WO2017126551A1 - Differentiation induction from human pluripotent stem cells into hypothalamic neurons - Google Patents

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Definitions

  • ACTH secretion ability of structures obtained by culturing human iPS cells under the simultaneous maturation conditions of the hypothalamus and pituitary gland * P ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 ACTH secretion ability when the pituitary gland (anterior lobe) and hypothalamus are separated and only the pituitary gland (anterior lobe) is cultured (A) and when the pituitary gland (anterior lobe) and hypothalamus are cultured again (B) comparison.
  • the ACTH concentration in the culture solution on the 150th day of culture was measured (right).
  • * P ⁇ 0.05 Schematic diagram (right) and test results (left) showing an overview of the ACTH stimulation test with CRH. * P ⁇ 0.05.
  • lentiviruses (Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007), adenoviruses (Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903 ), 945-949, 2008), plasmid (Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008), transposon vectors (Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: 770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009), or Techniques using episomal vectors (Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009) have been developed.
  • BMP4 is preferably a rodent (mouse, rat, etc.) or primate (human, etc.) BMP4, most preferably human BMP4.
  • Human BMP4 means BMP4 having the amino acid sequence of BMP4 that is naturally expressed in vivo by humans.
  • the concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator may not be constant throughout the entire phase of step (1).
  • the osteogenic factor signal transduction pathway activator is not added to the medium for 3 to 8 days (6 days in the specific example) from the start of suspension culture, and then the osteogenic factor signal transduction pathway activator is added to the medium. It may be added. Further, the concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator may be reduced during the culture.
  • “low concentration” when SAG is used as a substance acting on the Shh signal pathway is, for example, 0.1 ⁇ M to 2.0 ⁇ M, preferably 0.2 ⁇ M to 1.5 ⁇ M, and more preferably 0.3 ⁇ M to 1.0 ⁇ M.
  • the concentration of the Shh signal pathway agonist may not be constant over the entire period of step (1).
  • the Shh signal pathway agent may not be added to the medium for 3 to 8 days (specifically, 6 days) from the start of suspension culture, and then the Shh signal pathway agent may be added to the medium. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
  • Differentiation into dorsal hypothalamic tissue indicates that neural progenitor cells characteristic of dorsal hypothalamic tissue (eg, vasopressin (AVP) neuron progenitor cells, oxytocin (OXT) neuron progenitors) Cells, thyrotropin releasing hormone (TRH) neuron progenitor cells, corticotropin releasing hormone (CRH) neuron progenitor cells, neuropeptide Y (NPY) neuron progenitor cells) can be confirmed.
  • neural progenitor cells characteristic of the dorsal hypothalamic tissue are observed, it can be determined that the differentiation induction into the dorsal hypothalamic tissue is further advanced. Confirmation of the appearance of neural progenitor cells may be made using a marker characteristic of each. For example, if Otp and Brn2 expression is observed, it can be determined that AVP neuron progenitor cells have appeared.
  • Step (ii) In step (ii) following step (i), the cell aggregate obtained in step (i) is further subjected to suspension culture in a medium containing an osteogenic factor signal transduction pathway activator and a Shh signal pathway activator. This step induces further differentiation into the hypothalamus and pituitary gland.
  • Culture conditions not specifically mentioned culture method (preferably stationary culture is adopted), possibility of using feeder cells (preferably cultured in the absence of feeder cells), usable incubator, basal medium used
  • the additives other than the osteogenic factor signal transduction pathway activator and the Shh signal pathway activator are the same as in step (i).
  • the culture conditions characteristic to step (ii) will be described.
  • a medium containing a substance that acts on the Shh signal pathway is used.
  • the concentration of the Shh signal pathway agonist in the medium can be set as appropriate as long as differentiation into the hypothalamus and pituitary is possible, but when using SAG as the Shh signal pathway agonist, the concentration is For example, it is 1 nM to 1000 ⁇ M, preferably 10 nM to 100 ⁇ M, more preferably 100 nM to 10 ⁇ M (specific example is 2 ⁇ M).
  • the optimum concentration can be set through preliminary experiments.
  • the high oxygen partial pressure condition means an oxygen partial pressure condition that exceeds the oxygen partial pressure in air (20%).
  • the oxygen partial pressure in step (a) is, for example, 30 to 60%, preferably 35 to 60%, more preferably 38 to 60% (specific example is 40%).
  • Cell structure use of cells constituting cell structure, cell structure obtained by the production method of the present invention, that is, cell structure or hybrid cell structure including dorsal or ventral hypothalamic tissue, or A part (tissue or cell constituting the cell structure) is used for transplantation medicine, for example.
  • Part of the cell structure can be prepared by cutting with a scalpel or the like, treatment with a proteolytic enzyme, EDTA, or the like. Prior to application to transplantation medicine or the like, the prepared cells may be purified or purified using cell surface markers, morphology, secretory substances, etc. as indicators.
  • diseases to which the cell structure of the present invention or a part thereof can be applied include central diabetes insipidus, hypothalamic pituitary dysfunction, Prader syndrome, Lawrence Moonbeed syndrome, hypothalamic obesity, eating disorder , Cognitive dysfunction, sleep disorders, panhypopituitarism, pituitary dwarfism, hypoadrenocorticism, partial hypopituitarism, anterior pituitary hormone alone deficiency, trauma, radiation therapy, resection Damage to the hypothalamus and / or pituitary gland due to surgery.
  • Disperse the cell clumps seed the cells at 2 ⁇ 10 4 to 40 ⁇ 10 4 cells / cm 2 on a glass plate coated with Laminin, Poly-D-Lysine, Matrigel, and add NT3, BDNF, Planar culture was performed in a medium supplemented with CNTF and FBS. The medium was changed once every three days.

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Abstract

Provided is a method for efficiently inducing differentiation from human pluripotent stem cells into hypothalamic neurons. Also provided is a method for constructing a cellular structure that integrates pituitary tissue and hypothalamic tissue from human pluripotent stem cells. A cellular structure including hypothalamic tissue is obtained by a method including a step for suspension culturing human pluripotent stem cell spheroids in a medium including a low concentration of an osteogenic factor signaling pathway activator and a low concentration of a substance capable of acting on the Shh signaling pathway, and a step for also suspension culturing the cell spheroids obtained in that step in a medium including a low concentration of a substance capable of acting on the Shh signaling pathway. A cellular structure including hypothalamic tissue and pituitary tissue is also obtained by a method including a step for suspension culturing human pluripotent stem cell spheroids in a medium including an osteogenic factor signaling pathway activator and a substance capable of acting on the Shh signaling pathway, a step for also suspension culturing the cell spheroids formed in that step in a medium including an osteogenic factor signaling pathway activator and a substance capable of acting on the Shh signaling pathway, and a step for suspension culturing the cell spheroids obtained in that step in a medium suitable for simultaneous pituitary and hypothalamic induction .

Description

ヒト多能性幹細胞から視床下部ニューロンへの分化誘導Differentiation induction from human pluripotent stem cells to hypothalamic neurons
　本発明はヒト多能性幹細胞を視床下部ニューロンへ分化する技術及びその応用に関する。本出願は、２０１６年１月２２日に出願された日本国特許出願第２０１６－１０９４０号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。 The present invention relates to a technique for differentiating human pluripotent stem cells into hypothalamic neurons and its application. This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2016-10940 filed on January 22, 2016, the entire contents of which are incorporated by reference.
　視床下部は、成長・思春期・代謝・ストレス対応・生殖・授乳保育・免疫など、ヒトの体の恒常性を保つための中枢である。特に最近は、糖尿病など生活習慣病の増加に伴う食欲コントロールへの関心が高まっているが、食欲中枢も視床下部に存在する。他にも、視床下部ホルモンの一つであるオキシトシンは、従来から言われてきた射乳・子宮収縮効果以外にも、信頼関係や愛情に関係するとの報告が増えてきており、ヒトの生活に深く関わるホルモンと判明してきた。 The hypothalamus is the center for maintaining the homeostasis of the human body, such as growth, puberty, metabolism, stress response, reproduction, breastfeeding, and immunity. Recently, in particular, interest in appetite control associated with an increase in lifestyle-related diseases such as diabetes has increased, but an appetite center is also present in the hypothalamus. In addition, oxytocin, one of the hypothalamic hormones, has been reported to be related to trust and affection in addition to the traditional milk and uterine contraction effects. It has been found to be a deeply related hormone.
　視床下部が異常を来すと正常なホルモン分泌が行われず、中枢性尿崩症等の疾患、摂食障害、睡眠障害などが引き起こされる。視床下部の異常によるホルモン分泌不全に対してはホルモン補充療法が行われている。しかし、ホルモン補充療法には限界があり、十分な効果が得られないことも多い。本来、ホルモンの分泌量は環境の変化に対応して調節される。このような生体が備える調節機構を、外部からの補充によって再現することは事実上、不可能といえる。 When abnormalities occur in the hypothalamus, normal hormone secretion is not performed, leading to diseases such as central diabetes insipidus, eating disorders, and sleep disorders. Hormone replacement therapy is used for hormone secretion failure due to hypothalamic abnormalities. However, hormone replacement therapy has its limitations and often does not provide a sufficient effect. In essence, hormone secretion is regulated in response to environmental changes. It can be said that it is practically impossible to reproduce the adjustment mechanism provided in such a living body by external replenishment.
　視床下部は脳の深部にあり、また小さな領域であることから、実際の組織を取り出して研究に用いることは困難であった。一方、ES細胞等の多能性幹細胞から視床下部ニューロンを作製することが試みられている。例えば、2008年にWatayaらは、SFEBq法を開発し、マウスES細胞から視床下部AVP産生細胞を分化誘導する手法を確立した（非特許文献１）。SFEBq法では血清や成長因子を含まないgfCDM培地を使用し、非接着性のプレート内で細胞を凝集させて3次元浮遊培養を行い、神経組織へと分化させる。2015年には、Merkleらが3次元浮遊培養及び2次元平面培養の2種類の方法を用い、ヒトES細胞及びiPS細胞から視床下部ニューロンの分化誘導に成功した（非特許文献２）。 Since the hypothalamus is in the deep part of the brain and is a small area, it was difficult to extract the actual tissue and use it for research. On the other hand, attempts have been made to produce hypothalamic neurons from pluripotent stem cells such as ES cells. For example, in 2008, Wataya et al. Developed the SFEBq method and established a method for inducing differentiation of hypothalamic AVP-producing cells from mouse ES cells (Non-patent Document 1). The SFEBq method uses gfCDM medium that does not contain serum or growth factors, agglutinates cells in a non-adherent plate, performs three-dimensional suspension culture, and differentiates into neural tissue. In 2015, Merkle et al. Succeeded in inducing differentiation of hypothalamic neurons from human ES cells and iPS cells using two types of methods, 3D suspension culture and 2D planar culture (Non-patent Document 2).
　以上のように、多能性幹細胞を視床下部ニューロンへと分化誘導することが試みられている。しかしながら、Watayaらの方法では、ヒトES細胞ではうまく分化しなかった。また、Merkleらの方法では、3次元培養ではAVP分化効率が非常に悪く（分化効率0.2%程度）、2次元培養ではAVPニューロンの分化に成功していない。 As described above, attempts have been made to induce differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic neurons. However, Wataya et al. Did not differentiate well in human ES cells. In the method of Merkle et al., AVP differentiation efficiency is very poor in 3D culture (differentiation efficiency is about 0.2%), and AVP neurons are not successfully differentiated in 2D culture.
　ヒト多能性幹細胞（ES細胞やiPS細胞）を視床下部ニューロンへと分化誘導する方法、換言すれば視床下部組織を構築する方法を確立できれば、視床下部の障害に対する治療法の開発が大きく前進する。例えば、中枢性尿崩症患者から樹立された疾患特異的iPS細胞を用いた病態解析や治療法の開発が可能となる。また、移植医療への適用も期待できる。 If a method for inducing differentiation of human pluripotent stem cells (ES cells and iPS cells) into hypothalamic neurons, in other words, a method for constructing hypothalamic tissue, the development of treatments for hypothalamic disorders will be greatly advanced. . For example, it becomes possible to develop pathological analysis and treatment using disease-specific iPS cells established from patients with central diabetes insipidus. In addition, application to transplantation medicine can be expected.
　一方、視床下部と下垂体は、本来は機能的に不可分なものであることから、視床下部と下垂体が機能的に一体化した構造体は、視床下部及び／又は下垂体を標的とした創薬スクリーニング等に極めて有効なツールである。また、当該構造体は視床下部及び／又は下垂体の機能不全に対する移植材料としても有用性が高い。 On the other hand, since the hypothalamus and the pituitary gland are functionally inseparable in nature, a structure in which the hypothalamus and the pituitary gland are functionally integrated is a target that targets the hypothalamus and / or the pituitary gland. It is an extremely effective tool for drug screening. In addition, the structure is highly useful as a transplant material for hypothalamic and / or pituitary dysfunction.
　以上の背景の下、本発明は、ヒト多能性幹細胞を視床下部ニューロンへと効率よく分化誘導する方法の提供を第１の課題とする。また、ヒト多能性幹細胞から視床下部組織と下垂体組織が一体化した細胞構造体を構築する方法の提供を第２の課題とする。 Under the background described above, the first object of the present invention is to provide a method for efficiently inducing differentiation of human pluripotent stem cells into hypothalamic neurons. Another object of the present invention is to provide a method for constructing a cell structure in which hypothalamic tissue and pituitary tissue are integrated from human pluripotent stem cells.
　本発明者らは上記課題を解決すべく検討を重ねた。まず、Merkleらの方法は、必ずしも発生の順に沿った分化法ではなく、彼らの結果から推測するに、視床下部のなかでも腹側へ分化しているものと考えられた。一般にAVPニューロンは視床下部背側において認められる。そこで本発明者らは発生の各段階を順に再現する分化条件を検索し最適化することで、視床下部内の誘導位置を更に精密に制御し、結果として背側視床下部のAVPニューロンを得られるようにしようと考えた。各分化ステップのマーカーとして、視床下部初期マーカーであるRx（retina and anterior neural fold homeobox）、次に背側マーカーであるPax6（paired box 6）、そしてAVPのBona fideマーカーであるOtp（orthopedia homeobox）とBrn2（POU3F2、POU class 3 homeobox 2等としても知られる）、最後にAVPを設定した。 The present inventors have repeatedly studied to solve the above problems. First, the method of Merkle et al. Was not necessarily a differentiation method in the order of occurrence, but it was thought that they differentiated to the ventral side in the hypothalamus, as estimated from their results. AVP neurons are generally found on the dorsal side of the hypothalamus. Therefore, the present inventors search for and optimize the differentiation condition that reproduces each stage of development in order, thereby controlling the guidance position in the hypothalamus more precisely, and as a result, the AVP neurons in the dorsal hypothalamus can be obtained. I thought so. As markers for each differentiation step, Rx (retina and anterior neural 初期 fold homeobox), the hypothalamic initial marker, Pax6 (paired box 6), followed by Otp (orthopedia homeobox), the AVP Bona fide marker And Brn2 (also known as POU3F2, POU class 3 homeobox 2, etc.) and finally AVP.
　まず、Watayaらの方法（非特許文献１）に倣って、成長因子を含まない化学合成培地（growth-factor-free Chemica11y Defined Medium; gfCDM）のみを使用して分化を試みたところ、細胞がうまく凝集塊を形成しなかった。栄養不足が原因と考え、血清代替物KSRを培地に少量添加したところ、凝集塊はできたが、終脳へと位置情報がずれてしまった。そこで、BMP4シグナルを加えたところ、視床下部マーカーであるRxと背側マーカーであるPax6が共陽性になったが、網膜マーカーChx10も陽性となり、神経網膜になっていることが判明した。そこで、腹側化因子のShh（Sonic hedgehog）シグナル（ShhアゴニストであるSAG）を加えたところ、視床下部前駆細胞へと分化させることが可能になった。 First, following the method of Wataya et al. (Non-patent Document 1), when differentiation was attempted using only a chemically-synthesized medium (growth-factor-free Chemica11y Defined Medium; No agglomerates were formed. When a small amount of the serum substitute KSR was added to the medium because it was thought to be due to nutritional deficiency, an aggregate was formed, but the positional information shifted to the telencephalon. Therefore, when the BMP4 signal was added, the hypothalamic marker Rx and the dorsal marker Pax6 were copositive, but the retinal marker Chx10 was also positive, indicating that it was a neuroretina. Therefore, when a ventralizing factor Shh (Sonic hedgehog) signal (Shh, a Shh agonist) was added, it became possible to differentiate into hypothalamic progenitor cells.
　更なる検討の結果、KSR濃度、BMP4シグナルとShhシグナル（SAG）の濃度を調整し、また、別の腹側化シグナルであるAkt阻害剤の少量の添加の有無により、背側視床下部と腹側視床下部の作り分けに成功した。即ち、背側視床下部誘導条件と、腹側視床下部誘導条件が見出された。背側視床下部誘導条件にて浮遊培養を継続した結果、OtpとBrn2の発現を確認し、培養100日目でAVPの発現を確認したが、その数はわずかであった。そこで、神経発生に有利とされる分散培養を組み入れたところ、培養150日目でAVPニューロンの出現を確認した。また、このAVPニューロンが実際にAVPホルモンを分泌することを確認した。さらに、AVPニューロンが刺激試験において良好な反応性を示した。 As a result of further study, the dorsal hypothalamus and ventral side were adjusted by adjusting the concentrations of KSR, BMP4 signal and Shh signal (SAG), and with or without the addition of a small amount of Akt inhibitor, another ventralization signal. Successfully made the hypothalamus. That is, a dorsal hypothalamic guidance condition and a ventral hypothalamic guidance condition were found. As a result of continuing floating culture under dorsal hypothalamic induction conditions, the expression of Otp and Brn2 was confirmed, and the expression of AVP was confirmed on the 100th day of culture, but the number was very small. Thus, when dispersed culture, which is advantageous for neurogenesis, was incorporated, the appearance of AVP neurons was confirmed on day 150 of culture. We also confirmed that these AVP neurons actually secrete AVP hormones. In addition, AVP neurons showed good reactivity in stimulation tests.
　背側視床下部誘導条件又は腹側視床下部誘導条件で培養すると、AVPニューロン以外の視床下部ニューロンも分化誘導できることが確認された。腹側視床下部条件で培養を継続した場合は、背側視床下部誘導条件よりも高率にMCHニューロン等の腹側視床下部ニューロンが認められた。 It was confirmed that when cultured under dorsal hypothalamic induction conditions or ventral hypothalamic induction conditions, hypothalamic neurons other than AVP neurons can also be induced to differentiate. When culture was continued under ventral hypothalamic conditions, ventral hypothalamic neurons such as MCH neurons were found at a higher rate than dorsal hypothalamic induction conditions.
　一方、視床下部ニューロン成熟条件（分散培養用の培地の使用）を組み合わせるとともに、各段階の条件を調整することによって、一つの細胞塊から視床下部と下垂体の双方を分化・成熟させることに成功した。 On the other hand, we succeeded in differentiating and maturing both hypothalamus and pituitary gland from a single cell mass by combining hypothalamic neuron maturation conditions (use of dispersion culture medium) and adjusting the conditions of each stage. did.
　以上のように、今回の検討の結果、Merkleらの方法と比較して、より高率に視床下部ニューロン（例えばAVPニューロン）へ分化誘導することが可能になった。また、視床下部の背側と腹側とを正確に作り分けることが可能になった結果、分化誘導そのものをより精密にコントロールできるようになった。AVPニューロンのみならず、愛情ホルモンとも呼ばれるオキシトシンを産生するニューロンや、食欲に関連する複数の視床下部ホルモン産生ニューロンも分化誘導可能になった。更には、視床下部と下垂体が機能的に一体化した構造体の構築にも成功した。
　以下の発明は、主として上記の成果に基づく。
　［１］以下のステップ（１）及び（２）を含む、視床下部組織を含む細胞構造体の製造方法：
　（１）ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ、
　（２）ステップ（１）で得られた細胞凝集塊を、低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ。
　［２］ステップ（２）を高酸素分圧条件下で行う、［１］に記載の製造方法。
　［３］以下のステップ（３）を更に含む、［１］又は［２］に記載の製造方法：
　（３）ステップ（２）で得られた細胞凝集塊を回収し、細胞凝集塊を構成する細胞を分散培養するステップ。
　［４］ステップ（３）を高酸素分圧条件下で行う、［３］に記載の製造方法。
　［５］ステップ（１）における前記骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4であり、培地中のその濃度が0.1 nM～5.0 nMであり、
　ステップ（１）及び（２）における前記Shhシグナル経路作用物質がSAGであり、培地中のその濃度が0.1μM～2.0μMであり、
　前記ステップ（１）及び（２）によって背側視床下部組織への分化が誘導される、
　［１］～［４］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［６］前記背側視床下部組織はバゾプレシンニューロン、オキシトシンニューロン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンニューロン、コルチコトロピン放出ホルモンニューロン及びニューロペプチドYニューロンからなる群より選択される一以上のニューロンを含む、［５］に記載の製造方法。
　［７］ステップ（１）における前記骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4であり、培地中のその濃度が0.1 nM～3.0 nMであり、
　ステップ（１）及び（２）における前記Shhシグナル経路作用物質がSAGであり、培地中のその濃度が0.1μM～2.0μMであり、
　前記培地がAkt阻害剤を更に含み、
　前記ステップ（１）及び（２）によって腹側視床下部組織への分化が誘導される、［１］～［４］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［８］前記腹側視床下部組織はアグーチ関連タンパク質ニューロン、プロオピオメラノコルチンニューロン、メラニン凝集ホルモンニューロン及びOrexinニューロンからなる群より選択される一以上のニューロンを含む、［７］に記載の製造方法。
　［９］前記浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、［１］～［８］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［１０］ステップ（１）における前記凝集塊が、分散させたヒト多能性幹細胞の浮遊培養によって形成される、［１］～［９］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［１１］前記浮遊培養を無血清凝集浮遊培養法で行う、［１０］に記載の製造方法。
　［１２］以下のステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、視床下部組織と下垂体組織を含む細胞構造体の製造方法：
　（ｉ）ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ、
　（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成された細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ、
　（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られた細胞凝集塊を、下垂体及び視床下部の同時誘導に適した培地中で浮遊培養するステップ
　［１３］ステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を高酸素分圧条件下で行う、［１２］に記載の製造方法。
　［１４］ステップ（ｉｉ）とステップ（ｉｉｉ）の間に以下のステップ（ａ）を行い、ステップ（ｉｉｉ）ではステップ（ａ）で得られた細胞凝集塊を浮遊培養する、［１２］又は［１３］に記載の製造方法：
　（ａ）ステップ（ｉｉ）で得られた細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ。
　［１５］ステップ（ａ）を高酸素分圧条件下で行う、［１２］～［１４］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［１６］前記浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、［１２］～［１５］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［１７］ステップ（ｉ）における前記凝集塊が、分散させたヒト多能性幹細胞の浮遊培養によって形成される、［１２］～［１６］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［１８］骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4である、［１２］～［１７］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［１９］Shhシグナル経路作用物質がSAGである、［１２］～［１８］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［２０］［１］～［１９］のいずれか一項に記載の製造方法で得られる細胞構造体。 As described above, as a result of this study, it has become possible to induce differentiation into hypothalamic neurons (for example, AVP neurons) at a higher rate than the method of Merkle et al. In addition, as a result of being able to accurately create the dorsal side and the ventral side of the hypothalamus, differentiation induction itself can be controlled more precisely. Differentiating not only AVP neurons, but also neurons that produce oxytocin, also called love hormones, and multiple hypothalamic hormone-producing neurons related to appetite. Furthermore, we succeeded in constructing a structure in which the hypothalamus and the pituitary gland are functionally integrated.
