifugation (10 min, 4000 xg) and washed twice with 50 mM phosphate buffer (pH 7.4).
  • Chromatographic separation was performed on a Mediterranean Sea C18 column (150 mm ⁇ 4.6 mm internal diameter, 5 ⁇ particle size) (Teknokroma, Barcelona).
  • the mobile phases used contained water and 0.1% formic acid (A), acetonitrile and 0.1% formic acid (B).
  • the flow used was 1 ml min "1 and the linear gradient used is shown in table 1.
  • the eluent was analyzed by DAD and by the mass spectrometer from minute 1 to 50.
  • the working conditions of the equipment were: IES ionization source, capillary temperature (350 ° C), fogging coverage ( 60 ° C), capillary voltage (9 V), amplifier (400 Vp), source current (100 ⁇ ).
  • High purity nitrogen was used as auxiliary gas and nebulizer.
  • the quantitative analysis was performed by the internal standard method, from dilutions of the PROG stock solutions and 1 1 a-OH-PROG at concentrations between 500,000 ⁇ and 15,625 ⁇ , to which 250 ⁇ of testosterone was added as internal pattern
  • the extraction of analytes was carried out in the same manner as in the samples to be analyzed (see example 4, section 1). After extraction, the residues were resuspended in 500 ⁇ en of acetonitrile (LC-MaScan, LAB-SCAN) of which 25 ⁇ de was injected for chromatographic analysis.
  • the strain C. glutamicum R31 (pXKFUN) is also capable of 11 to hydroxylate other spheroids other than PROG and convert them into their corresponding derivatives 11 to hydroxylates.
  • the strain C. glutamicum R31 (pXKFUN) is supplied as a substrate, instead of PROG, substances such as DOC, TEST, AD or dehydroepiandrosterone (hereinafter, DHEA), at a concentration of 0.5 mM
  • DHEA dehydroepiandrosterone
  • the bacterial strain is capable of synthesizing 11 a-OH-DOC, 11 a-OH-TEST, 11 a-OH-AD or 11 a-OH-DHEA, respectively, with yields of 41.5 ⁇ 3.6%, 49 , 3 ⁇ 0.5%, 38.0 ⁇ 7.6% and 22.3 ⁇ 8.7%, respectively.
  • EXAMPLE 6 Biotransformation of CHO in 11 a-OH-ADD using strain M. smegmatis CECT 8331 (pMVFUN).
  • the 7H9 medium was used without supplements (without glycerol and without ADC) to which 18 mM glycerol and cholesterol were added to the final concentration of 1 mM, contained in 3.6% (v / v) of Tyloxapol. If necessary, kanamycin (20 ml "1 ) and 0.5 mM ⁇ -aminolevulinic acid were added from the moment of inoculation. A total volume of 20 ml of M.
  • smegmatis cell culture was grown at 37 ° C and 250 rpm in a 100 ml flask from a D0 6 oo of 0.1 using a 48 h pre-inoculum grown in 7H9 / Gli / ADC / Tween medium, at 37 ° C and stirred at 250 rpm. Samples were taken to analyze the biotransformation of spheroids and growth was monitored for 96 hours - Identification and quantification of ADD and 11 a-OH-ADD using CHO as substrate
  • Chromatographic separation was performed on a Tracer Excel 120 ODSB C18 column (150 mm ⁇ 4.6 mm internal diameter, 5 ⁇ particle size) (Teknokroma, Barcelona).
  • the mobile phases used contained water and 0.1% formic acid (A), acetonitrile and 0.1% formic acid (B), isopropanol and 0.1% formic acid (C).
  • the flow used was 1 ml min "1 and the linear gradient used is shown in table 2.
  • the eluent was analyzed by DAD and by the mass spectrometer from minute 1 to 52.
  • the working conditions of the equipment were: APCI ionization source, capillary temperature 275 ° C, vaporization temperature 425 ° C , capillary voltage 39 V, corona discharge voltage 6.00 kV, source current 6.00 ⁇ and 15 eV for collision dissociation energy.
  • High purity nitrogen was used as auxiliary gas and nebulizer.
  • the quantitative analysis was carried out by the internal standard method, from dilutions of the CHO stock solution, in concentrations between 1000,000 ⁇ and 15,625 ⁇ , to which 500 ⁇ of testosterone was added as internal standard.
  • the extraction of analytes was carried out in the same manner as in the samples to be analyzed (see example 4, section 1). After extraction, the residues were resuspended in 1500 ⁇ of acetonitrile (LC-MaScan, LAB-SCAN) of which 25 ⁇ de was injected for chromatographic analysis.
  • EXAMPLE 7 Biotransformation of FITO in 11 a-OH-ADD using the strain. smegmatis CECT 8331 (pMVFUN).
  • smegmatis cell culture was grown at 37 ° C and 250 rpm in a 100 ml flask from a D0 6 oo of 0.1 using a 48 h pre-inoculum grown in 7H9 / Gli / ADC / Tween medium, at 37 ° C and stirred at 250 rpm Samples were taken to analyze spheroid biotransformation and growth was monitored for 96 h. - Identification and quantification of ADD and 11 a-0H-ADD using as FITO substrate
  • the eluent was analyzed by DAD and by the mass spectrometer from minute 1 to 52.
  • the working conditions of the equipment were: APCI ionization source, capillary temperature 275 ° C, vaporization temperature 425 ° C , capillary voltage 39 V, corona discharge voltage 6.00 kV, source current 6.00 ⁇ and 15 eV for collision dissociation energy.
  • High purity nitrogen was used as auxiliary gas and nebulizer.
  • the quantitative analysis was carried out by the internal standard method, from dilutions of the FITO stock solution, in concentrations between 1000,000 ⁇ and 15,625 ⁇ , to which 500 ⁇ of testosterone was added as internal standard.
  • the extraction of analytes was carried out in the same manner as in the samples to be analyzed. After the extraction, the residues were resuspended in 1500 ⁇ of acetonitrile (LC-MaScan, LAB-SCAN) of which 25 ⁇ were injected for chromatographic analysis.
  • phytosterols solutions were prepared at a concentration of 1 mM using the molecular weight of ⁇ -sitosterol, the most abundant of the phytosterols present in the mixture, for the calculation.
  • EXAMPLE 8 Biotransformation of CHO in 11 a-OH-AD using strain M. smegmatis CECT 8332 (pMVFUN).
  • smegmatis cell culture they were grown at 37 ° C and 250 rpm in a 100 ml flask from a 6 or 0 D0 1 using a 48 h preinoculum grown in 7H9 / Gli / ADC / Tween medium, at 37 ° C and stirred at 250 rpm. Samples were taken to analyze the biotransformation of spheroids and growth was monitored for 96 h.
  • EXAMPLE 9 Biotransformation of FITO in 11 a-OH-AD using strain M. smegmatis CECT 8332 (pMVFUN).
  • 7H9 medium was used without supplements (without glycerol and without ADC) to which 18 mM glycerol and phytosterols were added to the final concentration of 1 mM, contained in 3.6% (v / v) of Tyloxapol. If necessary, kanamycin (20 ⁇ g mi "1 ) and 0.5 mM ⁇ -aminolevulinic acid were added from the moment of inoculation. A total volume of 20 ml of M.
  • smegmatis cell culture was grown at 37 ° C and 250 rpm in a 100 ml flask from a D0 6 oo of 0.1 using a 48 h pre-inoculum grown in 7H9 / Gli / ADC / Tween medium, at 37 ° C and stirred at 250 rpm Samples were taken to analyze spheroid biotransformation and growth was monitored for 96 h.

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Abstract

La presente invención proporciona un procedimiento para producir compuestos esteroideos 11α hidroxilados o derivados de los mismos por fermentación de esteroles naturales o por biotransformación de distintas sintonas esteroideas con bacterias recombinantes, preferiblemente de Mycobacterium smegmatis o de Corynebacterium glutamicum. Dichas bacterias recombinantes portan un plásmido que comprende un operón sintético que contiene los genes cyp509C12 y roCPR1 de Rhizopus oryzae, que codifican el citocromo CYP509C12 con actividad 11α-hidroxilasa y la citocromo reductasa (RoCPR1) necesaria para la actividad del citocromo. Mediante el método descrito en la presente invención se pueden producir, aunque sin limitarnos, 11α OH-ADD o 11α-OH-AD a partir de esteroles naturales como colesterol o fitoesteroles, o 1α-OH-PROG, 11α-OH-DOC, 11α-OH-TEST, 11α-OH-DHEA, 11α-OH-AD y/o 11α-OH-ADD a partir de sus correspondientes sintonas no hidroxiladas.

Description

PRODUCCIÓN DE ESTEROIDES 11 α HIDROXILADOS MEDIANTE
BIOTRANSFORM ACIÓN CON BACTERIAS RECOM BINANTES
DESCRIPCIÓN
La presente invención se encuadra dentro del campo de la industria química, farmacéutica y alimentaria, particularmente dentro de los procesos de producción de esferoides 1 1a hidroxilados y derivados de los mismos mediante biotransformaciones microbianas, tanto a partir de esteróles naturales como a partir de sintonas no hidroxiladas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los esferoides son lípidos terpénicos con una estructura definida, que contienen un núcleo de ciclopentanoperhidrofenantreno o gonano con cuatro anillos fusionados (A- D); esta estructura básica se modifica por adición de diversos grupos funcionales, como carbonilos e hidroxilos (hidrófilos) o cadenas hidrocarbonadas (hidrófobas). La actividad fisiológica de los esferoides depende de su estructura, es decir, del tipo, número y posición de los grupos funcionales unidos al núcleo esferoide, así como de su isomería configuracional y estructural, es decir, estereoisomería y regioisomería, y del estado de oxidación de los anillos.
Los esferoides se encuentran muy difundidos en la naturaleza y están presentes en todo tipo de organismos. Así, se han identificado cientos de esteróles y compuestos relacionados que se producen en las plantas, como por ejemplo los fitoesteroles; en los insectos, como por ejemplo los ecdisteroides; en los vertebrados, como por ejemplo, el colesterol, los corticoesteroides o las hormonas esteroideas; y en eucariotas inferiores (levaduras y hongos), como por ejemplo el ergosterol. Hoy en día los productos farmacéuticos de tipo esteroideo son de gran importancia para mantener nuestra calidad de vida, ya que muchos esferoides se utilizan como agentes anti-tumorales, anti-inflamatorios, anti-microbianos, anti-virales, anti-fúngicos, anti-estrogénicos, anti-convulsivos y antialérgicos. Además, otros se utilizan como agentes para la prevención y terapia de muchas otras enfermedades, tales como los cánceres hormona-dependientes de mama y de próstata, ciertas formas de cáncer de colon, la obesidad, la diabetes, la artritis reumatoide, la hipertensión, el asma, el eczema, las inflamaciones, los trastornos metabólicos, enfermedades neurodegenerativas en ancianos, o enfermedades del sistema nervioso central, entre otras muchas. Se incluyen aquí andrógenos, esferoides anabólicos, estrógenos, y corticosteroides, entre otros.
