WO2017142372A1 - 알칼리 저항성이 증대된 항체 친화성 리간드 - Google Patents

알칼리 저항성이 증대된 항체 친화성 리간드 Download PDF

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송영하
신철수
김현국
전옥선
김명화
유종길
유진희
김지은
진소리
정창구
김도균
유영선
박제현
홍민선
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    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic

Definitions

  • the present invention relates to antibody affinity ligands used for the purification of antibodies, and more particularly to increased resistance to alkalis while maintaining affinity to antibodies, which makes them more suitable and more suitable for column processes running under alkaline conditions. It is directed to providing economical antibody affinity ligands.
  • antibody affinity ligands made of Protein A, a membrane protein of Staphylococcus aureus .
  • Protein A has five domains (E, D, A, B and C) and X domain (C-terminal cell-wall-binding region, FEMS Immunol) having high affinity for a specific portion of the antibody, ie the Fc region.
  • E, D, A, B and C domains
  • X domain C-terminal cell-wall-binding region, FEMS Immunol
  • monoclonal antibodies produced by animal cells and the like are adsorbed to the protein A ligand bound to the chromatographic resin, and then separated under low pH conditions.
  • impurities nucleic acid, fat, Protein, etc.
  • CIP process to regenerate the column.
  • protein A is urgently needed to be resistant to alkaline conditions, and various methods have been devised to overcome the weakness of alkaline conditions.
  • the most popular and used products are GE's 'Healthcare' 'MabSelect SuRe'.
  • the present invention aims to develop and provide a technique capable of further increasing alkali resistance in various ligands developed on the basis of protein A or five domains (E, D, A, B, and C) therein.
  • the present invention relates to an Fc region binding ligand of an antibody in which at least one of the A, B, C, and D domains of protein A is formed by linking at least one of the domains of any one of the A, B, C, and D domains.
  • F phenylalanine
  • N asparagine
  • K lysine
  • the Fc region binding ligand of the antibody of the present invention is, for example, the second side toward the N-terminus of the FNK sequence in any one of the A, B, C, and D domains.
  • Asparagine (N) an amino acid present in front, may be substituted with alanine (A).
  • the Fc region binding ligand of the antibody of the present invention is preferably formed by linking a plurality of A domains. At this time, more preferably, four or five A domains are connected to each other.
  • the Fc region binding ligand of the antibody formed by connecting a plurality of A domains is further substituted with another amino acid, asparagine (N), which is the 23rd amino acid from the N-terminus, From the N-terminus, glycine (G), the 29th amino acid, is substituted with another amino acid, and asparagine (N), the 43rd amino acid, from the N-terminus is preferably substituted with another amino acid.
  • N asparagine
  • G the 29th amino acid
  • asparagine (N), the 23rd amino acid from the N-terminus, is substituted with threonine (T), and glycine (G), the 29th amino acid, from the N-terminus, is substituted with alanine (A), and the N-terminus Asparagine (N), the 43rd amino acid from, is preferably substituted with glutamic acid (E).
  • the whole or part of the X domain is preferably bound to the C-terminus of the Fc region binding ligand of the antibody.
  • productivity can be greatly improved by attaching the X domain or some sequence thereof to the C-terminus of the A, B, C or D domain.
  • 1 is a result of N-terminal sequence analysis of the degradation pattern and the degradation band according to 0.8M NaOH treatment of protein A.
  • Figure 2 shows protein A (labeled 'PA' in Figure 2), A4 domain (labeled 'A4' in Figure 2), A5 domain (labeled 'A5' in Figure 2), Z4 domain ('Z4 in Figure 2) And treated with 0.5 M NaOH for 5.1 hr each, followed by development of SDS-PAGE.
  • FIG. 3 shows the expression level of 'A5-X ligand' with X domain linked to A4, A5 and A5 domains.
  • Figure 5 shows the results of the alkali resistance comparison experiment (0.8M NaOH 1 hour treatment) of the three ligands and the control group PA (protein A) by SDS PAGE picture.
  • the present invention relates to an Fc region binding ligand of an antibody in which at least one of the A, B, C, and D domains of protein A is formed by linking at least one of the domains of any one of the A, B, C, and D domains.
  • F phenylalanine
  • N asparagine
  • K lysine
  • the Fc region binding ligand of the antibody for example, in any one of the A, B, C, D domain, asparagine (N) which is an amino acid present in the second front toward the N-terminal end of the FNK sequence It may be substituted with alanine (A).
  • the amino acid present in the first and amino acid present in the first toward the N-terminal end of the 'FNK sequence' present on the A, B, C, D domain of protein A It was confirmed that the decomposed by the alkali, and by replacing the amino acid present in the first or second amino acid from the wild type amino acid to other amino acids it could be confirmed that the resistance to alkali can be increased.