The following invention is mainly based on the above-mentioned results.
[1] A method for producing a cell structure including a hypothalamic tissue, including the following steps (1) and (2):
(1) Suspension culture of aggregates of human pluripotent stem cells in a medium containing a low concentration of an osteogenic factor signaling pathway activator and a low concentration of an Shh signaling pathway activator;
(2) A step of further subjecting the cell aggregate obtained in step (1) to suspension culture in a medium containing a low-concentration Shh signal pathway agent.
[2] The production method according to [1], wherein step (2) is performed under high oxygen partial pressure conditions.
[3] The production method according to [1] or [2], further comprising the following step (3):
(3) A step of recovering the cell aggregate obtained in step (2) and dispersing and culturing the cells constituting the cell aggregate.
[4] The production method according to [3], wherein step (3) is performed under high oxygen partial pressure conditions.
[5] The osteogenic factor signaling pathway activator in step (1) is BMP4, and its concentration in the medium is 0.1 nM to 5.0 nM,
The Shh signaling pathway agent in steps (1) and (2) is SAG, and its concentration in the medium is 0.1 μM to 2.0 μM;
Differentiation into dorsal hypothalamic tissue is induced by steps (1) and (2),
[1] The production method according to any one of [4].
[6] The dorsal hypothalamic tissue includes one or more neurons selected from the group consisting of vasopressin neurons, oxytocin neurons, thyroid-stimulating hormone releasing hormone neurons, corticotropin releasing hormone neurons, and neuropeptide Y neurons. The manufacturing method as described.
[7] The bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator in step (1) is BMP4, and its concentration in the medium is 0.1 nM to 3.0 nM,
The Shh signaling pathway agent in steps (1) and (2) is SAG, and its concentration in the medium is 0.1 μM to 2.0 μM;
The medium further comprises an Akt inhibitor;
The production method according to any one of [1] to [4], wherein differentiation into a ventral hypothalamic tissue is induced by the steps (1) and (2).
[8] The production method according to [7], wherein the ventral hypothalamic tissue includes one or more neurons selected from the group consisting of agouti-related protein neurons, proopiomelanocortin neurons, melanin-concentrating hormone neurons, and Orexin neurons.
[9] The production method according to any one of [1] to [8], wherein the suspension culture is performed in the absence of feeder cells.
[10] The production method according to any one of [1] to [9], wherein the aggregate in step (1) is formed by suspension culture of dispersed human pluripotent stem cells.
[11] The production method according to [10], wherein the suspension culture is performed by a serum-free agglutination suspension culture method.
[12] A method for producing a cell structure including hypothalamic tissue and pituitary tissue, including the following steps (i) to (iii):
(I) a suspension culture of aggregates of human pluripotent stem cells in a medium containing an osteogenic factor signal transduction pathway activator and a Shh signal pathway activator;
(Ii) further suspension-culturing the cell aggregate formed in step (i) in a medium containing a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator and a Shh signal pathway activator;
(Iii) Step of suspension culture of the cell aggregate obtained in step (ii) in a medium suitable for simultaneous induction of the pituitary gland and the hypothalamus. [13] Steps (ii) and (iii) are performed with high oxygen partial pressure. The production method according to [12], which is performed under conditions.
[14] The following step (a) is performed between step (ii) and step (iii), and in step (iii), the cell aggregate obtained in step (a) is suspended and cultured [12] or [ 13]:
(A) A step of further subjecting the cell aggregate obtained in step (ii) to suspension culture in a medium containing an Shh signal pathway agent.
[15] The production method according to any one of [12] to [14], wherein step (a) is performed under high oxygen partial pressure conditions.
[16] The production method according to any one of [12] to [15], wherein the suspension culture is performed in the absence of feeder cells.
[17] The production method according to any one of [12] to [16], wherein the aggregate in step (i) is formed by suspension culture of dispersed human pluripotent stem cells.
[18] The production method according to any one of [12] to [17], wherein the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator is BMP4.
[19] The production method according to any one of [12] to [18], wherein the substance acting on the Shh signal pathway is SAG.
[20] A cell structure obtained by the production method according to any one of [1] to [19].
マウスES細胞のAVPニューロンへの分化（左）とヒトES細胞の培養結果（右）。マウスES細胞で有効な分化法をヒトES細胞に適用しても細胞塊は形成されなかった。AVP：緑。Differentiation of mouse ES cells into AVP neurons (left) and culture results of human ES cells (right). Even when a differentiation method effective for mouse ES cells was applied to human ES cells, no cell mass was formed. AVP: Green. 血清代替物KSRを低濃度で含有する培地を用いた分化。凝集塊は形成されたが（左）、終脳へと分化した（右）。Rx::Venus：緑、Bf1：赤、DAPI：青。Differentiation using a medium containing a low concentration of serum substitute KSR. Aggregates formed (left) but differentiated into the telencephalon (right). Rx :: Venus: Green, Bf1: Red, DAPI: Blue. 血清代替物KSRを低濃度で含有し、且つBMP4シグナルを含有する培地を用いた分化。視床下部マーカーRxと背側マーカーPax6が共陽性になったが、網膜マーカーChx10も陽性になった。Rx::Venus：緑、Pax6：赤、Nkx2.1（NKX2-1 NK2 homeobox 1）：白、DAPI：青、Chx10：赤。Differentiation using a medium containing the serum substitute KSR at a low concentration and containing a BMP4 signal. Hypothalamic marker Rx and dorsal marker Pax6 were both positive, but retinal marker Chx10 was also positive. Rx :: Venus: Green, Pax6: Red, Nkx2.1 (NKX2-1 NK2 homeobox 1): White, DAPI: Blue, Chx10: Red. 血清代替物KSRを低濃度で含有し、BMP4シグナルを含有し、且つShhシグナル （ShhアゴニストであるSAG）を含有する培地を用いた分化。視床下部前駆細胞へと分化させることが可能になった（左）。Rx::Venus：緑、Pax6：赤、Nkx2.1：白、DAPI：青。視床下部前駆細胞の分化効率は80%を超えた（右）。Differentiation with medium containing serum substitute KSR at low concentration, BMP4 signal, and Shh signal (SAG, which is a Shh agonist). It became possible to differentiate into hypothalamic progenitor cells (left). Rx :: Venus: Green, Pax6: Red, Nkx2.1: White, DAPI: Blue. The differentiation efficiency of hypothalamic progenitor cells exceeded 80% (right). 背側視床下部誘導条件での培養30日目の細胞構造体（左）と、腹側視床下部誘導条件での培養30日目の細胞構造体（右）。Rx::Venus：緑、Pax6：赤、Nkx2.1：白、DAPI：青。A cell structure on the 30th day under the dorsal hypothalamic induction condition (left) and a cell structure on the 30th day under the ventral hypothalamic induction condition (right). Rx :: Venus: Green, Pax6: Red, Nkx2.1: White, DAPI: Blue. 背側視床下部誘導条件での培養60日目の細胞構造体。Opt：赤、DAPI：青、Brn2：白。Cell structure on day 60 of culture under dorsal hypothalamic induction conditions. Opt: Red, DAPI: Blue, Brn2: White. 背側視床下部誘導条件（分散培養なし）での培養103日目の細胞構造体。AVP：赤、DAPI：青。Cell structure on day 103 of culture under dorsal hypothalamic induction condition (no distributed culture). AVP: Red, DAPI: Blue. 背側視床下部誘導条件（分散培養あり）での培養150日目の細胞構造体。AVP：赤、DAPI：青。Cell structure on day 150 of culture under dorsal hypothalamic induction conditions (with distributed culture). AVP: Red, DAPI: Blue. 背側視床下部誘導条件（分散培養あり）で構築された細胞構造体の産生するAVPホルモンの測定結果（左）とKCl刺激試験の結果（右）。Measurement results of AVP hormone produced by cell structures constructed under dorsal hypothalamic induction conditions (with dispersed culture) (left) and results of KCl stimulation test (right). 背側視床下部誘導条件（分散培養あり）での培養130～150日目の細胞構造体に認められた視床下部ニューロン（下）と、各視床下部ニューロンの生体での局在（上）。OXT：緑、TRH：赤、CRH：赤、NPY：赤、AgRP：赤、POMC：赤、MCH：赤、Orexin：緑。Hypothalamic neurons (bottom) observed in cell structures from day 130 to 150 of culture under dorsal hypothalamic induction conditions (with distributed culture), and localization of each hypothalamic neuron in the living body (top). OXT: Green, TRH: Red, CRH: Red, NPY: Red, AgRP: Red, POMC: Red, MCH: Red, Orexin: Green. 各視床下部ニューロンの分化効率の比較。神経細胞1,000個あたりの免疫染色陽性ニューロンの数で比較した。Comparison of differentiation efficiency of each hypothalamic neuron. Comparison was made by the number of immunostaining positive neurons per 1,000 neurons. 腹側視床下部誘導条件での培養150日目の細胞構造体。MCH：赤、DAPI：青。Cell structure on day 150 of culture under ventral hypothalamic induction conditions. MCH: Red, DAPI: Blue. 視床下部と下垂体の同時成熟条件での培養150日目の細胞構造体。DAPI：青、CRH：緑、ACTH：赤。Cell structure on day 150 of culturing under conditions of simultaneous maturation of hypothalamus and pituitary. DAPI: Blue, CRH: Green, ACTH: Red. 背側視床下部誘導法の概略図。Schematic of the dorsal hypothalamus guidance method. 腹側視床下部誘導法の概略図。Schematic of the ventral hypothalamus guidance method. 視床下部と下垂体の同時成熟法の概略図（前半）。Schematic (first half) of simultaneous maturation method of hypothalamus and pituitary gland. 視床下部と下垂体の同時成熟法の概略図（後半）。Schematic of the method of simultaneous maturation of hypothalamus and pituitary gland (second half). ヒトiPS細胞（201B7株）を分化させて得られた視床下部AVPニューロンの免疫染色像。AVP：緑、DAPI：青。Immunostained images of hypothalamic AVP neurons obtained by differentiating human iPS cells (201B7 strain). AVP: Green, DAPI: Blue. 視床下部と下垂体の同時成熟条件でヒトiPS細胞を培養して得られた構造体のACTH分泌能。＊ p<0.05、＊＊ p<0.01ACTH secretion ability of structures obtained by culturing human iPS cells under the simultaneous maturation conditions of the hypothalamus and pituitary gland. * P <0.05, ** p <0.01 下垂体（前葉）と視床下部を分離し、下垂体（前葉）のみを培養した場合（A）と、下垂体（前葉）と視床下部を再度隣接させて培養した場合（B)のACTH分泌能の比較。培養150日目の培養液中のACTH濃度を測定した（右）。＊ p<0.05ACTH secretion ability when the pituitary gland (anterior lobe) and hypothalamus are separated and only the pituitary gland (anterior lobe) is cultured (A) and when the pituitary gland (anterior lobe) and hypothalamus are cultured again (B) comparison. The ACTH concentration in the culture solution on the 150th day of culture was measured (right). * P <0.05 CRHによるACTH刺激試験の概要を示す模式図（右）と試験結果（左）。＊ p<0.05。中央は免疫染色像。DAPI：青、ACTH：緑、CRH-R1：赤。Schematic diagram (right) and test results (left) showing an overview of the ACTH stimulation test with CRH. * P <0.05. The center is an immunostained image. DAPI: Blue, ACTH: Green, CRH-R1: Red. デキサメサゾンによるACTH抑制試験の概要を示す模式図（右）と試験結果（左）。＊ p<0.05Schematic diagram (right) and test results (left) showing an overview of the ACTH suppression test with dexamethasone. * P <0.05 CRH-R1阻害薬によるACTH抑制試験の概要を示す模式図（右）と試験結果（左と中央）。＊ p<0.05Schematic diagram (right) and test results (left and center) showing an overview of the ACTH suppression test with CRH-R1 inhibitors. * P <0.05 低グルコースによるACTH分泌試験、及び低グルコース＋CRH-R1阻害薬負荷試験の概要を示す模式図（右）と試験結果（左と中央）。＊ p<0.05、＊＊ p<0.01Schematic diagram (right) and test results (left and center) showing an overview of the low glucose + ACTH secretion test and low glucose + CRH-R1 inhibitor loading test. * P <0.05, ** p <0.01 既報の方法で分化誘導して得られた構造体の免疫染色像（左、中央）と、対応する模式図（右）。ACTH：赤、Lim3：緑、Rx：緑、AVP：赤。An immunostained image (left, center) of a structure obtained by differentiation induction by a previously reported method and a corresponding schematic diagram (right). ACTH: Red, Lim3: Green, Rx: Green, AVP: Red.
１．視床下部組織を含む細胞構造体の製造方法
　本発明の第１の局面は、視床下部組織を含む細胞構造体を製造する方法に関する。視床下部は弓状核、室傍核、側室周囲核、視索上核、視索前核、背内側視床下部核、腹内側視床下部核、後核などから構成される。視床下部には神経細胞と内分泌細胞の両方の機能を合わせ持つ細胞群が存在する。視床下部をその位置関係から背側視床下部と腹側視床下部に大別することができる。背側視床下部と腹側視床下部には各々特徴的な神経細胞（視床下部ニューロン）が存在する。視床下部において主に背側寄りに局在を認める神経細胞にはバゾプレシン（AVP）ニューロン、オキシトシン（OXT）ニューロン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）ニューロン、コルチコトロピン放出ホルモン（CRH）ニューロン、ニューロペプチドY（NPY）ニューロン等があり、主に腹側寄りに局在を認める神経細胞にはアグーチ関連タンパク質（AgRP）ニューロン、プロオピオメラノコルチン（POMC）ニューロン、メラニン凝集ホルモン（MCH）ニューロン、Orexinニューロン等がある。 1. Method for Producing Cell Structure Containing Hypothalamic Tissue The first aspect of the present invention relates to a method for producing a cell structure containing a hypothalamic tissue. The hypothalamus is composed of the arcuate nucleus, paraventricular nucleus, periventricular nucleus, supraoptic nucleus, preoptic nucleus, dorsal medial hypothalamic nucleus, ventral medial hypothalamic nucleus, posterior nucleus, and the like. In the hypothalamus, there is a group of cells having the functions of both neurons and endocrine cells. The hypothalamus can be broadly divided into a dorsal hypothalamus and a ventral hypothalamus based on the positional relationship. Characteristic neurons (hypothalamic neurons) exist in the dorsal hypothalamus and ventral hypothalamus, respectively. Neurons that are localized mainly in the dorsal hypothalamus include vasopressin (AVP) neurons, oxytocin (OXT) neurons, thyroid stimulating hormone releasing hormone (TRH) neurons, corticotropin releasing hormone (CRH) neurons, neuropeptide Y There are (NPY) neurons, etc. Neurons that are mainly localized on the ventral side include agouti-related protein (AgRP) neurons, proopiomelanocortin (POMC) neurons, melanin-concentrating hormone (MCH) neurons, Orexin neurons, etc. is there.
　本発明では、背側視床下部と腹側視床下部を総称する用語として視床下部組織を使用する。従って、特に言及のない限り、用語「視床下部組織」は、背側視床下部又は腹側視床下部、或いはこれらの両者を含む組織を意味する。 In the present invention, the hypothalamic tissue is used as a general term for the dorsal hypothalamus and ventral hypothalamus. Thus, unless otherwise noted, the term “hypothalamic tissue” means tissue that includes the dorsal hypothalamus or ventral hypothalamus, or both.
　本発明の製造方法では、以下のステップ（１）及び（２）を行う。
　（１）ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ
　（２）ステップ（１）で得られた細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ In the manufacturing method of the present invention, the following steps (1) and (2) are performed.
(1) Suspension culture of aggregates of human pluripotent stem cells in a medium containing a low concentration of an osteogenic factor signal transduction pathway activator and a low concentration of an Shh signal pathway activator (2) Step (1) The cell aggregate obtained in step 1 is further subjected to suspension culture in a medium containing a substance acting on the Shh signal pathway
　ステップ（１）
　ステップ（１）では、まず、ヒト多能性幹細胞の凝集塊を用意する。「ヒト多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つヒト細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。 Step (1)
In step (1), first, an aggregate of human pluripotent stem cells is prepared. “Human pluripotent stem cells” are the ability to differentiate into all the cells that make up a living body (differentiated pluripotency) and the ability to generate daughter cells that have the same differentiation potential as self through cell division (self-replication) Noh). Pluripotency can be evaluated by transplanting cells to be evaluated into nude mice and testing for the presence or absence of teratoma containing each of the three germ layers (ectodermal, mesoderm, and endoderm). it can.
　多能性幹細胞として、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。本発明においては、ES細胞又はiPS細胞が好適に用いられる。 Examples of pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), etc., which have both differentiation pluripotency and self-renewal ability. As long as it is a cell, it is not limited to this. In the present invention, ES cells or iPS cells are preferably used.
　ES細胞は、例えば、着床以前の初期胚、当該初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual， Second Edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994） ;Thomson，J. A. et al.，Science，282， 1145-1147（1998））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al.（Nature， 385， 810（1997））、Cibelli et al. （Science， 280， 1256（1998））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素， 44， 892 （1999））、Baguisi et al. （Nature Biotechnology， 17， 456 （1999））、Wakayama et al. （Nature， 394， 369 （1998）; Nature Genetics， 22， 127 （1999）; Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 96， 14984 （1999））、Rideout III et al. （Nature Genetics， 24， 109 （2000）、Tachibana et al. （Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell （2013） in press）。初期座として、単為発生胚を用いてもよいKim et al. （Science， 315， 482-486 （2007））、Nakajima et al. （Stem Cells， 25， 983-985 （2007））、Kim et al. （Cell Stem Cell， 1， 346-352 （2007））、Revazova et al. （Cloning Stem Cells， 9， 432-449 （2007））、Revazova et al.（Cloning Stem Cells， 10， 11-24 （2008））。上掲の論文の他、ES細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004；Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。尚、ES細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ES細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。 ES cells can be established, for example, by culturing an early embryo before implantation, an inner cell mass constituting the early embryo, a single blastomere, etc. (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Thomson, J. A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)). As an early embryo, an early embryo produced by nuclear transfer of a nucleus of a somatic cell may be used (Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256). (1998)), Akira Iriya et al. (Protein Nucleic Acid Enzyme, 44, 892 (1999)), Bagisi et al. (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999)), Wakayama et al. (Nature, 394, 369 (1998) ; Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999)), Rideout III et al. (Nature Genetics, 24, 109 (2000), Tachibana et al. ( Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell (2013) in press) Kim。et al. (Science, 315, 482-486 (2007)), Nakajima et al. (Stem Cells, 25, 983-985 (2007)), Kim et al. (Cell Stem Cell, 1, 346-352 (2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 9, 432-449 (2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 10, 11-24 (2008)). For the production of ES cells, see Strelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004; Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006; Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008; Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006; Wassarman, PM et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003, etc. Note that fused ES cells obtained by cell fusion of ES cells and somatic cells are also included in the embryonic stem cells used in the method of the present invention.
　ES細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトES細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばKhES-1、KhES-2及びKhES-3）、WiCell Research Institute、ESI BIOなどから入手可能である。 Some ES cells are available from preserving institutions or are commercially available. For example, human ES cells can be obtained from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University (for example, KhES-1, KhES-2 and KhES-3), WiCell Research Institute, ESI BIO, and the like.
　EG細胞は、始原生殖細胞を、LIF、bFGF、SCFの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al.， Cell， 70， 841-847 （1992）、Shamblott et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 95 （23）, 13726-13731 （1998）、Turnpenny et al.， Stem Cells， 21（5）， 598-609， （2003））。 EG cells can be established by culturing primordial germ cells in the presence of LIF, bFGF, SCF, etc. (Matsui et al., Cell, 70, 841-847 (1992), Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (23), 13726-13731 (1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21 (5), 598-609, (2003)).
　「誘導多能性幹細胞（iPS細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞（例えば線維芽細胞、皮膚細胞、リンパ球等）をリプログラミングすることによって作製される、分化多能性と自己複製能を有する細胞である。iPS細胞はES細胞に近い性質を示す。iPS細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。iPS細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるiPS細胞作製法を適用することも当然に想定される。 “Induced pluripotent stem cells (iPS cells)” are differentiated pluripotent cells created by reprogramming somatic cells (eg, fibroblasts, skin cells, lymphocytes, etc.) by introducing reprogramming factors. And self-replicating cells. iPS cells are similar to ES cells. Somatic cells used for the production of iPS cells are not particularly limited, and may be differentiated somatic cells or undifferentiated stem cells. iPS cells can be prepared by various methods reported so far. In addition, it is naturally assumed that an iPS cell production method developed in the future will be applied.
　iPS細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトiPS細胞についてはOct4、Sox2、Lin28及びNonogの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。c-Mycを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Oct3/4及びKlf4の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはOct3/4のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるiPS細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素G9aに対する阻害剤BIX-01294やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（VPA）或いはBayK8644等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。 The most basic method of iPS cell production is to introduce four factors, transcription factors Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc, into cells using viruses (Takahashi K, Yamanaka S : Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007). Human iPS cells have been reported to be established by introducing four factors, Oct4, Sox2, Lin28 and Nonog (Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007). Three factors excluding c-Myc (Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008), Oct3 / 4 and Klf4, two factors (Kim J B, et al: Nature 454 (7204 ), 646-650, 2008), or only Oct3 / 4 (Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009) has been reported to establish iPS cells. In addition, a method of introducing a gene expression product into a cell (Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al : Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009) has also been reported. On the other hand, by using the inhibitor BIX-01294 for histone methyltransferase G9a, the histone deacetylase inhibitor valproic acid (VPA) or BayK8644, production efficiency can be improved and factors to be introduced can be reduced. (Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J , Et al: PLoS. Biol. Studies on gene transfer methods are also underway. In addition to retroviruses, lentiviruses (Yu J, et al: Science 318 (5858), 1917-1920, 2007), adenoviruses (Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903 ), 945-949, 2008), plasmid (Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008), transposon vectors (Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: 770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009), or Techniques using episomal vectors (Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009) have been developed.
　iPS細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はFbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCript等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。 Cells that have undergone transformation (reprogramming) into iPS cells are expressed pluripotent stem cell markers (undifferentiation markers) such as Fbxo15, Nanog, Oct / 4, Fgf-4, Esg-1, and Cript Etc. can be selected as an index.
　iPS細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。 IPS cells can also be provided from, for example, Kyoto University or RIKEN BioResource Center.
　ヒト多能性幹細胞は公知の方法により、生体外（in vitro）で維持することができる。臨床応用を視野に入れた場合等、安全性の高い細胞を提供することが望まれる場合には、多能性幹細胞を、血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）を用いた無血清培養や、無フィーダー細胞培養により維持することが好ましい。血清を使用（又は併用）するのであれば、自己血清（即ちレシピエントの血清）を使用するとよい。 Human pluripotent stem cells can be maintained in vitro by known methods. Serum-free culture using pluripotent stem cells with serum substitutes (Knockout 能 serum replacement (KSR), etc.) when it is desired to provide highly safe cells, such as for clinical applications. Or it is preferable to maintain by feeder-free cell culture. If serum is used (or combined), autologous serum (ie recipient serum) may be used.
　ステップ（１）で使用する「ヒト多能性幹細胞の凝集塊」は、分散させたヒト多能性幹細胞を、培養器に対して非接着性の条件下で培養し（即ち、浮遊培養し）、複数のヒト多能性幹細胞を集合させて凝集塊を形成させることにより、得ることができる。 The “aggregate of human pluripotent stem cells” used in step (1) is obtained by culturing dispersed human pluripotent stem cells under non-adhesive conditions with respect to the incubator (ie, suspension culture). It can be obtained by assembling a plurality of human pluripotent stem cells to form an aggregate.
