WO2017103857A1 - Péptido quimérico modulador de una enzima presente en las balsas lipídicas de la membrana celular - Google Patents

Péptido quimérico modulador de una enzima presente en las balsas lipídicas de la membrana celular Download PDF

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WO2017103857A1
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Jean Paul VERNOT HERNANDEZ
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Universidad Nacional De Colombia
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses

Definitions

  • This invention is framed in the use of chimeric peptides using transduction domains protein or DTP (a carrier sequence) coupled to short functional peptide sequences (sequences cargo) forming a chimeric peptide with both functions, that is, with the ability to modulate enzymatic activities, in sub-cellular compartments defined. More specifically, this invention is a chimeric peptide that modulates the enzymatic activity of protein tyrosine kinase (PTK) specific for T lymphocytes, called p56Lck (or Lck) and which is present in the microdomains of the plasma membrane called lipid rafts.
  • PTK protein tyrosine kinase
  • the components and pharmaceutical compositions containing these compounds could be used in the treatment of those cancers, in which the deregulated molecules involve genes (like Lck) or oncogenes such as Ras (short for Rat Sarcoma) found in lipid rafts and that are responsible for tumor growth, resistance to conventional drugs and relapses of patients.
  • genes like Lck
  • oncogenes such as Ras (short for Rat Sarcoma) found in lipid rafts and that are responsible for tumor growth, resistance to conventional drugs and relapses of patients.
  • DTP Protein transduction domains
  • CPP Cell-permeable peptides
  • DTP Protein transduction domains
  • CPP Cell-permeable peptides
  • DTP Protein transduction domains
  • CPP Cell-permeable peptides
  • DTP have allowed the internalization of sequences functional to the cytoplasm of cells, but are not capable of carrying cargo molecules to the membrane plasma, and even less to lipid rafts, subcompartments of the cell membrane that have a composition and dynamics different from the rest of the membrane (Edidin M, 2003).
  • these rafts lipids function as a signaling platform cell that allows communication between cells (intercellular) or cellular stimulation (communication intracellular) by growth factors, cytokines or other proteins (Magee T et al., 2002; Michel V and Bakovic M, 2007).
  • Compounds that have the ability to dissociate lipid rafts prevent intercellular communication and intracellular signaling (Onodera R et al., 2013), showing the relevance of these signaling platforms.
  • lipid rafts are also a molecular platform for cell stimulation by oncogenes (tumor-inducing genes) and other cellular proteins responsible for growth tumor.
  • oncogenes tumor-inducing genes
  • these proteins are not an integral component of the plasma membrane, but they are post-translationally modified (i.e. after protein synthesis) with the addition of hydrophobic groups that facilitate their interaction with the inner bilayer of the plasma membrane.
  • Lck and others members of the Src family of tyrosine proteins kinase are palmitoylated and must also be myristoylated to adhere to membranes (Alland L, 1994; Resh MD, 1994; Schroeder H 1997).
  • a farnesyl group is added by the enzyme farnesyl transferase and in addition, either a palmitoylation, addition of a palmitate group by acylation, or the addition of an amino acid segment basic (Magee T, 1999).
  • These modifications are highly hydrophobic and allow their strong bond to the plasma membrane.
  • they are investigating various strategies to interfere with localization in the lipid rafts of these molecules of signaling (Lck or Ras) as a tool for slow down cell signaling, in other words like inhibitors of these signaling pathways and therefore of tumor growth.
  • Imatinib compound ABL1 protein kinase inhibitor
  • CML myeloid leukemia chronic
  • ALL-B acute B-cell lymphoid leukemia
  • ALL-type T, ALL-T ALL-type T, ALL-T
  • BCR-ABL1 + expressing the ABL1 protein kinase
  • Ras is a monomeric G protein (binds guanine nucleotides) which is activated by binding to GTP. Ras has activity intrinsic of GTPase, that is, it can hydrolyze the GTP to GDP, returning Ras to its basal state of activation. In cases where cancer is conducted by an active Ras, the mutations that occur in this protein cause GTPase activity to be lost making Ras permanently active, generating signals of cell growth and progression tumor.
  • Lck inhibitors that have been found are unspecific on the one hand, and not effective Ras inhibitors have been found, for another, it is necessary to develop strategies novel for the modulation of molecules that are found in lipid rafts. For this is It is important to know various aspects of the biology of lipid rafts and signaling mechanisms in these membrane microdomains in cells of the system immune (lymphocytes).
  • lipid rafts Van Laethem F and Leo O, 2002. These regions are rich in glycolipids and cholesterol, but also insoluble in detergents, characteristic that is used for its isolation. They contain many signaling proteins, as the protein tyrosine kinase of the Src family (including Src, Lck, Fyn Lyn), adapter proteins and Monomeric G proteins, just to name a few examples (Pizzo P and Viola A, 2003). These proteins like noted above are modified after their synthesis to be inserted into the internal face of the bilayer lipid.
  • lipid rafts function as platforms for the formation of signal transduction complexes (Magee T et al., 2002).
  • TCR or BCR T or B cell receptor
  • several of the components signaling are associated with these lipid rafts, allowing signal amplification and generation finely regulated signals with a high degree of specificity (Horejs ⁇ V, 2003; He HT and Marguet D, 2008).
  • lymphotropic viruses such as the virus human immunodeficiency (HIV), Epstein Barr virus (EBV) or Herpesvirus saimiri (HVS), to escape from immune control and maintaining latency (Isakov and Biesinger, 2000; Cho et al, 2004; Morio et al, 1997; Swart et al, 2000).
  • HVS is a ⁇ -lymphotropic herpesvirus that is not pathogenic in its natural host Saimiri sciureus, but in some New World primate species induces lymphomas of fulminant T cells (Meléndez et al, 1971).
  • the HVS infection has been used in vitro in humans and non-human primates (Aotus spp.) as a strategy for T cell transformation and understanding of this process and also, for studies of the mechanisms cellular and molecular immune response (Biesinger et al, 1992; Meinl et al, 1995; Vernot et al, 2005). This further suggests that the mechanisms of malignant transformation in humans and T cells of Aotus could have the same molecular basis.
  • the Lck-binding domains of the Tip protein are found in the carboxy-terminal portion of the molecule, and comprise two binding regions independent, SH3B (binding to Lck's SH3 motif) and CSKH (from the English, C-terminal Src-kinase homology, binding to the catalytic region of Lck). They are within a highly conserved region between amino acids 146 to 182 (Jung et al, 1995b; Lund et al, 1999; Hartley et al., 2000; de Heck et al 2006). Interestingly, Tip's mutants, which contain only one of the SH3B or CSKH domains bind to Lck (Hartley et al. 2000).
  • a truncated form of Tip protein without the SH3B domain is capable of inducing lymphomas in vivo (Duboise et al. 1998b) and also the co-expression of Lck with a Tip mutant lacking the SH3B domain stimulated tyrosine phosphorylation of proteins cellular (Hartley et al. 2000). This suggests a role adequate and sufficient of the CSKH domain for binding to Lck, T cell signaling and proliferation.
  • Tip protein is also present in the rafts lipids (Park et al, 2003, Cho et al. 2006), as explained earlier, a signaling platform for the T cell activation (Bromley et al. 2001 Kabouridis et al 2006), where early signals are induced allowing the expression of the specific gene and subsequently proliferation (Merlo and Tsygankov 2001. Kjellen et al, 2002; Filipp et al 2012). Recently, it was shown that the hydrophobic sequence (hTip) of Tip is responsible for its location on the rafts lipid.
  • the present invention provides a new peptide chimeric, with the amino acid sequence SEQ ID NO: 1 presented in the list of sequences and salts pharmacologically acceptable or derived therefrom.
  • This new synthetic peptide has a region hydrophobic (hTip) and other amphipathic with residues charged and some other hydrophobic.
  • This peptide with a length of 35 amino acids called hTip-CSKH, is inserted into the plasma membrane in the so-called lipid rafts or lipid rafts and modulates the activity of the protein tyrosine kinase called Lck, to induce its activation and proliferation of cells of the immune system (lymphocytes) or suppress the T-cell leukemias.
  • the peptide is specific for the Lck modulation as it uses a binding domain specific to Lck and not to other proteins of the family Src protein tyrosine kinase (Fyn, Lyn).
  • the present invention provides the use of the chimeric peptide hTip-CSKH in the manufacture of a drug or pharmaceutical composition with antineoplastic activity.
  • the present invention provides the use of the chimeric peptide hTip-CSKH in the manufacture of a drug or pharmaceutical composition with ability to modulate the enzymatic activity of Lck protein found in rafts lipid levels of plasma membranes.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition, comprising the peptide of the present invention as active principle of an antineoplastic drug, along with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention also provides a tool that can be used for the delivery of specific cargo sequences of oncoproteins responsible for malignant growth to specific membrane subcompartments.
  • the present invention also provides a tool that can be used for the activation of lymphocytes that are in the anergic (non-responder).
  • the chimeric synthetic peptide hTip-CSKH from the present invention consists of 35 amino acids SEQ ID NO: 1 from sequence listing. The existence of This synthetic peptide has not been reported in the literature. It is first made up of a sequence of 19 amino acids (SEQ ID NO: 2), belonging to the region Hydrophobic (hTip) of Herpesvirus Tip Protein saimir ⁇ . This 256 amino acid Tip protein has ability alone to transform T lymphocytes, this it is to induce them to proliferate without exogenous stimulation. Second, by the sequence SEQ ID NO: 3, of one of the two domains with which the Tip protein binds to the T lymphocyte protein tyrosine kinase Lck for induce transformation.
  • SEQ ID NO: 4 also from Tip that presents some charged amino acids (D, R and K) that allow to increase the amphipathic character of the cargo sequence.
  • D, R and K charged amino acids
  • P prolines
  • the protein HVS tip that induces T-cell lymphomas by itself alone, due to its binding and activation capacity specific protein tyrosine kinase Lck.
  • SH3B and CSKH the most studied has been SH3B, although both domains can be joined independently to Lck.
  • the CSKH domain was chosen taking into account that Tip proteins modified by genetic engineering, without the SH3B domain, are capable of induce T cell transformation, suggesting that the CSKH domain is sufficient for binding to Lck, the T cell signaling and proliferation.