Alrededor de 300 fármacos esteroideos han sido aprobados hasta la fecha para su uso en clínica, y este número tiende a crecer. Los medicamentos esteroideos se encuentran entre los productos médicos más comercializados y representan la segunda gran categoría de fármacos junto con los antibióticos. La producción anual de esferoides se estima en más de un millón de toneladas, con un mercado de miles de millones de euros.
Muchos esferoides utilizados como fármacos se sintetizan químicamente, pero desde hace mucho tiempo se conoce que la transformación microbiana de los esferoides es una herramienta poderosa para la generación de nuevos fármacos esteroideos, así como para la producción eficiente de productos intermedios (precursores) clave para la síntesis química de tales fármacos. Las bioconversiones permiten modificar los esferoides en posiciones de la molécula difícilmente disponibles o accesibles para los agentes químicos, y la funcionalización de la molécula puede ser realizada regio- y estéreo-específicamente. Más aún, mediante la bioconversion se pueden completar varias reacciones en un solo paso. Estas y otras ventajas de las biotransformaciones han supuesto una amplia expansión de las tecnologías microbianas en el campo de los esferoides, de tal manera que las aplicaciones de los microorganismos para la modificación de esferoides se han revisado en numerosos artículos a lo largo de los últimos años (Donova y Egorova, 2012, Appl Microbiol Biotechnol., 94(6): 1423-1447).
Los principales productos intermedios o precursores para la síntesis industrial de fármacos esteroideos son 4-androsten-3, 17-diona (en adelante, AD) y 1 ,4- androstadien-3, 17-diona (en adelante, ADD); sin embargo los esferoides hidroxiiados a menudo expresan una mayor actividad biológica en comparación con sus análogos menos polares no hidroxiiados. En particular, 11 a-hidroxi-progesterona (en adelante, 11 a-OH-PROG), 11 a-hidroxi-deoxicorticosterona (en adelante, 11 a-OH-DOC), 11 a- hidroxi-testosterona (en adelante, 11 a-OH-TEST), 11 a-hidroxi-4-androsten-3,17-diona (en adelante, 1 a-OH-AD) y 11 a-hidroxi-1 ,4-androstadien-3, 17-diona (en adelante, H cs-OH-ADD) son sintonas necesarias para la obtención de glucocorticoides que, además de usarse en terapia sustitutiva, poseen propiedades farmacológicas y se emplean como antialergénicos, antiinflamatorios, inmunosupresores y anticonceptivos. Por lo tanto, la producción económica y eficiente de estos precursores o sintonas, preferiblemente 11 a hidroxiladas, es una necesidad imperante en la industria farmacéutica.
Para la obtención de las sintonas AD y ADD, una de las principales materias primas empleadas en la industria química de esferoides son las sapogeninas, tal como la diosgenina. Alternativamente también se utilizan como materiales de partida en la industria de los esferoides algunos esteróles naturales, como son los esferoides 3β- alcoholes, que contienen un doble enlace en la posición 5-6 y una cadena lateral alifática en C-17. Entre estos esferoides se encuentran el colesterol, el cual se conoce como el esteral animal, o los fitoesteroles, los cuales son mezclas de esteróles derivados de plantas, principalmente de origen de soja, como por ejemplo sitosterol, estigmasterol, campesterol, y brasicasterol. Desde la década de los 1980, la transformación microbiana de fitoesterol viene siendo un foco de investigación en el campo de los esferoides.
Actualmente en la producción industrial de compuestos esteroideos 1 1a-hidroxilados se emplean especies pertenecientes a los géneros Aspergillus o Rhizopus; en particular A. ochraceus, R. oryzae y R. nigricans. Estos hongos son capaces de hidroxilar varios compuestos esteroideos en posición 11 a, entre ellos AD o ADD; pero también modifican e hidroxilan en mayor o menor medida en otras posiciones de la molécula, lo que hace descender drásticamente los rendimientos de producción.
Hasta la fecha estos compuestos hidroxilados no se pueden sintetizar desde materias primas de bajo coste en un solo paso; la hidroxilación se hace a partir de una sintona (AD o ADD) o desde sus precursores directos.
En el caso concreto de R. oryzae se ha identificado la enzima responsable de realizar las 11 a-hidroxilaciones. Se trata de un citocromo P450 denominado Cyp509C12 (European Nucleotide Archive - EBI EIE80372.1) y la proteína citocromo reductasa denominada RoCPRI , que transfiere el NADPH necesario para la actividad hidroxilasa {European Nucleotide Archive - EBI EIE89541.1) (Petric et al., 2010, J Biotechnol., 150(3):428-437; WO201 1042143A1). La 11 a-hidroxilasa Cyp509C12 realiza la hidroxilación en posición 11 α y 6β de diversas sintonas de interés farmacológico y/o industrial, entre ellas progesterona (en adelante, PROG), deoxicorticosterona (en adelante, DOC), testosterona (en adelante, TEST), y deoxicortisol (en adelante, Reichstein's Substance S, RSS).
El citocromo 11 a-hidroxilasa (GenBank DD180525.1) y la proteína citocromo reductasa (GenBank AR838156.1) de A. ochraceus también han sido identificados (US7033807). Esta 11 a-hidroxilasa utiliza como sustrato diversas sintonas de interés farmacológico y/o industrial, entre ellas PROG, TEST, AD, ADD, aldona, canrenona, mexrenona y derivados de esta última.
Las proteínas citocromo CYP509C12 y citocromo reductasa RoCPRI de R. oryzae han sido producidas de forma heteróloga en la levadura Schizosaccharomyces pombe y se han identificado los productos hidroxilados en posición 1 1a y 6β, así como otros compuestos no identificados, a partir de PROG, DOC, TEST y RSS, (Petric et al., 2010, J Biotechnol., 150(3):428-437; WO2011042143A1). No obstante, en la actualidad no se emplean estas levaduras para la producción industrial debido a los bajos rendimientos para la hidroxilación de estas sintonas.
Por otro lado, el citocromo P450 11 a-hidroxilasa de A. ochraceus se ha expresado en células de insecto a partir de una genoteca de cDNA. Su actividad enzimática (medida en la fracción microsomal) ha sido obtenida en coexpresión con la citocromo reductasa (CPR) de A. ochraceus hallada por similitud con la ya identificada de A. niger o en coexpresión con una CPR humana (US7033807).
La bacteria Corynebacterium glutamicum es una actinobacteria ampliamente estudiada por su uso como productor industrial de aminoácidos, motivo por el cual existen hoy en día numerosas herramientas moleculares para su modificación. De hecho a partir de su descubrimiento, el espectro de producción de C. glutamicum ha sido ampliado en las últimas décadas a diferentes productos químicos, materiales y fueles mediante múltiples estrategias de ingeniería genética y metabólica. Además cabe destacar que, pese al gran parecido filogenético con el género Mycobacterium, esta bacteria no utiliza esferoides como fuente de carbono y energía, ya que carece de la mayoría de los genes relacionados con su catabolismo. Su genoma está secuenciado y ha sido ampliamente estudiado, llegándose a convertir en un chasis bacteriano para las biotransformaciones industriales, con características que la convierten en una plataforma ideal para este tipo de biotransformaciones como son la multitud de herramientas moleculares para su manipulación, la robustez y el vigor metabólico.
Mycobacterium smegmatis mc2155 es una actinobacteria capaz de metabolizar esferoides y utilizarlos como fuente de carbono y energía. En una patente anterior se desarrollaron mutantes de esta cepa para la producción de sintonas como AD y ADD a partir de fitosteroles. En estas cepas se bloqueó la ruta de degradación del colesterol o fitosteroles, por lo que no sigue la degradación del compuesto y se acumula ADD (M. smegmatis mc2155 Δ6039, CECT 8331) y AD (M. smegmatis mc2155 Δ6039Δ5941 , CECT 8332) (WO2015128534). Sin embargo, hasta el momento no se conoce ningún sistema natural ni recombinante capaz de producir esferoides 1 1a hidroxilados, derivados de los mismos o sus precursores (sintonas) 11 a hidroxilados, de forma eficiente, ya que los organismos productores diseñados hasta la fecha (hongos y levaduras) tienen el inconveniente de que generan muchos productos secundarios que complican la purificación del derivado hidroxilado, lo que hace descender notablemente el rendimiento del proceso.
Se requiere, por tanto, el diseño de nuevos organismos que permitan hidroxilar en posición 1 1a compuestos con estructura esteroidea para obtener esferoides 11a hidroxilados o sintonas 1 1a hidroxiladas de forma eficiente, en un procedimiento de producción mejorado que resulte en mayores rendimientos del producto final. Además, idealmente estos organismos deberían permitir dicha producción tanto a partir de precursores no hidroxilados (sintonas) como a partir de esteróles naturales, generando así compuestos esteroideos 1 1 a hidroxilados de elevada pureza. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona bacterias recombinantes capaces de hidroxilar de forma eficiente compuestos con estructura esteroidea en posición 11 a. Estas bacterias permiten, por tanto, llevar a cabo procesos de biotransformación microbiana en los que se generan eficientemente y de forma económica compuestos esteroideos 1 1a hidroxilados y productos intermedios precursores de los mismos (sintonas) 11a hidroxiladas. Estos precursores son, por ejemplo aunque sin limitarnos, 11 a-hidroxi- progesterona (11a-OH-PROG), 1 1a-hidroxi-deoxicorticosterona (11a-OH-DOC), 11 a- hidroxi-testosterona (11a-OH-TEST), 11 a-hidroxi-dehidroepiandrosterona (11 α-ΟΗ- DHEA), 11a-hidroxi-4-androsten-3,17-diona (11 -OH-AD) y 11 a-hidroxi-1 ,4- androstadien-3,17-diona (11a-OH-ADD).
Hasta la fecha estos compuestos hidroxilados no se podían sintetizar directamente desde materias primas de bajo coste, como los esteróles naturales, en un solo paso, ya que la hidroxilación se realizaba a partir de una sintona intermedia (AD, ADD, TEST, PROG, etc.) en un proceso llevado a cabo por sistemas CYP/CPR de hongos tales como Rhizopus oryzae o Aspergillus ochraceus. Una de las ventajas de la presente invención es que permite obtener esferoides 11 a hidroxilados a partir de esteróles naturales en un único proceso de fermentación.
Además, cuando se emplean hongos o levaduras para la producción de estos compuestos se generan muchos productos secundarios que complican la purificación del derivado hidroxilado, lo que hace descender drásticamente el rendimiento del proceso. Sin embargo la presente invención representa una solución a este problema, ya que las bacterias recombinantes desarrolladas son capaces de hidroxilar en posición 1 1 a compuestos con estructura esteroidea, tanto a partir de sintonas como de esteróles naturales, generando compuestos esteroideos 1 1a hidroxilados de elevada pureza con un alto rendimiento de producción gracias a una drástica reducción de los productos secundarios.
