WO2017085351A1 - Derivados del ácido retinoico para el tratamiento de la colestasis - Google Patents

Derivados del ácido retinoico para el tratamiento de la colestasis Download PDF

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WO2017085351A1
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Manuel DE LA MATA GARCÍA
Sandra GONZÁLEZ RUBIO
Gustavo FERRÍN SÁNCHEZ
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Universidad de Cordoba
Servicio Andaluz de Salud
Centro de Investigacion Biomedica en Red CIBER
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Universidad de Cordoba
Servicio Andaluz de Salud
Centro de Investigacion Biomedica en Red CIBER
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/203—Retinoic acids ; Salts thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention is within the field of medicine and pharmacy, and refers to the use of an AP-1 transcription factor inhibitor in the preparation of a medicament for the relief, improvement, prevention and / or treatment of the disease.
  • cholestatic liver Preferably the AP-1 inhibitor is a derivative of retinoic acid, and more preferably it is SR 1 1302.
  • Cholestatic liver diseases include a group of various disorders with different epidemiology, pathophysiology, clinical evolution and prognosis, which are characterized by a defect in the formation of bile acids and / or their transport from the liver to the intestine. Cholestasis can be classified as intra or extrahepatic, depending on whether it occurs as a result of dysfunction or deterioration of intrahepatic bile ducts, or affects extrahepatic bile ducts, respectively. In any case, the accumulation of toxic bile acids in the serum and liver of patients with cholestasis can lead to fibrosis, cirrhosis and chronic liver failure.
  • Ursodeoxycholic acid has been shown to exert an anticolestatic effect in several cholestatic disorders, and is the treatment of choice in primary biliary cirrhosis, which represents the main cause of small duct bile duct diseases.
  • the beneficial effect of UDCA has been associated with inhibition of bile acid-induced apoptosis in hepatocytes and cholangiocytes, as well as better patient survival (Paumgartner G. and Beuers U., 2002.
  • Ursodeoxycholic acid in cholestatic liver disease mechanisms of action and therapeutic use revisited. Hepatology. 36: 525-31).
  • some considerations must be taken into account about the use of UDCA in the treatment of CHD.
  • UDCA is frequently combined with, or replaced by, other therapeutic agents such as corticosteroids, immunosuppressants and other drugs
  • other therapeutic agents such as corticosteroids, immunosuppressants and other drugs
  • Nitric oxide (NO) can act as a major mediator of liver damage or as a potent protector against tissue injury, depending on factors such as its concentration or the source that generates it (Clemens MG, 1999. Nitric oxide in liver injury Hepatology 30: 1-5).
  • NCX-1000 The chemical compound 2- (acetyloxy) benzoic 3- (nitroxymethyl) phenyl ester (NCX-1000) is a derivative of the UDCA that selectively releases ON in the liver and protects against the development of portal hypertension (Fiorucci S, Antonelli E, Morelli O, Mencarelli A, Casini A, Mello T, et al., 2001. NCX-1000, a NO-releasing derivative of ursodeoxycholic acid, selectively delivers NO to the liver and protects against development of portal hypertension. Proc. Nati. Acad Sci. USA .; 98: 8897-902).
  • endothelial nitric oxide synthase (NOS-3) is considered the main source of endogenous ON in the liver, and its expression has also been related to a protective role (Biecker E, Trebicka J, Kang A, Hennenberg M, Sauerbruch T, Heller J. (2008) Treatment of bile duct-ligated rats with the nitric oxide synthase transcription enhancer AVE 9488 ameliorates portal hypertension Liver Int. 28: 331-8; Lee KC, Yang YY, Huang YT, Lee FY, Hou MC , Lin HC (2010).
  • a first aspect of the invention relates to the use of an AP-1 transcription factor inhibitor in the preparation of a medicament for the relief, improvement, prevention and / or treatment of cholestatic liver disease, or alternatively, refers to a AP-1 transcription factor inhibitor for use in the relief, improvement, prevention and / or treatment of cholestatic liver disease.
  • the AP-1 transcription factor inhibitor is a derivative of retinoic acid or any of its pharmaceutically acceptable salts, esters, tautomers, solvates and hydrates, or any combination thereof.
  • the AP-1 transcription factor inhibitor is a retinoic acid derivative that is selected from the list consisting of: SR 11302, SR 1 1238, SR 1 1327, SR 11220 and SR11228.
  • the AP-1 transcription factor inhibitor is SR 1 1302.
  • a second aspect of the invention relates to a composition, hereinafter composition of the invention, which comprises at least one AP-1 transcription factor inhibitor, and even more preferably consisting of an AP- transcription factor inhibitor. one.
  • the AP-1 transcription factor inhibitor is a retinoic acid derivative, preferably SR 11302.
  • the composition of the invention comprises at least one other active ingredient.
  • the composition of the invention is a pharmaceutical composition.
  • a third aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention in the manufacture of a medicament.
  • a fourth aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention in the preparation of a medicament for the relief, improvement, prevention and / or treatment of cholestatic liver disease, or alternatively to the composition of the invention for use. for in the relief, improvement, prevention and / or treatment of cholestatic liver disease.
  • a fifth aspect of the invention relates to a pharmaceutical form, hereinafter the pharmaceutical form of the invention, which comprises the composition of the invention, and even more preferably consisting of the composition of the invention.
  • the pharmaceutical form of the invention is selected from the list consisting of: plaster, ointment, paste, cream, solution, suspension, emulsion, lotion, liniment, gel, hydrogel, hydrocolloid, foam, powder, or any combination thereof.
  • the pharmaceutical form of the invention is a solution or suspension.
  • Figure 1 Expression of cJun and cFos transcription factors in cells treated with GCDCA.
  • B Effect of the administration of curcumin or quercetin on the expression of p-cJun, p-cFos and p-SP1 (6 h).
  • FIG. 1 Role of AP-1 in the regulation of NOS-3 during cytotoxicity by GCDCA.
  • Cells exposed or not to GCDCA were treated with curcumin, quercetin or SR-11302.
  • Figure 3 Binding of cJun and cFos transcription factors to the NOS-3 promoter (pNOS-3).
