WO2017091043A1 - 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템 - Google Patents

관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템 Download PDF

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WO2017091043A1
WO2017091043A1 PCT/KR2016/013732 KR2016013732W WO2017091043A1 WO 2017091043 A1 WO2017091043 A1 WO 2017091043A1 KR 2016013732 W KR2016013732 W KR 2016013732W WO 2017091043 A1 WO2017091043 A1 WO 2017091043A1
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WO
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microfluidic
channel
cell culture
substrate
fluid
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PCT/KR2016/013732
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English (en)
French (fr)
Inventor
고정상
전형진
김문정
박동혁
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University Industry Cooperation Foundation of Pusan National University
Original Assignee
University Industry Cooperation Foundation of Pusan National University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/10—Perfusion

Definitions

  • the present invention relates to a system for cell culture, and more particularly, to a perfusion cell culture system using a microfluidic system to enable 3D cell culture.
  • the existing cell culture experiments can be said to be an experiment in a different environment than in vivo to grow and observe the cells while periodically changing the culture medium on a common plate (plate).
  • micro fluidic systems grow cells through the flow of culture in a very small area of microunits.
  • the microfluidic system provides a bio-like physical environment due to the very small size of the microfluidic channels included in the system, providing sufficient oxygen and at the same time helping the diffusion of nutrients.
  • Such conditions provide more accurate experimental results by providing a more suitable environment for cells than typical macro-scale experiments in cell-related experiments.
  • Many studies have been conducted on cell chips for this purpose, but until now, many experiments have been conducted on 2D systems by coating on the surface of a microfluidic channel.
  • microfluidic technology that is, microfluidic system
  • 3D cell culture technology cell migration, cell interactions, and cell-cell interactions observed in various phenomena in the human body such as angiogenesis, immune response, and cancer metastasis Interaction with extracellular matrix can be directly observed and analyzed in high resolution, real time, and can be applied to a variety of physical and chemical stimuli to determine how a particular element, environment, or combination thereof affects the cell.
  • angiogenesis angiogenesis
  • immune response immune response
  • cancer metastasis Interaction with extracellular matrix can be directly observed and analyzed in high resolution, real time, and can be applied to a variety of physical and chemical stimuli to determine how a particular element, environment, or combination thereof affects the cell.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Registration 10-1412155
  • An object of the present invention is to provide a perfusion cell culture system capable of accurate concentration distribution and evaluation, and precisely simulated microenvironment.
  • the present invention relates to a perfusion cell culture system using a microfluidic channel system.
  • the present invention utilizes a microfluidic system.
  • Microfluidic system refers to a technology that controls the flow in an extremely miniaturized device, such as nanoliter or picoliter, of liquid or gas, which has a streamlined flow characteristic, large surface area, and greater inertia than macro systems. It shows unusual characteristics such as surface tension characteristics.
  • the present invention precisely distributes the correct nutrients to the cell culture system through this microfluidic system to enable control and evaluation of the perfusion cell culture system.
  • the perfusion cell culture system of the present invention includes a substrate; A microfluidic injection channel configured to guide a fluid in the substrate along a planar direction of the substrate; Two or more microfluidic branching channels branched into the microfluidic injection channel in the substrate; Microfluidic outlet channels extending in a direction from an end of each branch channel to an upper surface of the substrate to penetrate the upper surface of the substrate to form a through opening; And well plates located on an upper surface of the substrate and connected in fluid communication with each of the outlet channels.
  • Nutrients and / or oxygen necessary for cell culture are supplied to the well plates through the microfluidic channels, and the cells are cultured in the well plates.
  • the culture of the well plate is discharged through the discharge means at the top of the well plate. This provides a perfusion system that continues to be supplied to the microchannels and continues to be discharged through the discharge means.
  • the branch channels are different in length from each other, and are configured to have different flow rates between the branch channels according to the Poiseuille law.
  • the law of fool-guilt is shown in Equation 1 below.
  • R is the resistance
  • P is the pressure drop
  • Q is the flow rate
  • d is the diameter of the channel
  • ⁇ is the viscosity coefficient
  • L is the length of the channel.
  • each branch channel is configured such that the flow rate into the branch channel increases linearly or decreases linearly with respect to the order of the flow direction of the fluid in the injection channel.
  • the difference in flow rate per branch channel is set to increase or decrease linearly, which facilitates comparative evaluation of the feed nutrients of each wellplate.
  • the substrate of the present invention includes an inlet channel for injecting microfluid into the injection channel, and includes a bubble tab between the inlet channel and the injection channel.
  • the bubble tap is, for example, a macro-sized space formed on the side of the microchannel and formed higher than the channel. If a gas (bubble) is contained in the fluid flowing through the microchannel, the bubble gas meets this space and the bubble rises and exits the space and the fluid continues to move into the microchannel.
  • the upper surface of the substrate has a plurality of cavities, through-holes formed by the outlet channels are formed in the inner surface of the cavity, and the bottom of the well plate has two or more holes, and the longest width of the cavity is the well.
  • the well plate is smaller than the shortest width of the lower surface of the plate and forms a space formed between the lower surface of the well plate and the cavity while the well plate is positioned above the cavity, and the fluid discharged from the through opening is stored in the cavity space, and the fluid of the cavity is stored in the well. And flows into the well plate through one or more openings on the bottom surface of the plate.
  • the well plate includes an opening on top of its sidewalls and is configured to discharge the well plate culture of the well plate through the opening.
  • the substrate further comprises a second microfluidic injection channel and two or more second microfluidic branching channels branched to the second microfluidic injection channel on the other side of the wellplate row that is not located on the injection channel; End portions of the two branch channels are joined to the end portions of the branch channel, and is connected in fluid communication with the microfluidic outlet channel.
  • the second branch channels are different in length from each other, and are configured to have different flow rates between the second branch channels according to the Poiseuille law.
  • each second branch channel is configured such that the flow rate into the second branch channel increases or decreases linearly with respect to the order of the flow direction of the fluid in the injection channel.
  • the substrate includes an inlet channel for injecting microfluid into the injection channel, and includes a bubble tab between the inlet channel and the injection channel.
  • the mixing channel includes a meander section, thereby improving the efficiency of mixing.
  • the perfusion cell culture system of the present invention is controllable and configured to compare and observe the nutritional component according to the exact concentration distribution, and can observe and evaluate tumor proliferation for various nutritional component and oxygen concentration inputs.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view showing the configuration of the perfusion cell culture microfluidic system of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view of an upper plate of the substrate shown in FIG. 1.
  • FIG. 3 is a bottom perspective view of the upper plate of the substrate shown in FIG. 1.
  • FIG. 4 is a plan view of the cell culture kit shown in FIG. 1.
  • FIG. 5 is a bottom perspective view of the cell culture kit shown in FIG. 1.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view showing a state in which the cell culture kit is coupled to the substrate shown in FIG.
  • Figure 7 shows the test results of whether the fluid is correctly supplied at different flow rates through the perfusion cell culture microfluidic system according to the present invention.
  • Figure 8a shows the test results of whether the fluid is supplied at the correct concentration distribution when the fluid is injected through the perfusion cell culture microfluidic system according to the present invention.
  • FIG. 8B is a graph showing the results of quantitative analysis of the fluid in each well plate according to the test of FIG. 8A.
  • FIG. 9A shows the well plates injected with different concentrations of the culture solution and the drug.
  • Figure 9b is a graph showing the result of confirming the amount of DNA extracted from the culture in each well plate shown in Figure 9a through PI staining.
  • Figure 9c is a graph showing the protein quantitative analysis results contained in cells according to the concentration of the drug supplied into each well plate.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating a mixing channel of the present invention.
  • FIG. 11 is a view showing mixing efficiency according to the bending characteristics of the mixing channel of the present invention.
  • FIG. 12 is a photograph showing the state of injection into the system of the present invention through a syringe pump (Harvard PHD 2000) for quantitatively injecting the fluid used in Example 2.
  • FIG. 12 is a photograph showing the state of injection into the system of the present invention through a syringe pump (Harvard PHD 2000) for quantitatively injecting the fluid used in Example 2.
  • Example 13 is a photograph showing the results of fluorescence analysis of Example 2.
  • FIG. 14 is a photograph of a standard sample prepared for the calibration curve preparation of Example 2.
  • FIG. 16 (a) is a result of fluorescence analysis of Example 2, and FIG. 16 (b) is a result expressed in concentration ratio by fitting to a calibration curve.
  • FIG. 18 is a photograph showing that in the case of the system of the present invention to which the bubble trap is applied, the bubbles injected together with the injection fluid after the syringe is replaced are collected in the bubble trap.
  • 19 and 20 show the system of the present invention used in Example 2 containing a mixing channel.
  • first and second may be used to describe various components, but the components should not be limited by the terms. The terms are used only for the purpose of distinguishing one component from another.
  • the first component may be referred to as the second component, and similarly, the second component may also be referred to as the first component.