  • the Fc region binding ligand of the antibody of the present invention may be formed by connecting a plurality of A domains.
  • the Fc region binding ligand of the antibody is preferably formed by connecting four or five A domains.
  • the Fc region binding ligand of the antibody formed by linking one or more A-domains is additionally, asparagine (N, 23rd amino acid from the N-terminus of the A-domain).
  • asparagine N, 23rd amino acid from the N-terminus of the A-domain.
  • G glycine
  • N asparagine
  • glycine (G) which is the 29th amino acid from the N-terminus
  • N which is the 43rd amino acid from the N-terminus
  • glutamic acid may be, for example, substituted with glutamic acid.
  • the Fc region binding ligand of the antibody of the present invention preferably, the whole or part of the X domain may be bound to the C-terminus.
  • the whole or part of the X domain is connected to the C-terminal of the A, B, C, D domain, it was confirmed that the productivity of the domain is improved.
  • Protein A was reacted with 0.8 M NaOH for 60 minutes and then developed by SDS-PAGE. Then, the decomposed bands were identified in SDS-PAGE, and the N-terminal amino acids of the decomposed bands (1, 2, and 3 bands in FIG. 1) were analyzed to identify E, D, A, B, and C domains of protein A. Compared with.
  • Figure 1 shows the 0.8M NaOH degradation pattern of protein A and the N-terminal sequence analysis of the degraded band.
  • the N-terminal sequence and each domain of the decomposed band as shown in FIG. 1, in the 1, 2, and 3 bands on the SDS-PAGE, the 2nd to 4th amino acids on the N-terminal side were each consecutive FNK sequence. It was confirmed by the sequence.
  • the present inventors infer that the presence of this particular sequence 'FNK' may be associated with alkali sensitivity, and that it may be possible to increase alkali resistance through modification of the N-terminal front amino acid of the sequence.
  • the following experiments were conducted.
  • the alkaline decomposition pattern was confirmed by the same method as in Experimental Example 1, and IgG binding activity was also measured.
  • FIG. 2 shows protein A (labeled 'PA' in Figure 2), A4 domain (labeled 'A4' in Figure 2), A5 domain (labeled 'A5' in Figure 2), Z4 domain ('Z4 in Figure 2) And treated with 0.5 M NaOH for 5.1 hr each, followed by development of SDS-PAGE.
  • A4 domain labeled 'A4' in Figure 2
  • A5 domain labeleled 'A5' in Figure 2
  • Z4 domain 'Z4 in Figure 2
  • IgG binding capacity in the relatively low concentration of alkaline conditions (0.1M NaOH, 0.3M NaOH) showed similar levels of the protein A, A4, Z4 domains.
  • the adsorption capacity for antibodies began to differ from the high alkaline conditions of 0.5 M NaOH, and the protein A, A4 and A5 domains showed low antibody adsorption capacity at 0.5 M NaOH / 24hr treatment, while the Z4 domain was relatively high. Adsorption capacity was shown.
  • Ligands of the A5-X domain were constructed, fermented and purified to determine the degree of alkali resistance by SDS-PAGE. 3 shows expression levels of A4, A5 and A5-X ligands.
  • the N-terminal NKFNKE position of the B domain and the C domain has the sequence of NNFNKE.
  • N asparagine
  • K lysine
  • the A (N4K) 5 domain (-> NKFNKE) was constructed and purified to test alkali resistance. As expected, treatment with 0.5 M NaOH for 10.2 hr or more resulted in complete degradation. This makes the alkali between the first amino acid ('K' in this experiment) and the second amino acid ('N' in this experiment) vulnerable to alkali towards the N-terminus of the FNK sequence. I could confirm the location.
  • the amino acid present in the second front and the amino acid present in the first is replaced with alanine (A) and lysine (K), respectively, to increase the alkali resistance to the N-terminal side of the 'FNK sequence'.
  • a (N3A, N4K) 5 ligand was prepared.
  • the ligand was newly designed to further increase alkali resistance to the ligand constructed in Example 1 by using the results of the previous research.
  • FIG. Figure 5 shows the results of the alkali resistance comparison experiment (0.8M NaOH 1 hour treatment) of the three ligands prepared above and the control PA (protein A) in SDS PAGE pictures. As shown in FIG. 5, it was found that the degree of degradation of A''5-X, A '' '5-X, and A' '' '' 5-X samples was lower than that of the control group, which showed high alkali resistance. (The lower the resolution, the dimer the band below the thick band).
  • A''5-X showed a lower degree of decomposition than A '' '5-X, indicating high alkali resistance
  • A' '' '-X showed the lowest degree of decomposition of A' '' '' 5-X, resulting in alkali resistance. This was confirmed to be the highest.
  • the antibody binding capacity was measured for the ligands used above, the results are shown in Table 2 below.