  • A Gene expression of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and NOS-3 as positive controls.
  • B Union of cJun and cFos to pNOS-3 at position -666. Data expressed as mean ⁇ standard error of 3 independent experiments. Statistically significant differences compared to the control group * are marked.
  • SR 1 1302 a retinoic acid derivative, specifically SR 1 1302, to produce inhibition of the AP-1 transcription factor, to restore the expression of endothelial nitric oxide synthase (NOS-3) and reduce cell damage caused by the administration of the main human bile acid, glycokenodeoxycholic acid (GCDCA).
  • SR 1 1302 could be useful for the treatment of cholestatic liver diseases.
  • a first aspect of the invention relates to the use of an AP-1 transcription factor inhibitor in the preparation of a medicament for the relief, improvement, prevention and / or treatment of cholestatic liver disease, or alternatively, refers to an AP-1 transcription factor inhibitor for use in the relief, improvement, prevention and / or treatment of cholestatic liver disease.
  • the AP-1 transcription factor inhibitor is a derivative of retinoic acid or any of its pharmaceutically acceptable salts, esters, tautomers, solvates and hydrates, or any combination thereof.
  • the AP-1 transcription factor inhibitor is a retinoic acid derivative that is selected from the list consisting of: SR 11302, SR 1 1238, SR 1 1327, SR 11220 and SR11228.
  • the AP-1 transcription factor inhibitor is SR 11302.
  • AP-1 transcription factor means Activating Protein 1 (AP-1).
  • This protein is a heterodimeric transcription factor composed of proteins belonging to the families of c-Fos, c-Jun, ATF and JDP.
  • AP-1 is involved in the regulation of the expression of genes related to the response to stimuli, such as cytokines, growth factors, stress and viral or bacterial infections. In this way, AP-1 controls different cellular processes including differentiation, proliferation and apoptosis.
  • c-Fos is a protein encoded in humans by the fos gene (van Straaten et al., 1983. Proc. Nati. Acad. Sci.
  • C-fos is a cellular proto-oncogene belonging to the family of rapid expression gene transcription factors.
  • c-Fos protein has a leucine zipper-like DNA binding domain, as well as another transactivation domain at the C-terminal end.
  • c-Jun is the protein encoded by the c-jun gene, it is the name of a gene that encodes the c-Jun protein, which, after combining with the c-Fos protein, forms the transcription factor AP-1 It was initially identified as a p39 Fos binding protein and subsequently rediscovered as the product of the c-jun gene. Its activation is produced by double phosphorylation through the JNK pathway, but an independent alternative phosphorylation function has also been described.
  • AP-1 is a transcription factor that has the ability to activate transcription of genes containing 12-0-tetradecanoylforbol-13-acetate (TPA) response elements, characterized by the sequence 5'-TGAG / CTCA-3 '.
  • TPA 12-0-tetradecanoylforbol-13-acetate
  • AP-1 binds to DNA through a region of its sequence rich in basic amino acids, while the dimeric structure is formed by a leucine zipper.
  • cholestatic liver disease is understood as the set of diseases that cause liver damage as a result of a defect in the flow of bile from the liver to the duodenum. This condition is called cholestasis, and it can be of two types: obstructive and metabolic. While the first one is characterized by the existence of a mechanical blockage in the duct system, and can be produced from a biliary calculus or malignancy, metabolic cholestasis occurs from disturbances in bile formation, which They can occur due to genetic or acquired defects.
  • AR Retinoic acid
  • AR is obtained from retinol (vitamin A), which is synthesized in animals but has a plant origin since it comes from ⁇ -carotene. Once the ⁇ -carotene has been ingested, it is adhered to the lumen of the intestine by the ⁇ -carotene dioxygenase and the retinoic acid synthesis process begins. AR is necessary to prevent the synthesis of high molecular mass keratin. Animals with vitamin A deficiency have been shown to be more susceptible to cancer due to the antioxidant potential of ⁇ -carotene and the effects that retinol and retinoic acid exert on cell regulation. Involved in the production of mucus in epithelial cells.
  • RA also participates in the mechanisms that control the inflammatory reaction, since it has been related to the generation and expression of nitric oxide, prostaglandins, interleukin and cytosines. These substances act in the generation or maintenance of pain due to inflammation. They are also target substances for many pain relievers. On the other hand, it acts as a protective agent against oxidative damage in mitochondria.
  • the retinoic acid derivative may include isomers, depending on the presence of multiple bonds, including optical isomers or enantiomers, depending on the presence of chiral centers.
  • the individual isomers, enantiomers or diastereoisomers and mixtures thereof fall within the scope of the present invention, that is, the term isomer also refers to any mixture of isomers, such as diastereomers, racemic, etc., even their optically isomers. assets or mixtures in different proportions thereof.
  • the individual enantiomers or diastereoisomers, as well as mixtures thereof, can be separated by conventional techniques.
  • prodrugs of the compounds of formula (I) include any derivative of a compound of formula (I) - for example and not limited to: esters (including esters of carboxylic acids, amino acid esters, phosphate esters, esters of sulphonate of metal salts, etc.), carbamates, amides, etc. - which when administered to an individual can be transformed directly or indirectly into said compound of formula (I) in said individual.
  • said derivative is a compound that increases the bioavailability of the compound of formula (I) when administered to an individual or that enhances the release of the compound of formula (I) in a biological compartment.
  • the nature of said derivative is not critical as long as it can be administered to an individual and provides the compound of formula (I) in a biological compartment of an individual.
  • the preparation of said prodrug can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art.
  • the term “derivative” includes both pharmaceutically acceptable compounds, that is, derivatives of the compound of formula (I) that can be used in the manufacture of a medicament or food compositions, as pharmaceutically unacceptable derivatives, and that these may be useful in the preparation of pharmaceutically acceptable derivatives.
  • the retinoic acid derivative may be in crystalline form as a free compound or as a solvate.
  • solvate includes both pharmaceutically acceptable solvates, that is, solvates of the compound of formula (I) that can be used in the manufacture of a medicament, as pharmaceutically acceptable solvates, which may be useful in the preparation of pharmaceutically acceptable solvates or salts.