  • hTip Tip's hydrophobic sequence
  • CMSP of human and Aotus were stimulated at different hTip-CSKH concentrations (0-80 uM) and determined cell proliferation by incorporation of [3H
  • Electrophoretic identification of hTip-CSKH and control peptides in one system Tris-Tricine with erythrocyte membranes. 10 ug of the indicated peptides were mixed with 10 ul of a erythrocyte membrane protein extract. The gel was stained with Coomasie blue. It is indicated to the right the size of the weight markers molecular (MWM). Arrow indicates band corresponding to hTip-CSKH.
  • Electrophoretic identification of hTip-CSKH in DRM fractions of membranes of lymphocytes in a Tris-Tricine system The extract membrane cells of PBMC stimulated with hTip-CSKH were separated by ultracentrifugation on a gradient of sucrose density. 8 fractions were recovered as indicated on each line. Half of each fraction was used for identification hTip-CSKH electrophoresis (Tris-Tricine system). The arrow indicates the band corresponding to your weight molecular. The remaining amount of the fraction is used in a WB in order to know its content Flotillin 2 (bottom). The size of each marker molecular weight (MWM) is indicated on the left.
  • MLM marker molecular weight
  • PBMCs were stimulated for 2 h with peptides or different indicated treatments.
  • hTip-CSKH induced an increase (2.5 times) in ERK2 phosphorylation.
  • the analysis is performed by WB with monoclonal antibodies anti-pERK1 / 2; the membrane were retested, after washing, with anti ERK1 / 2 for the band normalization in each treatment as shown shown on the graph.
  • DMSO Dimethylsulfoxide
  • PHA + PMA phytohemagglutinin + phorbol myristate acetate.
  • the selected peptides were synthesized chemically using the multiple synthesis technique in solid phase (t-boc) as previously described (Houghten, 1985).
  • the DTP used here and named hTip corresponds to the sequence SEQ ID NO: 2 of Tip; the cargo sequence SEQ ID NO: 3 corresponds to the domain of junction of Tip named CSKH and extension sequence SEQ ID NO: 4 is contiguous with CSKH.
  • the chimeric sequence SEQ ID NO: 1 includes these three sequences.
  • a chimeric sequence "Scrambled” this is with the cargo sequence but with the amino acids in disorder, to show specificity the effect of the ordered sequence; this was called hTip-CSKHsc.
  • the peptides were purified by HPLC and characterized by mass spectrophotometry MALDI-TOF. The peptides used had a purity ⁇ 90%.
  • the hTip-CSKH peptide was labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) to determine its interaction and fluorescence pattern in lymphocytes T. Briefly, 5 ml of a 0.0125 mM solution of the hTip-CSKH peptide was incubated for 24 h in a solution 0.1 M carbonate-bicarbonate buffer with 250 ul of a 2.5 mM FITC solution in DMSO. Dialysis was performed for 48 h against 0.1 M ammonium chloride in 1% DMSO (membrane with a 3.5 kDa exclusion limit).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • telomeres were harvested in fiberglass membranes and radiation was measured in a Beckman LS 6500 liquid scintillation counter.
  • Jurkat T leukemia cell line (5 x 104 cells), treated or not with the peptides, were stimulated with 2 ug / ml ionomycin or 2 mg / ml PHA-P and processed as described above for cells normal to determine their proliferation.
  • the index of proliferation was defined as the ratio of the mean [methyl-3H] -thymidine (cpm) incorporated in presence of the peptide over that incorporated in the absence of peptide X100.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Immunodetection is performed with monoclonal anti-Lck antibodies (Clone MOL171), anti-phosphotyrosine (Clone PY20).
  • human PBMC were stimulated with PHA-P or hTip-CSKH and prepared cell extracts as described above.
  • the proteins were then transferred to PVDF membranes and immunodetection was performed with antibodies monoclonal anti-Fyn (AHO0482, Invitrogen), anti- ⁇ -actin (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology).
  • the PVDF membranes and gels stained with blue Coomassie were scanned and analyzed by densitometry with GeneTool software (Syngene, Synoptics Ltda, Frederick, MD, USA). For data analysis, Bands of p56Fyn and p59Fyn were normalized with the band of ⁇ -actin.
  • Human PBMC were stimulated for 2 h with the different peptides or with PHA-PMA as described above.
  • Cell extracts are prepared as described above and tested by WB with anti-p-ERK1 / 2 (sc-7383, Santa Cruz Biotechnology), anti-ERK1 / 2 (sc-7383, Santa Cruz Biotechnology). Erk phosphorylation was normalized with ERK1 / 2 total.
  • sucrose density gradients extracts of cells were mixed with 250 ul of 80% sucrose in TNE buffer (25 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA), and covered with 730 ul of 35% sucrose and 320 ul 5% of sucrose, and centrifuged at 200,000 g for 5 h, 4 ° C (Beckman Optima, TLS-55 rotor). Eight fractions of equal volume recovered from the top of the gradient, they were diluted with 1 ml of TNE and the membranes resistant to detergents in each fraction were obtained by ultracentrifugation at 100,000g for 45 min, 4 ° C.
  • the sediments were extracted in 20 ul of solution Laemmli buffer: Half was used for WB and detection of Flotillin-2 and the other half for SDS-PAGE in Tris-Tricine buffer for the identification of peptides as described (Judd, 1994). To facilitate the identification of peptides in this system, it is erythrocyte membranes were prepared in parallel and incubated with the different peptides used. The peptides were identified by separating the sample on SDS-PAGE in Tris-Tricine.
  • the PBMC were incubated for 24 h in the absence or presence of 60 uM hTip-CSKH, they were washed with PBS, and resuspended in a 0.5% BSA-PBS solution and incubated further for 20 min at temperature environment with the respective monoclonal antibody.
  • the anti-CD3 antibody (clone UCTH1) was purchased from Sigma (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA); anti-CD25 conjugated with PE (clone M-A251) and anti-TCR ⁇ / ⁇ FITC-conjugated antibodies were purchased from Pharmingen (San Diego, CA, USA). All Incubations with fluorochrome-labeled antibodies are performed in the dark.
  • the cells are then washed with 2 ml of PBS and centrifuged. After a final wash, cells were suspended in 0.5 ml of PBS and read immediately on a flow cytometer FACScan (Beckton Dickinson, BD Biosciences, San Jose, CA, USA).
  • Example 2 hTip-CSKH induces proliferation of T cells independent of signal 2
  • T cells of the Jurkat leukemic line activation of TCR causes inhibition of the cell proliferation, suggesting that these leukemic cells have different requirements for activation to normal cells (Boonen et al, 1999).
  • Jurkat cells do not respond to stimulation with the PHA-P mitogen, but they respond properly to an influx of calcium.
  • Figure 4A shows that Jurkat cells have a rate of proliferation two to three times greater in the presence ionomycin than unstimulated cells. What previously reported, Jurkat cells stimulated with PHA-P showed a slight reduction in the rate of cell proliferation ( Figure 4A, central column). In the same way, the treatment with hTip-CSKH from Jurkat cells also induced a slight decrease in proliferation, similar to what was seen before with PHA-P.
  • Example 4 hTip-CSKH is located in fractions of detergent resistant plasma membranes (DRM)
  • Example 5 The hTIP-CSKH peptide associates with the cell surface
  • Example 6 The enzyme Lck is a target of the peptide hTIP-CSKH, inducing its rapid activation
  • Heavy lipid rafts are part of a TCR signaling platform involved in the coordination of the initial events of T cell signaling, namely activation protein tyrosine kinase, intracellular as Lck (Otáhal et al, 2010).
  • Lck activation protein tyrosine kinase
  • Monoclonal antibodies were used directed against Lck and phosphotyrosine residues to assess Lck phosphorylation and activation in short time.
  • cells stimulated with PHA-P They prepared cell extracts after 0, 15, 30 and 60 min of stimulation; and detection was performed by WB simultaneously for Lck and the residuals of phosphotyrosine.
  • Example 7 The enzyme Fyn is not a target of the peptide hTIP-CSKH
  • hTip-CSKH induces a different effect on Fyn when comparing with PHA-P stimulation, again suggesting a specificity towards Lck.
  • the observed increase in the Lck band of 59 kDa ( Figure 8) is not due to an increase in the band of Fyn, since, on the contrary, hTip-CSKH induces a reduction in the 59 kDa band of Fyn.
  • hTip-CSKH produced a 2.5-fold increase in phosphorylation from ERK; the other peptides tested did not show no relevant effect; only hTip induced an increase 1.5 times, but this was not enough to induce T cell proliferation, as shown showed previously.
  • hTip-CSKH induced Intracellular "downstream" signaling from Lck.
  • NUP214-ABL1-mediated cell proliferation in T-cell acute lymphoblastic leukemia is dependent on the LCK kinase and various interacting proteins. Haematologica. 2014; 99: 85–93.
  • Duboise SM, Guo J, Czajak S, Desrosiers RC, Jung JU: STP and Tip are essential for herpesvirus saimiri oncogenicity. J Virol. 1998a; 72: 1308-13.
  • Duboise SM Lee H, Guo J, Choi JK, Czajak S, Simon M, Desrosiers RC, Jung JU. 1998b. Mutation of the Lck-binding motif of Tip enhances lymphoid cell activation by herpesvirus saimiri. J. Virol. 1998b; 72: 2607-14.
  • Lck protein tyrosine kinase is a key regulator of T-cell activation and target for signal intervention by Herpesvirus saimiri and other viral gene products. Eur. J. Biochem. 2000; 267: 3413-21.
  • Herpesvirus saimiri Tip484 and Tip488 proteins both stimulate Lck tyrosine protein kinase activity in vivo and in vitro. Virology. 2002; 297: 281-8.
  • HIV glycoprotein gp120 inhibits TCR-CD3-mediated activation of fyn and lck. Int. Immunol. 1997; 9: 53-64.
  • Onodera R Motoyama K, Okamatsu A, Higashi T, Kariya R, Okada S, Arima H. Involvement of cholesterol depletion from lipid rafts in apoptosis induced by methyl- ⁇ -cyclodextrin. Int J Pharm. 2013; 452: 116-23.
  • Herpesvirus saimiri Tip gene causes T-cell lymphoma in transgenic mice. DNA Cell. Biol. 2001; 20: 81-88.

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Abstract

La presente invención provee un nuevo péptido quimérico sintético de 35 aminoácidos denominado hTip-CSKH que tiene una región hidrofóbica (hTip), una región de unión a Lck (CSKH) y una región anfipática corta con aminoácidos cargados e hidrofóbicos. El péptido quimérico se inserta en la membrana plasmática específicamente en las denominadas balsas lipídicas (en inglés, lipid rafts) donde modula la actividad de la proteína tirosina quinasa denominada Lck, para inducir su activación y la proliferación de células del sistema inmunitario (linfocitos) normales o inhibir el crecimiento de las leucemias de células T. El péptido es específico para la modulación de Lck ya que utiliza un dominio de unión específica a Lck y no a otras proteínas de la familia Src de proteínas tirosina quinasa como Fyn o Lyn. Además, la secuencia hidrofóbica utilizada (hTip) puede utilizarse como vehículo para la inhibición de otras proteínas presentes en las balsas lipídicas.

