JP2023552528A - Ｌｃａおよび３－ｋｃａをｕｄｃａおよび３－ｋｕｄｃａに変換するための酵素的方法 - Google Patents
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Abstract
７β－ヒドロキシル化系、ならびにかかる系からリトコール酸および３－ケト－リトコール酸のＰ－ヒドロキシ誘導体を産生するための方法が提供される。また、かかる酵素系およびかかる酵素をコードするプラスミド産生に有用な、組換え生物体も提供される。
Description
本発明は、７β－ヒドロキシル化系、ならびにかかる系からリトコール酸および３－ケト－５β－コール酸の７β－ヒドロキシル誘導体を産生するための方法に関する。本発明はまた、かかる酵素系およびかかる酵素をコードするプラスミド産生に有用な、組換え生物体に関する。
ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）よりも少ない副作用でコレステロール胆石を可溶化することができることから、胆嚢炎の処置に頻繁に処方される有益な胆汁酸である。ＵＤＣＡはまた、抗炎症性の特性も有し、嚢胞性線維症および原発性胆汁性胆管炎のような肝疾患の治療にも適用されている。ＵＤＣＡの主な天然源は、さまざまな種のクマ由来の胆汁である。
ＵＤＣＡはまた、動物の胆汁からも得られるコール酸（ＣＡ）またはＣＤＣＡからも産生することができる。Ｅｇｇｅｒｔら（２０１４）は、Ｗｏｌｆｆ－Ｋｉｓｈｎｅｒケトン還元およびＵＤＣＡを産生するＣ７にてのエピマー化を含めて、ＣＡから出発して５段階でＣＤＣＡを形成する合成経路について報告している。T. Eggert, D. Bakonyi, W. Hummel, J. Biotechnol. 2014, 191, 11-21. Ｚｈｅｎｇら（２０１５）は、ＵＤＣＡへのＣＤＣＡの生体触媒のエピマー化に基づく、より短い合成経路について報告している。M.-M. Zheng, R.-F. Wang, C.-X. Li, J.-H. Xu, Process Biochem. 2015, 50, 598-604.
細胞膜との７β－ヒドロキシラーゼ系の会合は、生体触媒系にとって特別な課題である。実際、Ｄｕｒａｉｒａｊら（２０１６）は、Ｐ４５０ｎｏｒはこれまで発見された唯一の可溶型の真菌ＣＹＰであり、これは脱窒反応を行うと報告している。Durairaj et al. Microb Cell Fact (2016) 15:125. フザリウム・エキセチ（Fusarium equiseti）などの細胞全体の真菌では、試みがさらに複雑化しており、この場合、Ｇｒｏｂｅら（２０２０）が、多重のＰ４５０酵素の作用により副産物の形成がもたらされると、報告している。S. Grobe, C. Badenhorst, T. Bayer, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 10.1002/anie.202012675.
こういったハードルを克服するために、Ｇｒｏｂｅら（２０２０）が報告するところは、大腸菌（Escherichia coli）ベースの細胞全体系での、細胞膜との会合を必要としないＰ４５０酵素である、ストレプトマイセス・アンチビオチクス（Streptomyces antibioticus）由来のｃｙｔ Ｐ４５０モノオキシゲナーゼＣＹＰ１０７Ｄ１（ｏｌｅＰ）のバリアントを使用する、ＬＣＡからのＵＤＣＡの形成である。その著者らは、ＬＣＡをその６β－ヒドロキシ誘導体であるＭＤＣＡに変換するネイティブの酵素を改変することにより、ＭＤＣＡに優先してＵＤＣＡが形成されるように、ヒドロキシル化の位置を大部に変化させることができた。しかし、変換は、極めて低い生産性（２４時間で良くても６７μＭ）および、不完全な位置選択性（良くても７３：２７のＵＤＣＡ：ＭＤＣＡ比）をもって、行われた。
したがって、ＬＣＡおよび３－ＫＣＡをＵＤＣＡおよび３－ＫＵＤＣＡに選択的に変換するための効率的かつ生産的な方法に対するニーズが存在する。理想的な方法であれば、高収率を与え、スケールアップすることが容易であり、商業生産で実装することが容易である、と思われる。商業的な量でのリトコール酸または３－ＫＣＡの７β－ヒドロキシル化のための効率的な酵素系、方法、および成分が必要とされている。
本発明者らは、他の種由来のネイティブの７β－ヒドロキシル化系で形質転換された酵母を用いた一連の実験を含めて、ＬＣＡおよび３－ＫＣＡをヒドロキシル化するための操作されたさまざまな微生物系を用いて鋭意実験をしたところ、予期せぬことに、７β－ヒドロキシラーゼ活性を発現するように形質転換された、酵母ベースの系であって、ＬＣＡおよび３－ＫＣＡならびにこれらの誘導体から、ＵＤＣＡおよび３－ＫＵＤＣＡならびにこれらの誘導体を選択的に産生することができる、酵母ベースの系を発見した。したがって、第１の主要な実施形態では、本発明は、ＬＣＡもしくは３－ＫＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、ＵＤＣＡもしくは３－ＫＵＤＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩に変換する方法であって、酵母、またはその抽出物もしくは溶解物の存在下で、ＬＣＡもしくは３－ＫＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、７β－ヒドロキシラーゼ系と接触させることを含み、７β－ヒドロキシラーゼ系は酵母に対してネイティブではない、方法を提供する。
さらなる主要な実施形態は、本発明の生物体を作出するのに使用されるプラスミドに関する。したがって、第２の主要な実施形態では、本発明は、配列番号８；配列番号１１；配列番号１４；配列番号１７；配列番号２０；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２９；もしくは配列番号３２；または、前述の配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列から選択される核酸配列を含む、プラスミドを提供する。
さらなる実施形態は、本発明の方法で使用される形質転換生物体に関する。したがって、第３の主要な実施形態では、本発明は、配列番号８；配列番号１１；配列番号１４；配列番号１７；配列番号２０；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２９；および配列番号３２；または、前述の核酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列から選択されるＣＹＰコード核酸配列によって形質転換された、生物体を提供する。
またさらなる実施形態は、本発明の変換が行われる反応混合物に関する。したがって、第４の主要な実施形態では、本発明は、（ｉ）ＬＣＡまたは３－ＫＣＡ、（ｉｉ）酵母、またはその抽出物もしくは溶解物、（ｉｉｉ）７β－ヒドロキシル化系を含む、反応混合物を提供する。第５の主要な実施形態は、酵母と、Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（「ＣＰＲ」）酵素およびＰ４５０ ７β－ヒドロキシラーゼ（「ＣＹＰ」）酵素を含む７β－ヒドロキシル化系とを含む反応混合物であって、ＣＹＰ酵素は、ジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）、好ましくはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＰＨ１またはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＶＫＭ２６００、最も好ましくはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＶＫＭ２６００に対してネイティブの酵素である、反応混合物を提供する。
本発明のさらなる利点は、以下の説明に一部が記載されており、また一部は説明から自明であり、または本発明の実施によって知ることになろう。本発明の利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素および組合せによって実現され、達成されるであろう。前述の全般的説明および以下の詳細な説明は、例示的および説明的なものにすぎず、特許請求されている本発明を限定するものではない。
添付図面は、本明細書の一部に取り込まれ、これを構成するものであるが、本発明のいくつかの実施形態を例示し、説明と一緒になって本発明の原理を説明する働きを果たすものである。
用語の定義および使用
本明細書でおよび以下の特許請求の範囲で使用される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。
本明細書でおよび以下の特許請求の範囲で使用される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。
本明細書および以下の特許請求の範囲で使用される場合、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」や「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの当該単語の変化形は、「含むがそれらに限定されない」ことを意味し、例えば、その他の添加剤、成分、整数またはステップを排除することを意図しない。要素が、複数の成分、ステップまたは条件を含むと記載されている場合、当該要素はまた、かかる複数の成分、ステップもしくは条件の任意の組合せを含むと記載される場合もあり、あるいは、複数の成分、ステップもしくは条件またはそれらの組合せ「からなる」もしくは「から実質的になる」と記載される場合もあることを理解されたい。
範囲の下限を範囲の上限とは別に指定するかまたは特定の数値を指定することによって範囲が与えられる場合、範囲は、下限変数、上限変数、および数学的に可能である特定の数値のいずれかを選択的に組み合わせることによって定義され得ることが理解されるであろう。同様に、範囲が一方の端点から別の端点にまたがるように定義されている場合、当該範囲は２つの端点の間およびこれらを除いた全範囲を包含することも理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、製造のばらつきや時間によって誘発される製品の劣化に起因する製品強度の差異などの、化学工業で許容されかつこの業界の製品に固有のばらつきを補償するものである。一実施形態では、本用語は±５％のばらつきまたは±１０％のばらつきを許容する。
本発明の組成物に関連して使用されるように「許容される」という句は、生理学的に容認でき、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与される場合に通常には有害反応を生じない、かかる組成物の分子実体およびその他の成分を指す。
「コード配列」とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
「天然に存在する」または「野生型の」または「ネイティブの」とは、「天然に存在しない」、「非野生型の」、「非ネイティブの」、または「外来性の」とは対照的に、天然で見いだされる形態を指す。例えば、天然に存在する、または野生型のポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列とは、天然におけるソースから分離することができ、ヒトの操作によって意図的に改変されていない、生物体中に存在する配列である。
例えば、細胞、核酸またはポリペプチドに言及して使用される場合の「組換え」とは、そうでなければ天然には存在しないと思われる様式で改変された、材料、または材料の天然のもしくはネイティブの形態に相当する材料を指す。非限定的な例としては、中でも、組換え細胞が細胞のネイティブ（非組換え）形態内では見いだされない遺伝子を発現することまたは組換え細胞がそうでなければ異なるレベルで発現されるネイティブの遺伝子を発現すること、が挙げられる。
「配列同一性のパーセンテージ」および「相同性のパーセンテージ」は、ポリヌクレオチド間およびポリペプチド間の比較を指して本明細書では互換的に使用され、最適にアライメントされた２つの配列を比較ウインドウにわたって比較することによって決定されるが、この場合、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、当該２つの配列の最適なアライメント向けの参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較した場合、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことになる。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列において存在する位置の数を決定することによって、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較のウインドウ内の位置の合計数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、算出される。
当業者であれば、２つの配列をアライメントするのに利用可能な確立された多くのアルゴリズムがあることを知っているであろう。比較のための配列の最適アライメントは、例えば、Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の類似度法の検索によって、これらアルゴリズムのコンピュータ化手段（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または外観検査（一般に、Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)を参照されたい）によって、実施することができる。配列の同一性パーセントおよび配列類似性を決定するのに適切であるアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０のアルゴリズムであるが、それらは、それぞれ、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410およびAltschul et al., 1977, Nucleic Acids Res. 3389-3402に記載されている。
「参照配列」とは、配列比較の根拠として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長の遺伝子配列またはポリペプチド配列のセグメント、であってもよい。一般には、参照配列は、少なくとも２０個のヌクレオチドまたはアミノ酸の残基の長さ、少なくとも２５個の残基の長さ、少なくとも５０個の残基の長さ、または核酸もしくはポリペプチドの完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、（１）２つの配列の間で類似している配列（すなわち、完全な配列の一部分）を含むことができるとともに、（２）２つの配列の間で異なる配列をさらに含むことができるので、２つの（またはそれより多い）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較は、「比較ウインドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較して配列類似性の局所領域を特定しかつ比較することにより通常には行われる。
「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０個の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、この場合、配列を、少なくとも２０の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、かつ、比較ウインドウ内の配列の部分は、２つの配列の最適アライメント向けの参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウは、２０個よりも長い連続する残基とすることができ、これには、必要に応じて、３０、４０、５０、１００、１５０もしくは２００個またはそれより多いウインドウが含まれる。
「実質的な同一性」とは、参照配列の少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％を含む比較ウインドウにわたって参照配列と比較して、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの配列同一性、少なくとも９０パーセントの配列同一性、または少なくとも９５パーセントの配列同一性、より通常には少なくとも９８もしくは９９％の配列同一性を有する、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を指す。ポリペプチドに適用される特定の実施形態では、「実質的な同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列が、例えば、デフォルトギャップウエイトを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適にアライメントされる場合、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれより多い配列同一性（例えば９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって相違する。
本明細書において細胞性生物体への言及が与えられる場合、その野生型状態と改変生物体としての両方での生物体を指すと理解されたい。したがって、酵母という用語には、組換え技法を使用して産生される任意の人工酵母に加えて、自然界に天然に存在するすべての野生型酵母も含まれる。
「酵母」という用語は、サッカロミセテス（Saccaromycetes）綱、好ましくはサッカロミセタール（Saccharomycetales）目、好ましくはサッカロミセテス（Saccharomycetaceae）科の子嚢菌類（Ascomycota Fungi）を指す。特に好ましい酵母は、ピキア属（Pichia）およびサッカロミケス属（Saccharomyces）の各属に属し、とりわけピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびサッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）である。
３－ＫＣＡ、すなわち３－ケト－５β－コラン酸は、以下の化学構造によって表される：
ＬＣＡ、すなわちリトコール酸は、以下の化学構造によって表される：
３－ＫＵＤＣＡ、すなわち７β－ヒドロキシ－３－ケト－５β－コラン酸は、以下の化学構造によって表される：
ＵＤＣＡ、すなわちウルソデオキシコール酸は、以下の化学構造によって表される：
本明細書で使用される場合、カルボキシレート「塩」とは、親化合物が、既存の酸部分をその塩の形態に変換することによって改変されている、本開示の化合物の誘導体を指す。適切な塩の例としては、それらに限定されないが、カルボン酸の酸性残基のアルカリ塩または有機塩が挙げられる。本発明の塩には、例えば非毒性の無機塩基または有機塩基から形成される、親化合物の従来の非毒性の塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。本発明の塩は、酸性部分を含有する親化合物から従来の化学的方法により合成することができる。一般に、かかる塩は、これらの化合物の遊離酸形態を、水中でもしくは有機溶媒中で、またはそれら２つの混合物中で化学量論量の適当な塩基と反応させることによって調製することができる。