  • the nature of the pharmaceutically acceptable solvate is not critical as long as it is pharmaceutically acceptable.
  • the solvate is a hydrate.
  • Solvates can be obtained by conventional solvation methods known to those skilled in the art.
  • the retinoic acid derivative, its salts, prodrugs or solvates will preferably be found in a pharmaceutically acceptable or substantially pure form, that is, having a pharmaceutically acceptable level of purity excluding normal pharmaceutical additives such as diluents and carriers, and not including material considered toxic at normal dosage levels.
  • the purity levels for the active ingredient are preferably greater than 50%, more preferably greater than 70%, and still more preferably greater than 90%. In a preferred embodiment, they are greater than 95% of the compound of formula (I), or of its salts, solvates or prodrugs.
  • SR 11302 refers to a chemical compound of formula C26H32O2, also called “Acid (E, E, Z, E) -3-methyl-7- (4-methylphenyl) -9- (2,6, 6-trimethyl-1-cyclohexene-1-yl) - 2,4,6,8-nonatetraenoic ", with CAS No. 160162-42-5 and PubChem 9976842 and of molecular weight 376.54 g / mol. Its formula is as follows:
  • a second aspect of the invention relates to a composition, hereinafter composition of the invention, which comprises at least one AP-1 transcription factor inhibitor, and even more preferably consisting of an AP- transcription factor inhibitor. one.
  • the AP-1 transcription factor inhibitor is a retinoic acid derivative, preferably SR 11302.
  • the composition of the invention comprises at least one other active ingredient.
  • the active ingredient is selected from the list consisting of: ursodeoxycholic acid (UDCA), corticosteroids, immunosuppressants or any combination thereof.
  • the composition of the invention is a pharmaceutical composition.
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • the pharmaceutical composition of the invention will comprise at least one compound of the invention, and preferably will comprise a therapeutically effective amount of the compound of the invention.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of the agent or compound capable of developing the therapeutic action determined by its pharmacological properties, calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, due to the characteristics of the compounds, including the age, condition of the patient, the severity of the alteration or disorder, and the route and frequency of administration.
  • the compounds described in the present invention, their salts, prodrugs and / or solvates as well as the pharmaceutical compositions containing them can be used together with other drugs, or additional active ingredients, to provide a combination therapy.
  • Said additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, they may be provided in the form of a separate composition for simultaneous or non-simultaneous administration to the pharmaceutical composition comprising a compound of formula (I), or a salt, prodrug or solvate thereof.
  • a third aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention in the manufacture of a medicament.
  • a fourth aspect of the invention relates to the use of the composition of the invention in the preparation of a medicament for the relief, improvement, prevention and / or treatment of cholestatic liver disease, or alternatively to the composition of the invention for use. for in the relief, improvement, prevention and / or treatment of cholestatic liver disease.
  • a fifth aspect of the invention relates to a pharmaceutical form, hereinafter the pharmaceutical form of the invention, which comprises the composition of the invention, and even more preferably consisting of the composition of the invention.
  • pharmaceutical form means the mixture of one or more active ingredients with or without additives that have physical characteristics for proper dosage, preservation, administration and bioavailability.
  • compositions and pharmaceutical forms of the invention are suitable for oral administration, in solid or liquid form.
  • Possible forms for oral administration are tablets, capsules, syrups or solutions and may contain conventional excipients known in the pharmaceutical field, as aggregating agents (eg syrup, acacia, gelatin, sorbitol, tragacanth or polyvinyl pyrrolidone), fillers (eg lactose, sugar, corn starch, calcium phosphate, sorbitol or glycine), disintegrants (eg starch, polyvinyl pyrrolidone or microcrystalline cellulose) or a pharmaceutically acceptable surfactant such as sodium lauryl sulfate.
  • Other pharmaceutical forms may be colloidal systems, which include nanoemulsions, nanocapsules and polymeric nanoparticles.
  • compositions for oral administration can be prepared by conventional methods of Galenic Pharmacy, as mixing and dispersion.
  • the tablets can be coated following methods known in the pharmaceutical industry.
  • compositions and pharmaceutical forms can be adapted for parenteral administration, such as sterile solutions, suspensions, or lyophilisates of the products of the invention, using the appropriate dose.
  • Suitable excipients such as pH buffering agents or surfactants, can be used.
  • the aforementioned formulations can be prepared using conventional methods, such as those described in the Pharmacopoeias of different countries and in other reference texts.
  • the administration of the compounds, compositions or pharmaceutical forms of the present invention can be performed by any suitable method, such as intravenous infusion and oral, topical or parenteral routes. Oral administration is preferred for the convenience of patients and for the chronic nature of the diseases to be treated.
  • the amount administered of a compound of the present invention will depend on the relative efficacy of the compound chosen, the severity of the disease to be treated and the weight of the patient. However, the compounds of this invention will be administered one or more times a day, for example 1, 2, 3 or 4 times daily, with a total dose between 0.001 and 1000 mg / Kg / day, or between 0, 1 and 500 mg / kg / day It is important to keep in mind that it may be necessary to introduce variations in the dose, depending on the age and condition of the patient, as well as modifications in the route of administration.
  • the compounds and compositions of the present invention can be used together with other medicaments in combination therapies.
  • the other drugs may be part of the same composition or of a different composition, for administration at the same time or at different times.
  • the pharmaceutical form of the invention is selected from the list consisting of: plaster, ointment, paste, cream, solution, suspension, emulsion, lotion, liniment, gel, hydrogel, hydrocolloid, foam, powder, or any combination thereof.
  • the pharmaceutical form of the invention is a solution or suspension.
  • the pGL4-NOS3 cell line was obtained by stable transfection of HepG2 cells with plasmid pGL4.20 [Iuc2 / Puro] (Promega, Wisconsin, USA) containing the luciferase reporter gene under the control of the NOS promoter -3 human (pNOS-3; 1601 nucleotides, GenBank AF387340.1; Fig. 1).
  • the pGL4 control cell line was obtained by stable transfection of HepG2 cells with the vector pGL4.20 [luc2 / Puro] without insertion of promoter sequence.
  • the cells were seeded in culture plates at a density of 150,000 cells / cm 2 .
