WO2017170300A1 - 老化を反映するミトコンドリアバイオマーカー - Google Patents

老化を反映するミトコンドリアバイオマーカー Download PDF

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WO2017170300A1
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taurine
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mitochondrial
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芳秀 砂田
裕 大澤
伸一郎 西松
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Definitions

  • the present invention relates to a mitochondrial biomarker that reflects aging, and relates to the field of visualizing aging and providing an index of healthy life expectancy.
  • Mitochondria are intracellular organelles responsible for aerobic metabolism of somatic cells, and produce ATP as energy by hydrogen transmission system and oxidative phosphorylation. This mitochondrial function is thought to be impaired not only by mitochondrial diseases caused by mutations in mitochondrial DNA, which has a replication mechanism independent of the genome, but also by aging. Therefore, early diagnosis of mitochondrial dysfunction and evaluation of the degree of disability not only play an important role in the selection of treatment policy and prognosis determination of patients with mitochondrial disease, but are also attracting attention as aging markers.
  • MELAS is the most common mitochondrial disease and exhibits various and characteristic symptoms such as Myopathy, Encephalopathy, Lactic acidosis and Stroke-like episodes. Life expectancy from diagnosis is 5 to 10 years. It is a refractory rare disease with no indications. Since stroke-like seizures progress repeatedly, anticipation of recurrence as soon as possible is awaited. MELAS is caused by a single base substitution (A3243G, T3271C, G3244A, T3258C, T3291C) of the tRNA Leu (UUR) gene coding region of mitochondrial DNA, but its basic pathology has long been unknown. Ota et al.
  • Non-patent Document 1 MELAS mutant tRNA Leu
  • Non-Patent Document 3 A review on the role of tRNA modification in human diseases has been published (Non-Patent Document 3), and a measurement method on lack of taurine modification of mitochondrial tRNA in human mitochondrial disease (Non-Patent Document 4) and a review have also been published (Non-Patent Document 5). ). In addition, several patent applications have been filed for diagnosis or treatment focusing on mitochondrial tRNA. 1) A method for diagnosing type 2 diabetes by measuring the chemical modification of tRNA including mitochondrial tRNA, specifically, the thiomethyl modification rate of tRNA encoding lysine is known (Patent Document 1).
  • Patent Document 2 A method for improving the health of elderly animals by preventing or repairing changes in metabolism accompanying aging, particularly changes associated with mitochondrial dysfunction is known (Patent Document 2).
  • Glutathione is a major intracellular antioxidant system that prevents oxidative damage of mitochondrial DNA (mtDNA), but with the aging of glutathione itself, the oxidation of glutathione itself progresses and its antioxidant function decreases.
  • oxidative damage of mtDNA can be prevented by supplying a thiol compound such as taurine.
  • taurine a thiol compound
  • Patent Document 3 A therapeutic agent for mitochondrial disease containing taurine, taurine chloramine, or taurine precursor as an active ingredient is known (Patent Document 3).
  • UUR normal mitochondrial tRNA Leu
  • the first object of the present invention is to provide a novel biomarker that leads to early detection of mitochondrial dysfunction and evaluation of the degree of damage associated with aging.
  • a second object of the present invention is to provide an agent for reducing the rate of taurine modification of mitochondrial tRNA Leu (UUR) accompanying aging, which causes a decrease in the function of mycotondoria.
  • UUR mitochondrial tRNA Leu
  • lactic acid levels in blood and cerebrospinal fluid which have been used clinically as markers for mitochondrial diseases, and the ratio of lactic acid levels to pyruvate levels are not only increased due to the pathological conditions in which anaerobic metabolism is increased in mitochondrial diseases. It is a low-specificity marker that is elevated by various conditions such as increased glycolytic metabolism due to hypoxia, ie, shock, respiratory failure, disseminated intravascular coagulation syndrome (Kraut JA, Madias NE. Lactic acidosis. N Engl J Med. 2015; 372 (11): 1078-1079).
  • the present inventors measured the taurine modification rate of mitochondrial tRNA Leu (UUR) in leukocyte specimens of subjects and intensively studied its usefulness as a marker for mitochondrial disease. Specifically, not only decreased taurine modification rate of mutant mitochondrial tRNA Leu (UUR) in patients with mitochondrial disease, but also decreased taurine modification rate of normal mitochondrial tRNA Leu (UUR).
  • the inventors have found that the taurine modification rate of mitochondrial tRNA Leu (UUR) can be an indicator of aging, and have conceived that it can be applied not only to patients with mitochondrial diseases but also to healthy individuals, and have completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • a method for measuring the aging of a subject comprising measuring the degree of taurine modification of mitochondrial tRNA Leu (UUR) in a biological sample isolated from the subject by a reverse transcription reaction from a primer using the tRNA Leu (UUR) as a template. Measuring method.
  • the primer is an oligonucleotide having a length of 10 to 25 bases complementary to the template, and a difference in the primer extension product due to the presence or absence of taurine modification is detected.
  • the primer comprises at least one base sequence selected from the group consisting of the base sequences represented by SEQ ID NOs: 3, 4, and 5.
  • U represents the amount of primer extension product from the tRNA Leu (UUR) with taurine modification
  • U is indicative of the amount of primer extension product from no taurine-modified tRNA Leu (UUR)
  • the method according to any one of [1] to [4], wherein the total taurine modification rate represented is used as an index of aging.
  • the subject is suspected of having a mutated mitochondrial DNA having a single base substitution selected from the group consisting of A3243G, T3271C, G3244A, T3258C and T3291C of the tRNA Leu (UUR) gene coding region, Following 1), the following formula (2):
  • the mtDNA point mutation rate is represented by the A-position at position 14 (A3243G), the G-position at position 15 (G3244A), the T-position at position 29 (DNA ) encoding tRNA Leu (UUR) represented by SEQ ID NO: 1 Normal taurine modification rate determined by T3258C), T at position 42 (T3271C) and T point at position 62 (showing the highest point mutation rate among point mutations selected from the group consisting of T3291C) as an index of aging The method according to [5]. [7] An agent for determining aging, comprising a primer comprising a base sequence consisting of 10 to 25 bases complementary to mitochondrial tRNA Leu (UUR) .
  • the mtDNA point mutation rate is represented by the A-position at position 14 (A3243G), the G-position at position 15 (G3244A), the T-position at position 29 (DNA ) encoding tRNA Leu (UUR) represented by SEQ ID NO: 1 T3258C), showing the highest rate of point mutation among point mutations selected from the group consisting of T at position 42 (T3271C) and T at position 62 (T3291C)).
  • the improver according to [11] or [12] which is a medicine or cosmetic.
  • the improver according to [11] or [12] which is a health functional food or food additive.
  • the taurine modification rate of normal tRNA Leu is a conventional mitochondrial disease marker, the ratio of blood lactate level, blood lactate level and pyruvate level, Cerebrospinal fluid lactic acid levels, cerebrospinal fluid lactic acid levels, and pyruvate levels were found to be correlated with aging. Therefore, the taurine modification rate of normal tRNA Leu (UUR) is a universal marker that can grasp the state of physiological functions of healthy individuals as well as patients with mitochondrial diseases.
  • aging means that the biological function is lowered due to the influence of aging or other internal or external factors such as genetic factors and life / environmental factors. Aging is the physical passage of time from birth to death and is synonymous with calendar age. Other internal factors include those related to cellular senescence such as mitochondrial function, peroxide radical concentration, and telomere length. Other external factors include, for example, individual exercise amount, the presence or absence of smoking, dietary habits, and nutritional status. Examples of biological functions include muscle strength, nerve conduction velocity, vital capacity, and resistance to disease. Aging by aging generally begins after reaching the reproductive age, and there are individual differences, but in humans it begins after 20 to 30 years of age.
  • Aging is thought to involve environmental factors and genetic predispositions that are intricately intertwined, and the speed of such functional decline is not the same for all humans, and it cannot always be defined only by factors such as aging. Previously there was no clear aging indicator.
  • the index of aging provided by the present invention can also be used from the viewpoint of healthy life expectancy. “Aging” of the present invention refers to physical functions associated with so-called aging such as a decrease in height and weight, external changes such as changes in skin and hair, a decrease in motor function, a decrease in sensory function, or a decrease in physiological function.
  • aging of the cells that make up the body (cell aging), as well as the aging of mitochondria that perform important functions in respiration and energy metabolism are included.
  • UUR mitochondrial tRNA Leu
  • the taurine modification rate of normal mitochondrial tRNA Leu can be used as an indicator of mitochondrial aging and functional decline, but it can be used as a living body, organ (organ), tissue, cell, or It is also useful as an indicator of the function of intracellular organelles, in particular, the aging and functional deterioration of organs, tissues, cells, or organelles with high demand for living organisms and energy.
  • the above index is useful for selecting a target for taurine therapy for patients with mitochondrial diseases currently under development, for companion diagnosis used for determining the therapeutic effect, and for assisting it.
  • healthy life expectancy is defined by the Ministry of Health, Labor and Welfare as the period during which people can live without being restricted due to health problems.
  • Each country, including the World Health Organization, aims to increase the healthy life expectancy.
  • mitochondrial tRNA Leu is a tRNA that is transcribed from mitochondrial DNA and recognizes the leucine codon UUR (R is A or G).
  • Mitochondrial tRNA Leu defines the positions of nucleotides (UAA) corresponding to anticodons as positions 34 to 36, since the bases at positions 17, 20, and 47 increase or decrease depending on the animal species.
  • DNA encoding human mitochondrial tRNA Leu (UUR) has been registered with NCBI and published under GenBank accession number AB026838 (version AB026838.1) (SEQ ID NO: 1).
  • the mitochondrial tRNA Leu (UUR) transcribed from the DNA published in SEQ ID NO: 1 is represented by SEQ ID NO: 2.
  • the uridine (U) at position 36 of SEQ ID NO: 2 may or may not be taurine-modified.
  • mitochondrial tRNA Leu (UUR) may be simply abbreviated as “tRNA Leu (UUR) ”.
  • mutant tRNA Leu are the DNA encoding tRNA Leu (UUR) represented by SEQ ID NO: 1, A at position 14 (A3243G), G at position 15 (G3244A), T at position 29 (T ( T3258C), T mutation at position 42 (T3271C), point mutation at position T (T3291C): these mutations result in a lack of taurine modification and are mutations found in MELAS patients; G at position 13 (A3242A), 21-position T (T3250C), 25-position C (C3254T), 51-position A (A3280G) point mutations: These mutations have no effect on taurine modification and are found in mitochondrial diseases other than MELAS And the like; For other mutations, reference can be made to MITOMAP (www.mitomap.org/MITOMAP).
  • the mutant tRNA Leu (UUR) in the present invention means the transferred tRNA Leu (UUR) from mtDNA with mutations that cause loss of taurine-modified, free of tRNA Leu (UUR) with mutations that do not affect the taurine-modified Make it not exist.
  • the normal tRNA Leu (UUR) refers to the tRNA Leu (UUR) except for the above-mentioned mutant tRNA Leu (UUR).
  • tRNA Leu of SEQ ID NO: 2 tRNA having tRNA Leu (UUR) and different base sequence represented by tRNA Leu (UUR) and SEQ ID NO: 2 having the same base sequence (UUR) Leu ( even UUR), but differences in the base sequences include tRNA Leu (UUR) that does not affect the taurine modification tRNA Leu (UUR), the function of the normal tRNA Leu or without taurine-modified (UUR) Does not include items that do not have
  • the 14th A, the 15th G, the 29th T, the 42nd T and the 62nd T are conserved in gorillas, cattle, pigs, dogs, cats, etc. in addition to humans.
  • the mutation that causes the lack of taurine modification of tRNA Leu is not limited to humans, and will be described later. Mammals such as primates, pets, farm animals and laboratory animals can also be targeted.
  • taurine modification of mitochondrial tRNA Leu means that a taurinomethyl group is bound to the 5th position of the uracil base of the first letter of the anticodon (UAA) of tRNA Leu (UUR) (the wobble position at position 34 according to the above definition).
  • taurine-modified uridine may be indicated by the abbreviation ⁇ m 5 U.
  • mtDNA mitochondrial DNA
  • heteroplasmy a state composed of a single mtDNA
  • heteroplasmy a state in which normal and mutant mtDNA are mixed
  • the degree of heteroplasmy varies from tissue to tissue such as skeletal muscle, blood vessels, and skin, or from cell to cell.
  • the degree of taurine modification of mitochondrial tRNA Leu is defined as follows, and subjects who have substantially normal mtDNA (healthy subjects) and subjects who contain mutant mtDNA at a certain ratio The taurine modification rate of tRNA Leu (UUR) is measured separately from (eg, MELAS patient, diabetic patient).
  • the total taurine modification ratio in the present invention the taurine-modified in mitochondria tRNA Leu (UUR) in a specimen from a subject tRNA Leu (UUR), taurine-modified tRNA Leu with (UUR) and taurine unmodified tRNA Leu (UUR) The value divided by the sum.
  • test subject is a mammal including a human
  • mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, and laboratory animals such as rabbits, pigs, cows, goats, horses
  • livestock such as sheep and mink
  • pets such as dogs and cats
  • primates such as humans, monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, chimpanzees, and gorillas.
  • the subject-derived specimen is not particularly limited as long as it can be collected from a mammal, preferably a human, body fluid sample such as blood, lymph, urine, hair, buccal mucosa, stomach, large intestine, lung, Biopsy tissues such as liver and brain can be mentioned.