Para el desarrollo de las bacterias recombinantes de la invención se ha partido de células de actinobacterias, preferiblemente de Corynebacterium glutamicum R31 o Mycobacterium smegmatis me2 155, donde se han expresado de forma heteróloga, mediante un operón sintético, las secuencias de ADN que codifican las enzimas implicadas en la actividad 1 1a-hidroxilasa en el hongo R. oryzae. En concreto, dichas enzimas son un citocromo P450 (CYP509C12) y su correspondiente citocromo reductasa dependiente de NADPH (RoCPRI). Ambas enzimas han sido expresadas en dichas bacterias mediante el diseño y construcción de un operón que comprende el ADN codificante para dicho citocromo y dicha reductasa y en el que además se han introducido ciertas modificaciones/mejoras para su expresión en bacterias, como son la optimización de codones, sitios de restricción, secuencias consenso, etc.
Adicionalmente, las cepas hospedadoras de M. smegmatis empleadas en la presente invención como células de partida son, preferiblemente, mutantes que producen sintonas AD y ADD a partir de colesterol y fitoesteroles. Así, en la presente invención se han desarrollado biocatalizadores bacterianos recombinantes capaces de hidroxilar esteroides en posición 11 a mediante un proceso de biotransformación en un solo paso, en el que se pueden emplear como material de partida tanto sintonas no hidroxiladas como esteróles naturales, lo que no se puede conseguir con hongos o levaduras.
Particularmente, la cepa modificada de C. glutamicum de la presente invención es capaz de producir las sintonas 1 1a-hidroxiladas: 1 1 a-OH-PROG, 1 1 a-OH-DOC, 1 1 a- OH-TEST, 11 a-OH-DH EA, 11 a-OH-AD y 1 1 a-OH-ADD sustancialmente puras, a partir de sus correspondientes precursores (sintonas) no hidroxiladas PROG, DOC, TEST, DHEA, AD y ADD, respectivamente. La cepa modificada de M. smegmatis CECT 8331 de la presente invención es capaz de producir la sintona 1 1 a-hidroxilada 1 1 a-OH- ADD sustancialmente pura, a partir de esteróles naturales. La cepa modificada de M. smegmatis CECT 8332 de la presente invención es capaz de producir la sintona 1 1 a-hidroxilada 11 α-ΟΗ-AD sustancialmente pura, a partir de esteróles naturales.
Las ventajas derivadas de la presente invención, en concreto de la utilización de bacterias frente a organismos eucariotas, son por tanto:
- El hecho de transferir esta capacidad de 11 a hidroxilación de esteroides a una bacteria hace posible obtener el esferoide de interés industrial hidroxilado en posición 11 a con una mayor pureza y eficiencia gracias a una drástica reducción de los productos secundarios de reacción, como sin embargo no ocurre utilizando directamente hongos o levaduras, los cuales modifican sustratos esteroideos en diversas posiciones contaminando las muestras y dificultando su purificación. La 11 a-hidroxilación llevada a cabo por las bacterias de la invención facilita los procesos de recuperación del producto, al reducirse los subproductos; y mejora los rendimientos de producción al permitir la obtención de un producto con mayor grado de pureza. - Permiten la obtención de derivados esteroideos 1 1 a hidroxilados, preferiblemente 1 1 a-OH-ADD y 1 1 a-OH-AD, a partir de esteróles naturales en un único proceso de fermentación, al contrario de lo que ocurre con hongos y levaduras donde el proceso se ha de dar en dos pasos (desde la materia prima a la sintona y de ésta a su derivado 1 1 a hidroxilado).
Por todo ello, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una construcción génica o genética que comprende una secuencia nucleotídica codificante para el citocromo CYP509C12 de Rhizopus oryzae y una secuencia nucleotídica codificante para la reductasa RoCPRI de R. oryzae. De ahora en adelante se hará referencia a este aspecto como "construcción génica de la invención".
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la secuencia nucleotídica codificante para el citocromo CYP509C12 y la secuencia nucleotídica codificante para la reductasa RoCPRI de R. oryzae se encuentran en forma de operón. Se entiende por "operón" una unidad genética funcional formada por un grupo o complejo de genes capaces de ejercer una regulación de su propia expresión por medio de los sustratos con ios que interaccionan las proteínas codificadas por sus genes. En la presente invención también se hará referencia a este operón como "operón FU ".
La construcción génica de la invención puede comprender además otros elementos reguladores de la expresión génica, tales como por ejemplo aunque sin limitarnos, promotores, reguladores, operadores, termínadores, inductores etc. Un "promotor" es un elemento de control que es una región del ADN con una secuencia que es reconocida por la ARN poiimerasa para comenzar la transcripción. Se encuentra inmediatamente antes de los genes estructurales codificantes para CYP509C12 y RoCPRI . El promotor al que se refiere la presente invención puede ser constitutivo o inducible, preferiblemente inducible. Ejemplos de promotores procariotas incluyen, por ejemplo, pero sin limitarnos, los promotores de los genes trp, hps, recA, lacZ, lacl, tet, gal, trc, o tac de Escherichia coli, o el promotor del gen de la α-amilasa de Bacillus subtilis.
Un "operador es otro elemento de control que es una región del ADN con una secuencia que es reconocida por la proteína reguladora. El operador se sitúa entre la región promotora y ios genes estructurales. Un "regulador" es una secuencia de ADN que codifica para la proteína reguladora que reconoce la secuencia de la región del operador. El gen regulador está cerca de los genes estructurales del operón pero no está inmediatamente al lado. Un Inductor" es el sustrato o compuesto cuya presencia/ausencia induce la expresión del resto de los genes que conforman el operón. Puede actuar activando la expresión, denominándose "activador" o bien reprimiéndola, llamándose "represor".
La construcción génica de la presente invención comprende, preferiblemente, las secuencias nucleotídicas en forma de un operón inducible, entendiéndose por "operón inducible" el que en condiciones normales no se expresa y se activa en respuesta a un agente inductor que funciona como activador, de manera que en el momento en que el inductor se une al operador, se activa el promotor y comienza la transcripción de los genes estructurales. El modelo clásico de este tipo de operón es el operón lactosa. Otros ejemplos de operones inducibles son, aunque sin limitarnos, aquellos que codifican para enzimas que participan en el metabolismo de sustratos como operón maltosa, arabinosa, etc. En la presente invención el operón es preferiblemente inducible por IPTG. En otra realización preferida, la construcción génica de la invención está comprendida en un vector de expresión. El término "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN en la que se puede integrar otro fragmento de ADN sin que pierda la capacidad de autorreplicación. El término "vector de expresión" se refiere a un vector de clonación adecuado para expresar un ácido nucleico que ha sido clonado en el mismo tras ser introducido en una célula hospedadora. Dicho ácido nucleico se encuentra, generalmente, unido operativamente a secuencias control. En una realización más preferida, el vector se selecciona del grupo que consiste en: plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos, cromosomas artificiales de levaduras (YAC), cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas humanos artificiales (HAC), vectores virales, tales como adenovirus, retrovirus o cualquier otro tipo de molécula de DNA con capacidad para replicarse en el interior de una célula, preferiblemente procariota. En una realización aún más preferida, la construcción génica de la invención se encuentra comprendida en un plásmido. Ejemplos de plásmidos en los que se puede introducir la construcción génica de la invención son, aunque sin limitarnos, pGH, pMV261 , pECXK- 99E, etc., preferiblemente pMV261 y pECXK- 99E. Debido a la degeneración del código genético, en el cual diversos tripletes de nucleótidos dan lugar a un mismo aminoácido, existen diversas secuencias de nucleótidos que dan lugar a una misma secuencia aminoacídica. Los términos "secuencia nucleotídica", "secuencia de nucleótidos", "ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótido" se usan aquí de manera intercambiable y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud que pueden estar o no, química o bioquímicamente modificados. Se refieren, por tanto, a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, tanto de cadena sencilla como de doble hebra.
Las secuencias nucleotídicas comprendidas en la construcción génica de la invención pueden comprender, adicionalmente a la secuencia codificante, otros elementos, como por ejemplo aunque sin limitarse, secuencias no codificantes en los extremos 5' o 3', sitios de unión a ribosomas, o secuencias estabilizadoras. Estos polinucleótidos adicionalmente también pueden incluir secuencias codificantes para aminoácidos adicionales que puedan ser útiles, por ejemplo, aunque sin limitarse, para aumentar la estabilidad del péptido generado a partir de él o permitir una mejor purificación del mismo.
En otra realización preferida de la construcción génica de la invención, el citocromo Cyp509C12 es el descrito en European Nucleotide Archive - EBI EIE80372.1 y la proteína citocromo reductasa RoCPRI es la descrita en European Nucleotide Archive - EBI EIE89541.1.
En una realización más preferida, las secuencias nucleotídicas codificantes para el citocromo CYP509C12 y la reductasa RoCPRI de Rhizopus oryzae se encuentran optimizadas para su expresión en bacterias, es decir, los codones de dichas secuencias nucleotídicas se encuentran optimizados. En una realización aún más preferida, la secuencia nucleotídica codificante para el citocromo CYP509C12 es la SEQ ID NO: 1. En otra realización preferida, la secuencia nucleotídica codificante para la reductasa RoCPRI es la SEQ ID NO: 2.
En otra realización preferida, la construcción génica de la invención además comprende una secuencia consenso para un sitio de unión al ribosoma o secuencia Shine Dalgarno aguas arriba ("upstream") de cada uno de los codones de inicio (ATG) de cada secuencia nucleotídica, para conseguir la traducción óptima del ARNm en bacterias. En una realización más preferida, esta secuencia consenso se localiza 6 pb (6 nucleótidos) aguas arriba de cada uno de los codones de inicio de cada secuencia nucleotídica. En una realización aún más preferida, esta secuencia consenso es la SEQ ID NO: 3.
En otra realización preferida, la construcción génica de la invención además comprende al menos dos sitios de restricción para facilitar diferentes opciones de clonación. Ejemplos de sitios de restricción que pueden ser introducidos en la construcción génica de la invención son, aunque sin limitarnos, fíamHI, Pstl, Sac\, Nco\, PvuW, Ανή\, Mfe\, Nde\, EcoR\ y/o Xba\.
En otra realización preferida, la construcción génica de la invención además comprende un codón que da lugar a una alanina situada en la segunda posición de cada una de las dos proteínas traducidas. De esta manera, se aumenta la traducción de las proteínas recombinantes en los ribosomas bacterianos. Codones que dan lugar a una alanina son GCU, GCC, GCA o GCG. Un ejemplo de disposición estructural de la construcción génica de la invención se muestra en la Fig. 1.