  • FIG. 1 is a view showing the configuration of the perfusion cell culture microfluidic system of the present invention
  • Figure 2 is a plan view of the top plate of the substrate shown in Figure 1
  • Figure 3 is a bottom perspective view of the top plate of the substrate shown in Figure 1
  • 4 is a plan view of the cell culture kit shown in FIG. 1
  • FIG. 5 is a bottom perspective view of the cell culture kit shown in FIG.
  • a perfusion cell culture microfluidic system includes a substrate 100, a microfluidic injection channel 210, a microfluidic branching channel 220, and a microfluidic outlet. Channels 230 and well plates 310.
  • Substrate 100 is a micro fluid injection channel 210, micro fluid branching channels 220 and micro fluid outlet channels 230 to supply a fluid, that is, nutrients required for cell culture to the well plates 310 This is the fluid supply plate that is formed.
  • the substrate 100 has a predetermined thickness to form the microfluidic injection channel 210, the microfluidic branch channels 220, and the microfluidic outlet channels 230 therein.
  • the substrate 100 may be formed of an upper plate 100a and a lower plate 100b having a rectangular plate shape having a predetermined length.
  • the microfluidic injection channel 210, the microfluidic branch channels 220, and the microfluidic outlet channels 230 may be formed on the upper plate 100a or the lower plate 100b, preferably the well plates. It may be formed on the lower surface of the upper plate (100a) to facilitate the supply of fluid to the (310).
  • the upper plate 100a and the lower plate 100b may be stacked and integrated.
  • the substrate 100 may be integral and the channels may be formed inside the substrate.
  • the microfluidic injection channel 210 is configured to guide the fluid injected into the substrate 100 along the planar direction of the substrate 100.
  • the microfluidic injection channel 210 may be engraved on the bottom surface of the upper plate 100a of the rectangular plate shape constituting the substrate 100 to guide the fluid in the long axis direction of the rectangular plate shape.
  • the microfluidic branch channels 220 supply the fluid flowing along the microfluidic injection channel 210 at a predetermined flow rate toward the microfluidic outlet channels 230.
  • the microfluidic branch channels 220 may consist of two or more channels branched to the microfluidic injection channel 210, wherein each of the microfluidic branch channels 220 is separated from the microfluidic injection channel 210. Extend toward the microfluidic outlet channels 230.
  • the microfluidic branch channels 220 may be configured to have different flow rates between the branch channels according to the Poiseuille law.
  • the law of fool-guilt is the same as Equation 1 described above.
  • the fluid flowing through the microfluidic injection channel 210 is divided into the microfluidic branch channels 220 and flows into the microfluidic branch channels 220 depending on the length of each microfluidic branch channel 220.
  • the microfluidic branching channels 220 are designed according to the Poisson's law, such that the flow rate of the microfluidic branching channels 220 increases or decreases linearly with respect to the order according to the flow direction of the fluid of the injection channel.
  • the length of the fluid branch channel 220 may be configured.
  • the microfluidic branch channels 220 may be formed in four, and the length of each of the four microfluidic branch channels 220 may be sequentially set to 69 mm, 40 mm, 21 mm, and 16 mm according to the flow direction of the fluid.
  • the flow rate of the fluid is such that a 69 mm channel provides a flow rate of 40%, a 40 mm channel flows 30%, a 21 mm channel flows 20%, and a 16 mm channel flows 10%. This may be configured in a linear decreasing form.
  • microfluidic branching channels 220 facilitates a comparative evaluation of the feed nutrients of each well plate 310.
  • microfluidic outlet channels 230 discharge fluid moving along the microfluidic branch channels 220 toward the well plates 310.
  • the microfluidic outlet channels 230 extend in the direction of the top surface of the substrate 100 at the end of each microfluidic branch channel 220 to form a through opening through the top surface of the substrate 100.
  • These microfluidic outlet channels 230 are arranged along the flow direction of the fluid.
  • the substrate 100 includes an inflow channel 110 and a cavity 120 to continuously supply the fluid to the well plates 310 from the time when the fluid is supplied into the substrate 100.
  • Inlet channel 110 is a channel for injecting fluid into the microfluidic injection channel 210.
  • the inflow channel 110 penetrates toward the microfluid injection channel 210 from the end of the fluid inlet 111 and the end of the fluid inlet 111 extending from the side of the substrate 100 toward the inside of the substrate 100.
  • the fluid inlet 111 may be positioned higher than the micro fluid injection channel 210, and may have a form of a thread formed on an inner surface thereof so that an adapter connected to a hose for supplying fluid may be coupled.
  • the cavity 120 is a space in which the fluid discharged from the microfluidic outlet channels 230 collects.
  • the cavity 120 may be equal to the number of microfluidic outlet channels 230, and each cavity 120 is formed on the top surface of the substrate 100 to be positioned above the microfluidic outlet channels 230. .
  • the longest width of the cavity 120 is smaller than the shortest width of the bottom surface of the well plate 310, so that the space between the bottom surface of the well plate 310 and the inner surface of the cavity 120 is formed while the well plate 310 is positioned above the cavity 120.
  • the through openings formed by the microfluidic outlet channels 230 are formed on the inner surface of the cavity 120. As a result, fluid discharged from the microfluidic outlet channels 230 may be stored in the cavity 120.
  • the well plates 310 store cells for culture, and supply the fluid for cell culture through the microfluidic injection channel 210, the microfluidic branch channels 220, and the microfluidic outlet channels 230. Receive. To this end, the well plates 310 are formed on the upper surface of the substrate 100 in the same number as the number of the microfluidic outlet channels 230 and are connected in fluid communication with the respective microfluidic outlet channels 230. .
  • Figure 6 is a cross-sectional view showing a state in which the cell culture kit is coupled to the substrate shown in Figure 1, this state is shown well in FIG.
  • the well plates 310 may include a bottom plate 311 constituting a bottom surface of the well plate 310 and a sidewall 312 extending vertically from the bottom plate 311.
  • the well plates 310 may have an opening 312a formed at an upper end of the sidewall 312 so that the culture in the well plates 310 may be discharged, and the bottom plate 311 may include one or more openings 311a.
  • One or more openings 311a may be in fluid communication with the cavity 120 of the substrate 100 so that fluid in the cavity 120 may enter the well plates 310 through the one or more openings 311a. have.
  • the well plates 310 may be provided as one cell culture kit 300.
  • the cell culture kit 300 may be in the form of constituting a plurality of cells (cell) for cell culture. Some of the cells that make up the cell culture kit 300 may be composed of well plates 310 connected to the microfluidic outlet channels 230, and some of the remaining cells may be formed of the well plates 310.
  • the culture receiving cell 320 may be configured to receive a culture discharged through the opening 312a at the top of the sidewall 312.
  • the culture receiving cell 320 may have a form including a bottom plate 321 and sidewalls 322 to form the same shape as the well plates 310, for example, two, each culture
  • the bottom plate 321 of the receiving cell 320 may be formed with a discharge hole (321a) for discharging the supplied culture.
  • the well plates 310 may be arranged to constitute one row among the plurality of cells of the cell culture kit 300, and the culture receiving cell 320 may be different. May be arranged in columns.
  • an opening 322a formed by cutting from the top of the sidewall 322 to the bottom plate 321 may be formed in the sidewall 322 of the culture accommodation cells 320, and the culture accommodation cells 320 may be formed.
  • the bottom between the disposed row and the row of well plates 310 may be blocked, and the opening 312a formed in the sidewall 312 of the well plates 310 faces the culture receiving cells 320.
  • Discharge holes 322a disposed on the sidewalls 322 of the culture accommodation cells 320 may be disposed to face the well plates 310.
  • the culture discharged from the well plates 310 by this structure may be introduced into the culture receiving cells 320.
  • the fluid can provide a perfusion system that continues to be supplied to the microchannels and continues to be discharged through the discharge means.
  • the substrate 100 includes a bubble tab 130.
  • Bubble tab 130 is a space for receiving the bubbles contained in the fluid injected through the inlet channel (110).
  • the bubbletab 130 may be positioned on the path of the microfluidic injection channel 210.
  • the bubble tab 130 may be disposed at the end of the microfluid injection channel 210 connected to the inlet channel 110 so as to be disposed between the inflow channel 110 and the microfluid injection channel 210 for injecting the microfluid.
  • the bubble tab 130 may be formed higher than the micro fluid injection channel 210.
  • the bubble tap 130 includes gas (bubble) in the fluid injected from the inflow channel 110 to the microfluidic injection channel 210, the bubble gas meets the bubble tap 130 and the bubble gas is As it rises into and exits the bubble tap 130, the fluid moves into the microfluidic injection channel 210.
  • gas bubble
  • the perfusion cell culture microfluidic system may include a second microfluid injection channel 240, second microfluidic branch channels 250, a second inflow channel 140, and a second bubbletab 150. ).
  • the second microfluidic injection channel 240 is configured to guide the fluid injected into the substrate 100 along the planar direction of the substrate 100, such as the microfluidic injection channel 210.
  • the second microfluidic injection channel 240 may be located on the other side of the substrate 100 in which the injection channel 210 is not located, or in the same side, the second microfluid injection channel 240 may be positioned to sandwich the rows in which the well plates are placed. .