  • the GCDCA Sigma-Aldrich
  • MnTBAP manganese (III) tetrakis (acid) 4-porphyrin chloride chloride
  • MitoQ mitochondrial antioxidant mimetic compound were administered at a concentration of 0.1 mg / ml and 1 mM, respectively.
  • Curcumin (diferuloylmethane), quercetin (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) and the specific AP-1 inhibitor SR-1 1302 (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) were used at 4 ⁇ , 20 ⁇ and 50 ⁇ , respectively.
  • the cells were collected at different times depending on the parameter under study. MitoQ was synthesized according to the procedure described by Kelso et al. (Kelso GF, Porteous CM, Coulter CV, Hughes G, Porteous WK, Ledgerwood EC, 2001. Selective targeting of a redox-active ubiquinone to mitochondria within cells: antioxidant and antiapoptotic properties. J. Biol. Chem .; 276: 4588- 96). Preparation of cell protein extracts
  • HepG2 protein extracts were obtained by incubating the cells in a lysis buffer containing 50 mM Hepes, pH 7.5, 100 mM NaCI, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM PMSF, 5 ⁇ g / ml aprotinin and 10 ⁇ g / ml leupeptin (Sigma-Aldrich). The integrity and concentration of the protein samples were determined from the red-Ponceau stain and the Bradford method, respectively.
  • Mitochondrial-driven ubiquinone enhances extracellular calcium-dependent nitric oxide production and reduces glycochenodeoxycholic acid-induced cell death in hepatocytes.
  • Calcium-dependent nitric oxide production is involved in the cytoprotective properties of n-acetylcysteine in glycochenodeoxycholic acid-induced cell death in hepatocytes.
  • Promoter activity assay The activity of pNOS-3 was measured in pGL4-NOS3 and pGL4 cells using the luciferase assay system "One-Glow" (Promega). Briefly, the cells were seeded in a 384-well plate with black walls and transparent bottom (15,000 cells / well) and, after treatment administration, lysed with 20 ⁇ of 1X lysis buffer. 40 ⁇ of the cell extract was used for the luciferase assay according to the manufacturer's recommendations.
  • RPL13A Ribosomal Protein L13A
  • Nitric oxide production The production of ON was determined by the Griess reaction, as previously described (Gonzalez-Rubio S, Lopez-Sanchez L, Munoz-Castaneda J, Linares Cl, Aguilar-Melero P, Rodriguez-Peralvarez M, (2015 GCDCA down-regulates gene expression by increasing Sp1 binding to the NOS-3 promoter in an oxidative stress dependent manner. Biochem. Pharmacol. 96: 39-51; Gonzalez-Rubio S, Hidalgo AB, Ferrin G, Bello Rl, González R, Gahete MD, 2009.
  • Mitochondrial-driven ubiquinone enhances extracellular calcium-dependent nitric oxide production and reduces glycochenodeoxycholic acid-induced cell death in hepatocytes.
  • Calcium-dependent nitric oxide production is involved in the cytoprotective properties of n-acetylcysteine in glycochenodeoxycholic acid-induced cell death in hepatocytes.Toxicol. Appl. Pharmacol. 242: 165- 72).
  • the extracellular culture medium was collected 24 h after the administration of the treatment. This ensured the sensitivity and reproducibility of the reaction. Nitrite concentrations were determined accurately from a calibration curve of known concentrations.
  • Chromatin immunoprecipitation assay ChIP-RT-qPCR
  • the ChIP assay was performed as previously described, using nuclei isolated from HepG2 cells fixed with formaldehyde Fernandez-Alvarez A, Soledad Alvarez M, Cucarella C, Married M, 2010. Characterization of the human insulin-induced gene 2 (INSIG2) promoter: the role of Ets-binding motifs. J. Biol. Chem. 285: 1 1765-74). Immunoprecipitation was performed using primary anti-cJun or anti-cFos antibodies, together with magnetic beads (Dynabeads® Protein G, Life Technologies).
  • RNA polymerase II Poly I
  • rabbit IgG were used as positive and negative controls, respectively, using anti-Polll (sc-899) and anti-lgG (sc-2027) antibodies. 4 ⁇ g of antibody were used for each experiment. All primary antibodies were from Santa Cruz Biotechnology.
  • the purified samples were analyzed by RT-qPCR, using the "SensiFast SYBR" kit (Bioline, London, United Kingdom) and the following specific oligonucleotides to detect target sequences: Site -666 for AP-1, 5'-CTTTTGTGTCCCCCACTTGAG-3 ' and 5'-CAATTTCCTGGAACCCCCAC-3 '; Site -235 for GATA-1, 5'-AGGGCTCTGCTGGACACCT-3 'and 5'- GCTGTGAGGACTGAGGCTGAT-3 '; Site -1 144 for GATA-1 / -4, 5'- CCCACCCCAACCTTATCCTC-3 'and 5'-TTGTGTTGGCCAGACTCCTCT-3'.
  • GCDCA-induced oxidative stress stimulates the expression and activation of cJun and cFos
  • Bioinformatic analysis of the pNOS-3 sequence identified binding sites for candidate FTs (SUFTs), which could participate in the modulation of NOS-3 expression. Only those SUFTs (other than SP1) that were identified by the three bioinformatic prediction tools used were selected for further analysis. Thus, the SUFTs for AP-1 and GATA-1 in the positions described in Table 1 were considered.
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  • AP-1 participates in the deregulation of NOS-3 during GCDCA-induced cytotoxicity
  • GCDCA increases the binding of AP-1 to pNOS-3
  • Cholestasis is a disorder that is associated with oxidative damage and the regulation of NOS-3 expression (Biecker E, Trebicka J, Kang A, Hennenberg M, Sauerbruch T, Heller J. (2008). Treatment of bile duct -Ligated rats with the nitric oxide synthase transcription enhancer AVE 9488 ameliorates portal hypertension Liver Int. 28: 331-8.
  • Bile acids up-regulate death receptor 5 / TRAIL-receptor 2 expression via a c-Jun N-terminal kinase-dependent pathway involving Sp1. J Biol Chem. 299: 51-60.