La construcción génica de la invención se puede introducir en una célula bacteriana de tal manera que dicha construcción se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante, por ejemplo, un plásmido, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. La construcción génica de la invención puede comprender cualquier medio o elemento para asegurar su autorreplicación. De forma alternativa, la construcción génica de la invención puede ser una que, cuando se introduce en la célula hospedadora, se integra en el genoma y se replica junto con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se ha integrado.
Por ello, otro aspecto de la invención se refiere a una célula bacteriana que comprende y expresa la construcción génica de la invención, de ahora en adelante "célula bacteriana de la invención" o "célula de la invención". La célula bacteriana de la invención expresa el citocromo CYP509C12 y la reductasa RoCPRI de Rhizopus oryzae porque comprende la construcción génica de la invención, en forma autorreplicante o integrada en su cromosoma. El término "expresión" incluye cualquier etapa implicada en la producción de estas enzimas que incluye, pero no se limita a, transcripción, modificación post-transcripcional, traducción, modificación post-traduccional, y secreción.
La célula bacteriana ha de ser transformada en una célula competente, preferiblemente electrocompetente, para la posterior introducción de la construcción génica de la invención. Métodos para producir células electrocompetentes son bien conocidos por los expertos en la materia. Preferiblemente, el método empleado en la presente invención es RbCI y choque térmico o el descrito en Parish y Stoker (1998, Mycobacteria Protocols. Totowa, N.J., Humana Press). Son bien conocidos en la técnica diversos métodos para la transformación de células bacterianas con construcciones génicas. El método preferiblemente empleado en la presente invención para la introducción de la construcción génica de la invención en una célula bacteriana es la electroporación. En otra realización preferida, la célula bacteriana de la invención es una célula de actinobacterias. En una realización más preferida, dicha célula es una célula de la especie Corynebacterium glutamicum, aún más preferiblemente C. glutamicum R31. En otra realización preferida, dicha célula es una célula de la especie Mycobacterium smegmatis, aún más preferiblemente M. smegmatis me2 155.
En una realización más preferida, la célula bacteriana de la invención de la especie Mycobacterium smegmatis además comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide-9a-hidroxilasa. En una realización aún más preferida, esta célula que comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica el componente reductasa de la enzima 3- cetosteroide 9a-hidroxilasa es la célula de M. smegmatis CECT 8331. En otra realización preferida, esta célula de la invención de la especie Mycobacterium smegmatis que además comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide-9a-hidroxilasa, además comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1- deshidrogenasa. En una realización aún más preferida, esta célula que comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica el componente reductasa de la enzima 3- cetosteroide 9a-hidroxilasa y que además comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1-deshidrogenasa es la célula de M. smegmatis CECT 8332. Estas cepas CECT 8331 y CECT 8332, descritas en WO2015128534, tienen bloqueada la ruta de degradación del colesterol o fitosteroles, por lo que no sigue la degradación del compuesto y se acumula ADD (M. smegmatis mc2155 Δ6039, CECT 8331) y AD (M. smegmatis mc2155 Δ6039Δ5941 , CECT 8332). Estas cepas se utilizan, preferiblemente, como células de partida en esta invención para el desarrollo de la célula bacteriana de la invención que comprende la construcción génica de la invención.
La bacteria salvaje M. smegmatis me2 155 no puede utilizar las sustancias AD y ADD como fuente de carbono cuando dichas sustancias se añaden a un medio de cultivo, a pesar de ser intermediarios del catabolismo bacteriano del colesterol. De esta manera, la bacteria M. smegmatis me2 155 es una bacteria ideal para la producción de las AD y ADD intermedias necesarias para la producción de sus correspondientes derivados hidroxilados, pues una vez secretadas al medio no podrán ser catabolizadas por el metabolismo de la bacteria.
El término "deleción de un gen" tal y como se emplea en la presente invención se refiere a la eliminación total o parcial de un gen mediante la eliminación total o parcial de la secuencia de ADN que caracteriza ese gen en el genoma de una bacteria. El término "secuencia de nucleótidos funcionalmente inactivada" tal y como se emplea en la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que no es capaz de ejercer su funcionalidad, es decir, no es capaz de proporcionar una enzima funcional. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la célula bacteriana de la invención para la producción de esferoides 1 1a hidroxilados, compuestos esteroideos 11a hidroxilados o derivados de los mismos, o sintonas 1 1a hidroxiladas.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, los esferoides 11a hidroxilados o las sintonas 1 1a hidroxiladas se producen a partir de sintonas no hidroxiladas. En una realización más preferida, las sintonas 11 a hidroxiladas producidas son 11 a-OH-PROG, 11 a-OH-DOC, 11 a-OH-TEST, 11 a-OH-DHEA, 11 a- OH-AD y/o 11 a-OH-ADD y las sintonas no hidroxiladas a partir de las cuales se producen las primeras son PROG, DOC, TEST, DHEA, AD y/o ADD, respectivamente. En una realización aún más preferida, la célula productora de estas sintonas 11 a hidroxiladas indicadas, preferiblemente de 11 a-OH-PROG a partir de PROG, es la célula de la invención de la especie C. glutamicum.
En otra realización preferida, la sintona 11 a hidroxilada producida es 11 a-OH-ADD y se produce a partir de esteróles naturales. En una realización más preferida, la célula bacteriana productora de esta sintona 11 a hidroxilada indicada es la célula de la invención de la especie M. smegmatis que además comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica el componente reductasa de la enzima 3- cetosteroide-9a-hidroxilasa, preferiblemente la cepa CECT 8331.
En otra realización preferida, la sintona 1 1 a hidroxilada producida es 11 a-OH-AD y se produce a partir de esteróles naturales. En una realización más preferida, la célula bacteriana productora de esta sintona 11 a hidroxilada indicada es la célula de la invención de la especie M. smegmatis que además comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica el componente reductasa de la enzima 3- cetosteroide-9a-hidroxilasa y al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1-deshidrogenasa, preferiblemente la cepa CECT 8332. Los "esteróles naturales" a los que se refiere la presente invención son, preferiblemente, colesterol o fitoesteroles, aunque otros esteroides 3-β alcoholes podrían ser también empleados como material de partida. Ejemplos de fitoesteroles son, aunque sin limitarnos, sitoesterol, estigmasterol, campesterol o brasicasterol. Los esteróles naturales empleados en la presente invención pueden ser solamente colesterol o un fitoesterol, o bien una mezcla de fitoesteroles.
Los "esteroides 11 a hidroxilados" obtenibles según la presente invención son aquellos compuestos con estructura esteroidea hidroxilados en posición 1 1a, preferentemente aquellos que forman parte de las familias de Estrógenos, Andrógenos, Progestágenos y Glucocorticoides; por ejemplo, estrona, estradiol, testosterona o fluoximestrona, entre otros.
Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de biotransformacion microbiana (bacteriana) de sustratos esteroideos en sus correspondientes derivados 1 1a hidroxilados o procedimiento para la producción de esteroides 11 a hidroxilados o sintonas 1 1 a hidroxiladas que comprende las etapas de: a. poner en contacto un cultivo de la célula bacteriana de la invención con un sustrato esteroideo,
b. incubar la mezcla del paso (a) en condiciones de fermentación, y c. separar del medio de cultivo los esteroides 1 1a hidroxilados o las sintonas 1 1a hidroxiladas producidos tras la incubación del paso (b).
De ahora en adelante se hará referencia a este procedimiento como "procedimiento o método de la invención".
El procedimiento de la invención se puede llevar a cabo tanto a nivel de laboratorio como a nivel industrial, aunque preferiblemente se lleva a cabo a nivel industrial en un biorreactor.
En una realización preferida del método de la invención, el medio de cultivo del paso (a) comprende una fuente de carbono adicional, más preferiblemente glicerol. En otra realización preferida, el medio de cultivo del paso (a) comprende un tensioactivo. Dicho tensioactivo se selecciona, aunque sin limitarnos, de entre polisorbato 80 (Tween 80™) o polisorbato 20 (Tween 20™). El medio de cultivo del paso (a) puede comprender también tampón fosfato.
En otra realización preferida, el medio de cultivo del paso (a) comprende al menos un antibiótico. Dicho antibiótico se selecciona, aunque sin limitarnos, de entre kanamicina, gentamicina, o cualquiera de sus combinaciones.
En general, el cultivo del paso (a) puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, en medio líquido o en medio sólido. Los medios y condiciones de cultivo para el crecimiento de células bacterianas son ampliamente conocidos por los expertos en la materia. El medio de cultivo comprende todos los elementos y nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de la célula bacteriana de la invención y para favorecer su actividad fermentadora. Así, dicho medio de cultivo podrá comprender, aunque sin limitarnos, fuentes de carbono (por ejemplo, glucosa, sacarosa, glicerol o manitol), fuentes de vitaminas, aminoácidos, sales inorgánicas, etc.
Para que la célula bacteriana de la invención crezca adecuadamente en el medio de cultivo, éste debe reunir una serie de condiciones como son temperatura, agitación, grado de humedad, y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad (pH). Asimismo, el medio de cultivo debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
En cuanto a las condiciones de fermentación adecuadas para ser aplicadas en el paso (b) del procedimiento de la invención, preferiblemente dichas condiciones comprenden la agitación e incubación a una temperatura de entre 30 y 37°C. Más preferiblemente, la Ta es de 30°C cuando la célula bacteriana de la invención es de la especie C. glutamicum y de 37°C cuando la célula bacteriana de la invención es de la especie M. smegmatis. La incubación se realiza preferiblemente durante un tiempo de entre 25 y 35 h, más preferiblemente durante 30 h cuando la célula bacteriana de la invención es de la especie C. glutamicum. Los cultivos de la célula bacteriana de la invención deben ser inducidos por el compuesto activador correspondiente si el promotor empleado en la construcción génica de la invención es inducible. Así, preferiblemente el cultivo bacteriano en el método de la invención es inducido con IPTG. En otra realización preferida, el sustrato esteroideo del paso (a) se selecciona de la lista que consiste en: fitoesteroles, colesterol, PROG, DOC, TEST, DHEA, AD o ADD, o cualquiera de sus combinaciones. En una realización más preferida del método de la invención, el sustrato esteroideo de partida del paso (a) son fitoesteroles y/o colesterol, la sintona 1 1a hidroxilada producida es 1 1a-OH-AD y la célula bacteriana empleada para la producción es la célula de la invención de la especie M. smegmatis que además comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica el componente reductasa de la enzima 3- cetosteroide 9a-hidroxilasa y al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1-deshidrogenasa, preferiblemente la cepa CECT 8332. En otra realización preferida del método de la invención, el sustrato esteroideo de partida del paso (a) son fitoesteroles y/o colesterol, la sintona 1 1a-hidroxilada producida es 11 a-OH-ADD y la célula bacteriana empleada para la producción es la célula de la invención de la especie M. smegmatis que además comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica el componente reductasa de la enzima 3- cetosteroide 9a-hidroxilasa, preferiblemente la cepa CECT 8331.