  • the second microfluidic injection channel 240 is parallel to the microfluidic injection channel 210 and is engraved on the lower surface of the upper plate 100a of the rectangular plate shape constituting the substrate 100 in the longitudinal direction of the rectangular plate shape.
  • the fluid can be guided.
  • the second microfluidic injection channel 240 may guide the fluid in a direction opposite to the flow direction of the fluid flowing along the microfluidic injection channel 210.
  • the second microfluidic branch channels 250 divide and supply the fluid flowing along the second microfluid injection channel 240 at a predetermined flow rate toward the microfluidic outlet channels 230.
  • the second microfluidic branching channels 250 may be formed of two or more channels branched to the second microfluidic injection channel 240, wherein each of the second microfluidic branching channels 250 may be a second channel. It extends from the microfluidic injection channel 240 toward the microfluidic outlet channels 230. That is, the ends of the second microfluidic branch channels 250 are joined to the ends of the microfluidic branch channels 220 and are connected in fluid communication with the microfluidic outlet channels 230.
  • the second microfluidic branch channels 250 may be configured to be different in length from each other so that flow rates between the branch channels are different according to the Poisson's law. That is, the flow rate into the second microfluidic branch channels 250 is increased or decreased linearly with respect to the order of the flow direction of the fluid of the second microfluidic injection channel 240. Length can be configured. Since the configuration of the second microfluidic branch channels 250 is the same as that of the microfluidic branch channels 220, a detailed description thereof will be omitted.
  • the second inflow channel 140 is a channel for injecting fluid into the second microfluidic injection channel 240.
  • the second inflow channel 140 may include a second fluid injection hole extending toward the inside of the substrate 100 from the other side of the substrate 100, that is, the side opposite to the side on which the inflow channel 110 is formed. 141 and a second opening 142 penetrated from the end of the second fluid inlet 141 toward the second microfluid injection channel 240. Since the shape of the second fluid inlet 141 is the same as that of the fluid inlet 111, a detailed description thereof will be omitted.
  • the second bubble tab 150 is a space for receiving the bubbles contained in the fluid injected through the second inflow channel 140.
  • the second bubbletab 150 may be positioned on a path of the second microfluidic injection channel 240.
  • the second bubble tab 150 is connected to the second inflow channel 140 to be disposed between the second inflow channel 140 and the second microfluid injection channel 240 for injecting the microfluid.
  • 2 may be positioned at the end of the micro fluid injection channel 240, wherein the second bubble tap 150 may be formed higher than the second micro fluid injection channel 240.
  • the bubble gas When a gas (bubble) is included in the fluid injected from the second inflow channel 140 to the second microfluid injection channel 240 by the second bubble tap 150, the bubble gas is formed in the second bubble tap ( 150, the bubble gas rises into and exits the second bubble tap 150, and the fluid moves into the second microfluid injection channel 240.
  • a gas bubble
  • nutrients and oxygen required for cell culture can be provided in different precise concentration distributions into each well plate 310 for culturing cells, and at different concentrations.
  • the proliferation of each cultured cell can be observed and evaluated routinely by the flow rate of the fluid dispensed and supplied.
  • FIG. 10 illustrates the system of the present invention further comprising a mixing channel.
  • 20 illustrates a state in which FIG. 19 is coupled.
  • 10 shows an enlarged view of the branch channel.
  • the mixing channel 1010 is further included from the branch point of the branch channel end and the end of the second branch channel to the microfluidic outlet channel.
  • the mixing channel 1010 may be located at the same level as the fluid injection channels and the branching channels, the end of the mixing channel is connected to the start point of the outlet channel and the outlet channel extends in the thickness direction of the substrate so that the top surface of the substrate Penetrates.
  • the mixing channel includes a meander section.
  • the grain section means a section having a serpentine shape as illustrated in FIG. 10, and facilitates mixing of different fluids introduced into the two channels, thereby reducing the length of the mixing channel.
  • the design of the channel of 120 mm is made to confirm that the mixing is performed according to the design.
  • the CV Coefficient of variation
  • the length of the channel is long.
  • the bending shape further applies the mixing according to the flow (fluid convection) in the channel, so that the CV falls below 5% at 60 mm and is uniformly mixed. You can check it. That is, in the case of applying the mixing channel of the grain form, even if the length of 60 mm can be seen evenly mixed, the length of the channel also has the advantage of reduced.
  • FIG. 1 The system illustrated in FIG. 1 was fabricated to evaluate the system of the present invention.
  • Figure 7 shows the test results of whether the fluid is correctly supplied at different flow rates through the perfusion cell culture microfluidic system according to the present invention. The dye was used for the test of FIG.
  • FIG. 7A illustrates test results when a blue dye is injected through the inlet channel 110, and each cavity 120 is shown through the microfluidic outlet channels 230 as shown. It can be seen that the flow rate of the fluid discharged divided into the gradual decrease with respect to the order according to the flow direction of the fluid.
  • FIG. 7B illustrates a case where yellow dye is injected through the second inflow channel 140, and is divided into the respective cavity 120 through the microfluidic outlet channels 230 as shown. It can be seen that the flow rate of the discharged fluid gradually decreased with respect to the order according to the flow direction of the fluid.
  • FIG. 7 (c) shows a case where blue dye and yellow dye are injected through the inflow channel 110 and the second inflow channel 140, respectively, and the microfluidic outlet channels as shown in FIG.
  • the flow rate of the fluid discharged by dividing into each cavity 120 through 230 is linearly decreased in the order of the flow direction of the microfluid injection channel 210 and the flow direction of the second microfluid injection channel 240, respectively. You can see that.
  • Figure 8a shows the test results of whether the fluid is supplied at the correct concentration distribution when the fluid is injected through the perfusion cell culture microfluidic system according to the present invention.
  • ultrapure water DI-water
  • bromine phenol blue Bromphenol blue
  • FIG. 8B is a graph showing the results of quantitative analysis of the fluid in each well plate according to the test of FIG. 8A.
  • the perfusion cell culture microfluidic system according to the present invention can be effectively used for three-dimensional perfusion cell culture experiments. To confirm this, while continuously injecting the culture solution and the drug (hydrogen peroxide solution) to confirm the cell death results according to the concentration of the drug.
  • Figure 9a shows the state in which the culture medium and the drug is injected into the correct concentration distribution different from the well plate
  • Figure 9b is a graph showing the result of confirming the amount of DNA extracted from the culture in each well plate through PI staining
  • Figure 9c is a graph showing the protein quantitative analysis results contained in cells according to the concentration of the drug supplied into each well plate.
  • a syringe pump such as the photograph of FIG. 12 (Harvard PHD 2000 ) was used. Two 10 ml syringes were used for long infusion. The experiment was prepared by connecting the syringe and the device using a silicon tube. In addition, a pipette and a 96 well plate were prepared so that the fluid from each well of the device could be collected at a predetermined time for fluorescence analysis.
  • One syringe was injected with DI water into the first microfluid injection channel, and the other syringe was injected with a mixture of methanol and ultrapure water in which fluorescent substance rhodamine 110 was dissolved into the second microfluid injection channel.
  • the channel was filled with ultrapure water so that the concentration gradient functioned smoothly as soon as the pump was running. If the channel is not filled with ultrapure water, the inside of the bubble trap is placed in a bubble-filled environment before the experiment, making it difficult to achieve normal concentration gradient operation. Therefore, the syringe pump was operated in an environment filled with ultrapure water to check the function of the concentration gradient and bubble trap of rhodamine 110.
  • Samples collected in 96 well plates were fluorescence analyzed using a FLUOstar OPTIMA microplate reader. Considering that the excitation and emission wavelengths of rhodamine 110 are 496 and 520 nm, respectively, the excitation and emission wavelengths of the reader are set to 485 and 520 nm, and the gain value is set to 100. The luminous intensity of rhodamine 110 was measured.
  • the perfusion cell culture microfluidic system according to the present invention can observe various cell cultures and cell proliferation, and can quantitatively evaluate cell proliferation.
  • the microenvironment in the living body can be simulated to observe and evaluate tumor proliferation in the living body.

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Abstract

관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템이 개시된다. 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템은, 기판; 상기 기판 내에 상기 기판의 평면 방향에 따라 유체를 가이드하도록 구성된 마이크로 유체 주입채널; 상기 기판 내에 상기 마이크로 유체 주입 채널에 분지된 둘 이상의 마이크로 유체 분지채널들; 상기 각 분지채널의 종단부에서 상기 기판의 상면으로 방향으로 연장되어 상기 기판의 상면을 관통하여 관통개구를 형성하는 마이크로 유체 출구채널들; 및 상기 기판의 상면에 위치하고 상기 각 출구채널과 유체 소통가능하도록 연결된 웰플레이트들을 포함한다. 이러한 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템은 마이크로 유체 시스템을 이용한다. 마이크로 유체 시스템은 극소량(나노리터 또는 피코리터 정도)의 액체나 기체를 극히 소형화시킨 장치 내에서 그 흐름을 제어하는 기술을 의미하는 것으로 매크로 시스템과는 달린 유선형 흐림, 큰 표면적 특성 및 관성보다 큰 표면장력 등의 특이한 특성을 보여준다. 본 발명은 이러한 마이크로 유체 시스템을 통해 정확한 영양분을 세포 배양 시스템에 정밀 분배하여 관류 세포 배양 시스템의 제어 및 평가를 가능하게 한다.