本明細書で使用される場合、「エステル」とは、好ましくは、－ＣＯＯＲ部分を指す（式中、Ｒは、必要に応じて置換されたＣ１～２０アルキル、または必要に応じて置換されたアリールである）。
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、直鎖または分枝鎖である飽和炭化水素基を指すことを意味する。例としてのアルキル基には、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ－プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）等が挙げられる。本発明の実施形態または下位実施形態のいずれかでは、アルキル基は、１個～約２０個、２個～約２０個、１個～約１０個、１個～約８個、１個～約６個、１個～約４個、または１個～約３個の炭素原子を含有することができる。
本明細書で使用される場合、「アリール」とは、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、およびインデニル等などの、単環式または多環式（例えば、２、３または４つの縮合環を有する）芳香族炭化水素（ヘテロ芳香族炭化水素を含む）を指す。一部の実施形態では、アリール基は６個～約２０個の炭素原子を有する。
本発明の実施形態または下位実施形態のいずれかでは、必要に応じて置換されている部分は、ハロ、ＯＨ、アミン、Ｃ１～６アルキル、Ｃ１～６アルコキシ、Ｃ１～６ヒドロキシアルキル、ＣＯ（Ｃ１～６アルキル）、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１～６アルキル）、およびＣ１～６ハロアルキルから独立して選択される０、１、２、または３個の置換基で置換されていると、択一的に定義することができる。
本明細書で使用される場合、アミドは、好ましくは、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）（Ｒ”）部分を指す（式中、Ｒ’およびＲ”は、独立して、必要に応じて置換されているＣ１～２０アルキル、または必要に応じて置換されているアリールである）。代替的に、ＵＤＣＡのカルボキシルアミドは、タウロウルソデオキシコール酸（「ＴＵＤＣＡ」）とすることができる。
本発明の「Ｐ４５０ ７β－ヒドロキシラーゼ系」とは、ＬＣＡまたはＫ－ＬＣＡの７－Ｈ位置をヒドロキシル化することができるクラスＩＩ ＣＹＰ酵素系を指す。Durairaj et al. Microb Cell Fact (2016) 15:125に論議のように、クラスＩＩ ＣＹＰ酵素系は、補欠因子であるＦＡＤおよびＦＭＮを含有する２つの膜内在性タンパク質：Ｐ４５０ ７β－ヒドロキシラーゼ（本明細書では「ＣＹＰ」と呼ばれることもある）およびシトクロムＰ４５０レダクターゼ（本明細書では「ＣＰＲ」と呼ばれることもある）を含むが、これら補欠因子はＮＡＤ（Ｐ）Ｈからヘム部分に２個の電子を伝達する。この系はまた、第３のタンパク質成分Ｃｙｔ ｂ５も含み、これは、オキシフェラスＣＹＰに第２の電子を運ぶ。
主要な実施形態の論議
本発明の第１の主要な実施形態は、ＬＣＡもしくは３－ＫＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、ＵＤＣＡもしくは３－ＫＵＤＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩に変換する方法であって、酵母、またはその抽出物もしくは溶解物の存在下で、ＬＣＡもしくは３－ＫＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、７β－ヒドロキシラーゼ系と接触させることを含み、７β－ヒドロキシラーゼ系は酵母に対してネイティブではない、方法を提供する。
本発明の第１の主要な実施形態は、ＬＣＡもしくは３－ＫＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、ＵＤＣＡもしくは３－ＫＵＤＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩に変換する方法であって、酵母、またはその抽出物もしくは溶解物の存在下で、ＬＣＡもしくは３－ＫＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、７β－ヒドロキシラーゼ系と接触させることを含み、７β－ヒドロキシラーゼ系は酵母に対してネイティブではない、方法を提供する。
第２の主要な実施形態は、配列番号８；配列番号１１；配列番号１４；配列番号１７；配列番号２０；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２９；もしくは配列番号３２；または、前述の配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、から選択される核酸配列を含む、プラスミドを提供する。
第３の主要な実施形態は、配列番号８；配列番号１１；配列番号１４；配列番号１７；配列番号２０；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２９；および配列番号３２；または、前述の核酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、から選択されるＣＹＰコード核酸配列によって形質転換された、生物体を提供する。
第４の主要な実施形態では、本発明は、（ｉ）ＬＣＡまたは３－ＫＣＡ、（ｉｉ）酵母、またはその抽出物もしくは溶解物、および（ｉｉｉ）７β－ヒドロキシル化系を含む、反応混合物を提供する。
第５の主要な実施形態は、酵母と、Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（「ＣＰＲ」）酵素およびＰ４５０ ７β－ヒドロキシラーゼ（「ＣＹＰ」）酵素を含む７β－ヒドロキシル化系とを含む、反応混合物であって、ＣＹＰ酵素は、ジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）、好ましくはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＰＨ１またはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＶＫＭ２６００、最も好ましくはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＶＫＭ２６００に対してネイティブの酵素である、反応混合物を提供する。
下位実施形態の論議
先に記述のように、本発明は、非ネイティブの７β－ヒドロキシル化系を発現するように形質転換された酵母の存在下で実施されるのが好ましい。酵母は、サッカロミケス属（Saccharomyces）およびピキア属（Pichia）から選択されるのが好ましく、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）から選択されるのが最も好ましい。
先に記述のように、本発明は、非ネイティブの７β－ヒドロキシル化系を発現するように形質転換された酵母の存在下で実施されるのが好ましい。酵母は、サッカロミケス属（Saccharomyces）およびピキア属（Pichia）から選択されるのが好ましく、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）から選択されるのが最も好ましい。
本発明の方法で使用される生物体は、非ネイティブのＰ４５０ ７β－ヒドロキシラーゼ（「ＣＹＰ」）酵素および必要に応じて非ネイティブのＰ４５０オキシドレダクターゼ（「ＣＰＲ」）酵素を含む非ネイティブの７β－ヒドロキシル化系によって形質転換されることになる。ＣＰＲ酵素は、７β－ヒドロキシラーゼ系にとって極めて重要であるが、一方、酵母にとってネイティブの内在性のもので十分な場合もあるように、ＣＰＲ酵素が生物体にとって外来性であることは絶対に必要というわけではない。
本発明を実施するための好ましいＣＹＰ酵素は、配列番号８；配列番号１１；配列番号１４；配列番号１７；配列番号２０；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２９；および配列番号３２；または、前述の核酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、から選択されるＣＹＰコード核酸配列によってコードされる。
ＣＹＰをコードする核酸を、前述の配列番号のいずれか１つまたはそれらの組合せから選択し、本発明のＣＰＲ酵素のいずれかと組み合わせることができる。一実施形態では、コード核酸配列は、配列番号８；配列番号１１；配列番号１４；配列番号１７；および配列番号２０；または、前述の配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列から選択される。別の実施形態では、核酸は、配列番号２３；配列番号２６；もしくは配列番号２９；または、前述の配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列から選択される。さらに別の実施形態では、核酸配列は、配列番号３２；または、配列番号３２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
から選択される。
から選択される。
ＣＹＰ酵素は、好ましくは、配列番号９；配列番号１２；配列番号１５；配列番号１８；配列番号２１；配列番号２４；配列番号２７；配列番号３０；もしくは配列番号３３；または、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、から選択されるＣＹＰアミノ酸配列を含む。
ＣＹＰ酵素を、前述の配列番号のいずれか１つまたはそれらの組合せから選択し、本発明のＣＰＲ酵素のいずれかと組み合わせることができる。一実施形態では、ＣＹＰ酵素は、配列番号９；配列番号１２；配列番号１５；配列番号１８；および配列番号２１；または、前述の配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＹＰ酵素は、配列番号２４；配列番号２７；もしくは配列番号３０；または、前述の配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ＣＹＰ酵素は、配列番号３３；または、配列番号３３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明のＣＹＰ酵素をコードする好ましいプラスミドは、好ましくは、配列番号７；配列番号１０；配列番号１３；配列番号１６；配列番号１９；配列番号２２；配列番号２５；配列番号２８；もしくは配列番号３１；または、前述の核酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、から選択される核酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＹＰ酵素をコードするプラスミドは、配列番号７；配列番号１０；配列番号１３；配列番号１６；もしくは配列番号１９；または、前述の配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＹＰ酵素をコードするプラスミドは、配列番号２２；配列番号２５；もしくは配列番号２８；または、前述の配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む。さらに別の実施形態では、ＣＹＰ酵素をコードするプラスミドは、配列番号３１；または、配列番号３１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列を含む。
一実施形態では、ＣＹＰ酵素は、ジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）、好ましくはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＰＨ１またはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＶＫＭ２６００、最も好ましくはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＶＫＭ２６００に対してネイティブのタンパク質であり、生物体はかかるタンパク質を発現するように形質転換されている。
７β－ヒドロキシル化系におけるＣＰＲ酵素は、７β－ヒドロキシラーゼ活性が発現される生物体対してネイティブであってもよく、配列番号２および配列番号５、または、前述の核酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列、から選択されるＣＰＲコード核酸配列よってコードされていてもよい。ＣＰＲ酵素は、好ましくは、配列番号３および配列番号６、または前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列、から選択されるＣＰＲアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の方法は、ＬＣＡ、またはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を７β－ヒドロキシラーゼ系と接触させることによって、ＵＤＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を産生するように、実行される。別の実施形態では、本発明の方法は、３－ＫＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を７β－ヒドロキシラーゼ系と接触させて、３－ＫＵＤＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を産生するステップによって、実行される。３－ＫＵＤＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を産生する場合、本発明の方法は必要に応じて、３－ＫＵＤＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、ＵＤＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩に還元するステップをさらに含むことになる。
好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＵＤＣＡもしくは３－ＫＵＤＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、７β－ヒドロキシラーゼ系から単離するステップをさらに含む。単離されているとは、ＵＤＣＡまたは３－ＫＵＤＣＡが、７β－ヒドロキシラーゼ系およびＵＤＣＡまたは３－ＫＵＤＣＡが産生された反応混合物から実質的に純粋であることを意味する。したがって、任意の残留反応混合物の重量を考慮する場合、ＵＤＣＡまたは３－ＫＵＤＣＡは少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、または少なくとも９８％純粋である。特に好ましい実施形態では、ＵＤＣＡもしくは３－ＫＵＤＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩は、実質的に純粋なジアステレオ異性体として産生される。「実質的に純粋なジアステレオマー」とは、その７α－ジアステレオマーを考慮する場合、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、または少なくとも９８％純粋であるジアステレオマーを指す。
操作されたＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素
本明細書に開示のＣＹＰおよびＣＰＲの酵素配列とは異なる特性を有するＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素は、ＣＹＰ酵素またはＣＰＲ酵素をコードする遺伝物質を突然変異させることおよび所望の特性を備える操作された酵素を発現するポリヌクレオチドを特定することによって得ることができる。こういった天然に存在しないＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発または指向性進化法などのさまざまなよく知られた技法によって作り出すことができる。一部の実施形態では、指向性進化法とは、ポリペプチドをコードする遺伝子の全体にわたって突然変異を発生させること、さらには、先に突然変異されたポリヌクレオチドを取り出せる能力をもたらすことならびにそれらを突然変異誘発および／または組換えのさらなるサイクルに供して、選択された酵素特性においてさらなる改善を得ること、が比較的容易であることから、操作された酵素を作り出すための魅力的な方法である。遺伝子全体を突然変異誘発に供することにより、遺伝子の限られた領域への変化を制限することから結果として生じる恐れがある偏りを減少させることができる。遺伝子全体を突然変異誘発に供することにより、また、さまざまな酵素特性において影響を受ける酵素の作出を増強することができるが、これは、酵素に関し遠く間隔が開いた部分が酵素機能のさまざまな面において役割を担っている可能性があるからである。
本明細書に開示のＣＹＰおよびＣＰＲの酵素配列とは異なる特性を有するＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素は、ＣＹＰ酵素またはＣＰＲ酵素をコードする遺伝物質を突然変異させることおよび所望の特性を備える操作された酵素を発現するポリヌクレオチドを特定することによって得ることができる。こういった天然に存在しないＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発または指向性進化法などのさまざまなよく知られた技法によって作り出すことができる。一部の実施形態では、指向性進化法とは、ポリペプチドをコードする遺伝子の全体にわたって突然変異を発生させること、さらには、先に突然変異されたポリヌクレオチドを取り出せる能力をもたらすことならびにそれらを突然変異誘発および／または組換えのさらなるサイクルに供して、選択された酵素特性においてさらなる改善を得ること、が比較的容易であることから、操作された酵素を作り出すための魅力的な方法である。遺伝子全体を突然変異誘発に供することにより、遺伝子の限られた領域への変化を制限することから結果として生じる恐れがある偏りを減少させることができる。遺伝子全体を突然変異誘発に供することにより、また、さまざまな酵素特性において影響を受ける酵素の作出を増強することができるが、これは、酵素に関し遠く間隔が開いた部分が酵素機能のさまざまな面において役割を担っている可能性があるからである。
突然変異誘発および指向性進化法では、天然に存在するもしくは野生型のＣＹＰ酵素またはＣＰＲ酵素をコードする親ポリヌクレオチドまたは参照ポリヌクレオチドを、突然変異誘発プロセス、例えばランダム突然変異誘発および組換えに供して、ポリヌクレオチドに突然変異を導入する。突然変異されたポリヌクレオチドは発現および翻訳され、それによってポリペプチドへの改変を含む操作されたＣＹＰ酵素またはＣＰＲ酵素が作り出される。本明細書で使用される場合、「改変」には、アミノ酸の置換、欠失、および挿入が含まれる。改変のいずれか１つまたは組合せを、天然に存在する酵素的に活性なポリペプチドに導入して、操作された酵素を作り出すことができ、次いで、このような酵素をさまざまな方法によってスクリーニングし、その結果、特定の酵素特性において所望の改善を有するポリペプチドおよび対応するポリヌクレオチドを特定する。
７－ベータヒドロキシラーゼ環境
ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素は、細胞内に、細胞培地中に、固定化基質上に、または酵素を発現するように組換え設計された細胞の溶解物および抽出物、もしくは単離された調製物などの他の形態で、存在することができる。「単離されたポリペプチド」という用語は、それを天然に伴う他の夾雑物、例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されているポリペプチドを指す。本用語は、それらが天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から取り出されたまたは精製されたポリペプチドを包含する。
ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素は、細胞内に、細胞培地中に、固定化基質上に、または酵素を発現するように組換え設計された細胞の溶解物および抽出物、もしくは単離された調製物などの他の形態で、存在することができる。「単離されたポリペプチド」という用語は、それを天然に伴う他の夾雑物、例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されているポリペプチドを指す。本用語は、それらが天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から取り出されたまたは精製されたポリペプチドを包含する。
一部の実施形態では、単離されたＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素は、実質的に純粋なポリペプチドの組成物中に存在する。用語「実質的に純粋なポリペプチド」とは、当該ポリペプチド種が、存在している優勢種である（すなわち、モルベースまたは重量ベースで、当該ポリペプチド種が、組成物中の他のいかなる個々の高分子種よりも豊富である）ような、組成物を指すものであり、そして、「実質的に純粋なポリペプチド」とは、対象種が、モルまたは重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合に、全体としては実質的に精製された組成物である。全体として、実質的に純粋なＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素の組成物は、当該組成物中に存在する、モルまたは重量％で、すべての高分子種のうちの約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上および約９８％以上を構成することになる。一部の実施形態では、対象の種は、本質的な均質性へと精製され（すなわち、夾雑物種は従来の検出方法によって組成物中に検出されない）、この場合、当該組成物は、唯一のＣＹＰおよびＣＰＲの高分子種から本質的になる。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、高分子種として考慮されない。
コードポリヌクレオチド
ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素をコードする分離されたポリヌクレオチドはさまざまな方法で操作されて、酵素の発現をもたらすことができる。分離されたポリヌクレオチドをベクターへのその挿入の前に操作することは、発現ベクターに応じて、望ましい場合もあれば必要である場合もある。組換えＤＮＡ法を活用する、ポリヌクレオチド配列および核酸配列を改変する技法は、当技術分野でよく知られている。指針については、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2006、に提供されている。
ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素をコードする分離されたポリヌクレオチドはさまざまな方法で操作されて、酵素の発現をもたらすことができる。分離されたポリヌクレオチドをベクターへのその挿入の前に操作することは、発現ベクターに応じて、望ましい場合もあれば必要である場合もある。組換えＤＮＡ法を活用する、ポリヌクレオチド配列および核酸配列を改変する技法は、当技術分野でよく知られている。指針については、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel. F. ed., Greene Pub. Associates, 1998, updates to 2006、に提供されている。
したがって、別の態様では、本開示はまた、組換え発現ベクターであって、これが導入されることになる宿主のタイプに応じて、ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素のポリペプチドまたはそれのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、プロモーターおよびターミネーター、複製起点等などの１つまたは複数の発現調節領域とを含む、組換え発現ベクターも指向する。さまざまな核酸配列および制御配列を互いに結合させて、１つまたは複数の便利な制限部位を含むことができる組換え発現ベクターを作製し、その結果、かかる部位にてのポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換をもたらすことができる。上記組換え発現ベクターを創る場合、コード配列が発現のための適当な制御配列と作動可能に連結されるように、コード配列はベクター内で配置される。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に適宜供することができるとともにポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、任意のベクター（例えば、プラスミドでもウイルスでも）とすることができる。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入されることになる宿主細胞とのベクターの適合性に依存することになる。ベクターは、直鎖状プラスミドであっても閉環状プラスミドであってもよい。
発現ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体複製から独立している染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体とすることができる。ベクターには、自己複製を保証するための任意の手段を含有することができる。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入される場合にゲノムに統合され、それが統合された染色体とともに一緒に複製されるものであってもよい。さらに、単一のベクターもしくはプラスミド、または、宿主細胞のゲノムに導入されることになる全ＤＮＡを一緒になって含有する２つ以上のベクターもしくはプラスミドを使用してもよい。特に好ましい実施形態では、本発明のプラスミドまたはベクターは、ＡＯＸ１プロモーターおよびＡＯＸ１ターミネーター配列の制御下にある。
「制御配列」という用語は、本明細書では、本開示のポリペプチドの発現に必要または有益であるすべての成分を含んで、定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとってネイティブであっても外来性であってもよい。かかる制御配列には、それらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが含まれる。最低限、制御配列にはプロモーター、転写停止シグナルおよび翻訳停止シグナル、ならびにリボソーム結合部位（翻訳を停止するため）が含まれる。特定の制限部位を導入してポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列とのライゲーションを容易にする目的で、制御配列にリンカーが設けられてもよい。
「作動可能に連結された」という用語は、本明細書では、制御配列は、ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を導くように、ＤＮＡ配列のコード配列に対してある位置で適当に配置される構成であると、定義される。制御配列は、適当なプロモーター配列とすることができる。「プロモーター配列」とは、コード領域の発現のために、宿主細胞によって認識される核酸配列である。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異型、切断型およびハイブリッドの各プロモーターを含めて、最適の宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列とすることができ、そして、宿主細胞にとって同種性または異種性のいずれかである細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち宿主細胞によって認識されて転写を終了させる配列の場合もある。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。最適の宿主細胞内で機能性である任意のターミネーターを本発明で使用することができる。
ＣＹＰポリペプチドおよびＣＰＲポリペプチドの発現のための宿主細胞
別の態様では、本開示は、本開示のＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素の発現に使用するための宿主細胞は当技術分野でよく知られており、これには、特に本発明の酵母細胞（例えば、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris））が含まれる。特定の一実施形態では、本発明の方法は、ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素を発現する細胞全体、またはかかる細胞の抽出物もしくは溶解物を用いて実施され、この場合、細胞全体またはかかる細胞全体の抽出物もしくは溶解物は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびサッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から選択される。上記の宿主細胞用の適当な培養培地および増殖条件は当技術分野でよく知られている。
別の態様では、本開示は、本開示のＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素の発現に使用するための宿主細胞は当技術分野でよく知られており、これには、特に本発明の酵母細胞（例えば、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris））が含まれる。特定の一実施形態では、本発明の方法は、ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素を発現する細胞全体、またはかかる細胞の抽出物もしくは溶解物を用いて実施され、この場合、細胞全体またはかかる細胞全体の抽出物もしくは溶解物は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）およびサッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）から選択される。上記の宿主細胞用の適当な培養培地および増殖条件は当技術分野でよく知られている。
ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素の発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で知られているさまざまな方法によって細胞に導入することができる。本明細書に記載の酵母の場合、典型的な方法は、形質転換（例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウム媒介）もしくはコンジュゲーション、または場合によってはプロトプラスト融合によるものである。ポリヌクレオチドを細胞に導入するためのさまざまな方法が、当業者であれば明らかであろう。
反応条件
本明細書に記載の立体選択的ヒドロキシル化を実施する場合、精製酵素（固定化バリアントを含む）、酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞全体、ならびに／またはかかる細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解物の形態で、ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素を反応混合物に添加することができる。操作されたＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素をコードする遺伝子は、別々に宿主細胞に形質転換されても、同じ宿主細胞に一緒に形質転換されてもよい。
本明細書に記載の立体選択的ヒドロキシル化を実施する場合、精製酵素（固定化バリアントを含む）、酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞全体、ならびに／またはかかる細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解物の形態で、ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素を反応混合物に添加することができる。操作されたＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素をコードする遺伝子は、別々に宿主細胞に形質転換されても、同じ宿主細胞に一緒に形質転換されてもよい。
例えば、一部の実施形態では、宿主細胞の一方のセットを、ＣＹＰ酵素をコードする遺伝子で形質転換してもよく、別のセットを、ＣＰＲ酵素をコードする遺伝子で形質転換してもよい。形質転換細胞の両セットとも、細胞全体の形態で、またはこれに由来する溶解物もしくは抽出物の形態で、反応混合物中で一緒に利用することができる。他の実施形態では、宿主細胞を、操作されたＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素の両方をコードする遺伝子で形質転換する場合もある。
ＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞全体、またはこれの細胞抽出物および／もしくは溶解物は、固体（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、固定化等）または半固体（例えば粗ペースト）を含めて、さまざまな異なる形態で用いることができる。細胞抽出物または細胞溶解物は、沈殿によって（硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理等）によって、これに続いて凍結乾燥前の脱塩手順（例えば、限外濾過、透析等）によって、部分的に精製することができる。
ヒドロキシル化反応に使用される反応物質の量は全体として、用いられるＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素の基質の量に応じて変動することになる。以下の指針を、使用するＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素の量を決定するのに使用することができる。一般に、ステロール基質を、ヒドロキシラーゼ系約５０ｍｇ／リットル～約５ｇ／リットルを使用して、約１～２０グラム／リットルの濃度で用いる。反応混合物中のステロールとヒドロキシラーゼ系との重量比は通常、約１０：１～２００：１である。当業者であれば、これらの量を変動させて所望の生産性レベルおよび生産スケールにそれらの量を合うようにする方法を容易に理解するであろう。
反応物質の添加順序は重要なものではない。反応物質は、同時に溶媒（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系等）に一緒に添加してもよく、または代替的に、反応物質の一部を別々に添加し、一部を異なる時点で一緒に添加してもよい。例えば、ヒドロキシラーゼ系を最初に溶媒に添加してもよい。しかし、好ましくは、酵素調製物は最後に添加する。
本明細書に記載のＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素の触媒反応を実施するための適切な条件には、経験的なｐＨおよび温度でＣＹＰ酵素およびＣＰＲ酵素とステロール基質とを接触させること、ならびに、例えば、本明細書で提供される実施例に記載の方法を使用して生成物を検出することを含めて、広範囲の条件が含まれる。
本明細書に記載のヒドロキシラーゼ触媒反応は全体として溶媒中で行われる。水が最も好ましいが、有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、１－オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエン等、および、イオン液体、例えば、１－エチル４－メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩、１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムテトラフルオロホウ酸塩、１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムヘキサフルオロリン酸塩等を、ある特定の状況で、単独でまたは水と組み合わせて使用することができる。好ましい実施形態では、水および水性共溶媒系を含めて、水性溶媒が使用される。溶媒系は、５０％、７５％、９０％、９５％、または９８％を超える水であるのが好ましく、一実施形態では１００％水である。
ヒドロキシル化の過程中、反応混合物のｐＨが変化することがある。反応混合物のｐＨは、反応の過程中に酸または塩基の添加によって、所望のｐＨにまたは所望のｐＨ範囲内に維持することができる。代替的に、緩衝剤を含む溶媒を使用することによってｐＨを制御することができる。所望のｐＨ範囲を維持する適切な緩衝剤が当技術分野で知られており、これには、例えば、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤等が含まれる。緩衝剤と酸または塩基の添加との組合せも使用することができる。
ヒドロキシル化は典型的には約１５℃～約７５℃の範囲の温度で実施される。一部の実施形態の場合、反応は約２０℃～約５５℃の範囲の温度で実施される。さらに他の実施形態では、反応は約２０℃～約４５℃の範囲の温度で実施される。反応は室温条件下で実施されてもよい。
反応を全体として、基質の本質的に完全な、またはほぼ完全なヒドロキシル化が得られるまで進行させてもよい。生成物への基質のヒドロキシル化を、基質および／または生成物を検出することによる既知の方法を使用してモニタリングすることができる。適切な方法には、ガスクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等が含まれる。反応混合物中で産生されるステロールヒドロキシル化生成物の変換収率は、全体として約５０％超であり、約６０％超の場合もあり、約７０％超の場合もあり、約８０％超の場合もあり、約９０％超の場合もあり、約９７％超の場合さえある。
ヒドロキシル化生成物を、反応混合物から回収することができ、必要に応じて、当業者に知られている方法を使用してさらに精製することができる。ヒドロキシラーゼ系から単離するためのクロマトグラフィー技法には、中でも、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。特定のステロールを精製するための条件は、部分的には、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状等などの要因に左右されることになり、当業者であれば明らかであろう。生成物精製向けの好ましい方法には、有機溶媒への抽出とこれに続く結晶化を伴う。