Description

PÉPTIDO QUIMÉRICO MODULADOR DE UNA ENZIMA PRESENTE EN LAS BALSAS LIPÍDICAS DE LA MEMBRANA CELULAR
Esta invención se enmarca en el uso de péptidos quiméricos utilizando dominios de transducción proteica o DTP (una secuencia transportadora) acoplados a secuencias peptídicas funcionales cortas (secuencias cargo) formando un péptido quimérico con ambas funciones, es decir, con capacidad de modular actividades enzimáticas, en compartimentos sub-celulares definidos. Más específicamente, esta invención es un péptido quimérico que modula la actividad enzimática de la proteína tirosina quinasa (PTK) específica de linfocitos T, denominada p56Lck (o Lck) y que está presente en los microdominios de la membrana plasmática llamados “balsas” lipídicas (en inglés, lipid rafts). Los desarrollos que se han realizado para modular enzimas presentes en las balsas lipídicas han sido infructuosos en la clínica (Kostantinopoulos PA, 2007). Este péptido quimérico modula la actividad enzimática de Lck, presente en las balsas lipídicas y modifica la proliferación celular de linfocitos T. La actividad enzimática de Lck se requiere necesariamente para el crecimiento y sobrevida de varios tipos de células leucémicas (Accordi B y col., 2010; Lee KC y col., 2010; Talab F y col., 2013; De Keersmaecker K y col., 2014).
Los componentes y composiciones farmacéuticas que tengan estos compuestos, podrían ser usados en el tratamiento de aquellos cánceres, en los cuales las moléculas desreguladas involucran genes (como Lck) u oncogenes como Ras (abreviatura del inglés de Rat Sarcoma) que se encuentran en las balsas lipídicas y que son responsables del crecimiento tumoral, de la resistencia a los fármacos convencionales y de las recaídas de los pacientes.
El interés de la investigación actual se centra en la identificación de nuevos blancos moleculares específicos que eventualmente puedan utilizarse con un enfoque más personalizado de acuerdo con las necesidades de cada paciente (Accordi B y col., 2010). Se espera además, que estas nuevas aproximaciones permitan mejorar la eficacia de la terapia molecular y reducir su toxicidad. El conocimiento de la desregulación de las vías de señalización celular en el cáncer, responsables del incremento de la supervivencia y de la proliferación de células, y su falta de respuesta a las señales de diferenciación o de muerte celular, constituyen la base para el entendimiento del desarrollo y progresión tumoral y el establecimiento de nuevas estrategias terapéuticas.
Los dominios de transducción proteica (DTP) o péptidos permeables a las células (PPC) se definen como secuencias de aminoácidos de un tamaño considerable (mayores de 600 Da), que en general pueden atravesar las membranas celulares. En general se han utilizado, mediante la síntesis química de péptidos quiméricos, para introducir en las células otras secuencias o moléculas (secuencias o motivos cargo) permitiendo la regulación (estimulación o inhibición) de funciones específicas intracelulares (Dietz GP, 2010). Estos DTP han permitido la internalización de secuencias funcionales al citoplasma de las células, pero no son capaces de llevar moléculas cargo a la membrana plasmática, y menos aún a las balsas lipídicas, subcompartimentos de la membrana celular que tienen una composición y dinámica diferente al resto de la membrana (Edidin M, 2003). En condiciones normales, estas balsas lipídicas funcionan como una plataforma de señalización celular que permite la comunicación entre células (intercelular) o la estimulación celular (comunicación intracelular) por factores de crecimiento, citoquinas u otras proteínas (Magee T y col., 2002; Michel V y Bakovic M, 2007). Los compuestos que tienen la capacidad de disociar las balsas lipídicas (como las cilodextrinas) impiden la comunicación intercelular y señalización intracelular (Onodera R y col., 2013), mostrando la relevancia de estas plataformas de señalización.
Sin embargo, las balsas lipídicas son también una plataforma molecular para la estimulación celular por parte de oncogenes (genes que inducen tumores) y otras proteínas celulares responsables del crecimiento tumoral. Para el caso que nos concierne, estas proteínas no son un componente integral de la membrana plasmática, pero son modificadas post-traduccionalmente (es decir, después de la síntesis proteica) con la adición de grupos hidrofóbicos que facilitan su interacción con la bicapa interna de la membrana plasmática. Lck y otros miembros de la familia Src de proteínas tirosina quinasa, son palmitoiladas y deben ser también miristoiladas para adherirse a las membranas (Alland L, 1994; Resh MD, 1994; Schroeder H 1997). Al oncogen Ras se le adiciona un grupo farnesilo por la enzima farnesil-transferasa y además, puede ocurrir o bien una palmitoilación, adición de un grupo palmitato por acilación, o la adición de un segmento de aminoácidos básicos (Magee T, 1999). Estas modificaciones son altamente hidrofóbicas y permiten su fuerte unión a la membrana plasmática. En la actualidad se investigan diversas estrategias para interferir con la localización en las balsas lipídicas de estas moléculas de señalización (Lck o Ras) como una herramienta para frenar la señalización celular, en otras palabras como inhibidores de estas vías de señalización y por lo tanto del crecimiento tumoral.
El desarrollo del compuesto Imatinib, inhibidor de la proteína quinasa ABL1, constituye un ejemplo relativamente exitoso de la terapia molecular dirigida a blancos específicos (Druker BJ, 2008). Esto ha revolucionado el tratamiento de la leucemia mieloide crónica (LMC), la leucemia linfoide aguda de células B (LLA-B) y otros tumores (LLA-tipo T, LLA-T) que expresan la proteína quinasa ABL1 (BCR-ABL1+). Sin embargo, se ha encontrado que algunos pacientes pueden desarrollar resistencia al Imatinib, debido a la existencia de múltiples copias del gen BCR-ABL1+ (Mahon FX y col., 2000) o a la aparición de mutaciones puntuales adicionales (O’Hare T, y col. 2007). De manera interesante, se encontró que líneas celulares humanas y murinas, positivas para el gen NUP214-ABL1 y resistentes al Imatinib, eran sensibles a un inhibidor de Lck (De Keersmaecker K y col., 2014). Además, se ha encontrado que ratones transgénicos que sobreexpresan Lck de tipo silvestre (secuencia normal) o Lck activa constitutivamente (mutada) desarrollan tumores del timo (Abraham KM y col., 1991). Estos resultados en conjunto permiten establecer que Lck puede ser un blanco terapéutico importante en la patogénesis de algunas leucemias. Mientras que BCR-ABL1 y algunas otras de las proteínas mutadas se encuentran estrictamente en el citoplasma, la Lck se encuentra en las balsas lipídicas.
De la misma manera, debido a su papel central en varios cánceres, los miembros de la familia Ras, también presente en las balsas lipídicas, se han estudiado también exhaustivamente como blancos terapéuticos. Sin embargo, los inhibidores desarrollados de la enzima farnesil-transferasa, responsable de su localización en las balsas lipídicas, no han tenido la eficacia clínica esperada (Kostantinopoulos PA, 2007), por lo tanto se necesitan nuevas estrategias terapéuticas para inhibir al oncogen Ras. A diferencia de Lck que es una proteína tirosina quinasa, y que puede ser inhibida de manera inespecífica por inhibidores de las tirosinas quinasas BCR-ABL1 o NUP214-ABL1, Ras es una proteína G (une nucleótidos de guanina) monomérica que se activa por la unión a GTP. Ras tiene actividad intrínseca de GTPasa, esto es que puede hidrolizar el GTP a GDP, retornando a Ras a su estado basal de activación. En los casos en que el cáncer es conducido por un Ras activo, las mutaciones ocurridas en esta proteína hacen que se pierda la actividad de GTPasa haciendo que Ras se encuentre permanentemente activo, generando señales de crecimiento celular y progresión tumoral.
Debido a que el interés en Lck como un blanco terapéutico en diversos tipos de leucemias es relativamente reciente (Accordi B y col., 2010; Lee KC y col., 2010; Talab Fy col., 2013; De Keersmaecker K y col., 2014) y a que los inhibidores de Lck que se han encontrado son inespecíficos por una parte, y a que no se han podido encontrar inhibidores eficaces de Ras, por otra, se hace necesario el desarrollo de estrategias novedosas para la modulación de moléculas que se encuentren en las balsas lipídicas. Para esto es importante saber varios aspectos de la biología de las balsas lipídicas y de los mecanismos de señalización en estos microdominios membranales en células del sistema inmune (linfocitos).
Se sabe que la iniciación y propagación de los eventos de señalización que tienen lugar en las células del sistema inmune se producen en regiones de membrana especializadas denominadas balsas lipídicas (Van Laethem F y Leo O, 2002). Estas regiones son ricas en glicolípidos y colesterol, pero también insolubles en detergentes, característica que se utiliza para su aislamiento. Contienen muchas proteínas de señalización, como las proteínas tirosina quinasa de la familia Src (entre ellas Src, Lck, Fyn Lyn), proteínas adaptadoras y proteínas G monoméricas, solo para citar algunos ejemplos (Pizzo P y Viola A, 2003). Estas proteínas como se señaló arriba son modificadas después de sus síntesis para poder insertarse en la cara interna de la bicapa lipídica.
El reclutamiento de estas moléculas de señalización en estos subdominios de membrana, sugiere que las balsas lipídicas funcionan como plataformas para la formación de complejos de transducción de señales (Magee T y col., 2002). En el caso de los linfocitos, después de la activación del receptor de células T o B (TCR o BCR, respectivamente), varios de los componentes de señalización se asocian a estas balsas lipídicas, permitiendo la amplificación de la señal y la generación de señales finamente reguladas y con alto grado de especificidad (Horejsí V, 2003; He HT y Marguet D, 2008).