　この凝集塊形成に用いる培養器は特に限定されない。例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等を用いることができる。非接着性の条件下での培養を可能にするため、細胞非接着性の培養面を有する培養器を用いることが好ましい。該当する培養器としては、培養器の細胞非接着性になるように表面（培養面）処理したもの、細胞の接着性向上のための処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）が表面（培養面）に施されていないもの、を挙げることができる。 The incubator used for forming this agglomerate is not particularly limited. For example, flask, tissue culture flask, dish, petri dish, tissue culture dish, multi-dish, microplate, microwell plate, micropore, multiplate, multiwell plate, chamber slide, petri dish, tube, tray, culture bag A roller bottle or the like can be used. In order to enable culturing under non-adhesive conditions, it is preferable to use an incubator having a non-cell-adhesive culture surface. Applicable incubators include surface (culture surface) treated so that the cells become non-adherent in the incubator, treatment for improving cell adhesion (for example, coating treatment with extracellular matrix, etc.) Those not applied to the culture surface) can be mentioned.
　凝集塊の形成に用いる培地は、哺乳動物細胞の培養に用いる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地、及びこれらの混合培地など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham's F-12＝O.8～1.2：1.2～0.8である。 The medium used for the formation of aggregates can be prepared using a medium used for culturing mammalian cells as a basal medium. As the basal medium, for example, BME medium, BGJb medium, CMRL1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium199 medium, Eagle MEM medium, αMEM medium, DMEM medium, Ham medium, Ham's F-12 medium , RPMI1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal medium, and mixed media thereof are not particularly limited as long as they can be used for culturing mammalian cells. In one embodiment, a mixed medium of IMDM medium and Ham's F-12 medium is used. The mixing ratio is a volume ratio, for example, IMDM: Ham's F-12 = O.8 to 1.2: 1.2 to 0.8.
　血清含有培地、無血清培地のいずれを使用することもできる。無血清培地とは、血清を含まない培地である。精製した血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）を含有する培地は、血清自体を含まない限りにおいて、無血清培地に該当する。未知の或いは意図しない成分の混入を回避するため等の観点から、無血清培地を用いることが好ましい。 Either a serum-containing medium or a serum-free medium can be used. A serum-free medium is a medium that does not contain serum. A medium containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components (for example, growth factors) corresponds to a serum-free medium as long as serum itself is not included. From the viewpoint of avoiding mixing of unknown or unintended components, it is preferable to use a serum-free medium.
　凝集塊の形成に用いる培地が血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3'チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを含有し得る。公知の方法（例えばＷ０　９８／３０６７９を参照）により血清代替物を調製することができる。市販の血清代替物を用いることもできる。市販の血清代替物の例として、KSR（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated （Gibco社製）、Glutamax （Gibco社製）が挙げられる。 The medium used for the formation of aggregates may contain a serum substitute. Serum replacements can contain, for example, albumin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3 ′ thiol glycerol, or equivalents thereof. Serum substitutes can be prepared by known methods (see eg W0 98/30679). A commercially available serum replacement can also be used. Examples of commercially available serum substitutes include KSR (manufactured by Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco), and Glutamax (Gibco).
　凝集塊の形成に用いる培地は、ヒト多能性幹細胞から、目的の組織への分化誘導に悪影響を与えないことを条件に他の添加物を含むことができる。ここでの添加物として、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）を挙げることができる。 The medium used for the formation of aggregates can contain other additives provided that it does not adversely affect differentiation induction from human pluripotent stem cells into the target tissue. Examples of additives herein include insulin, iron sources (for example, transferrin), minerals (for example, sodium selenate), saccharides (for example, glucose), organic acids (for example, pyruvate, lactic acid, etc.), serum proteins (for example, Albumin etc.), amino acids (eg L-glutamine etc.), reducing agents (eg 2-mercaptoethanol etc.), vitamins (eg ascorbic acid, d-biotin etc.), antibiotics (eg streptomycin, penicillin, gentamicin etc.), buffer An agent (for example, HEPES etc.) can be mentioned.
　例えば、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の形成に際しては、まず、ヒト多能性幹細胞を継代培養から回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。ヒト多能性幹細胞の分散は、適切な細胞解離液を用いて行うことができる。細胞解離液としては、例えば、EDTA-トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。細胞障害性が少ないものが好ましい。このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE （Invitrogen）又はアキュターゼ（MILLIPORE）等の市販品が入手可能である。分散されたヒト多能性幹細胞は上記培地中に懸濁される。 For example, when forming an aggregate of human pluripotent stem cells, first, the human pluripotent stem cells are recovered from the subculture and dispersed into single cells or a state close thereto. Human pluripotent stem cells can be dispersed using an appropriate cell dissociation solution. As the cell dissociation solution, for example, proteolytic enzymes such as EDTA-trypsin, collagenase IV, metalloprotease and the like can be used alone or in appropriate combination. Those having low cytotoxicity are preferred. As such a cell dissociation solution, for example, commercially available products such as dispase (Adia), TrypLE® (Invitrogen), or Accutase (MILLIPORE) are available. Dispersed human pluripotent stem cells are suspended in the medium.
　分散したヒト多能性幹細胞の懸濁液を培養器中に播き、分散したヒト多能性幹細胞を培養器に対して非接着性の条件下で培養することにより、複数のヒト多能性幹細胞が集合し凝集塊を形成する。この際、分散したヒト多能性幹細胞を比較的大きな培養器（例えば10cmディッシュ）に播種し、1つの培養コンパートメント中に複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊を同時に形成させてもよいが、このようにすると凝集塊毎の大きさや、凝集塊に含まれるヒト多能性幹細胞の数に大きなばらつきが生じ得る。そして、このばらつきが原因となり、凝集塊間で分化の程度に差が生じ、結果として分化誘導効率が低下してしまう。そこで、分散したヒト多能性幹細胞を迅速に凝集させ、1つの培養コンパートメント中に1つの凝集塊を形成させることが好ましい。分散したヒト多能性幹細胞を迅速に凝集させる方法としては、例えば、以下の方法（１）及び（２）を挙げることができる。
（１）比較的小さな体積（例えば、1ml以下、500μl以下、200μl以下、100μl以下）の培養コンパートメント中に、分散したヒト多能性幹細胞を閉じ込め、コンパートメント中に1個の凝集塊を形成させる。好ましくは、分散したヒト多能性幹細胞を閉じ込めた後、培養コンパートメントを静置する。培養コンパートメントとしては、マルチウェルプレート（384ウェル、192ウェル、96ウェル、48ウェル、24ウェル等）、マイクロポア、チャンバースライド等におけるウェルや、チューブ、ハンギングドロップ法における培地の液滴等を挙げることができるが、これらに限定されない。コンパートメントに閉じ込められた、分散したヒト多能性幹細胞が重力の作用で1箇所に沈殿し、或いは細胞同士が接着することにより、1つのコンパートメントにつき1つの凝集塊が形成される。マルチウェルプレート、マイクロポア、チャンバースライド、チューブ等の底の形状は、分散したヒト多能性幹細胞が1箇所へ沈殿するのが容易となるようにU底又はV底であることが好ましい。
（２）分散したヒト多能性幹細胞を遠心チューブに入れて遠心し、1箇所にヒト多能性幹細胞を沈殿させる。チューブ中に1個の凝集塊が形成される。 A plurality of human pluripotent stem cells can be obtained by seeding a suspension of dispersed human pluripotent stem cells in an incubator and culturing the dispersed human pluripotent stem cells under non-adherent conditions to the incubator. Aggregate to form agglomerates. At this time, dispersed human pluripotent stem cells may be seeded in a relatively large incubator (for example, a 10 cm dish), and an aggregate of a plurality of human pluripotent stem cells may be simultaneously formed in one culture compartment. In this way, large variations may occur in the size of each aggregate and the number of human pluripotent stem cells contained in the aggregate. This variation causes a difference in the degree of differentiation between the aggregates, resulting in a decrease in differentiation induction efficiency. Therefore, it is preferable that the dispersed human pluripotent stem cells are rapidly aggregated to form one aggregate in one culture compartment. Examples of a method for rapidly aggregating dispersed human pluripotent stem cells include the following methods (1) and (2).
(1) The dispersed human pluripotent stem cells are confined in a culture compartment having a relatively small volume (for example, 1 ml or less, 500 μl or less, 200 μl or less, 100 μl or less), and one aggregate is formed in the compartment. Preferably, after the dispersed human pluripotent stem cells are confined, the culture compartment is allowed to stand. Examples of culture compartments include wells in multi-well plates (384-well, 192-well, 96-well, 48-well, 24-well, etc.), micropores, chamber slides, etc., tubes, medium drops in the hanging drop method, etc. However, it is not limited to these. Dispersed human pluripotent stem cells trapped in the compartment are precipitated in one place by the action of gravity, or the cells adhere to each other, so that one aggregate is formed in one compartment. The bottom shape of the multi-well plate, micropore, chamber slide, tube or the like is preferably U-bottom or V-bottom so that the dispersed human pluripotent stem cells can be easily precipitated in one place.
(2) The dispersed human pluripotent stem cells are placed in a centrifuge tube and centrifuged to precipitate the human pluripotent stem cells in one place. One aggregate is formed in the tube.
　1つの培養コンパートメント中に播くヒト多能性幹細胞の数は、1つの培養コンパートメントにつき1つの凝集塊が形成され、且つ本発明の方法によって、該凝集塊において、ヒト多能性幹細胞から目的の組織（視床下部組織、視床下部と下垂体組織）への分化誘導が可能であれば特に限定されないが、1つの培養コンパートメントにつき、通常約1×103～約5×104個、好ましくは約1×103～約2×104個、より好ましくは約2×103～約1.2×104個のヒト多能性幹細胞を播く。そして、ヒト多能性幹細胞を迅速に凝集させることにより、1つの培養コンパートメントにつき、通常約1×103～約5×104個、好ましくは約1×103～約2×104個、より好ましくは約2×103～約1.2×104個のヒト多能性幹細胞からなる細胞凝集塊が1個形成される。 The number of human pluripotent stem cells seeded in one culture compartment is such that one aggregate is formed per culture compartment, and the target tissue is separated from the human pluripotent stem cell in the aggregate by the method of the present invention. Although it is not particularly limited as long as differentiation induction into (hypothalamic tissue, hypothalamus and pituitary tissue) is possible, it is usually about 1 × 10 3 to about 5 × 10 4 per culture compartment, preferably about 1 From × 10 3 to about 2 × 10 4 cells, more preferably from about 2 × 10 3 to about 1.2 × 10 4 human pluripotent stem cells are seeded. Then, by rapidly agglutinating human pluripotent stem cells, about 1 × 10 3 to about 5 × 10 4 cells, preferably about 1 × 10 3 to about 2 × 10 4 cells per culture compartment, More preferably, one cell aggregate consisting of about 2 × 10 3 to about 1.2 × 10 4 human pluripotent stem cells is formed.
　凝集塊形成までの時間は、1つの培養コンパートメントにつき1つの凝集塊が形成され、且つ本発明の方法によって、該凝集塊において、ヒト多能性幹細胞から目的の組織への分化誘導が可能な範囲で適宜決定可能であるが、目的の組織への効率よい分化誘導のためには、この時聞は短いことが好ましい。好ましくは、24時間以内、より好ましくは12時間以内、さらに好ましくは6時間以内、最も好ましくは、2～3時間でヒト多能性幹細胞の凝集塊を形成させる。この凝集塊形成までの時間は、細胞を凝集させるための器具や条件（例えば遠心処理の条件）などの設定ないし調整によって当業者であれば適宜調節することが可能である。 The time to aggregate formation is a range in which one aggregate is formed per culture compartment, and differentiation can be induced from the human pluripotent stem cell to the target tissue in the aggregate by the method of the present invention. However, it is preferable that this time is short for efficient differentiation induction to the target tissue. Preferably, aggregates of human pluripotent stem cells are formed within 24 hours, more preferably within 12 hours, even more preferably within 6 hours, and most preferably within 2 to 3 hours. A person skilled in the art can appropriately adjust the time until the formation of the agglomerate by setting or adjusting an instrument and conditions (for example, conditions for centrifugation) for aggregating cells.
　凝集塊形成時の培養温度、C02濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。また、C02濃度は、例えば約1～10%、好ましくは約5%である。 Aggregate formation during cultivation temperature, other culture conditions such as C0 2 concentration may be set as appropriate. The culture temperature is not particularly limited and is, for example, about 30 to 40 ° C, preferably about 37 ° C. Also, C0 2 concentration, for example, from about 1-10%, preferably about 5%.
　同一培養条件の培養コンパートメントを複数用意し、各培養コンパートメントにおいて1個のヒト多能性幹細胞の凝集塊を形成させることにより、質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を得ることができる。ヒト多能性幹細胞の凝集塊が質的に均一であることは、凝集塊のサイズ及び細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態及びその均一性、分化及び未分化マーカーの発現及びその均一性、分化マーカーの発現制御及びその同期性、分化効率の凝集塊間の再現性などに基づき評価することが可能である。一態様において、本発明の方法に用いる、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団は、凝集塊中に含まれるヒト多能性幹細胞の数が均一である。特定のパラメーターについて、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団が「均一」とは、凝集塊の集団全体のうちの90%以上の凝集塊が、当該凝集塊の集団における当該パラメーターの平均値±10%の範囲内、好ましくは、平均値±5%の範囲内であることを意味する。 By preparing multiple culture compartments under the same culture conditions and forming one human pluripotent stem cell aggregate in each culture compartment, a qualitatively uniform population of human pluripotent stem cell aggregates is obtained. be able to. The qualitative uniformity of aggregates of human pluripotent stem cells means that the aggregate size and number of cells, macroscopic morphology, microscopic morphology and homogeneity by tissue staining analysis, expression of differentiation and undifferentiation markers It is possible to evaluate based on homogeneity thereof, expression control of differentiation markers and synchronization thereof, reproducibility of aggregates of aggregation efficiency, and the like. In one embodiment, the population of human pluripotent stem cell aggregates used in the method of the present invention has a uniform number of human pluripotent stem cells contained in the aggregate. For a particular parameter, a population of human pluripotent stem cell aggregates is `` homogeneous '' means that 90% or more of the aggregates in the aggregate population are average values of the parameters in the aggregate population ± It means within a range of 10%, preferably within an average value ± 5%.
　ステップ（１）では、ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。 In step (1), agglomerates of human pluripotent stem cells are cultured in suspension in a medium containing a low concentration of a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator and a low concentration of a Shh signal pathway activator.
　凝集塊を「浮遊培養する」とは、凝集塊を、培地中において、培養器に対して非接着性の条件下で培養することをいう。浮遊培養に用いられる培地は、低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の作用により、ヒト多能性幹細胞の視床下部への分化が誘導される。 “To float culture” an agglomerate refers to culturing the agglomerate in a medium under non-adhesive conditions with respect to the incubator. The medium used for suspension culture contains a low concentration of an osteogenic factor signal transduction pathway activator and a low concentration of an Shh signal pathway agonist. Differentiation of human pluripotent stem cells into the hypothalamus is induced by the action of the osteogenic factor signal transduction pathway activator and the Shh signal pathway agonist.
　浮遊培養に用いる培養器は特に限定されない。例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等を用いることができる。非接着性の条件下での培養を可能にするため、細胞非接着性の培養面を有する培養器を用いることが好ましい。該当する培養器としては、培養器の細胞非接着性になるように表面（培養面）処理したもの、細胞の接着性向上のための処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）が表面（培養面）に施されていないもの、を挙げることができる。 The incubator used for suspension culture is not particularly limited. For example, flask, tissue culture flask, dish, petri dish, tissue culture dish, multi-dish, microplate, microwell plate, micropore, multiplate, multiwell plate, chamber slide, petri dish, tube, tray, culture bag A roller bottle or the like can be used. In order to enable culturing under non-adhesive conditions, it is preferable to use an incubator having a non-cell-adhesive culture surface. Applicable incubators include surface (culture surface) treated so that the cells become non-adherent in the incubator, treatment for improving cell adhesion (for example, coating treatment with extracellular matrix, etc.) Those not applied to the culture surface) can be mentioned.
　浮遊培養に用いる培養器として、酸素透過性のものを用いても良い。酸素透過性の培養器を用いることにより、細胞凝集塊への酸素の供給が向上し、細胞凝集塊の長期間の維持培養に寄与しうる。 As an incubator used for suspension culture, an oxygen permeable one may be used. By using an oxygen-permeable incubator, the supply of oxygen to the cell aggregate can be improved, which can contribute to long-term maintenance culture of the cell aggregate.
　細胞凝集塊の浮遊培養に際しては、細胞凝集塊の培養器に対する非接着状態を維持できる限り、細胞凝集塊を静置培養してもよいし、旋回培養や振とう培養により凝集塊を意識的に動かしてもよい。但し、本発明においては、旋回培養や振とう培養により凝集塊を意識的に動かす必要はない。即ち、一態様において、本発明の製造方法における浮遊培養は、静置培養により行われる。静置培養とは、凝集塊を意識的に移動させない状態で培養する培養法のことをいう。例えば、局所的な培地温度の変化に伴って培地が対流し、その流れによって凝集塊が移動することがあるが、意識的に凝集塊を移動させていないことから、この様な場合も静置培養に該当する。浮遊培養の全期間を通じて静置培養を実施してもよいし、一部の期間のみ静置培養を実施してもよい。好ましい態様において、浮遊培養の全期間を通じて、静置培養を行う。静置培養は特別の装置が不要であること、細胞塊のダメージも少ないことが期待されること、培養液の量も少なくできることなど、多くの利点を有する。 In suspension culture of cell aggregates, the cell aggregates may be statically cultured as long as the non-adhesive state of the cell aggregates with respect to the incubator can be maintained. You may move it. However, in the present invention, it is not necessary to consciously move the aggregate by swirling culture or shaking culture. That is, in one aspect, the suspension culture in the production method of the present invention is performed by stationary culture. The stationary culture refers to a culture method for culturing in a state where the aggregate is not intentionally moved. For example, the medium may convect with local changes in the medium temperature, and the aggregate may move due to the flow. However, since the aggregate is not intentionally moved, it is also allowed to stand in this case. Corresponds to culture. Static culture may be performed throughout the whole period of suspension culture, or static culture may be performed only for a part of the period. In a preferred embodiment, stationary culture is performed throughout the entire period of suspension culture. Static culture has many advantages, such as the fact that a special device is not required, damage to the cell mass is expected to be small, and the amount of the culture solution can be reduced.
　フィーダー細胞の存在下/非存在下いずれの条件で細胞凝集塊の浮遊培養を行ってもよいが、未決定因子の混入を回避する観点からフィーダー細胞の非存在下で細胞凝集塊の浮遊培養を行うのが好ましい。 Cell aggregates may be suspended in the presence or absence of feeder cells, but from the viewpoint of avoiding contamination of undecided factors, cell aggregates may be suspended in the absence of feeder cells. It is preferred to do so.
　細胞凝集塊の浮遊培養における培養温度、C02濃度、02濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1～10%、好ましくは約5%である。02濃度は、例えば約20%である。 The culture temperature in the suspension culture of cells clumps, C0 2 concentration, other culture conditions such as 0 2 concentration can be set as appropriate. The culture temperature is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. The CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%. The 0 2 concentration is, for example, about 20%.
　本発明において、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、骨形成因子と受容体との結合によってシグナルが伝達される経路を活性化する物質を意味する。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の例としてはBMP2、BMP4、BMP7、GDF5などが挙げられる。好ましくは、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質としてBMP4を用いる。以下、主にBMP4について記載するが、本発明において使用される骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質はBMP4に限定されない。BMP4は公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。本発明に用いるBMP4は哺乳動物のBMP4である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブ夕、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることができる。BMP4は、好ましくは、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のBMP4であり、最も好ましくはヒトBMP4である。ヒトBMP4とは、ヒトが生体内で天然に発現するBMP4のアミノ酸配列を有するBMP4のことを意味する。ヒトBMP4の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001193.2（2013年6月15日更新）、NP_570911.2（2013年6月15日更新）、NP_570912.2（2013年6月15日更新）、これらのアミノ酸配列のそれぞれからN末端シグナル配列（1-24）を除いたアミノ酸配列（成熟型ヒトBMP4アミノ酸配列）を例示することができる。 In the present invention, a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activating substance means a substance that activates a pathway through which a signal is transmitted by binding of a bone morphogenetic factor and a receptor. Examples of the osteogenic factor signal transduction pathway activator include BMP2, BMP4, BMP7, GDF5 and the like. Preferably, BMP4 is used as a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator. Hereinafter, although mainly BMP4 will be described, the osteogenic factor signal transduction pathway activator used in the present invention is not limited to BMP4. BMP4 is a known cytokine and its amino acid sequence is also known. BMP4 used in the present invention is mammalian BMP4. Examples of mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and laboratory animals such as rabbits, livestock such as buyu, cattle, goats, horses, and sheep, pets such as dogs and cats, humans, monkeys, and the like. Primates such as orangutans and chimpanzees. BMP4 is preferably a rodent (mouse, rat, etc.) or primate (human, etc.) BMP4, most preferably human BMP4. Human BMP4 means BMP4 having the amino acid sequence of BMP4 that is naturally expressed in vivo by humans. The representative amino acid sequences of human BMP4 are NCBI accession numbers, NP_001193.2 (updated June 15, 2013), NP_570911.2 (updated June 15, 2013), NP_570912.2 (2013) (Updated on June 15), an amino acid sequence (mature human BMP4 amino acid sequence) obtained by removing the N-terminal signal sequence (1-24) from each of these amino acid sequences can be exemplified.
　本発明におけるShhシグナル経路作用物質は、Shhにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り、特に限定されない。Shhシグナル経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白（例えば、Shh）、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Purmorphamine、Smoothened Agonist （SAG） （3-Chloro-N-[trans-4-（methylamino）cyclohexyl]-N-[[3-（4-pyridinyl）phenyl]methyl]-benzo[b]thiophene-2-carboxamide）及びHh-Ag1.5（3-chloro-4,7-difluoro-N-(4-(methylamino)cyclohexyl)-N-(3(pyridin-4-yl)benzyl)benzo[b]thiophene-2-carboxamide)を挙げることができる。特にSAGが好ましい。 The Shh signal pathway acting substance in the present invention is not particularly limited as long as it can enhance signal transduction mediated by Shh. Examples of Shh signal pathway agonists include proteins belonging to the Hedgehog family (for example, Shh), Shh receptors, Shh receptor agonists, Purmorphamine, Smoothened Agonist (SAG) (3-Chloro-N- [trans-4- ( methylamino) cyclohexyl] -N-[[3- (4-pyridinyl) phenyl] methyl] -benzo [b] thiophene-2-carboxamide) and Hh-Ag1.5 (3-chloro-4,7-difluoro-N- (4- (methylamino) cyclohexyl) -N- (3 (pyridin-4-yl) benzyl) benzo [b] thiophene-2-carboxamide). SAG is particularly preferable.
　骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質とShhシグナル経路作用物質の好ましい組合せは、BMP4及びSAGの組合せである。 A preferred combination of a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator and a Shh signal pathway activator is a combination of BMP4 and SAG.