Description

관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템
본 발명은 세포 배양을 위한 시스템에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 3D 세포 배양이 가능하도록 마이크로 유체 시스템을 이용한 관류 세포 배양 시스템에 관한 것이다.
종래의 세포배양기술로 배양한 세포는 세포가 2차원 방향으로 퍼진 단층세포이기 때문에, 생체 내와 동등한 3차원 조직을 구축할 수 없고, 세포가 체내에서 갖고 있는 특이적인 기능을 장시간 유지할 수 없으며, 이에 따라 시뮬레이션의 정밀도가 보장되지 않는 문제가 있다.
한편, 기존의 세포배양(cell culture) 실험은 일반적인 플레이트(plate) 위에서 주기적으로 배양액을 갈아주면서 세포를 성장시키고 관찰하는 생체 내와는 다른 환경의 실험이라고 할 수 있다. 그에 비해 마이크로 유체 시스템(micro fluidic system)은 마이크로 단위의 아주 작은 영역 에서 배양액의 흐름을 통해 세포를 성장시킨다. 마이크로 유체 시스템은 시스템 내에 포함되어 있는 마이크로 유체 채널들의 매우 작은 사이즈로 인해 생체와 비슷한 물리적 환경을 제공하고 충분한 산소를 공급하는 동시에 빠른 영양분의 확산을 도와준다. 그러한 조건은 세포관련 실험에 있어 일반적인 매크로 스케일의 실험보다 세포에 적합한 환경을 제공함으로서 보다 정확한 실험 결과를 얻을 수 있다. 이를 위한 셀 칩과 관련한 많은 연구들이 이루어지고 있으나 현재까지는 마이크로 유체 채널 (micro fluidic channel) 표면 위의 코팅을 통한 2D 상의 시스템의 세포실험이 많이 이 루어지고 있다.
그러나 이러한 2D 실험 은 제대로 된 결과를 얻을 수 없다. 생체는 기본적으로 3D상의 환경이기 때문이다. 세포는 주위 환경의 아주 미세한 변화에도 민감하게 반응하여 전혀 다른 실험 결과를 보일 수 있다. 그리하여 최근 3D 환경에서 세포를 배양하기 위한 연구들이 진행되고 있다.
따라서, 3차원 세포배양기술에 미세유체기술, 즉 마이크로 유체 시스템이 통합될 경우, 혈관신생, 면역반응, 암의 전이 등 인체 내 다양한 현상에서 관찰되는 세포의 이동, 세포간의 상호작용, 세포와 세포외기질(Extracellular matrix)과의 상호 작용을 고해상도 실시간으로 바로 관찰하고 분석할 수 있으며, 다양한 물리적, 화학적 자극을 가할 수 있어, 특정한 요소, 환경 등이 혹은 그 조합이 세포에 어떠한 방식으로 영향을 미치는지 체계적인 연구가 가능한 장점이 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 대한민국 등록특허 10-1412155
본 발명의 목적은 정확한 농도 분배 및 평가가 가능하고 미세환경이 정밀하게 모사된 관류 세포 배양 시스템을 제공함에 있다.
본 발명은 마이크로 유체 채널 시스템을 이용한 관류 세포 배양 시스템에 관한 것이다.
본 발명은 마이크로 유체 시스템을 이용한다. 마이크로 유체 시스템은 극소량(나노리터 또는 피코리터 정도)의 액체나 기체를 극히 소형화시킨 장치 내에서 그 흐름을 제어하는 기술을 의미하는 것으로 매크로 시스템과는 달린 유선형 흐름 특성, 큰 표면적 특성 및 관성보다 큰 표면장력 특성 등의 특이한 특성을 보여준다. 본 발명은 이러한 마이크로 유체 시스템을 통해 정확한 영양분을 세포 배양 시스템에 정밀 분배하여 관류 세포 배양 시스템의 제어 및 평가를 가능하게 한다.
본 발명의 관류 세포 배양 시스템은, 기판; 상기 기판 내에 상기 기판의 평면 방향에 따라 유체를 가이드하도록 구성된 마이크로 유체 주입채널; 상기 기판 내에 상기 마이크로 유체 주입 채널에 분지된 둘 이상의 마이크로 유체 분지채널들; 상기 각 분지채널의 종단부에서 상기 기판의 상면으로 방향으로 연장되어 상기 기판의 상면을 관통하여 관통개구를 형성하는 마이크로 유체 출구채널들; 및 상기 기판의 상면에 위치하고 상기 각 출구채널과 유체 소통가능하도록 연결된 웰플레이트들을 포함하는, 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템을 제공한다.
상기 마이크로유체채널들을 통해 세포 배양에 필요한 영양분 및/또는 산소가 웰플레이트로 공급되고 상기 웰플레이트에서는 세포가 배양된다. 웰플레이트 상단에 상단의 배출수단을 통해 웰플레이트의 배양물을 배출된다. 이처럼 마이크로채널들로 계속 공급되고 배출수단을 통해 계속 배출되는 관류 시스템을 제공한다.
상기 분지채널들은 서로 길이가 상이하여 푸아죄유(poiseuille) 법칙에 따라 각 분지 채널간의 유량이 상이하도록 구성된다. 푸아죄유 법칙은 아래 수학식1과 같다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2016013732-appb-I000001
여기서, R : 저항, P : 압력강하, Q : 유량, d : 채널의 직경, μ : 점성계수, L : 채널의 길이이다.
푸아죄유 법칙에 따라, 마이크로 채널의 길이 별로 상이한 유량이 공급된다. 즉, 본 발명의 주입채널을 통해 흐르는 유체는 이의 분지채널들로 나뉘어 유입되는데 분지채널의 길이에 따라 나뉘어 유입되는 유량이 차이가 난다.
상기 분지채널로의 유량이 상기 주입채널의 유체의 흐름 방향에 따른 순서에 대해 선형 증가 또는 선형 감소하도록, 상기 각각의 분지채널의 길이가 구성되어 있음을 특징으로 한다. 분지 채널별 유량의 차이가 선형 증가 또는 감소토록 설정함을 일 특징으로 하며, 이는 각 웰플레이트의 공급 영양분의 비교 평가를 용이하게 한다.
본 발명의 상기 기판은 상기 주입채널로 마이크로유체를 주입하는 유입채널을 포함하고, 상기 유입채널과 상기 주입채널 사이에 버블트탭을 포함함을 특징으로 한다. 버블트탭은 예를 들어 마이크로채널의 측면에 형성된 매크로 크기의 공간으로서 채널보다 높게 형성된 공간이다. 마이크로 채널을 통해 흐르는 유체 내에 기체(버블)이 포함되어 있으면 그 버블 기체는 이 공간을 만나게 되어 버블을 그 공간 내로 상승해 빠져나가고 유체는 계속 마이크로 채널 내로 이동하게 된다.
상기 기판 상면은 다수의 캐비티(cavity)를 가지며, 상기 출구채널들에 의한 관통개구들은 상기 캐비티의 내면에 형성되어 있고, 상기 웰플레이트 하면은 둘 이상의 구멍을 가지고, 상기 캐비티의 최장 너비는 상기 웰플레이트 하면의 최단 너비보다 작아 상기 웰플레이트가 상기 캐비티 위에 위치하면서 웰플레이트 하면과 캐비티 내면이 이루는 공간을 형성하며, 상기 캐비티 공간에 상기 관통개구로부터 유출된 유체가 저장되고 이 캐비티의 유체가 상기 웰플레이트 하면의 하나 이상의 개구를 통해 상기 웰플레이트로 유입됨을 특징으로 한다.
상기 웰플레이트는 이의 측벽 상단에 개구를 포함하고, 상기 개구를 통해 웰플레이트의 웰플레이트 배양물이 배출되도록 구성된다.
상기 기판은 상기 웰플레이트 열의 상기 주입채널의 위치하지 않은 다른 측에 제2 마이크로 유체 주입채널 및 상기 제2 마이크로 유체 주입 채널에 분지된 둘 이상의 제2 마이크로 유체 분지채널들을 추가로 포함하며, 상기 제2 분지채널의 종단부는 상기 분지채널의 종단부와 합류되어, 상기 마이크로유체 출구채널에 유체소통가능하게 연결되어 있음을 특징으로 한다.
상기 제2 분지채널들은 서로 길이가 상이하여 푸아죄유(poiseuille) 법칙에 따라 각 제2 분지 채널간의 유량이 상이하도록 구성된다.
상기 제2 분지채널로의 유량이 상기 주입채널의 유체의 흐름 방향에 따른 순서에 대해 선형 증가 또는 선형 감소하도록, 상기 각각의 제 2 분지채널의 길이가 구성되어 있음을 특징으로 한다.
상기 기판은 상기 주입채널로 마이크로유체를 주입하는 유입채널을 포함하고, 상기 유입채널과 상기 주입채널 사이에 버블트탭을 포함한다.