Muchos investigadores han proporcionado evidencia importante en el sentido de que la integridad y la dinámica de las balsas lipídicas es esencial para el inicio y el mantenimiento de las señales intracelulares. Considerando también la importancia de las interacciones entre proteínas y lípidos en la organización de los Rafts, se ha propuesto llamarlos “balsas membranales” (Simons K y Gerl MJ, 2010); sin embargo, todavía la mayoría de la literatura usa la denominación lipids rafts. Hay que tener en cuenta de todas maneras que los complejos multiméricos de señalización que se forman, si bien son consecuencia de las características de los componentes lipídicos, son en su gran mayoría proteínas. La versatilidad en la señalización celular que sucede en las balsas lipídicas hace que sea utilizada por oncoproteínas (producidas por los oncogenes) que señalizan en estos microdominios membranales.
Desafortunadamente, Lck y otros miembros de la familia Src son también blanco de proteínas virales de los virus linfotrópicos como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de Epstein Barr (EBV) o el Herpesvirus saimiri (HVS), para escapar de control inmunológico y mantener la latencia (Isakov y Biesinger, 2000; Cho et al, 2004; Morio et al, 1997; Swart et al, 2000). En particular, HVS es un γ-herpesvirus linfotrópico que no es patógeno en su huésped natural Saimiri sciureus, pero en algunas especies de primates del Nuevo Mundo induce linfomas de células T fulminantes (Meléndez et al, 1971). La infección con HVS se ha utilizado in vitro en humanos y primates no humanos (Aotus spp.) como una estrategia para la transformación de células T y la comprensión de este proceso y además, para estudios de los mecanismos celulares y moleculares de la respuesta inmune (Biesinger et al, 1992; Meinl et al, 1995; Vernot et al, 2005). Esto sugiere además que los mecanismos de transformación maligna en el ser humano y en células T de Aotus podrían tener la misma base molecular.
Dos productos génicos del HVS, Tip (del inglés, “tyrosine-kinase interacting protein”) y STP (del inglés, “Saimiri transforming protein”), parecen ser esenciales para obtener el fenotipo oncogénico (Duboise et al, 1998a). Sin embargo, la proteína Tip sola fue capaz de inducir linfoma de células T en ratones transgénicos, y por lo tanto es muy probable que sea responsable de la oncogenicidad en células T (Wehner et al, 2001). Algunos estudios han demostrado que la proteína Tip se asocia específicamente con Lck, produce un aumento de su fosforilación y de su actividad y finalmente, la proliferación de células T (Biesinger et al, 1995; Wiese et al, 1996; Kjellen et al., 2002). Por otra parte, la proteína Tip ha sido implicada ampliamente en la transformación oncogénica (Lund et al, 1997; Isakov y Biesinger, 2000).
Sin embargo, en las líneas leucémicas de células T, Jurkat o en células T primarias inmortalizadas por transducción lentiviral, otros autores han demostrado que la proteína Tip induce una regulación negativa de Lck y una disminución general de la fosforilación de tirosina celular de varias proteínas, incluyendo Lck y ZAP70 (Jung et al, 1995a; Cho et al, 2004). Los primeros trabajos han demostrado diferencias en la expresión de moléculas de señalización y los requisitos para la activación de las células alteradas Jurkat (Favero y Lafont, 1998), lo que explica en parte el efecto contrario de Tip en las células T primarias, por una parte, vs células Jurkat o células T inmortalizadas, por otra.
Los dominios de unión a Lck de la proteína Tip se encuentran en la porción carboxi-terminal de la molécula, y comprenden dos regiones de unión independientes, SH3B (unión al motivo SH3 de Lck) y CSKH (del inglés, C-terminal Src-kinase homology, unión a la región catalítica de Lck). Se encuentran dentro de una región altamente conservada entre los aminoácidos 146 a 182 (Jung et al, 1995b; Lund et al, 1999; Hartley et al., 2000; de Heck et al 2006). De manera interesante, los mutantes de Tip, que contienen sólo uno de los dominios SH3B o CSKH se unen a Lck (Hartley et al. 2000). Muy importante para el desarrollo de esta invención, una forma truncada de la proteína Tip sin el dominio SH3B es capaz de inducir linfomas in vivo (Duboise et al. 1998b) y además la co-expresión de Lck con un mutante de Tip que carece del dominio SH3B estimuló la fosforilación de tirosinas de las proteínas celulares (Hartley et al. 2000). Esto sugiere un papel adecuado y suficiente del dominio CSKH para la unión a Lck, la señalización de las células T y la proliferación.
Como sería de esperar para una proteína de unión y regulación de Lck, se ha demostrado que la proteína Tip está presente también en las balsas lípidicas (Park et al, 2003, Cho et al. 2006), como se explicó antes, una plataforma de señalización para la activación de células T (Bromley et al. 2001 Kabouridis et al 2006), donde las señales tempranas son inducidas permitiendo la expresión del gen específico y posteriormente la proliferación (Merlo y Tsygankov 2001. Kjellen et al, 2002; Filipp et al 2012). Recientemente, se demostró que la secuencia hidrofóbica (hTip) de Tip es responsable de su localización en las balsas lipídicas. Además, se demostró que una secuencia helicoidal anfipática de 14 aminoácidos, enriquecida en aminoácidos cargados e hidrófobicos y además contigua a la secuencia hTip, puede aumentar la localización de Tip a las balsas lipídicas (Min et al. 2008). paragraphs 229 to 236).
La presente invención provee un nuevo péptido quimérico, con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 presentada en la lista de secuencias y sales farmacológicamente aceptables o derivadas de este. Está formado por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 presentada en la lista de secuencias, perteneciente a la región hidrofóbica (hTip) de la proteína Tip del Herpesvirus saimiri; la secuencia SEQ ID NO: 3 presentada en la lista de secuencias, de un dominio de unión de la proteína Tip a la PTK p56Lck (Lck) y de una extensión de la misma proteína de 6 aminoácidos SEQ ID NO: 4 presentada en la lista de secuencias.
Podría ser aceptado como un medicamento antineoplásico para aquellos cánceres donde la proteína Lck juega un papel importante en el crecimiento maligno. También podría ser una herramienta para la entrega de secuencias funcionales relevantes para la funcionalidad de oncoproteínas, responsables de la transformación maligna, en compartimentos subcelulares específicos.
Este nuevo péptido sintético tiene una región hidrofóbica (hTip) y otra anfipática con residuos cargados y algunos otros hidrofóbicos. Este péptido con una longitud de 35 aminoácidos, denominado hTip-CSKH, se inserta en la membrana plasmática en los denominados rafts lipídicos o balsas lipídicas y modula la actividad de la proteína tirosina quinasa denominada Lck, para inducir su activación y la proliferación de células del sistema inmunitario (linfocitos) normales o inhibir las leucemias de células T. El péptido es específico para la modulación de Lck ya que utiliza un dominio de unión específica a Lck y no a otras proteínas de la familia Src de proteínas tirosina quinasa (Fyn, Lyn).
En primera instancia, la presente invención provee el uso del péptido quimérico hTip-CSKH en la manufactura de una droga o composición farmacéutica con actividad antineoplásica.
En segunda instancia, la presente invención provee el uso del péptido quimérico hTip-CSKH en la manufactura de una droga o composición farmacéutica con capacidad de modular la actividad enzimática de la proteína Lck que se encuentra en las balsas (rafts) lipídicas de las membranas plasmáticas.
En tercera instancia, la presente invención provee una composición farmacéutica, que comprende el péptido de la presente invención como principio activo de un medicamento antineoplásico, junto con un acarreador farmacéuticamente aceptable.
En cuarta instancia, la presente invención también provee una herramienta que pueda ser utilizada para la entrega de secuencias cargo específicas de oncoproteínas responsables del crecimiento maligno a subcompartimentos membranales específicos.
En quinta instancia, la presente invención también provee una herramienta que pueda ser utilizada para la activación de linfocitos que estén en estado anérgico (no respondedor).
El péptido sintético quimérico hTip-CSKH de la presente invención está formado por 35 aminoácidos SEQ ID NO: 1 de la lista de secuencias. La existencia de este péptido sintético no ha sido reportada en la literatura. Está conformado primero por una secuencia de 19 aminoácidos (SEQ ID NO: 2), perteneciente a la región hidrofóbica (hTip) de la proteína Tip del Herpesvirus saimirí. Esta proteína Tip de 256 aminoácidos tiene capacidad por sí sola de transformar linfocitos T, esto es inducirlos a proliferar sin estimulación exógena. Segundo, por la secuencia SEQ ID NO: 3, de uno de los dos dominios con los que la proteína Tip se une a la proteína tirosina quinasa Lck de linfocitos T para inducir la transformación. Estos dos dominios tienen capacidad de unión independiente a Lck. Tercero, por una secuencia de 6 aminoácidos SEQ ID NO: 4 también de Tip que presenta algunos aminoácidos cargados (D,R y K) que permiten incrementar el carácter anfipático de la secuencia cargo. Además, se incluyeron dos residuos de prolinas (P) para permitir la estructuración de la secuencia CSKH, dado el caso que esto fuera necesario para su interacción con Lck.
Para esta invención se escogió la proteína Tip del HVS que induce linfomas de células T por sí sola, debido a su capacidad de unión y de activación específica de la proteína tirosina quinasa Lck. De los dos dominios de unión SH3B y CSKH, el más estudiado ha sido SH3B, aunque ambos dominios se pueden unir de manera independiente a Lck. Se escogió el dominio CSKH teniendo en cuenta que proteínas Tip modificadas por ingeniería genética, sin el dominio SH3B, son capaces de inducir la transformación de células T, sugiriendo que el dominio CSKH es suficiente para la unión a Lck, la señalización de las células T y la proliferación. Se escogió la secuencia hidrofóbica de Tip, denominada aquí hTip, como vehículo para llevar a CSKH a las balsas lipídicas, debido que esta secuencia junto con una secuencia anfipática son las responsables de permiten de la localización de Tip en estos subcompartimentos membranales. Debido a esto, se incluyó una secuencia corta con residuos cargados que permiten aumentar este carácter anfipático.
Con esta invención hemos demostrado que es posible modular la activación de células T y su proliferación mediante el uso de un motivo corto (CSKH) de unión a Lck de la proteína Tip del HVS y llevarlo a las balsas lipídicas con efectividad mediante la secuencia hidrofóbica de Tip (hTip). En efecto, la quimera hTip-CSKH se encontró en membranas resistentes a detergentes (lipid rafts) donde, según el modelo celular, activó (células normales) o inhibió (células leucémicas), específicamente a la proteína tirosina quinasa, Lck, para inducir la correspondiente señalización intracelular y consecuentemente la inducción o la inhibición de la proliferación de células T.