  • a blood sample is preferred, and white blood cells in the blood sample are more preferred.
  • Total taurine modification rate is determined indirectly by measuring the amount of taurine-modified tRNA Leu (UUR) and non-taurine-modified tRNA Leu (UUR ) by measuring the amount of primer extension product by primer-based reverse transcription (primer extension method).
  • UUR taurine-modified tRNA Leu
  • UUR non-taurine-modified tRNA Leu
  • U is tRNA Leu with a taurine-modified (indicates the amount of primer extension product from UUR), U indicates the amount of primer extension product from no taurine-modified tRNA Leu (UUR)) The value calculated by substituting for.
  • the mtDNA point mutation rate (%) is the 14th position A (A3243G), 15th position G (G3244A), 29th position in the DNA encoding tRNA Leu (UUR) represented by SEQ ID NO: 1.
  • T (T3258C), 42 position T (T3271C) and 62 position T (T3291C) are used to determine the normal taurine modification rate. It is desirable to use as an index of aging.
  • DNA sequencing method For the analysis of mtDNA point mutation rate, DNA sequencing method, PCR-RFLP method, PCR-SSCP method, denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) method, BiPlex Invader method, SnaP shot method, high-resolution melt (HRM)
  • TTGE temporal temperature gradient gel electrophoresis
  • the total taurine modification rate is theoretically in the range of 0-100%. However, considering the pathology of MELAS patients, if the total taurine modification rate decreases, serious symptoms may develop. On the other hand, the normal taurine modification rate is almost the same as the total taurine modification rate when calculated using the formula [6] because the mtDNA point mutation rate is approximately 0% in healthy individuals. However, the normal taurine modification rate in patients with mitochondrial disease can be calculated to exceed 1OO% due to the mtDNA point mutation rate.
  • the normal taurine modification rate of tRNA Leu (UUR) was plotted on the vertical axis and the subject age was plotted on the horizontal axis, and it was found that the normal taurine modification rate decreased as the subject age increased ( Figure 2). It was also revealed that oral taurine modification in MELAS patients recovered the normal taurine modification rate and improved the taurine modification of tRNA Leu (UUR) derived from mutant mtDNA (FIG. 7, Table 1). Administration of an effective amount of taurine can be expected to delay the progression of aging. It can be judged that aging is progressing, so that the normal taurine modification rate is low. That is, using the normal taurine modification rate, the scale of aging can be indicated as “taurine age”. Moreover, in healthy individuals, the total taurine modification rate and the normal taurine modification rate are close to each other. For convenience, the total taurine modification rate can be used to indicate the scale of aging as “taurine age”.
  • Measurement method of aging A step of measuring the degree of taurine modification of mitochondrial tRNA Leu (UUR) in a biological sample isolated from a subject by reverse transcription reaction from a primer using the tRNA Leu (UUR) as a template
  • biological samples include, but are not limited to, biopsy tissues such as hair, buccal mucosa, stomach, large intestine, lung, liver and brain, and body fluid samples such as blood, lymph and urine. Blood is preferable from the viewpoint of easy collection, and white blood cells obtained from blood are more preferable.
  • a method for measuring aging will be described using white blood cells as an example, but other biological samples can be measured in the same manner.
  • White blood cells to be used for measurement can be obtained by collecting blood from a subject and collecting the white blood cell fraction by a conventional method.
  • Commercially available reagents can be suitably used for this purpose.
  • Commercially available reagents include Lymphoprep (registered trademark), Ficoll (registered trademark) -Paque, and the like.
  • the leukocyte fraction is obtained by performing density gradient centrifugation according to the instructions of the reagent manufacturer and separating the blood cell layer (peripheral blood mononuclear cells: PBMC) containing lymphocytes and monocytes.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the subject is typically a human, but may be a mammal other than a human.
  • mammals other than humans include, for example, laboratory animals such as rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and rabbits, domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, sheep and minks, and pets such as dogs and cats.
  • Primates such as monkeys, cynomolgus monkeys, rhesus monkeys, marmosets, orangutans, chimpanzees and gorillas.
  • RNA can be prepared from leukocytes by precipitating the gene using a method such as that described above.
  • a commercially available extraction kit can be suitably used for this operation. For example, Isogen (made by Nippon Gene), Trizol ⁇ (made by Ambion) and the like can be mentioned.
  • the obtained RNA can be subjected to a reverse transcription reaction without further purification.
  • a primer that specifically hybridizes to the tRNA Leu (UUR) is used.
  • the primer is an oligonucleotide complementary to the template.
  • the oligonucleotide may be DNA, RNA, or a hybrid of DNA and RNA, but DNA is preferred from the viewpoint of operability.
  • the nucleotide constituting the oligonucleotide may be a natural nucleotide or an artificial nucleotide.
  • the length of the primer is not particularly limited as long as it can retain a function capable of specifically hybridizing to tRNA Leu (UUR) , but is 8 to 30 bases long, preferably 10 to 25 bases long, more preferably 10 to 22 bases long It is.
  • the specific base sequence of the primer is designed so that the length of the primer extension product is different or the length of the primer extension product is different from the base sequence depending on the presence or absence of taurine modification of tRNA Leu (UUR) .
  • a suitable base sequence is designed to hybridize in the 3 ′ to 5 ′ direction (from position 56 to position 41 ) of tRNA Leu (UUR) represented by SEQ ID NO: 2, which is shown below: It is DNA containing the base sequence represented by 5′-acctctgactgtaaag-3 ′ (SEQ ID NO: 3).
  • the primer may have one or more (for example, two) bases added to the 5 ′ end and / or the 3 ′ end in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • one or more (eg, two) bases may be deleted from the 5 ′ end and / or the 3 ′ end.
  • the tRNA Leu (UUR) to be measured has a mutated base sequence at the position where it hybridizes with the primer, so as to be complementary to the base sequence of the mutated tRNA Leu (UUR)
  • Any base in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 may be substituted with another base.
  • the primers designed in this way may be used in combination of not only one type but also two or more types.
  • the primer may be directly or indirectly labeled with a labeling substance.
  • labeling substance include fluorescent substances (eg, FITC, rhodamine, FAM TM , VIC TM , NED TM , PET TM , the above four are trade names of Applied Biosystems), radioactive materials (eg, 32 P, 35 S). , 14 C, 3 H), enzymes (eg, alkaline phosphatase, peroxidase), colored particles (eg, metal colloid particles, colored latex), biotin and the like.
  • it is a fluorescent substance or a radioactive substance
  • the site to be labeled is desirably the 5 ′ end of the primer.
  • the reverse transcription reaction can be performed by a known method with reference to Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition (2012).
  • Reverse transcriptase using the above primers and dNTPs (nucleotide mix), the presence of RNase inhibitor necessary, tRNA in the obtained RNA Leu and (UUR) as a template, a reverse transcription reaction is performed.
  • a reverse transcriptase is commercially available, and a commercially available enzyme kit can be used as long as it is an enzyme capable of performing a reverse transcription reaction using tRNA Leu (UUR) as a template.
  • AMV reverse transcriptase, M-MuLV reverse transcriptase and the like can be mentioned, but mutant reverse transcriptases such as Superscript III (manufactured by Thermo Fisher Scientific Inc.) cannot be used because the reaction does not stop at the taurine modification site.
  • As the template RNA about 1 pg to 1 ⁇ g of total RNA is used. About 0.1 to 1 ⁇ g of primer is used.
  • dNTP a mixture of four types of nucleotides (eg, dATP, dGTP, dCTP, dTTP) may be used, or 1 to 3 types of nucleotides complementary to the base sequence of the template may be used.
  • dNTP is usually used at a concentration of about 1 to 500 ⁇ M per nucleotide.
  • the RNase inhibitor can be used without limitation as long as it can inhibit RNase under the conditions of reverse transcription reaction.
  • Various RNase inhibitors are commercially available, and examples of commercially available products include RNaseOUT (manufactured by Thermo Fisher Scientific Inc.), RNasin (manufactured by Promega), and the like.
  • the composition of the reverse transcription reaction solution can be appropriately set depending on the reverse transcriptase used.
  • the reaction buffer attached to a commercially available enzyme kit can be diluted and used.
  • the reverse transcription reaction is divided into a template and primer annealing reaction and a subsequent extension reaction from the primer.
  • a condition of incubating at about 80 ° C. for 1 to 5 minutes and then allowing to stand at 37 ° C. or less, usually room temperature (around 25 ° C.) for 10 minutes to several hours can be mentioned.
  • the primer extension reaction for example, the reaction is carried out at 42 ° C. to 60 ° C. for 15 minutes to 2 hours, and after completion of the reaction, the reverse transcriptase is inactivated by heat treatment at 95 ° C. for 1 to 5 minutes.
  • the difference in the primer extension product due to the presence or absence of taurine modification is detected.
  • a primer extension product is developed on an agarose gel or polyacrylamide gel by electrophoresis and then detected by a difference in size.
  • the 5 ′ end of the primer is fluorescently or radiolabeled in advance, and after electrophoresis, a signal is taken into the imaging plate and can be detected using an appropriate detection device.
  • tRNA Leu with a taurine-modified when carrying out reverse transcription reaction using primers comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, .tau.m 5 U modification acts as a barricade against elongation reaction As a result, the elongation reaction stops at the U position.
  • the extension reaction proceeds without steric hindrance to the extension reaction, and dideoxynucleotides (eg, ddA, ddG, ddC, ddT) are allowed to coexist in the reaction solution.
  • the extension reaction can be stopped at a desired position. For example, when ddG is used, as shown in FIG. 1, the difference between tRNA Leu (UUR) with taurine modification and tRNA Leu (UUR) without taurine modification is primer extension with different length of one base. Expressed as a product.
  • the band may be identified by cutting out the band separated by electrophoresis, determining the base sequence by a conventional method, and measuring the difference in the base sequence of the primer extension product depending on the presence or absence of taurine modification.
  • a primer extension product from the tRNA Leu (UUR) having a taurine-modified in step the step of calculating the quantitative ratio between the primer extension products from the no taurine-modified tRNA Leu (UUR), a primer extension product
  • the signal captured on the imaging plate is quantified using densitometry such as BAS 2000 Image Analyzer (manufactured by GE Healthcare).
  • primer extension product from tRNA Leu (UUR) with taurine modification can be expressed in arbitrary units, or expressed in quantitative ratios. Also good. These values are expressed by the following formula (1):
  • U represents the amount of primer extension product from the tRNA Leu (UUR) with taurine modification
  • U is indicative of the amount of primer extension product from no taurine-modified tRNA Leu (UUR)
  • the mtDNA point mutation rate (%) is the 14th position A (A3243G), 15th position G (G3244A), 29th position in the DNA encoding tRNA Leu (UUR) represented by SEQ ID NO: 1.
  • T (T3258C), 42 position T (T3271C) and 62 position T (T3291C) are used to determine the normal taurine modification rate. It is desirable to use as an index of aging.
  • the point mutation rate of mtDNA is DNA sequencing method, PCR-RFLP method, PCR-SSCP method, denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) method, BiPlex Invader method, SnaP shot method, high-resolution melt (HRM) profiling method,
  • TTGE temporal temperature gradient gel electrophoresis
  • the PCR product amplified using the PCR-RFLP method is used for the presence or absence of a restriction enzyme ApaI cleavage site (a PCR product with a mutation has a cleavage site, and a PCR product without a mutation has The difference in the length of the band obtained by (without a cleavage site) can be quantified, and the point mutation rate of A3243G can be measured.
  • the PCR product amplified using the PCR-RFLP method has a cleavage site for the restriction enzyme AflII (a PCR product with a mutation has a cleavage site, and a PCR product without a mutation has a cleavage site)
  • AflII a PCR product with a mutation has a cleavage site
  • a PCR product without a mutation has a cleavage site
  • the total taurine modification rate and the normal taurine modification rate thus obtained can be used as indicators of aging in the present invention.
  • a healthy person can use the total taurine modification rate as an index of aging because the total taurine modification rate and the normal taurine modification rate are almost the same.
  • the total taurine modification rate of 100% can be determined as young from the viewpoint of taurine age.
  • the rate of taurine modification of normal mitochondrial tRNA Leu can be used as an indicator of aging and functional degradation of mitochondria itself, and it can be used as a living body, organ (organ), tissue, cell, or cell. It shows that it is useful as an indicator of aging and functional deterioration of organelles, especially organs, tissues, cells, or organelles with high energy demand.
  • the taurine modification rate of normal mitochondrial tRNA Leu is a biomarker used in determining whether a subject is healthy or unaffected, determining whether a subject is in need of life improvement and treatment, and assisting them. Useful.
  • the rate of taurine modification of normal mitochondrial tRNA Leu is As an innovative new biomarker, it has been shown to be useful for selecting companion diagnostics for assisting the selection and treatment of taurine therapy for patients with mitochondrial diseases currently under development .
  • a primer comprising a base sequence consisting of 10 to 25 bases complementary to mitochondrial tRNA Leu (UUR) , which is included in the aging determination drug of the present invention, is the same as the primer described in "Method for measuring aging”. It is.
  • the primer may be contained in a lyophilized state or may be contained in a solution with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier when preparing the determination drug of the present invention as a liquid, various carriers conventionally used as a preparation material, for example, a diluent, a solvent, a solubilizing agent, a tonicity agent, a buffering agent, etc. May be included.
  • the diluent include water and physiological saline.