En otra realización preferida del método de la invención, el sustrato esteroideo de partida del paso (a) es AD, ADD, PROG, DOC, DHEA y/o TEST, preferiblemente PROG, la sintona 11 a hidroxilada producida es 11 a-OH-PROG, 11 a-OH-DOC, 11 a- OH-TEST, 11 a-OH-DHEA, 11 a-OH-AD y/o 11 a-OH-ADD, preferiblemente 11 a-OH- PROG, y la célula bacteriana productora es la célula bacteriana de la invención, más preferiblemente la célula de la invención de la especie C. glutamicum. El procedimiento de la invención puede comprender otras etapas o pasos adicionales, tales como un paso previo de preparación y esterilización de una mezcla de sintonas o de esteróles naturales o de ambos, preferiblemente en un polialcohol o aceite vegetal, con o sin la adición de sales minerales y/o un paso de preparar y crecer un cultivo de la célula bacteriana de la invención previamente a su exposición al sustrato esteroideo. Los esteroides 11 α hidroxilados o sintonas 11 α hidroxiladas producidas por el procedimiento de la invención se secretan, junto con otros metabolitos o compuestos, en el medio de cultivo, y éstos se pueden recuperar directamente del medio. Así, tras la incubación del paso (b) del método de la invención se puede separar el sedimento celular para obtener una disolución comprendiendo el/los esteroide/s 1 1a hidroxilado/s o la/s sintona/s 11 a hidroxilada/s producida/s. Estos productos se obtienen con una elevada pureza y con un mayor rendimiento de producción que cuando se emplean hongos o levaduras en procesos de biotransformación similares.
Tras la incubación de la etapa (b) del procedimiento de la invención tiene lugar un paso de extracción en el cual se descartan los sedimentos y se seleccionan los sobrenadantes. Dichos sobrenadantes son posteriormente empleados para obtener los esteroides 1 1 a hidroxilados o sintonas 1 1 a hidroxiladas presentes en los mismos.
Estos compuestos secretados al medio de cultivo por la célula bacteriana de la invención pueden recuperarse del medio empleando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, mediante procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitación, centrifugación, filtración, extracción, evaporación y/o precipitación.
Estos compuestos producidos por la célula bacteriana de la invención en cultivo pueden purificarse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, cromatografía (por ejemplo, HPLC, HPLC-DAD, TLC, LC-MS, intercambio iónico, afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque, y exclusión molecular), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato amónico), SDS-PAGE, precipitación o extracción, con el fin de obtener los esteroides 11 a hidroxilados o sintonas 1 1a hidroxiladas sustancialmente puros.
Estos compuestos producidos por la célula bacteriana de la invención en cultivo pueden detectarse usando procedimientos conocidos en la técnica. Estos procedimientos de detección pueden incluir, por ejemplo aunque sin limitarnos, cromatografía, RMN, espectrometría de masas, o similares.
La presente invención se refiere, por tanto, a cepas modificadas genéticamente de M. smegmatis me2 155 que contienen un operón sintético (FUN) que codifica el citocromo CYP509C12 y la citocromo reductasa RoCPRI de R. oryzae, así como a los procesos para producir 1 a-OH-AD y 11 a-OH-ADD a partir de esteróles naturales, como colesterol o fitoesteroles, utilizando dichas cepas modificadas.
La presente invención también se refiere a cepas modificadas genéticamente de C. glutamicum R31 que contienen un operón sintético (FUN) que codifica el citocromo CYP509C12 y la citocromo reductasa RoCPRI de R. oryzae, así como a los procesos para producir 1 1 a-OH-PROG, H a-OH-DOC, 11 a-OH-DHEA y/o 11 a-OH-TEST, entre otras, de forma sustancialmente pura a partir de las sintonas correspondientes. La invención se refiere al uso de la cepa recombinante M. smegmatis CECT 8331 , la cual es una cepa muíante derivada de M. smegmatis me2 155 que comprende al menos una secuencia de nucleótidos que codifica el componente reductasa de la enzima 3-cetosteroide 9a-hidroxilasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, que porta un plásmido que comprende el operón FUN, la cual es capaz de producir 11 a-OH-ADD de manera sustancialmente pura. La invención se refiere al uso de dicha cepa bacteriana para la producción de 11 a-OH-ADD en forma sustancialmente pura mediante fermentación de esteróles naturales.
La invención se refiere al uso de la cepa recombinante M. smegmatis CECT 8332, la cual es una cepa muíante derivada de M. smegmatis me2 155 que comprende al menos una secuencia de nucleóíidos que codifica el componeníe reducíasa de la enzima 3-ceíosíeroide-9a-hidroxilasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, así como al menos una secuencia de nucleótidos que codifica la enzima 3-cetosteroide-Al-deshidrogenasa inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente, que porta un plásmido que comprende el operón FUN, la cual es capaz de producir 11 a-OH-AD de manera sustancialmente pura. La invención se refiere al uso de dicha cepa bacteriana para la producción de 1 1a-OH-AD en forma sustancialmente pura mediante fermentación de esteróles naturales. La invención se refiere al uso de la cepa recombinante C. glutamicum R31 que porta un plásmido que comprende el operón FUN, la cual es capaz de producir esferoides hidroxilados en posición 11 a (H a-OH-PROG, Ha-OH-DOC, 11 a-OH-TEST, 11 a-OH- DHEA, 11 a-OH-AD y 1 1 a-OH-ADD) a partir de sus sintonas correspondientes (PROG, DOC, TEST, DHEA, AD y ADD, respectivamente) de manera sustancialmente pura. La invención se refiere al uso de dicha cepa bacteriana para la producción de 11 a-OH- PROG, H a-OH-DOC, 11 a-OH-TEST, 1 a-OH-DHEA, 11 a-OH-AD y 11 a-OH-ADD en forma sustancialmente pura a partir de sus sintonas correspondientes: PROG, DOC, TEST, DHEA, AD y ADD, respectivamente. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Esquema del operón FUN. FIG. 2. Biotransformación de PROG en 11 a-OH-PROG utilizando la cepa C. glutamicum R31 (pXKFUN). Se representa el consumo de PROG (línea gris punteada) y la aparición de 1 1a-OH-PROG (línea negra continua).
FIG. 3. Crómate-gramas de LC-MS mostrando la producción de 11 aOH- progesterona a partir de progesterona en la cepa C. glutamicum R31 (pECXK- 99E) utilizada como control negativo (A) y la cepa C. glutamicum R31 (pXKFUN) (B). PROG, 11 a-OH-PROG y TEST, que ha sido utilizado como estándar interno (ISTD). Espectros de masas obtenidos de los iones de m/z entre 150-400 (full sean) presentes en la muestra (línea de arriba). Espectro de masas del ion 315 característico del compuesto PROG (línea del medio). Espectro de masas del ion 331.3 característico del compuesto 11a-OH-PROG (línea de abajo).
FIG. 4. Biotransformación de colesterol (CHO) en 11 a-OH-ADD utilizando la cepa M. smegmatis CECT 8331 (pMVFUN). Se muestra el consumo de CHO y la aparición de 11 α-ΟΗ-ADD y otros subproductos: ADD y 1 1 a-OH-AD.
FIG. 5. Biotransformación de fitosteroles (FITO) en 11 a-OH-ADD utilizando la cepa M. smegmatis CECT 8331 (pMVFUN). Se muestra el consumo de fitoesteroles y la aparición de 11 a-OH-ADD y otros subproductos: ADD. FIG. 6. Biotransformación de colesterol (CHO) en 11 a-OH-AD utilizando la cepa M. smegmatis CECT 8332 (pMVFUN). Se muestra el consumo de CHO y la aparición de 11 a-OH-AD y otros subproductos: AD, 11 a-OH-ADD y 4-HBC (220H-23.24- bisnorchol-4-en-3-ona).
FIG. 7. Biotransformación de fitosteroles (FITO) en 11 a-OH-AD utilizando la cepa M. smegmatis CECT 8332 (pMVFUN). Se muestra el consumo de FITO y la aparición de 11 a-OH-AD y otros subproductos: AD y 4-HBC (220H-23,24-bisnorchol-4-en-3- ona).
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que ponen de manifiesto la efectividad de las células bacterianas recombinantes diseñadas en la producción de esferoides 11 a hidroxilados o sus derivados, tanto a partir de sintonas como de esteróles naturales.
EJEMPLO 1. Bacterias utilizadas y métodos de cultivo.
Las cepas bacterianas utilizadas en esta invención son:
1. - Mycobacterium smegmatis me2 155 (ept-1, muíante me2 eficiente para electroporación).
2. - Mycobacterium smegmatis me2 155 Δ6039 (M. smegmatis me2 155 con el gen MSMEG_6039 delecionado) (Cepa CECT8331).
3. - Mycobacterium smegmatis me2 155 Δ6039Δ5941 (M. smegmatis me2 155 con los genes MSMEG_6039 y MSMEG_5941 delecionados) (Cepa CECT8332).
4. - Corynebacterium glutamicum R31 (MeLisR, AecR eficiente para electroporación).
5. - Escherichia coli DH 10B (F-, mcrA, A(mrr-hsdRMS-mcrBC), f80AlacZDM15AlacX74, deoR, recA1, endA1, araD139, A(ara,leu) 7697, galU, galK, rpsL, nupG, λ) (Invitrogen). Los plásmidos empleados en esta invención para el clonaje, mutación y expresión génica, junto con sus características más relevantes se muestran a continuación:
1. - Plásmido pMV261 (Vector de expresión en micobacterias, bajo el control del promotor Pns eo, KmR).
2. - Plásmido pECXK-99E (Vector bifuncional E. coli/C. glutamicum, que contiene el gen laclq, KmR).
Todas las soluciones y medios de cultivo utilizados en esta invención se esterilizaron por calor húmedo en un autoclave a 121 °C y 1 atm de presión, o mediante filtración utilizando filtros estériles Millipore de 0.2 μηι de diámetro.
El medio rico utilizado para cultivar las células de E. coli fue el medio Lysogenic Broth (LB). Los cultivos en medio sólido se realizaron con medio LB al que se añadió Bacto Agar (Pronadisa) al 1.5 % (p/v).En caso de ser necesario se añadieron antibióticos a las siguientes concentraciones finales: ampicilina (100 μg mi"1), kanamicina (50 μg mi" 1), cloranfenicol (20 μg mi"1). Las células de E. coli se cultivaron a 37 °C. Los cultivos en medio líquido se llevaron a cabo en un agitador orbital a 250 rpm. El crecimiento en medio líquido fue seguido por turbidimetría a 600 nm (D06oo) empleando un espectrofotómetro UVMini-1240 (Shimadzu).