  • PA protein A
  • A5-X X domains combined with 5 A domains
  • A'5-X ligand N is replaced by K
  • the fourth amino acid N4K
  • the X domain is bound to five A domains in which the A''5-X ligand (N is the third amino acid is replaced by A (N3A) and N is the fourth amino acid is substituted by K (N4K) is bonded.
  • a '' '5-X ligand (N23T, G29A, N43E modified A domain with five A domains bound), A' '' '' 5-X ligand (N3A, 5 domains of N4K, N23T, G29A, and N43E modified to which the X domain is bound).

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Abstract

본 발명은 항체의 정제에 사용되는 항체 친화성 리간드에 관한 것으로, 프로테인 A의 A, B, C 또는 D 도메인에서, 'FNK 연속서열'의 N-말단 쪽으로 첫 번째 앞에 존재하는 아미노산과 두 번째 앞에 존재하는 아미노산 사이가 알칼리에 대해 취약성을 보이는 위치임을 구명하고, 이들 아미노산의 치환에 의해 IgG 결합능의 소실 없이 알칼리에 대한 저항성을 획득할 수 있음을 밝혀냈다.

Description

알칼리 저항성이 증대된 항체 친화성 리간드
본 발명은 항체의 정제에 사용되는 항체 친화성 리간드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항체에 대한 친화도를 유지하면서도, 알칼리에 대한 저항성이 증대되어, 알칼리 조건에서 실행하는 컬럼 공정에 더 적합하고 더 경제적인 항체 친화성 리간드를 제공하는 것에 관한 것이다.
현재 생산되고 있는 항체치료제 대부분은 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 세포막 단백질인 프로테인 A (Protein A)로 만들어진 항체 친화성 리간드를 이용하여 정제한다.
프로테인 A는 항체의 특정부분, 즉 Fc 영역(region)에 대해 높은 친화력을 지닌 5개의 도메인 (E, D, A, B 및 C) 및 X 도메인 (C-terminal cell-wall-binding region, FEMS Immunol Med Microbiol. 1998 Jan;20(1):69-78 ; J Bacteriol. 1984 Aug; 159(2): 713719)으로 이루어져 있다.
프로테인 A의 전체 아미노산 서열은 1984년에 Uhlen 등이 밝혀냈으며 (The Journal of Biological Chemistry, 259, 1695-1702), 1966년에 Forsgren, Sjoquist 등은 인간 IgG 서브클래스 1, 2의 Fc 부위가 프로테인 A에 결합하는 것으로 보고하였다 (J Immunol 1966 97:822-827). 1986년에 Moks 등은 프로테인 A의 5개 도메인은 56~61개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 각각 IgG의 Fc 부위에 결합하는 것으로 보고하였다 (Eur J Biochem 156(3): 637-643).
한편, 동물세포 등에 의해 생산된 단클론 항체는 크로마토그래피 수지에 결합되어 있는 프로테인 A 리간드에 흡착된 후, 낮은 pH 조건하에서 분리되는데, 다시 0.1~0.5N NaOH의 높은 pH 조건으로 불순물(핵산, 지방, 단백질 등)을 제거한 후, 컬럼을 재생하는 CIP 과정을 거치게 된다.
그런데, 이와 같은 알칼리 조건의 반복적인 CIP 과정에서 항체 친화성 리간드의 전체 또는 일부가 수지로부터 떨어져 나와 제품을 오염시키는 치명적인 결과를 초래하거나, 리간드가 변성되어 목적하는 항체의 회수율이 낮아지는 문제가 발생한다. 결국 생산성이 낮아지게 되어 고가의 항체 친화성 리간드가 부착된 레진을 교체하여야만 하는 문제가 수반되는 것이다. 또한, 리간드의 유출 여부를 검출하기 위하여 별도의 프로테인 A 검출 키트를 사용하여 최종 제품에 포함되어 있을 수 있는 프로테인 A를 검출해야 하는 문제도 수반한다.
따라서, 프로테인 A는 알칼리 조건에 대해 저항성을 가질 필요가 절실한데, 알칼리 조건의 취약성을 극복하기 위한 다양한 방법들이 고안되어 왔다. 현재 시판되는 제품 중에서 가장 주목을 받고 사용되는 제품은 GE 'Healthcare'사의 'MabSelect SuRe'이다.
이 제품은 B 도메인 중 2개의 아미노산이 치환된 Z 도메인을 기반으로 한 것으로, 이들 중 일부 아미노산을 치환한 것이다 (FEMS Immunology and Medical Microbiology Volume 20, Issue 1, January 1998, Pages 6978). 또한, 상기 제품 외에 B 도메인과 높은 유사성을 보이는 C-도메인을 이용한 알칼리 저항성의 리간드도 개발되어 있다.