  • the cellular response to GCDCA was characterized by an increase in the expression and activation of cJun and cFos, as well as the union of these to the SUFT identified in pNOS-3 at position -666. This suggests that the AP-1 complex binds in this position. tion as a heterodimer. This resulted in a decrease in pNOS-3 activity and NOS-3 protein expression.
  • the administration of curcumin or quercetin as inhibitors of AP-1 reversed the activation of FT induced by GCDCA, as well as decreased expression of NOS-3.
  • AP-1 is involved in the regulation of NOS-3 by cyclosporine A and hypoxia (Navarro-Antolin J, Rey-Campos J, Lamas S. 2000. Transcriptional induction of endothelial nitric oxide gene by cyclosporine A. A role for activator protein-1 J. Biol. Chem. 275: 3075-80; Hoffmann A, Gloe T, Pohl U. 2001. Hypoxia-induced upregulation of eNOS gene expression is redox-sensitive: a comparison between hypoxia and inhibitors of cell metabolism J. Cell Physiol. 188: 33-44), which are related to oxidative stress.
  • the antioxidant nordihydroguaar thriftco acid positively regulates the expression of NOS-3 through the increase in the binding of AP-1 to pNOS-3 in pulmonary arterial endothelial cells (Kumar S, Wedgwood S, Black SM. 2007. Nordihydroguaiaretic acid increases endothelial nitric oxide synthase expression via the transcription factor AP-1. DNA Cell Biol. 26: 853-62). Kumar et al. showed that the binding of AP-1 in the same position of pNOS-3 that we discussed here, regulates promoter activity in response to oxidative stress.
  • the oxidative stress induced by GCDCA caused the activation of the cJun and cFos FTs, and their binding to pNOS-3 in the -666 position. This fact was related to repression of promoter activity, decreased expression / activity of NOS-3 and cell death.
  • the observed hepatocellular damage was associated with the inhibition of NOS-3 expression and the activation of the cJun and cFos FTs (data not shown).
  • retinoids The regulation of the activity of cJun and cFos by oxidative stress and the participation of NOS-3 in this process represents a new mechanism by which the accumulation of bile acids causes a cytotoxic effect, and provides a new therapeutic target for EHC. It is known that the biological activities of retinoids are mediated by the transcriptional activation of the retinoic acid response element (RARE) and the inhibition of AP-1 activity. However, the clinical use of retinoids is limited due to their side effects (Pfahl M, Apfel R, Bendik I, Fanjul A, Graupner G, Lee MO, 1994. Nuclear retinoid receptors and their mechanism of action. Vitam Horm.
  • SR-1 1302 belongs to this new class of retinoids and its use has been described in human pathologies such as peritoneal inflammation (Qatar R, Witowski J, Wagner P, Annett Schramm I, Kawka E, Philippe A. 2013. The proto- oncogene c-Fos transcriptionally regulates VEGF production during peritoneal inflammation. Kidney Int. 84: 11 19-28) and cancer (Huang C, Ma WY, Dawson MI, Rincon M, Flavell RA, Dong Z. 1997.

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Abstract

Uso de un derivado del ácido retinoico en la elaboración de un medicamento para el alivio, mejora, prevención y/o tratamientode la enfermedad hepática colestásica. Composición, forma farmacéutica y usos.

Description

DERIVADOS DEL ÁCIDO RETINOICO PARA EL TRATAMIENTO DE LA COLESTASIS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina y la farmacia, y se refiere al uso de un inhibidor del factor de transcripción AP-1 en la elaboración de un medicamento para el alivio, mejora, prevención y/o tratamiento de la enfermedad hepática colestásica. Preferiblemente el inhibidor de AP-1 es un derivado del ácido retinoico, y más preferiblemente es el SR 1 1302.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las enfermedades hepáticas colestásicas (EHC) incluyen un grupo de diversos trastornos con diferente epidemiología, fisiopatología, evolución clínica y pronóstico, que se caracterizan por un defecto en la formación de ácidos biliares y/o en su transporte desde el hígado hasta el intestino. La colestasis puede ser clasificada como intra o extrahepática, dependiendo de si se produce como resultado de la disfunción o deterioro de los conductos biliares intrahepáticos, o afecta a los conductos biliares extrahepáticos, respectivamente. En cualquier caso, la acumulación de ácidos biliares tóxicos en el suero e hígado de los pacientes con colestasis puede dar lugar a fibrosis, cirrosis e insuficiencia hepática crónica. Por lo tanto, las consecuencias de la colestasis son muy graves y, si no se trata, progresará invariablemente hacia el trasplante de hígado (Liver EEAftSot. EASL Clinical Practice Guidelines: management of cholestatic liver diseases. J. Hepatol. 2009; 51 :237-67).