　本発明では、視床下部組織への分化を誘導するために、低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含有する培地を使用する。一態様（以下、「第１態様」と呼ぶ）では背側視床下部組織への分化を誘導する。この態様において、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質としてBMP4を用いる場合の「低濃度」とは、例えば0.1 nM～5.0 nM、好ましくは0.5 nM～4.0 nM、更に好ましくは1.0 nM～3.0 nMである。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度は、ステップ（１）の全ての期聞に亘り一定でなくてもよい。例えば、浮遊培養の開始から3日間～8日間（具体例は6日間）は培地に骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を添加せず、その後、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を培地へ添加してもよい。また、培養途中で骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度を低減させてもよい。例えば、浮遊培養の開始から3日間～8日間（具体例は6日間）は培地に骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を添加せず、その後の6日間～12日間（具体例は9日間）は、培地中の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度が比較的高い条件（例えばBMP4を1.0 nM～3.0 nM含む培地を使用する）とし、続く1日間～5日間（具体例は3日間）は、培地中の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度が低下した条件（例えばBMP4を0.5 nM～1.5 nM含む培地を使用する）で培養する。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 In the present invention, in order to induce differentiation into hypothalamic tissue, a medium containing a low concentration of an osteogenic factor signal transduction pathway activator and a low concentration of an Shh signal pathway activator is used. In one aspect (hereinafter referred to as “first aspect”), differentiation into dorsal hypothalamic tissue is induced. In this embodiment, the “low concentration” when BMP4 is used as a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator is, for example, 0.1 to nM to 5.0 to nM, preferably 0.5 to nM to 4.0 to nM, more preferably 1.0 to nM to 3.0 to nM. is there. The concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator may not be constant throughout the entire phase of step (1). For example, the osteogenic factor signal transduction pathway activator is not added to the medium for 3 to 8 days (6 days in the specific example) from the start of suspension culture, and then the osteogenic factor signal transduction pathway activator is added to the medium. It may be added. Further, the concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator may be reduced during the culture. For example, 3 to 8 days (6 days in the specific example) from the start of suspension culture, no osteogenic factor signal transduction pathway activator is added to the medium, then 6 to 12 days (9 days in the specific example) Is a condition in which the concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator in the medium is relatively high (for example, a medium containing BMP4 in a range of 1.0 nM to 3.0 、 nM), followed by 1 to 5 days (specific example is 3 days) ) Is cultured under conditions in which the concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator in the medium is reduced (for example, a medium containing BMP4 at 0.5 to 1.5 nM is used). The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　一方、第１態様において、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合の「低濃度」とは、例えば0.1μM～2.0μM、好ましくは0.2μM～1.5μM、更に好ましくは0.3μM～1.0μMである。Shhシグナル経路作用物質の濃度は、ステップ（１）の全ての期間に亘り一定でなくてもよい。例えば、浮遊培養の開始から3日間～8日間（具体例は6日間）は培地にShhシグナル経路作用物質を添加せず、その後、Shhシグナル経路作用物質を培地へ添加してもよい。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 On the other hand, in the first embodiment, “low concentration” when SAG is used as a substance acting on the Shh signal pathway is, for example, 0.1 μM to 2.0 μM, preferably 0.2 μM to 1.5 μM, and more preferably 0.3 μM to 1.0 μM. . The concentration of the Shh signal pathway agonist may not be constant over the entire period of step (1). For example, the Shh signal pathway agent may not be added to the medium for 3 to 8 days (specifically, 6 days) from the start of suspension culture, and then the Shh signal pathway agent may be added to the medium. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　別の一態様（以下、「第２態様」と呼ぶ）では腹側視床下部への分化を誘導する。この態様において、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質としてBMP4を用いる場合の「低濃度」とは、例えば0.1 nM～3.0 nM、好ましくは0.3 nM～2.0 nM、更に好ましくは0.5 nM～1.5 nMである。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度は、ステップ（１）の全ての期聞に亘り一定でなくてもよい。例えば、浮遊培養の開始から3日間～8日間（具体例は6日間）は培地に骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を添加せず、その後、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を培地へ添加してもよい。また、培養途中で骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度を低減させてもよい。例えば、浮遊培養の開始から3日間～8日間（具体例は6日間）は培地に骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を添加せず、その後の6日間～12日間（具体例は9日間）は、培地中の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度が比較的高い条件（例えばBMP4を0.5 nM～1.5 nM含む培地を使用する）とし、続く1日間～5日間（具体例は3日間）は、培地中の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度が低下した条件（例えばBMP4を0.25 nM～0.75 nM含む培地を使用する）で培養する。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 In another aspect (hereinafter referred to as “second aspect”), differentiation into the ventral hypothalamus is induced. In this embodiment, the “low concentration” when BMP4 is used as a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator is, for example, 0.1 to n to 3.0 to nM, preferably 0.3 to n to 2.0 to nM, more preferably 0.5 to n to 1.5 to nM. is there. The concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator may not be constant throughout the entire phase of step (1). For example, the osteogenic factor signal transduction pathway activator is not added to the medium for 3 to 8 days (6 days in the specific example) from the start of suspension culture, and then the osteogenic factor signal transduction pathway activator is added to the medium. It may be added. Further, the concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator may be reduced during the culture. For example, 3 to 8 days (6 days in the specific example) from the start of suspension culture, no osteogenic factor signal transduction pathway activator is added to the medium, then 6 to 12 days (9 days in the specific example) Is a condition in which the concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator in the medium is relatively high (for example, a medium containing BMP4 in a range of 0.5 nM to 1.5 nM), followed by 1 to 5 days (specific example is 3 days) ) Is cultured under conditions where the concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator in the medium is reduced (for example, using a medium containing 0.25 to nM BMP4). The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　一方、第２態様において、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合の「低濃度」とは、例えば0.1μM～2.0μM、好ましくは0.2μM～1.5μM、更に好ましくは0.3μM～1.0μMである。Shhシグナル経路作用物質の濃度は、ステップ（１）の全ての期間に亘り一定でなくてもよい。例えば、浮遊培養の開始から3日間～8日間（具体例は6日間）は培地にShhシグナル経路作用物質を添加せず、その後、Shhシグナル経路作用物質を培地へ添加してもよい。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 On the other hand, in the second embodiment, the “low concentration” when SAG is used as a substance acting on the Shh signal pathway is, for example, 0.1 μM to 2.0 μM, preferably 0.2 μM to 1.5 μM, and more preferably 0.3 μM to 1.0 μM. . The concentration of the Shh signal pathway agonist may not be constant over the entire period of step (1). For example, the Shh signal pathway agent may not be added to the medium for 3 to 8 days (specifically, 6 days) from the start of suspension culture, and then the Shh signal pathway agent may be added to the medium. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　BMP4以外の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を使用する場合に採用すべき濃度、即ち「低濃度」の範囲は、使用する物質の特性とBMP4の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。SAG以外のShhシグナル経路作用物質を使用する場合も同様である。このように、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質についての「低濃度」は、当業者であれば特段の困難を伴うことなく認識且つ理解できる。 The concentration to be adopted when using a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator other than BMP4, that is, the range of “low concentration” takes into account the difference in the characteristics of the substance used and the characteristics of BMP4 (particularly the difference in activity). Then, those skilled in the art can set according to the above-mentioned concentration range. Further, whether or not the set concentration range is appropriate can be confirmed by a preliminary experiment according to an example described later. The same applies when using an Shh signal pathway agonist other than SAG. Thus, the “low concentration” for the osteogenic factor signaling pathway activator and the Shh signaling pathway activator can be recognized and understood by those skilled in the art without any particular difficulty.
　第２態様に使用する培地には、低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質と低濃度のShhシグナル経路作用物質に加え、Akt阻害剤を含有させることが好ましい。Akt阻害剤は腹側化シグナルとして作用し、腹側視床下部への効率的な分化を促す。Akt阻害剤として、Akt inhibitor VIII（1,3-Dihydro-1-(1-((4-(6-phenyl-1H-imidazo[4,5-g]quinoxalin-7-yl)phenyl)methyl)-4-piperidinyl)-2H-benzimidazol-2-one、例えばCalbiochem社が提供する）を用いることができる。Akt阻害剤の濃度は、使用するAkt阻害剤によっても変動し得るが、例えばAkt inhibitor VIIIを使用した場合には、例えば0.1μM～2.0μM、好ましくは0.2μM～1.5μM、更に好ましくは0.3μM～1.0μMである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 The medium used in the second embodiment preferably contains an Akt inhibitor in addition to a low-concentration osteogenic factor signal transduction pathway activator and a low-concentration Shh signal pathway activator. Akt inhibitors act as ventralization signals and promote efficient differentiation into the ventral hypothalamus. As an Akt inhibitor, Akt inhibitor VIII (1,3-Dihydro-1- (1-((4- (6-phenyl-1H-imidazo [4,5-g] quinoxalin-7-yl) phenyl) methyl)-) 4-piperidinyl) -2H-benzimidazol-2-one, such as provided by Calbiochem, can be used. The concentration of the Akt inhibitor may vary depending on the Akt inhibitor used. For example, when Akt inhibitor VIII is used, for example, 0.1 μM to 2.0 μM, preferably 0.2 μM to 1.5 μM, more preferably 0.3 μM. ~ 1.0 μM. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　ステップ（１）に用いる培地は、分散により誘導されるヒト多能性幹細胞の細胞死を抑制するために、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）阻害剤を培養開始時から添加することが好ましい（特開２００８－９９６６２号公報を参照）。ROCK阻害剤を培養開始から例えば15日以内、好ましくは10日以内、より好ましくは6日以内添加する。ROCK阻害剤としては、Y-27632（（＋）-（R）-trans-4-（1-aminoethyl）-N-（4-pyridyl）cyclohexanecarboxamide dihydrochloride）等を挙げることができる。ROCK阻害剤は、分散により誘導されるヒト多能性幹細胞の細胞死を抑制し得る濃度で使用される。例えば、Y-27632を用いる場合には、例えば約O.1～200μM、好ましくは約2～50μMの濃度とする。ROCK阻害剤の濃度を添加期間内で変動させてもよく、例えば添加期間の後半で濃度を半減させることができる。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 In order to suppress the cell death of human pluripotent stem cells induced by dispersion, it is preferable to add a Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor from the beginning of the culture to the medium used in step (1). (See JP 2008-99662 A). The ROCK inhibitor is added, for example, within 15 days, preferably within 10 days, more preferably within 6 days from the start of culture. Examples of ROCK inhibitors include Y-27632 ((+)-(R) -trans-4- (1-aminoethyl) -N- (4-pyridyl) cyclohexanecarboxamide dihydrochloride). The ROCK inhibitor is used at a concentration that can suppress cell death of human pluripotent stem cells induced by dispersion. For example, when Y-27632 is used, the concentration is, for example, about O.1 to 200 μM, preferably about 2 to 50 μM. The concentration of the ROCK inhibitor may be varied within the addition period, for example, the concentration can be halved in the latter half of the addition period. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　浮遊培養に用いる培地は、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、G1asgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地及びこれらの混合培地など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、IMDM培地及びHam's F-12培地の混合培地が用いられる。混合比は、容量比で、例えば、IMDM：Ham's F-12＝O.8～1.2：1.2～0.8である。 The medium used for suspension culture can be prepared using a medium used for culturing mammalian cells as a basal medium. As the basal medium, for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, G1asgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium199 medium, Eagle MEM medium, αMEM medium, DMEM medium, Ham's F-12 The medium is not particularly limited as long as it can be used for culturing mammalian cells, such as a medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal medium, and mixed medium thereof. In one embodiment, a mixed medium of IMDM medium and Ham's F-12 medium is used. The mixing ratio is a volume ratio, for example, IMDM: Ham's F-12 = O.8 to 1.2: 1.2 to 0.8.
　血清含有培地、無血清培地のいずれを使用することもできる。未知の或いは意図しない成分の混入を回避するため等の観点から、無血清培地を用いることが好ましい。 Either a serum-containing medium or a serum-free medium can be used. From the viewpoint of avoiding mixing of unknown or unintended components, it is preferable to use a serum-free medium.
　浮遊培養に用いる培地が血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール又は3'チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを含有し得る。公知の方法（例えば、Ｗ０　９８／３０６７９を参照）により血清代替物を調製することができる。市販の血清代替物を用いることもできる。市販の血清代替物の例として、KSR（Invitrogen社製）、Chemically-defined Lipid concentrated （Gibco社製）、Glutamax （Gibco社製）が挙げられる。 The medium used for suspension culture may contain a serum substitute. Serum replacements can contain, for example, albumin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3 ′ thiol glycerol, or equivalents thereof. Serum substitutes can be prepared by known methods (see, eg, W0 98/30679). A commercially available serum replacement can also be used. Examples of commercially available serum substitutes include KSR (manufactured by Invitrogen), Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco), and Glutamax (Gibco).
　細胞凝集塊の浮遊培養に用いられる培地は、ヒト多能性幹細胞から、目的の組織への分化誘導に悪影響を与えないことを条件に他の添加物を含むことができる。ここでの添加物として、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等を挙げることができる。 The medium used for the suspension culture of cell aggregates can contain other additives provided that it does not adversely affect differentiation induction from human pluripotent stem cells into the target tissue. Examples of additives herein include insulin, iron sources (for example, transferrin), minerals (for example, sodium selenate), saccharides (for example, glucose), organic acids (for example, pyruvate, lactic acid, etc.), serum proteins (for example, Albumin etc.), amino acids (eg L-glutamine etc.), reducing agents (eg 2-mercaptoethanol etc.), vitamins (eg ascorbic acid, d-biotin etc.), antibiotics (eg streptomycin, penicillin, gentamicin etc.), buffer An agent (for example, HEPES etc.) etc. can be mentioned.
　一態様において、浮遊培養に用いられる培地は、目的の組織への分化誘導に悪影響を与えないという観点から、本明細書において培地に含まれることが明記されたもの以外の成長因子を含まない化学合成培地（growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM）に、血清代替物（KSR等）を添加したものである。ここでの「成長因子」には、Fgf;BMP;Wnt、Noda1、Notch、Shh等のパターン形成因子、インスリン及びLipid-rich albuminが包含される。成長因子を含まない化学合成培地としては、例えば、Wataya et al，Proc Natl Acad Sci USA，105（33）:11796-11801，2008に開示されたgfCDMを挙げることができる。 In one embodiment, the medium used for the suspension culture is a chemistry that does not include growth factors other than those specified in the medium herein, from the viewpoint that it does not adversely affect differentiation induction into the target tissue. Serum substitutes (KSR, etc.) are added to a synthetic medium (growth-factor-free Chemically Defined Medium; gfCDM). “Growth factors” here include Fgf; BMP; patterning factors such as Wnt, Noda1, Notch, Shh, insulin, and Lipid-rich albumin. Examples of the chemically synthesized medium not containing a growth factor include gfCDM disclosed in Wataya et al, Proc Natri Acad Sci USA, 105 (33): 11796-11801, 2008.
　ステップ（１）では、未分化細胞から視床下部への分化の初期の方向付けをする。ステップ（１）の初期方向付けの結果として、次のステップ（２）経過中に、背側又は腹側視床下部への分化が確実となる。例えば、ステップ（２）において背側視床下部へと分化誘導した場合、典型的には、培養開始30日後頃に背側視床下部ならではの性質（Pax6発現など）を示すようになる（図５を参照） In step (1), the initial direction of differentiation from undifferentiated cells to the hypothalamus is performed. As a result of the initial orientation of step (1), differentiation into the dorsal or ventral hypothalamus is ensured during the course of the next step (2). For example, when differentiation is induced to the dorsal hypothalamus in step (2), typically, properties (Pax6 expression, etc.) unique to the dorsal hypothalamus appear around 30 days after the start of culture (see FIG. 5). reference)
　ステップ（１）の培養を行うことにより、将来的に視床下部になりうる細胞の凝集塊、即ち、視床下部前駆細胞の凝集塊を得ることができる。ステップ（１）は、例えば、培養中の細胞凝集塊のうち10%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは50%以上の細胞凝集塊が視床下部前駆細胞を含むまで実施するとよい。視床下部前駆細胞は、例えば、RT-PCRや、視床下部前駆細胞のマーカー特異的抗体を用いた免疫組織化学により検出することができる。視床下部前駆細胞のマーカーとして好ましくはRxを用いる。培養期間は、使用する骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の種類に応じて変動し得るが、例えば10～26日（具体例は18日間）である。 By performing the culture in step (1), an aggregate of cells that can become the hypothalamus in the future, that is, an aggregate of hypothalamic progenitor cells can be obtained. Step (1) may be performed, for example, until 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 50% or more of the cell aggregates in culture contain hypothalamic progenitor cells. Hypothalamic progenitor cells can be detected by, for example, RT-PCR or immunohistochemistry using a marker-specific antibody for hypothalamic progenitor cells. Rx is preferably used as a marker for hypothalamic progenitor cells. The culture period may vary depending on the type of osteogenic factor signal transduction pathway activator and Shh signal pathway agonist used, but is, for example, 10 to 26 days (specific example is 18 days).
　好ましい一態様では、質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を、低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を用いることにより、凝集塊間での分化の程度の差を最小限に留め、分化誘導効率を向上することができる。質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団の浮遊培養の例として、以下の態様（Ａ）及び（Ｂ）を挙げることができる。
（Ａ）複数の培養コンパートメントを用意し、1つの培養コンパートメントに1つのヒト多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を播く。（例えば、96ウェルプレートの各ウェルにヒト多能性幹細胞の凝集塊を1つずつ入れる。）そして、各培養コンパートメントにおいて、1つのヒト多能性幹細胞の凝集塊を低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
（Ｂ）1つの培養コンパートメントに複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を1つの培養コンパートメントに播く。（例えば、10cmディッシュに、複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊を入れる。）そして、当該コンパートメントにおいて、複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊を低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。 In a preferred embodiment, a qualitatively uniform population of human pluripotent stem cell aggregates is suspended in a medium comprising a low concentration of an osteogenic factor signaling pathway activator and a low concentration of an Shh signaling pathway agonist. Incubate. By using a population of qualitatively uniform aggregates of human pluripotent stem cells, the difference in the degree of differentiation between aggregates can be minimized and differentiation induction efficiency can be improved. Examples of suspension culture of a qualitatively uniform population of human pluripotent stem cell aggregates include the following aspects (A) and (B).
(A) Prepare multiple culture compartments and seed a qualitatively uniform population of human pluripotent stem cell aggregates so that one culture compartment contains one human pluripotent stem cell aggregate . (For example, one well of a human pluripotent stem cell is placed in each well of a 96-well plate.) Then, in each culture compartment, one human pluripotent stem cell aggregate is transferred to a low concentration of osteogenic factor signal. Suspension culture is performed in a medium containing a transduction pathway activator and a low-concentration Shh signaling pathway agonist.
(B) A qualitatively uniform population of human pluripotent stem cell aggregates is seeded in one culture compartment so that one culture compartment contains multiple human pluripotent stem cell aggregates. (For example, a plurality of human pluripotent stem cell aggregates are placed in a 10 cm dish.) In the compartment, a plurality of human pluripotent stem cell aggregates are converted into low-concentration osteogenic factor signaling pathway activators. And suspension culture in a medium containing a low concentration of an Shh signal pathway agonist.
　本発明の方法では（Ａ）及び（Ｂ）のいずれの態様を採用することもできる。また、本発明の方法における培養の途中で態様を変更してもよい（（Ａ）の態様から（Ｂ）の態様への変更。或いは（Ｂ）の態様から（Ａ）の態様への変更）。一態様では、ステップ（１）の培養に（Ａ）の態様を採用し、ステップ（２）の培養に（Ｂ）の態様を採用する。 In the method of the present invention, any of the aspects (A) and (B) can be adopted. Moreover, you may change an aspect in the middle of the culture | cultivation in the method of this invention (change from the aspect of (A) to the aspect of (B). Or the change from the aspect of (B) to the aspect of (A)). . In one aspect, the aspect of (A) is employ | adopted for culture | cultivation of step (1), and the aspect of (B) is employ | adopted for culture | cultivation of step (2).
　ステップ（２）
　ステップ（１）に続くステップ（２）では、ステップ（１）で得られた細胞凝集塊を、低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養する。このステップによって、視床下部組織への更なる分化が誘導される。特に言及しない培養条件（培養方法（好ましくは静置培養が採用される）、フィーダー細胞の使用の可能性（好ましくはフィーダー細胞非存在下で培養する）、使用可能な培養器、使用する基礎培地、Shhシグナル経路作用物質以外の添加物等）についてはステップ（１）と同様である。以下では、ステップ（２）に特徴的な培養条件を説明する。 Step (2)
In step (2) following step (1), the cell aggregate obtained in step (1) is further subjected to suspension culture in a medium containing a low-concentration Shh signal pathway agent. This step induces further differentiation into hypothalamic tissue. Culture conditions not specifically mentioned (culture method (preferably stationary culture is adopted), possibility of using feeder cells (preferably cultured in the absence of feeder cells), usable incubator, basal medium used , Additives other than Shh signal pathway agonists, etc.) are the same as in step (1). Below, the culture conditions characteristic of step (2) will be described.
　ステップ（２）は、好ましくは、高酸素分圧条件下で行われる。高酸素分圧条件下で浮遊培養することにより、細胞凝集塊内部への酸素の到達、及び細胞凝集塊の長期間の維持培養が達成され、視床下部組織への効率的な分化誘導が可能となる。 Step (2) is preferably performed under high oxygen partial pressure conditions. By floating culture under high oxygen partial pressure conditions, oxygen can reach inside the cell aggregate and long-term maintenance culture of the cell aggregate can be achieved, enabling efficient induction of hypothalamic differentiation. Become.
　高酸素分圧条件とは、空気中の酸素分圧（20%）を上回る酸素分圧条件を意味する。ステップ（２）における酸素分圧は、例えば30～60%、好ましくは35～60%、より好ましくは38～60%（具体例は40%）である。 The high oxygen partial pressure condition means an oxygen partial pressure condition that exceeds the oxygen partial pressure in air (20%). The oxygen partial pressure in step (2) is, for example, 30 to 60%, preferably 35 to 60%, more preferably 38 to 60% (specific example is 40%).
　ステップ（２）の浮遊培養における培養温度、C02濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。C02濃度は、例えば約1～10%、好ましくは約5%である。 The culture temperature in suspension culture in step (2), other culture conditions such as C0 2 concentration may be set as appropriate. The culture temperature is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. C0 2 concentration, for example, from about 1-10%, preferably about 5%.
　ステップ（２）に使用する培地は低濃度でShhシグナル経路作用物質を含む。第１態様（背側視床下部組織への分化を誘導する態様）において、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合の「低濃度」とは、例えば0.1μM～2.0μM、好ましくは0.2μM～1.5μM、更に好ましくは0.3μM～1.0μMである。第２態様（腹側視床下部組織への分化を誘導する態様）においても同様の濃度が採用される。本発明に必要な作用効果（即ち、背側視床下部組織又は腹側視床下部組織への分化誘導）が得られる限りにおいて、Shhシグナル経路作用物質の濃度は、ステップ（２）の全ての期聞に亘り一定でなくてもよい。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 The medium used in step (2) contains a substance that acts on the Shh signal pathway at a low concentration. In the first embodiment (embodiment in which differentiation into the dorsal hypothalamus tissue is induced), the “low concentration” when SAG is used as a substance acting on the Shh signal pathway is, for example, 0.1 μM to 2.0 μM, preferably 0.2 μM to 1.5 μM, more preferably 0.3 μM to 1.0 μM. Similar concentrations are employed in the second mode (mode in which differentiation into ventral hypothalamic tissue is induced). As long as the effects necessary for the present invention (that is, differentiation induction into dorsal hypothalamic tissue or ventral hypothalamic tissue) can be obtained, the concentration of the Shh signal pathway agonist is determined in all the phases of step (2). May not be constant. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　SAG以外のShhシグナル経路作用物質を使用する場合に採用すべき濃度、即ち「低濃度」の範囲は、使用する物質の特性とSAGの特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。このように、ステップ（２）においても、Shhシグナル経路作用物質についての「低濃度」は、当業者であれば特段の困難を伴うことなく認識且つ理解できる。 The concentration to be adopted when using a substance that acts on the Shh signaling pathway other than SAG, that is, the range of “low concentration” is determined by considering the difference in the characteristics of the substance used and the characteristics of SAG (particularly the difference in activity). If it is a trader, it can be set according to the above-mentioned concentration range. Further, whether or not the set concentration range is appropriate can be confirmed by a preliminary experiment according to an example described later. Thus, also in step (2), the “low concentration” for the Shh signal pathway agonist can be recognized and understood by those skilled in the art without any particular difficulty.