Para el cultivo de micobacterias se utilizaron los medios ricos Bacto Middiebrook 7H10 Agar (7H10) (Difco) como medio sólido, y Middiebrook 7H9 Broth (7H9) (Difco) como medio líquido. Los medios 7H9 y 7H10 fueron suplidos con 0,2 % (v/v) de glicerol y 10 % (v/v) de Middiebrook ADC Enrichment (ADC) (Difco) (7H9/GN/ADC y 7H 10/Gli/ADC). En todos los cultivos en medio líquido se añadió 0,05 % (v/v) de Tween80 (Sigma) previamente autoclavado para evitar la agregación de las células (7H9/Gli/ADC/Tween). En caso de ser necesario se añadieron antibióticos a las siguientes concentraciones: kanamicina (20 μg mi"1) y gentamicina (5 μg mi"1). Las células de M. smegmatis se cultivaron a 37 °C. Los cultivos en medio líquido se llevaron a cabo en un agitador orbital a 250 rpm. El crecimiento en medio líquido fue seguido por turbidimetría a 600 nm (D06oo) empleando un espectrofotómetro UVMini- 1240 (Shimadzu). Para el cultivo de corinebacterias se utilizaron los medios ricos Tryptic Soy Agar (TSA) (Difco) como medio sólido y Tryptic Soy Broth (TSB) (Difco) como medio líquido. En caso de ser necesario se añadió kanamicina (25 mi"1). Las células de C. glutamicum se cultivaron a 30 °C. Los cultivos en medio líquido se llevaron a cabo en un agitador orbital a 250 rpm. El crecimiento en medio líquido fue seguido por turbidimetría a 600 nm (D06oo) empleando un espectrofotómetro UVMini-1240 (Shimadzu).
EJEMPLO 2. Métodos de transformación genética para la construcción de las cepas recom binantes.
A. - TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS DE E. coli
Las células de E. coli fueron modificadas genéticamente por transformación tras hacerlas competentes mediante el método de RbCI y choque térmico.
B. - TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS DE M. smegmatis
1.- Preparación de células electrocompetentes de M. smegmatis. La preparación de células electrocompetentes de M. smegmatis se llevó a cabo según un protocolo previamente descrito (Parish y Stoker, 1998, Mycobacteria Protocols. Totowa, N.J., Humana Press). Se parte de un preinóculo en fase estacionaria (aproximadamente 30 h) (10 mi en matraz de 100 mi) en medio 7H9/Gli/ADC/Tween. Se inocula medio fresco con D06oo 0.01 (200 mi 7H9/Gli/ADC/Tween en matraz de 11) y se incuba en agitación (200 rpm) a 30 °C hasta una D06oo de 0.8-1 (18 h de cultivo aproximadamente). A continuación, el cultivo se mantiene 1 ,5 h en hielo y se centrifuga en 4 tubos cónicos de 50 mi a 3000 x g a 4 °C durante 10 min. Una vez decantado el sobrenadante, se resuspenden las células volteando gentilmente en 200 mi de una solución 10 % (v/v) de glicerol y 0,05 % (v/v) de Tween-80 (Gli/Tween) enfriada en hielo. Seguidamente se centrifuga la suspensión de células, se retira el sobrenadante y se resuspenden de nuevo en 100 mi de la misma solución Gli/Tween. Tras un tercer paso de centrifugación se añaden 25 mi de Gli/Tween. Las células se resuspenden volteando y se dejan reposar para sedimentar los agregados. Posteriormente se toma la suspensión sin los agregados con una pipeta estéril. La suspensión se lleva a un tubo cónico limpio enfriado en hielo y se centrifuga. Finalmente se retira el sobrenadante, las células se resuspenden en 1 ,5 mi de Gli/Tween frío y se reparten en alícuotas de 200 μΙ que se guardan a -80 °C hasta su uso. 2.- Transformación de células de M. smegmatis mediante electroporación.
A una alícuota de 200 μΙ de células electrocompetentes se le añade 1 μg del DNA con el que se van a transformar. Esta mezcla se deposita en una cubeta de electroporación (Cell Projects, 50 x 2 mm) y se incuba durante 10 min en hielo. A continuación se electropora en un electroporador Gene Pulser (Biorad) a 2.5 kV, 25 F y 1000 Ω y se incuba la cubeta en hielo otros 10 min. Posteriormente, se añade 1 mi de medio 7H9/Gli/ADC/Tween a la cubeta y el líquido se pasa a un tubo cónico de 15 mi. Las células se incuban 4 h a 37 °C en agitación (250 rpm) antes de sembrarlas en medio sólido 7H 10/GN/ADC con los antibióticos necesarios.
C- TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS DE C. glutamicum
1.- Preparación de células electrocompetentes de C. glutamicum. Para la preparación de las células se parte de un preinóculo en fase estacionaria (aproximadamente 30 h) (10 mi de medio en un matraz de 100 mi) en medio TSB. Se inocula el medio fresco con una D06oo 0.01 (200 mi TSB en matraz de 1 I) y se incuba en agitación (200 rpm) a 30 °C hasta una D06oo de 1.2-1.5 (6 h de cultivo aproximadamente). A continuación, el cultivo se mantiene 30 min en hielo y se centrifuga en 4 tubos cónicos de 50 mi a 3000 x g a 4 °C durante 10 min. Una vez decantado el sobrenadante, se resuspenden las células volteando gentilmente en 200 mi de una solución 10 % (v/v) de glicerol enfriada en hielo. Seguidamente se centrifuga la suspensión de células, se retira el sobrenadante y se resuspenden de nuevo en 100 mi de la misma solución. Tras un tercer paso de centrifugación se añaden 25 mi de 10 % (v/v) de glicerol. Las células se resuspenden volteándolas y se dejan reposar para sedimentar los agregados. Posteriormente se toma la suspensión sin los agregados con una pipeta estéril. La suspensión se lleva a un tubo cónico limpio enfriado en hielo y se centrifuga. Finalmente se retira el sobrenadante, las células se resuspenden en 2,0 mi de 10 % (v/v) de glicerol y se reparten en alícuotas de 50 μΙ que se guardan a -80 °C hasta su uso. 2.- Transformación de células de C. glutamicum mediante electroporacion.
A una alícuota de 50 μΙ de células electrocompetentes se añade 1 del DNA con que se va a transformar. Esta mezcla se pasa a una cubeta de electroporacion (Cell Projects, 50 x 2 mm) y se incuba durante 10 min en hielo. A continuación se electropora en un electroporador Gene Pulser (Biorad) a 2.5 kV, 25 F y 200 Ω. Posteriormente se añade 1 mi de medio TSB a la cubeta y se pasa a un tubo cónico de 15 mi. Las células se incuban 1 h a 30 °C en agitación (200 rpm) antes de sembrarlas en medio sólido TSA con los antibióticos necesarios.
EJEMPLO 3. Diseño y construcción del operón FUN y de los plásmidos recom binantes que lo portan. Para llevar a cabo la producción heteróloga de la actividad 11 a-hidroxilasa en bacterias se diseñó el operón sintético denominado FUN, el cual contiene los genes cyp509C12 y roCPRI de R. oryzae, que codifican el citocromo CYP509C12 con actividad 11 a-hidroxilasa y la proteína citocromo reductasa RoCPRI necesaria para la actividad del mismo, respectivamente. El uso de codones se optimizó de forma manual para las bacterias Mycobacterium y Rhodococcus, conservando un porcentaje de identidad en nucleótidos del 82,80 % para el caso del citocromo y del 83,24 % para el caso de la CPR. Para conseguir la traducción óptima del ARNm se añadió una secuencia Shine Dalgarno/RBS (SEQ ID NO. 3: AAAGGGAG) 6 nucleótidos aguas arriba a partir de los respectivos codones de inicio de cada gen. Se añadieron además diversos sitios de restricción para facilitar diferentes opciones de clonación. Además se añadió una alanina como segundo aminoácido para aumentar la traducción de las proteínas. El operón diseñado se sintetizó mediante síntesis química y se clonó inicialmente en el plásmido pGH generando el plásmido recombinante pGH-FUN que se utilizó para transformar células competentes de E. coli DH10B. El plásmido pGH- FUN se secuenció para verificar que la secuencia del operón clonado era correcta. El esquema del operón FUN puede verse en la figura 1.
El plásmido pGH-FUN se digirió con fíamHI y EcoRI para liberar el fragmento que contiene el operón FUN y éste fue subclonado en el plásmido pMV261 , con doble origen de replicación para E. coli/ Mycobacterium; resultando el vector pMVFUN que expresará los genes bajo control del promotor constitutivo Phps. El plásmido pMVFUN se clonó inicialmente en E. coli DH10B donde se secuenció para comprobar que la construcción era correcta. Los plásmidos pMV261 y pMVFUN fueron posteriormente aislados de las cepas de E. coli portadoras y transformados en M. smegmatis mediante electroporación.
Por otro lado, el plásmido pGH-FUN se digirió con Sac\ y Xba\ para liberar el fragmento que contiene el operón FUN y éste fue subclonado en el plásmido pECXK- 99E, con doble origen de replicacion para E. coli/C. glutamicum resultando el vector pXKFUN que expresará los genes bajo control del promotor Ptrc, inducible por IPTG. El plásmido pXKFUN se clonó inicialmente en E. coli DH 10B donde se secuenció para comprobar que la construcción era correcta. Los plásmidos pECXK-99E y pXKFUN fueron posteriormente aislados de las cepas de E. coli portadoras y transformados en C. glutamicum mediante electroporación.
EJEMPLO 4. Técnicas de análisis de los esteroides. 1.- Métodos de extracción A.- Extracción de los esteroides en sistemas de reacción con células en reposo.
La extracción de los esteroides a analizar a partir de sistemas de reacción con células en reposo se llevó a cabo recogiendo alícuotas (1 mi) de la reacción a las que se le añadieron los correspondientes patrones internos (testosterona) a la concentración de interés (250 μΜ) antes de comenzar el proceso de extracción. Las muestras con el patrón interno se extraen en 10 mi de cloroformo y se homogenizan empleando un homogeneizador Bullet Blender 50-DX-CE a velocidad 12, durante 3 min. Tras la ruptura, las células se centrifugan 10 min a 4000 x g a 4 °C y posteriormente los tubos se congelan a -80°C durante 10-15 min para separar correctamente las dos fases. La fase orgánica se recoge, se pasa a tubos cónicos de 50 mi y se evapora a totalidad a 70 °C.
B.- Extracción de los esteroides en sistemas de reacción con células en cultivo. La extracción de esteroides a analizar por las diferentes técnicas cromatográficas en sistemas de reacción con células en cultivo se llevó a cabo recogiendo alícuotas (0,2 mi) de los diferentes cultivos a los que se le añadieron los correspondientes patrones internos a la concentración de interés, indicados en cada caso, antes de comenzar el proceso de extracción. Las muestras con el patrón interno se extraen en 0,5 mi de cloroformo y se homogenizan empleando un vórtex durante 30 s. Las muestras se congelan a -80°C durante 10-15 min para separar correctamente las dos fases. La fase orgánica se recoge, se pasa a tubos eppendorf de 2 mi y se evapora a totalidad a 70 °C.