El ácido ursodesoxicólico (UDCA) ha demostrado ejercer un efecto anticolestásico en varios trastornos colestásicos, y es el tratamiento de elección en la cirrosis biliar primaria, la cual representa la causa principal de las enfermedades biliares de pequeños conductos. El efecto beneficioso de UDCA se ha asociado con la inhibición de la apoptosis inducida por ácidos biliares en hepatocitos y colangiocitos, así como una mejor supervivencia del paciente (Paumgartner G. y Beuers U., 2002. Ursodeoxycholic acid in cholestatic liver disease: mechanisms of action and therapeutic use revisited. Hepatology. 36:525-31). Sin embargo, algunas consideraciones deben ser tenidas en cuenta sobre el uso de UDCA en el tratamiento de las EHC. Así, UDCA es frecuentemente combinado con, o reemplazado por, otros agentes terapéuticos tales como los corticoesteroides, inmunosupresores y otros fármacos (Liver EEAftSot. EASL Clinical Practice Guidelines: management of cholestatic liver diseases. J. Hepatol. 2009; 51 :237-67). El óxido nítrico (NO) puede actuar como un mediador principal de daño hepático o como un potente protector frente a la lesión tisular, dependiendo de factores tales como su concentración o la fuente que lo genera (Clemens MG, 1999. Nitric oxide in liver injury. Hepatology 30: 1-5). El compuesto químico 2-(acetiloxi) benzoico 3-(nitrooximetil) fenil éster (NCX-1000) es un derivado del UDCA que libera ON de manera selectiva en el hígado y protege frente al desarrollo de hipertensión portal (Fiorucci S, Antonelli E, Morelli O, Mencarelli A, Casini A, Mello T, et al., 2001. NCX-1000, a NO-releasing derivative of ursodeoxycholic acid, selectively delivers NO to the liver and protects against development of portal hypertension. Proc. Nati. Acad. Sci. USA.; 98:8897-902). La enzima óxido nítrico sintasa endotelial (NOS-3) es considerada la principal fuente de ON endógeno en el hígado, y su expresión también ha sido relacionada con un papel protector (Biecker E, Trebicka J, Kang A, Hennenberg M, Sauerbruch T, Heller J. (2008). Treatment of bile duct-ligated rats with the nitric oxide synthase transcription enhancer AVE 9488 ameliorates portal hypertension. Liver Int. 28:331-8; Lee KC, Yang YY, Huang YT, Lee FY, Hou MC, Lin HC (2010). Administration of a low dose of sildenafil for 1 week decreases intrahepatic resistance in rats with biliary cirrhosis: the role of NO bioavailability. Clin Sci (Lond). 1 19:45-55). Recientemente, hemos demostrado que el factor de transcripción (FT) SP1 regula negativamente la expresión de NOS-3 durante la colestasis inducida por ácido glicoquenodesoxicólico (GCDCA) a través de la unión directa al promotor de NOS-3 (pNOS-3), de manera dependiente al estrés oxidativo. En este sentido, la inhibición específica de SP1 resultó en el aumento de la expresión de NOS-3 y la reducción de parámetros relacionados con la muerte celular, siendo propuesto como una nueva diana potencial en el tratamiento de las EHC (González-Rubio S., López-Sánchez L., Muñoz- Castaneda J., Linares C.I., Aguilar-Melero P., Rodríguez-Perálvarez M., (2015). GCDCA down- regulates gene expression by increasing Sp1 binding to the NOS-3 promoter in an oxidative stress dependent manner. Biochem. Pharmacol. 96:39-51). Aquí, hemos investigado la participación de nuevos sitios de unión de FTs (SUFTs) para AP-1 , GATA-1 y GATA-4 en la regulación de la expresión de NOS-3 durante la colestasis experimental en la línea celular de hepatocarcinoma humano HepG2.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la invención se refiere al uso de un inhibidor del factor de transcripción AP-1 en la elaboración de un medicamento para el alivio, mejora, prevención y/o tratamiento de la enfermedad hepática colestásica, o alternativamente, se refiere a un inhibidor del factor de transcripción AP-1 para su uso en el alivio, mejora, prevención y/o tratamiento de la enfermedad hepática colestásica.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es un derivado del ácido retinoico o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es un derivado del ácido retinoico que se selecciona de la lista que consiste en: SR 11302, SR 1 1238, SR 1 1327, SR 11220 y SR11228.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es el SR 1 1302.
COMPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN
Un segundo aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende al menos un inhibidor del factor de transcripción AP-1 , y aún más preferiblemente que consiste en un inhibidor del factor de transcripción AP-1.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es un derivado del ácido retinoico, preferiblemente es el SR 11302.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención comprende al menos otro principio activo. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención es una composición farmacéutica.
Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención en la elaboración de un medicamento.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención en la elaboración de un medicamento para el alivio, mejora, prevención y/o tratamiento de la enfermedad hepática colestásica, o alternativamente a la composición de la invención para su uso para en el alivio, mejora, prevención y/o tratamiento de la enfermedad hepática colestásica. Un quinto aspecto de la invención se refiere a una forma farmacéutica, de ahora en adelante forma farmacéutica de la invención, que comprende la composición de la invención, y aún más preferiblemente que consiste en la composición de la invención.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la forma farmacéutica de la invención se selecciona de la lista que consiste en: emplasto, pomada, pasta, crema, solución, suspensión, emulsión, loción, linimento, gel, hidrogel, hidrocoloide, espuma, polvo, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente la forma farmacéutica de la invención es una solución o suspensión.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Expresión de los factores de transcripción cJun y cFos en las células tratadas con GCDCA. (A) Efecto de la administración of MnTBAP o mitoQ (12 h). Imágenes representativas para la expresión de fosfo (p)-cJun (n=4 y 3, respectivamente) y p-cFos (n=4 y 5, respectivamente) en lisados celulares de HepG2. (B) Efecto de la administración de curcumina o quercetina sobre la expresión de p-cJun, p-cFos y p-SP1 (6 h).
Figura 2. Papel de AP-1 en la regulación de NOS-3 durante la citotoxicidad por GCDCA. Células expuesta o no a GCDCA fueron tratadas con curcumina, quercetina o SR-11302. (A) Actividad del promotor de NOS-3 (pNOS-3) (n=6). (B) Expresión de la proteína NOS-3 (n=3). (C) Actividad caspasa-3 (n=4). Los parámetros fueron determinados a 6 ó 17 h tras el tratamiento. Datos expresados como media ± error estándar. Las diferencias estadísticamente significativas frente al grupo control* o frente al grupo de tratamiento con GCDCA# están marcadas.
Figura 3. Unión de los factores de transcripción cJun y cFos al promotor de NOS-3 (pNOS-3). (A) Expresión génica de la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y NOS-3 como controles positivos. (B) Unión de cJun y cFos al pNOS-3 en la posición -666. Datos expresados como media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Las diferencias estadísticamente significativas frente al grupo control* están marcadas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han obtenido una serie de resultados que muestran el efecto de un derivado del ácido retinoico, concretamente el SR 1 1302, para producir la inhibición del factor de transcripción AP-1 , restaurar la expresión de la oxido nítrico sintasa endotelial (NOS-3) y reducir el daño celular causado por la administración del principal ácido biliar humano, el ácido glicoquenodeoxicólico (GCDCA). De esta manera, el SR 1 1302 podría resultar útil para el tratamiento de las enfermedades hepáticas colestásicas. USO DEL COMPUESTO DE LA INVENCIÓN
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso de un inhibidor del factor de transcripción AP-1 en la elaboración de un medicamento para el alivio, mejora, prevención y/o tratamiento de la enfermedad hepática colestásica, o alternativamente, se refiere a un inhibidor del factor de transcripción AP-1 para su uso en el alivio, mejora, prevención y/o tratamiento de la enfermedad hepática colestásica.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es un derivado del ácido retinoico o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es un derivado del ácido retinoico que se selecciona de la lista que consiste en: SR 11302, SR 1 1238, SR 1 1327, SR 11220 y SR11228. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es el SR 11302.