  • the solvent include water, physiological saline, ethanol and the like.
  • solubilizers include cyclodextrins.
  • the isotonic agent examples include inorganic salts such as sodium chloride and potassium chloride, and carbohydrates such as glycerin, mannitol and sorbitol.
  • the buffer examples include phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer, and the like. Those skilled in the art can appropriately determine the mixing ratio of these carriers. It is desirable to store the primer on ice or on ice until just before use.
  • the aging determination kit of the present invention contains a primer containing a base sequence consisting of 10 to 25 bases complementary to mitochondrial tRNA Leu (UUR) and a reverse transcriptase.
  • the primer containing a base sequence consisting of 10 to 25 bases complementary to mitochondrial tRNA Leu (UUR) which is included in the aging determination kit of the present invention, is the same as the primer described in “Method for measuring aging”.
  • the kit of the present invention may further contain nucleoside triphosphate, a buffer for primer extension reaction, and an RNase inhibitor.
  • Nucleoside triphosphates are substrates that are incorporated into primers to form primer extension products and are usually used as dNTP mixtures.
  • a dNTP mixture typically consists of dATP, dTTP, dCTP and dGTP. If necessary, it may contain at least one dideoxynucleotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) for stopping primer extension at a desired site.
  • the buffer examples include tris buffer, phosphate buffer, veronal buffer, borate buffer, Good buffer and the like, which are used when performing a normal hybridization reaction.
  • the pH is not particularly limited, but is usually preferably in the range of 5 to 9.
  • the RNase inhibitor is the same as the RNase inhibitor described in “Measurement method for aging”.
  • the kit of the present invention includes a reaction vessel, a buffer for diluting the primer, a positive control (eg, normal human-derived cybrid cell RNA: Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102 ( 20): 7127-7132), negative control (eg, MELAS patient-derived cybrid cell RNA: Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102 (20): 7127-7132), instructions describing the protocol, etc. Further, it may be included.
  • a positive control eg, normal human-derived cybrid cell RNA: Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102 ( 20): 7127-7132
  • negative control eg, MELAS patient-derived cybrid cell RNA: Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102 (20): 7127-7132
  • instructions describing the protocol etc. Further, it may be included.
  • taurine and it Contained composition is used to improve the rate of taurine modification of mitochondrial tRNA Leu (UUR) , to prevent a decrease in the rate of taurine modification of mitochondrial tRNA Leu (UUR) , especially due to aging of normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) It is useful as a pharmaceutical, quasi-drug, cosmetic or food for improving the taurine modification rate.
  • the improving agent of the present invention contains taurine as an active ingredient.
  • Taurine is also referred to as aminoethylsulfonic acid or 2-aminoethanesulfonic acid.
  • Taurine may be organically synthesized according to a conventional method, or may be a natural product extracted and isolated from animals and plants.
  • Taurine may be in the form of a taurine derivative as long as it acts as taurine in vivo.
  • taurine derivatives include N-methyltaurine, N, N-dimethyltaurine, N, N, N-trimethyltaurine, guanidinoethanesulfonic acid, guanidinoethanesulfinic acid, N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid Piperazino-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid), N- [1′-aza-cycloheptan-2′-yl] -2-aminoethanesulfonic acid, N- [1′-aza-cyclo Pentane-2′-yl] -2-aminoethanesulfonic acid, N- [1′-aza-cycloheptane-2′-yl] -3-aminopropanesulfonic acid, N- [1′-aza-cyclopentane-
  • the administration of the improving agent of the present invention to a subject improves the taurine modification rate in the subject as compared to before administration or ingestion.
  • the improved taurine modification rate is the total taurine modification rate represented by the above-described formula (1) and / or the normal taurine modification rate represented by the above-described formula (2).
  • the improving agent of the present invention is taurine alone or an excipient (for example, lactose, sucrose, starch, cyclodextrin, etc.), and in some cases, a fragrance, a pigment, a seasoning, a stabilizer, a storage Containing tablets, pills, granules, fine granules, powders, pellets, capsules, solutions, emulsions, suspensions, syrups, troches, etc., and pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics or foods ( Preferably, it can be used as a health functional food) or food additive. Further, the improving agent of the present invention can also be used as a research reagent.
  • an excipient for example, lactose, sucrose, starch, cyclodextrin, etc.
  • a fragrance for example, lactose, sucrose, starch, cyclodextrin, etc.
  • a pigment for example, lactose, sucrose, starch, cyclodextr
  • the amount of taurine contained in the improving agent of the present invention is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited, but is usually 0.0001 to 100% by weight, preferably 0.001 to 99.0% by weight. %.
  • the effective amount of taurine can be expressed as the amount of taurine per kg body weight per day.
  • the recommended effective amount is 0.01 to 1.0 g / kg body weight / day, preferably 0.02 to 0.5 g / kg body weight / day.
  • the improving agent of the present invention when used as a medicine, it preferably contains an effective amount of taurine and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier examples include excipients (eg, lactose, sucrose, dextrin, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, light anhydrous silicic acid, etc.), disintegrating agents (eg, starch, carboxymethylcellulose, etc.), Lubricant (eg, magnesium stearate, talc, etc.), surfactant (eg, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, glyceryl monostearate, sodium lauryl sulfate, macrogol, sucrose fatty acid ester, etc.), solvent (eg, , Water, saline, soybean oil, etc.), preservatives (for example, p-hydroxybenzoic acid ester, etc.) and the like, but are not limited thereto.
  • excipients eg, lactose, sucrose, dextrin, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, light anhydrous silicic acid, etc.
  • disintegrating agents
  • the improver of the present invention can be safely administered orally or parenterally to animals (eg, mammals, birds, fish, etc.).
  • animals eg, mammals, birds, fish, etc.
  • the improver of the present invention can be taken as a food or as a food additive.
  • Food in the present invention means all foods, but in addition to general foods including so-called health foods, health foods such as foods for specified health use and functional foods for nutrition specified in the health function food system of the Ministry of Health, Labor and Welfare. And may be foods with health claims or health claims, and supplements, feeds and feeds are also included in the foods of the present invention.
  • taurine can be used by adding it to general foods (including so-called health foods) such as soft drinks, breads and confectionery.
  • general foods including so-called health foods
  • taurine is mixed with excipients (for example, lactose, sucrose, starch, etc.), and in some cases, flavors, pigments, etc., tablets, pills, granules, fine granules, powders, pellets, capsules, solutions, emulsions, It can be formulated into suspensions, syrups, lozenges, etc., and used as health functional foods and supplements such as foods for specified health use and nutritional functional foods.
  • the food and food additive of the present invention can also be applied to feed and feed applications, and can be ingested or administered to poultry and livestock in addition to normal feed and feed.
  • the intake or dose of the improving agent of the present invention varies depending on the age, weight and health condition of the intake or administration target, and cannot be determined in general.
  • it is usually in the form of quasi-drugs such as drinks, foods or cosmetics, while treatment or health for disorders caused by a decreased rate of taurine modification
  • taurine is 0.4-40 g per adult, preferably 0.8 g-20 g, more preferably 4.0. It is preferable to take or administer ⁇ 15 g in 1 to several times a day.
  • the body weight is 40 kg or less, it is usually taken in an amount of 0.3 to 30 g, preferably 0.6 to 15 g, more preferably 3.0 to 12 g per day divided into once to several times a day. Administration is preferred.
  • the administration method of the improving agent (medicine) of the present invention is not particularly limited as long as it provides a preventive and therapeutic effect against a decrease in the taurine modification rate.
  • parenteral administration intravenous administration, intramuscular administration, direct administration within tissue, intranasal administration, intradermal administration, transdermal administration, intraperitoneal administration, gastrostomy, tube administration, enteral nutrition administration, etc.
  • oral administration and in particular for application of the medicament to humans, it can be administered by intravenous, intramuscular or oral administration.
  • the dosage form is not particularly limited, and various dosage forms such as oral preparations (eg, granules, powders, tablets, capsules, syrups, emulsions, suspensions, drinks), injections, It can be administered as an instillation or an external preparation (nasal preparation, transdermal preparation, ointment, etc.). External preparations (transdermal preparations, ointments, etc.) can also be administered as quasi drugs or cosmetics.
  • oral preparations eg, granules, powders, tablets, capsules, syrups, emulsions, suspensions, drinks
  • injections It can be administered as an instillation or an external preparation (nasal preparation, transdermal preparation, ointment, etc.).
  • External preparations transdermal preparations, ointments, etc.
  • quasi drugs or cosmetics can also be administered as quasi drugs or cosmetics.
  • the agent for improving the rate of taurine modification of mitochondrial tRNA Leu (UUR) of the present invention is a patient who has developed mitochondrial disease, preferably a patient who has developed mitochondrial disease due to a mutation in a mitochondrial tRNA Leu (UUR) taurine modification.
  • tRNA Leu (UUR) represented by SEQ ID NO: 1
  • a at position 14 A3243G
  • G at position 15 G3244A
  • T at position 29 T3258C
  • T at position 42 Patients with mitochondrial disease caused by any point mutation selected from the group consisting of T3271C) and T at position 62 (T3291C), particularly preferably encoding tRNA Leu (UUR) represented by SEQ ID NO: 1
  • Factor Living and environmental factors mitochondrial tRNA Leu with a reduced due state of vital functions due to the effect of such may be used as improving agent of taurine modification rate of (UUR).
  • the improving agent of the present invention reduces the rate of taurine modification of mitochondrial tRNA Leu (UUR) due to aging, the state of biological functions due to the influence of genetic factors, living and environmental factors, etc. in these subjects and patients It may be used as a preventive agent.
  • improving agents of taurine-modified mitochondrial tRNA Leu (UUR) of the present invention not only the improvement of taurine modification rate of abnormal mitochondrial tRNA Leu (UUR), normal mitochondrial tRNA Leu taurine modification rate is decreased (UUR ) Is particularly useful in that it can improve the taurine modification rate.
  • Example 1 Detection of Taurine Modification of Mitochondrial tRNA Leu (UUR) by Reverse Transcription Reaction Basically, the method was performed according to the method of Kirino et al. (Proc Natl Acad Sci US A. 2005; 102 (20): 7127-7132) It was.
  • the principle of the primer extension method by Kirino et al. Is shown in FIG.
  • the base sequences of the primers used are as follows. 5'-acctctgactgtaaag-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • the base sequences of the two expected primer extension products are as follows.
  • dATP, dTTP, ddGTP (1.5 mM each, manufactured by AmershamPharmacia) was added in the reaction buffer for reverse transcriptase (manufactured by Invitrogen) (final concentration 37.5 ⁇ M), and 1 ⁇ L of M-MuLV Reverse transcriptase (RNase H ⁇ ) ( 40 units / ⁇ L, manufactured by Invitrogen), and a reverse transcription reaction was performed at 42 ° C. for 1 hour.
  • the 32 P-labeled primer (mixed primer, 0.1 pmol) represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 was used.
  • the reaction mixture was subjected to 15% polyacrylamide electrophoresis containing 7M urea.
  • the band labeled with RI was visualized with a BAS5000 bioimaging analyzer (Fuji Film).
  • Anti-codon (first letter U: underlined in Fig. 1) lacks taurine modification ( 5 U 34 ) and reaction stops at AAG, and taurine modification exists ( ⁇ m 5 U 34 ) and reaction stops at AG .
  • the RI-labeled reaction product was separated by electrophoresis and quantified with a BAS5000 bioimaging analyzer (Fuji Film) to determine the total taurine modification rate. The results are shown in FIG.
  • T3271C mutation For: 5'-taagaagaggaattgaacctctgaccttaa-3 '(SEQ ID NO: 10) and Rev: 5′-aggacaagagaaataaggcc-3 ′ (SEQ ID NO: 11) was used for PCR, and the amplified PCR product was cleaved with the restriction enzyme AflII.
  • AflII cleavage site there is no restriction enzyme AflII cleavage site, so there is only one 170 bp band
  • AflII cleavage site there is an AflII cleavage site, so two fragments of 140 bp and 30 bp are cleaved. A band appears.
  • the PCR product cleaved with the above restriction enzyme was subjected to 15% polyacrylamide electrophoresis, the separated band was stained with ethidium bromide, the intensity of the band was quantified using a densitometer, and the point mutation rate was determined ( Table 1).
  • the normal taurine modification rate of MELAS patients was determined using the total taurine modification rate and point mutation rate. The results are shown in FIG.
  • Test Example 1 Measurement of blood and cerebrospinal fluid lactate and pyruvate levels
  • the blood and cerebrospinal fluid lactate levels were measured by reacting L-lactic acid with lactate oxidase and converting the resulting hydrogen peroxide to peroxidase.
  • the dye produced in the presence of was quantified by colorimetric measurement.
  • the pyruvate value was measured by allowing pyruvate oxidase to act on pyruvate and colorimetrically measuring the resulting hydrogen peroxide in the presence of peroxidase.
  • Table 1 shows the total taurine modification rate, the normal taurine modification rate, and the point mutation rate of individual MELAS patients after the start of taurine administration and after the end of administration.
  • Example 1 and Test Example 2 indicate that the taurine modification rate of normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) decreases with aging, and the decreased taurine modification rate increases by taking taurine. Furthermore, the fact that the taurine modification rate of normal tRNA Leu (UUR) exceeds 100% indicates that the taurine modification rate of mutant tRNA Leu (UUR) is also improved by taking taurine. Until now, it was thought that the cause of MELAS was due to the lack of taurine modification of mutant tRNA Leu (UUR) , but this result shows that the rate of taurine modification of normal tRNA Leu (UUR) associated with the onset of MELAS It is shown that the decline of is involved.