상기 분지채널 종단부 및 상기 제2 분지채널의 종단부의 합류지점부터 상기 마이크로유체 출구채널까지 혼합 채널을 추가로 더 포함함을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 혼합 채널은 곡류(Meander) 구간을 포함하여 혼합의 효율을 향상시킴을 특징으로 한다.
본 발명의 관류 세포 배양 시스템은, 정확한 농도 분배에 따른 영양 성분의 제공이 제어 가능하고 이를 비교 관찰할 수 있도록 구성되어 다양한 영양 성분 및 산소 농도 입력에 대한 종양 증식을 관찰하고 정략적으로 평가 가능하다.
도 1은 본 발명의 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템의 구성을 나타낸 분해 사시도이다.
도 2는 도 1에 도시된 기판의 상판의 평면도이다.
도 3은 도 1에 도시된 기판의 상판의 저면 사시도이다.
도 4는 도 1에 도시된 세포 배양 키트의 평면도이다.
도 5는 도 1에 도시된 세포 배양 키트의 저면 사시도이다.
도 6은 도 1에 도시된 기판 상에 세포 배양 키트가 결합된 상태를 나타낸 단면도이다.
도 7은 본 발명에 따른 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템을 통해 유체가 서로 다른 유량으로 정확히 공급되는지 여부의 테스트 결과를 나타낸다.
도 8a는 본 발명에 따른 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템을 통해 유체를 주입한 경우 정확한 농도 분배로 공급되는지 여부의 테스트 결과를 나타낸다.
도 8b는 도 8a의 테스트에 따른 각각의 웰플레이트 내의 유체를 정량적 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9a는 웰플레이트들에 배양액과 약물이 서로 다른 정확한 농도 분배로 주입된 상태를 나타낸다.
도 9b는 PI staining을 통해 도 9a에 도시된 각 웰플레이트 내의 배양물에서 추출된 DNA의 양을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9c는 각 웰플레이트 내로 공급된 약물의 농도에 따라 세포가 함유하고 있던 단백질 정량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 혼합 채널을 예시한 도면이다.
도 11은 본 발명의 혼합 채널의 굽이 특성에 따른 혼합 효율을 보여주는 도면이다.
도 12는 실시예2에서 사용한 유체를 정량적으로 주입하기 위한 시린지 펌프(Harvard PHD 2000)를 통해 본 발명의 시스템에 주입하고 있는 모습을 보여주는 사진이다.
도 13은 실시예2의 형광 분석의 결과를 보여주는 사진이다.
도 14는 실시예2의 검량선 제작을 위해 제조한 스탠다드 샘플의 사진이다.
도 15는 실시예2의 스탠다드 샘플을 통한 형광 분석의 광도 데이터를 그래프로 나타내어 2차 곡선의 검량선이 근사값 R2 = 0.9977를 보여주는 그래프이다.
도 16에서 도 16(a)는 실시예2의 형광 분석 결과이고, 도 16(b)는 검량선에 피팅하여 농도 비율로 나타낸 결과이다.
도 17은 버블트랩이 적용되지 않은 시스템에서 수행한 결과이다.
도 18은 버블트랩이 적용된 본 발명의 시스템의 경우, 시린지의 교체 이후 주입 유체와 함께 주입되는 기포가 버블트랩에 포집 되는 것을 보여주는 사진이다.
도 19 및 20은 혼합 채널을 함유하는 본 실시예2에서 사용된 본 발명의 시스템이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
도 1은 본 발명의 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템의 구성을 나타낸 도면이고, 도 2는 도 1에 도시된 기판의 상판의 평면도이고, 도 3은 도 1에 도시된 기판의 상판의 저면 사시도이고, 도 4는 도 1에 도시된 세포 배양 키트의 평면도이고, 도 5는 도 1에 도시된 세포 배양 키트의 저면 사시도이다.
도 1 내지 도 5를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템은, 기판(100), 마이크로 유체 주입채널(210), 마이크로 유체 분지채널들(220), 마이크로 유체 출구채널들(230) 및 웰플레이트들(310)을 포함한다.
기판(100)은 유체, 즉 세포 배양에 필요한 영양분을 웰플레이트들(310)로 공급하기 위해 상기 마이크로 유체 주입채널(210), 마이크로 유체 분지채널들(220) 및 마이크로 유체 출구채널들(230)이 형성되는 유체 공급 플레이트이다. 이러한 기판(100)은 상기 마이크로 유체 주입채널(210), 마이크로 유체 분지채널들(220) 및 마이크로 유체 출구채널들(230)을 내부에 형성하기 위해 소정의 두께를 갖는다. 일 예로, 기판(100)은 소정의 길이를 갖는 직사각형의 플레이트 형상으로 이루어진 상판(100a) 및 하판(100b)으로 이루어질 수 있다. 이러한 경우, 마이크로 유체 주입채널(210), 마이크로 유체 분지채널들(220) 및 마이크로 유체 출구채널들(230)은 상판(100a) 또는 하판(100b)에 형성될 수 있고, 바람직하게는 웰플레이트들(310)에 유체의 공급을 원활히 하기 위해 상판(100a)의 하면에 형성될 수 있다. 상판(100a) 및 하판(100b)는 포개져서 일체화될 수 있다. 다른 예로서, 기판(100)은 일체형이고, 상기 채널들은 기판 내부에 형성될 수 있다.
마이크로 유체 주입채널(210)은 기판(100) 내로 주입되는 유체를 기판(100)의 평면 방향에 따라 가이드하도록 구성된다. 예를 들면, 마이크로 유체 주입채널(210)은 기판(100)을 구성하는 직사각형 플레이트 형상의 상판(100a)의 하면에 음각 가공되어 직사각형 플레이트 형상의 장축 방향으로 유체를 가이드하도록 구성될 수 있다.
마이크로 유체 분지채널들(220)은 마이크로 유체 주입채널(210)을 따라 흐르는 유체를 마이크로 유체 출구채널들(230)을 향해 소정의 유량으로 나누어 공급한다. 이를 위해, 마이크로 유체 분지채널들(220)은 마이크로 유체 주입채널(210)에 분지된 둘 이상의 채널로 이루어질 수 있고, 이때 각각의 마이크로 유체 분지채널들(220)은 마이크로 유체 주입채널(210)로부터 마이크로 유체 출구채널들(230)을 향해 연장된다.
이러한 마이크로 유체 분지채널들(220)은 서로 길이가 상이하여 푸아죄유(poiseuille) 법칙에 따라 각 분지 채널간의 유량이 상이하도록 구성될 수 있다. 푸아죄유 법칙은 앞서 설명한 수학식1과 같다.
푸아죄유 법칙에 따라, 마이크로 채널의 길이 별로 상이한 유량이 공급된다. 즉, 마이크로 유체 주입채널(210)을 통해 흐르는 유체는 마이크로 유체 분지채널들(220)로 나뉘어 유입되는데 각 마이크로 유체 분지채널(220)의 길이에 따라 나뉘어 유입되는 유량이 차이가 난다.
마이크로 유체 분지채널들(220)은 푸아죄유 법칙에 따라 설계되어, 마이크로 유체 분지채널들(220)의 유량이 주입채널의 유체의 흐름 방향에 따른 순서에 대해 선형 증가 또는 선형 감소하도록, 각각의 마이크로 유체 분지채널(220)의 길이를 ㄱ구성시킬 수 있다.
예를 들면, 마이크로 유체 분지채널들(220)은 4개로 이루어질 수 있고, 4개의 마이크로 유체 분지채널(220) 각각의 길이는 유체의 흐름 방향에 따라 순차적으로 69mm, 40mm, 21mm, 16mm로 설정될 수 있고, 이러한 경우 69mm의 채널은 40%의 유량을, 40mm의 채널은 30%의 유량을, 21mm의 채널은 20%의 유량을, 16mm의 채널은 10%의 유량을 공급하도록 유체의 공급 유량이 선형 감소하는 형태로 구성될 수 있다.
이러한 마이크로 유체 분지채널들(220)의 설계는 각 웰플레이트(310)의 공급 영양분의 비교 평가를 용이하게 한다.
마이크로 유체 출구채널들(230)은 마이크로 유체 분지채널들(220)을 따라 이동하는 유체를 웰플레이트들(310) 방향으로 배출한다. 이를 위해, 마이크로 유체 출구채널들(230)은 각 마이크로 유체 분지채널(220)의 종단부에서 기판(100)의 상면 방향으로 연장되어 기판(100)을 상면을 관통하여 관통개구를 형성한다. 이러한 마이크로 유체 출구채널들(230)은 유체의 흐름 방향을 따라 배열된다.
한편, 기판(100)은 유체를 기판(100)의 내부로 공급하는 시점부터 웰플레이트들(310)까지 유체가 계속 공급되기 위해 유입채널(110) 및 캐비티(120)를 포함한다.