En esta memoria se entiende por "factor de transcripción AP-1" a la Proteína Activadora 1 (AP- 1). Esta proteína es un factor de transcripción heterodimérico compuesto por proteínas pertenecientes a las familias de c-Fos, c-Jun, ATF y JDP. AP-1 está implicada en la regulación de la expresión de genes relacionados con la respuesta a estímulos, como citoquinas, factores de crecimiento, estrés e infecciones virales o bacterianas. De esta manera, AP-1 controla, distintos procesos celulares incluyendo la diferenciación, proliferación y apoptosis.
En la presente memoria se entiende por inhibidor del factor de transcripción AP-1 , tanto a un inhibidor de la Proteína Activadora 1 heterodimérica en su conjunto, como a un inhibidor de cualquiera de las proteínas de las familias de c-Fos, c-Jun, ATF y JDP que lo forman. Preferiblemente, es un inhibidor de la proteína heterodimérica. En otra realización preferida, es un inhibidor de c-Fos. En otra realización preferida, es un inhibidor de c-Jun, En otra realización preferida, es un inhibidor de ATC. En otra realización preferida, es un inhibidor de JDP. En la presente memoria, c-Fos es una proteína codificada en humanos por el gen fos (van Straaten et al., 1983. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80 (1 1): 3183-7. c-fos es un proto-oncogén celular perteneciente a la familia de factores de transcripción de genes de expresión rápida. La proteína c-Fos presenta un dominio de unión a ADN de tipo cremallera de leucina, así como otro dominio de transactivación en el extremo C-terminal.
En la presente memoria, c- Jun es la proteína codificada por el gen c-jun, es el nombre de un gen que codifica la proteína c-Jun, la cual, tras combinarse con la proteína c-Fos, conforma el factor de transcripción AP-1. Inicialmente fue identificado como proteína p39 de unión a Fos y posteriormente fue redescubierta como el producto del gen c-jun. Su activación se produce por una doble fosforilación a través de la ruta JNK, pero también se ha descrito una función alternativa independiente de fosforilación.
AP-1 es un factor de transcripción que tiene la capacidad de activar la transcripción de los genes que contienen elementos de respuesta a 12-0-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA), caracterizados por la secuencia 5'-TGAG/CTCA-3'. AP-1 se une al ADN por medio de una región de su secuencia rica en aminoácidos básicos, mientras que la estructura dimérica está formada por una cremallera de leucina.
En la presente invención se entiende por "enfermedad hepática colestásica" al conjunto de enfermedades que provocan un daño hepático como consecuencia de un defecto en el flujo de la bilis desde el hígado hasta el duodeno. A esta condición se la denomina colestasis, y puede ser de dos tipos: obstructiva y metabólica. Mientras que la primera de ellas se caracteriza por la existencia de un bloqueo mecánico en el sistema de conductos, y se puede producir a partir de un cálculo biliar o malignidad, la colestasis metabólica se produce a partir de perturbaciones en la formación de bilis, que pueden ocurrir debido a defectos genéticos o adquiridos.
El ácido retinoico (AR) es un metabolito de la vitamina A. El AR se requiere por todos los animales superiores como los peces y los humanos. Tiene un papel fundamental en el desarrollo embrionario. Su fórmula desarrollada es la siguiente:
Figure imgf000007_0001
Fórmula (I)
El AR se obtiene del retinol (vitamina A), que se sintetiza en los animales pero que tiene un origen vegetal ya que proviene del β-caroteno. Una vez el β-caroteno ha sido ingerido, se adhiere en el lumen del intestino por la β-caroteno dioxigenasa y se inicia el proceso síntesis del ácido retinoico. El AR es necesario para impedir la síntesis de queratina de alta masa molecular. Se ha demostrado que los animales con deficiencia de vitamina A son más susceptibles a padecer cáncer debido al potencial antioxidante del β-caroteno y a los efectos que ejercen el retinol y el ácido retinoico en la regulación celular. Interviene en la producción de mucus en las células epiteliales. El AR también participa en los mecanismos que controlan la reacción inflamatoria, ya que ha sido relacionado con la generación y la expresión de óxido nítrico, prostaglandinas, interleucina y citosinas. Estas sustancias actúan en la generación o el mantenimiento del dolor debido a la inflamación. También son sustancias diana para muchos analgésicos. Por otro lado, actúa como agente protector del daño oxidativo en las mitocondrias. El derivado del ácido retinócio puede incluir isómeros, dependiendo de la presencia de enlaces múltiples, incluyendo isómeros ópticos o enantiómeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invención, es decir, el término isómero también se refiere a cualquier mezcla de isómeros, como diastereómeros, racémicos, etc., incluso a sus isómeros ópticamente activos o las mezclas en distintas proporciones de los mismos. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, pueden separarse mediante técnicas convencionales.