　ステップ（２）に使用する培地は、好ましくは、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を含有しない。換言すれば、ステップ（２）では、低濃度でShhシグナル経路作用物質を含有する一方で、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は含有しない培地を使用することが好ましい。当該条件によれば、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の長期暴露による細胞凝集塊の嚢胞化や分化方向の変化（視床下部から神経網膜への分化方向の変化など）を避けられるという効果が得られる。 The medium used in step (2) preferably does not contain an osteogenic factor signal transduction pathway activator. In other words, in step (2), it is preferable to use a medium that contains the Shh signal pathway activator at a low concentration but does not contain the osteogenic factor signal transduction pathway activator. According to the conditions, the effect of avoiding cystization of cell aggregates and changes in differentiation direction (changes in differentiation direction from hypothalamus to neural retina, etc.) due to long-term exposure to a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator. can get.
　第２態様でのステップ（２）に使用する培地には、低濃度のShhシグナル経路作用物質に加え、Akt阻害剤を含有させることが好ましい。Akt阻害剤は腹側化シグナルとして作用し、腹側視床下部への効率的な分化を促す。好ましいAkt阻害剤及びその使用濃度については、前記ステップ（１）の第２態様における例と同様のものが挙げられる。 The medium used for step (2) in the second aspect preferably contains an Akt inhibitor in addition to a low-concentration Shh signal pathway agent. Akt inhibitors act as ventralization signals and promote efficient differentiation into the ventral hypothalamus. Examples of the preferred Akt inhibitor and the use concentration thereof are the same as those in the second embodiment of Step (1).
　ステップ（２）の培養は、視床下部組織（背側視床下部又は腹側視床下部）への分化が更に誘導されるのに十分な期間実施される。視床下部組織への更なる誘導が生じたことは、視床下部組織特異的なマーカーの検出によって確認することができる。視床下部組織のマーカーとして好ましくはPax6及び／又はNkx2.1を用いる。Rxも併用するとよい。典型的には、背側視床下部組織は、Rx陽性、Pax6陽性且つNkx2.1陰性の組織であり、腹側視床下部組織は、Rx陽性、Pax6陰性且つNkx2.1陽性の組織である。 The culture in step (2) is carried out for a period sufficient to further induce differentiation into the hypothalamic tissue (dorsal hypothalamus or ventral hypothalamus). Further induction to the hypothalamic tissue can be confirmed by detection of a hypothalamic tissue specific marker. Pax6 and / or Nkx2.1 is preferably used as a marker for hypothalamic tissue. Rx is also recommended. Typically, dorsal hypothalamic tissue is Rx positive, Pax6 positive and Nkx2.1 negative tissue, and ventral hypothalamic tissue is Rx positive, Pax6 negative and Nkx2.1 positive tissue.
　背側視床下部組織（第１の態様の場合）へと分化が進んだことは、背側視床下部組織に特徴的な神経前駆細胞（例えばバゾプレシン（AVP）ニューロン前駆細胞、オキシトシン（OXT）ニューロン前駆細胞、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）ニューロン前駆細胞、コルチコトロピン放出ホルモン（CRH）ニューロン前駆細胞、ニューロペプチドY（NPY）ニューロン前駆細胞）が出現していることによって確認することができる。背側視床下部組織に特徴的な神経前駆細胞が認められた場合には、背側視床下部組織への分化誘導がより一層進んでいると判断できる。神経前駆細胞の出現の確認は、各々に特徴的なマーカーを利用すればよい。例えば、OtpとBrn2の発現が認められればAVPニューロン前駆細胞が出現していると判断できる。 Differentiation into dorsal hypothalamic tissue (in the first embodiment) indicates that neural progenitor cells characteristic of dorsal hypothalamic tissue (eg, vasopressin (AVP) neuron progenitor cells, oxytocin (OXT) neuron progenitors) Cells, thyrotropin releasing hormone (TRH) neuron progenitor cells, corticotropin releasing hormone (CRH) neuron progenitor cells, neuropeptide Y (NPY) neuron progenitor cells) can be confirmed. When neural progenitor cells characteristic of the dorsal hypothalamic tissue are observed, it can be determined that the differentiation induction into the dorsal hypothalamic tissue is further advanced. Confirmation of the appearance of neural progenitor cells may be made using a marker characteristic of each. For example, if Otp and Brn2 expression is observed, it can be determined that AVP neuron progenitor cells have appeared.
　一方、腹側視床下部組織への更なる誘導が生じたこと（第２の態様の場合）は、腹側視床下部組織に特徴的な神経前駆細胞（例えばアグーチ関連タンパク質（AgRP）ニューロン前駆細胞、プロオピオメラノコルチン（POMC）ニューロン前駆細胞、メラニン凝集ホルモン（MCH）ニューロン前駆細胞、Orexinニューロン前駆細胞）が出現していることによって確認することができる。背側視床下部組織に特徴的な神経前駆細胞が認められた場合には、背側視床下部組織への分化誘導がより一層進んでいると判断できる。神経細胞の出現の確認は、各々に特徴的なマーカーを利用すればよい。 On the other hand, the further induction to the ventral hypothalamic tissue (in the case of the second embodiment) indicates that neural progenitor cells characteristic of the ventral hypothalamic tissue (eg, agouti-related protein (AgRP) neuron progenitor cells, This can be confirmed by the appearance of proopiomelanocortin (POMC) neuron progenitor cells, melanin-concentrating hormone (MCH) neuron progenitor cells, orexin neuron progenitor cells). When neural progenitor cells characteristic of the dorsal hypothalamic tissue are observed, it can be determined that the differentiation induction into the dorsal hypothalamic tissue is further advanced. Confirmation of the appearance of a nerve cell may be performed using a marker characteristic of each.
　ステップ（２）の培養期間は、使用するShhシグナル経路作用物質の種類に応じて変動し得るが、例えば20～100日、好ましくは30日～80日（具体例は30日間、40日間、50日間、60日間、70日間、80日間）である。 The culture period of step (2) may vary depending on the type of Shh signal pathway agonist used, but for example 20 to 100 days, preferably 30 to 80 days (specific examples are 30 days, 40 days, 50 days, 50 days). Day, 60 days, 70 days, 80 days).
　ステップ（３）
　本発明の製造方法では、好ましくは、ステップ（１）及び（２）に加えて以下のステップ（３）を行う。
　（３）ステップ（２）で得られた細胞凝集塊を回収し、細胞凝集塊を構成する細胞を分散培養するステップ Step (3)
In the manufacturing method of the present invention, preferably, the following step (3) is performed in addition to steps (1) and (2).
(3) A step of recovering the cell aggregate obtained in step (2) and dispersing and culturing the cells constituting the cell aggregate
　ステップ（３）によって視床下部組織への分化誘導が更に促され、また成熟化が生じる。言い換えれば、ステップ（３）は分化効率の更なる向上をもたらす。ステップ（３）の培養は、神経細胞の培養に有利とされる分散培養に相当する。ステップ（３）によって、浮遊培養という３次元的な培養から２次元的な培養へと切り換えられることになる。 Step (3) further promotes differentiation into the hypothalamic tissue and causes maturation. In other words, step (3) brings about further improvement of differentiation efficiency. The culture in step (3) corresponds to a dispersion culture that is advantageous for the culture of nerve cells. By step (3), switching from the three-dimensional culture of suspension culture to the two-dimensional culture is performed.
　分散培養するにあたっては、まず、細胞凝集塊を回収し、細胞を解離（単一細胞化）させる。細胞の解離には、EDTA-トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。細胞障害性が少ないものが好ましい。このような細胞解離液として、例えば、ディスパーゼ（エーディア）、TrypLE （Invitrogen）又はアキュターゼ（MILLIPORE）等の市販品が入手可能である。 In dispersion culture, first, cell aggregates are collected, and the cells are dissociated (single cells). For cell dissociation, proteolytic enzymes such as EDTA-trypsin, collagenase IV, and metalloprotease can be used alone or in appropriate combination. Those having low cytotoxicity are preferred. As such a cell dissociation solution, for example, commercially available products such as dispase (Adia), TrypLE® (Invitrogen), or Accutase (MILLIPORE) are available.
　単一細胞化した細胞は分散培養に適した培養器に播種される。分散培養に用いる培養器は特に限定されない。例えば、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ等を用いることができる。培養面への細胞の接着性を高めるために、マトリゲル（BD）、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、或いはこれらの中の二つ以上の組み合わせによってコーティング処理された培養器を用いるとよい。 Single cells are seeded in an incubator suitable for dispersion culture. The incubator used for the dispersion culture is not particularly limited. For example, a dish, petri dish, tissue culture dish, multi-dish, microplate, microwell plate, multiplate, multiwell plate, chamber slide, petri dish or the like can be used. Matrigel (BD), poly-D-lysine, poly-L-lysine, collagen, gelatin, laminin, heparan sulfate proteoglycan, entactin, or two or more of these to enhance cell adhesion to the culture surface It is recommended to use an incubator coated with a combination of the above.
　ステップ（３）は、好ましくは、高酸素分圧条件下で行われる。高酸素分圧条件下で平面培養することにより、神経細胞へ分化しやすくなる。 Step (3) is preferably performed under high oxygen partial pressure conditions. By planar culture under high oxygen partial pressure conditions, it becomes easy to differentiate into nerve cells.
　高酸素分圧条件とは、空気中の酸素分圧（20%）を上回る酸素分圧条件を意味する。ステップ（３）における酸素分圧は、例えば30～60%、好ましくは35～60%、より好ましくは38～60%（具体例は40%）である。 The high oxygen partial pressure condition means an oxygen partial pressure condition that exceeds the oxygen partial pressure in air (20%). The oxygen partial pressure in step (3) is, for example, 30 to 60%, preferably 35 to 60%, more preferably 38 to 60% (specific example is 40%).
　分散培養における培養温度、C02濃度、02濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1～10%、好ましくは約5%である。02濃度は、例えば約20%である。 The culture temperature in dissociated culture, C0 2 concentration, other culture conditions such as 0 2 concentration can be set as appropriate. The culture temperature is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. The CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%. The 0 2 concentration is, for example, about 20%.
　分散培養に用いる培地は、哺乳動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、G1asgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、Ham's F-12培地、RPMI1640培地、Fischer's培地、Neurobasal培地及びこれらの混合培地など、哺乳動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。一態様において、DMEM培地及びHam's F-12培地の混合培地（例えば、Sigma Aldrich社のDMEM/F-12　Catalog No.D6421）が用いられる。 The medium used for dispersion culture can be prepared using a medium used for culturing mammalian cells as a basal medium. As the basal medium, for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, G1asgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium199 medium, Eagle MEM medium, αMEM medium, DMEM medium, Ham's F-12 The medium is not particularly limited as long as it can be used for culturing mammalian cells, such as a medium, RPMI1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal medium, and mixed medium thereof. In one embodiment, a mixed medium of DMEM medium and Ham's F-12 medium (eg, DMEM / F-12 Catalog No. D6421 from Sigma-Aldrich) is used.
　血清含有培地、無血清培地のいずれを使用することもできる。未知の或いは意図しない成分の混入を回避するため等の観点から、無血清培地を用いることが好ましい。 Either a serum-containing medium or a serum-free medium can be used. From the viewpoint of avoiding mixing of unknown or unintended components, it is preferable to use a serum-free medium.
　好ましくは、神経細胞の増殖及び分化を促すために、毛様体神経栄養因子（CNTF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン３（NT-3）、ウシ胎児血清、N2サプリメント、B27サプリメント等を添加した培地を使用する。好ましい一態様では、N2サプリメントとB27サプリメントを添加した培地を使用する。培地中のN2サプリメントの含有量は、例えば、容量比で全体量の1%とする。同様に培地中のB27サプリメントの含有量は、例えば、容量比で全体量の2%とする。尚、N2サプリメントはGibco（製品名　N2 supplement(x100)）等から入手することができ、B27サプリメントはGibco（製品名　B27 supplement(x100)）等から入手することができる。また、BDNFはLM22A-4（BDNFアゴニストであるN1,N3,N5-Tris(2-hydroxyethyl)-1,3,5-benzenetricarboxamide（SIGMA-ALDRICHから入手可能））で代用が可能である。 Preferably, in order to promote proliferation and differentiation of neurons, ciliary neurotrophic factor (CNTF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), neurotrophin 3 (NT-3), fetal bovine serum, N2 supplement, Use a medium supplemented with B27 supplements. In a preferred embodiment, a medium supplemented with N2 supplement and B27 supplement is used. The content of N2 supplement in the medium is, for example, 1% of the total amount by volume ratio. Similarly, the content of B27 supplement in the medium is, for example, 2% of the total amount in volume ratio. N2 supplements can be obtained from Gibco (product name: N2 supplement (x100)), and B27 supplements can be obtained from Gibco (product name: B27 supplement (x100)). BDNF can be substituted with LM22A-4 (BDNF agonist N1, N3, N5-Tris (2-hydroxyethyl) -1,3,5-benzenetricarboxamide (available from SIGMA-ALDRICH)).
　分散培養に用いられる培地が血清代替物及び／又は他の添加物を含有していてもよい。ここでの他の添加物として、例えば、インスリン、鉄源（例えばトランスフェリン等）、ミネラル（例えばセレン酸ナトリウム等）、糖類（例えばグルコース等）、有機酸（例えばピルビン酸、乳酸等）、血清蛋白質（例えばアルブミン等）、アミノ酸（例えばL-グルタミン等）、還元剤（例えば2-メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えばアスコルビン酸、d-ビオチン等）、抗生物質（例えばストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、緩衝剤（例えばHEPES等）等を挙げることができる。 The medium used for dispersion culture may contain a serum substitute and / or other additives. Other additives herein include, for example, insulin, iron sources (eg transferrin, etc.), minerals (eg sodium selenate etc.), sugars (eg glucose etc.), organic acids (eg pyruvic acid, lactic acid etc.), serum proteins (Eg albumin), amino acids (eg L-glutamine etc.), reducing agents (eg 2-mercaptoethanol etc.), vitamins (eg ascorbic acid, d-biotin etc.), antibiotics (eg streptomycin, penicillin, gentamicin etc.) And buffering agents (for example, HEPES).
　神経細胞の分散培養に関しては様々な報告があり（例えばWataya T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 105(33): 11796-11801 (2008).）、それらを参考にして本発明の分散培養における条件を設定ないし調整することができる。 There are various reports on the dispersion culture of nerve cells (for example, Wataya T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 105 (33): 11796-11801 (2008)), and the dispersion culture of the present invention is referred to them. The conditions in can be set or adjusted.
　ステップ（３）の培養は、視床下部神経細胞の分化・成熟に十分な期間実施される。視床下部神経細胞の十分な分化・成熟が生じたことは、第１態様（背側視床下部組織への分化を誘導する態様）の場合であれば、背側視床下部組織に局在が認められる神経細胞（例えば、AVPニューロン、OXTニューロン、TRHニューロン、CRHニューロン、NPYニューロン）の有無や存在率、当該神経細胞が産生するホルモンの有無や量によって確認することができる。例えば、AVPの産生が認められれば、機能的なAVPニューロンが出現しており、神経細胞の十分な分化・成熟が生じたと判断できる。背側視床下部組織に局在を認めるその他の神経細胞についても、各神経細胞が産生するホルモンを指標として、その分化・成熟の有無ないし程度を判断することができる。 The culture in step (3) is performed for a period sufficient for differentiation and maturation of hypothalamic neurons. In the case of the first mode (a mode in which differentiation into the dorsal hypothalamic tissue is induced) that sufficient differentiation / maturation of hypothalamic neurons has occurred, localization is observed in the dorsal hypothalamic tissue. It can be confirmed by the presence or absence of nerve cells (for example, AVP neurons, OXT neurons, TRH neurons, CRH neurons, NPY neurons) and the presence or amount of hormones produced by the neurons. For example, if production of AVP is observed, it can be determined that functional AVP neurons have appeared and sufficient differentiation / maturation of neurons has occurred. With respect to other neurons that are localized in the dorsal hypothalamic tissue, the presence or degree of differentiation / maturation can be determined using hormones produced by each nerve cell as an index.
　同様に、第２態様（腹側視床下部組織への分化を誘導する態様）の場合には、腹側視床下部組織に局在が認められる神経細胞（例えば、AgRPニューロン、POMCニューロン、MCHニューロン、Orexinニューロン）の有無や存在率、当該神経細胞が産生するホルモンの有無や量によって、神経細胞の十分な分化・成熟が生じたことを確認することができる。 Similarly, in the second embodiment (embodiment in which differentiation into ventral hypothalamic tissue is induced), neurons that are localized in ventral hypothalamic tissue (for example, AgRP neurons, POMC neurons, MCH neurons, The presence or absence of Orexin neurons) and the presence or amount of hormones produced by the neurons can confirm that the neurons have been sufficiently differentiated and matured.
　ステップ（３）の培養期間は、培養条件に応じて変動し得るが、例えば30～150日、好ましくは40日～110日（具体例は40日間、50日間、60日間、70日間、80日間、90日間、100日間、110日間）である。 The culture period in step (3) may vary depending on the culture conditions, but for example, 30 to 150 days, preferably 40 days to 110 days (specific examples are 40 days, 50 days, 60 days, 70 days, 80 days) , 90 days, 100 days, 110 days).
２．視床下部組織と下垂体組織を含む細胞構造体の製造方法
　本発明の第２の局面は、視床下部組織と下垂体組織を含む細胞構造体（以下、「ハイブリッド型細胞構造体」とも呼ぶ）の製造方法に関する。本発明の製造方法では、以下のステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）を行う。尚、特に言及しない事項については、上記第１の局面と同様であり、対応する説明が援用される。
　（ｉ）ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ
　（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成された細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ
　（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られた細胞凝集塊を、下垂体及び視床下部の同時誘導に適した培地中で浮遊培養するステップ 2. Method for Producing Cell Structure Containing Hypothalamic Tissue and Pituitary Tissue The second aspect of the present invention relates to a cell structure containing hypothalamic tissue and pituitary tissue (hereinafter also referred to as “hybrid cell structure”). It relates to a manufacturing method. In the manufacturing method of the present invention, the following steps (i) to (iii) are performed. Note that matters not particularly mentioned are the same as those in the first aspect, and corresponding explanations are incorporated.
(I) A step of suspending the aggregate of human pluripotent stem cells in a medium containing a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator and a Shh signal pathway activator (ii) Cell aggregation formed in step (i) The suspension is further cultured in suspension in a medium containing a bone morphogenetic factor signaling pathway activator and a Shh signaling pathway activator. (Iii) The cell aggregate obtained in step (ii) is added to the pituitary and hypothalamus. Step of suspension culture in a medium suitable for simultaneous induction
　ステップ（ｉ）
　ステップ（ｉ）では、まず、本発明の第１の局面の場合と同様の手段でヒト多能性幹細胞の凝集塊を用意し、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。 Step (i)
In step (i), first, an aggregate of human pluripotent stem cells is prepared by the same means as in the first aspect of the present invention, and an osteogenic factor signal transduction pathway activator and a Shh signal pathway activator are prepared. Suspend culture in medium containing.
　フィーダー細胞の存在下/非存在下いずれの条件で細胞凝集塊の浮遊培養を行ってもよいが、未決定因子の混入を回避する観点からフィーダー細胞の非存在下で細胞凝集塊の浮遊培養を行うのが好ましい。 Cell aggregates may be suspended in the presence or absence of feeder cells, but from the viewpoint of avoiding contamination of undecided factors, cell aggregates may be suspended in the absence of feeder cells. It is preferred to do so.
　細胞凝集塊の浮遊培養における培養温度、C02濃度、02濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1～10%、好ましくは約5%である。02濃度は、例えば約20%である。 The culture temperature in the suspension culture of cells clumps, C0 2 concentration, other culture conditions such as 0 2 concentration can be set as appropriate. The culture temperature is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. The CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%. The 0 2 concentration is, for example, about 20%.
　骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質としてはBMP2、BMP4、BMP7、GDF5などを用いることができる。好ましくは、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質としてBMP4を用いる。一方、Shhシグナル経路作用物質としては、Hedgehogファミリーに属する蛋白（例えば、Shh）、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Purmorphamine、Smoothened Agonist （SAG） （3-Chloro-N-[trans-4-（methylamino）cyclohexyl]-N-[[3-（4-pyridinyl）phenyl]methyl]-benzo[b]thiophene-2-carboxamide）を用いることができる。好ましくはSAGを用いる。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質とShhシグナル経路作用物質の好ましい組合せは、BMP4及びSAGの組合せである。 BMP2, BMP4, BMP7, GDF5, etc. can be used as the osteogenic factor signal transduction pathway activator. Preferably, BMP4 is used as a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator. On the other hand, Shh signal pathway agonists include proteins belonging to the Hedgehog family (for example, Shh), Shh receptors, Shh receptor agonists, Purmorphamine, SmoothenedtheAgonist (SAG) (3-Chloro-N- [trans-4- ( methylamino) cyclohexyl] -N-[[3- (4-pyridinyl) phenyl] methyl] -benzo [b] thiophene-2-carboxamide). Preferably, SAG is used. A preferred combination of the osteogenic factor signal transduction pathway activator and the Shh signal pathway agonist is a combination of BMP4 and SAG.