  • Example 1 the taurine modification rate of normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) can be used as an indicator of aging and functional deterioration of mitochondria itself.
  • Organ tissue, cell, or organelle function, especially useful as an indicator of aging or functional degradation of organs, tissues, cells, or organelles with high energy demand. It shows that there is.
  • the normal taurine modification is performed although the calendar age is relatively high as in the case of the subject age 14 in Test Example 2 and the case where the normal taurine modification rate is low compared to the calendar age and the subject age 46
  • the rate of normal taurine modification is simply an aging that accompanies aging of the subject because there is a considerable range in the rate of normal taurine modification in young healthy subjects in Test Example 4 described later.
  • an indicator of aging but also as an indicator of aging reflecting the health status of subjects including the presence of diseases such as nutritional status and metabolic abnormalities, or as an indicator of healthy life expectancy, especially healthy life expectancy that does not include a specific cause of death Indicates that it can be used.
  • composition is for improvement of taurine modification rate of mitochondrial tRNA Leu (UUR), for the prevention of lowering taurine modification rate of mitochondrial tRNA Leu (UUR), among others, decreased by aging of normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) This indicates that it is useful as a pharmaceutical, quasi-drug, cosmetic or food for improving the taurine modification rate.
  • Test example 3 Improvement of diabetes marker by administration of taurine to diabetic patients
  • improvement of disease state was observed by administration of taurine.
  • the therapeutic effect of taurine administration on diabetes mellitus caused by base mutation (A3243G) was confirmed.
  • taurine (trade name Taurinsan 98% Taisho, Taisho Pharmaceutical Co., Ltd., manufactured by Taisho Pharmaceutical Co., Ltd.) was diagnosed as diabetes due to a single nucleotide mutation (A3243G) in the mitochondrial gene and was also associated with cardiomyopathy. ) was orally administered daily.
  • HbA1c hemoglobin A1c
  • MELAS reduces the rate of normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) taurine modification due to aging and the effects of genetic factors, living and environmental factors, etc. Since it is not limited and is a universal phenomenon even in healthy individuals, the mechanism of diabetes onset by mitochondrial gene mutation is the same as in MELAS, in addition to abnormal mitochondrial tRNA Leu ( in addition to UUR , normal mitochondrial tRNA Leu presumably due to a decrease in taurine modification rate of (UUR).
  • UUR normal mitochondrial tRNA Leu
  • Test Example 4 Measurement of normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) taurine modification rate in healthy subjects
  • the normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) taurine modification rate decreases with age
  • the rate of taurine modification of normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) decreased with aging even in healthy subjects. The result is shown in FIG.
  • the normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) modification rate is Compared with the average of younger (10s) 56.7 ⁇ 12.6% (Mean ⁇ SE), the elderly (80s) showed a significant decrease with aging, 35.8 ⁇ 3.0%.
  • a modification rate is about 80% to about 40%, which is about twice as wide. Therefore, a decrease in the normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) taurine modification rate is This is thought to reflect not only aging but also the decline in biological functions due to genetic factors, lifestyle and environmental factors. This result shows that the taurine modification rate of normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) can be used as a useful aging biomarker not only in MELAS patients but also in healthy individuals.
  • the taurine modification rate of normal mitochondrial tRNA Leu is universally aging regardless of mitochondrial disease patients and healthy individuals due to the effects of aging, genetic factors, living and environmental factors, etc. It shows that it decreases with it. Moreover, since it was confirmed that the decrease in the taurine modification rate was improved by administration of taurine, the taurine modification-improving agent of the mitochondrial tRNA Leu (UUR) of the present invention is suitable for not only healthy subjects but also unaffected subjects and some diseases.
  • the taurine modification rate of normal mitochondrial tRNA Leu (UUR) is a biomarker that can be used to select the target of taurine therapy for patients with mitochondrial disease that is currently under development, as well as for companion diagnostic applications used to determine the therapeutic effect It is also useful for assistance.
  • Formulation Example 1 Granule (in one package) Taurine 3000mg Aspartame 9mg Talc 20mg Low-substituted hydroxypropylcellulose 60mg A granule having the above formulation was prepared by a conventional method.
  • Formulation Example 2 Liquid for internal use (in 1 drug) Keihi 100mg Royal Jelly 100mg Taurine 5000mg 70% sorbitol solution 1000mg Erythritol 1000mg pH adjuster Add an appropriate amount of purified water to make the total volume 180mL. By an ordinary method, a liquid preparation for internal use comprising the above formulation was prepared.
  • Formulation Example 3 Drink (in 1) Vitamin B1 nitrate 10mg Vitamin B2 2mg Carnitine chloride 50mg Taurine 4000mg Sodium pantothenate 10mg Benzoic acid 20mg Butyl paraoxybenzoate 2.5mg Aspartame 6mg Citric acid 100mg Glycine 300mg Add purified water to bring the total volume to 50 mL. A drink comprising the above formulation was prepared by a conventional method.
  • the present inventors have found that the taurine modification rate of normal tRNA Leu (UUR) among mitochondrial tRNAs is an indicator of aging.
  • the rate of taurine modification of normal tRNA Leu (UUR) is a universal marker that can be used to understand the status of healthy individuals as well as patients with mitochondrial diseases.
  • Taurine is a pharmaceutical, quasi-drug, and cosmetic product that improves the rate of taurine modification that has decreased due to the aging of mitochondrial tRNA Leu (UUR) and the effects of life and environmental factors such as strength fatigue and genetic factors. Alternatively, it is useful as a food.
  • the present invention is based on Japanese Patent Application No. 2016-062910 (filing date: March 26, 2016) filed in Japan, and all the contents thereof are included in this specification.

Abstract

本発明は、被験者から単離した生体試料におけるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の程度を、該tRNALeu(UUR)を鋳型としてプライマーからの逆転写反応により測定する工程を含む、被験者の老化の測定方法を提供する。また、本発明は、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０～２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーを含有する、老化の判定薬も提供する。さらに、本発明は、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０～２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーおよび逆転写酵素を含有する、老化の判定キットも提供する。その上、本発明は、タウリンを有効成分として含有する、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善剤も提供する。

Description

老化を反映するミトコンドリアバイオマーカー
　本発明は、老化を反映するミトコンドリアバイオマーカーに関し、老化を可視化し、健康寿命の指標を提供する分野に関する。
　ミトコンドリアは、体細胞の好気性代謝を担う細胞内小器官で、水素伝達系と酸化的リン酸化によってエネルギーとなるATPを産生する。このミトコンドリア機能は、ゲノムとは独立した複製機構をもつミトコンドリアDNAの変異を原因とするミトコンドリア病ばかりでなく、老化によっても障害されると考えられている。したがって、ミトコンドリア機能障害の早期診断や障害度評価は、ミトコンドリア病患者の治療方針の選択や予後判定に重要な役割を果たすばかりではなく、老化マーカーとしても注目される。
　MELASは、最も頻度の高いミトコンドリア病で、Myopathy、Encephalopathy、Lactic acidosis、Stroke-like episodeで代表される多彩かつ特徴的な症候を呈し、診断からの平均余命は5-10年、世界的に保険適応を獲得した医薬品が皆無の難治性希少疾患である。脳卒中様発作を繰り返し進行するため、その一刻も早い再発抑制療法が待望されている。MELASは、ミトコンドリアDNAのtRNALeu(UUR)遺伝子コード領域の一塩基置換（A3243G、T3271C、G3244A、T3258C、T3291C）が原因で発症するが、その基本病態は長らく不明であった。日本医科大学の太田らは、MELAS変異tRNALeu(UUR)では、正常で認められるアンチコドン1文字目のタウリン修飾が欠損して翻訳障害が惹起されるというユニークな基本病態を発見し、「tRNA転写後修飾異常病」という新規疾患概念を世界に先駆け提唱した(非特許文献１)。本発明者らは、太田らとの共同研究により、タウリン大量投与によって、MELASモデル細胞のミトコンドリア機能異常が改善し、2名の患者の頻発していた脳卒中様発作が10年以上完全に抑制されることを発表した（非特許文献２）。そこで、GCP試験薬タウリンのMELAS脳卒中様発作抑制効果の有効性を検証する多施設オープン3相医師主導治験（厚生労働科学研究費：平成24-26年度難治等（難治）-一般-068）を実施して、60％の患者で主要評価項目であるMELAS脳卒中様発作の完全抑制を達成した。
　ヒト疾患におけるtRNA修飾の役割に関する総説が刊行され（非特許文献３）、ヒトミトコンドリア病におけるミトコンドリアtRNAのタウリン修飾欠如に関する測定法（非特許文献4）および総説も刊行されている（非特許文献5）。また、ミトコンドリアtRNAに着目した診断または治療に関していくつかの特許出願がなされている。
1）ミトコンドリアtRNAを含むtRNAの化学修飾、具体的にはリジンをコードするtRNAのチオメチル修飾率を測定することで２型糖尿病を診断する方法が知られている（特許文献１）。
2）高齢化に伴う代謝の変化、特にミトコンドリアの機能不全に結びつく変化を予防または修復することによって高齢動物の健康状態を改善する方法が知られている（特許文献２）。グルタチオンはミトコンドリアDNA（mtDNA）の酸化的傷害を防止する主要な細胞内抗酸化システムであるが、高齢化に伴いグルタチオン自体の酸化が進んで抗酸化機能が低下する。これに対して、タウリンなどのチオール化合物を供給することでmtDNAの酸化的傷害を防止できることが記載されている。しかし、tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率と老化との関係については記載がない。