De gran importancia en relación a esta invención, se puede entonces inferir que el uso de una secuencia hidrofóbica de la proteína transformante Tip, junto con secuencias anfipáticas y funcionales, podrían ser parte de una nueva estrategia molecular para activar o inhibir vías de transducción de la señales, en otros tipos de células y condiciones, en las que esté implicada la dinámica de señalización intracelular de las plataformas lipídicas de señalización.
Los siguientes métodos y ensayos biológicos in vitro son proporcionados para que la presente invención pueda ser completamente entendida. Debe entenderse que estos métodos y ejemplos son solamente con propósitos ilustrativos y no pueden ser interpretados como limitantes de la presente invención.
Fig.1
Proliferación celular inducida por el péptido quimérico hTip-CSKH en células humanas y de Aotus. CMSP de 2 Aotus nancymaae y un donante humano se estimularon con 40 uM péptidos hTip o hTip-CSKH y se determinó la proliferación celular por la incorporación de [3H
Fig.2
Proliferación celular inducida a diferentes concentraciones del péptido quimérico hTip-CSKH en células humanas y de Aotus. CMSP de humano y Aotus se estimularon a diferentes concentraciones de hTip-CSKH (0-80 uM) y se determinó la proliferación celular por la incorporación de [3H
Fig.3
Proliferación celular inducida a diferentes concentraciones del péptido quimérico hTip-CSKH y PMA en células humanas. CMSP de humano se estimularon con hTip-CSKH a diferentes concentraciones y con PMA 25 ng/ml; se determinó la proliferación celular por la incorporación de [3H
Fig.4
Inhibición de la proliferación de células leucémicas Jurkat por el péptido hTip-CSKH. A. PHA-P indujo una disminución de la proliferación basal en las células Jurkat; a diferencia de las PBMC normales las células Jurkat no responden a este mitógeno, pero si proliferan en respuesta al tratamiento con Ionomicina (IONO). B. Al igual que PHA-P, el péptido hTip-CSKH indujo una pequeña disminución de la proliferación basal. En células leucémicas estimuladas con ionomicina (IONO), el hTip-CSKH produjo una inhibición de la proliferación cercana al 50%. El péptido control (hTip) no produjo esta inhibición. La proliferación celular se evaluó como en las figura 3. Se utilizó la prueba t de Student para determinar las diferencias estadísticamente significativas. Los valores de p < 0,05 se señalan con asterisco (*).
Fig.5
Identificación electroforética de hTip-CSKH y péptidos de control en un sistema Tris-Tricina con membranas de eritrocitos. 10 ug de los péptidos indicados se mezclaron con 10 ul de un extracto de proteínas de membranas de eritrocitos. El gel se tiñó con azul de Coomasie. Se indica a la derecha el tamaño de los marcadores de peso molecular (MWM). La flecha indica la banda correspondiente a hTip-CSKH.
Fig.6
Identificación electroforética de hTip-CSKH en fracciones DRM de membranas de linfocitos en un sistema Tris-Tricina. El extracto de membrana de PBMC estimuladas con hTip-CSKH se separó por ultracentrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa. Se recuperaron 8 fracciones como se indica en cada línea. La mitad de cada fracción se utilizó para la identificación electroforética de hTip-CSKH (sistema Tris-Tricina). La flecha indica la banda correspondiente a su peso molecular. La cantidad restante de la fracción se utilizó en un WB con el fin de conocer su contenido Flotillin 2 (abajo). El tamaño de cada marcador de peso molecular (MWM) se indica en la izquierda.
Fig.7
Microscopía de fluorescencia de los linfocitos T incubados con hTip-CSKH. PBMC humanas se incubaron con 40 uM de péptido marcado con FITC durante 1h (A y B). Como control se utilizó péptido no marcado (C y D). Las células se observaron en microscopio de luz invertido (A y C) o un microscopio de fluorescencia Nikon C-1PLUS (B y D).
Fig.8
Determinación de Lck en en extractos de PBMC después de la estimulación celular. A. PBMC sin tratar (carriles 1-4) o tratados (carriles 5-8) durante 1 h con hTip-CSKH se estimularon con PHA-P durante 0, 15, 30 y 60 min y luego se lisaron. Los extractos se separaron en SDS-PAGE y las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF. El WB se realizó con anticuerpos monoclonales dirigidos Lck (paneles superiores) y a fosfo-tirosina (P-Y) (paneles inferiores). Se identificaron 2 bandas bien definidas correspondientes a p56Lck (bajo peso molecular) y p59 Lck, (banda de alto peso molecular). B. La cuantificación de las bandas p56Lck y p59Lck mostró un aumento de la relación de p59Lck/p56Lck. Las barras blancas representan células no tratadas y las barras negras células tratadas con hTip-CSKH a diferentes tiempos de estimulación.
Fig.9
Detección de la proteína tirosina quinasa Fyn en membranas PBMC estimuladas. A. Las PBMC se estimularon con PHA-P y hTip-CSKH durante 2 h, se lisaron y el extracto de proteínas se separó en SDS-PAGE. El WB se realizó con un anticuerpo monoclonal anti-Fyn. PHA-P se utilizó como control positivo, se muestra que induce la aparición de una segunda banda de 56 kDa (p56Fyn). B. Cuantificación de las bandas de p59Fyn y p56Fyn. La intensidad de cada banda de Fyn se normalizó con el control de carga β-actina.
Fig.10
Determinación de la fosforilación de Erk en PBMC estimuladas. A. Las PBMC se estimularon por 2 h con los péptidos o los diferentes tratamientos indicados. hTip-CSKH indujo un aumento (2,5 veces) en la fosforilación ERK2. El análisis se realizó por WB con anticuerpos monoclonales anti-pERK1/2; la membrana se volvieron a probar, después de lavados, con anti ERK1/2 para la normalización banda en cada tratamiento como se muestra en el gráfico. DMSO: Dimetilsulfóxido; PHA + PMA: fitoohemaglutinina + forbol miristato acetato.
Síntesis de péptidos control y quiméricos
Los péptidos seleccionados se sintetizaron químicamente utilizando la técnica de síntesis múltiple en fase sólida (t-boc) como ha sido descrito previamente (Houghten, 1985). El DTP utilizado aquí y denominado hTip corresponde a la secuencia SEQ ID NO: 2 de Tip; la secuencia cargo SEQ ID NO: 3 corresponde al dominio de unión de Tip denominado CSKH y la secuencia de extensión SEQ ID NO: 4 es contigua a CSKH. La secuencia quimérica SEQ ID NO: 1 incluye estas tres secuencias. En algunos experimentos se incluyó una secuencia quimérica “scrambled”, esto es con la secuencia cargo pero con los aminoácidos en desorden, para mostrar la especificidad del efecto de la secuencia ordenada; ésta se denominó hTip-CSKHsc. Los péptidos se purificaron por HPLC y se caracterizaron por espectrofotometría de masas MALDI-TOF. Los péptidos utilizados tenían una pureza ≥90%.
Marcación del péptido quimérico hTip-CSKH
El péptido hTip-CSKH se marcó con isotiocianato de fluoresceína (FITC) para determinar su interacción y patrón de fluorescencia en los linfocitos T. Brevemente, 5 ml de una solución 0,0125 mM del péptido hTip-CSKH se incubó por 24 h en una solución tampón de carbonato-bicarbonato 0,1 M con 250 ul de una solución 2,5 mM FITC en DMSO. La diálisis se realizó durante 48 h contra 0,1 M de cloruro de amonio en 1% de DMSO (membrana con un límite de exclusión de 3,5 kDa). 105 células mononucleares humanas de sangre periférica (PBMC) se resuspendieron en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS, HEPES 10 mM y piruvato de sodio 1 mM (medio completo) durante 1 h a 37°C y se incubaron con 40 uM hTip-CSKH marcado con FITC. Las células se lavaron con PBS y se resuspendieron en 20 ul de medio (NaCl 150 mM, glicerol al 50%) y se montaron en un portaobjetos y se observaron en un microscopio de fluorescencia Nikon C-1PLUS. Las fotografías digitales fueron tomadas con una cámara digital Sony DSC-P73.
Ensayos de proliferación de linfocitos
Un total de 5 x 104 PBMC/pozo se cultivaron durante 1 h a 37ºC y 5% de CO2 en medio completo en ausencia o presencia de diferentes concentraciones de péptido (tal como se indica en cada figura) en microplacas de 96 pozos de fondo plano. En algunos experimentos, las PBMC también se estimularon con 2 ug/ml de PHA-P o 25 ng/ml de PMA durante 48 h o 72 h con o sin adición de péptidos. Después de esto, se adicionó 0,5 uCi/pozo de timidina radiactiva, [metil-3H]-timidina (ICN Biomedicals), por 18 h. Las células se cosecharon en membranas de fibra de vidrio y se midió la radiación en un contador de centelleo líquido Beckman LS 6500. La línea celular de leucemia T (5 x 104células) Jurkat, tratadas o no con los péptidos, se estimularon con 2 ug/ml de ionomicina o 2 mg/ml de PHA-P y se procesaron como se describió anteriormente para las células normales para determinar su proliferación. El índice de proliferación (SIP) se definió como la relación de la media de [metil-3H]-timidina (cpm) incorporada en presencia del péptido sobre la incorporada en ausencia de péptido X100.
Detección de la proteína tirosina quinasa por Western blot (WB)
Las PBMC se pre-incubaron (o no) durante 1 h con 60 uM del péptido hTip-CSKH, y estimulado (o no) adicionalmente con PHA-P (5 mg/ml) durante 15, 30 o 60 min. La estimulación se detuvo por enfriamiento con hielo; estas células se lavaron dos veces en PBS y se prepararon extractos celulares por una incubación de 20 min en tampón de lisis frío (20 mM Tris-Cl pH 8,0, NaCl 276 mM, glicerol al 10%, 1% NP40, 1 mM PMSF, 10 g / ml de aprotinina, 10 mg / ml de leupeptina, 1 mM Na3VO4, mM NaF 10 y EDTA 2 mM). Los extractos se centrifugaron durante 15 min a 10000 g y 4°C; los sobrenadantes se recuperaron y se sometieron a 10% SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron luego a membranas de PVDF (Immobilon-P, Millipore Corp). La inmunodetección se realizó con anticuerpos monoclonales anti-Lck (Clon MOL171), anti-fosfotirosina (Clon PY20). En otro conjunto de experimentos, las PBMC humanas se estimularon con PHA-P o hTip-CSKH y se prepararon extractos celulares como se describió anteriormente. Las proteínas se transfirieron luego a membranas de PVDF y la inmunodetección se realizó con anticuerpos monoclonales anti-Fyn (AHO0482, Invitrogen), anti-β-actina (sc-47778, Santa Cruz Biotecnología). Las membranas de PVDF y los geles teñidos con azul de Coomassie se escanearon y analizaron por densitometría con el software GeneTool (Syngene, Synoptics Ltda, Frederick, MD, USA). Para el análisis de datos, las bandas de p56Fyn y p59Fyn se normalizaron con la banda de β-actina.