以下の実施例では、数値（例えば、量、温度等）に関して正確性を確保するように努めたが、いくらかの誤差および偏差を考慮に入れるべきである。以下の実施例は、本明細書で特許請求される方法がどのようになされ、評価されるかについての完全な開示および記載を当業者に提供するように記載するものであり、本発明の純粋な例示であることを意図するものであり、本発明者らが本発明者らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
実施例１～１５の一般方法
ＤＮＡの分離、取り扱い、操作は、標準方法（ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、２０１２）を使用して実施するが、これには、制限酵素による消化、ＰＣＲ、クローニング技法、細菌細胞の形質転換が含まれる。例えば、Green, M.R., Sambrook, J., 2012. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, 4 Lab edition. ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい。
ＤＮＡの分離、取り扱い、操作は、標準方法（ＧｒｅｅｎおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、２０１２）を使用して実施するが、これには、制限酵素による消化、ＰＣＲ、クローニング技法、細菌細胞の形質転換が含まれる。例えば、Green, M.R., Sambrook, J., 2012. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, 4 Lab edition. ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい。
合成ＤＮＡは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＥ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ ベルギー）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）、Ｇｅｎｅｗｉｚ（ａ Ｂｒｏｏｋｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、またはＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの商用ベンダーから注文する。遺伝子は、実施例に記載のカスタムベクターで供給される。
培地
２ＴＹ培地は、バクトトリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、およびＮａＣｌ ５ｇ／Ｌを含有し、オートクレーブにより滅菌されている。２ＴＹ寒天は寒天１５ｇ／Ｌをさらに含有する。
２ＴＹ培地は、バクトトリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、およびＮａＣｌ ５ｇ／Ｌを含有し、オートクレーブにより滅菌されている。２ＴＹ寒天は寒天１５ｇ／Ｌをさらに含有する。
ＹＰＤ培地は酵母エキス１０ｇ／Ｌ、バクトトリプトン１０ｇ／Ｌを含有し、オートクレーブにより滅菌されている。滅菌４０％グルコース原液５０ｍｌ／Ｌを使用直前に添加する。ＹＰＤ寒天プレートは寒天１５ｇ／Ｌをさらに含有する。
ＢＭＧは、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５、ＹＮＢ １３．４ｇ／Ｌ、ビオチン０．４ｍｇ／Ｌおよび１％グリセロールを含有する。
ＢＭＭは、１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．５、ＹＮＢ １３．４ｇ／Ｌ、ビオチン０．４ｍｇ／Ｌおよび１％メタノールを含有する。
ＢＭＭＹ培地を、酵母エキス１０ｇおよびバクトトリプトン１０ｇをｄＨ２Ｏ ７００ｍｌに溶解し、オートクレーブによる滅菌によって作製する。使用直前に、ＹＮＢ原液１００ｍｌ、ビオチン原液２ｍｌおよび１００ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６．０、１００ｍｌを添加する。
ＹＮＢ原液は、硫酸アンモニウム含およびアミノ酸不含酵母ニトロゲンベース１３４ｇ／Ｌから構成され、オートクレーブにより滅菌されている。
ビオチン原液はビオチン２００ｍｇ／Ｌから構成され、０．２μｍフィルターを使用して濾過滅菌されている。
材料
制限酵素は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）またはＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から購入する。培地成分、化学薬品およびＰＣＲプライマーは、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から入手する。ゼオシンは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって供給される。
制限酵素は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）またはＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から購入する。培地成分、化学薬品およびＰＣＲプライマーは、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から入手する。ゼオシンは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）によって供給される。
ピキア・パストリス（Pichia Pastoris）の形質転換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（コマガタエッラ・ファッフィ（Komagataella phaffi）ＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０／ＡＴＣＣ ７６２７３、以下、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０１と呼ぶ）を、２５０ＲＰＭで振盪しながらＹＰＤ １０ｍｌ中で３０℃で一晩増殖させる。この培養物を使用して、ＯＤ６００ ０．１までＹＰＤ ５００ｍｌに接種し、次いで、ＯＤ６００ １．３～１．５まで２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でインキュベートする。細胞を、２０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって回収し、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０ ２０ｍｌおよび１Ｍ ＤＴＴ ２．５ｍｌを補充したＹＰＤ １００ｍｌ中に再懸濁する。細胞を振盪なしで３０℃で１５分間インキュベートする。冷ｄＨ２Ｏを最終容量５００ｍｌまで添加し、細胞を２０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって回収する。細胞を冷ｄＨ２Ｏ ２５０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって回収する。細胞を冷１Ｍソルビトール２０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって回収する。細胞を冷１Ｍソルビトール５００μｌに再懸濁する。ＤＮＡ １００ｎｇをコンピテントセル４０μｌに添加し、氷上で予冷した２ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベットに移す。細胞を、１５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ設定を使用して、ＢＴＲＸ ＥＣＭ ６３０減衰波エレクトロポレーションシステムで電気穿孔する。冷１Ｍソルビトール１ｍｌを即座に添加し、混合物を滅菌エッペンドルフチューブに移す。細胞を、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で少なくとも３０分間再生する。次いで、細胞を適当な抗生物体質を含有するＹＰＤ寒天プレート上へと塗り広げ、次いで、３０℃で２日間、またはコロニーが視認することができるまでインキュベートする。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（コマガタエッラ・ファッフィ（Komagataella phaffi）ＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０／ＡＴＣＣ ７６２７３、以下、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０１と呼ぶ）を、２５０ＲＰＭで振盪しながらＹＰＤ １０ｍｌ中で３０℃で一晩増殖させる。この培養物を使用して、ＯＤ６００ ０．１までＹＰＤ ５００ｍｌに接種し、次いで、ＯＤ６００ １．３～１．５まで２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でインキュベートする。細胞を、２０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって回収し、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０ ２０ｍｌおよび１Ｍ ＤＴＴ ２．５ｍｌを補充したＹＰＤ １００ｍｌ中に再懸濁する。細胞を振盪なしで３０℃で１５分間インキュベートする。冷ｄＨ２Ｏを最終容量５００ｍｌまで添加し、細胞を２０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって回収する。細胞を冷ｄＨ２Ｏ ２５０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって回収する。細胞を冷１Ｍソルビトール２０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって回収する。細胞を冷１Ｍソルビトール５００μｌに再懸濁する。ＤＮＡ １００ｎｇをコンピテントセル４０μｌに添加し、氷上で予冷した２ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベットに移す。細胞を、１５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ設定を使用して、ＢＴＲＸ ＥＣＭ ６３０減衰波エレクトロポレーションシステムで電気穿孔する。冷１Ｍソルビトール１ｍｌを即座に添加し、混合物を滅菌エッペンドルフチューブに移す。細胞を、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で少なくとも３０分間再生する。次いで、細胞を適当な抗生物体質を含有するＹＰＤ寒天プレート上へと塗り広げ、次いで、３０℃で２日間、またはコロニーが視認することができるまでインキュベートする。
[実施例１]
配列番号２（ＦＧＳＧ＿０４９０３）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０２を、配列番号１の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号２の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号３の配列を備えるＰ４５０レダクターゼをコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。ＡＯＸ１プロモーターはユニークＰｍｅＩ制限部位を含有し、その結果、プラスミドｐＳＡＮＤ１０２の線状化が可能となる。
配列番号２（ＦＧＳＧ＿０４９０３）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０２を、配列番号１の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号２の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号３の配列を備えるＰ４５０レダクターゼをコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。ＡＯＸ１プロモーターはユニークＰｍｅＩ制限部位を含有し、その結果、プラスミドｐＳＡＮＤ１０２の線状化が可能となる。
プラスミドｐＳＡＮＤ１０２を制限酵素ＰｍｅＩを用いて線状化する。線状プラスミドを、例えば市販のカラム精製キットを使用して反応混合物から精製する。ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０１株のエレクトロコンピテントセルを、ＰｍｅＩ線状化プラスミドｐＳＡＮＤ１０２で形質転換し、その結果、これをＡＯＸ１プロモーターにてゲノムに統合させることが可能となる。形質転換体を、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２と名付ける。
[実施例２]
配列番号５（ＦＧＳＧ＿０３１７５）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０３を、配列番号４の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号５の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号６の配列を備えるＰ４５０レダクターゼをコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。ＡＯＸ１プロモーターはユニークＰｍｅＩ制限部位を含有し、その結果、プラスミドｐＳＡＮＤ１０３の線状化が可能となる。
配列番号５（ＦＧＳＧ＿０３１７５）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０３を、配列番号４の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号５の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号６の配列を備えるＰ４５０レダクターゼをコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。ＡＯＸ１プロモーターはユニークＰｍｅＩ制限部位を含有し、その結果、プラスミドｐＳＡＮＤ１０３の線状化が可能となる。
プラスミドｐＳＡＮＤ１０３を制限酵素ＰｍｅＩを用いて線状化する。線状プラスミドを、例えば市販のカラム精製キットを使用して反応混合物から精製する。ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０１株のエレクトロコンピテントセルを、ＰｍｅＩ線状化プラスミドｐＳＡＮＤ１０３で形質転換し、その結果、これをＡＯＸ１プロモーターにてゲノムに統合させることが可能となる。形質転換体を、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０３と名付ける。
[実施例３]
配列番号８（ＦＧＳＧ＿０５３３３）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０４を、配列番号７の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号８の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号９の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
配列番号８（ＦＧＳＧ＿０５３３３）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０４を、配列番号７の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号８の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号９の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０４で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４と名付ける。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０３株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０４で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０５と名付ける。
[実施例４]
配列番号１１（ＦＧＳＧ＿０２６７２）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０５を、配列番号１０の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号１１の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号１２の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
配列番号１１（ＦＧＳＧ＿０２６７２）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０５を、配列番号１０の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号１１の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号１２の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０５で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０６と名付ける。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０３株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０５で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０７と名付ける。
[実施例５]
配列番号１４（ＦＧＳＧ＿１０６９５）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０６を、配列番号１３の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号１４の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号１５の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