3）タウリン、タウリンクロラミンまたはタウリン前駆物質等を有効成分とするミトコンドリア病の治療薬が知られている（特許文献３）。しかし、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が加齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による老化(生体機能の低下)に伴い低下すること、および、その低下がタウリン投与により改善されることは開示も示唆もされていない。
国際公開第２０１４－１３６８７０号 特表２００４－５１９２４１号公報 特開２００３－４８８２９号公報
Yasukawa T, Suzuki T, Ueda T, Ohta S, Watanabe K. J Biol Chem. 2000; 275(6):4251-4257 Rikimaru M, Ohsawa Y, Wolf AM, Nishimaki K, Ichimiya H, Kamimura N, Nishimatsu S, Ohta S, Sunada Y. Intern Med. 2012; 51(24):3351-3357. Adrian Gabriel Torres, Eduard Batlle, Lluis Ribas de Poulana, Trends in Molecular Medicine 2014; 20 (6):306-314 Kirino Y, Goto Y, Campos Y, Arenas J, SuzukiT. Proc Natl Acad Sci U S A.2005;102(20):7127-7132. Tsutomu Suzuki, Asuteka Nagao, and Takeo Suzuki, WIREs RNA 2011; 2:376-386
　本発明の第一の目的は、老化に伴う、ミトコンドリア機能障害の早期発見や障害度評価につながる新規バイオマーカーを提供することにある。
　本発明の第二の目的は、ミコトンドリアの機能低下を惹起する、老化に伴う、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下の改善剤を提供することにある。
　これまで臨床的にミトコンドリア病マーカーとして使われてきた血液および髄液の乳酸値ならびに乳酸値とピルビン酸値との比は、ミトコンドリア病で嫌気性代謝が亢進する病態によって上昇するばかりでなく、組織低酸素による解糖系代謝の亢進、すなわちショック、呼吸不全、播種性血管内凝固症候群など様々な病態によっても上昇が認められる特異性の低いマーカーである（Kraut JA, Madias NE. Lactic acidosis. N Engl J Med. 2015; 372(11):1078-1079）。本発明者らは、被験者の白血球検体のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率を測定し、ミトコンドリア病マーカーとしての有用性について鋭意検討した。具体的には、ミトコンドリア病患者における変異ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下のみならず、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下も観測され、意外にも、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が老化の指標となり得ることを見出し、ミトコンドリア病患者のみならず健常者への適用が可能であることに想到し、本発明を完成するに至った。さらに、本発明者らは、タウリンの大量投与は、ミトコンドリア病患者における変異ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の増加のみならず、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の増加をももたらすことを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明は、以下のものを提供する。
〔１〕　被験者から単離した生体試料におけるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の程度を、該tRNALeu(UUR)を鋳型としてプライマーからの逆転写反応により測定する工程を含む、被験者の老化の測定方法。
〔２〕　プライマーが鋳型に相補的な１０～２５塩基長からなるオリゴヌクレオチドであり、タウリン修飾の有無によるプライマー伸長産物の相違を検出する、〔１〕に記載の方法。
〔３〕　プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕　タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物と、タウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物との量比を算出する工程をさらに含む、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕　下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
（式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）で表される総タウリン修飾率を老化の指標とする、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕　被験者が、tRNALeu(UUR)遺伝子コード領域のA3243G、T3271C、G3244A、T3258CおよびT3291Cからなる群より選ばれる一塩基置換を有する変異ミトコンドリアDNAを有すると疑われる者であり、前記式（１）に続いて、下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
（上記式中、mtDNA点変異率は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い点変異率を示す）により求めた正常タウリン修飾率を老化の指標とする、〔５〕に記載の方法。
〔７〕　ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０～２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーを含有する、老化の判定薬。
〔８〕　プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、〔７〕に記載の判定薬。
〔９〕　ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０～２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーおよび逆転写酵素を含有する、老化の判定キット。
〔１０〕　プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、〔９〕に記載のキット。
〔１１〕　タウリンを有効成分として含有する、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善剤。
〔１２〕　ミトコンドリアtRNALeu(UUR)が正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)である、〔１１〕に記載の改善剤。
〔１３〕　タウリン修飾率の改善が下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
（式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）により求めた総タウリン修飾率、および／または
下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
（上記式中、mtDNA点変異率は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い点変異率を示す）により求めた正常タウリン修飾率の改善である、〔１１〕に記載の改善剤。
〔１４〕　医薬または化粧品である、〔１１〕または〔１２〕に記載の改善剤。
〔１５〕　保健機能食品または食品添加物である、〔１１〕または〔１２〕に記載の改善剤。
〔１６〕　ミトコンドリア病を発症した患者、および／または発症リスクを有する対象のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善用である、〔１１〕～〔１５〕のいずれかに記載の改善剤。
〔１７〕　ミトコンドリア病がミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損遺伝子変異に起因する、〔１６〕に記載の改善剤。
〔１８〕　ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損遺伝子変異が、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異である、〔１７〕に記載の改善剤。
〔１９〕　ミトコンドリア病が、MELASあるいは糖尿病である、〔１６〕～〔１８〕のいずれかに記載の改善剤。
　本発明者らは、ミトコンドリアtRNAの中でも、正常なtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が、従来のミトコンドリア病のマーカーである、血中乳酸値、血中乳酸値とピルビン酸値との比、髄液乳酸値、髄液乳酸値とピルビン酸値とは異なり、加齢と相関することを見出した。したがって、正常なtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、ミトコンドリア病患者のみならず健常人の生理機能の状態を把握することのできるユニバーサルマーカーである。
プライマー伸長法によるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾測定法の概略を示す。 MELAS患者の総タウリン修飾率、ならびに正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率と年齢との相関を示す。 血中乳酸値と、MELAS患者の正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率または年齢との関連を調べた図である。 血中乳酸/ピルビン酸比と、MELAS患者の正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率または年齢との関連を調べた図である。 髄液乳酸/ピルビン酸比と、MELAS患者の正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率または年齢との関連を調べた図である。 髄液乳酸値と、MELAS患者の正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率または年齢との関連を調べた図である。 MELAS患者へのタウリン投与による総タウリン修飾率の変化、ならびに正常tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善を示す図である。 若年（10代）および老年（80代）健常人のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率を調べた図である。
　本明細書において、アミノ酸、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ヌクレオチドなどの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列またはアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）、および当該分野における慣用記号に従う。
定義
　本発明において「老化」とは、加齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などのその他の内的または外的な要因の影響により生体機能が低下することをいう。加齢とは、生まれてから死までの物理的な時間経過であり、暦年齢と同義である。その他の内的な要因とは、例えば、ミトコンドリア機能、過酸化ラジカル濃度、およびテロメア長などの細胞老化に係わるものなどがあげられる。また、その他の外的な要因とは、例えば、個々の運動量、喫煙の有無、食事習慣、および栄養状態などがあげられる。生体機能とは、例えば筋力、神経伝導速度、肺活量、病気に対する抵抗力などがあげられる。加齢による老化は、一般に生殖年齢に達した後に始まり、個体差があるが、ヒトでは２０歳から３０歳以降に始まる。老化は、環境要因や遺伝的素因が複雑に絡み合って関与していると考えられ、かかる機能低下の速さはすべてのヒトが同じではなく、必ずしも加齢という要因のみで規定できるものではなく、従来は明確な老化の指標がなかった。本発明が提供する老化の指標は、健康寿命の観点からも指標とすることができる。
　本発明の「老化」は、身長や体重の減少、皮膚や頭髪の変化などの外的変化、運動機能の低下、感覚機能の低下、或いは、生理機能の低下などの所謂加齢に伴う身体機能の低下のみでなく、生体を構成する細胞の老化（細胞老化）、さらに呼吸・エネルギー代謝に重要な機能を果たすミトコンドリアの老化が含まれる。老化に伴いミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が低下すれば、当然、UUGコドン特異的な翻訳能が律速となって、UUGコドンを含むタンパク質の合成が低下する。ひいてはミトコンドリアの機能が低下し、生体やそれを構成する器官等の機能が低下するのは明らかであり、さらに修飾率の低下が進行すれば、例えば、高齢者に認められる呼吸困難や骨格筋の減弱のような重篤な症状を発症するに至る場合もあると考えられる。従って、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、ミトコンドリア自体の老化や機能低下の指標として用いることができることは言うに及ばず、生体、器官(臓器)、組織、細胞、或は、細胞内小器官の機能、とりわけ、生体やエネルギー需要の高い器官(臓器)、組織、細胞、或いは、細胞内小器官の老化や機能低下の指標としても有用である。
　また、上記指標は、現在開発が進行中のミトコンドリア病患者に対するタウリン療法の対象者の選定や、その治療効果判定に用いるコンパニオン診断用途やその補助にも有用である。
　ここで健康寿命とは、厚生労働省が定義する、健康上の問題で日常生活が制限されることなく生活できる期間をいう。世界保健機関を始めとして、各国が健康寿命を伸ばすことを目標としており、究極的には、健康寿命と平均寿命との差をゼロに近づけることが望まれている。
　本発明においてミトコンドリアtRNALeu(UUR)は、ミトコンドリアDNAから転写され、ロイシンのコドンUUR (RはAまたはGである)を認識するtRNAである。ミトコンドリアtRNALeu(UUR)は、動物種によって17位、20位、47位の塩基が増減するため、アンチコドンに相当するヌクレオチド（UAA）の位置を統一して34位～36位と定めている。ヒトミトコンドリアtRNALeu(UUR)をコードするDNAは、NCBIに登録されており、GenBankアクセッション番号AB026838（バージョンAB026838.1）（配列番号１）で公表されている。また、配列番号１で公表されているDNAから転写されるミトコンドリアtRNALeu(UUR)は、配列番号２で表される。配列番号２の36番目（上記定義によると34位）のウリジン（U）は、タウリン修飾されている場合と修飾されていない場合とがある。
　本願明細書においては、「ミトコンドリアtRNALeu(UUR)」を単に「tRNALeu(UUR)」と省略する場合がある。
　tRNALeu(UUR)には様々な変異が見出されている。本発明においては、配列番号２で表されるtRNALeu(UUR)のみならず、現在までに知られている変異tRNALeu(UUR)および将来見出される変異tRNALeu(UUR)をも測定対象とする。変異tRNALeu(UUR)の具体例は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）、62位のT（T3291C）の点変異：これらの変異はタウリン修飾の欠損を生じさせ、MELAS患者で見出されている変異である；13位のG（A3242A）、21位のT（T3250C）、25位のC（C3254T）、51位のA（A3280G）の点変異：これらの変異はタウリン修飾に影響はなく、MELAS以外のミトコンドリア病で見出されている変異である；などがあげられる。その他の変異については、ＭＩＴＯＭＡＰ（www.mitomap.org/MITOMAP）を参照することができる。
　本発明において変異tRNALeu(UUR)とは、タウリン修飾の欠損を生じさせる変異を有するmtDNAより転写されたtRNALeu(UUR)をいい、タウリン修飾に影響しない変異を有するtRNALeu(UUR)を含まないものとする。
　また、正常tRNALeu(UUR)とは、上記変異tRNALeu(UUR)を除くtRNALeu(UUR)をいう。ヒトの場合、配列番号２で表されるtRNALeu(UUR)と同一の塩基配列を有するtRNALeu(UUR)および配列番号２で表されるtRNALeu(UUR)と異なる塩基配列を有するtRNALeu(UUR)であっても、該塩基配列の相違がtRNALeu(UUR)のタウリン修飾に影響しないtRNALeu(UUR)が含まれるが、タウリン修飾の有無にかかわらず正常なtRNALeu(UUR)の機能を有さないものは含まない。
　ここで、上記14位のA、15位のG、29位のT、42位のTおよび62位のTは、ヒト以外に、ゴリラ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等においても保存されており、ラットおよびマウスの場合も、42位がCである以外は同様に保存されているため、tRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損を生じさせる変異は、ヒトに限定されるものではなく、後述する霊長類、ペット、家畜、実験動物等の哺乳動物も対象となりうる。
　本発明においてミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾とは、tRNALeu(UUR)のアンチコドン（UAA）１文字目（上記定義によると34位のwobble位）のウラシル塩基の５位にタウリノメチル基が結合した転写後修飾をいう。このようにタウリン修飾されたウリジンをτm5Uの略号で示す場合がある。
ミトコンドリアDNA（mtDNA）とヘテロプラスミーについて
　細胞あたり数百のミトコンドリアが存在し、そのひとつひとつのミトコンドリアに5～10個のミトコンドリアDNA（mtDNA）が含まれている。単一のmtDNAで構成されている状態を「ホモプラスミー」、正常と変異mtDNAが混在している状態を「ヘテロプラスミー」と呼ぶ。変異mtDNAの比率（ヘテロプラスミーの度合い）が高くなると、ミトコンドリアの呼吸機能に異常を来たし、ミトコンドリア病を発症する。ヘテロプラスミーの度合いは、骨格筋、血管、皮膚などの組織ごと、または細胞ごとに異なる。また、健常者の組織または細胞においても、変異mtDNAが微量に含まれていることが最近報告された（Brendan A.I. Payne et al.: Universal heteroplasmy of human mitochondrial DNA. Hum Mol Gent 22: 384 - 390 (2013)）。そこで、本発明においては、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の度合いを以下のように定義し、実質的に正常なmtDNAを有する被験者（健常者）と、変異mtDNAを一定の割合で含む被験者(例、MELAS患者、糖尿病患者)とに区別して、tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率を測定する。