2.- Métodos cromatográficos
A. - CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC). Las placas de TLC utilizadas (Silica gel 60 F254 20 x 20 cm, Merck) se recortan dejando 1 cm de margen en cada lado, 8 cm de carrera y 1 cm de separación entre muestra y muestra. Las diferentes muestras extraídas se resuspenden en acetonitrilo en un volumen de entre 10-20 μΙ dependiendo de la concentración esperada en cada caso. Para realizar la TLC, 10 μΙ de cada muestra se cargan sobre la placa de TLC y una mezcla de cloroformo:etanol (95:5) (Merck) se usa como fase móvil. Los diferentes esteroides de las biotransformaciones se revelan con una solución del 20 % (v/v) de H2S04.
B. - CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA ACOPLADA A DETECTOR DE FOTODIODOS EN SERIE (HPLC-DAD) Y CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
ACOPLADA A ESPECTROMETRÍA DE MASAS (LC-MS).
La detección y cuantificación de los productos generados en las reacciones de biotransformación esteroideas se realizó mediante HPLC-DAD-MS usando un equipo de cromatografía líquida (Surveyor Plus LC) equipada con inyector automático acoplado en serie a un detector DAD que permitió monitorizar la elución a DO245 y con una trampa iónica (LXQ) equipada con una fuente de ionización química a presión atmosférica (APCI) y una fuente de isoelectronebulización (IES), todo ello suministrado por Thermo Electron (San José, CA, EEUU). Los datos se procesaron con el software Xcalibur (Thermo Fisher Scientific, San José, CA, EEUU). La separación se realiza mediante una columna de fase reversa C18 y a un gradiente determinado en cada caso.
EJEMPLO 5. Biotransformación de PROG en 11 a-OH-PROG utilizando la cepa C. glutamicum R31 (pXKFUN).
Para los ensayos de biotransformación de progesterona (PROG) con células en reposo de C. glutamicum R31 (pXKFUN) se empleó tampón fosfato 50 mM (pH 7.4), al que se le añadieron los esferoides a una concentración final de 0,5 mM, desde una solución de esteroide preparada a 5 mM en 10 % (v/v) de Tyloxapol, siendo por tanto la concentración final del mismo de 1 % (v/v). Se tomaron muestras para analizar la biotransformación de esferoides durante 72 h. Para la obtención de la biomasa empleada en la biotransformación se cultivó un volumen total de 200 mi de células de C. glutamicum crecidas en medio TSB durante 30 h a 30 °C y 250 rpm en matraz de 1 I desde una D06oo de 0, 1 , empleando un preinóculo de 48 h crecido en medio TSB, a 30 °C y agitado a 250 rpm. En caso de ser necesario se añadieron kanamicina (25 μg mi"1) y ácido δ-aminolevulínico 0,5 mM. Los cultivos fueron inducidos con IPTG 1 mM cuando alcanzaban una DO600 de 1 ,5. Dichas células fueron recogidas mediante centrifugación (10 min, 4000 x g) y lavadas dos veces con tampón fosfato 50 mM (pH 7.4).
- Identificación y cuantificación de PROG y 1 1a-OH-PROG.
La separación cromatográfica se realizó en una columna Mediterránea Sea C18 (150 mm χ 4.6 mm de diámetro interno, 5 μηι de tamaño de partícula) (Teknokroma, Barcelona). Las fases móviles empleadas contenían agua y 0.1 % ácido fórmico (A), acetonitrilo y 0.1 % ácido fórmico (B). El flujo empleado fue de 1 mi min"1 y el gradiente lineal utilizado se muestra en la tabla 1.
Tiempo
% A %B
(min)
0 50 50
5 50 50
35 20 80
40 20 80 45 50 50
60 50 50
Tabla 1.
Durante este gradiente, el eluyente se analizó por DAD y por el espectrómetro de masas desde el minuto 1 hasta el 50. Las condiciones de trabajo del equipo fueron: fuente de ionización IES, temperatura del capilar (350 °C), cobertura de nebulización (60 °C), voltaje del capilar (9 V), amplificador (400 Vp), corriente de la fuente (100 μΑ). Como gas auxiliar y nebulizador se utilizó nitrógeno de alta pureza. El análisis cuantitativo se realizó por el método del patrón interno, a partir de diluciones de las soluciones madre de PROG y 1 1 a-OH-PROG en concentraciones comprendidas entre 500.000 μΜ y 15.625 μΜ, a las que se añadió 250 μΜ de testosterona como patrón interno. La extracción de analitos se llevó a cabo de la misma manera que en las muestras a analizar (véase el ejemplo 4, apartado 1). Una vez realizada la extracción, los residuos se resuspendieron en 500 μΙ de acetonitrilo (LC-MaScan, LAB-SCAN) de los que se inyectaron 25 μΙ para su análisis cromatográfico.
Los resultados de un experimento de biotransformación de PROG en 11 a-OH-PROG pueden verse en las Figuras 2 y 3.
La cepa C. glutamicum R31 (pXKFUN) también es capaz de 11 a hidroxilar otros esferoides distintos a la PROG y convertirlos en sus correspondientes derivados 11 a hidroxilados. Asi por ejemplo cuando a la cepa C. glutamicum R31 (pXKFUN) se le suministran como sustrato, en lugar de PROG, sustancias como DOC, TEST, AD o dehidroepiandrosterona (en adelante, DHEA), a una concentración de 0,5 mM, la cepa bacteriana es capaz de sintetizar 11 a-OH-DOC, 11 a-OH-TEST, 11 a-OH-AD u 11 a- OH-DHEA, respectivamente, con rendimientos de 41 ,5 ± 3,6%, 49,3 ± 0,5%, 38,0 ± 7,6% y 22,3 ± 8,7%, respectivamente.
EJEMPLO 6. Biotransformación de CHO en 11 a-OH-ADD utilizando la cepa M. smegmatis CECT 8331 (pMVFUN).
Para los ensayos de biotransformación de colesterol con células en crecimiento de M. smegmatis CECT 8331 (pMVFUN) se empleó el medio 7H9 sin suplementos (sin glicerol y sin ADC) al que se le añadió glicerol 18 mM y colesterol a la concentración final de 1 mM, contenidos en 3,6 % (v/v) de Tyloxapol. En caso de ser necesario se añadió kanamicina (20 mi"1) y ácido δ-aminolevulínico 0,5 mM desde el momento de la inoculación. Un volumen total de 20 mi de cultivo de células de M. smegmatis fueron cultivadas a 37 °C y 250 rpm en matraz de 100 mi desde una D06oo de 0, 1 empleando un preinoculo de 48 h crecido en medio 7H9/Gli/ADC/Tween, a 37 °C y agitado a 250 rpm. Se tomaron muestras para analizar la biotransformación de esferoides y se monitorizó el crecimiento durante 96 h. - Identificación y cuantificación de ADD y 11 a-OH-ADD empleando como sustrato CHO
La separación cromatográfica se realizó en una columna Tracer Excel 120 ODSB C18 (150 mm χ 4,6 mm de diámetro interno, 5 μηι de tamaño de partícula) (Teknokroma, Barcelona). Las fases móviles empleadas contenían agua y 0, 1 % ácido fórmico (A), acetonitrilo y 0,1 % ácido fórmico (B), isopropanol y 0,1 % ácido fórmico (C). El flujo empleado fue de 1 mi min"1 y el gradiente lineal utilizado se muestra en la tabla 2.
Figure imgf000031_0001
Tabla 2.
Durante este gradiente, el eluyente se analizó por DAD y por el espectrómetro de masas desde el minuto 1 hasta el 52. Las condiciones de trabajo del equipo fueron: fuente de ionización APCI, temperatura del capilar 275 °C, temperatura de vaporización 425 °C, voltaje del capilar 39 V, voltaje de descarga de la corona 6.00 kV, corriente de la fuente 6.00 μΑ y 15 eV para la energía de disociación por colisión. Como gas auxiliar y nebulizador se utilizó nitrógeno de alta pureza.
El análisis cuantitativo se realizó por el método del patrón interno, a partir de diluciones de la solución madre de CHO, en concentraciones comprendidas entre 1000.000 μΜ y 15.625 μΜ, a las que se añadió 500 μΜ de testosterona como patrón interno. La extracción de analitos se llevó a cabo de la misma manera que en las muestras a analizar (véase el ejemplo 4, apartado 1). Una vez realizada la extracción, los residuos se resuspendieron en 1500 μΙ de acetonitrilo (LC-MaScan, LAB-SCAN) de los que se inyectaron 25 μΙ para su análisis cromatográfico.
Las cuantificaciones de 11 a-OH-ADD se realizaron mediante el cálculo de rendimiento de la reacción empleando las áreas corregidas, al no disponer de producto puro. Se calcula el rendimiento con respecto al sustrato (colesterol) como:
Figure imgf000032_0001
El resultado de un experimento puede verse en la figura 4.
EJEMPLO 7. Biotransformación de FITO en 11 a-OH-ADD utilizando la cepa . smegmatis CECT 8331 (pMVFUN).
Para los ensayos de biotransformación de fitoesteroles con células en crecimiento de M. smegmatis CECT 8331 (pMVFUN) se empleó el medio 7H9 sin suplementos (sin glicerol y sin ADC) al que se le añadió glicerol 18 mM y los fitoesteroles a la concentración final de 1 mM, contenidos en 3,6 % (v/v) de Tyloxapol. En caso de ser necesario se añadió kanamicina (20 μg mi"1) y ácido δ-aminolevulínico 0,5 mM desde el momento de la inoculación. Un volumen total de 20 mi de cultivo de células de M. smegmatis fueron cultivadas a 37 °C y 250 rpm en matraz de 100 mi desde una D06oo de 0,1 empleando un preinoculo de 48 h crecido en medio 7H9/Gli/ADC/Tween, a 37 °C y agitado a 250 rpm. Se tomaron muestras para analizar la biotransformación de esferoides y se monitorizó el crecimiento durante 96 h. - Identificación y cuantificación de ADD y 11 a-0H-ADD empleando como sustrato FITO
La separación cromatográfica se realizó en una columna Tracer Excel 120 ODSB C18 (150 mm χ 4,6 mm de diámetro interno, 5 μηι de tamaño de partícula) (Teknokroma, Barcelona). Las fases móviles empleadas contenían agua y 0, 1 % ácido fórmico (A), acetonitrilo y 0,1 % ácido fórmico (B), isopropanol y 0,1 % ácido fórmico (C). El flujo empleado fue de 1 ml min"1 y el gradiente lineal utilizado se muestra en la siguiente tabla 3:
Figure imgf000033_0001
Tabla 3.