Señalización “corriente-abajo” después de la estimulación de Lck
Las PBMC humanas se estimularon durante 2 h con los diferentes péptidos o con PHA-PMA como se describió anteriormente. Extractos celulares se prepararon como se describió anteriormente y se ensayaron por WB con anti-p-ERK1/2 (sc-7383, Santa Cruz Biotecnología), anti-ERK1/2 (sc-7383, Santa Cruz Biotecnología). La fosforilación de Erk se normalizó con ERK1/2 total.
Aislamiento bioquímica de membranas resistentes a detergentes (DRM)
Cerca de 6 x 107 PBMC se trataron con 40 uM de hTip-CSKH en suero RMPI-1640 durante 1 h a 37°C. Las células se lavaron en medio y las membranas se extrajeron durante 20 min en 200 ul de tampón de lisis enfriado con hielo que contenía Tris 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,5% Triton-X100, 1 ug/ml de leupeptina, 1 ug/ml de pepstatina, 4 ug/ml de aprotinina, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4 y 50 mM NaF. Para los gradientes de densidad de sacarosa, los extractos de células se mezclaron con 250 ul de 80% de sacarosa en tampón TNE (Tris 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM), y se cubrieron con 730 ul de 35% de sacarosa y 320 ul 5% de sacarosa, y se centrifugaron a 200.000 g durante 5 h, 4°C (Beckman Optima, rotor TLS-55). Ocho fracciones de igual volumen se recuperaron de la parte superior del gradiente, se diluyeron con 1 ml de TNE y las membranas resistentes a detergentes en cada fracción se obtuvieron mediante ultracentrifugación a 100.000g durante 45 min, 4°C. Los sedimentos se extrajeron en 20 ul de solución tampón de Laemmli: La mitad se utilizó para WB y detección de Flotillin-2 y la otra mitad para SDS-PAGE en tampón Tris-Tricina para la identificación de péptidos como está descrito (Judd, 1994). Para facilitar la identificación de los péptidos en este sistema, se prepararon membranas de los eritrocitos en paralelo y se incubaron con los diferentes péptidos utilizados. Los péptidos se identificaron por la separación de la muestra en SDS-PAGE en Tris-Tricina.
Determinación de marcadores de superficie después del tratamiento con hTip-CSKH
Las PBMC se incubaron durante 24 h en ausencia o presencia de 60 uM hTip-CSKH, se lavaron con PBS, y se resuspendieron en una solución de BSA-PBS 0,5% y se incubaron adicionalmente durante 20 min a temperatura ambiente con el respectivo anticuerpo monoclonal. El anticuerpo anti-CD3 (clon UCTH1) se adquirió de Sigma (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EE.UU.); anti-CD25 conjugado con PE (clon M-A251) y anti-TCR α / β anticuerpos conjugados con FITC se adquirieron de Pharmingen (San Diego, CA, EE.UU.). Todas las incubaciones con anticuerpos marcados con fluorocromo se realizaron en la oscuridad. Luego, las células se lavaron con 2 ml de PBS y se centrifugó. Después de un lavado final, las células se suspendieron en 0,5 ml de PBS y leer inmediatamente en un citómetro de flujo FACScan (Beckton Dickinson, BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).
Análisis estadísticos
Los valores para los experimentos de proliferación se expresaron como media ± media del error estándar (SEM). La significancia estadística se evaluó por análisis de varianza de una vía (ANOVA) y una prueba de Bonferroni para determinar la significancia de las comparaciones entre los grupos de tratamientos a diferentes concentraciones. Las diferencias entre grupos en los algunos de los experimentos se analizaron con una t pareada. Se utilizó el programa Stata 6.0 (College Station, TX, USA). P <0.05 (*) y P <0.01 (**) se consideraron estadísticamente significativos.
Ejemplo 1. Efecto deI péptido hTip-CSKH en la proliferación de linfocitos normales
La incubación de PBMC (linfocitos T) de Aotus o de humanos con hTip-CSKH a 40 uM durante 48 h indujo un aumento de la proliferación celular (2-3 veces) (Figura 1). Se demostró que la proliferación era dependiente de la secuencia cargo ya que no hubo proliferación celular con la secuencia control hTip. Igualmente, las secuencias CSKH sola y la quimérica con la secuencia CSKH desordenada no produjeron este efecto. El efecto de hTip-CSKH es entonces similar al mitógeno de células T, denominado PHA-P, es decir la inducción de la proliferación celular sin otras sustancias estimuladoras. El resultado observado con hTip-CSKH fue más fuerte y dependiente de la dosis tanto en PBMC humanos como en Aotus cuando se ensayó la proliferación después de 72 h de incubación y con diferentes concentraciones de péptidos (Figura 2). El aumento de la proliferación se observó inicialmente entre 20 y 40 uM de hTip-CSKH. Sorprendentemente, se observó una inducción de seis veces en la proliferación a 80 uM del hTip-CSKH tanto en células T de humanos como de Aotus.
Ejemplo 2. hTip-CSKH induce proliferación de células T independiente de la señal 2
La proliferación de PBMC humanas inducida por hTip-CSKH fue 40% menor que la inducida por PHA-P, lo que sugiere diferentes mecanismos de inducción o la necesidad de señales complementarias a través de co-receptores para obtener una proliferación equivalente al obtenido por el mitógeno. Por otra parte, es bien conocido que los linfocitos T humanos requieren de al menos dos señales diferentes (señal 1 y 2) para la proliferación celular (Croft y Dubey, 1997; Baxter 2002). Estas señales pueden ser simuladas in vitro por la combinación de la entrada de calcio (señal 1) y la activación de la enzima proteína quinasa C (PKC) (señal 2) o alternativamente por la estimulación con el mitógeno PHA-P (señal 1 y 2). Para analizar este tema, se utilizó un activador clásico de la PKC, el forbol-12-miristato-13-acetato o PMA, para inducir la señal 2 (Croft y Dubey, 1997). La idea fue probar la activación de PKC como un complemento de la señalización hTip-CSKH. Como era de esperar, se obtuvo una proliferación celular relativamente baja cuando las PBMC humanas se trataron solo con el PMA (Figura 3). Por el contrario, la estimulación con PMA y hTip-CSKH indujo un aumento en la proliferación dosis-dependiente (a partir de 20 a 40 uM), con un incremento de cinco veces a una concentración de 80 uM. La secuencia control hTip no produjo el mismo efecto (Figura 3). El inicio de la proliferación celular y la respuesta máxima a hTip-CSKH fue muy similar a la obtenida sin PMA, por lo tanto, hTip-CSKH parece ser capaz por sí solo de sustituir eficientemente la señal 2.
Ejemplo 3. hTip-CSKH inhibe la proliferación de linfocitos T leucémicos
En células T de la línea leucémica Jurkat la activación de TCR provoca la inhibición de la proliferación celular, lo que sugiere que estas células leucémicas tienen diferentes requisitos de activación a las células normales (Boonen et al, 1999). Las células Jurkat no responden a la estimulación con el mitógeno PHA-P, pero responden adecuadamente a un influjo de calcio. La Figura 4A muestra que las células Jurkat tienen una tasa de proliferación de dos a tres veces mayor en presencia de ionomicina que las células no estimuladas. Como se ha reportado anteriormente, las células Jurkat estimuladas con PHA-P mostraron una reducción leve en la tasa de proliferación celular (Figura 4A, columna central). De la misma manera, el tratamiento con hTip-CSKH de las células Jurkat también indujo una ligera disminución en la proliferación, similar a lo que se vió antes con PHA-P. El control con el péptido hTip no tuvo ningún efecto (Figura 4B, segunda columna). Las células Jurkat estimuladas con ionomicina y tratadas con hTip-CSKH mostraron una fuerte reducción en la tasa de proliferación (Figura 4B, sexta columna) mientras que las células tratadas con el péptido control hTip no mostraron ningún efecto (Figura 4B, quinta columna). En conjunto, estos resultados demuestran que si las células T proliferan en respuesta a PHA-P, como sucede en las células T normales, h-Tip-CSKH también induce la proliferación. En contraste, si la estimulación a través de la señal 1 inhibe la proliferación como en las células leucémicas Jurkat, hTip-CSKH también tiene efectos inhibidores. Esto sugiere que el péptido hTip-CSKH puede utilizarse como inhibidor del crecimiento celular en células leucémicas que tengan defectos en la señalización intracelular como las células Jurkat.
Ejemplo 4. hTip-CSKH se localiza en fracciones de membranas plasmáticas resistentes a detergentes (DRM)
Se reportó con anterioridad que se requiere el dominio transmembrana (residuos de aminoácidos de 229 a 250) de la proteína Tip para su asociación con las balsas lipídicas (Cho et al., 2006). Por lo tanto, se estudió mediante pruebas bioquímicas la localización hTip-CSKH en la membrana plasmática, específicamente su asociación con las DRM, las cuales se han asociado funcionalmente con las balsas lipídicas (Brown and London, 1998). Primero que todo, probamos un sistema de electroforesis (SDS-PAGE en tampón Tris-Tricina) con una alta resolución para la identificación de péptidos. 10 ug de cada uno de los péptidos hTip-CSKH, hTip, hTip-CSKHsc o CSKH se mezcló con 10 ul de un extracto de membranas plasmáticas de eritrocito. Como puede verse en la Figura 5, los péptidos hTip-CSKH, hTip-CSKHsc y CSKH pudieron ser identificados como bandas difusas de migración rápida por debajo del marcador de PM de 6,9 kDa (flecha). hTip no pudo resolverse debido a su alta hidrofobicidad. Posteriormente, preparamos un extracto de membranas con el detergente Triton X-100 de PBMC tratadas con hTip-CSKH y se separaron en un gradiente de densidad de sacarosa por centrifugación. Se recogieron 8 fracciones que se separaron y ensayaron por SDS-PAGE en Tris-Tricina y WB para determinar la presencia de hTip-CSKH y Flotillin-2, respectivamente. La Flotillin-2, un marcador de balsas de lípidos, se distribuye principalmente en las fracciones 1-3 y 6-8 (Figura 6, panel inferior). Se detectó una banda correspondiente a la hTip-CSKH MW en las fracciones 6 y 7 (Figura 6, panel superior, flecha), que muestra la localización hTip-CSKH en balsas lipídicas pesadas de la membrana. Esto es de mucha relevancia, ya que se demostró recientemente, la existencia de un nuevo tipo de microdominios lipídicos pesados en la membrana que contienen moléculas de señalización importantes en la activación de células T que incluyen Lck, LAT y otras (Otáhal et al., 2010). La evidencia anterior muestra que casi la totalidad del péptido quimérico hTip-CSKH está presente en estas balsas lipídicas pesadas, recientemente descritas, donde puede interactuar con la proteína Lck, blanco del péptido quimérico.