유입채널(110)은 마이크로 유체 주입채널(210)로 유체를 주입하기 위한 채널이다. 일 예로, 유입채널(110)은 기판(100)의 측면으로부터 기판(100)의 내부를 향해 연장된 유체주입구(111) 및 유체주입구(111)의 끝으로부터 마이크로 유체 주입채널(210)을 향해 관통된 개구(112)를 포함할 수 있다. 유체주입구(111)는 마이크로 유체 주입채널(210)보다 높게 위치할 수 있고, 유체의 공급을 위한 호스와 연결되는 어댑터가 결합될 수 있도록 내면에 나사산을 형성하는 형태일 수 있다.
캐비티(120)는 마이크로 유체 출구채널들(230)로부터 배출되는 유체가 모이는 공간이다. 캐비티(120)는 마이크로 유체 출구채널들(230)의 개수와 동일한 개수일 수 있고, 각각의 캐비티(120)는 마이크로 유체 출구채널들(230)의 위로 위치하도록 기판(100)의 상면에 형성된다. 이때, 캐비티(120)의 최장 너비는 웰플레이트(310) 하면의 최단 너비보다 작아 웰플레이트(310)가 캐비티(120) 위에 위치하면서 웰플레이트(310) 하면과 캐비티(120) 내면이 이루는 공간을 형성하며, 마이크로 유체 출구채널들(230)에 의한 관통개구들은 캐비티(120)의 내면에 형성된다. 이에 의해 캐비티(120) 내에 마이크로 유체 출구채널들(230)로부터 배출되는 유체가 저장될 수 있다.
웰플레이트들(310)은 배양을 위한 세포가 저장되며, 상기 마이크로 유체 주입채널(210), 마이크로 유체 분지채널들(220) 및 마이크로 유체 출구채널들(230)을 통해 세포 배양에 필요한 유체를 공급받는다. 이를 위해, 웰플레이트들(310)은 마이크로 유체 출구채널들(230)의 개수와 동일한 개수를 이루어 기판(100)의 상면에 위치하고 각각의 마이크로 유체 출구채널들(230)과 유체 소통가능하도록 연결된다. 도 6은 도 1에 도시된 기판 상에 세포 배양 키트가 결합된 상태를 나타낸 단면도로써, 이러한 모습은 도 6에 잘 나타나 있다.
이러한 웰플레이트들(310)은 웰플레이트(310)의 하면을 구성하는 바닥판(311) 및 바닥판(311)으로부터 수직하게 연장된 측벽(312)을 포함할 수 있다. 웰플레이트들(310)은 웰플레이트들(310) 내의 배양물이 배출되도록 측벽(312)의 상단에 개구(312a)가 형성되며, 바닥판(311)에 하나 이상의 개구(311a)를 포함할 수 있고, 하나 이상의 개구(311a)는 기판(100)의 캐비티(120)와 유체 소통 가능하게 연결되어 하나 이상의 개구(311a)를 통해 캐비티(120) 내의 유체가 웰플레이트들(310)로 유입될 수 있다.
한편, 이러한 웰플레이트들(310)은 하나의 세포 배양 키트(300)로서 제공될 수 있다. 세포 배양 키트(300)는 세포 배양을 위한 다수의 셀(cell)을 구성하는 형태일 수 있다. 세포 배양 키트(300)를 전체를 구성하는 셀들 중 일부는 마이크로 유체 출구채널들(230)과 연결되는 웰플레이트들(310)로 구성될 수 있고, 나머지 셀들 중 일부는 웰플레이트들(310)의 측벽(312)의 상단의 개구(312a)를 통해 배출되는 배양물을 공급받는 배양물수용셀(320)을 구성할 수 있다. 상기 배양물수용셀(320)은 웰플레이트들(310)과 동일한 형태를 이루도록 바닥판(321) 및 측벽(322)을 포함하는 형태일 수 있고, 예를 들면 2개일 수 있고, 각각의 배양물수용셀(320)의 바닥판(321)에는 공급된 배양물을 배출하는 배출구멍(321a)이 형성될 수 있다.
이러한 경우, 도 1에 도시된 바와 같이 웰플레이트들(310)은 세포 배양 키트(300)의 다수의 셀들 중 가운데의 1열을 구성하도록 배치될 수 있고, 상기 배양물수용셀(320)은 다른 열에 배치될 수 있다. 이때, 배양물수용셀들(320)의 측벽(322)에는 측벽(322)의 상단으로부터 바닥판(321)까지 절개하여 형성된 개구(322a)가 형성될 수 있고, 배양물수용셀들(320)이 배치된 열과 웰플레이트들(310)의 열 사이의 바닥은 막혀 있을 수 있고, 웰플레이트들(310)의 측벽(312)에 형성된 개구(312a)는 배양물수용셀들(320)을 향하도록 배치되고 배양물수용셀들(320)의 측벽(322)에 형성된 배출구멍(322a)은 웰플레이트들(310)을 향햐도록 배치될 수 있다. 이러한 구조에 의해 웰플레이트들(310)로부터 배출되는 배양물은 배양물수용셀들(320)의 내측으로 유입될 수 있다.
이와 같이 본 발명은 마이크로 유체 채널들을 통해 세포 배양에 필요한 영양분 및 산소가 웰플레이트들(310)로 공급되고 웰플레이트들(310)에서는 세포가 배양된다. 또한 웰플레이트들(310) 상단의 배출수단을 통해 웰플레이트들(310)의 배양물을 배출한다. 이처럼 유체는 마이크로채널들로 계속 공급되고 배출수단을 통해 계속 배출되는 관류 시스템을 제공할 수 있다.
그런데 이러한 관류 시스템을 통한 유체의 공급 과정에서 유체에 포함된 기포가 마이크로채널들 내로 들어가게 되면 채널 막힘 현상이 발생될 뿐만 아니라, 의도하지 않은 저항이 마이크로채널들에 발생하기 때문에 정확한 농도 분포로 유체를 공급하기 어려워질 수 있다. 이를 방지하기 위해, 기판(100)은 버블트탭(130)을 포함한다.
버블트탭(130)은 유입채널(110)을 통해 주입되는 유체에 포함된 기포를 수용하는 공간이다. 버블트탭(130)은 마이크로 유체 주입채널(210)의 경로 상에 위치할 수 있다. 예를 들면, 버블트탭(130)은 마이크로유체를 주입하는 유입채널(110) 및 마이크로 유체 주입채널(210)의 사이에 배치되도록 유입채널(110)에 연결되는 마이크로 유체 주입채널(210)의 끝에 위치할 수 있고, 이때 버블트탭(130)은 마이크로 유체 주입채널(210)보다 높게 형성될 수 있다.
이러한 버블트탭(130)에 의해, 유입채널(110)로부터 마이크로 유체 주입채널(210)로 주입되는 유체 내에 기체(버블)이 포함된 경우 그 버블 기체는 버블트탭(130)과 만나게 되어 버블 기체는 버블트탭(130) 내로 상승해 빠져나가고 유체는 마이크로 유체 주입채널(210) 내로 이동하게 된다.
본 발명의 다른 실시예에 따라 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템은 제2 마이크로 유체 주입채널(240), 제2 마이크로 유체 분지채널들(250), 제2 유입채널(140) 및 제2 버블트탭(150)을 포함한다.
제2 마이크로 유체 주입채널(240)은 상기 마이크로 유체 주입채널(210)과 같이 기판(100) 내로 주입되는 유체를 기판(100)의 평면 방향에 따라 가이드하도록 구성된다. 제2 마이크로 유체 주입채널(240)은 기판(100) 내에서 상기 주입채널(210)이 위치하지 않은 다른 측에 위치할 수 있거나, 동일 측인 경우 웰플레이트가 놓이는 행을 사이에 두는 위치일 수 있다. 제2 마이크로 유체 주입채널(240)은 상기 마이크로 유체 주입채널(210)과 평행하며, 기판(100)을 구성하는 직사각형 플레이트 형상의 상판(100a)의 하면에 음각 가공되어 직사각형 플레이트 형상의 장축 방향으로 유체를 가이드할 수 있다. 일 예로, 제2 마이크로 유체 주입채널(240)은 상기 마이크로 유체 주입채널(210)을 따라 흐르는 유체의 흐름 방향과 반대 방향으로 유체를 가이드할 수 있다.
*제2 마이크로 유체 분지채널들(250)은 제2 마이크로 유체 주입채널(240)을 따라 흐르는 유체를 마이크로 유체 출구채널들(230)을 향해 소정의 유량으로 나누어 공급한다. 이를 위해, 제2 마이크로 유체 분지채널들(250)은 제2 마이크로 유체 주입채널(240)에 분지된 둘 이상의 채널로 이루어질 수 있고, 이때 각각의 제2 마이크로 유체 분지채널들(250)은 제2 마이크로 유체 주입채널(240)로부터 마이크로 유체 출구채널들(230)을 향해 연장된다. 즉, 제2 마이크로 유체 분지채널들(250)의 종단부는 상기 마이크로 유체 분지채널들(220)의 종단부와 합류되어, 상기 마이크로 유체 출구채널들(230)에 유체 소통 가능하도록 연결된다.