　培地中の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度は、視床下部と下垂体への分化誘導が可能な範囲で、適宜設定することができるが、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質としてBMP4を用いる場合、その濃度は、例えば0.01～1000nM、好ましくは0.1～100nM、より好ましくは1～10nM（具体例は5nM）である。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は、ステップ（ｉ）の全ての期聞に亘り一定でなくてもよい。例えば、浮遊培養の開始から3日間～8日間（具体例は6日間）は培地に骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を添加せず、その後、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を培地へ添加してもよい。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 The concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator in the medium can be set as appropriate as long as it can induce differentiation into the hypothalamus and pituitary gland. When is used, the concentration is, for example, 0.01 to 1000 nM, preferably 0.1 to 100 nM, more preferably 1 to 10 nM (specific example is 5 nM). The osteogenic factor signaling pathway activator may not be constant throughout all phases of step (i). For example, the osteogenic factor signal transduction pathway activator is not added to the medium for 3 to 8 days (6 days in the specific example) from the start of suspension culture, and then the osteogenic factor signal transduction pathway activator is added to the medium. It may be added. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　培地中のShhシグナル経路作用物質の濃度は、視床下部と下垂体への分化誘導が可能な範囲で、適宜設定することができるが、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合、その濃度は、例えば1nM～1000μM、好ましくは10nM～100μM、より好ましくは100nM～10μM（具体例は2μM）である。Shhシグナル経路作用物質の濃度は、ステップ（ｉ）の全ての期間に亘り一定でなくてもよい。例えば、浮遊培養の開始から3日間～8日間（具体例は6日間）は培地にShhシグナル経路作用物質を添加せず、その後、Shhシグナル経路作用物質を培地へ添加してもよい。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 The concentration of the Shh signal pathway agonist in the medium can be set as appropriate as long as differentiation into the hypothalamus and pituitary is possible, but when using SAG as the Shh signal pathway agonist, the concentration is For example, it is 1 nM to 1000 μM, preferably 10 nM to 100 μM, more preferably 100 nM to 10 μM (specific example is 2 μM). The concentration of the Shh signal pathway agent may not be constant over the entire period of step (i). For example, the Shh signal pathway agent may not be added to the medium for 3 to 8 days (specifically, 6 days) from the start of suspension culture, and then the Shh signal pathway agent may be added to the medium. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　ステップ（ｉ）に用いる培地は、分散により誘導されるヒト多能性幹細胞の細胞死を抑制するために、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）阻害剤を培養開始時から添加することが好ましい（特開２００８－９９６６２号公報を参照）。ROCK阻害剤を培養開始から例えば15日以内、好ましくは10日以内、より好ましくは6日以内添加する。ROCK阻害剤としては、Y-27632（（＋）-（R）-trans-4-（1-aminoethyl）-N-（4-pyridyl）cyclohexanecarboxamide dihydrochloride）等を挙げることができる。ROCK阻害剤は、分散により誘導されるヒト多能性幹細胞の細胞死を抑制し得る濃度で使用される。例えば、Y-27632を用いる場合には、例えば約O.1～200μM、好ましくは約2～50μMの濃度とする。ROCK阻害剤の濃度を添加期間内で変動させてもよく、例えば添加期間の後半で濃度を半減させることができる。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 In order to suppress the cell death of human pluripotent stem cells induced by dispersion, the medium used in step (i) is preferably added with a Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor from the beginning of the culture. (See JP 2008-99662 A). The ROCK inhibitor is added, for example, within 15 days, preferably within 10 days, more preferably within 6 days from the start of culture. Examples of ROCK inhibitors include Y-27632 ((+)-(R) -trans-4- (1-aminoethyl) -N- (4-pyridyl) cyclohexanecarboxamide dihydrochloride). The ROCK inhibitor is used at a concentration that can suppress cell death of human pluripotent stem cells induced by dispersion. For example, when Y-27632 is used, the concentration is, for example, about O.1 to 200 μM, preferably about 2 to 50 μM. The concentration of the ROCK inhibitor may be varied within the addition period, for example, the concentration can be halved in the latter half of the addition period. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　使用可能な基礎培地、培地に含有させることが可能な物質等、特に言及しない事項は上記第１の局面のステップ（１）に準ずる。 Matters not specifically mentioned, such as usable basal medium and substances that can be contained in the medium, conform to step (1) of the first aspect.
　ステップ（ｉ）の培養は、ヒト多能性幹細胞から視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化が誘導されるのに十分な期間実施される。視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉への分化は、例えば、RT-PCRや、視床下部神経上皮組織や表皮外胚葉のマーカー特異的抗体を用いた免疫組織化学により検出することができる。例えば、培養中の細胞凝集塊のうち10%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは50%以上の細胞凝集塊が視床下部神経上皮組織及び表皮外胚葉を含むまで実施される。培養期間は、使用する骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の種類に応じて変動し得るが、例えば15～20日（具体例は18日間）である。 The culture in step (i) is performed for a period sufficient to induce differentiation from human pluripotent stem cells into hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm. Differentiation into hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm can be detected by, for example, RT-PCR and immunohistochemistry using marker-specific antibodies for hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm. For example, it is carried out until 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 50% or more of the cell aggregates in culture contain hypothalamic neuroepithelial tissue and epidermal ectoderm. The culture period may vary depending on the type of osteogenic factor signal transduction pathway activator and Shh signal pathway agonist used, and is, for example, 15 to 20 days (specific example is 18 days).
　視床下部神経上皮組織とは、視床下部マーカーを発現する神経上皮組織をいう。視床下部マーカーとしては、NKx2.1（腹側視床下部マーカー）、Pax6（背側視床下部マーカー）等が挙げられる。一態様において、腹側視床下部神経上皮組織は、Rx陽性、Chx10陰性、且つNkx2.1陽性の神経上皮組織である。一態様において、背側視床下部神経上皮組織は、Rx陽性、Chx10陰性、且つPax6陽性の神経上皮組織である。 The hypothalamic neuroepithelial tissue refers to a neuroepithelial tissue that expresses a hypothalamic marker. Examples of hypothalamic markers include NKx2.1 (ventral hypothalamic marker), Pax6 (dorsal hypothalamic marker), and the like. In one embodiment, the ventral hypothalamic neuroepithelial tissue is Rx positive, Chx10 negative, and Nkx2.1 positive neuroepithelial tissue. In one embodiment, the dorsal hypothalamic neuroepithelial tissue is Rx positive, Chx10 negative, and Pax6 positive neuroepithelial tissue.
　表皮外胚葉とは、胚発生において、胚の表層に形成される外胚葉細胞層である。表皮外胚葉マーカーとしては、pan-cytokeratinが挙げられる。表皮外胚葉は、一般的には、下垂体前葉、皮膚、口腔上皮、歯のエナメル質、皮膚腺等へ分化し得る。一態様において、表皮外胚葉は、E-cadherin陽性且つpan-cytokeratin陽性の細胞層である。 The epidermal ectoderm is an ectoderm cell layer formed on the surface layer of the embryo during embryogenesis. Examples of epidermal ectoderm markers include pan-cytokeratin. Epidermal ectoderm can generally differentiate into anterior pituitary, skin, oral epithelium, dental enamel, skin glands and the like. In one embodiment, the epidermal ectoderm is an E-cadherin positive and pan-cytokeratin positive cell layer.
　好適には、ステップ（ｉ）で得られる細胞凝集塊においては、視床下部神経上皮組織がその細胞凝集塊の内部を占めており、単層の表皮外胚葉の細胞がその細胞凝集塊の表面を構成する。表皮外胚葉は、その一部に肥厚した表皮プラコードを含んでいてもよい。 Preferably, in the cell aggregate obtained in step (i), the hypothalamic neuroepithelial tissue occupies the inside of the cell aggregate, and the cells of the monolayer epidermis ectoderm cover the surface of the cell aggregate. Constitute. The epidermis ectoderm may contain a thickened epidermis placode in part.
　好ましい一態様では、質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を用いることにより、凝集塊間での分化の程度の差を最小限に留め、分化誘導効率を向上することができる。質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団の浮遊培養の例として、以下の態様（Ａ）及び（Ｂ）を挙げることができる。
（Ａ）複数の培養コンパートメントを用意し、1つの培養コンパートメントに1つのヒト多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を播く。（例えば、96ウェルプレートの各ウェルにヒト多能性幹細胞の凝集塊を1つずつ入れる。）そして、各培養コンパートメントにおいて、1つのヒト多能性幹細胞の凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。
（Ｂ）1つの培養コンパートメントに複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊が含まれるように、質的に均一な、ヒト多能性幹細胞の凝集塊の集団を1つの培養コンパートメントに播く。（例えば、10cmディッシュに、複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊を入れる。）そして、当該コンパートメントにおいて、複数のヒト多能性幹細胞の凝集塊を骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養する。 In one preferred embodiment, a population of qualitatively uniform aggregates of human pluripotent stem cells is cultured in suspension in a medium containing an osteogenic factor signaling pathway activator and a Shh signaling pathway agonist. By using a population of qualitatively uniform aggregates of human pluripotent stem cells, the difference in the degree of differentiation between aggregates can be minimized and differentiation induction efficiency can be improved. Examples of suspension culture of a qualitatively uniform population of human pluripotent stem cell aggregates include the following aspects (A) and (B).
(A) Prepare multiple culture compartments and seed a qualitatively uniform population of human pluripotent stem cell aggregates so that one culture compartment contains one human pluripotent stem cell aggregate . (For example, one human pluripotent stem cell aggregate is placed in each well of a 96-well plate.) Then, in each culture compartment, one human pluripotent stem cell aggregate is converted into osteogenic factor signaling pathway activity. Suspension culture in a medium containing an activator and an Shh signaling pathway agonist.
(B) A qualitatively uniform population of human pluripotent stem cell aggregates is seeded in one culture compartment so that one culture compartment contains multiple human pluripotent stem cell aggregates. (For example, a plurality of human pluripotent stem cell aggregates are placed in a 10 cm dish.) In the compartment, a plurality of human pluripotent stem cell aggregates are combined with an osteogenic factor signaling pathway activator and an Shh signal. Suspension culture is performed in a medium containing a pathway agent.
　本発明の方法では（Ａ）及び（Ｂ）のいずれの態様を採用することもできる。また、本発明の方法における培養の途中で態様を変更してもよい（（Ａ）の態様から（Ｂ）の態様への変更。或いは（Ｂ）の態様から（Ａ）の態様への変更）。一態様では、ステップ（ｉ）の培養に（Ａ）の態様を採用し、ステップ（ｉｉ）の培養に（Ｂ）の態様を採用する。 In the method of the present invention, any of the aspects (A) and (B) can be adopted. Moreover, you may change an aspect in the middle of the culture | cultivation in the method of this invention (change from the aspect of (A) to the aspect of (B). Or the change from the aspect of (B) to the aspect of (A)). . In one aspect, the aspect of (A) is employ | adopted for culture | cultivation of step (i), and the aspect of (B) is employ | adopted for culture | cultivation of step (ii).
　ステップ（ｉｉ）
　ステップ（ｉ）に続くステップ（ｉｉ）では、ステップ（ｉ）で得られた細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養する。このステップによって、視床下部及び下垂体への更なる分化が誘導される。特に言及しない培養条件（培養方法（好ましくは静置培養が採用される）、フィーダー細胞の使用の可能性（好ましくはフィーダー細胞非存在下で培養する）、使用可能な培養器、使用する基礎培地、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質以外の添加物等）についてはステップ（ｉ）と同様である。以下では、ステップ（ｉｉ）に特徴的な培養条件を説明する。 Step (ii)
In step (ii) following step (i), the cell aggregate obtained in step (i) is further subjected to suspension culture in a medium containing an osteogenic factor signal transduction pathway activator and a Shh signal pathway activator. This step induces further differentiation into the hypothalamus and pituitary gland. Culture conditions not specifically mentioned (culture method (preferably stationary culture is adopted), possibility of using feeder cells (preferably cultured in the absence of feeder cells), usable incubator, basal medium used The additives other than the osteogenic factor signal transduction pathway activator and the Shh signal pathway activator are the same as in step (i). Hereinafter, the culture conditions characteristic to step (ii) will be described.
　ステップ（ｉｉ）は、好ましくは、高酸素分圧条件下で行われる。高酸素分圧条件下で浮遊培養することにより、細胞凝集塊内部への酸素の到達、及び細胞凝集塊の長期間の維持培養が達成され、視床下部組織及び下垂体組織への効率的な分化誘導が可能となる。 Step (ii) is preferably performed under high oxygen partial pressure conditions. By floating culture under high oxygen partial pressure conditions, oxygen can reach inside the cell aggregate and long-term maintenance culture of the cell aggregate can be achieved, and efficient differentiation into hypothalamic and pituitary tissues Guidance is possible.
　高酸素分圧条件とは、空気中の酸素分圧（20%）を上回る酸素分圧条件を意味する。ステップ（ｉｉ）における酸素分圧は、例えば30～60%、好ましくは35～60%、より好ましくは38～60%（具体例は40%）である。 The high oxygen partial pressure condition means an oxygen partial pressure condition that exceeds the oxygen partial pressure in air (20%). The oxygen partial pressure in step (ii) is, for example, 30 to 60%, preferably 35 to 60%, more preferably 38 to 60% (specific example is 40%).
　ステップ（ｉｉ）の浮遊培養における培養温度、C02濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30～40℃、好ましくは約37℃である。C02濃度は、例えば約1～10%、好ましくは約5%である。 The culture temperature in suspension culture in step (ii), other culture conditions such as C0 2 concentration may be set as appropriate. The culture temperature is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. C0 2 concentration, for example, from about 1-10%, preferably about 5%.
　ステップ（ｉｉ）に使用する培地は骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含有する。培地中の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度は、視床下部と下垂体への分化誘導が可能な範囲で、適宜設定することができるが、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質としてBMP4を用いる場合、その濃度は、例えば0.01～1000nM、好ましくは0.1～100nM、より好ましくは1～10nM（具体例は5nM）である。培養途中で骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の濃度を低減させてもよい。例えば、ステップ（ｉｉ）の開始時に上述の濃度とし、2～4日毎に半分の濃度になるように、段階的に濃度を低減させることができる。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 The medium used in step (ii) contains an osteogenic factor signal transduction pathway activator and a Shh signal pathway activator. The concentration of the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator in the medium can be set as appropriate as long as it can induce differentiation into the hypothalamus and pituitary gland. When is used, the concentration is, for example, 0.01 to 1000 nM, preferably 0.1 to 100 nM, more preferably 1 to 10 nM (specific example is 5 nM). The concentration of the osteogenic factor signal transduction pathway activator may be reduced during the culture. For example, the concentration can be reduced stepwise so that the concentration is the above-described concentration at the start of step (ii) and becomes half the concentration every 2 to 4 days. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　培地中のShhシグナル経路作用物質の濃度は、視床下部と下垂体への分化誘導が可能な範囲で、適宜設定することができるが、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合、その濃度は、例えば1nM～1000μM、好ましくは10nM～100μM、より好ましくは100nM～10μM（具体例は2μM）である。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 The concentration of the Shh signal pathway agonist in the medium can be set as appropriate as long as differentiation into the hypothalamus and pituitary is possible, but when using SAG as the Shh signal pathway agonist, the concentration is For example, it is 1 nM to 1000 μM, preferably 10 nM to 100 μM, more preferably 100 nM to 10 μM (specific example is 2 μM). The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　一態様において、ステップ（ｉｉ）に用いる培地は、FGF2を含む。FGF2は、表皮外胚葉から下垂体プラコードへの分化を促進する。培地中における、FGF2の濃度は、通常1～1000ng/ml、好ましくは10～100ng/mlである。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 In one embodiment, the medium used in step (ii) contains FGF2. FGF2 promotes differentiation from epidermal ectoderm to pituitary placode. The concentration of FGF2 in the medium is usually 1 to 1000 ng / ml, preferably 10 to 100 ng / ml. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　FGF2は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）とも呼ばれる、公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列も公知である。本発明に用いるFGF2は、通常哺乳動物のFGF2である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブ夕、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、オランウータン、チンパンジー等の霊長類を挙げることができる。FGF2は、多くの哺乳動物の種間で交差反応性を有するので、本発明の目的を達成し得る限り、いずれの哺乳動物のFGF2を用いてもよいが、FGFは、好ましくは、げっ歯類（マウス、ラット等）又は霊長類（ヒト等）のFGF2であり、好ましくはヒトFGF2である。ヒトFGF2とは、ヒトが生体内で天然に発現するFGF2のアミノ酸配列を有することを意味する。ヒトFGF2の代表的なアミノ酸配列としては、NCBIのアクセッション番号で、NP_001997.5（2014年2月18日更新）等を例示することができる。 FGF2 is a known cytokine, also called basic fibroblast growth factor (bFGF), and its amino acid sequence is also known. FGF2 used in the present invention is usually mammalian FGF2. Examples of mammals include rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and laboratory animals such as rabbits, livestock such as buyu, cattle, goats, horses, and sheep, pets such as dogs and cats, humans, monkeys, and the like. Primates such as orangutans and chimpanzees. Since FGF2 has cross-reactivity between many mammalian species, FGF2 of any mammal may be used as long as the object of the present invention can be achieved. However, FGF is preferably a rodent. (Mouse, rat, etc.) or primate (human etc.) FGF2, preferably human FGF2. Human FGF2 means that the human has the amino acid sequence of FGF2 that is naturally expressed in vivo. As a representative amino acid sequence of human FGF2, NP_001997.5 (updated on February 18, 2014) can be exemplified by the NCBI accession number.
　ステップ（ｉｉ）の培養期間は、使用する骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質の種類に応じて変動し得るが、例えば6～20日、好ましくは10日～14日（具体例は12日間）である。 The culture period in step (ii) may vary depending on the type of osteogenic factor signal transduction pathway activator and Shh signal pathway activator used, but for example 6 to 20 days, preferably 10 to 14 days ( A specific example is 12 days).
　ステップ（ｉｉｉ）
　ステップ（ｉｉ）で得られた細胞凝集塊は更なる浮遊培養に供される。このステップの培養には、下垂体及び視床下部の同時誘導に適した培地が用いられる。換言すれば、培地組成を変更し、下垂体及び視床下部の同時誘導を促す。 Step (iii)
The cell aggregate obtained in step (ii) is subjected to further suspension culture. For this step, a medium suitable for simultaneous induction of the pituitary gland and the hypothalamus is used. In other words, the medium composition is changed to promote simultaneous induction of the pituitary gland and the hypothalamus.
　ステップ（ｉｉｉ）の培養では、好ましくは、Shhシグナル経路作用物質を含む培地を使用する。培地中のShhシグナル経路作用物質の濃度は、視床下部と下垂体への分化誘導が可能な範囲で、適宜設定することができるが、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合、その濃度は、例えば1nM～1000μM、好ましくは10nM～100μM、より好ましくは100nM～10μM（具体例は2μM）である。一方、好ましくは、上記ステップ（３）の分散培養に用いる培地の成分を含んだ培地（好ましくは、神経細胞の増殖及び分化を促す成分を含む）を用いる。例えば、上記ステップ（３）の分散培養に用いる培地と、上記ステップ（ｉｉ）の培養に用いる培地を容量比１：１で混合した培地を用いる。また、この混合培地に血清代替物（例えばKSR）を容量で20%程度加えるとよい。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 In the culture in step (iii), a medium containing an Shh signal pathway acting substance is preferably used. The concentration of the Shh signal pathway agonist in the medium can be set as appropriate as long as differentiation into the hypothalamus and pituitary is possible, but when using SAG as the Shh signal pathway agonist, the concentration is For example, it is 1 nM to 1000 μM, preferably 10 nM to 100 μM, more preferably 100 nM to 10 μM (specific example is 2 μM). On the other hand, preferably, a medium containing components of the medium used for the dispersion culture in the above step (3) (preferably including a component that promotes proliferation and differentiation of nerve cells) is used. For example, a medium in which the medium used for the dispersion culture in step (3) and the medium used for the culture in step (ii) are mixed at a volume ratio of 1: 1 is used. In addition, a serum substitute (for example, KSR) may be added to the mixed medium at a volume of about 20%. The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　ステップ（ｉｉｉ）の培養は、視床下部の成熟（視床下部神経細胞の分化・成熟）及び下垂体の成熟に十分な期間実施される。視床下部の十分な成熟が生じたことは、視床下部組織に局在が認められる神経細胞（例えば、AVPニューロン、OXTニューロン、TRHニューロン、CRHニューロン、NPYニューロン、AgRPニューロン、POMCニューロン、MCHニューロン、Orexinニューロン）の有無や存在率、当該神経細胞が産生するホルモンの有無や量によって確認することができる。他方、下垂体の十分な成熟が生じたことは、下垂体ホルモン産生細胞（成長ホルモン（GH）産生細胞、プロラクチン（PRL）産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）産生細胞、甲状腺刺激ホルモン（TSH）産生細胞、卵胞刺激ホルモン（FSH）産生細胞、黄体化ホルモン産生細胞、メラニン細胞刺激ホルモン（MSH）産生細胞等）の有無や存在率、当該細胞が産生するホルモンの有無や量によって確認することができる。 The culture in step (iii) is carried out for a period of time sufficient for hypothalamic maturation (hypothalamic neuron differentiation / maturation) and pituitary maturation. Full maturation of the hypothalamus has occurred because neurons that are localized in the hypothalamic tissue (eg, AVP neurons, OXT neurons, TRH neurons, CRH neurons, NPY neurons, AgRP neurons, POMC neurons, MCH neurons, Orexin neurons) and the presence rate thereof, and the presence and amount of hormones produced by the nerve cells. On the other hand, sufficient pituitary maturation occurred when pituitary hormone-producing cells (growth hormone (GH) producing cells, prolactin (PRL) producing cells, corticotropin (ACTH) producing cells, thyroid stimulating hormone (TSH) ) Production cells, follicle stimulating hormone (FSH) producing cells, luteinizing hormone producing cells, melanocyte stimulating hormone (MSH) producing cells, etc.) Can do.
　ステップ（ｉｉｉ）の培養期間は、培養条件に応じて変動し得るが、例えば50日～200日、好ましくは70日～150日（具体例は70日間、80日間、90日間、100日間、110日間、120日間）である。 The culture period of step (iii) may vary depending on the culture conditions, but for example, 50 days to 200 days, preferably 70 days to 150 days (specific examples are 70 days, 80 days, 90 days, 100 days, 110 days, 110 days). 120 days).
　一態様では、ステップ（ｉｉ）とステップ（ｉｉｉ）の間に以下のステップ（ａ）を行う。
　（ａ）ステップ（ｉｉ）で得られた細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ In one aspect, the following step (a) is performed between step (ii) and step (iii).
(A) A step of further subjecting the cell aggregate obtained in step (ii) to suspension culture in a medium containing a substance acting on the Shh signal pathway
　この態様では、ステップ（ａ）で得られた細胞凝集塊がステップ（ｉｉｉ）の培養に供される。ステップ（ａ）によって、視床下部及び下垂体への効率的な分化が誘導される。特に言及しない培養条件（培養方法（好ましくは静置培養が採用される）、フィーダー細胞の使用の可能性（好ましくはフィーダー細胞非存在下で培養する）、使用可能な培養器、使用する基礎培地及びShhシグナル経路作用物質以外の添加物等）についてはステップ（ｉｉ）と同様である。以下では、ステップ（ａ）に特徴的な培養条件を説明する。 In this embodiment, the cell aggregate obtained in step (a) is subjected to the culture in step (iii). Step (a) induces efficient differentiation into the hypothalamus and pituitary gland. Culture conditions not specifically mentioned (culture method (preferably stationary culture is adopted), possibility of using feeder cells (preferably cultured in the absence of feeder cells), usable incubator, basal medium used And additives other than the Shh signal pathway agonist) are the same as in step (ii). Hereinafter, the culture conditions characteristic to step (a) will be described.
　ステップ（ａ）では、Shhシグナル経路作用物質を含む培地を使用する。培地中のShhシグナル経路作用物質の濃度は、視床下部と下垂体への分化誘導が可能な範囲で、適宜設定することができるが、Shhシグナル経路作用物質としてSAGを用いる場合、その濃度は、例えば1nM～1000μM、好ましくは10nM～100μM、より好ましくは100nM～10μM（具体例は2μM）である。尚、最適な濃度は予備実験を通して設定することができる。 In step (a), a medium containing a substance that acts on the Shh signal pathway is used. The concentration of the Shh signal pathway agonist in the medium can be set as appropriate as long as differentiation into the hypothalamus and pituitary is possible, but when using SAG as the Shh signal pathway agonist, the concentration is For example, it is 1 nM to 1000 μM, preferably 10 nM to 100 μM, more preferably 100 nM to 10 μM (specific example is 2 μM). The optimum concentration can be set through preliminary experiments.
　ステップ（ａ）に使用する培地は、好ましくは、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を含有しない。換言すれば、ステップ（ａ）では、Shhシグナル経路作用物質を含有する一方で、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質は含有しない培地を使用することが好ましい。当該条件によれば、骨形成因子シグナルの長期暴露による細胞塊の嚢胞化や分化方向の変化を避けられる、という効果が得られる。 The medium used in step (a) preferably does not contain a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator. In other words, in the step (a), it is preferable to use a medium containing a substance that acts on the Shh signal pathway but does not contain a substance that activates the bone morphogenetic factor signal transduction pathway. According to the said conditions, the effect that the change of the cystification of a cell mass and the differentiation direction by the long-term exposure of an osteogenic factor signal can be avoided.