配列番号１４（ＦＧＳＧ＿１０６９５）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０６を、配列番号１３の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号１４の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号１５の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０６で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０８と名付ける。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０３株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０６で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０９と名付ける。
[実施例６]
配列番号１７（Ｐ４５０ ５１（１）－ＦＧＳＧ＿０４０９２）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０７を、配列番号１６の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号１７の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号１８の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
配列番号１７（Ｐ４５０ ５１（１）－ＦＧＳＧ＿０４０９２）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０７を、配列番号１６の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号１７の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号１８の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０７で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１０と名付ける。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０３株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０７で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１１と名付ける。
[実施例７]
配列番号２０（Ｐ４５０ ５１（２）－ＦＧＳＧ＿０１０００）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０８を、配列番号１９の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号２０の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号２１の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
配列番号２０（Ｐ４５０ ５１（２）－ＦＧＳＧ＿０１０００）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０８を、配列番号１９の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号２０の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号２１の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０８で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１２と名付ける。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０３株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０８で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１３と名付ける。
[実施例８]
配列番号２３（ＦＧＲＡＭＰＨ１＿０１Ｔ０５０８９）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０９を、配列番号２２の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号２３の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号２４の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
配列番号２３（ＦＧＲＡＭＰＨ１＿０１Ｔ０５０８９）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０９を、配列番号２２の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号２３の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号２４の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０９で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１４と名付ける。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０３株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１０９で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１５と名付ける。
[実施例９]
配列番号２６（ＦＧＲＡＭＰＨ１＿０１Ｔ０９３２５）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１１０を、配列番号２５の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号２６の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号２７の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
配列番号２６（ＦＧＲＡＭＰＨ１＿０１Ｔ０９３２５）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１１０を、配列番号２５の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号２６の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号２７の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１１０で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１６と名付ける。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０３株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１１０で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１７と名付ける。
[実施例１０]
配列番号２９（ＦＧＲＡＭＰＨ１＿０１Ｔ２１２３９）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１１１を、配列番号２８の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号２９の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号３０の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
配列番号２９（ＦＧＲＡＭＰＨ１＿０１Ｔ２１２３９）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１１１を、配列番号２８の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号２９の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号３０の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１１１で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１８と名付ける。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０３株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１１１で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１９と名付ける。
[実施例１１]
配列番号３２（ＦＧＳＧ＿０２６７２Ｖ２）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１１２を、配列番号３１の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号３２の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号３３の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
配列番号３２（ＦＧＳＧ＿０２６７２Ｖ２）を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１１２を、配列番号３１の配列を備える合成ＤＮＡとして商用プロバイダから入手する。簡潔に、このプラスミドは、ＡＯＸ１プロモーター配列と、これに続く配列番号３２の配列を備える遺伝子であって、ＡＯＸ１プロモーターの制御下にあって配列番号３３の配列を備えるＰ４５０をコードする、遺伝子と、これに続くＡＯＸ１ターミネーター配列とを含有する。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１１２で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２０と名付ける。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０３株のエレクトロコンピテントセルを、プラスミドｐＳＡＮＤ１１２で形質転換し、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ寒天上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートする。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１と名付ける。
[実施例１２]
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）株のピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４～ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１におけるＰ４５０遺伝子およびＰ４５０レダクターゼ遺伝子の発現
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１０、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１１、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１２、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１３、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２０、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の各株によるウルソデオキシコール酸へのリトコール酸の変換について、標準法を使用して遺伝子発現の誘導によって試験する。かかる方法の一つでは、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ培地に、株の新鮮な単一コロニーを接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートする。２ｍＭアミノレブリン酸、ヌルセオスリシン１００μｌ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有する新鮮なＢＭＭＹ培地に、１／１０容量の一晩の培養物を接種し、ＯＤ６００ １．０に達するまで２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でインキュベートする。メタノールを最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）まで添加し、リトコール酸を最終濃度１ｍＭまで添加し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で２～３日間インキュベーションを再開する。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）株のピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４～ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１におけるＰ４５０遺伝子およびＰ４５０レダクターゼ遺伝子の発現
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１０、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１１、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１２、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１３、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２０、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の各株によるウルソデオキシコール酸へのリトコール酸の変換について、標準法を使用して遺伝子発現の誘導によって試験する。かかる方法の一つでは、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ培地に、株の新鮮な単一コロニーを接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートする。２ｍＭアミノレブリン酸、ヌルセオスリシン１００μｌ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有する新鮮なＢＭＭＹ培地に、１／１０容量の一晩の培養物を接種し、ＯＤ６００ １．０に達するまで２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でインキュベートする。メタノールを最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）まで添加し、リトコール酸を最終濃度１ｍＭまで添加し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で２～３日間インキュベーションを再開する。
ＵＤＣＡを含めて生成物を、X. Ma, and X. Cao, Bioresources and Bioprocessing volume 1, Article number: 5 (2014) and F. Tonin and I. Arends, Beilstein J Org Chem. 2018; 14: 470-483に記載のものなどの、標準法を使用してブロスから抽出する。一方法では、培養物を等容量の酢酸エチルに抽出し、酸の添加によりｐＨを４未満に調整し、酢酸エチル相を分離し、次いで溶媒を蒸発により除去し、次いで、目的のステロールをクロマトグラフィーを使用して精製する。
[実施例１３]
ＢＭＧ培地で増殖させたピキア・パストリス（Pichia pastoris）株のピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４～ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の細胞全体を使用するＬＣＡ変換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１０、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１１、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１２、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１３、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２０、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の各株によるウルソデオキシコール酸へのリトコール酸の変換について、W. Lu, J. Feng, X. Chen, et al., 2019 Appl. Environ. Microbiol. 85, e01182-19に記載のものなどの、標準法を使用して遺伝子発現の誘導によって試験する。この方法では、ＢＭＧ培地２５ｍｌに、株の新鮮な単一コロニーを接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でＯＤ６００ １０までインキュベートする。細胞を、４０００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、ＯＤ６００ １．０まで２ｍＭアミノレブレン酸を含有するＢＭＭ培地中に懸濁する。培養物を、２４時間毎のメタノール（１％ｖ／ｖ）添加とともに、２５０ＲＰＭで振盪しながら２０℃で５日間インキュベートする。