이러한 제2 마이크로 유체 분지채널들(250)은 서로 길이가 상이하여 푸아죄유 법칙에 따라 각 분지 채널간의 유량이 상이하도록 구성될 수 있다. 즉, 제2 마이크로 유체 분지채널들(250)로의 유량이 제2 마이크로 유체 주입채널(240)의 유체의 흐름 방향에 따른 순서에 대해 선형 증가 또는 선형 감소하도록, 각각의 제2 마이크로 유체 분지채널의 길이가 구성될 수 있다. 이러한 제2 마이크로 유체 분지채널들(250)의 구성 형태는 상기 마이크로 유체 분지채널들(220)의 구성 형태와 동일하므로 이에 대한 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
제2 유입채널(140)은 제2 마이크로 유체 주입채널(240)로 유체를 주입하기 위한 채널이다. 일 예로, 제2 유입채널(140)은 기판(100)의 다른 측면, 즉 상기 유입채널(110)이 형성된 측면의 반대편에 위치한 측면으로부터 기판(100)의 내부를 향해 연장된 제2 유체주입구(141) 및 제2 유체주입구(141)의 끝으로부터 제2 마이크로 유체 주입채널(240)을 향해 관통된 제2 개구(142)를 포함할 수 있다. 제2 유체주입구(141)의 형태는 상기 유체주입구(111)의 형태와 동일하므로 구체적인 설명은 생략하기로 한다.
제2 버블트탭(150)은 제2 유입채널(140)을 통해 주입되는 유체에 포함된 기포를 수용하는 공간이다. 제2 버블트탭(150)은 제2 마이크로 유체 주입채널(240)의 경로 상에 위치할 수 있다. 예를 들면, 제2 버블트탭(150)은 마이크로유체를 주입하는 제2 유입채널(140) 및 제2 마이크로 유체 주입채널(240)의 사이에 배치되도록 제2 유입채널(140)에 연결되는 제2 마이크로 유체 주입채널(240)의 끝에 위치할 수 있고, 이때 제2 버블트탭(150)은 제2 마이크로 유체 주입채널(240)보다 높게 형성될 수 있다.
이러한 제2 버블트탭(150)에 의해, 제2 유입채널(140)로부터 제2 마이크로 유체 주입채널(240)로 주입되는 유체 내에 기체(버블)이 포함된 경우 그 버블 기체는 제2 버블트탭(150)과 만나게 되어 버블 기체는 제2 버블트탭(150) 내로 상승해 빠져나가고 유체는 제2 마이크로 유체 주입채널(240) 내로 이동하게 된다.
이러한 본 발명에 따른 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템을 이용하면, 세포 배양에 필요한 영양분 및 산소를 세포를 배양하는 각각의 웰플레이트(310) 내로 서로 다른 정확한 농도 분배로 제공할 수 있고, 서로 다른 농도로 분배되어 공급된 유체의 유량에 의해 배양되는 각 세포의 증식을 관찰하고 정략적으로 평가할 수 있다.
도 10, 도 19 및 도 20은 혼합 채널을 더 포함하는 본 발명의 시스템을 예시한다. 도 20은 도 19가 결합된 상태를 예시한다. 도 10은 상기 분지 채널의 모습을 확대해서 예시한다. 상기 분지채널 종단부 및 상기 제2 분지채널의 종단부의 합류지점부터 상기 마이크로유체 출구채널까지 혼합 채널(1010)을 추가로 더 포함한다. 혼합 채널(1010)은 유체주입채널들과 분지채널들과 같은 수준에 위치될 수 있고, 혼합 채널의 종단은 상기 출구채널의 시작지점과 연결되고 출구채널은 기판의 두께 방향으로 연장되어 기판의 상면을 관통한다.
상기 혼합 채널은 곡류(Meander) 구간을 포함한다. 곡류 구간은 도 10에서 예시되는 바와 같이 구불구불 형상을 가진 구간을 의미하며, 두 채널로 유입된 상이한 유체의 혼합을 용이하게 하여, 혼합 채널의 길이를 줄일 수 있다.
혼합 채널이 직선형상인 경우, 120 mm의 채널을 디자인하여 설계대로 혼합이 이루어지는지 확인한 결과, 도 11에서 확인 되는 바와 같이, 120 mm 부근에서 C.V(Coefficient of variation, 변동계수)가 5% 이하로 균일하게 혼합되는 것을 확인할 수 있지만, 채널의 길이가 길어지는 단점이 있다. 그러나 곡류 형태의 혼합 채널의 경우, 굽어지는 형상에 의해, 채널 내의 유동(유체의 대류)에 따른 혼합이 추가로 적용되어, 60 mm 부근에서, C.V가 5% 이하로 떨어져, 균일하게 혼합되는 것을 확인할 수 있다. 즉, 곡류 형태의 혼합 채널을 적용할 경우, 60 mm의 길이만 적용하여도 균일한 혼합을 볼 수 있으며, 채널의 길이 또한 감소된 장점을 가진다.
[실시예 1]
도 1에서 예시된 시스템을 제작하여 본 발명의 시스템을 평가하였다. 도 7은 본 발명에 따른 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템을 통해 유체가 서로 다른 유량으로 정확히 공급되는지 여부의 테스트 결과를 나타낸다. 도 7의 테스트를 위해 염색물을 이용하였다.
도 7의 (a)는 유입채널(110)을 통해 푸른색의 염색물을 주입한 경우의 테스트 결과를 도시하며, 도시된 바와 같이 마이크로 유체 출구채널들(230)을 통해 각각의 캐비티(120) 내로 나뉘어 토출된 유체의 유량이 유체의 흐름 방향에 따른 순서에 대해 점차 감소한 것을 확인할 수 있다.
도 7의 (b)는 제2 유입채널(140)을 통해 노랑색의 염색물을 주입한 경우를 도시하며, 도시된 바와 같이 마이크로 유체 출구채널들(230)을 통해 각각의 캐비티(120) 내로 나뉘어 토출된 유체의 유량이 유체의 흐름 방향에 따른 순서에 대해 점차 감소한 것을 확인할 수 있다.
도 7의 (c)는 유입채널(110) 및 제2 유입채널(140)을 통해 각각 푸른색의 염색물 및 노랑색의 염색물을 주입한 경우를 도시하며, 도시된 바와 같이 마이크로 유체 출구채널들(230)을 통해 각각의 캐비티(120) 내로 나뉘어 토출된 유체의 유량이 마이크로 유체 주입채널(210)의 흐름 방향 및 제2 마이크로 유체 주입채널(240)의 흐름 방향에 따른 순서에 대해 각각 선형 감소한 것을 확인할 수 있다.
도 8a은 본 발명에 따른 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템을 통해 유체를 주입한 경우 정확한 농도 분배로 공급되는지 여부의 테스트 결과를 나타낸다. 도 8a의 테스트를 위해 유입채널(110)로는 초순수(DI-water)를 주입하고, 제2 유입채널(140)로는 형광물질인 브롬페놀 블루(Bromphenol blue) 및 초순수가 혼합된 혼합액을 주입하였다.
도 8a에 나타난 바와 같이 각각의 웰플레이트에 공급된 유체의 농도 구배가 현저하게 차이가 나는 것이 확인되며, 이는 정확한 농도 분배로 유체가 공급되었음을 확인시킨다.
도 8b는 도 8a의 테스트에 따른 각각의 웰플레이트 내의 유체를 정량적 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8b에 나타난 바와 같이 웰플레이트들 내의 유체의 농도 분배가 선형적으로 증가하였음을 확인할 수 있다.
이러한 각각의 테스트들을 통해 본 발명에 따른 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템을 이용하면 세포 배양에 필요한 영양분 및 산소를 서로 다른 정확한 유량 및 농도 분배로 공급할 수 있음을 확인할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템은 3차원 관류 세포 배양 실험에 효과적으로 이용될 수 있다. 이를 확인하기 위해, 배양액과 약물(과산화수소수)을 연속적으로 주입하면서 약물의 농도에 따른 세포 사멸 결과를 확인하였다.
도 9a은 웰플레이트들에 배양액과 약물이 서로 다른 정확한 농도 분배로 주입된 상태를 나타내며, 도 9b는 PI staining을 통해 각 웰플레이트 내의 배양물에서 추출된 DNA의 양을 확인한 결과를 나타낸 그래프이고, 도 9c는 각 웰플레이트 내로 공급된 약물의 농도에 따라 세포가 함유하고 있던 단백질 정량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9b에 나타난 바와 같이 고농도의 약물이 가해진 경우일수록 초기에 많은 양의 DNA가 측정된 것을 확인할 수 있다.
한편, 각 웰플레이트 내의 생존해 있는 세포를 추출하여 BCA 단백질 정량분석을 수행한 결과, 도 9c에 나타난 바와 같이 가해진 약물의 농도에 따라 세포가 함유하고 있던 단백질량이 구별됨을 확인할 수 있다.
[실시예 2]
두 개의 마이크로 유체 주입 채널을 포함하는 도 19 및 도 20에서 예시된 본 발명의 시스템을 준비하고, 상기 주입 채널에 주입 유량을 정량적으로 주입하기 위해, 도 12의 사진과 같은 시린지 펌프(Harvard PHD 2000)를 이용하였다. 장시간 동안 주입시키기 위해 10 ml 용량의 시린지 2개를 이용하였다. 실리콘 튜브를 이용하여 시린지와 디바이스를 연결하여 실험 준비를 하였다. 또한, 디바이스의 각 웰로부터 나오는 유체를 일정 시간마다 채취하여 형광분석을 할 수 있도록, 피펫과 96웰 플레이트를 준비하였다.