　ステップ（ａ）に使用する培地は、好ましくは、血清代替物を含有する。培地中の血清代替物の濃度は、視床下部と下垂体への分化誘導が可能な範囲で、適宜設定することができるが、血清代替物としてKSRを用いる場合、その濃度は、例えば1%(v/v)～30%(v/v)、好ましくは5%(v/v)～～20%(v/v)（具体例は10%(v/v)）である。 The medium used in step (a) preferably contains a serum replacement. The concentration of the serum substitute in the medium can be appropriately set as long as differentiation into the hypothalamus and the pituitary gland is possible, but when KSR is used as the serum substitute, the concentration is, for example, 1% ( v / v) to 30% (v / v), preferably 5% (v / v) to 20% (v / v) (specific example is 10% (v / v)).
　ステップ（ａ）は、好ましくは、高酸素分圧条件下で行われる。高酸素分圧条件下で浮遊培養することにより、細胞凝集塊内部への酸素の到達、及び細胞凝集塊の長期間の維持培養が達成され、視床下部組織及び下垂体組織への効率的な分化誘導が可能となる。 Step (a) is preferably performed under high oxygen partial pressure conditions. By floating culture under high oxygen partial pressure conditions, oxygen can reach inside the cell aggregate and long-term maintenance culture of the cell aggregate can be achieved, and efficient differentiation into hypothalamic and pituitary tissues Guidance is possible.
　高酸素分圧条件とは、空気中の酸素分圧（20%）を上回る酸素分圧条件を意味する。ステップ（ａ）における酸素分圧は、例えば30～60%、好ましくは35～60%、より好ましくは38～60%（具体例は40%）である。 The high oxygen partial pressure condition means an oxygen partial pressure condition that exceeds the oxygen partial pressure in air (20%). The oxygen partial pressure in step (a) is, for example, 30 to 60%, preferably 35 to 60%, more preferably 38 to 60% (specific example is 40%).
　ステップ（ａ）の培養期間は、培養条件に応じて変動し得るが、例えば10日～40日、好ましくは15日～30日（具体例は20日間、25日間）である。 The culture period of step (a) may vary depending on the culture conditions, and is, for example, 10 to 40 days, preferably 15 to 30 days (specific examples are 20 days and 25 days).
３．細胞構造体、細胞構造体を構成する細胞の用途
　本発明の製造方法により得られた細胞構造体、即ち、背側若しくは腹側の視床下部組織を含む細胞構造体又はハイブリッド型細胞構造体、或いはその一部（細胞構造体を構成する組織又は細胞）は、例えば、移植医療に利用される。「細胞構造体の一部」は、メス等による裁断、タンパク質分解酵素やEDTA等による処理等によって調製することができる。移植医療などへの適用に先立って、調製した細胞を細胞表面マーカー、形態、分泌物質などを指標として精製ないし純化してもよい。 3. Cell structure, use of cells constituting cell structure, cell structure obtained by the production method of the present invention, that is, cell structure or hybrid cell structure including dorsal or ventral hypothalamic tissue, or A part (tissue or cell constituting the cell structure) is used for transplantation medicine, for example. “Part of the cell structure” can be prepared by cutting with a scalpel or the like, treatment with a proteolytic enzyme, EDTA, or the like. Prior to application to transplantation medicine or the like, the prepared cells may be purified or purified using cell surface markers, morphology, secretory substances, etc. as indicators.
　視床下部組織を含む細胞構造体又はその一部を用いた移植医療では、視床下部の障害に起因する疾患、視床下部の障害を伴う疾患（本明細書では以上の二つの疾患をまとめて「視床下部疾患」と呼ぶ）が治療対象となる。他方、ハイブリッド型細胞構造体又はその一部を用いた移植医療では、視床下部及び／又は下垂体の障害に起因する疾患、視床下部及び／又は下垂体の障害を伴う疾患（本明細書では以上の二つの疾患をまとめて「視床下部下垂体疾患」と呼ぶ）が治療対象となる。ハイブリッド型細胞構造体は、機能的に不可分な視床下部組織と下垂体組織が複合体を形成していることから、視床下部と下垂体の両者に障害を認める病態の治療に特に好適である。 In transplantation medical treatment using a cellular structure including a hypothalamic tissue or a part thereof, a disease caused by a hypothalamic disorder, a disease accompanied by a hypothalamic disorder (in this specification, the above two diseases are collectively referred to as “thalamus” This is called “lower disease”. On the other hand, in transplantation medical treatment using a hybrid cell structure or a part thereof, diseases caused by disorders of the hypothalamus and / or pituitary gland, diseases associated with disorders of the hypothalamus and / or pituitary gland (in the present specification, it is These two diseases are collectively referred to as “hypothalamic pituitary disease”). The hybrid cell structure is particularly suitable for the treatment of a pathological condition in which both the hypothalamus and the pituitary gland are impaired because a functionally indivisible hypothalamic tissue and pituitary tissue form a complex.
　本発明の細胞構造体又はその一部が適用可能な疾患を例示すると、中枢性尿崩症、視床下部性下垂体機能低下症、プラダー症候群、ローレンスムーンビードル症候群、視床下部性肥満、摂食障害、認知機能障害、睡眠障害、汎下垂体機能低下症、下垂体性小人症、副腎皮質機能低下症、部分的下垂体機能低下症、下垂体前葉ホルモン単独欠損症、外傷、放射線治療、切除術等による視床下部及び／又は下垂体の損傷である。 Examples of diseases to which the cell structure of the present invention or a part thereof can be applied include central diabetes insipidus, hypothalamic pituitary dysfunction, Prader syndrome, Lawrence Moonbeed syndrome, hypothalamic obesity, eating disorder , Cognitive dysfunction, sleep disorders, panhypopituitarism, pituitary dwarfism, hypoadrenocorticism, partial hypopituitarism, anterior pituitary hormone alone deficiency, trauma, radiation therapy, resection Damage to the hypothalamus and / or pituitary gland due to surgery.
　本発明の細胞構造体又はその一部を移植医療に用いる場合の移植部位は、移植後に視床下部及び／又は下垂体としての機能を発揮する限り特に限定されないが、例えば、腎皮膜下、皮下、腹膜、大脳、視床下部、下垂体を挙げることができる。以上の説明から明らかな通り、本願は、本発明の細胞構造体又はそれを構成する細胞を患者に移植することを特徴とする、視床下部疾患又は視床下部下垂体疾患の治療法も提供する。 The transplant site when the cell structure of the present invention or a part thereof is used for transplantation medical treatment is not particularly limited as long as it functions as a hypothalamus and / or pituitary after transplantation, for example, subrenal, subcutaneous, Examples include the peritoneum, cerebrum, hypothalamus, and pituitary gland. As is apparent from the above description, the present application also provides a method for treating hypothalamic disease or hypothalamic pituitary disease, characterized by transplanting the cell structure of the present invention or the cells constituting the cell structure to a patient.
　移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、レシピエントの体細胞から樹立したヒト多能性幹細胞を用いて本発明の細胞構造体を製造することで当該問題を克服できる。そこで、本発明の好ましい態様では、本発明の方法におけるヒト多能性幹細胞として、レシピエントの体細胞から樹立したヒト多能性幹細胞（例えばiPS細胞）を用いることにする。当該態様によれば、自己の細胞から構築された細胞構造体又はその一部がレシピエントに移植されることになる。 In transplantation medicine, rejection due to differences in histocompatibility antigens is often a problem, but this problem can be solved by producing the cell structure of the present invention using human pluripotent stem cells established from recipient somatic cells. It can be overcome. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, human pluripotent stem cells (for example, iPS cells) established from recipient somatic cells are used as human pluripotent stem cells in the method of the present invention. According to this aspect, a cell structure constructed from self cells or a part thereof is transplanted into a recipient.
　本発明の細胞構造体又はその一部は、薬物のスクリーニングや評価に使用することができる。詳しくは、視床下部疾患又は視床下部下垂体疾患の治療薬のスクリーニング、治療薬候補の有効性評価や毒性試験等に適用することができる。例えば、視床下部疾患又は視床下部下垂体疾患を罹患する患者からiPS細胞を作製し、当該iPS細胞から本発明の製造方法で細胞構造体を製造する。得られた細胞構造体又はその一部を被験物質の存在下で培養する（試験群）。コントロール群として、非存在下で培養する。そして、試験群とコントロール群の間で障害の程度を比較する。障害の程度を軽減する効果を認めた被験物質を治療薬の候補物質として選択する。被験物質としては様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を用いることができる。有機化合物の例として、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。被験物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被験物質として用いてもよい。また、既存の薬剤を被験物質としてもよい。2種類以上の被験物質を同時に添加することにより、被験物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。 The cell structure of the present invention or a part thereof can be used for drug screening and evaluation. Specifically, the present invention can be applied to screening of therapeutic agents for hypothalamic diseases or hypothalamic pituitary diseases, efficacy evaluation of therapeutic drug candidates, toxicity tests, and the like. For example, iPS cells are produced from a patient suffering from hypothalamic disease or hypothalamic pituitary disease, and a cell structure is produced from the iPS cells by the production method of the present invention. The obtained cell structure or a part thereof is cultured in the presence of a test substance (test group). As a control group, the cells are cultured in the absence. Then, the degree of injury is compared between the test group and the control group. A test substance that has been confirmed to be effective in reducing the degree of the disorder is selected as a candidate substance for the therapeutic agent. As a test substance, organic compounds or inorganic compounds having various molecular sizes can be used. Examples of organic compounds include nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosylglycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, vitamins (B1 B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.) The test substance may be derived from a natural product or may be synthetic. In this case, an efficient screening system can be constructed using, for example, a combinatorial synthesis technique, and plant extracts, cell extracts, culture supernatants, etc. may be used as test substances. Drugs may be used as test substances, and by adding two or more kinds of test substances at the same time, it is possible to investigate the interaction and synergy between test substances. It may be.
Ａ．ヒトES細胞からの分化誘導
１．ヒトES細胞から視床下部への分化誘導法の検討
（１）既報の方法の適用
　Watayaらは、マウスES細胞から視床下部ニューロンへ分化誘導する方法を確立した（Wataya T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 105(33): 11796-11801 (2008).）。マウスES細胞を用いた場合には当該方法によってAVPニューロンへ分化することを確認した（図１左）。 A. Induction of differentiation from human ES cells Examination of differentiation induction method from human ES cell to hypothalamus (1) Application of previously reported method Wataya et al. Established a method to induce differentiation from mouse ES cell to hypothalamic neuron (Wataya T. et al., Proc Natl Acad Sci USA 105 (33): 11796-11801 (2008).). When mouse ES cells were used, it was confirmed that they differentiated into AVP neurons by this method (left in FIG. 1).
　次に、当該方法がヒトES細胞にも適用可能であるか検討した。ヒトES細胞（KhES-1）を常法によりMEF上で維持培養したものを用いた。視床下部組織への分化誘導をモニターするために、視床下部神経のマーカーであるRxの遺伝子へVenus cDNAをノックインしたKhES-1を利用した。無血清浮遊凝集塊培養法（SFEBq法）によりヒトES細胞を分化させるため、Nakanoら（Cell Stem Cell. 2012 Jun 14;10(6):771-85.）の方法により、ヒトES細胞を酵素により単一細胞へ分散させた上、低細胞接着性のV底96穴プレート（住友ベークライト）を用いて再凝集させた。1穴につき10,000個の細胞を播種し、gfCDM分化培地で5％CO2下に37℃で培養した。播種日を分化培養0日として、0日目から3日目まで20μM　Y-27632（ROCK阻害剤：分散時の細胞死抑制剤：Watanabeら（Nat Biotechnol. 2007 Jun;25(6):681-6. Epub 2007 May 27.））を添加し、培養3日目以降はY-27632を含まない分化培地で3日に1回の頻度で半量培地交換を行った。 Next, it was examined whether the method can be applied to human ES cells. Human ES cells (KhES-1) maintained and cultured on MEF by a conventional method were used. In order to monitor the induction of differentiation into hypothalamic tissue, KhES-1 in which Venus cDNA was knocked in to the gene of Rx, a marker of hypothalamic nerve, was used. In order to differentiate human ES cells by the serum-free floating aggregate culture method (SFEBq method), the human ES cells were enzymatically isolated by the method of Nakano et al. (Cell Stem Cell. 2012 Jun 14; 10 (6): 771-85.). And then re-aggregated using a low cell adhesion V-bottom 96-well plate (Sumitomo Bakelite). 10,000 cells were seeded per well and cultured in gfCDM differentiation medium at 37 ° C. under 5% CO 2 . 20 μM Y-27632 (ROCK inhibitor: cell death inhibitor during dispersion: Watanabe et al. (Nat Biotechnol. 2007 Jun; 25 (6): 681-) 6. Epub 2007 May 27.)) was added, and after the third day of culture, half-volume medium was changed once every three days in a differentiation medium not containing Y-27632.
　結果を図１右に示す。培養3日目にて、細胞塊が形成されないことを確認した。即ち、gfCDM培地を用いてSFEBq法を施行したものの、細胞塊の形成が認められなかった。 The results are shown on the right side of FIG. On day 3 of culture, it was confirmed that no cell mass was formed. That is, although the SFEBq method was performed using the gfCDM medium, the formation of cell clusters was not observed.
（２）培地中の成分の検討１（血清代替物の使用）
　凝集塊が形成しなかった原因が栄養不足にあると考え、gfCDMに血清代替物KSRを少量添加し、その効果を検証した。具体的には、gfCDM培地に2%、5%、10%、20%のKSRを混合してSFEBq法を施行した。18日目以降は、培養時の酸素分圧を40％とした。組織の分化を蛍光抗体法で解析した。 (2) Examination of ingredients in medium 1 (use of serum substitute)
Considering the lack of nutrition as the cause of the formation of no aggregates, a small amount of serum substitute KSR was added to gfCDM, and the effect was verified. Specifically, SFEBq method was performed by mixing 2%, 5%, 10%, and 20% KSR in gfCDM medium. After the 18th day, the oxygen partial pressure during culture was set to 40%. Tissue differentiation was analyzed by the fluorescent antibody method.
　培養3日目において凝集塊はできた（図２左）が、培養30日目の細胞塊の内部は、Rxが発現せず、Bf1の広範な発現を認めた（図２右）。終脳の前駆細胞へ分化したものと考えられた。 On the 3rd day of culture, aggregates were formed (FIG. 2 left), but Rx was not expressed inside the cell mass on the 30th day of culture, and extensive expression of Bf1 was observed (right side of FIG. 2). It was thought to have differentiated into progenitor cells of the telencephalon.
（３）培地中の成分の検討２（骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質の使用）
　終脳へと位置情報がずれた原因はKSRが含む種々の成長因子にあると考え、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を添加することにした。具体的には、以下の条件で分化誘導を試みた。SFEBq法施行後6日目より3.0 nM程度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質を含む培地にて浮遊培養した。培養15日目の培地交換からは、骨形成因子シグナル伝達活性化物質を含まない培地を用いて半量の培地を交換することにした（従って、培養15日目以降は培地交換の度に骨形成因子シグナル伝達活性化物質の濃度が培地交換前の1/2になる）。培地交換の頻度は3日に1回である。 (3) Examination of components in the culture medium 2 (use of osteogenic factor signal transduction pathway activator)
It was thought that the cause of positional information shift to the telencephalon was due to various growth factors contained in KSR, and we decided to add a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator. Specifically, differentiation induction was attempted under the following conditions. From day 6 after the SFEBq method was applied, suspension culture was performed in a medium containing a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator of about 3.0 nM. From the medium exchange on the 15th day of culture, it was decided to replace half of the medium with a medium that does not contain the bone morphogenetic factor signaling activator. The concentration of the factor signaling activator is halved before the medium change). The frequency of medium change is once every 3 days.
　BMP4シグナルを加えることによって、培養30日目において、視床下部マーカーであるRxと背側マーカーであるPax6が共陽性になった（図３左）。しかしながら、網膜マーカーChx10も陽性となり（図３右）、神経網膜になっていることが判明した。 By adding the BMP4 signal, the hypothalamic marker Rx and the dorsal marker Pax6 were co-positive on the 30th day of culture (left in FIG. 3). However, the retinal marker Chx10 was also positive (right side of FIG. 3), and it was found that the retinal marker was a neural retina.
（４）培地中の成分の検討３（Shhシグナル経路作用物質の使用）
　神経網膜への分化が誘導された原因が腹側化因子の不足にあると考え、腹側化因子のShhシグナル（ShhアゴニストであるSAG）を追加することにした。具体的には、以下の条件で分化誘導を試みた。SFEBq法施行後6日目より少量の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質（具体的例では1.5～2.0 nM）と少量のSAG（具体例では0.5 μM）を含む培地にて浮遊培養した。12日目より骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質のみ濃度を漸減し、SAGの濃度は維持した。Shhシグナルを加えることで、培養30日目においてRxとPax6が共陽性かつChx10陰性の細胞凝集塊を認め、視床下部前駆細胞へと分化させることが可能になった（図４左）。視床下部前駆細胞の分化効率は80%を超えた（図４右）。 (4) Examination of ingredients in medium 3 (Use of Shh signal pathway agonist)
We thought that the cause of the differentiation into the neural retina was the lack of ventralizing factor, so we decided to add a ventralizing factor Shh signal (SAG, which is a Shh agonist). Specifically, differentiation induction was attempted under the following conditions. From the 6th day after the SFEBq method was applied, suspension culture was performed in a medium containing a small amount of a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator (specific example: 1.5 to 2.0 nM) and a small amount of SAG (specific example: 0.5 μM). From day 12, only the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator was gradually reduced in concentration and the SAG concentration was maintained. By adding a Shh signal, Rx and Pax6 co-positive and Chx10-negative cell aggregates were observed on the 30th day of culture, and it was possible to differentiate into hypothalamic progenitor cells (left of FIG. 4). The differentiation efficiency of hypothalamic progenitor cells exceeded 80% (right side of FIG. 4).
（５）背側視床下部又は腹側視床下部への選択的な分化
　背側視床下部と腹側視床下部を作り分けることを目指し、更に検討した。骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びSAGの添加濃度と添加タイミング、Akt阻害剤の添加有無と濃度及びタイミングを検討した。背側視床下部条件としては、（４）の培養条件を採用した。一方、腹側視床下部への分化を促すために、BMP4の最終濃度を1.0 nMに変更した。加えて、Akt阻害剤を最終濃度0.5μMで培養開始6日目から添加した。 (5) Selective differentiation into dorsal hypothalamus or ventral hypothalamus A further study was conducted with the aim of separately creating the dorsal hypothalamus and ventral hypothalamus. The addition concentration and timing of the osteogenic factor signal transduction pathway activator and SAG, and the presence / absence, concentration and timing of the Akt inhibitor were examined. As the dorsal hypothalamic condition, the culture condition of (4) was adopted. On the other hand, in order to promote differentiation into the ventral hypothalamus, the final concentration of BMP4 was changed to 1.0 nM. In addition, an Akt inhibitor was added at a final concentration of 0.5 μM from the 6th day after the start of culture.
　背側視床下部条件では、Rx::Venus陽性細胞の大部分がPax6陽性を示した（図５左）。背側視床下部の前駆細胞に分化したものと考えられる。一方、腹側視床下部条件では、Rx::Venus陽性細胞の大部分がNkx2.1陽性を示した（図５右）。腹側視床下部の前駆細胞に分化したものと考えられる。 In the dorsal hypothalamus condition, most of the Rx :: Venus positive cells showed Pax6 positive (left of FIG. 5). It is thought that it has differentiated into progenitor cells of the dorsal hypothalamus. On the other hand, in the ventral hypothalamus condition, most of the Rx :: Venus positive cells were Nkx2.1 positive (right in FIG. 5). Probably differentiated into progenitor cells in the ventral hypothalamus.
　以上の通り、KSR濃度、BMP4シグナルとShhシグナル（SAG）の濃度の調整、及び別の腹側化シグナルであるAkt阻害剤の少量の添加の有無により、背側視床下部と腹側視床下部を作り分けること、即ち、選択的に背側視床下部又は腹側視床下部へと分化させることに成功した。 As described above, the dorsal hypothalamus and ventral hypothalamus are created by adjusting the concentration of KSR, BMP4 signal and Shh signal (SAG), and the addition of a small amount of another abdominalization signal, Akt inhibitor. In other words, they succeeded in dividing into selective dorsal hypothalamus or ventral hypothalamus.
（６）背側視床下部誘導条件の最適化
　背側視床下部誘導条件にて浮遊培養を継続した結果、培養60日目にはOtpとBrn2の発現（一般に、OtpとBrn2陽性の視床下部は、AVPニューロンの前駆状態にあると考えられる）を確認し（図６）、培養103日目でAVP陽性細胞を少数認めた（図７）。誘導効率の向上を目指し、神経発生に有利とされる分散培養を組み入れることにした。具体的には、以下の条件で分化誘導を試みた。細胞凝集塊を分散し、Laminin, Poly-D-Lysine, Matrigelにてコーティングしたガラス板上に2×104～40×104 cells/cm2で細胞を播種し、DFNB培地にNT3、BDNF、CNTF、FBSを添加した培地にて平面培養を行った。尚、3日に1回の頻度で培地交換を行った。 (6) Optimization of dorsal hypothalamic induction conditions As a result of continuous suspension culture under dorsal hypothalamic induction conditions, Otp and Brn2 expression was observed on the 60th day of culture. A probable state of AVP neurons was confirmed (FIG. 6), and a few AVP positive cells were observed on day 103 of culture (FIG. 7). In order to improve the induction efficiency, we decided to incorporate a distributed culture that is advantageous for neurogenesis. Specifically, differentiation induction was attempted under the following conditions. Disperse the cell clumps, seed the cells at 2 × 10 4 to 40 × 10 4 cells / cm 2 on a glass plate coated with Laminin, Poly-D-Lysine, Matrigel, and add NT3, BDNF, Planar culture was performed in a medium supplemented with CNTF and FBS. The medium was changed once every three days.
　上記条件で分化誘導した結果、培養150日目でAVPニューロンの出現を確認した（図８）。当該AVPニューロンの成熟度及び機能を検証するために、培養180日目の細胞をサンプルとして以下の手順でAVPホルモンの測定及び刺激試験を行った。まず、3日間細胞培養に用いた後の培地を回収し、RIA法にて培地中のAVPホルモン測定を行った。測定の結果、誘導されたAVPニューロンが実際にAVPホルモンを分泌していることが確認された（図９左）。また、塩化カリウム（0.1% 塩化カリウムを含む等張液で30分間培養）刺激にも良好に反応した（図９右）。 As a result of differentiation induction under the above conditions, the appearance of AVP neurons was confirmed on the 150th day of culture (FIG. 8). In order to verify the maturity and function of the AVP neurons, AVP hormones were measured and stimulated by the following procedure using cells on day 180 of culture as samples. First, the medium after being used for cell culture for 3 days was collected, and AVP hormone was measured in the medium by the RIA method. As a result of the measurement, it was confirmed that the induced AVP neuron actually secreted AVP hormone (FIG. 9 left). It also responded well to stimulation with potassium chloride (cultured with an isotonic solution containing 0.1% potassium chloride for 30 minutes) (right in FIG. 9).
（７）他の視床下部ニューロンの出現
　上記条件（（６）の欄）で分化誘導し、培養150日目に以下の方法でOXTニューロン、TRHニューロン、CRHニューロン、NPYニューロン、AgRPニューロン、POMCニューロン、MCHニューロン、及びOrexinニューロンを検出した。 (7) Appearance of other hypothalamic neurons Differentiation was induced under the above conditions (column (6)), and on the 150th day of culture, OXT neurons, TRH neurons, CRH neurons, NPY neurons, AgRP neurons, POMC neurons by the following method MCH neurons and Orexin neurons were detected.