ＢＭＧ培地で増殖させたピキア・パストリス（Pichia pastoris）株のピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４～ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の細胞全体を使用するＬＣＡ変換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１０、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１１、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１２、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１３、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２０、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の各株によるウルソデオキシコール酸へのリトコール酸の変換について、W. Lu, J. Feng, X. Chen, et al., 2019 Appl. Environ. Microbiol. 85, e01182-19に記載のものなどの、標準法を使用して遺伝子発現の誘導によって試験する。この方法では、ＢＭＧ培地２５ｍｌに、株の新鮮な単一コロニーを接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でＯＤ６００ １０までインキュベートする。細胞を、４０００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、ＯＤ６００ １．０まで２ｍＭアミノレブレン酸を含有するＢＭＭ培地中に懸濁する。培養物を、２４時間毎のメタノール（１％ｖ／ｖ）添加とともに、２５０ＲＰＭで振盪しながら２０℃で５日間インキュベートする。
細胞を４０００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、２ｍＭアミノレブリン酸および１ｍＭリトコール酸を含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ７．５ ３０ｍｌに再懸濁する。細胞懸濁液を、２４時間毎のメタノール（１％ｖ／ｖ）添加とともに、２００ＲＰＭで振盪しながら３０℃で３日間インキュベートする。
ＵＤＣＡを含めて生成物を、X. Ma, and X. Cao, Bioresources and Bioprocessing volume 1, Article number: 5 (2014) and F. Tonin and I. Arends, Beilstein J Org Chem. 2018; 14: 470-483に記載のものなどの、標準法を使用してブロスから抽出する。一方法では、培養物を等容量の酢酸エチルに抽出し、酸の添加によりｐＨを４未満に調整し、酢酸エチル相を分離し、次いで溶媒を蒸発により除去し、次いで、目的のステロールをクロマトグラフィーを使用して精製する。
[実施例１４]
ＹＰＤ培地で増殖させたピキア・パストリス（Pichia pastoris）株のピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４～ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の細胞全体を使用する３－ＫＣＡ変換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１０、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１１、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１２、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１３、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２０、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の各株による、３－ケト－７－ベータ－ヒドロキシ－５－ベータ－コラン酸（３－ＫＵＤＣＡ）への、３－ケト－５－ベータ－コラン酸（３－ＫＣＡ）酸の変換について、標準法を使用して遺伝子発現の誘導によって試験する。かかる方法の一つでは、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ培地に、株の新鮮な単一コロニーを接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートする。２ｍＭアミノレブリン酸、ヌルセオスリシン１００μＬ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有する新鮮なＢＭＭＹ培地に、１／１０容量の一晩の培養物を接種し、ＯＤ６００ １．０に達するまで２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でインキュベートする。メタノールを最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）まで添加し、３－ＫＣＡを最終濃度１ｍＭまで添加し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で２～３日間インキュベーションを再開する。
ＹＰＤ培地で増殖させたピキア・パストリス（Pichia pastoris）株のピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４～ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の細胞全体を使用する３－ＫＣＡ変換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１０、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１１、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１２、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１３、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２０、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の各株による、３－ケト－７－ベータ－ヒドロキシ－５－ベータ－コラン酸（３－ＫＵＤＣＡ）への、３－ケト－５－ベータ－コラン酸（３－ＫＣＡ）酸の変換について、標準法を使用して遺伝子発現の誘導によって試験する。かかる方法の一つでは、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有するＹＰＤ培地に、株の新鮮な単一コロニーを接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートする。２ｍＭアミノレブリン酸、ヌルセオスリシン１００μＬ／ｍｌおよびゼオシン１００μｇ／ｍｌを含有する新鮮なＢＭＭＹ培地に、１／１０容量の一晩の培養物を接種し、ＯＤ６００ １．０に達するまで２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でインキュベートする。メタノールを最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）まで添加し、３－ＫＣＡを最終濃度１ｍＭまで添加し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で２～３日間インキュベーションを再開する。
３－ＫＵＤＣＡを含めて生成物を、標準法を使用してブロスから抽出する。一方法では、培養物を等容量の酢酸エチルに抽出し、酸の添加によりｐＨを４未満に調整し、酢酸エチル相を分離し、次いで溶媒を蒸発により除去し、次いで、目的のステロールをクロマトグラフィーを使用して精製する。
[実施例１５]
ＢＭＧ培地で増殖させたピキア・パストリス（Pichia pastoris）株のピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４～ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の細胞全体を使用する３－ＫＣＡ変換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１０、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１１、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１２、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１３、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２０、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の各株による３－ＫＵＤＣＡへの３－ＫＣＡの変換について、W. Lu, J. Feng, X. Chen, et al., 2019 Appl. Environ. Microbiol. 85, e01182-19に記載のものなどの標準法を使用して遺伝子発現の誘導によって試験する。この方法では、ＢＭＧ培地２５ｍｌに、株の新鮮な単一コロニーを接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でＯＤ６００ １０までインキュベートする。細胞を、４０００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、ＯＤ６００ １０まで２ｍＭアミノレブレン酸を含有するＢＭＭ培地中に懸濁する。培養物を、２４時間毎のメタノール（１％ｖ／ｖ）添加とともに、２５０ＲＰＭで振盪しながら２０℃で５日間インキュベートする。
ＢＭＧ培地で増殖させたピキア・パストリス（Pichia pastoris）株のピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４～ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の細胞全体を使用する３－ＫＣＡ変換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１０、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１１、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１２、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１３、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１４、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１５、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１６、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１７、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１８、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１１９、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２０、およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１の各株による３－ＫＵＤＣＡへの３－ＫＣＡの変換について、W. Lu, J. Feng, X. Chen, et al., 2019 Appl. Environ. Microbiol. 85, e01182-19に記載のものなどの標準法を使用して遺伝子発現の誘導によって試験する。この方法では、ＢＭＧ培地２５ｍｌに、株の新鮮な単一コロニーを接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でＯＤ６００ １０までインキュベートする。細胞を、４０００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、ＯＤ６００ １０まで２ｍＭアミノレブレン酸を含有するＢＭＭ培地中に懸濁する。培養物を、２４時間毎のメタノール（１％ｖ／ｖ）添加とともに、２５０ＲＰＭで振盪しながら２０℃で５日間インキュベートする。
細胞を４０００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、２ｍＭアミノレブリン酸および１ｍＭ ３－ＫＣＡを含有する５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ７．５ ３０ｍｌに再懸濁する。細胞懸濁液を、２４時間毎のメタノール（１％ｖ／ｖ）添加とともに、２００ＲＰＭで振盪しながら３０℃で３日間インキュベートする。
３－ＫＵＤＣＡを含めて生成物を、標準法を使用してブロスから抽出する。一方法では、培養物を等容量の酢酸エチルに抽出し、酸の添加によりｐＨを４未満に調整し、酢酸エチル相を分離し、次いで溶媒を蒸発により除去し、次いで、目的のステロールをクロマトグラフィーを使用して精製する。
実施例１６～２１の一般方法
培養抽出物の分析
実施例に記載の液体培養物の溶媒抽出に続いて、ラインカラムフィルターにＷａｔｅｒｓ ＶａｎＧｕａｒｄおよびＡｃｑｕｉｔｙを取り付け、６０℃で操作した、Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ×３．５μｍ）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣで、ＵＤＣＡおよび３－ＫＵＤＣＡの生成について試料を分析した。移動相を、流速１．０ｍＬ／分で、溶媒Ａ（０．００５Ｍ酢酸アンモニウム、０．０１２％ギ酸）および溶媒Ｂ（９５％メタノール、５％水、０．０１２％ギ酸）から構成した。９．５分かけて５０％溶媒Ｂから１００％溶媒Ｂへと勾配をランさせた。２１２ｎｍにてのＵＶによって、および質量範囲ｍ／ｚ １５０～５００でエレクトロスプレー陰イオンモードでランさせるＷａｔｅｒｓ ＺＱシングル四重極ＭＳを使用するＭＳによって、試料を分析した。
培養抽出物の分析
実施例に記載の液体培養物の溶媒抽出に続いて、ラインカラムフィルターにＷａｔｅｒｓ ＶａｎＧｕａｒｄおよびＡｃｑｕｉｔｙを取り付け、６０℃で操作した、Ｗａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ×３．５μｍ）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣで、ＵＤＣＡおよび３－ＫＵＤＣＡの生成について試料を分析した。移動相を、流速１．０ｍＬ／分で、溶媒Ａ（０．００５Ｍ酢酸アンモニウム、０．０１２％ギ酸）および溶媒Ｂ（９５％メタノール、５％水、０．０１２％ギ酸）から構成した。９．５分かけて５０％溶媒Ｂから１００％溶媒Ｂへと勾配をランさせた。２１２ｎｍにてのＵＶによって、および質量範囲ｍ／ｚ １５０～５００でエレクトロスプレー陰イオンモードでランさせるＷａｔｅｒｓ ＺＱシングル四重極ＭＳを使用するＭＳによって、試料を分析した。
培地
２ＴＹ培地は、バクトトリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、およびＮａＣｌ ５ｇ／Ｌを含有し、オートクレーブにより滅菌されている。２ＴＹ寒天は寒天１５ｇ／Ｌをさらに含有する。
２ＴＹ培地は、バクトトリプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、およびＮａＣｌ ５ｇ／Ｌを含有し、オートクレーブにより滅菌されている。２ＴＹ寒天は寒天１５ｇ／Ｌをさらに含有する。
合成デキストロース最少培地は、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース６．７ｇ／Ｌ、デキストロース２０ｇ／Ｌおよびアミノ酸ドロップアウトパウダー１．３ｇ／Ｌを含有し、オートクレーブにより滅菌されている。合成デキストロース最少寒天培地は、寒天２０ｇ／Ｌを含有する。
合成ガラクトース最少培地は、アミノ酸不含酵母ニトロゲンベース６．７ｇ／Ｌ、ガラクトース２０ｇ／Ｌおよびアミノ酸ドロップアウトパウダー１．３ｇ／Ｌを含有し、オートクレーブにより滅菌されている。合成ガラクトース最少寒天培地は、寒天２０ｇ／Ｌを含有する。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）の形質転換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（コマガタエッラ・ファッフィ（Komagataella phaffi）ＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０／ＡＴＣＣ ７６２７３、以下、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０１と呼ぶ）を、２５０ＲＰＭで振盪しながらＹＰＤ １０ｍｌ中で３０℃で一晩増殖させた。この培養物を使用して、ＯＤ６００ ０．１までＹＰＤ ５００ｍｌに接種し、次いで、ＯＤ６００ １．３～１．５まで２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でインキュベートした。細胞を、２０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって回収し、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０ ２０ｍｌおよび１Ｍ ＤＴＴ ２．５ｍｌを補充したＹＰＤ １００ｍｌ中に再懸濁した。細胞を振盪なし、３０℃で１５分間インキュベートした。冷ｄＨ２Ｏを最終容量５００ｍｌまで添加し、細胞を２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷ｄＨ２Ｏ ２５０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷１Ｍソルビトール２０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷１Ｍソルビトール５００μｌに再懸濁した。ＤＮＡ １００ｎｇをコンピテントセル４０μｌに添加し、氷上で予冷した２ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベットに移した。細胞を、１５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ設定を使用して、ＢＴＲＸ ＥＣＭ ６３０減衰波エレクトロポレーションシステムで電気穿孔した。冷１Ｍソルビトール１ｍＬを即座に添加し、混合物を滅菌エッペンドルフチューブに移した。細胞を、３０℃、２５０ＲＰＭで少なくとも３０分間振盪しながら再生した。次いで、細胞を適当な抗生物体質を含有するＹＰＤ寒天プレート上へと塗り広げ、３０℃で２日間、またはコロニーが視認することができるまでインキュベートした。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（コマガタエッラ・ファッフィ（Komagataella phaffi）ＮＲＲＬ Ｙ－１１４３０／ＡＴＣＣ ７６２７３、以下、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０１と呼ぶ）を、２５０ＲＰＭで振盪しながらＹＰＤ １０ｍｌ中で３０℃で一晩増殖させた。この培養物を使用して、ＯＤ６００ ０．１までＹＰＤ ５００ｍｌに接種し、次いで、ＯＤ６００ １．３～１．５まで２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でインキュベートした。細胞を、２０００×ｇで４℃で１０分間の遠心分離によって回収し、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０ ２０ｍｌおよび１Ｍ ＤＴＴ ２．５ｍｌを補充したＹＰＤ １００ｍｌ中に再懸濁した。細胞を振盪なし、３０℃で１５分間インキュベートした。冷ｄＨ２Ｏを最終容量５００ｍｌまで添加し、細胞を２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷ｄＨ２Ｏ ２５０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷１Ｍソルビトール２０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷１Ｍソルビトール５００μｌに再懸濁した。ＤＮＡ １００ｎｇをコンピテントセル４０μｌに添加し、氷上で予冷した２ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベットに移した。細胞を、１５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ設定を使用して、ＢＴＲＸ ＥＣＭ ６３０減衰波エレクトロポレーションシステムで電気穿孔した。冷１Ｍソルビトール１ｍＬを即座に添加し、混合物を滅菌エッペンドルフチューブに移した。細胞を、３０℃、２５０ＲＰＭで少なくとも３０分間振盪しながら再生した。次いで、細胞を適当な抗生物体質を含有するＹＰＤ寒天プレート上へと塗り広げ、３０℃で２日間、またはコロニーが視認することができるまでインキュベートした。
サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の形質転換
サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＹＰＨ４９９（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、２５０ＲＰＭで振盪しながらＹＰＤ １０ｍｌ中、３０℃で一晩増殖させた。この培養物を使用して、ＯＤ６００ ０．１までＹＰＤ ５００ｍｌに接種し、次いで、ＯＤ６００ １．３～１．５まで２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でインキュベートした。細胞を、２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収し、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０ ２０ｍｌおよび１Ｍ ＤＴＴ ２．５ｍｌを補充したＹＰＤ １００ｍｌ中に再懸濁した。細胞を振盪なし、３０℃で１５分間インキュベートした。冷ｄＨ２Ｏを最終容量５００ｍｌまで添加し、細胞を２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷ｄＨ２Ｏ ２５０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷１Ｍソルビトール２０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷１Ｍソルビトール５００μｌに再懸濁した。ＤＮＡ １００ｎｇをコンピテントセル４０μｌに添加し、氷上で予冷した２ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベットに移した。細胞を、１５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ設定を使用して、ＢＴＲＸ ＥＣＭ ６３０減衰波エレクトロポレーションシステムで電気穿孔した。冷１Ｍソルビトール１ｍＬを即座に添加し、混合物を滅菌エッペンドルフチューブに移した。細胞を、３０℃、２５０ＲＰＭで少なくとも３０分間振盪しながら再生した。次いで、細胞を、ウラシルを欠く合成デキストロース最少寒天培地上へと塗り広げ、次いで、３０℃で３日間、またはコロニーが視認することができるまでインキュベートした。
サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＹＰＨ４９９（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、２５０ＲＰＭで振盪しながらＹＰＤ １０ｍｌ中、３０℃で一晩増殖させた。この培養物を使用して、ＯＤ６００ ０．１までＹＰＤ ５００ｍｌに接種し、次いで、ＯＤ６００ １．３～１．５まで２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でインキュベートした。細胞を、２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収し、１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０ ２０ｍｌおよび１Ｍ ＤＴＴ ２．５ｍｌを補充したＹＰＤ １００ｍｌ中に再懸濁した。細胞を振盪なし、３０℃で１５分間インキュベートした。冷ｄＨ２Ｏを最終容量５００ｍｌまで添加し、細胞を２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷ｄＨ２Ｏ ２５０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷１Ｍソルビトール２０ｍｌで洗浄し、２０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって回収した。細胞を冷１Ｍソルビトール５００μｌに再懸濁した。ＤＮＡ １００ｎｇをコンピテントセル４０μｌに添加し、氷上で予冷した２ｍｍギャップのエレクトロポレーションキュベットに移した。細胞を、１５００Ｖ、２００Ω、２５μＦ設定を使用して、ＢＴＲＸ ＥＣＭ ６３０減衰波エレクトロポレーションシステムで電気穿孔した。冷１Ｍソルビトール１ｍＬを即座に添加し、混合物を滅菌エッペンドルフチューブに移した。細胞を、３０℃、２５０ＲＰＭで少なくとも３０分間振盪しながら再生した。次いで、細胞を、ウラシルを欠く合成デキストロース最少寒天培地上へと塗り広げ、次いで、３０℃で３日間、またはコロニーが視認することができるまでインキュベートした。
[実施例１６]
配列番号２および配列番号３２を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０１を以下のように構築した。プラスミドｐＰＩＣＨＯＬＩ－１（ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ）を制限酵素ＢｓａＩおよびＰｃｉＩで切断した。配列番号３４を合成ＤＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文し、インフュージョンクローニング（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）によって切断したｐＰＩＣＨＯＬＩ－１に挿入し、これ続いて標準法を使用して大腸菌（E. coli）を形質転換した。形質転換体を、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍＬを含有する２ＴＹ寒天上へとプレーティングした。ｐＳＡＮＤ１０１のコレクトアセンブリは、制限消化によって確認した。
配列番号２および配列番号３２を発現することができるピキア・パストリス（Pichia pastoris）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１０１を以下のように構築した。プラスミドｐＰＩＣＨＯＬＩ－１（ＭｏＢｉＴｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ）を制限酵素ＢｓａＩおよびＰｃｉＩで切断した。配列番号３４を合成ＤＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）として注文し、インフュージョンクローニング（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）によって切断したｐＰＩＣＨＯＬＩ－１に挿入し、これ続いて標準法を使用して大腸菌（E. coli）を形質転換した。形質転換体を、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍＬを含有する２ＴＹ寒天上へとプレーティングした。ｐＳＡＮＤ１０１のコレクトアセンブリは、制限消化によって確認した。
プラスミドｐＳＡＮＤ１０２を以下のように構築した。プラスミドｐＳＡＮＤ１０１を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断した。配列番号３５を合成ＤＮＡ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）として注文し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断した。消化した合成ＤＮＡを、標準法に従うライゲーションによって、切断したｐＳＡＮＤ１０１に挿入した。大腸菌（E. coli）形質転換体を、ヌルセオスリシン１００μｇ／ｍＬを含有する２ＴＹ寒天上へとプレーティングした。ｐＳＡＮＤ１０２のコレクトアセンブリは制限消化によって確認した。
プラスミドｐＳＡＮＤ１１２を以下のように構築した。プラスミドｐＰＩＣＨＯＬＩ－１を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断した。配列番号３６を合成ＤＮＡ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）として注文し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断した。消化した合成ＤＮＡを、標準法に従うライゲーションによって、切断したｐＰＩＣＨＯＬＩ－１に挿入した。大腸菌（E. coli）形質転換体を、ゼオシン１００μｇ／ｍＬを含有する２ＴＹ寒天上へとプレーティングした。ｐＳＡＮＤ１１２のコレクトアセンブリは制限消化によって確認した。
プラスミドｐＳＡＮＤ１０２を制限酵素ＰｍｅＩで消化することにより線状化した。線状化ｐＳＡＮＤ１０２を使用して、標準法を使用してエレクトロポレーションによってピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０１を形質転換した。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２とラベル付けした。
プラスミドｐＳＡＮＤ１１２を使用して、標準法を使用してエレクトロポレーションによってピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１０２を形質転換した。産生する株は、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１とラベル付けした。
[実施例１７]
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）Ｓａｎｄ１２１によるＵＤＣＡへのＬＣＡの生物変換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１を使用して、２５０ｍＬ三角フラスコ中でゼオシン１００μｇ／ｍＬを補充したＢＭＧ培地２５ｍＬに接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートして、種培養として使用した。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）Ｓａｎｄ１２１によるＵＤＣＡへのＬＣＡの生物変換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１を使用して、２５０ｍＬ三角フラスコ中でゼオシン１００μｇ／ｍＬを補充したＢＭＧ培地２５ｍＬに接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で２日間インキュベートして、種培養として使用した。
種培養からの細胞を遠心分離によって回収し、これを使用して、１Ｌ三角フラスコ中で２ｍＭ ５－アミノレブリン酸（５－ＡＬＡ）を含有するＢＭＭ ２５０ｍＬにＯＤ５９５ １．０まで接種し、２０℃で５日間インキュベートして、発現培養物として使用した。発現培養物を１７０ＲＰＭで１日間振盪し、次いで、残りの４日間２５０ＲＰＭで振盪した。メタノールを発現培養物に１％ｖ／ｖの濃度へと、毎日供給した。
発現培養物８０ｍＬからの細胞を遠心分離によって回収し、ｐＨ７．５にての濾過滅菌リン酸カリウム緩衝剤３０ｍＬに懸濁し、２５０ｍＬの三角フラスコに移した。発現培養物８０ｍＬからの細胞を遠心分離によって回収し、ｐＨ９にての濾過滅菌リン酸カリウム緩衝剤－３０ｍＬに懸濁し、２５０ｍＬの三角フラスコに移した。各フラスコに、５－ＡＬＡ水溶液（２００ｍＭ）０．２５ｍＬおよびＬＣＡ ３８．８ｍｇ／ｍＬを含有するメタノール０．３５ｍＬを添加した。生物変換培養物として使用する、双方のフラスコを、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃でインキュベートした。生物変換培養物にメタノール０．３５ｍＬを毎日供給し、その後、２日間インキュベーションを続けた。次いで、生物変換培養物にメタノール１．０ｍＬを供給し、その後、インキュベーションを３日間続けた。
試料５００μＬを、生物変換培養物から取り出し、０．１％ギ酸を含有する酢酸エチル等容量を用いて４５分間振盪することにより抽出した。相を遠心分離により分離し、溶媒相２０μＬをクリーンなチューブに移し、蒸発させた。ペレットをメタノール２０μＬに溶解し、５０％移動相溶液Ａと５０％移動相溶液Ｂの混合物で１０倍に希釈し、ＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した（一般方法を参照されたい）。ＵＤＣＡ標準物質を並行してランさせて見られるのと、同一の保持時間および質量スペクトルプロファイルを備えるピークが見られた（図１および図２を参照されたい）。
残りの生物変換培養ブロスを５０ｍＬのファルコンチューブに移し、ＵＤＣＡの後の単離のために－２０℃で保存した（実施例１８を参照されたい）。
[実施例１８]
ＵＤＣＡの単離およびオーセンティック標準物質との比較
実施例１７に記載の－２０℃で保存した生物変換培養ブロスを解凍し、４５００ＲＰＭで１５分間遠心分離した。産生する上清１００ｍＬをデカントし、４５分間撹拌しながら０．１％ギ酸を含有する酢酸エチル等容量で３回抽出した。有機相をプールし、真空下で蒸発させて、重さ１７９ｍｇの粗生成物を得た。
ＵＤＣＡの単離およびオーセンティック標準物質との比較
実施例１７に記載の－２０℃で保存した生物変換培養ブロスを解凍し、４５００ＲＰＭで１５分間遠心分離した。産生する上清１００ｍＬをデカントし、４５分間撹拌しながら０．１％ギ酸を含有する酢酸エチル等容量で３回抽出した。有機相をプールし、真空下で蒸発させて、重さ１７９ｍｇの粗生成物を得た。
粗生成物を酢酸エチル８０ｍＬに溶解し、真空中で溶媒を除去することによってシリカゲル（メルクグレード９３８５、２００～４００メッシュ粒径）１．５ｇ上へとドライローディングを行った。乾燥したシリカを、２５ｇのＢｉｏｔａｇｅＫＰ－Ｓｉｌ Ｓｎａｐカートリッジ（Ｂｉｏｔａｇｅ）のプレパックシリカの上部に注いだ。カラムを、１０カラム容量にわたって１０％酢酸エチル～１００％酢酸エチルの酢酸エチル－ヘキサン勾配で溶出した。画分を収集し、ＬＣＭＳによってアッセイした。選択した画分を合わせ、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させ、重さ１１．３ｍｇの抽出物を得た。
次いで、この抽出物をアセトニトリル（０．３ｍＬ）およびＤＭＳＯ（０．７ｍＬ）に溶解し、２５％アセトニトリルと７５％水の混合物で予め平衡化した１２ｇのＳｎａｐ Ｕｌｔｒａカートリッジ（Ｂｉｏｔａｇｅ）上へと注入した。カラムを、１０カラム容量にわたって２５％アセトニトリル～８０％アセトニトリルのアセトニトリル－水勾配で溶出した。画分を収集し、次いでＬＣ－ＭＳによってアッセイした。選択した画分をプールし、ＬＣＭＳ（図３および図４を参照されたい）によって分析し、次いで凍結乾燥して重さ３．８ｍｇの白色粉末を得た。
この試料のｄ４－メタノール中でのＮＭＲ分光法を行い、同時にランさせたＵＤＣＡの市販入手試料（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と比較した。ＮＭＲスペクトルは、それぞれ１Ｈおよび１３Ｃについて５００．０５ＭＨｚおよび１２５．７５ＭＨｚで操作して２９８ＫにてのＢｒｕｋｅｒ ５００ＭＨｚ ＤＣＨ Ｃｒｙｏｐｒｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒで記録した。ＵＤＣＡ市販標準物質のＮＭＲスペクトルは、試料ＮＭＲスペクトルと一致した（図５、図６、図７、および図８を参照されたい）。
[実施例１９]
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）Ｓａｎｄ１２１による３－ＫＵＤＣＡへの３－ＫＣＡの生物変換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１を使用して、２５０ｍＬ三角フラスコ中でヌルセオスリシン１００μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬのゼオシンを補充したＢＭＧ培地２５ｍＬに接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で３日間インキュベートした。５－ＡＬＡ水溶液（２００ｍＭ）０．２５ｍＬおよび３－ケトリトコール酸（３－ＫＣＡ）３７．６ｍｇ／ｍＬを含有するメタノール０．２５ｍＬを培養物に添加し、次いで、以前と同様に１日間インキュベーションを続けた。メタノール０．２５ｍＬを培養物に添加し、次いで、以前と同様に１日間インキュベーションを続けた。ブロス８００μＬを培養物から取り出し、０．１％ギ酸を含有する酢酸エチル等容量で４５分間振盪することにより抽出した。相を遠心分離により分離し、溶媒相４００μＬをクリーンなチューブに移し、蒸発させた。ペレットを１０分間混合することによってメタノール４００μＬに溶解し、１２０００×ｇで１分間遠心分離した。メタノール溶液１５μＬ、５０％移動相溶液Ａと５０％移動相溶液Ｂの混合物で１０倍に希釈し、ＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した（一般方法を参照されたい）。３－ＫＵＤＣＡ標準物質を並行してランさせて見られるのと、同一の保持時間および質量スペクトルプロファイルを備えるピークが見られた（図９および図１０を参照されたい）。
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）Ｓａｎｄ１２１による３－ＫＵＤＣＡへの３－ＫＣＡの生物変換
ピキア・パストリス（Pichia pastoris）ＳＡＮＤ１２１を使用して、２５０ｍＬ三角フラスコ中でヌルセオスリシン１００μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬのゼオシンを補充したＢＭＧ培地２５ｍＬに接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で３日間インキュベートした。５－ＡＬＡ水溶液（２００ｍＭ）０．２５ｍＬおよび３－ケトリトコール酸（３－ＫＣＡ）３７．６ｍｇ／ｍＬを含有するメタノール０．２５ｍＬを培養物に添加し、次いで、以前と同様に１日間インキュベーションを続けた。メタノール０．２５ｍＬを培養物に添加し、次いで、以前と同様に１日間インキュベーションを続けた。ブロス８００μＬを培養物から取り出し、０．１％ギ酸を含有する酢酸エチル等容量で４５分間振盪することにより抽出した。相を遠心分離により分離し、溶媒相４００μＬをクリーンなチューブに移し、蒸発させた。ペレットを１０分間混合することによってメタノール４００μＬに溶解し、１２０００×ｇで１分間遠心分離した。メタノール溶液１５μＬ、５０％移動相溶液Ａと５０％移動相溶液Ｂの混合物で１０倍に希釈し、ＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した（一般方法を参照されたい）。３－ＫＵＤＣＡ標準物質を並行してランさせて見られるのと、同一の保持時間および質量スペクトルプロファイルを備えるピークが見られた（図９および図１０を参照されたい）。