하지만, 기존에 개발된 제품들이 알칼리에 대해 어느 정도 저항성을 가지고 있다 하더라도, 비용 절감 및 생산성 향상을 위해서는 더 높은 알칼리 저항성을 가지면서 높은 항체 친화력이 유지되는 리간드를 개발할 필요가 있다.
본 발명은 프로테인 A 또는 그 내부의 5개 도메인 (E, D, A, B 및 C)을 기반으로 하여 개발된 여러 리간드에 있어서, 알칼리 저항성을 한층 증대시킬 수 있는 기술을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 프로테인 A의 A, B, C, D 도메인 중 어느 하나 이상의 도메인이, 하나 이상 연결되어 형성되는 항체의 Fc 영역 결합 리간드에 있어서, A, B, C, D 도메인 중 어느 하나의 도메인 상에 존재하는 것으로, 페닐알라닌(F), 아스파라긴(N), 리신(K)이 연속적으로 연결된 ‘FNK 연속서열’의 N-말단 쪽으로 첫 번째 앞에 존재하는 아미노산 또는 두 번째 앞에 존재하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 항체의 Fc 영역 결합 리간드를 제공한다.
상기 본 발명 항체의 Fc 영역 결합 리간드에 있어서, 상기 항체의 Fc 영역 결합 리간드는, 일 예로 상기 A, B, C, D 도메인 중 어느 하나의 도메인에 있어서, FNK 연속서열의 N-말단 쪽으로 두 번째 앞에 존재하는 아미노산인 아스파라긴(N)이 알라닌(A)으로 치환된 것일 수 있다.
상기 본 발명 항체의 Fc 영역 결합 리간드에 있어서, 상기 항체의 Fc 영역 결합 리간드는, 바람직하게 A 도메인이 복수 개 연결되어 형성된 것이 좋다. 이때, 더욱 바람직하게는 A 도메인이 4개 또는 5개 연결되어 형성된 것이 좋다.
상기 본 발명 항체의 Fc 영역 결합 리간드에 있어서, A 도메인이 복수 개 연결되어 형성된 상기 항체의 Fc 영역 결합 리간드는, 추가적으로, N-말단으로부터 23번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 다른 아미노산으로 치환되고, N-말단으로부터 29번째 아미노산인 글리신(G)이 다른 아미노산으로 치환되며, N-말단으로부터 43번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 다른 아미노산으로 치환되는 것이 좋다. 이때, 상기 N-말단으로부터 23번째 아미노산인 아스파라긴(N)은 트레오닌(T)으로 치환되고, 상기 N-말단으로부터 29번째 아미노산인 글리신(G)은 알라닌(A)으로 치환되며, 상기 N-말단으로부터 43번째 아미노산인 아스파라긴(N)은 글루탐산(E)으로 치환되는 것이 좋다.
상기 본 발명 항체의 Fc 영역 결합 리간드에 있어서, 항체의 Fc 영역 결합 리간드는, 바람직하게 C-말단에 X 도메인 전체 또는 그 일부가 결합되어 있는 것이 좋다.
본 발명에서는 프로테인 A의 A, B, C 또는 D 도메인에서, ‘FNK 연속서열’의 N-말단 쪽으로 첫 번째 앞에 존재하는 아미노산과 두 번째 앞에 존재하는 아미노산 사이가 알칼리에 대해 취약성을 보이는 위치임을 구명하고, 이들 첫 번째 앞 존재 아미노산 또는 두 번 째 앞 존재 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 항체(IgG) 결합능의 소실 없이 알칼리에 대한 저항성을 획득할 수 있음을 밝혀냈다.
또한, A, B, C 또는 D 도메인의 C-말단에 X 도메인 또는 이의 일부 서열을 붙일 경우, 생산성이 크게 향상될 수 있음을 밝혀냈다.
도 1은 프로테인 A의 0.8M NaOH 처리에 따른 분해 패턴 및 분해된 밴드의 N-말단서열 분석결과이다.
도 2는 프로테인 A (도 2에서 'PA'로 표시), A4 도메인 (도 2에서 'A4'로 표시), A5 도메인 (도 2에서 'A5'로 표시), Z4 도메인 (도 2에서 'Z4'로 표시)을 각각 0.5M NaOH에서 5.1hr 동안 처리를 한 후, SDS-PAGE를 전개한 것이다.
도 3은 A4, A5 및 A5 도메인에 X 도메인이 연결된 'A5-X 리간드'의 발현 수준을 보여준다.
도 4는 A(N4K)5와 A(N3A,N4K)5의 알칼리 분해 패턴 확인 및 알칼리 처리 후 시간의 경과에 따른 IgG 결합능 측정 결과이다.
도 5는 3종류 리간드와 대조군인 PA (protein A)의 알칼리 저항성 비교 실험(0.8M NaOH 1시간 처리) 결과를 SDS PAGE 사진으로 보여준다.