ミトコンドリア病患者のタウリン修飾率について
　MELAS患者の細胞のミトコンドリアは、ヘテロプラスミーであるため、変異mtDNAと正常なmtDNAが含まれている。したがって、変異mtDNAより転写されたtRNALeu(UUR)のアンチコドン１番目のウラシルはタウリン修飾が欠損しているとしても、正常なmtDNAより転写されたtRNALeu(UUR)はタウリン修飾されていると考えられる。
　MELAS患者を始めとする変異mtDNAを含む被験者由来の細胞に含まれる正常なmtDNAより転写されたtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率を「正常タウリン修飾率」と定義し、下記式（１）により求めた「総タウリン修飾率」に基づいて、下記式（２）により求めることができる。
　本発明において総タウリン修飾率とは、被験者由来の検体中のミトコンドリアtRNALeu(UUR)におけるタウリン修飾tRNALeu(UUR)を、タウリン修飾tRNALeu(UUR)とタウリン非修飾tRNALeu(UUR)との総和で除した値をいう。
　ここで被験者とは、ヒトを始めとする哺乳動物であり、哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー、ゴリラなどの霊長類等をあげることができる。被験者由来の検体とは、哺乳動物、好ましくはヒトから採取可能なものであれば特に限定されるものではなく、血液、リンパ液、尿などの体液試料、毛髪、頬粘膜、胃、大腸、肺、肝臓、脳などの生検組織をあげることができる。好ましくは血液試料であり、血液試料中の白血球がより好ましい。
　総タウリン修飾率は、タウリン修飾tRNALeu(UUR)およびタウリン非修飾tRNALeu(UUR)の量を、プライマーを用いた逆転写反応（プライマー伸長法）によるプライマー伸長産物の量を測定することによって間接的に求め、下記式（１）：
（上記式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）に代入して計算した値である。
　ここで、被験者が、tRNALeu(UUR)遺伝子コード領域のA3243G、T3271C、G3244A、T3258CおよびT3291Cからなる群より選ばれる一塩基置換を有する変異ミトコンドリアDNAを有すると疑われる者である場合、前記式（１）に続いて、下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
（上記式中、mtDNA点変異率（％）は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い変異率を示す）により、正常タウリン修飾率を求め、該数値を老化の指標とすることが望ましい。
　mtDNAの点変異率の解析については、DNAシークエンス法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、denaturing high-performance liquid chromatography(DHPLC)法、 BiPlex Invader法、SnaP shot法、high-resolution melt(HRM)プロファイリング法、temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE)法のほか、現在開発されている次世代シーケンサーを用いた方法などがあげられる。
　総タウリン修飾率は、理論上０～１００％の範囲内にある。しかし、MELAS患者の病態を考察すると、総タウリン修飾率が低下すると、重篤な症状を発症する場合がある。一方、正常タウリン修飾率については、健常者ではmtDNA点変異率がほぼ0%であるため、前記［数6］の計算式を用いて計算すると、総タウリン修飾率とほぼ同値となる。しかし、ミトコンドリア病患者の正常タウリン修飾率は、mtDNA点変異率により、計算上1OO%を超えることがあり得る。
　医師主導治験において、tRNALeu(UUR)の正常タウリン修飾率を縦軸に、被験者年齢を横軸にプロットしたところ、被験者年齢が高くなるに従って正常タウリン修飾率が減少していることを発見した（図２）。また、MELAS患者のタウリン内服により、正常タウリン修飾率が回復し、変異mtDNAに由来するtRNALeu(UUR)のタウリン修飾も改善することが明らかとなった（図７、表１）。有効量のタウリン投与により、老化の進行を遅延させることが期待できる。
　正常タウリン修飾率が低いほど、老化が進行していると判断することができる。すなわち、正常タウリン修飾率を用いて、老化の尺度を「タウリン年齢」として示すことができる。また、健常者においては、総タウリン修飾率と正常タウリン修飾率とが近似しており、便宜的に総タウリン修飾率を用いて、老化の尺度を「タウリン年齢」として示すことができる。
老化の測定方法
（1）被験者から単離した生体試料におけるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の程度を、該tRNALeu(UUR)を鋳型としてプライマーからの逆転写反応により測定する工程
　測定対象の生体試料としては、毛髪、頬粘膜、胃、大腸、肺、肝臓、脳などの生検組織や、血液、リンパ液、尿などの体液試料が限定なくあげられる。採取が容易な点から血液が好ましく、血液より得られる白血球がより好ましい。以下、白血球を例にして、老化の測定方法を説明するが、他の生体試料も同様に測定することができる。
　測定に供する白血球は、被験者から血液を採取し、常法により白血球画分を回収することにより得ることができる。この目的のために、市販の試薬を好適に使用することができる。市販の試薬としては、Lymphoprep（登録商標）、Ficoll（登録商標）-Paqueなどがあげられる。白血球画分は、試薬の製造業者の指示書に従って、密度勾配遠心分離法を実施し、リンパ球や単球を含む血球層（末梢血単核球：PBMC）を分離することにより得られる。
　被験者は、典型的には、ヒトであるが、ヒトを除く哺乳動物であってもよい。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー、ゴリラなどの霊長類等をあげることができる。
　被験者由来の白血球画分から、常法によりRNAを含む試料を調製する。細胞からRNAを抽出する方法は、細胞破砕とRNaseの不活化を同時に行う方法を採用することが望ましく、細胞を破砕して可溶化剤によって可溶化した後、変性剤によってタンパク質を除去し、エタノール等で遺伝子を沈殿させることで、白血球からRNAを調製することができる。該操作には、市販の抽出キットを好適に使用することができる。例えば、Isogen（ニッポンジーン製）、Trizol (Ambion製）などがあげられる。
　得られたRNAは、それ以上精製することなく逆転写反応に供することができる。得られたRNAに含まれるtRNALeu(UUR)を鋳型とするためには、該tRNALeu(UUR)に特異的にハイブリダイズするプライマーを用いる。本発明においては、プライマーは、該鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドとしては、DNA、RNA、DNAとRNAのハイブリッドであってもよいが、操作性の観点から、DNAが好ましい。オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、天然のヌクレオチドであっても人工のヌクレオチドであってもよい。
　プライマーの長さは、tRNALeu(UUR)に特異的にハイブリダイズできる機能を保持できる限り特に限定されないが、８～３０塩基長、好ましくは１０～２５塩基長、より好ましくは１０～２２塩基長である。
　プライマーの具体的な塩基配列は、tRNALeu(UUR)のタウリン修飾の有無により、プライマー伸長産物の長さが相違する、あるいは、プライマー伸長産物の長さと塩基配列が相違するように設計される。好適な塩基配列は、配列番号２で表されるtRNALeu(UUR)の3’から5’の向き（56位→41位）にハイブリダイズするように設計された、下記：
5’-acctctgactgtaaag-3’（配列番号３）で表される塩基配列を含むDNAである。
　プライマーは、本発明の目的の範囲内で、配列番号３に示される塩基配列において、5’末端および／または3’末端に1または複数個（例えば、2個）の塩基が付加されていてもよく、5’末端および／または3’末端から1または複数個（例えば、2個）の塩基が欠失してもよい。
　さらに、プライマーとハイブリダイズする位置に、測定対象のtRNALeu(UUR)が変異した塩基配列を有することが想定される場合は、変異tRNALeu(UUR)の塩基配列と相補的となるように、配列番号３に示される塩基配列の任意の塩基を他の塩基に置換してもよい。具体的には、下記：
5’-acctctgactgtaagg-3’（配列番号４）：3271変異の場合、または
5’-acctctgactgcaaag-3’（配列番号５）：3280変異の場合
で表される塩基配列を含むDNAがあげられる。このようにして設計したプライマーは、１種のみならず、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　前記プライマーは、直接的または間接的に標識物質により標識されていてもよい。標識物質としては、蛍光物質（例、ＦＩＴＣ、ローダミン、FAMTM、VICTM、NEDTM、PETTM、前記４種はApplied Biosystems社の商品名である）、放射性物質（例、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ）、酵素（例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ）、着色粒子（例、金属コロイド粒子、着色ラテックス）、ビオチンなどがあげられる。好ましくは、蛍光物質または放射性物質であり、標識される部位は、プライマーの5’末端が望ましい。
　逆転写反応は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition (2012)等を参照して、公知の方法で行うことができる。逆転写酵素、上記プライマーおよびdNTP（ヌクレオチド混合物）を用いて、必要によりRNase阻害剤の共存下、得られたRNA中に含まれるtRNALeu(UUR)を鋳型として、逆転写反応を行う。
　逆転写酵素は市販されており、tRNALeu(UUR)を鋳型として、逆転写反応を行える酵素であれば、市販の酵素キットを使用することができる。例えば、AMV逆転写酵素、M-MuLV逆転写酵素などがあげられるが、SuperscriptIII(Thermo Fisher Scientific Inc. 製)のような変異型の逆転写酵素はタウリン修飾部位で反応が停止しないため使用できない。
　鋳型RNAは、総RNAとして1pg～1μg程度を用いる。
　プライマーは、0.1～1μg程度を用いる。
　dNTPは、4種のヌクレオチド（例、dATP、dGTP、dCTP、dTTP）の混合物を用いてもよく、鋳型の塩基配列に相補的な1～3種のヌクレオチドを用いてもよい。dNTPは、通常、各ヌクレオチドあたり1-500μM程度の濃度で使用する。
　RNase阻害剤は、逆転写反応の条件下でRNaseを阻害できる限り限定なく使用することができる。種々のRNase阻害剤が市販されており、市販品としては、RNaseOUT(Thermo Fisher Scientific  Inc. 製）、RNasin(Promega製）等があげられる。
　逆転写反応溶液の組成は、用いる逆転写酵素により適宜設定することができる。また、市販の酵素キットに添付されている反応緩衝液を希釈して使用することができる。
　逆転写反応は、鋳型とプライマーのアニーリング反応およびそれに続くプライマーからの伸長反応とに分けられる。
　アニーリング反応の一例として、例えば、約80℃で1～5分間インキュベートした後、37℃以下、通常は室温（25℃前後）にて10分～数時間静置する条件があげられる。
　プライマー伸長反応の一例として、例えば、42℃～60℃で15分間～2時間行い、反応終了後は95℃で1～5分間熱処理することにより逆転写酵素を失活させる。
　逆転写反応終了後、タウリン修飾の有無によるプライマー伸長産物の相違を検出する。例えば、プライマー伸長産物を電気泳動によりアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルで展開した後、サイズの相違によって検出する方法があげられる。この場合、プライマーの５'末端を予め蛍光標識または放射線標識しておき、電気泳動後、イメージングプレートにシグナルを取り込み、適当な検出装置を用いて検出することができる。
　ここで、タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)は、配列番号３で表される塩基配列を含むプライマーを用いて逆転写反応を実施すると、τｍ5U修飾が伸長反応に対してバリケードとして作用することにより、35位のUで伸長反応が停止する。タウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)の場合は、伸長反応に対する立体障害がなく伸長反応が進み、ジデオキシヌクレオチド（例、ddA、ddG、ddC、ddT）を反応液中に共存させておくことで、所望の位置で伸長反応を停止させることができる。例えば、ddGを用いた場合、図１に示すように、タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)とタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)との相違は、1塩基の長さが相違するプライマー伸長産物として表される。
　さらに、電気泳動により分離したバンドを切り出し、常法により塩基配列を決定して、タウリン修飾の有無によるプライマー伸長産物の塩基配列の相違を測定することによって、バンドを同定してもよい。
（2）タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物と、タウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物との量比を算出する工程
　前記工程で、プライマー伸長産物を電気泳動後、イメージングプレートに取り込んだシグナルを、BAS 2000イメージアナライザー (GEヘルスケア製）等のデンシトメトリーを用いて定量する。
　タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物およびタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量は、任意の単位で表すことができ、あるいは、量比で表してもよい。これらの値を、下記式（１）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
（式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）に代入し、総タウリン修飾率を算出する。
　ここで、被験者が変異mtDNAを有すると疑われる場合、下記式（２）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
（上記式中、mtDNA点変異率（％）は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い変異率を示す）により、正常タウリン修飾率を求め、該数値を老化の指標とすることが望ましい。
　mtDNAの点変異率は、DNAシークエンス法、PCR-RFLP法、PCR-SSCP法、denaturing high-performance liquid chromatography(DHPLC)法、BiPlex Invader法、SnaP shot法、high-resolution melt(HRM)プロファイリング法、temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE)法のほか、現在開発されている次世代シーケンサーを用いた方法を用いて測定することができる。
　例えば、A3243Gを有するMELAS患者の場合、PCR-RFLP法を用いて増幅したPCR産物を、制限酵素ApaIの切断部位の有無（変異のあるPCR産物は切断部位を有し、変異のないPCR産物は切断部位を有しない）により得られるバンドの長さの相違を定量し、A3243Gの点変異率を測定することができる。T3271Cを有するMELAS患者の場合、PCR-RFLP法を用いて増幅したPCR産物を、制限酵素AflIIの切断部位の有無（変異のあるPCR産物は切断部位を有し、変異のないPCR産物は切断部位を有しない）により得られるバンドの長さの相違を定量し、T3271Cの点変異率を測定することができる。
　このようにして得られた総タウリン修飾率および正常タウリン修飾率は、本発明において老化の指標とすることができる。健常者は、総タウリン修飾率と正常タウリン修飾率がほぼ同一であるので、総タウリン修飾率を老化の指標とすることができる。
　総タウリン修飾率１００％は、タウリン年齢の観点からは若年と判断することができる。
　MELAS患者の解析結果では、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下は、患者の暦年齢と一定の相関関係を有することが今回新たに示された（図２）。また、健常者の解析結果においても、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下が、患者の暦年齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による生体機能の状態と一定の相関関係を有することが今回新たに示された（図８）。上記結果は、tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、健常者、ミトコンドリア病者を問わず、ミトコンドリアの老化のバイオマーカーとして用いることができることを示している。さらに、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、ミトコンドリア自体の老化や機能低下の指標として用いることができることは言うに及ばず、生体、器官(臓器)、組織、細胞、或いは、細胞内小器官の機能、とりわけ、生体やエネルギー需要の高い器官(臓器)、組織、細胞、或いは、細胞内小器官の老化や機能低下の指標としても有用であることを示している。
　加えて、稀に、健常者、MELAS患者のいずれにおいても暦年齢と相関しない正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の例が認められることから、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、単に、被験者の加齢に伴う老化の指標となるだけでなく、栄養状態や代謝異常など疾患の有無なども含めた被験者の健康状態を反映した身体機能全般の老化の指標、或いは、健康寿命、とりわけ、特定死因を含まない健康寿命の指標としても利用できることを示している。
　また、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、被験者が健常か未病の状態かの判定や被験者の生活改善や治療の要否の判定、それらの補助方法において用いるバイオマーカーとしても有用である。
　また、MELAS患者のみでなく、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)の一塩基置換(A3243G)を有する糖尿病患者でもタウリン投与の有効性が確認されており、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が、革新的な新規バイオマーカーとして、現在開発が進行中のこれらミトコンドリア病患者に対するタウリン療法の対象者の選定やその治療効果判定に用いるコンパニオン診断用途やその補助にも有用であることを示している。
老化の判定薬