Ejemplo 5. El péptido hTIP-CSKH se asocia con la superficie celular
Adicionalmente, la incubación de PBMC humanas con el péptido hTip-CSKH marcado con isotiocianato de fluoresceína o FITC durante 1 h y su análisis por microscopía de fluorescencia mostró una localización de superficie homogénea sin acumulación intracitoplasmática (Figura 7). Esto demuestra que hTip-CSKH interactúa con la membrana citoplasmática y como se demostró arriba se localiza en las balsas lipídicas donde modula la actividad de Lck.
Ejemplo 6. La enzima Lck es blanco del péptido hTIP-CSKH, induciendo su rápida activación
Las balsas lipídicas pesadas son parte de una plataforma de señalización del TCR implicada en la coordinación de los eventos iniciales de señalización de células T, a saber, la activación proteína tirosina quinasa, intracelulares como Lck (Otáhal et al, 2010). Analizamos entonces el efecto hTip-CSKH sobre la proteína tirosina quinasa Lck, molécula clave durante la activación de células T y blanco teórico del péptido hTip-CSKH, utilizado aquí. Se utilizaron anticuerpos monoclonales dirigidos contra Lck y los residuos de fosfotirosina para evaluar la fosforilación de Lck y su activación en corto tiempo. Para comparación se utilizaron células estimuladas con PHA-P. Se prepararon extractos celulares después de 0, 15, 30 y 60 min de estimulación; y se realizó detección por WB simultáneamente para Lck y los residuos de fosfotirosina.
Se evidenciaron bandas definidas de 56 kDa y 59 kDa (Figura 8). Al analizar la intensidad de las bandas de Lck en el tiempo (Figura 8, panel superior), la banda de p56lck apareció más intensa que la banda p59Lck en células estimuladas con PHA-P. Después de 15 min de estimulación, se observó un aumento progresivo en la banda de p59Lck y la fosforilación de residuos de tirosina y esto se prolongó por el resto del período ensayado, es decir 1 h (Figura 8, panel superior izquierdo). Simultáneamente, la banda p56lck se redujo, lo que indica que el aumento de la banda p59Lck depende de la contribución de la banda de p56lck. Por el contrario, en las células tratadas con hTip-CSKH, la relación entre p59Lck y p56lck bandas se invirtió inmediatamente después de la estimulación y se prolongó durante el período de prueba (Figura 8).
Ejemplo 7. La enzima Fyn no es blanco del péptido hTIP-CSKH
Debido a que se ha reportado que la proteína tirosina quinasa Fyn está relacionada estructuralmente con Lck, y que tiene, al menos en parte, una función redundante durante la activación de células T (Filipp et al. 2004), se decidió probar el efecto de hTip-CSKH sobre Fyn. Como puede verse en la Figura 9, la estimulación con PHA-P induce una reducción en la intensidad de la proteína Fyn de 59 kDa (aproximadamente 22%) y la aparición de una banda de bajo PM (56 kDa). hTip-CSKH tuvo un efecto similar en la proteína de 59 kDa de Fyn (20% de reducción) mientras que la segunda banda apareció difusa y mal resuelta. Por lo tanto, hTip-CSKH induce un efecto diferente en Fyn cuando se compara con PHA-P estimulación, lo que sugiere de nuevo una especificidad hacia Lck. Además, se puede concluir que el aumento observado en la banda de Lck de 59 kDa (Figura 8) no es debido a un aumento en la banda de Fyn, ya que, por el contrario, hTip-CSKH induce una reducción en la banda de 59 kDa de Fyn.
Ejemplo 8. Eventos de señalización intracelular inducidos por hTip-CSKH
Con el fin de evaluar si la señal intracelular inducida por hTip-CSKH podría determinarse “corriente abajo” de Lck se estudió la activación de ERK (lo que se evalúa por la fosforilación de residuos de Ser), un paso importante en la proliferación inducida por TCR (Ferrell y Bhatt, 1997), ya que Erk activo activa factores transcripcionales que modifican la expresión génica. El nivel de fosforilación de ERK logrado durante la estimulación de PBMC con PHA-P y PMA fue 5,5 veces en comparación con las células no estimuladas (Figura 10). Igualmente, hTip-CSKH produjo un aumento de 2,5 veces de la fosforilación de ERK; los otros péptidos ensayados no presentaron ningún efecto relevante; solo hTip indujo un aumento de 1,5 veces, pero éste no fue suficiente para inducir la proliferación de células T, como se mostró anteriormente. Claramente, hTip-CSKH indujo señalización intracelular “corriente abajo” de Lck.
Bibliografía distinta de la de patentes
Abraham KM, Levin SD, Marth JD, ForbushKA, Perlmutter RM. Thymic tumorigenesis induced by overexpression of p56lck. Proc Natl Acad Sci USA. 1991;88:3977-81.
Accordi B, Espina V, Giordan M, VanMeter A, Milani G, Galla L, Ruzzene M, Sciro M, Trentin L, De Maria R, te Kronnie G, Petricoin E, Liotta L, Basso G. Functional Protein Network Activation Mapping Reveals New Potential Molecular Drug Targets for Poor Prognosis Pediatric BCP-ALL. PLoS One. 2010;5(10):e13552.
Alland L, Peseckis SM, Atherton RE, Berthiaume L, Resh MD. Dual myristylation and palmitylation of Src family member p59fyn affects subcellular localization. J Biol Chem. 1994;269:16701–05.
Baxter AG and Hodgkin PD. Activation rules: the two-signal theories of immune activation. Nat. Rev. Immunol. 2002;2:439-46.
Biesinger B, Muller-Fleckenstein I, Simmer B, Lang G, Wittmann S, Platzer E, Desrosiers RC and Fleckenstein B. Stable growth transformation of human T lymphocytes by Herpesvirus saimiri. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992;89:3116-19.
Biesinger B, Tsygankov AY, Fickenscher H, Emmrich F, Fleckenstein B, Bolen J B and Broker BM. The product of the Herpesvirus saimiri open reading frame 1 (tip) interacts with T cell-specific kinase p56lck in transformed cells. J. Biol. Chem. 1995; 270:4729-34.
Boonen GJ, Van Oirschot BA, Van Diepen A, Mackus WJ, Verdonck LF, Rijksen G, and Medema RH. Cyclin D3 regulates proliferation and apoptosis of leukemic T cell lines. J. Biol. Chem. 1999;274:34676-82.
Bromley SK, Burack WR, Johnson KG, Somersalo K, Sims TN, Sumen C, Davis MM, Shaw AS, Allen PM and Dustin ML. 2001. The immunological synapse. Annu. Rev. Immunol. 19:375-96.
Brown DA, London E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu Rev Cell Dev Biol. 1998;14:111-36.
Cho NH, Feng P, Lee SH, Lee BS, Liang X, Chang H and Jung JU. 2004. Inhibition of T cell receptor signal transduction by tyrosine kinase interacting protein of Herpesvirus saimiri. J. Exp. Med. 2004; 200:681-7.
Cho NH, Kingston D, Chang H, Kwon EK, Kim JM, Lee JH, Chu H, Choi MS, Kim IS, Jung JU. Association of herpesvirus saimiri tip with lipid raft is essential for downregulation of T-cell receptor and CD4 coreceptor. J Virol. 2006;80:108-18.
Croft M1, Dubey C. Accessory molecule and costimulation requirements for CD4 T cell response. Crit Rev Immunol. 1997;17:89-118.
De Keersmaecker K, Porcu M, Cox L, Girardi T, Vandepoel R, de Beeck JO, Gielen O, Mentens N, Bennett KL, Hantschel O. NUP214-ABL1-mediated cell proliferation in T-cell acute lymphoblastic leukemia is dependent on the LCK kinase and various interacting proteins. Haematologica. 2014;99:85–93.
Dietz GP. Cell-penetrating peptide technology to deliver chaperones and associated factors in diseases and basic research. Curr Pharm Biotechnol. 2010;11:167-74.
Duboise SM, Guo J, Czajak S, Desrosiers RC, Jung JU: STP and Tip are essential for herpesvirus saimiri oncogenicity. J Virol. 1998a;72:1308-13.
Duboise SM, Lee H, Guo J, Choi JK, Czajak S, Simon M, Desrosiers RC, Jung JU. 1998b. Mutation of the Lck-binding motif of Tip enhances lymphoid cell activation by herpesvirus saimiri. J. Virol. 1998b;72:2607–14.
Druker BJ. Translation of the Philadelphia chromosome into therapy for CML. Blood. 2008;112:4808-17.
Edidin M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2003;32:257–83
Favero J, Lafont V. 1998. Effector pathways regulating T cell activation. Biochem. Pharmacol. 56:1539-47.
Ferrell J, Bhatt R. Mechanistic studies of the dual phosphorylation of mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem. 1997;272(30):19008-16.
Filipp D, Ballek O, Manning J. Lck, Membrane Microdomains, and TCR Triggering Machinery: Defining the New Rules of Engagement. 2012. Front Immunol. 3:1-14.
Filipp D, and Julius M. Lipid rafts: resolution of the “fyn problem”? Mol. Immunol. 2004;41:645–56.
Hartley DA, Amdjadi K, Hurley TR, Lund TC, Medveczky PG and Sefton BM. Activation of the Lck tyrosine protein kinase by the Herpesvirus saimiri Tip protein involves two binding interactions. Virology. 2000;276:339-48.
He HT, Marguet D. T-cell antigen receptor triggering and lipid rafts: a matter of space and time scales. Talking Point on the involvement of lipid rafts in T-cell activation. EMBO Rep. 2008;9:525-30. doi: 10.1038/embor.2008.78.
Heck E, Friedrich U, Gack MU, Lengenfelder D, Schmidt M, Müller-Fleckenstein I, Fleckenstein B, Ensser A, Biesinger B. 2006. Growth transformation of human T cells by herpesvirus saimiri requires multiple Tip-Lck interaction motifs. J Virol. 2006;80:9934-42.