본 발명은 프로테인 A의 A, B, C, D 도메인 중 어느 하나 이상의 도메인이, 하나 이상 연결되어 형성되는 항체의 Fc 영역 결합 리간드에 있어서, A, B, C, D 도메인 중 어느 하나의 도메인 상에 존재하는 것으로, 페닐알라닌(F), 아스파라긴(N), 리신(K)이 연속적으로 연결된 ‘FNK 연속서열’의 N-말단 쪽으로 첫 번째 앞에 존재하는 아미노산 또는 두 번째 앞에 존재하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 항체의 Fc 영역 결합 리간드를 제공한다. 이때, 상기 항체의 Fc 영역 결합 리간드는, 일 예로 상기 A, B, C, D 도메인 중 어느 하나의 도메인에 있어서, FNK 연속서열의 N-말단 쪽으로 두 번째 앞에 존재하는 아미노산인 아스파라긴(N)이 알라닌(A)으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명에서는, 하기 본 발명의 실험을 통해, 프로테인 A의 A, B, C, D 도메인 상에 존재하는‘FNK 연속서열’의 N-말단 쪽으로 첫 번째 앞에 존재하는 아미노산과 두 번째 앞에 존재하는 아미노산 사이가 알칼리에 의해 분해되는 것으로 확인하고, 첫 번째 앞에 존재하는 아미노산 또는 두 번째 앞에 존재하는 아미노산을 야생형의 아미노산에서 다른 아미노산으로 치환함으로써 알칼리에 대한 저항성이 증대될 수 있음을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명 항체의 Fc 영역 결합 리간드에 있어서, 상기 항체의 Fc 영역 결합 리간드는, 일 예로 A 도메인이 복수 개 연결되어 형성된 것일 수 있다. 이때, 상기 항체의 Fc 영역 결합 리간드는, 바람직하게 A 도메인이 4개 또는 5개 연결되어 형성된 것이 좋다.
기존의 Fc 영역 결합 리간드는 B-도메인을 기반으로 하여 개발된 것이 많이 있었고, A-도메인을 기반으로 하여 개발된 것은 없었다. 하지만, 본 발명에서는 A-도메인을 기반으로 해서도 항체 결합능의 소실 없이 알칼리에 대한 저항성이 증대된 Fc 영역 결합 리간드를 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명 항체의 Fc 영역 결합 리간드에 있어서, 상기 A-도메인이 하나 또는 복수 개 연결되어 형성된 항체의 Fc 영역 결합 리간드는, 추가적으로, A-도메인의 N-말단으로부터 23번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 다른 아미노산으로 추가적으로 치환되고, N-말단으로부터 29번째 아미노산인 글리신(G)이 다른 아미노산으로 치환되며, N-말단으로부터 43번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 다른 아미노산으로 치환되는 것일 수 있다. 이때, 본 발명 항체의 Fc 영역 결합 리간드에 있어서, 상기 N-말단으로부터 23번째 아미노산인 아스파라긴(N)은 일 예로 트레오닌으로 치환되고, 상기 N-말단으로부터 29번째 아미노산인 글리신(G)은 일 예로 알라닌으로 치환되며, 상기 N-말단으로부터 43번째 아미노산인 아스파라긴(N)은 일 예로 글루탐산으로 치환되는 것일 수 있다.
N-말단의 23번째 아미노산, 29번째 아미노산, 43번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 경우, 알칼리에 대한 저항성이 증대될 수 있다는 것은 기존의 문헌에서도 보고된 바 있다. 그런데, 이를 본 발명에 추가적으로 적용할 경우, 항체에 대한 결합능이 상승하면서도, 알칼리에 대한 저항성이 증대되는 리간드를 제작할 수 있음을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명 항체의 Fc 영역 결합 리간드에 있어서, 항체의 Fc 영역 결합 리간드는, 바람직하게 C-말단에 X 도메인 전체 또는 그 일부가 결합되어 있는 것일 수 있다. X 도메인 전체 또는 그 일부를 A, B, C, D 도메인의 C-말단에 연결시킬 경우, 해당 도메인의 생산성이 향상됨을 확인할 수 있었다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실험예 1: 알칼리에 의한 프로테인 A의 분해 패턴 확인]
프로테인 A의 알칼리 저항성에 대한 실험을 진행하였다 (제조사 : Repligen, catalog No. : 10-2001-1M).
프로테인 A (PA)를 0.8M NaOH에 60분간 반응시킨 후, SDS-PAGE로 전개하였다. 이후, SDS-PAGE에서 분해된 밴드를 확인하였으며, 분해된 밴드들(도 1의 1, 2, 3 밴드)의 N-말단 아미노산을 분석하여 프로테인 A의 E, D, A, B, C 도메인들과 비교하였다.