　本発明の老化の判定薬に含まれる、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０～２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーは、「老化の測定方法」に記載のプライマーと同様である。
　プライマーは、凍結乾燥した状態で含まれてもよく、医薬上許容されうる担体とともに溶液状で含まれていてもよい。
　医薬上許容されうる担体としては、本発明の判定薬を液剤として調製する場合、製剤素材として慣用されている各種担体、例えば希釈剤、溶剤、溶解補助剤、等張化剤、緩衝剤などを含んでいてもよい。
　希釈剤としては、水、生理用食塩水などがあげられる。
　溶剤としては、水、生理用食塩水、エタノールなどがあげられる。
　溶解補助剤としては、シクロデキストリン類などがあげられる。
　等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの無機塩類、グリセリン、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物などがあげられる。
　緩衝剤としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液などがあげられる。
　これらの担体の配合比は、当業者が適宜決定することができる。
　プライマーは、使用直前まで凍結または氷上で保管しておくことが望ましい。
老化の判定キット
　本発明の老化の判定キットは、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０～２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーおよび逆転写酵素を含有する。
　本発明の老化の判定キットに含まれる、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０～２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーは、「老化の測定方法」に記載のプライマーと同様である。
　上記逆転写酵素の好ましい態様および具体例は、「老化の測定方法」において説明した通りである。
　本発明のキットはさらに、ヌクレオシド三リン酸、プライマー伸長反応用緩衝液、RNase阻害剤を含んでいてもよい。
　ヌクレオシド三リン酸は、プライマーに組み込まれてプライマー伸長産物を構成する基質であり、通常dNTP混合物として使用される。dNTP混合物は、典型的には、dATP、dTTP、dCTPおよびdGTPからなる。
　必要に応じて、プライマー伸長を所望の部位で停止させるためのジデオキシヌクレオチド（ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP）を少なくとも1種含んでいてもよい。
　前記緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられる緩衝液があげられ、そのｐＨも特に限定されないが、通常５～９の範囲が好ましい。
　前記RNase阻害剤は、「老化の測定方法」に記載のRNase阻害剤と同様である。
　本発明のキットには、上記プライマー等に加えて、反応容器、プライマーを希釈するための緩衝液、陽性対照（例、正常人由来サイブリッド細胞RNA：Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(20):7127-7132参照）、陰性対照（例、MELAS患者由来サイブリッド細胞RNA：Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(20):7127-7132参照）、プロトコールを記載した指示書などをさらに含んでもよい。
ミトコンドリアtRNA Leu(UUR) のタウリン修飾率の改善剤
　加齢による正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下がタウリンの投与により改善できることから、試験例２の結果は、タウリンおよびそれを含有する組成物が、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善用、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下の予防用、とりわけ、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)の加齢により低下したタウリン修飾率の改善用の医薬品、医薬部外品、化粧品、或いは、食品として有用であることを示している。
　本発明の改善剤は、タウリンを有効成分として含有する。タウリンは、アミノエチルスルホン酸または２－アミノエタンスルホン酸ともいう。タウリンは、常法に従って有機合成されたものであってもよく、動植物から抽出単離された天然物であってもよい。
　タウリンは、生体内でタウリンとして作用する限りにおいては、タウリン誘導体の形態であってもよい。タウリン誘導体としては、Ｎ－メチルタウリン、Ｎ、Ｎ－ジメチルタウリン、Ｎ、Ｎ、Ｎ－トリメチルタウリン、グアニジノエタンスルホン酸、グアニジノエタンスルフィン酸、Ｎ－（２－アセタミド）－２－アミノエタンスルホン酸、ピペラジノ－Ｎ,Ｎ'－ビス（２－エタンスルホン酸）、Ｎ－［１'－アザ－シクロヘプタン－２'－イル］－２－アミノエタンスルホン酸、Ｎ－［１'－アザ－シクロペンタン－２'－イル］－２－アミノエタンスルホン酸、Ｎ－［１'－アザ－シクロヘプタン－２'－イル］－３－アミノプロパンスルホン酸、Ｎ－［１'－アザ－シクロペンタン－２'－イル］－３－アミノプロパンスルホン酸、２－アミノエチルホスホン酸、３－アミノプロピオン酸、エタノールアミン－Ｏ－サルフェート、アミノメタンスルホン酸、ホモタウリン、ピリジン－３－スルホン酸、ピペリジン－３－スルホン酸、アニリン－２－スルホン酸、（±）－２－アミノシクロヘキサンスルホン酸、２－アミノシクロペンタンスルホン酸、キノリン－８－スルホン酸、１,２,３,４－テトラヒドロキノリン－８－スルホン酸、３－アミノ－ビシクロ［２.２.１］ヘプタン－２－スルホン酸、６－アミノメチル－３－メチル－４－１,２,４－ベンゾチアジアジン－、１－ジオキサイド（ＴＡＧ）、グリシン、レチニリデンタウリン（ＴＡＵＲＥＴ）３－アセタミド－１－プロパンスルホン酸Ｃａ塩（ＡＣＡＭＰＲＯＳＡＴＥ）、５－タウリノメチルウリジン、５－タウリノメチル－２－チオウリジン、イセチオン酸、システインスルホン酸、リトラロン、２－アミノ－３－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸、Ｎ－（２,３－ジヒドロキシ－ｎ－プロピル）タウリン、デカノイルサルコシルタウリンなどがあげられる。
　本発明の改善剤を被験者に投与または摂取させることによって、投与または摂取前と比べて、該被験者におけるタウリン修飾率が改善される。ここで、改善されるタウリン修飾率とは、上述した式（１）で表される総タウリン修飾率および／または、上述した式（２）で表される正常タウリン修飾率である。
　かかる目的のため、本発明の改善剤は、タウリン単独で、あるいは賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デンプン、シクロデキストリン等）、場合によっては、香料、色素、調味料、安定剤、保存剤等も含有し、錠剤、丸剤、顆粒、細粒、粉末、ペレット、カプセル、溶液、乳液、懸濁液、シロップおよびトローチ等に製剤化して、医薬、医薬部外品、化粧品または食品（好ましくは、保健機能食品）もしくは食品添加物として用いることができる。また、本発明の改善剤は、研究用試薬として用いることもできる。
　本発明の改善剤に含まれるタウリンの量は、本発明の効果を奏する限り特に限定されるものではないが、通常０．０００１～１００重量％であり、好ましくは０．００１～９９．０重量％である。
　タウリンの有効量は、１日当たり体重１ｋｇ当たりのタウリンの量として表すことができる。推奨される有効量としては、０．０１～１．０ｇ/ｋｇ体重/日であり、好ましくは０．０２～０．５ｇ/ｋｇ体重/日である。
　本発明の改善剤を医薬として用いる場合、有効量のタウリンおよび医薬として許容されうる担体を含有することが好ましい。
　医薬として許容されうる担体としては、例えば、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、軽質無水ケイ酸等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク等）、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、マクロゴール類、ショ糖脂肪酸エステル等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エステル等）などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
　本発明の改善剤は、動物（例、哺乳動物、鳥類、魚類等）に対して、経口的あるいは非経口的に安全に投与することができる。
　本発明の改善剤は、食品としてまたは食品添加物として、摂取することもできる。本発明の「食品」は、食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定される特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品をも含むものであり、ヘルスクレームや健康強調表示をした食品であってもよく、さらにサプリメント、飼料・餌料等も本発明の食品に包含される。
　食品用途の場合、タウリンを、例えば、清涼飲料、パン、菓子等の一般食品（いわゆる健康食品を含む）に含有させて用いることもできる。また、タウリンを、賦形剤（例えば、乳糖、ショ糖、デンプン等）、場合によっては、香料、色素等と共に、錠剤、丸剤、顆粒、細粒、粉末、ペレット、カプセル、溶液、乳液、懸濁液、シロップおよびトローチ等に製剤化して、特定保健用食品や栄養機能食品等の保健機能食品、サプリメントとして用いることができる。また、本発明の食品および食品添加物は、飼料・餌料用途にも適用することができ、家禽や家畜等には、通常の飼料・餌料に添加して摂取または投与することができる。
　食品または飼料・餌料として摂取する場合、食品または飼料・餌料の１日当たりの摂取回数および１回当たりの摂取量の目安を概算し、１日摂取量を規定した上で１日摂取量の食品または飼料・餌料に含まれるタウリンの量を決定する。タウリンの含有量は、後述する用量に基づいて決定することができる。
　本発明の改善剤の摂取または投与量は、摂取または投与対象の年齢、体重、健康状態によって異なり、一概に決定することはできない。例えば、健康の維持、増進または改善を目的とする場合は、通常、ドリンク剤などの医薬部外品、食品または化粧品の形態にして、一方、タウリン修飾率の低下に起因する障害の治療や健康回復を目的とする場合には、通常、医薬品、医薬部外品または食品の形態にして、タウリンとして、成人１日当たり０．４～４０ｇ、好ましくは０．８ｇ～２０ｇ、より好ましくは４．０～１５gを１日１回から数回に分けて摂取または投与することが好ましい。なお、体重が４０kg以下の場合には、通常、１日当たり０．３～３０ｇ、好ましくは０．６ｇ～１５ｇ、より好ましくは３．０～１２gを１日１回から数回に分けて摂取または投与することが好ましい。
　本発明の改善剤（医薬）の投与方法としては、タウリン修飾率の低下に対する予防的および治療的な効果が得られる経路であれば特に限定されない。例えば、非経口的投与（静脈内投与、筋肉内投与、組織内直接投与、鼻腔内投与、皮内投与、経皮投与、腹腔内投与、胃瘻、経管投与、経腸栄養投与など）または経口投与により投与することができ、特に、該医薬をヒトに適用するには、静脈内、筋肉内または経口投与によって投与することができる。また、剤型としても特に制限されることなく、各種投与剤型、例えば、経口剤（顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、ドリンク剤など）、注射剤、点滴剤、外用剤（経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤など）として投与することが可能である。外用剤（経皮製剤、軟膏剤など）は、医薬部外品または化粧品として投与することも可能である。
　本発明のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善剤は、ミトコンドリア病を発症した患者、好ましくは、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損遺伝子変異によりミトコンドリア病を発症した患者、より好ましくは、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれるいずれかの点変異に起因するミトコンドリア病を発症した患者、特に好ましくは、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）の点変異に起因するミトコンドリア病を発症した患者、とりわけ、MELASや糖尿病を発症した患者において、またはそれらの発症リスクを有する対象において、加齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による生体機能の状態などにより低下したミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善剤として用いられてもよい。さらに、本発明の改善剤は、これらの対象や患者おいて、加齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による生体機能の状態などによるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下の予防剤として用いられてもよい。また、本発明のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の改善剤は、異常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善のみでなく、タウリン修飾率が低下した正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善ができる点がとりわけ有用である。
　以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。
血液試料
　治験に参加したMELAS患者から書面によるインフォームドコンセントを得て、患者血液を採取した。採取した血液から、Isogen（ニッポンジーン製）を用いて、製造業者の指示書に従って粗RNAを得た。
　患者血液の取り扱いについては、川崎医科大学での倫理規定にも従った。
実施例１　逆転写反応によるミトコンドリアtRNA Leu(UUR) のタウリン修飾の検出
　基本的には、桐野らの方法（Proc Natl Acad Sci U S A. 2005; 102(20): 7127-7132）に準じて行った。桐野らによるプライマー伸長法の原理を図１に示す。
　使用したプライマーの塩基配列は、以下の通りである。
5’-acctctgactgtaaag-3’（配列番号３）
　予想される２種のプライマー伸長産物の塩基配列は、以下の通りである。
5’-acctctgactgtaaagTTTTAAG-3’（配列番号６：プライマーから伸長した配列を大文字で示す）
5’-acctctgactgtaaagTTTTAG-3’（配列番号７：プライマーから伸長した配列を大文字で示す）
　上記プライマーおよびプライマー伸長産物の5’末端は、本実施例においては32Pで標識されている。
（逆転写反応）
　被験者白血球から得たRNA（0.2～1μg）を鋳型として、tRNALeu(UUR)のアンチコドンの3'側に相当する32P 標識プライマー（配列番号３、0.1pmol）と80℃で2分間インキュベートした後、室温で１時間静置することにより、プライマーをアニーリングさせた。その後、逆転写酵素用反応緩衝液（Invitrogen製）中、dATP、dTTP、ddGTP（各1.5mM、AmershamPharmacia製）を添加し（最終濃度37.5μM）、M-MuLV Reverse transcriptase（RNase H-）1μL（40 units/μL、Invitrogen製）を混合し、42℃で１時間逆転写反応を行なった。T3271C変異を有するMELAS患者の場合は、配列番号３および配列番号４で示される32P 標識プライマー（混合プライマー、0.1pmol）を用いた。
　反応終了後、反応混合物を、7M尿素を含む15%ポリアクリルアミド電気泳動に供した。RIで標識されたバンドを、BAS5000バイオイメージングアナライザー（富士フィルム製）で可視化した。
　アンチコドン（1文字目U：図１中、下線で示す）にタウリン修飾が欠損する(5U34)と反応はAAGまで、タウリン修飾が存在する(τm5U34)と反応はAGで停止する。このRI標識反応物を電気泳動で分離してBAS5000バイオイメージングアナライザー（富士フィルム製）で定量し、総タウリン修飾率を求めた。結果を図２に示す。
　医師主導治験に参加したMELAS患者はA3243G変異またはT3271C変異を有するため、これらの点変異率を以下のようにして求めた。後藤らのPCR-RFLP法を一部改変して行った（Goto Y. et al.: A new mtDNA mutation associated with mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes (MELAS). Biochimica et Biophysica Acta 1097: 238-240 (1991)）。A3243G変異の検出については、
For: 5’-gcccttcccccgtaaatgatat-3’（配列番号８）および
Rev: 5’-gaagaggaattgaacctctgactg-3’（配列番号９）の2本のプライマーでPCRを行い、増幅したPCR産物を制限酵素のApaIで切断した。正常mtDNAでは、制限酵素ApaIの切断部位がないため136 bpのバンドが１本であるのに対し、A3243G変異では、ApaIの切断部位があるため、切断されて84 bp、52 bpの２本のバンドが現れる。T3271C変異については、
For: 5’-taagaagaggaattgaacctctgaccttaa-3’ （配列番号１０）および
Rev: 5’-aggacaagagaaataaggcc-3’（配列番号１１）の2本のプライマーでPCRを行い、増幅したPCR産物を制限酵素のAflIIで切断した。正常mtDNAでは、制限酵素AflIIの切断部位がないため170 bpのバンドが１本であるのに対し、T3271C変異では、AflIIの切断部位があるため、切断されて140 bp、30 bpの２本のバンドが現れる。
　上記制限酵素で切断したPCR産物を、15%ポリアクリルアミド電気泳動に供し、分離したバンドを臭化エチジウムで染色し、デンシトメーターを用いてバンドの強度を定量し、点変異率を求めた（表１）。
　上記総タウリン修飾率および点変異率を用いて、MELAS患者の正常タウリン修飾率を求めた。結果を図２に示す。
試験例１　血中および髄液中の乳酸値およびピルビン酸値の測定
　血液中および髄液中の乳酸値の測定は、L-乳酸に乳酸オキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を、パーオキシダーゼの存在下で生じる色素を比色測定することにより定量した。
　ピルビン酸値の測定は、ピルビン酸にピルビン酸オキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を、パーオキシダーゼの存在下で生じる色素を比色測定することにより定量した。
結果