한 시린지는 초순수(DI water)를 제1 마이크로 유체 주입 채널로 주입하였고, 다른 시린지에는 형광 물질 로다민 110이 용해된 메탄올과 초순수의 혼합물을 제2 마이크로 유체 주입 채널로 주입하였다. 도 13이 참조된다. 펌프의 작동과 동시에 농도 구배 기능이 원활히 작동하도록, 채널 내부를 초순수로 채워 놓았다. 채널이 초순수로 채워져 있지 않을 경우, 버블트랩 내부는 실험 전부터 기포로 가득 찬 환경에 놓이게 되어, 농도 구배의 정상 작동이 이루어지기 어렵다. 따라서, 초순수로 충진되어 있는 환경에서 시린지 펌프를 작동시켜, 로다민 110의 농도 구배 및 버블트랩의 기능을 확인하고자 하였다. 샘플은 80 ㎕/min의 유량으로 주입하였다. 펌프의 작동 후 로다민 110이 모든 웰에 토출되기 시작했을 때를 기준으로, 매 30분 마다 디바이스의 각 웰에서 150 μl 씩 채취하여 96웰플레이트에 옮겨담았으며, 이는 시간별로 각 웰에서 채취한 샘플을 형광 분석을 수행하기 위함에 있다.
샘플의 형광 분석 결과는 광도로 나타나는데, 이 광도만을 가지고 샘플이 가지고 있는 농도량을 판단하기엔 어려움이 있어서, 로다민 110의 광도에 따른 농도를 정량적으로 평가하기 위해, 스탠다드 샘플을 제조하여 형광분석을 수행하였다. 스탠다드 샘플은 로다민 110을 메탄올에 용해 한 후, 초순수와 혼합하여 제조하였다. 스탠다드는 0.1부터 10까지의 농도 비율로 7개의 스탠다드를 제조하였고 도 14에 예시하였다. 이를 형광 분석하여, 제조한 농도[g/ml]에 따른 광도의 데이터를 얻을 수 있었으며 이는 아래 표1에 예시하였다. 이를 그래프로 나타내어 2차 곡선의 검량선을 구하였으며, 근사값은 R2 = 0.9977로 확인되었다. 도 15를 통해 제공하였다. 이를 통해, 임의의 샘플의 광도를 본 검량선에 피팅하여, 샘플이 함유하고 있는 농도량을 확인 할 수 있도록 준비하였다.
Concentration ratio Concentration (g/ml) Intensity
0 0 10
0.1 0.00248 134
0.3 0.00744 386
0.6 0.01488 630.
1.2 0.02976 1002
2.5 0.062 2243
5 0.124 3556
10 0.248 5968
FLUOstar OPTIMA microplate reader를 이용하여 96 웰 플레이트 안에 채취한 샘플을 형광분석 하였다. 로다민 110의 여기 파장(excitation wavelength)과 방사 파장(emission wavelength)가 각각 496, 520 nm 인 것을 고려하여, reader의 여기 파장과 방사 파장을 485, 520 nm로 설정하였으며, gain값을 100으로 설정하여 로다민 110의 광도가 측정 가능하도록 하였다.
형광 분석 결과 도 16(a)에서와 같이 검량선에 피팅하여 농도 비율로 나타낸 결과는 도 16(b) 와 같다. 6시간의 관류 동안, 전체적으로 각 웰에서 로다민 110의 농도가 선형적으로 구배되며, 그 비율이 시간의 경과에도 유지되는 것을 확인하였다.실험 셋업 시에는 채널 내부에 초순수를 채워놓으므로 기포가 없는 환경에서 실험을 시작 할 수 있다. 하지만, 장시간 동안 주입을 하면 시린지의 용량이 줄어들어, 시린지 교체가 필요하다. 이러한 교체 과정에서, 시린지와 펌프, 디바이스의 분리가 불가피하고, 이는 시스템 내부로 기포가 들어가게 된다. 버블트랩이 적용되지 않은 디바이스로 실험을 수행한 결과, 채널 내부로 버블이 침투하여 유동 저항으로 작용하였고, 이는 결과적으로 도 17과 같이 농도 구배 조절을 불가능하게 하였다. 반면에 버블트랩을 포함하는 시스템으로 실험을 하였을 경우, 시린지의 교체 이후 주입 유체와 함께 주입되는 기포는 도 18에서와 같이 버블트랩에 포집 되는 것을 확인하였으며, 또한 앞서 실험한 결과(도 16(b))와 같이, 장시간의 관류 중에도 농도 구배 시스템이 안정하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 본 발명에 따른 관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템은 다양한 세포 배양 및 세포 증식의 관찰이 가능하며, 세포 증식의 정량적인 평가가 가능하다. 예를 들면, 생체 내부의 미세환경을 모사하여 생체 내부에서의 종양 증식을 관찰하고 정략적으로 평가 가능하다.
제시된 실시예들에 대한 설명은 임의의 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 이용하거나 또는 실시할 수 있도록 제공된다. 이러한 실시예들에 대한 다양한 변형들은 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 여기에 정의된 일반적인 원리들은 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 다른 실시예들에 적용될 수 있다. 그리하여, 본 발명은 여기에 제시된 실시예들로 한정되는 것이 아니라, 여기에 제시된 원리들 및 신규한 특징들과 일관되는 최광의의 범위에서 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

  1. 기판;
    상기 기판 내에 상기 기판의 평면 방향에 따라 유체를 가이드하도록 구성된 마이크로 유체 주입채널;
    상기 기판 내에 상기 마이크로 유체 주입 채널에 분지된 둘 이상의 마이크로 유체 분지채널들;
    상기 각 분지채널의 종단부에서 상기 기판의 상면 방향으로 연장되어 상기 기판의 상면을 관통하여 관통개구를 형성하는 마이크로 유체 출구채널들; 및
    상기 기판의 상면에 위치하고 상기 각 출구채널과 유체 소통가능하도록 연결된 웰플레이트들을 포함하는,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분지채널들은 서로 길이가 상이하여 푸아죄유(poiseuille) 법칙에 따라 각 분지 채널간의 유량이 상이하도록 구성된,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 분지채널로의 유량이 상기 주입채널의 유체의 흐름 방향에 따른 분지채널의 순서에 대해 선형 증가 또는 선형 감소하도록, 상기 각각의 분지채널의 길이가 구성되어 있음을 특징으로 하는,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 기판은 상기 주입채널로 마이크로유체를 주입하는 유입채널을 포함하고, 상기 유입채널과 상기 주입채널 사이에 버블트탭을 포함하는,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 기판 상면은 다수의 캐비티(cavity)를 가지며,
    상기 출구채널들에 의한 관통개구들은 상기 캐비티의 내면에 형성되어 있고,
    상기 웰플레이트 하면은 둘 이상의 구멍을 가지고 있고,
    상기 캐비티의 최장 너비는 상기 웰플레이트 하면의 최단 너비보다 작아 상기 웰플레이트가 상기 캐비티 위에 위치하면서 웰플레이트 하면과 캐비티 내면이 이루는 공간을 형성하며, 상기 캐비티에 상기 관통개구로부터 유출된 유체가 저장되고 이 캐비티의 유체가 상기 웰플레이트 하면의 하나 이상의 개구를 통해 상기 웰플레이트로 유입되는,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 웰플레이트는 이의 측벽 상단에 개구를 포함하고,
    상기 개구를 통해 웰플레이트의 웰플레이트 배양물이 배출되도록 구성되는,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 기판은 상기 웰플레이트 행을 사이에 위치시키고 상기 주입채널과 평행한 제2 마이크로 유체 주입채널 및 상기 제2 마이크로 유체 주입 채널에 분지된 둘 이상의 제2 마이크로 유체 분지채널들을 추가로 포함하며,
    상기 제2 분지채널의 종단부는 상기 분지채널의 종단부와 합류되어, 상기 마이크로유체 출구채널에 유체소통가능하게 연결되어 있음을 특징으로 하는,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제2 분지채널들은 서로 길이가 상이하여 푸아죄유(poiseuille) 법칙에 따라 각 제2 분지 채널간의 유량이 상이하도록 구성된,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제2 분지채널로의 유량이 상기 주입채널의 유체의 흐름 방향에 따른 순서에 대해 선형 증가 또는 선형 감소하도록, 상기 각각의 제2 분지채널의 길이가 구성되어 있음을 특징으로 하는,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 기판은 상기 주입채널로 마이크로유체를 주입하는 유입채널을 포함하고, 상기 유입채널과 상기 주입채널 사이에 버블트탭을 포함하는,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 분지채널 종단부 및 상기 제2 분지채널의 종단부의 합류지점부터 상기 마이크로유체 출구채널까지 혼합 채널을 추가로 더 포함함을 특징으로 하는,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 혼합 채널은 곡류(Meander) 구간을 포함하는,
    관류 세포 배양 마이크로 유체 시스템.
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