도 1은 프로테인 A의 0.8M NaOH 분해 패턴 및 분해된 밴드의 N-말단서열 분석 결과이다. 분해된 밴드의 N-말단서열과 각 도메인을 비교한 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, SDS-PAGE 상의 1, 2, 3 밴드에서, 각각 N-말단 쪽의 2~4번째 아미노산이 FNK의 연속서열로 확인되었다.
이 결과를 프로테인 A의 A (서열번호 1), B (서열번호 2), C (서열번호 3), D (서열번호 4), E (서열번호 5) 도메인 시퀀스와 비교해 보았는데, A 도메인, B 도메인, C 도메인 및 D 도메인의 N-말단 쪽에서 공통적인 특정의 서열 'FNK'가 확인되었다.
따라서, 본 발명자들은 이 특정 연속서열 'FNK'의 존재가 알칼리에 대한 민감성과 연관성이 있을 것이라 추론하고, 이 연속서열의 N-말단 앞쪽 아미노산의 변형을 통해 알칼리 저항성을 증대시킬 수 있을 것이라 추론하고 하기 실험들을 진행하였다.
[실험예 2: 알칼리에 의한 프로테인 A의 A 도메인 분해 패턴 확인]
본 실험에서는 상기의 실험결과를 바탕으로 프로테인 A의 'A 도메인'에 대한 알칼리 분해 패턴을 확인해 보고자 하였다. 이를 위해서 A 도메인 4개의 반복서열로 이루어진 리간드와 A 도메인 5개의 반복서열로 이루어진 리간드를 각각 제조하여, 이들에 대한 알칼리 저항성을 실험하였다. 비교 실험군으로는 자사에서 특허 EP 2,202,310 A2를 참조하여 제작한 Z 도메인 4개로 이루어진 리간드를 제조하여 사용하였다.
제작한 A-도메인 리간드에 대해 상기 실험예 1과 같은 방법으로 알칼리 분해 패턴을 확인해 보고, IgG 결합능(bindig activity)도 측정해 보았다.
실험결과, A4 도메인 및 A5 도메인 경우도 프로테인 A와 분해정도 및 분해패턴이 유사함을 확인할 수 있었다. 도 2는 프로테인 A (도 2에서 'PA'로 표시), A4 도메인 (도 2에서 'A4'로 표시), A5 도메인 (도 2에서 'A5'로 표시), Z4 도메인 (도 2에서 'Z4'로 표시)을 각각 0.5M NaOH에서 5.1hr 동안 처리를 한 후, SDS-PAGE를 전개한 것이다. 프로테인 A 및 A4, A5 도메인의 경우, 5.1hr 처리 후 분해 밴드들이 확인되었다. 하지만, Z4 도메인의 경우 분해되는 정도가 낮음을 확인하였다.
한편, 0.5M NaOH 농도에서 다양한 시간 동안 처리하는 경우, 고농도 알칼리 상태에서 변성 등이 발생하여 최종 역할인 항체 흡착능이 소실될 수 있기 때문에, 추가적으로 IgG 결합능을 측정하여 결합능의 변화 여부를 확인하였다.
실험 결과, 하기 표 1에서 확인할 수 있듯이, 비교적 낮은 농도의 알칼리 조건(0.1M NaOH, 0.3M NaOH)에서 IgG 결합능은 프로테인 A, A4, Z4 도메인이 모두 비슷한 정도를 보였다. 하지만, 0.5M NaOH의 높은 알칼리 조건에서부터 항체에 대한 흡착능이 차이가 나기 시작했고, 프로테인 A, A4, A5 도메인은 0.5M NaOH/24hr 처리조건에서 낮은 항체 흡착능을 보여주는 반면, Z4 도메인은 비교적 높은 항체 흡착능을 나타내었다.
Solution PA AAAA(A4) AAAAA(A5) ZZZZ(Z4)
Control 99.97 97.02 97.17 92.63
0.1M NaOH 5.1hr 91.81 88.08 - 85.65
6.8hr 91.87 - - 86.23
10.2hr 89.54 87.62 - 84.98
0.3M NaOH 5.1hr 77.92 - - 76.06
0.5M NaOH 5.1hr 61.98 69.5 64.8 68.02
10.2hr 45.37 47.29 46.07 62.62
24hr 28.96 26.07 29.13 49.67
[실험예 3: A4, A5 도메인의 정제 수율 향상]
A4 도메인, A5 도메인을 생산하기 위하여 5L 회분배양을 실시하였다. 실험 결과, 전체적인 발현율 및 정제 수율이 프로테인 A에 비하여 낮게 나타났다. 이에, 본 발명자들은 프로테인 A에 있는 X 도메인이 발현율에 일정한 영향을 주는 것으로 추론하고, A5 도메인의 C-말단에 X 도메인 (서열번호 6)을 추가하고자 하였다.