Durante este gradiente, el eluyente se analizó por DAD y por el espectrómetro de masas desde el minuto 1 hasta el 52. Las condiciones de trabajo del equipo fueron: fuente de ionización APCI, temperatura del capilar 275 °C, temperatura de vaporización 425 °C, voltaje del capilar 39 V, voltaje de descarga de la corona 6.00 kV, corriente de la fuente 6.00 μΑ y 15 eV para la energía de disociación por colisión. Como gas auxiliar y nebulizador se utilizó nitrógeno de alta pureza.
El análisis cuantitativo se realizó por el método del patrón interno, a partir de diluciones de la solución madre de FITO, en concentraciones comprendidas entre 1000.000 μΜ y 15.625 μΜ, a las que se añadió 500 μΜ de testosterona como patrón interno. La extracción de analitos se llevó a cabo de la misma manera que en las muestras a analizar. Una vez realizada la extracción, los residuos se resuspendieron en 1500 μΙ de acetonitrilo (LC-MaScan, LAB-SCAN) de los que se inyectaron 25 μΙ para su análisis cromatográfico.
Para la preparación del medio de cultivo, como para la recta de calibrado, se prepararon las soluciones de fitosteroles a una concentración de 1 mM empleando para el cálculo el peso molecular del β-sitosterol, el más abundante de los fitosteroles presentes en la mezcla. Sin embargo, para la cuantificación se realizó una corrección basándose en la abundancia relativa de sus componentes: β-sitosterol (83,61 %), campesterol (7,59 %) y estigmasterol (8,79%) y teniendo en cuenta peso molecular de cada uno de ellos se calculó la concentración de los mismos, por lo que en la concentración real en las muestras preparadas a concentración 1 mM (medio inicial de cultivo) era la siguiente: 0,84 mM de β-sitosterol, 0,08 mM de campesterol y 0,09 mM de estigmasterol. En la cuantificación, tanto para el cálculo del consumo como para el cálculo de los rendimientos, se expresa la concentración de fitosteroles como el sumatorio de las concentraciones sus componentes, e.g. para el tiempo inicial la concentración de fitosteroles sería 0,84 + 0,08 + 0,08 = 1 mM). Como puede observarse, aunque esta corrección se realizó, resulta despreciable.
Las cuantificaciones de ADD y 1 1aOH-ADD se realizaron mediante el cálculo de rendimiento de la reacción empleando las áreas corregidas, al no disponer de producto puro. Se calcula el rendimiento con respecto al sustrato (fitosteroles) como:
/lltxOH— ADD~\
A{ ISTD )
Ψΐ ΐα- OH-ADD/ FITO AD \ , /ADD , ΊΐαΟΗ-AD , ΊΐαΟΗ-ADD -HBC , Ί,4-ΗΒ< . FITO
El resultado de un experimento puede verse en la figura 5.
EJEMPLO 8. Biotransformación de CHO en 11 a-OH-AD utilizando la cepa M. smegmatis CECT 8332 (pMVFUN).
Para los ensayos de biotransformación de colesterol con células en crecimiento de M. smegmatis CECT 8332 (pMVFUN) se empleó el medio 7H9 sin suplementos (sin glicerol y sin ADC) al que se le añadió glicerol 18 mM y colesterol a la concentración final de 1 mM, contenidos en 3,6 % (v/v) de Tyloxapol. En caso de ser necesario se añadió kanamicina (20 μg mi"1) y ácido δ-aminolevulínico 0,5 mM desde el momento de la inoculación. Un volumen total de 20 mi de cultivo de células de M. smegmatis fueron cultivadas a 37 °C y 250 rpm en matraz de 100 mi desde una D06oo de 0, 1 empleando un preinoculo de 48 h crecido en medio 7H9/Gli/ADC/Tween, a 37 °C y agitado a 250 rpm. Se tomaron muestras para analizar la biotransformación de esferoides y se monitorizó el crecimiento durante 96 h.
La identificación y cuantificación de AD y 11 a-OH-AD se realizó empleando la metodología contenida en el ejemplo 6. La cuantificación 11 a-OH-AD, igualmente se realizó mediante el cálculo de rendimiento de la reacción empleando las áreas corregidas, al no disponer de producto puro. Se calcula el rendimiento con respecto al sustrato CHO como: llttOH—AD
1 a-OH-AD/CHO - ^^^(1^ ^^^
El resultado de un experimento puede verse en la figura 6.
EJEMPLO 9. Biotransformación de FITO en 11 a-OH-AD utilizando la cepa M. smegmatis CECT 8332 (pMVFUN).
Para los ensayos de biotransformación de fitoesteroles con células en crecimiento de M. smegmatis CECT 8332 (pMVFUN) se empleó el medio 7H9 sin suplementos (sin glicerol y sin ADC) al que se le añadió glicerol 18 mM y los fitoesteroles a la concentración final de 1 mM, contenidos en 3,6 % (v/v) de Tyloxapol. En caso de ser necesario se añadió kanamicina (20 μg mi"1) y ácido δ-aminolevulínico 0,5 mM desde el momento de la inoculación. Un volumen total de 20 mi de cultivo de células de M. smegmatis fueron cultivadas a 37 °C y 250 rpm en matraz de 100 mi desde una D06oo de 0,1 empleando un preinoculo de 48 h crecido en medio 7H9/Gli/ADC/Tween, a 37 °C y agitado a 250 rpm. Se tomaron muestras para analizar la biotransformación de esferoides y se monitorizó el crecimiento durante 96 h.
La identificación y cuantificación de AD y 1 1a-OH-AD se realizó empleando la metodología contenida en el ejemplo 7. La cuantificación 11 a-OH-AD, igualmente se realizó mediante el cálculo de rendimiento de la reacción empleando las áreas corregidas, al no disponer de producto puro. Se calcula el rendimiento con respecto al sustrato (FITO) como: Ψ1111a-OH-AD/FITO
Figure imgf000036_0001
El resultado de un experimento puede verse en la figura 7.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Construcción génica que comprende una secuencia nucleotídica codificante para el citocromo CYP509C12 de Rhizopus oryzae y una secuencia nucleotídica codificante para la reductasa RoCPRI de Rhizopus oryzae.
2. Construcción génica según la reivindicación 1 , donde la secuencia nucleotídica codificante para el citocromo CYP509C12 es la SEQ ID NO: 1.
3. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la secuencia nucleotídica codificante para la reductasa RoCPRI es la SEQ ID NO: 2.
4. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que además comprende una secuencia consenso Shine Dalgarno aguas arriba de cada uno de los codones de inicio de cada secuencia nucleotídica.
5. Construcción génica según la reivindicación 4, donde la secuencia consenso se localiza 6 pb aguas arriba de cada uno de los codones de inicio de cada secuencia nucleotídica.
6. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende al menos dos sitios de restricción.
7. Construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que además comprende un codón que da lugar a una alanina situada en la segunda posición de cada una de las dos proteínas traducidas.
8. Célula bacteriana que comprende la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Célula bacteriana según la reivindicación 8, que es una célula de actinobacterias.
10. Célula bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, que es una célula de la especie Corynebacterium glutamicum.
1 1. Célula bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, que es una célula de la especie Mycobacterium smegmatis.
12. Célula bacteriana según la reivindicación 1 1 , que además comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica el componente reductasa de la enzima 3- cetosteroide-9a-hidroxilasa.
13. Célula bacteriana según la reivindicación 12, que además comprende inactivada funcionalmente o delecionada total o parcialmente al menos una secuencia de nucleótidos endógena que codifica la enzima 3-cetosteroide-A1-deshidrogenasa.
14. Célula bacteriana según la reivindicación 12, que es una célula de M. smegmatis CECT 8331.
15. Célula bacteriana según la reivindicación 13, que es una célula de M. smegmatis CECT 8332.
16. Uso de la célula bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para la producción de esferoides 1 1a hidroxilados o sintonas 1 1a hidroxiladas.
17. Uso de la célula bacteriana según la reivindicación 16, donde los esferoides 11 a hidroxilados o las sintonas 1 1a hidroxiladas se producen a partir de sintonas no hidroxiladas.
18. Uso de la célula bacteriana según la reivindicación 17, donde las sintonas 11a hidroxiladas son 11 a-OH-PROG, 11 a-OH-DOC, 11 a-OH-TEST, 11 a-OH-DHEA, 11 a-OH-AD y/o 11 a-OH-ADD y las sintonas no hidroxiladas son PROG, DOC, TEST, DHEA, AD y/o ADD.
19. Uso de la célula bacteriana según la reivindicación 18, donde la célula es la célula según la reivindicación 10.
20. Uso de la célula bacteriana según la reivindicación 16, donde la sintona 11 a hidroxilada es 11 a-OH-ADD producida a partir de esteróles naturales y la célula bacteriana es la célula según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 14.
21. Uso de la célula bacteriana según la reivindicación 16, donde la sintona 11 a hidroxilada es 11 a-OH-AD producida a partir de esteróles naturales y la célula bacteriana es la célula según cualquiera de las reivindicaciones 13 o 15.
22. Uso de la célula bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21 , donde los esteróles naturales son colesterol o fitoesteroles.
23. Procedimiento para la producción de esteroides 1 1a hidroxilados o sintonas 1 1a hidroxiladas que comprende las etapas de: a. poner en contacto un cultivo de la célula bacteriana según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 con un sustrato esteroideo,
b. incubar la mezcla del paso (a) en condiciones de fermentación, y c. separar del medio de cultivo los esteroides 1 1a hidroxilados o las sintonas 1 1a hidroxiladas producidos tras la incubación del paso (b).
24. Procedimiento según la reivindicación 23, donde el medio de cultivo comprende glicerol.
25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24, donde el sustrato esteroideo se selecciona de la lista que consiste en: fitoesteroles, colesterol,
PROG, DOC, TEST, DHEA, AD o ADD, o cualquiera de sus combinaciones.
26. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, donde el sustrato esteroideo son fitoesteroles o colesterol, la sintona 11 a hidroxilada es 11 a-OH-AD y la célula bacteriana es la célula según cualquiera de las reivindicaciones 13 o 15.
27. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, donde el sustrato esteroideo son fitoesteroles o colesterol, la sintona 11 a hidroxilada es 1 1a-OH- ADD y la célula bacteriana es la célula según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 14.
28. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, donde el sustrato esteroideo es AD, ADD, PROG, DOC, DHEA y/o TEST, la sintona 11 a hidroxilada es 11 a-OH-PROG, 11 a-OH-DOC, 11 a-OH-TEST, 11 a-OH-DHEA, 11 a-OH-AD y/o 11 a-OH-ADD y la célula bacteriana es la célula según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.
29. Procedimiento según la reivindicación 28, donde la célula bacteriana es la célula según la reivindicación 10.
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