　培養150日目に免疫染色を行い、AVPニューロン以外の視床下部ニューロン（OXTニューロン、TRHニューロン、CRHニューロン、NPYニューロン、AgRPニューロン、POMCニューロン、MCHニューロン、Orexinニューロン）が出現していることが確認された（図１０）。検出結果から、各視床下部ニューロンの分化効率を比較した（図１１）。AVPニューロンを効率的に誘導できている。 On day 150 of culture, immunostaining was performed, and it was confirmed that hypothalamic neurons (OXT neurons, TRH neurons, CRH neurons, NPY neurons, AgRP neurons, POMC neurons, MCH neurons, Orexin neurons) other than AVP neurons appeared (FIG. 10). From the detection results, the differentiation efficiency of each hypothalamic neuron was compared (FIG. 11). AVP neurons can be efficiently induced.
　一方、腹側視床下部誘導条件（図１５）で培養した場合には、背側視床下部誘導条件よりも高率にMCHニューロン等の腹側視床下部ニューロンが認められた（図１２）。 On the other hand, when cultured under ventral hypothalamic induction conditions (FIG. 15), ventral hypothalamic neurons such as MCH neurons were observed at a higher rate than dorsal hypothalamic induction conditions (FIG. 12).
２．視床下部と下垂体の同時成熟
　視床下部と下垂体は、本来は機能的に不可分なものであることから、視床下部と下垂体が機能的に一体化した構造体は創薬スクリーニング等のツールとして、或いは移植材料として極めて有用である。そこで、視床下部と下垂体が機能的に一体化した構造体の構築を目指し、以下の検討を行った。Ozone Cらは、ヒトES細胞から下垂体への分化誘導方法を報告した（Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Ozone C, Suga H, Eiraku M, Kadoshima T, Yonemura S, Takata N, Oiso Y, Tsuji T, Sasai Y. Nat Commun. 2016 Jan 14;7:10351. doi: 10.1038/ncomms10351.）。この方法を再現したところ、報告されている通り、初期の視床下部前駆細胞と下垂体原基とが同時誘導された。しかしながら、視床下部組織は培養途中で分化が停止し、視床下部ホルモンを発現するニューロンにまでは到達しない。そこで、培養前半は背側視床下部誘導条件に準じた条件（但し、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質とShhシグナル経路作用物質の濃度を高く設定した。また、培養18日目の培地交換からは、骨形成因子シグナル伝達活性化物質を含まない培地を用いて半量の培地を交換することにした）とし、培養後半については、使用する培地の組成を改良し、下垂体のみならず視床下部への分化にも適するようにした。具体的には、上記ステップ（ｉｉ）に用いる培地と分散培養に用いる培地を容量比１：１で混合し、血清代替物（例えばKSR）を20%加えたものとし（図１７を参照）、浮遊培養を継続した。 2. Simultaneous maturation of the hypothalamus and the pituitary gland The hypothalamus and pituitary gland are functionally inseparable in nature, so a structure in which the hypothalamus and the pituitary gland are functionally integrated is a tool for drug discovery screening. Alternatively, it is extremely useful as a transplant material. Therefore, the following studies were conducted with the aim of constructing a structure in which the hypothalamus and the pituitary gland were functionally integrated. Ozone C et al. Reported a method of inducing differentiation from human ES cells to the pituitary gland (Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Ozone C, Suga H, Eiraku M, Kadoshima T, Yonemura S, Takata N, Oiso Y, Tsuji T, Sasai Y. Nat Commun. 2016 Jan 14; 7: 10351. Doi: 10.1038 / ncomms10351.). When this method was reproduced, as reported, early hypothalamic progenitor cells and pituitary primordia were simultaneously induced. However, hypothalamic tissue stops differentiation during culture and does not reach neurons that express hypothalamic hormones. Therefore, in the first half of the culture, conditions according to the dorsal hypothalamic induction conditions (however, the concentrations of the osteogenic factor signal transduction pathway activator and the Shh signal pathway activator were set high. Decided to replace half of the medium with a medium that does not contain a bone morphogenetic signal transduction activator), and in the latter half of the culture, the composition of the medium used was improved and not only the pituitary but also the hypothalamus Also suitable for differentiation into. Specifically, the medium used in the above step (ii) and the medium used for dispersion culture are mixed at a volume ratio of 1: 1, and a serum substitute (for example, KSR) is added at 20% (see FIG. 17). Suspension culture was continued.
　培養開始150日目で蛍光抗体法にて解析した結果、視床下部組織中にCRHニューロンが、下垂体組織中にACTHニューロンが存在することが判明した（図１３）。即ち、一つの細胞塊から視床下部と下垂体の双方を分化・成熟させることに成功した。 As a result of analysis by the fluorescent antibody method on the 150th day from the start of culture, it was found that CRH neurons were present in the hypothalamic tissue and ACTH neurons were present in the pituitary tissue (FIG. 13). In other words, both hypothalamus and pituitary were successfully differentiated and matured from a single cell mass.
３．まとめ
　以上の検討によって、背側視床下部への分化誘導条件と腹側視床下部への分化誘導条件が見出された。また、視床下部と下垂体を同時に成熟させることにより、視床下部と下垂体が機能的に一体化した構造体の構築を可能にする分化誘導条件も判明した。好適な分化誘導条件の具体例（概要）を図１４（背側視床下部）、図１５（腹側視床下部）、図１６、１７（視床下部と下垂体の同時成熟）に示す。 3. Conclusion Based on the above studies, conditions for inducing differentiation into the dorsal hypothalamus and conditions for inducing differentiation into the ventral hypothalamus were found. In addition, the differentiation induction conditions that make it possible to construct a structure in which the hypothalamus and the pituitary gland are functionally integrated by simultaneously maturing the hypothalamus and the pituitary gland were also found. Specific examples (outline) of suitable differentiation-inducing conditions are shown in FIG. 14 (dorsal hypothalamus), FIG. 15 (ventral hypothalamus), and FIGS. 16 and 17 (simultaneous maturation of hypothalamus and pituitary gland).
　ヒトES細胞を下垂体前葉に分化させることに成功したとの報告（Ozone C et al., Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2016 Jan 14;7:10351.）があるが、そこに示された条件で分化誘導して得られた細胞塊の特性を蛍光抗体法で評価したところ、視床下部ニューロン（AVPニューロン等）は検出されず（図２５）、最終分化した機能的なニューロンの出現には至っていなかった。従って、上記検討によって見出された新たな分化誘導条件は、機能的な視床下部ニューロンを含む構造体を構築できる点において、当該報告と一線を画する。 Report of successful differentiation of human ES cells into the anterior pituitary gland (Ozone C et al., Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2016 Jan 14; 7: 10351. However, when the characteristics of the cell mass obtained by inducing differentiation under the conditions shown there were evaluated by the fluorescent antibody method, hypothalamic neurons (AVP neurons, etc.) were not detected (FIG. 25). The emergence of differentiated functional neurons has not been achieved. Therefore, the new differentiation-inducing condition found by the above study is different from the report in that a structure containing functional hypothalamic neurons can be constructed.
Ｂ．ヒトiPS細胞からの分化誘導
　上記検討によって見出された分化誘導条件がヒトiPS細胞から視床下部を誘導すること、及び視床下部と下垂体の同時成熟に有効であることを確認するため、以下の検証実験を行った。 B. Induction of differentiation from human iPS cells In order to confirm that the differentiation-inducing conditions found by the above examination induce the hypothalamus from human iPS cells and are effective for simultaneous maturation of the hypothalamus and pituitary gland, A verification experiment was conducted.
１．視床下部AVPニューロンの出現
　ヒトES細胞を用いた検討によって見出された背側視床下部誘導条件（Ａ．１．（６）の欄を参照）でヒトiPS細胞（201B7株）を培養した。その結果、AVPニューロンの出現が確認された（図１８）。 1. Appearance of hypothalamic AVP neurons Human iPS cells (strain 201B7) were cultured under dorsal hypothalamic induction conditions (see section A.1. (6)) found by studies using human ES cells. As a result, the appearance of AVP neurons was confirmed (FIG. 18).
２．視床下部と下垂体の同時成熟
（１）下垂体の成熟化
　視床下部と下垂体の同時成熟に有効であった条件（Ａ．２．の欄を参照）でヒトiPS細胞（201B7株）を培養した。培養60日目には下垂体組織と視床下部組織が認められ、下垂体組織にはACTHニューロンが検出された。また、長期培養によって下垂体組織からのACTHの分泌量が増加し（図１９）、培養時間の経過に伴って下垂体組織の成熟化が進んでいることが確認された。 2. Simultaneous maturation of hypothalamus and pituitary gland (1) Maturation of pituitary gland Human iPS cells (strain 201B7) were cultured under conditions effective for simultaneous maturation of hypothalamus and pituitary gland (see column A.2). did. On day 60 of culture, pituitary and hypothalamic tissues were found, and ACTH neurons were detected in the pituitary tissues. Further, it was confirmed that the amount of ACTH secretion from the pituitary tissue increased by long-term culture (FIG. 19), and the maturation of the pituitary tissue progressed with the lapse of culture time.
（２）視床下部と下垂体の隣接による効果
　培養70日目に下垂体組織と視床下部組織を分離し、下垂体組織のみで培養を継続した場合（図２０A）と下垂体組織と視床下部組織を再度隣接させて培養した場合（図２０B）で組織の成熟化を比較評価した。培養150日目で培養液中のACTH濃度を測定したところ、下垂体組織と視床下部組織を再度隣接させて培養した場合のACTH濃度が有意に高かった（図２０右）。この結果は、二つの組織を隣接した状態で培養することがその成熟化に極めて重要であることを示唆する。 (2) Effect of adjacent hypothalamus and pituitary gland When pituitary tissue and hypothalamic tissue were separated on the 70th day of culture and culture was continued with only the pituitary tissue (FIG. 20A), pituitary tissue and hypothalamic tissue When the cells were cultured next to each other (FIG. 20B), the maturation of the tissues was compared and evaluated. When the ACTH concentration in the culture medium was measured on the 150th day of culture, the ACTH concentration was significantly higher when the pituitary tissue and the hypothalamic tissue were cultured again adjacent to each other (right side of FIG. 20). This result suggests that culturing two tissues adjacent to each other is extremely important for their maturation.
（３）下垂体組織の機能評価１
　（１）の条件で培養して得られた下垂体組織の機能を評価するため、CRHを用いたACTH刺激試験（図２１右）を行った。試験方法は既報（Ozone C et al., Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2016 Jan 14;7:10351.）の方法に準じた（CRHは5μg/mlで添加）。試験の結果、CRHに反応してACTHが分泌すること、即ち、機能的なACTHニューロンが得られていることが示された（図２１左）。尚、蛍光抗体法で解析し、ACTH陽性細胞がCRH-R1陽性であることも確認した（図２１中央）。 (3) Functional evaluation 1 of pituitary tissue
In order to evaluate the function of the pituitary tissue obtained by culturing under the condition (1), an ACTH stimulation test using CRH (right in FIG. 21) was performed. The test method was in accordance with the method already reported (Ozone C et al., Functional anterior pituitary generated in self-organizing culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2016 Jan 14; 7: 10351.). CRH is 5 μg / ml. Addition). As a result of the test, it was shown that ACTH was secreted in response to CRH, that is, functional ACTH neurons were obtained (FIG. 21 left). In addition, it analyzed by the fluorescent antibody method, and also confirmed that the ACTH positive cell was CRH-R1 positive (FIG. 21 center).
（４）下垂体組織の機能評価２
　（１）の条件で培養して得られた下垂体組織の機能を更に評価するため、デキサメサゾンを用いたACTH抑制試験（図２２右）を行った。CRH添加による刺激を行う際にデキサメサゾンを500ng/mlで添加し（試験群）、デキサメサゾンを添加しない場合（コンロール群）とACTH分泌量を比較した。試験の結果、デキサメサゾンによってACTHの分泌が抑制された（図２２左）。即ち、ステロイドによるネガティブフィードバックが生ずる機能的な下垂体組織が形成されていることが確認された。 (4) Functional evaluation of pituitary tissue 2
In order to further evaluate the function of the pituitary tissue obtained by culturing under the condition (1), an ACTH suppression test using dexamethasone (FIG. 22 right) was performed. When stimulating with CRH addition, dexamethasone was added at 500 ng / ml (test group), and when no dexamethasone was added (control group), ACTH secretion was compared. As a result of the test, the secretion of ACTH was suppressed by dexamethasone (FIG. 22 left). That is, it was confirmed that a functional pituitary tissue in which a negative feedback by steroid occurs was formed.
（５）下垂体組織の機能評価３
　（１）の条件で培養して得られた下垂体組織の機能を更に評価するため、CRH-R1阻害薬（Antalarmin、NBI2719）を用いたACTH抑制試験を行った（図２３右）。CRH添加による刺激を行う際にCRH-R1阻害薬を10-5Mで添加し（試験群）、CRH-R1阻害薬を添加しない場合（コンロール群）とACTH分泌量を比較した。試験の結果、CRH-R1阻害薬によってACTHの分泌が抑制された（図２３左と中央）。この結果は、ACTHニューロン（ACTH陽性細胞）がCRHニューロン（CRH陽性細胞）の制御を受けて機能していることを示唆する。 (5) Functional evaluation of pituitary tissue 3
In order to further evaluate the function of the pituitary tissue obtained by culturing under the conditions of (1), an ACTH suppression test using a CRH-R1 inhibitor (Antalarmin, NBI2719) was performed (FIG. 23 right). When stimulating with CRH addition, CRH-R1 inhibitor was added at 10 -5 M (test group), and when no CRH-R1 inhibitor was added (control group), ACTH secretion was compared. As a result of the test, the secretion of ACTH was suppressed by the CRH-R1 inhibitor (FIG. 23 left and center). This result suggests that ACTH neurons (ACTH positive cells) are functioning under the control of CRH neurons (CRH positive cells).
（６）視床下部と下垂体が一体化した構造体の機能評価
　同時成熟によって得られた構造体の低血糖ストレスへの反応性を評価した（図２４右）。低グルコース刺激によるACTH分泌量の変化を調べた結果、低グルコース刺激に反応してACTH分泌量が増大し（図２４左）、この反応性はCHRH-R1阻害薬によって減弱した（図２４中央）。これらの結果は、同時成熟によって得られた構造体に含まれるACTHニューロン（ACTH陽性細胞）が視床下部の制御を受けて機能していることを示唆するとともに、視床下部と下垂体が機能的に一体化した構造体が形成されていることを裏づける。 (6) Functional evaluation of a structure in which the hypothalamus and the pituitary gland are integrated The reactivity of the structure obtained by simultaneous maturation to hypoglycemic stress was evaluated (right in FIG. 24). As a result of examining changes in the amount of ACTH secreted by low glucose stimulation, ACTH secretion increased in response to low glucose stimulation (FIG. 24 left), and this reactivity was attenuated by a CHRH-R1 inhibitor (middle of FIG. 24). . These results suggest that ACTH neurons (ACTH positive cells) contained in the structure obtained by simultaneous maturation function under the control of the hypothalamus, and that the hypothalamus and pituitary gland are functional. This confirms that an integrated structure is formed.
　本発明によれば、ヒト多能性幹細胞から視床下部組織を効率的に誘導することができる。本発明の方法で構築された細胞構造体は、例えば、視床下部の障害を標的とした創薬スクリーニング用のツールとして有用である。また、視床下部の障害に対する治療手段（移植材料）としての利用も期待される。一方、本発明は、視床下部組織と下垂体組織が機能的に一体化した細胞構造体をインビトロで構築することも可能にする。当該細胞構造体は視床下部及び／又は下垂体を標的とした創薬スクリーニング等に極めて有効なツールであり、また、移植材料としての適用も期待できる。 According to the present invention, hypothalamic tissue can be efficiently induced from human pluripotent stem cells. The cell structure constructed by the method of the present invention is useful, for example, as a drug discovery screening tool targeting hypothalamic disorders. It is also expected to be used as a therapeutic means (transplant material) for hypothalamic disorders. On the other hand, the present invention makes it possible to construct a cell structure in which hypothalamic tissue and pituitary tissue are functionally integrated in vitro. The cell structure is an extremely effective tool for drug discovery screening targeting the hypothalamus and / or pituitary gland, and can be expected to be applied as a transplant material.
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。 The present invention is not limited to the description of the embodiments and examples of the above invention. Various modifications may be included in the present invention as long as those skilled in the art can easily conceive without departing from the description of the scope of claims. The contents of papers, published patent gazettes, patent gazettes, and the like specified in this specification are incorporated by reference in their entirety.

Claims (20)

  1. 　以下のステップ（１）及び（２）を含む、視床下部組織を含む細胞構造体の製造方法：
    　（１）ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ、
    　（２）ステップ（１）で得られた細胞凝集塊を、低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ。     A method for producing a cellular structure containing hypothalamic tissue, comprising the following steps (1) and (2):
    (1) Suspension culture of aggregates of human pluripotent stem cells in a medium containing a low concentration of an osteogenic factor signaling pathway activator and a low concentration of an Shh signaling pathway activator;
    (2) A step of further subjecting the cell aggregate obtained in step (1) to suspension culture in a medium containing a low-concentration Shh signal pathway agent.
  2. 　ステップ（２）を高酸素分圧条件下で行う、請求項１に記載の製造方法。 The manufacturing method according to claim 1, wherein step (2) is performed under a high oxygen partial pressure condition.
  3. 　以下のステップ（３）を更に含む、請求項１又は２に記載の製造方法：
    　（３）ステップ（２）で得られた細胞凝集塊を回収し、細胞凝集塊を構成する細胞を分散培養するステップ。     The production method according to claim 1 or 2, further comprising the following step (3):
    (3) A step of recovering the cell aggregate obtained in step (2) and dispersing and culturing the cells constituting the cell aggregate.
  4. 　ステップ（３）を高酸素分圧条件下で行う、請求項３に記載の製造方法。 The manufacturing method according to claim 3, wherein step (3) is performed under a high oxygen partial pressure condition.
  5. 　ステップ（１）における前記骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4であり、培地中のその濃度が0.1 nM～5.0 nMであり、
    　ステップ（１）及び（２）における前記Shhシグナル経路作用物質がSAGであり、培地中のその濃度が0.1μM～2.0μMであり、
    　前記ステップ（１）及び（２）によって背側視床下部組織への分化が誘導される、
    　請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。     The osteogenic factor signaling pathway activator in step (1) is BMP4, and its concentration in the medium is 0.1 nM to 5.0 nM;
    The Shh signaling pathway agent in steps (1) and (2) is SAG, and its concentration in the medium is 0.1 μM to 2.0 μM;
    Differentiation into dorsal hypothalamic tissue is induced by steps (1) and (2),
    The production method according to any one of claims 1 to 4.
  6. 　前記背側視床下部組織はバゾプレシンニューロン、オキシトシンニューロン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンニューロン、コルチコトロピン放出ホルモンニューロン及びニューロペプチドYニューロンからなる群より選択される一以上のニューロンを含む、請求項５に記載の製造方法。 6. The production of claim 5, wherein the dorsal hypothalamic tissue comprises one or more neurons selected from the group consisting of vasopressin neurons, oxytocin neurons, thyroid stimulating hormone releasing hormone neurons, corticotropin releasing hormone neurons and neuropeptide Y neurons. Method.
  7. 　ステップ（１）における前記骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4であり、培地中のその濃度が0.1 nM～3.0 nMであり、
    　ステップ（１）及び（２）における前記Shhシグナル経路作用物質がSAGであり、培地中のその濃度が0.1μM～2.0μMであり、
    　前記培地がAkt阻害剤を更に含み、
    　前記ステップ（１）及び（２）によって腹側視床下部組織への分化が誘導される、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。     The osteogenic factor signaling pathway activator in step (1) is BMP4, and its concentration in the medium is 0.1 nM to 3.0 nM;
    The Shh signaling pathway agent in steps (1) and (2) is SAG, and its concentration in the medium is 0.1 μM to 2.0 μM;
    The medium further comprises an Akt inhibitor;
    The production method according to any one of claims 1 to 4, wherein differentiation into a ventral hypothalamic tissue is induced by the steps (1) and (2).
  8. 　前記腹側視床下部組織はアグーチ関連タンパク質ニューロン、プロオピオメラノコルチンニューロン、メラニン凝集ホルモンニューロン及びOrexinニューロンからなる群より選択される一以上のニューロンを含む、請求項７に記載の製造方法。 The production method according to claim 7, wherein the ventral hypothalamic tissue includes one or more neurons selected from the group consisting of agouti-related protein neurons, proopiomelanocortin neurons, melanin-concentrating hormone neurons, and Orexin neurons.
  9. 　前記浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 1 to 8, wherein the suspension culture is performed in the absence of feeder cells.
  10. 　ステップ（１）における前記凝集塊が、分散させたヒト多能性幹細胞の浮遊培養によって形成される、請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 1 to 9, wherein the aggregate in step (1) is formed by suspension culture of dispersed human pluripotent stem cells.
  11. 　前記浮遊培養を無血清凝集浮遊培養法で行う、請求項１０に記載の製造方法。 The production method according to claim 10, wherein the suspension culture is performed by a serum-free agglutination suspension culture method.
  12. 　以下のステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、視床下部組織と下垂体組織を含む細胞構造体の製造方法：
    　（ｉ）ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ、
    　（ｉｉ）ステップ（ｉ）で形成された細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ、
    　（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られた細胞凝集塊を、下垂体及び視床下部の同時誘導に適した培地中で浮遊培養するステップ     A method for producing a cell structure comprising hypothalamic tissue and pituitary tissue, comprising the following steps (i) to (iii):
    (I) a suspension culture of aggregates of human pluripotent stem cells in a medium containing an osteogenic factor signal transduction pathway activator and a Shh signal pathway activator;
    (Ii) further suspension-culturing the cell aggregate formed in step (i) in a medium containing a bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator and a Shh signal pathway activator;
    (Iii) A step of culturing the cell aggregate obtained in step (ii) in suspension in a medium suitable for simultaneous induction of the pituitary gland and the hypothalamus
  13. 　ステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を高酸素分圧条件下で行う、請求項１２に記載の製造方法。 The production method according to claim 12, wherein steps (ii) and (iii) are performed under high oxygen partial pressure conditions.
  14. 　ステップ（ｉｉ）とステップ（ｉｉｉ）の間に以下のステップ（ａ）を行い、ステップ（ｉｉｉ）ではステップ（ａ）で得られた細胞凝集塊を浮遊培養する、請求項１２又は１３に記載の製造方法：
    　（ａ）ステップ（ｉｉ）で得られた細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ。     The following step (a) is performed between step (ii) and step (iii), and the cell aggregate obtained in step (a) is suspended and cultured in step (iii). Production method:
    (A) A step of further subjecting the cell aggregate obtained in step (ii) to suspension culture in a medium containing an Shh signal pathway agent.
  15. 　ステップ（ａ）を高酸素分圧条件下で行う、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 12 to 14, wherein step (a) is performed under high oxygen partial pressure conditions.
  16. 　前記浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 12 to 15, wherein the suspension culture is performed in the absence of feeder cells.
  17. 　ステップ（ｉ）における前記凝集塊が、分散させたヒト多能性幹細胞の浮遊培養によって形成される、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 12 to 16, wherein the aggregate in step (i) is formed by suspension culture of dispersed human pluripotent stem cells.
  18. 　骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4である、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 12 to 17, wherein the bone morphogenetic factor signal transduction pathway activator is BMP4.
  19. 　Shhシグナル経路作用物質がSAGである、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の製造方法。 The production method according to any one of claims 12 to 18, wherein the substance acting on the Shh signal pathway is SAG.
  20. 　請求項１～１９のいずれか一項に記載の製造方法で得られる細胞構造体。 A cell structure obtained by the production method according to any one of claims 1 to 19.
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