Horejsí V. The roles of membrane microdomains (rafts) in T cell activation. Immunol Rev. 2003;191:148-64.
Houghten R. A. General Method for the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: specificity of antigen-antibody interaction at the level of individual aminoacids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985;82:5131-35.
Isakov N and Biesinger B. Lck protein tyrosine kinase is a key regulator of T-cell activation and target for signal intervention by Herpesvirus saimiri and other viral gene products. Eur. J. Biochem. 2000;267:3413-21.
Judd RC. Electrophoresis of peptides. Methods Mol Biol. 1994;32:49-57.
Jung JU, Lang SM, Jun T, Roberts TM, Veillette A and Desrosiers RC. Downregulation of Lck-mediated signal transduction by Tip of Herpesvirus saimiri. J. Virol. 1995a;69:7814-22.
Jung JU, Lang SM, Friedrich U, Jun T, Roberts T, Desrosiers RC and Biesienger B. Identification of Lck-binding elements in Tip of Herpesvirus saimiri. J. Biol. Chem. 1995b;270:20660-67.
Kabouridis PS. Lipid rafts in T cell receptor signalling. Mol. Membr. Biol. 2006;23:49–57.
Kjellen P, Amdjadi K, Lund TC, Medvecsky PG and Sefton BM. The Herpesvirus saimiri Tip484 and Tip488 proteins both stimulate Lck tyrosine protein kinase activity in vivo and in vitro. Virology. 2002;297:281-8.
Konstantinopoulos PA, Karamouzis MV, Papavassiliou AG. Post-translational modifications and regulation of the RAS superfamily of GTPases as anticancer targets. Nat Rev Drug Discov. 2007;6:541-55.
Lee KC, Ouwehand I, Giannini AL, Thomas NS, Dibb NJ, Bijlmakers MJ. Lck is a key target of imatinib and dasatinib in T-cell activation. Leukemia. 2010;24:896-900.
Lund T, Medveczky MM and Medveczcky PG. 1997. Herpesvirus saimiri Tip 484 membrane protein markedly increases p56lck activity in T cells. J. Virol. 1997;71:378-82.
Lund T, Prator PC, Medveczky MM and Medveczky PG. 1999. The Lck binding domain of Herpesvirus saimiri Tip-484 constitutively activates Lck and STAT3 in T cells. J. Virol. 1999;73:1689-94.
Magee T, Marshall C. New insights into the interaction of Ras with the plasma membrane. Cell. 1999;98:9-12.
Magee T, Pirinen N, Adler J, Pagakis SN, Parmryd I. Lipid rafts: cell surface platforms for T cell signaling. Biol Res. 2002;35:127-31.
Mahon FX, Deininger MW, Schultheis B,Chabrol J, Reiffers J, Goldman JM, et al. Selection and characterization of BCR-ABLpositive cell lines with differential sensitivityto the tyrosine kinase inhibitor STI571:diverse mechanisms of resistance. Blood. 2000;96:1070-9.
Meinl E, t Hart BA, Bontrop RE, Hoch RM, Iglesias A, de Waal Malefyt R, Fickenscher H, Muller-Fleckenstein I, Fleckenstein B and Wekerle H. 1995. Activation of a myelin basic protein-specific human T cell clone by antigen presenting cells from rhesus monkeys. Int. Immunol. 1995;7:1489-95.
Melendez LV, Hunt RD, Daniel MD, Blake BJ and Garcia FG. Acute lymphocytic leukemia in owl monkeys inoculated with Herpesvirus saimiri. Science. 1971; 171:1161-3.
Merlo JJ and Tsygankov AY. 2001. Herpesvirus saimiri oncoproteins Tip and StpC synergistically stimulate NF-kB activity and interleukin-2 gene expression. Virology. 2001;279:325-38.
Michel V, Bakovic M. Lipid rafts in health and disease. Biol Cell. 2007;99:129-40.
Min CK, Bang SY, Cho BA, Choi YH, Yang JS, Lee SH, Seong SY, Kim KW, Kim S, Jung JU, Choi MS, Kim IS, Cho NH. Role of amphipathic helix of a herpesviral protein in membrane deformation and T cell receptor downregulation. PLoS Pathog. 2008;4(11):e1000209. doi:10.1371/journal.ppat.1000209.
Morio T, Chatila T and Geha RS. HIV glycoprotein gp120 inhibits TCR-CD3-mediated activation of fyn and lck. Int. Immunol. 1997;9:53-64.
O'Hare T, Eide CA, Deininger MWN. Bcr-Abl kinase domain mutations, drug resist-ance, and the road to a cure for chronicmyeloid leukemia. Blood. 2007;110:2242-9
Onodera R, Motoyama K, Okamatsu A, Higashi T, Kariya R, Okada S, Arima H. Involvement of cholesterol depletion from lipid rafts in apoptosis induced by methyl-β-cyclodextrin. Int J Pharm. 2013;452:116-23.
Otáhal P, Angelisová P, Hrdinka M, Brdicka T, Novák P, Drbal K, Horejsí V. A new type of membrane raft-like microdomains and their possible involvement in TCR signaling. J Immunol. 2010;184:3689-96.
Park J, Cho N-H, Choi J-K, Feng P, Choe J and Jung JU. 2003. Distinct roles of cellular Lck and p80 proteins in Herpesvirus saimiri Tip function on lipid rafts. J. Virol. 2003;77:9041-51.
Pizzo P, Viola A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr Opin Immunol. 2003;15:255-60.
Resh MD. Myristylation and palmitylation of Src family members: the fats of the matter. Cell. 1994;76:411-13.
Schroeder H, Leventis R, Rex S, Schelhaas M, Nagele E, Waldmann H, Silvius JR. S-Acylation and plasma membrane targeting of the farnesylated carboxyl-terminal peptide of N-ras in mammalian fibroblasts. Biochemistry. 1997;36:13102-09.
Simons K and Gerl M J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2010;11:688–99.
Swart R, Ruf IK, Sample J and Longnecker, R. 2000. Latent Membrane Protein 2A-Mediated Effects on the Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt Pathway. J. Virol. 74:10838-45.
Talab F, Allen JC, Thompson V, Lin K, Slupsky JR. LCK is an important mediator of B-cell receptor signaling in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol Cancer Res. 2013; 11:541-54.
Van Laethem F, Leo O. Membrane lipid rafts: new targets for immunoregulation. Curr Mol Med. 2002;2:557-70.
Vernot JP, Pérez-Quintero LA, Perdomo-Arciniegas AM, Quijano S and Patarroyo ME. Herpesvirus saimiri immortalisation of Aotus T-cells specific for an immunogenic modified peptide of Plasmodium falciparum merozoite surface antigen 2. Immunol. Cell. Biol. 2005;83:67-74.
Wehner LE, Schroder N, Kamino K, Friedrich U, Biesinger B and Ruther U. Herpesvirus saimiri Tip gene causes T-cell lymphoma in transgenic mice. DNA Cell. Biol. 2001;20:81-88.
Wiese N, Tsygankov AY, Klauenberg U, Bolen JB, Fleischer B and Broker BM. Selective activation of T cell kinase p56lck by herpesvirus saimiri protein tip. J. Biol. Chem. 1996;271:847-52. John

Claims (5)

  1. Un péptido quimérico CARACTERIZADO POR estar compuesto por 35 aminoácidos, SEQ ID NO: 1, dispuestos en unión covalente de tres secuencias distintas de la proteína Tip del Herpesvirus saimiri, una secuencia hidrofóbica de 19 aminoácidos, SEQ ID NO: 2, una secuencia de unión de 10 aminoácidos, SEQ ID NO: 3 y una secuencia de un mayor carácter anfipático de 6 aminoácidos, SEQ ID NO: 4, unidas covalentemente en ese orden, y que en conjunto modulan la actividad de la proteína tirosina quinasa Lck de linfocitos T.
    Formula molecular: C190H313N41O49S1
    Peso molecular: 3987.89 g/mol
    Punto isoeléctrico: 4.54
    Carga: -1
    Este compuesto es de origen peptídico y consta de aminoácidos no modificados que facilitan su síntesis química.
  2. El péptido quimérico de la reivindicación 1, CARACTERIZADO POR tener una secuencia hidrofóbica, SEQ ID NO: 2, contigua a una secuencia anfipática, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, que permite su localización en los subcompartimentos membranales denominados “balsas lipídicas” (en inglés, lipid rafts) que funcionan como plataformas de señalización celular en linfocitos.
  3. El péptido quimérico de la reivindicación 1 CARACTERIZADO POR tener una secuencia de unión a p56Lck, SEQ ID NO: 3, que permite la modulación de la actividad enzimática de Lck, proteína tirosina quinasa localizada en las balsas lipídicas e importante en la activación y funcionalidad de los linfocitos T.
  4. El péptido quimérico de la reivindicación 1 CARACTERIZADO POR tener una secuencia de unión a p56Lck, SEQ ID NO: 3, que modula la actividad enzimática de la Lck, inhibiendo la proliferación de células Jurkat, una línea leucémica de células T, establecida in vitro de un paciente con leucemia.
  5. El péptido quimérico de la reivindicación 1 y 2 CARACTERIZADO POR que constituye una herramienta molecular para localizar blancos terapéuticos en cáncer (oncogenes) asociados a la membrana plasmática, específicamente en las balsas lipídicas.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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HARTLEY D. A. ET AL.: "Activation of the Lck Tyrosine Protein Kinase by the Herpesvirus Saimiri Tip Protein Involves Two Binding Interactions.", VIROLOGY, vol. 276, 2000, pages 339 - 348, XP004435842 *
VERNOT J. P . ET AL.: "Modulación de la señalización de p56Lck en células T por un motivo de la proteína Tip del virus Herpes virus Saimiri.", REV FAC MED., vol. 60, no. 2, 2012, pages 129 - 130 *
VERNOT J. P . ET AL.: "Modulating p56Lck in T-Cells by a Chimeric Peptide Comprising Two Functionally Different Motifs of Tip from Herpesvirus saimiri.", JOURNAL OF IMMUNOLOGY RESEARCH, 30 October 2015 (2015-10-30), XP055392489 *
YOON D. W. ET AL.: "Tap: A Novel Cellular Protein That Interacts with Tip of Herpesvirus Saimiri and Induces Lymphocyte Aggregation.", IMMUNITY, vol. 6, May 1997 (1997-05-01), pages 571 - 582, XP055392499 *

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