A5-X 도메인의 리간드를 구축하고, 발효 및 정제하여 알칼리 저항성 정도를 SDS-PAGE로 확인하였다. 도 3은 A4, A5 및 A5-X 리간드의 발현 수준을 보여준다.
도 3에서 보듯이 X 도메인을 붙임으로써 발현수준이 향상되고 정제 수율도 함께 향상되었다.
[실시예 1: A 도메인의 알칼리에 대한 저항성을 높이기 위한 실험]
A 도메인의 경우, B 도메인, C 도메인의 N-말단 NKFNKE 위치에 NNFNKE의 서열을 가지고 있다. A-도메인의 4번째 아미노산인 아스파라긴(N)을 리신(K)으로 치환하게 되면, B 도메인, C 도메인과 동일한 아미노산 서열이 된다.
일단, A(N4K)5 도메인(->NKFNKE)을 구축한 후, 정제하여 알칼리 저항성을 실험하였다. 예상되는 바와 같이, 0.5M NaOH에서 10.2hr 이상 처리하였더니 완전히 분해되었다. 이를 통해, 'FNK 연속서열'의 N-말단 쪽으로 첫 번째 앞에 존재하는 아미노산 (본 실험에서 'K')과 두 번째 앞에 존재하는 아미노산 (본 실험에서 'N')사이가 알칼리에 대해 취약성을 보이는 위치임을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 실시예에서는 알칼리 저항성을 높이도록 ‘FNK 연속서열’의 N-말단 쪽으로 두 번째 앞에 존재하는 아미노산과 첫 번째 앞에 존재하는 아미노산을, 각각 알라닌(A) 및 리신(K)으로 치환하여, A(N3A,N4K)5 리간드를 제작하였다.
이와 같이 제작한 리간드에 대해, 상기 실험예 1과 같은 방법으로 알칼리 분해 패턴을 확인해 보고, IgG 결합능(bindig activity)도 측정해 보았다.
실험 결과, 알칼리 저항성이 현저히 상승하는 것을 확인할 수 있었고, IgG 결합능도 대조군에 비해 줄어드는 정도가 현저히 작음을 확인할 수 있었다 (도 4). 도 4는 A(N4K)5와 A(N3A,N4K)5의 알칼리 분해 패턴 확인 및 알칼리 처리 후 시간의 경과에 따른 IgG 결합능 측정 결과이다.
이상과 같은 실험으로부터, A, B, C, D 도메인 상 ‘FNK 연속서열’의 N-말단 쪽으로 두 번째 앞에 존재하는 아미노산과 첫 번째 앞에 존재하는 아미노산 중 어느 하나 이상을 종래의 서열에서 다른 서열로 바꿈으로써 IgG 결합능의 손실 없이 알칼리에 대한 저항성을 높일 수 있는 것으로 확신할 수 있었다.
[실시예 2: A 도메인의 알칼리에 대한 저항성을 더욱 높이기 위한 실험]
여러 문헌 등에서는, D 도메인, B 도메인, C 도메인의 알칼리 취약부분인 N23, G29, N43를 다른 아미노산으로 치환할 경우, 알칼리에 대한 저항성을 높일 수 있는 것으로 보고하고 있다.
본 발명에서는 이와 같은 선행연구 결과를 활용하여 상기 실시예 1에서 구축한 리간드에 대해 알칼리 저항성을 더욱 높이도록 리간드를 새롭게 설계하였다.
즉, 상기 실시예 1에서 구축한 A(N3A,N4K)5-X 리간드 (A''5-X)에 대해, 추가적으로 N23T, G29A, N43E 변형을 가하여, A(N3A, N4K, N23T, G29A, N43E)5-X 리간드 (A'''''5-X)를 구축하였다. 이때, N3A, N4K를 제외한 N23T, G29A, N43E의 3부분만 치환된 리간드 (A'''5-X)를 별도로 구축하여, N3, N4의 알칼리 저항성에 대한 중요성을 확인하는 비교군으로 사용하였다.
실험 결과는 도 5와 같이 나타났다. 도 5는 상기에서 제작한 3종류 리간드와 대조군인 PA (protein A)의 알칼리 저항성 비교 실험(0.8M NaOH 1시간 처리) 결과를 SDS PAGE 사진으로 보여준다. 도 5에서 보는 바와 같이, A''5-X, A'''5-X, A'''''5-X 샘플의 분해 정도가 대조군인 PA에 비해 낮아 알칼리 저항성이 높은 것을 알 수 있었다 (분해도가 낮을수록 굵은 밴드 밑의 밴드가 흐리게 나타남). 또한, A''5-X는 A'''5-X보다 분해 정도가 낮게 나타나, 알칼리 저항성이 높은 것으로 나타났고, A'''''5-X의 분해 정도가 가장 낮게 나타나, 알칼리 저항성이 가장 높은 것으로 확인할 수 있었다.