　治験参加MELAS患者の血中白血球におけるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率を測定し、被験者の年齢を横軸にプロットしてグラフ化した。その結果、総タウリン修飾率と年齢とは相関がなかったのに対し、正常タウリン修飾率は、年齢依存性に低下した（図２）。一方、正常タウリン修飾率は、従来のミトコンドリア病マーカーとされる、血中および髄液乳酸値、乳酸/ピルビン酸比とは相関しなかったし、被験者の年齢と従来のミトコンドリア病マーカーとも相関しなかった（図３－６）。
試験例２　MELAS患者へのタウリン投与によるタウリン修飾率の改善
　上記医師主導治験において、MELAS患者にタウリンを投与した。投与量は、体重40kg以上の被験者の場合12g/日、25kg以上40kg未満の場合9g/日で、投薬期間は52週（１年間）であった。タウリン投与終了日（52週）に被験者から血液を採取し、実施例１に記載の方法に従って総タウリン修飾率および正常タウリン修飾率を測定した。結果を実施例1で求めた投与開始日（開始前0週）のデータと併せて図７に示す。また、個々のMELAS患者の、タウリン投与開始日および投与終了後の総タウリン修飾率、正常タウリン修飾率および点変異率をまとめて表1に示す。総タウリン修飾率をタウリン投与前と投与後とで比較した結果、有意差傾向があった（P＝0.0546）。タウリン内服により、正常タウリン修飾率が回復し、変異mtDNAに由来するtRNALeu(UUR)のタウリン修飾も改善することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　実施例１および試験例２の結果は、ミトコンドリアの正常tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が加齢に伴い低下し、タウリン内服によりその低下したタウリン修飾率が上昇することを示している。さらに、正常tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が100%を超える症例があることは、タウリン内服により変異tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率も改善していることを示している。
　これまで、MELASの発症原因は変異tRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損にあると考えられてきたが、この結果は、MELASの発症に加齢に伴う正常tRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下が関与していることを示している。
　周知のようにMELAS患者においてtRNALeu(UUR)のタウリン修飾機能自体に欠損はない。
　実施例1で認められた現象は、MELAS患者の解析結果ではあるが、健常者でも同様に発生する現象を反映していると言える。つまりtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率はミトコンドリアの老化のバイオマーカーとして用いることができることを示している。
　また、老化に伴いミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が低下すれば、当然、UUGコドン特異的な翻訳能が律速と成って、UUGコドンを含むタンパク質全般の合成が低下する。それに伴い、呼吸・エネルギー代謝に重要な機能を果たすミトコンドリアの機能が低下し、生体やそれを構成する器官等の機能が低下するのは明らかであり、さらに修飾率の低下が進行すれば、例えば、高齢者に認められる呼吸困難や骨格筋の減弱のような重篤な症状を発症するに至る場合もあると考えられる。
　従って、実施例１および試験例の結果は、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、ミトコンドリア自体の老化や機能低下の指標として用いることができることは言うに及ばず、生体、器官(臓器)、組織、細胞、或いは、細胞内小器官の機能、とりわけ、生体やエネルギー需要の高い器官(臓器)、組織、細胞、或いは、細胞内小器官の老化や機能低下の指標としても有用であることを示している。加えて、試験例２の被験者年齢１４の患者のように暦年齢に比して正常タウリン修飾率の低い例や被験者年齢４６の患者のように暦年齢が比較的高いにも関わらず正常タウリン修飾率が比較的高い例が認められることや、後述の試験例４の若年健常者の正常タウリン修飾率にかなりの幅があることから、正常タウリン修飾率は、単に、被験者の加齢に伴う老化の指標となるだけでなく、栄養状態や代謝異常など疾患の有無なども含めた被験者の健康状態を反映した老化の指標、或いは、健康寿命、とりわけ、特定死因を含まない健康寿命の指標としても利用できることを示している。
　さらに、加齢などによる老化に伴う正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下がタウリンの投与により改善できることから、試験例２および後述の試験例３の結果は、タウリンおよびそれを含有する組成物が、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善用、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下の予防用、とりわけ、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)の加齢により低下したタウリン修飾率の改善用の医薬品、医薬部外品、化粧品、或いは、食品として有用であることを示している。
試験例３　糖尿病患者へのタウリン投与による糖尿病マーカーの改善
　試験例２では、ミトコンドリア遺伝子の一塩基変異(A3243G)によるMELAS患者において、タウリン投与により病状の改善が認められたので、同じミトコンドリア遺伝子の一塩基変異(A3243G)に起因する糖尿病に対するタウリン投与の治療効果を確認した。具体的には、ミトコンドリア遺伝子の一塩基変異(A3243G)による糖尿病と診断され、心筋症を併発した患者(49歳 女性)に、タウリン(商品名　タウリン散98%「大正」、大正製薬株式会社製)を、毎日経口投与した。投与は、タウリンとして４g/回、３回/日(12g/日)で、投薬期間は約１年間であった。当該患者より、タウリン投与開始から終了まで経時的に血液を採取し、糖尿病マーカーであるヘモグロビンA1c(HbA1c)の値を測定したところ、開始時には7.7%あった値が、投与開始２３週目(約５カ月目)には6.9%に低下し、投与終了時には6.8%になった。上記結果が示すように、当該患者のHbA1cの値を、タウリン投与期間中を通じて、糖尿病の合併症を予防するための目標値である７％未満にコントロールした。さらに、タウリン投与開始時には１２単位必要であったインスリン投与を、投与終了時には9単位にまで低減することができ、タウリン内服により、ミトコンドリア遺伝子変異による糖尿病患者の症状改善が出来ることを確認した。
　後述の試験例４から明らかなように、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の加齢や、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による生体機能の状態による低下は、MELASに限定されるものではなく健常者においても普遍的な現象であるので、ミトコンドリア遺伝子変異による糖尿病発症のメカニズムは、MELASの場合と同様に、異常ミトコンドリアtRNALeu(UURに加えて、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下によるものと考えられる。従って、当該糖尿病の場合でも、タウリンの投与による異常ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善に加えて、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が改善したことにより、臨床症状が改善したものと考えることができる。
　試験例４　健常者における正常なミトコンドリアtRNA Leu(UUR) のタウリン修飾率の測定
　試験例２において、MELAS患者で確認された正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が加齢に伴い低下することが確認されたので、健常者でも同様に、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が加齢に伴い低下することを、試験例２と同様の方法により確認した。その結果を図８に示す。実施例１に記載の方法に従った、若年（10代）および老年（80代）健常人各々３名の末梢血白血球検体を用いた解析では、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)修飾率は、若年者（10代）平均56.7±12.6% (Mean±SE)と比較して、高齢者（80代）では35.8±3.0%と、加齢による有意な低下が認められた。また、若年者間で比較した場合、かかる修飾率は約80%～約40%と約２倍程度の幅が認められることから、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の低下は、加齢のみでなく、遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による生体機能の低下をも反映していると考えられる。この結果は、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、MELAS患者のみでなく健常者においても、有用な老化のバイオマーカーとして用いることができることを示している。
　上記試験例は、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が、ミトコンドリア病患者、健常者を問わず、普遍的に、加齢あるいは遺伝的要因や生活・環境要因などの影響による老化に伴い低下することを示している。
　また、前記タウリン修飾率の低下が、タウリン投与により改善することが確認されたため、本発明のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾改善剤は、健常者はもとより、未病の対象や何らかの疾患を発症するリスクを有する対象、さらには、何らかの疾患を有する患者、とりわけ、ミトコンドリア病患者やその発症リスクを有する対象における、老化に伴うミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下、特に、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率低下の改善や予防に有用である。
　さらに、正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、バイオマーカーとして、現在開発が進行中のミトコンドリア病患者に対するタウリン療法の対象者の選定や、その治療効果判定に用いるコンパニオン診断用途やその補助にも有用である。
処方例１　顆粒剤（１包中）
タウリン　　　　　　　　　　　　　　　３０００ｍｇ
アスパルテーム　　　　　　　　　　　　　　　９ｍｇ
タルク　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０ｍｇ
低置換ヒドロキシプロピルセルロース　　　　６０ｍｇ
常法により、上記処方からなる顆粒剤を調製した。
処方例２　内服用液剤（1剤中）
ケイヒ　　　　　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
ローヤルゼリー　　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
タウリン　　　　　　　　　　　　　　　５０００ｍｇ
７０％ソルビトール液　　　　　　　　　１０００ｍｇ
エリスリトール　　　　　　　　　　　　１０００ｍｇ
ｐＨ調整剤　　　　　　　　　　　　　　　　　　適量
精製水を加えて全量を１８０ｍＬとする。
常法により、上記処方からなる内服用の液剤を調製した。
処方例３　ドリンク剤（１剤中）
ビタミンB1硝酸塩     　　　　　　　　　　 １０ｍｇ
ビタミンＢ2             　　　　　　　　　　２ｍｇ
塩化カルニチン      　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
タウリン          　　　　　　　　　　４０００ｍｇ
パントテン酸ナトリウム　　　　　　　　　　１０ｍｇ
安息香酸                    　　　　　　　２０ｍｇ
パラオキシ安息香酸ブチル  　　　　　　　２．５ｍｇ
アスパルテーム　　　　　　　　　　　　　　　６ｍｇ
クエン酸                　　　　　　　　１００ｍｇ
グリシン                  　　　　　　　３００ｍｇ
精製水を加え全量を５０ｍＬとする。
常法により、上記処方からなるドリンク剤を調製した。
　本発明者らは、ミトコンドリアtRNAの中でも、正常なtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率が老化の指標となることを見出した。正常なtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率は、ミトコンドリア病患者のみならず健常人の状態を把握することのできるユニバーサルマーカーである。タウリンは、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)の加齢や、例えば、強度疲労などの生活・環境要因や遺伝的要因などの影響等により低下したタウリン修飾率の改善用の医薬品、医薬部外品、化粧品、或いは、食品として有用である。
　以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正および変更も、すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
　本発明は、日本で出願された特願２０１６－０６２９１０（出願日：２０１６年３月２６日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (19)

  1. 　被験者から単離した生体試料におけるミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の程度を、該tRNALeu(UUR)を鋳型としてプライマーからの逆転写反応により測定する工程を含む、被験者の老化の測定方法。
  2. 　プライマーが鋳型に相補的な１０～２５塩基長からなるオリゴヌクレオチドであり、タウリン修飾の有無によるプライマー伸長産物の相違を検出する、請求項１に記載の方法。
  3. 　プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　タウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物と、タウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物との量比を算出する工程をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
     （式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）で表される総タウリン修飾率を老化の指標とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　被験者が、tRNALeu(UUR)遺伝子コード領域のA3243G、T3271C、G3244A、T3258CおよびT3291Cからなる群より選ばれる一塩基置換を有する変異ミトコンドリアDNAを有すると疑われる者であり、前記式（１）に続いて、下記式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
     （上記式中、mtDNA点変異率は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い点変異率を示す）により求めた正常タウリン修飾率を老化の指標とする、請求項５に記載の方法。
  7. 　ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０～２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーを含有する、老化の判定薬。
  8. 　プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、請求項７に記載の判定薬。
  9. 　ミトコンドリアtRNALeu(UUR)に相補的な１０～２５塩基からなる塩基配列を含むプライマーおよび逆転写酵素を含有する、老化の判定キット。
  10. 　プライマーが配列番号３、４および５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を含む、少なくとも１種である、請求項９に記載のキット。
  11. 　タウリンを有効成分として含有する、ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善剤。
  12. 　ミトコンドリアtRNALeu(UUR)が正常なミトコンドリアtRNALeu(UUR)である、請求項１１に記載の改善剤。
  13. 　タウリン修飾率の改善が下記式（１）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
     （式中、τｍ５Ｕはタウリン修飾を有するtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示し、Ｕはタウリン修飾を有しないtRNALeu(UUR)からのプライマー伸長産物の量を示す）により求めた総タウリン修飾率、および／または
    下記式（２）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
     （上記式中、mtDNA点変異率は、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異の中で最も高い点変異率を示す）により求めた正常タウリン修飾率の改善である、請求項１１または１２に記載の改善剤。
  14. 　医薬または化粧品である、請求項１１または１２に記載の改善剤。
  15. 　保健機能食品または食品添加物である、請求項１１または１２に記載の改善剤。
  16. 　ミトコンドリア病を発症した患者、および／または発症リスクを有する対象のミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾率の改善用である、請求項１１～１５のいずれか１項に記載の改善剤。
  17. 　ミトコンドリア病がミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損遺伝子変異に起因する、請求項１６に記載の改善剤。
  18. ミトコンドリアtRNALeu(UUR)のタウリン修飾の欠損遺伝子変異が、配列番号１で表されるtRNALeu(UUR)をコードするDNAにおいて、14位のA（A3243G）、15位のG（G3244A）、29位のT（T3258C）、42位のT（T3271C）および62位のT（T3291C）からなる群より選ばれる点変異である、請求項１７に記載の改善剤。
  19. 　ミトコンドリア病が、MELASあるいは糖尿病である、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の改善剤。
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PCT/JP2017/012205 WO2017170300A1 (ja) 2016-03-26 2017-03-25 老化を反映するミトコンドリアバイオマーカー

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