[実施例２０]
配列番号２および配列番号３２を発現することができるサッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１１３を、これは、Ｇａｌ１プロモーターの制御下にあって配列番号３３の配列を備えるＰ４５０をコードする遺伝子と、Ｇａｌ１０プロモーターの制御下にあって配列番号３の配列を備えるＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子とを発現するが、以下のように構築した。
配列番号２および配列番号３２を発現することができるサッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）株の構築
プラスミドｐＳＡＮＤ１１３を、これは、Ｇａｌ１プロモーターの制御下にあって配列番号３３の配列を備えるＰ４５０をコードする遺伝子と、Ｇａｌ１０プロモーターの制御下にあって配列番号３の配列を備えるＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子とを発現するが、以下のように構築した。
プラスミドｐＥＳＣ－ＵＲＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで切断した。８３７ｂｐの断片を、配列番号３７および配列番号３８のプライマーを使用してプラスミドｐＳＡＮＤ１０２から増幅した。この８３７ｂｐ断片を、ＳＬｉＣＥクローニング法（Ｚｈａｎｇら、２０１４）を使用してＥｃｏＲＩ－ＳｐｅＩで消化したｐＥＳＣ－ＵＲＡに挿入し、中間体プラスミドを形成した。インサートの挿入および同一性は制限消化によって確認した。
中間体プラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断した。１５８４ｂｐの断片を、配列番号３９および配列番号４０のプライマーを使用してプラスミドｐＳＡＮＤ１１２から増幅した。この１５８４ｂｐ断片を、ＳＬｉＣＥクローニング法（Ｚｈａｎｇら、２０１４）を使用してＨｉｎｄＩＩＩ－ＳａｌＩで消化した中間体プラスミドに挿入し、プラスミドｐＳＡＮＤ１１３を形成した。インサートの挿入および同一性は制限消化によって確認した。
サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＹＰＨ４９９株（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、標準法を使用して、エレクトロポレーションによってプラスミドｐＳＡＮＤ１１３で形質転換し、その後、細胞懸濁液をウラシルを欠く合成デキストロース最少寒天培地上へとプレーティングし、コロニーが視認することができるまで３０℃でインキュベートした。産生する株をサッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＳＡＮＤ１２２と名付けた。
[実施例２１]
サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＳＡＮＤ１２２によるＵＤＣＡへのＬＣＡの生物変換
５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブ中、ウラシルを欠く合成デキストロース最少培地７ｍＬに、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＳＡＮＤ１２２を接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で２４時間インキュベートして、種培養として使用した。
サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＳＡＮＤ１２２によるＵＤＣＡへのＬＣＡの生物変換
５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎチューブ中、ウラシルを欠く合成デキストロース最少培地７ｍＬに、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＳＡＮＤ１２２を接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で２４時間インキュベートして、種培養として使用した。
種培養１ｍＬを手短に遠心分離して細胞を収集した。上清を廃棄し、残留する細胞ペレットを、発泡栓でキャップした５０ｍＬファルコンチューブ中、ウラシルを欠く合成ガラクトース最少培地５ｍＬに懸濁した。この培養物を、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で２４時間インキュベートして、発現培養物として使用した。
発現培養物４ｍＬを手短に遠心分離して細胞を収集した。上清を廃棄し、残留する細胞ペレットを、発泡栓でキャップした５０ｍＬファルコンチューブ中、生物変換緩衝剤（ｐＨ１０にての０．１Ｍリン酸カリウム緩衝剤、１％ガラクトースおよびＬＣＡ ６５０ｍｇ／Ｌ）５ｍＬに懸濁した。この懸濁液を、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で７２時間インキュベートして、生物変換培養物として使用した。
試料５００μＬを、生物変換培養物から取り出し、０．１％ギ酸を含有する酢酸エチル等容量を用いて４５分間振盪することにより抽出した。相を遠心分離により分離し、溶媒相２０μＬをクリーンなチューブに移し、蒸発させた。ペレットをメタノール２０μＬに溶解し、５０％移動相溶液Ａと５０％移動相溶液Ｂの混合物で１０倍に希釈し、ＨＰＬＣ－ＭＳによって分析した（一般方法を参照されたい）。ＵＤＣＡ標準物質を並行してランさせて見られるのと、同一の保持時間および質量スペクトルプロファイルを備えるピークが見られた（図１１および図１２を参照されたい）。
参考文献
Zhang, Y., Werling, U., Ederlmann, W. (2014). Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE) Cloning Method. Methods in Molecular Biology 1116, 235-244.
Zhang, Y., Werling, U., Ederlmann, W. (2014). Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE) Cloning Method. Methods in Molecular Biology 1116, 235-244.
本出願の全体にわたって、さまざまな刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、それらの全体が、本発明が関係する当技術分野の状態についてより詳しく記載するために、参照により本出願にここに組み込まれる。本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、本発明において種々の改変および変形がなされ得ることは、当業者であれば明らかであろう。本発明の他の実施形態は、本明細書を考慮し、本明細書中に開示された本発明を実施することから当業者であれば明らかであろう。本明細書および実施例は、単なる例示として考慮されるべきであり、本発明の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲の記載により指示されることが意図されている。
Claims (35)
- ＬＣＡもしくは３－ＫＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、ＵＤＣＡもしくは３－ＫＵＤＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩に変換する方法であって、
酵母、またはその抽出物もしくは溶解物の存在下で、前記ＬＣＡもしくは３－ＫＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、７β－ヒドロキシラーゼ系と接触させることを含み、
前記７β－ヒドロキシラーゼ系は前記酵母に対してネイティブではない、
方法。 - 前記酵母が、サッカロミケス属（Saccharomyces）およびピキア属（Pichia）から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記酵母が、サッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびピキア・パストリス（Pichia pastoris）から選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記酵母、またはその抽出物もしくは溶解物が、生物体にとって外来性である７β－ヒドロキシラーゼ系によって形質転換されている、請求項１に記載の方法。
- 前記７β－ヒドロキシル化系が、Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（「ＣＰＲ」）酵素およびＰ４５０ ７－ベータ－ヒドロキシラーゼ（「ＣＹＰ」）酵素を含み、前記ＣＹＰ酵素が前記酵母に対してネイティブではなく、前記ＣＰＲ酵素は前記酵母に対してネイティブであってもネイティブでなくてもよい、請求項４に記載の方法。
- 前記ＣＹＰ酵素が、配列番号８；配列番号１１；配列番号１４；配列番号１７；配列番号２０；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２９；および配列番号３２から選択されるＣＹＰコード核酸配列；または
前述の核酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
によってコードされる、請求項５に記載の方法。 - 前記ＣＰＲ酵素は、配列番号２および配列番号５から選択されるＣＹＰコード核酸配列；または
前述の核酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
によってコードされる、請求項５または６に記載の方法。 - 前記ＣＹＰ酵素が、配列番号９；配列番号１２；配列番号１５；配列番号１８；配列番号２１；配列番号２４；配列番号２７；配列番号３０；もしくは配列番号３３から選択されるＣＹＰアミノ酸配列；または
前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項５に記載の方法。 - 前記ＣＰＲ酵素が、配列番号３および配列番号６から選択されるＣＰＲアミノ酸配列、または
前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項５または８に記載の方法。 - 前記７β－ヒドロキシラーゼ系が、Ｆ．グラミネアラム（F. graminearum）またはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）、好ましくはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＰＨ１またはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＶＫＭ２６００、最も好ましくはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＶＫＭ２６００に対してネイティブのＰ４５０ ７－ベータ－ヒドロキシラーゼ（「ＣＹＰ」）酵素を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ＬＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を前記７β－ヒドロキシラーゼ系と接触させて、ＵＤＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を産生することを含む、請求項８に記載の方法。
- 前記３－ＫＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を前記７β－ヒドロキシラーゼ系と接触させて、３－ＫＵＤＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を産生することを含む、請求項８に記載の方法。
- 前記３－ＫＵＤＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、ＵＤＣＡまたはそのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩に還元することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
- 前記ＵＤＣＡもしくは３－ＫＵＤＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩を、前記７β－ヒドロキシラーゼ系から単離することをさらに含む、請求項１１、１２、または１３に記載の方法。
- 前記ＵＤＣＡもしくは３－ＫＵＤＣＡ、またはこれらのカルボン酸エステル、カルボキシルアミドもしくはカルボキシレート塩が、実質的に純粋なジアステレオ異性体として産生される、請求項１１、１２、または１３に記載の方法。
- 約１５℃～約７５℃の温度で実施される、請求項１１、１２、または１３に記載の方法。
- 約ｐＨ５～約ｐＨ９のｐＨで実施される、請求項１１、１２、または１３に記載の方法。
- 前記ＬＣＡまたは３－ＫＣＡと前記７β－ヒドロキシラーゼ系との重量比が約１０：１～２００：１である、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
- 配列番号８；配列番号１１；配列番号１４；配列番号１７；配列番号２０；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２９；もしくは配列番号３２から選択される核酸配列；または
前述の配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
を含む、プラスミド。 - 配列番号８；配列番号１１；配列番号１４；配列番号１７；および配列番号２０から選択される核酸配列；または
前述の配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
を含む、請求項１９に記載のプラスミド。 - 配列番号２３；配列番号２６；もしくは配列番号２９から選択される核酸配列；または
前述の配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
を含む、請求項１９に記載のプラスミド。 - 配列番号３２の核酸配列；または
配列番号３２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
を含む、請求項１９に記載のプラスミド。 - ＡＯＸ１プロモーターおよびＡＯＸ１ターミネーター配列の制御下にある、請求項１９から２２のいずれかに記載のプラスミド。
- 配列番号８；配列番号１１；配列番号１４；配列番号１７；配列番号２０；配列番号２３；配列番号２６；配列番号２９；および配列番号３２から選択されるＣＹＰコード核酸配列；または
前述の核酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
によって形質転換された、生物体。 - 配列番号８；配列番号１１；配列番号１４；配列番号１７；および配列番号２０から選択されるＣＹＰコード核酸配列；または
前述の核酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
によって形質転換された、請求項２４に記載の生物体。 - 配列番号２３；配列番号２６；および配列番号２９から選択されるＣＹＰコード核酸配列；または
前述の核酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
によって形質転換された、請求項２４に記載の生物体。 - 配列番号３２のＣＹＰコード核酸配列；または
配列番号３２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
によって形質転換された、請求項２４に記載の生物体。 - 配列番号２もしくは配列番号５を含むＣＰＲコード核酸配列、または
前述の核酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有する核酸配列
によってさらに形質転換された、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の生物体。 - 酵母、好ましくはサッカロミケス属（Saccharomyces）またはピキア属（Pichia）、より好ましくはサッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の生物体。
- （ｉ）ＬＣＡまたは３－ＫＣＡ、（ｉｉ）酵母、またはその抽出物もしくは溶解物、（ｉｉｉ）７β－ヒドロキシル化系を含む、反応混合物。
- 前記７β－ヒドロキシル化系が、Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（「ＣＰＲ」）酵素およびＰ４５０ ７β－ヒドロキシラーゼ（「ＣＹＰ」）酵素を含み、
前記ＣＹＰ酵素が、配列番号９；配列番号１２；配列番号１５；配列番号１８；配列番号２１；配列番号２４；配列番号２７；配列番号３０；および配列番号３３から選択されるのアミノ酸配列；または、前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項３０に記載の反応混合物。 - 前記ＣＰＲ酵素が、配列番号３および配列番号６から選択されるアミノ酸配列、または
前述のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項３０または３１に記載の反応混合物。 - 前記酵母が、サッカロミケス属（Saccharomyces）またはピキア属（Pichia）、より好ましくはサッカロミケス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項３０または３１に記載の反応混合物。
- 酵母と、Ｐ４５０オキシドレダクターゼ（「ＣＰＲ」）酵素およびＰ４５０ ７β－ヒドロキシラーゼ（「ＣＹＰ」）酵素を含む７β－ヒドロキシル化系とを含む反応混合物であって、
前記ＣＹＰ酵素が、ジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）、好ましくはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＰＨ１またはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＶＫＭ２６００、最も好ましくはジベレラ・ゼアエ（Gibberella zeae）ＶＫＭ２６００に対してネイティブの酵素である、
反応混合物。 - ＬＣＡまたは３－ＫＣＡをさらに含む、請求項３４に記載の反応混合物。
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