한편, 상기에서 사용한 리간드들에 대해 항체 결합능을 측정하였는데, 그 결과는 하기 표 2와 같이 나타났다. 대조군으로는 PA (protein A), A5-X (A 도메인이 5개 결합된 것에 X 도메인이 결합된 것), A'5-X 리간드 (4번째 아미노산인 N이 K로 치환(N4K) A 도메인이 5개 결합된 것에 X 도메인이 결합된 것)를 사용하였다. 실험군으로는 A''5-X 리간드 (3번째 아미노산인 N이 A로 치환(N3A)되고, 4번째 아미노산인 N이 K로 치환(N4K) 된 A 도메인이 5개 결합된 것에 X 도메인이 결합된 것), A'''5-X 리간드 (N23T, G29A, N43E 변형이 가해진 A 도메인이 5개 결합된 것에 X 도메인이 결합된 것), A'''''5-X 리간드 (N3A, N4K, N23T, G29A, N43E 변형이 가해진 A 도메인이 5개 결합된 것에 X 도메인이 결합된 것)를 사용하였다.
Solution PA A5-X A'5-X A''5-X A'''5-X A'''''5-X ZZZZ(Z4)
Control 99.17 97.04 97.87 98.35 98.66 98.81 92.15
0.5M 5.1 hr 61.35 67.38 69.58 80.23 79.63 82.22 77.16
10.2 hr 46.37 47.51 49.92 77.75 76.3 78.78 73.93
24 hr 20.5 20.12 20.80 44.13 41.05 53.46 42.65
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 0.5M의 NaOH를 다양한 샘플(리간드)에 처리한 결과, A''5-X, A'''5-X, A'''''5-X 샘플이 대조군인 PA, A5-X, A'5-X 샘플에 비해 시간의 경과에 따라 항체 결합능을 높게 유지하는 것으로 나타났다.
이상의 실험 결과로부터, 기존에 알려진 아미노산 부분의 치환만으로도 상당히 높은 알칼리 저항성 및 항체 친화성 정도를 나타낼 수 있지만, 본 발명에서와 같이,‘FNK 연속서열'의 N-말단 쪽으로 두 번째 앞에 존재하는 아미노산과 첫 번째 앞에 존재하는 아미노산을 치환하였을 경우, 더 높은 알칼리 저항성 및 IgG 결합능을 얻을 수 있는 것으로 결론 내릴 수 있었다.

Claims (7)

  1. 프로테인 A의 A, B, C, D 도메인 중 어느 하나 이상의 도메인이, 하나 이상 연결되어 형성되는 항체의 Fc 영역 결합 리간드에 있어서,
    A, B, C, D 도메인 중 어느 하나의 도메인 상에 존재하는 것으로, 페닐알라닌(F), 아스파라긴(N), 리신(K)이 연속적으로 연결된 ‘FNK 연속서열’의 N-말단 쪽으로 첫 번째 앞에 존재하는 아미노산 또는 두 번째 앞에 존재하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 하는 항체의 Fc 영역 결합 리간드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체의 Fc 영역 결합 리간드는,
    상기 A, B, C, D 도메인 중 어느 하나의 도메인에 있어서, FNK 연속서열의 N-말단 쪽으로 두 번째 앞에 존재하는 아미노산인 아스파라긴(N)이 알라닌(A)으로 치환된 것을 특징으로 하는 항체의 Fc 영역 결합 리간드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체의 Fc 영역 결합 리간드는,
    A 도메인이 복수 개 연결되어 형성된 것을 특징으로 하는 항체의 Fc 영역 결합 리간드.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 항체의 Fc 영역 결합 리간드는,
    A 도메인이 4개 또는 5개 연결되어 형성된 것을 특징으로 하는 항체의 Fc 영역 결합 리간드.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 항체의 Fc 영역 결합 리간드는, 추가적으로,
    N-말단으로부터 23번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 다른 아미노산으로 치환되고,
    N-말단으로부터 29번째 아미노산인 글리신(G)이 다른 아미노산으로 치환되며,
    N-말단으로부터 43번째 아미노산인 아스파라긴(N)이 다른 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 항체의 Fc 영역 결합 리간드.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 N-말단으로부터 23번째 아미노산인 아스파라긴(N)은 트레오닌(T)으로 치환되고,
    상기 N-말단으로부터 29번째 아미노산인 글리신(G)은 알라닌(A)으로 치환되며,
    상기 N-말단으로부터 43번째 아미노산인 아스파라긴(N)은 글루탐산(E)으로 치환되는 것을 특징으로 항체의 Fc 영역 결합 리간드.
  7. 제1항에 있어서,
    항체의 Fc 영역 결합 리간드는,
    C-말단에 X 도메인 전체 또는 그 일부가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 항체의 Fc 영역 결합 리간드.
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