Asimismo, dentro del alcance de esta invención se encuentran los profármacos de los compuestos de fórmula (I). El término "prodroga" o "profármaco" tal como aquí se utiliza incluye cualquier derivado de un compuesto de fórmula (I) -por ejemplo y no limitativamente: ésteres (incluyendo ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de aminoácidos, ésteres de fosfato, ésteres de sulfonato de sales metálicas, etc.), carbamatos, amidas, etc.- que al ser administrado a un individuo puede ser transformado directa o indirectamente en dicho compuesto de fórmula (I) en el mencionado individuo. Ventajosamente, dicho derivado es un compuesto que aumenta la biodisponibilidad del compuesto de fórmula (I) cuando se administra a un individuo o que potencia la liberación del compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico. La naturaleza de dicho derivado no es crítica siempre y cuando pueda ser administrado a un individuo y proporcione el compuesto de fórmula (I) en un compartimento biológico de un individuo. La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Tal como aquí se utiliza, el término "derivado" incluye tanto a compuestos farmacéuticamente aceptables, es decir, derivados del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento o composiciones alimentarias, como derivados farmacéuticamente no aceptables, ya que éstos pueden ser útiles en la preparación de derivados farmacéuticamente aceptables. El derivado del ácido retinoico puede estar en forma cristalina como compuesto libre o como solvato. En este sentido, el término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos farmacéuticamente aceptables, es decir, solvatos del compuesto de fórmula (I) que pueden ser utilizados en la elaboración de un medicamento, como solvatos farmacéuticamente no aceptables, los cuales pueden ser útiles en la preparación de solvatos o sales farmacéuticamente aceptables. La naturaleza del solvato farmacéuticamente aceptable no es crítica siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. En una realización particular, el solvato es un hidrato. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación conocidos por los expertos en la materia. Para su aplicación en terapia, el derivado del ácido retinoico, sus sales, profármacos o solvatos, se encontrarán, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superiores al 70%, y todavía más preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% de compuesto de fórmula (I), o de sus sales, solvatos o profármacos.
En esta memoria "SR 11302" se refiere a un compuesto químico de fórmula C26H32O2, también denominado "Ácido (E,E,Z,E)-3-metil-7-(4-metilfenil)-9-(2,6,6-trimetil-1-ciclohexeno-1-yl)- 2,4,6,8-nonatetraenoico", con N° CAS 160162-42-5 y PubChem 9976842 y de peso molecular 376,54 g/mol. Su fórmula es la siguiente:
Figure imgf000009_0001
Fórmula (II) COMPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN
Un segundo aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende al menos un inhibidor del factor de transcripción AP-1 , y aún más preferiblemente que consiste en un inhibidor del factor de transcripción AP-1. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es un derivado del ácido retinoico, preferiblemente es el SR 11302.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención comprende al menos otro principio activo. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el principio activo se selecciona de la lista que consiste en: ácido ursodesoxicólico (UDCA), corticosteroides, inmunosupresores o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la composición de la invención es una composición farmacéutica.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.
La composición farmacéutica de la invención comprenderá al menos un compuesto de la invención, y preferiblemente comprenderá una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la invención. En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración.
Los compuestos descritos en la presente invención, sus sales, profármacos y/o solvatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos, o principios activos, adicionales para proporcionar una terapia de combinación. Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (I), o una sal, profármaco o solvato del mismo.
USOS DE LA COMPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN
Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención en la elaboración de un medicamento. Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de la composición de la invención en la elaboración de un medicamento para el alivio, mejora, prevención y/o tratamiento de la enfermedad hepática colestásica, o alternativamente a la composición de la invención para su uso para en el alivio, mejora, prevención y/o tratamiento de la enfermedad hepática colestásica.
FORMA FARMACÉUTICA DE LA INVENCIÓN
Un quinto aspecto de la invención se refiere a una forma farmacéutica, de ahora en adelante forma farmacéutica de la invención, que comprende la composición de la invención, y aún más preferiblemente que consiste en la composición de la invención. En esta memoria se entiende por "forma farmacéutica" la mezcla de uno o más principios activos con o sin aditivos que presentan características físicas para su adecuada dosificación, conservación, administración y biodisponibilidad.
En otra realización preferida de la presente invención, las composiciones y formas farmacéuticas de la invención son adecuadas para la administración oral, en forma sólida o líquida. Las posibles formas para la administración oral son tabletas, cápsulas, siropes o soluciones y pueden contener excipientes convencionales conocidos en el ámbito farmacéutico, como agentes agregantes (p.e. sirope, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto o polivinil pirrolidona), rellenos (p.e. lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina), disgregantes (p.e. almidón, polivinil pirrolidona o celulosa microcristalina) o un surfactante farmacéuticamente aceptable como el lauril sulfato de sodio. Otras formas farmacéuticas pueden ser los sistemas coloidales, dentro de los cuales se incluyen nanoemulsiones, nanocápsulas y nanopartículas poliméricas.
Las composiciones para administración oral pueden ser preparadas por métodos los convencionales de Farmacia Galénica, como mezcla y dispersión. Las tabletas se pueden recubrir siguiendo métodos conocidos en la industria farmacéutica.
Las composiciones y formas farmacéuticas se pueden adaptar para la administración parenteral, como soluciones estériles, suspensiones, o liofilizados de los productos de la invención, empleando la dosis adecuada. Se pueden emplear excipientes adecuados, como agentes tamponadores del pH o surfactantes. Las formulaciones anteriormente mencionadas pueden ser preparadas usando métodos convencionales, como los descritos en las Farmacopeas de diferentes países y en otros textos de referencia. El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, mejora, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales.
La administración de los compuestos, composiciones o formas farmacéuticas de la presente invención puede ser realizada mediante cualquier método adecuado, como la infusión intravenosa y las vías oral, tópica o parenteral. La administración oral es la preferida por la conveniencia de los pacientes y por el carácter crónico de las enfermedades a tratar.
La cantidad administrada de un compuesto de la presente invención dependerá de la relativa eficacia del compuesto elegido, la severidad de la enfermedad a tratar y el peso del paciente. Sin embargo, los compuestos de esta invención serán administrados una o más veces al día, por ejemplo 1 , 2, 3 ó 4 veces diarias, con una dosis total entre 0,001 y 1000 mg/Kg/día, o entre 0, 1 y 500 mg/Kg/día. Es importante tener en cuenta que puede ser necesario introducir variaciones en la dosis, dependiendo de la edad y de la condición del paciente, así como modificaciones en la vía de administración. Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la forma farmacéutica de la invención se selecciona de la lista que consiste en: emplasto, pomada, pasta, crema, solución, suspensión, emulsión, loción, linimento, gel, hidrogel, hidrocoloide, espuma, polvo, o cualquiera de sus combinaciones. Preferiblemente la forma farmacéutica de la invención es una solución o suspensión.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN
Material y métodos
Líneas celulares y condiciones de cultivo La línea celular de hepatocarcinoma humano HepG2 (Colección Europea de Cultivos Celulares) se mantuvo rutinariamente como hemos descrito anteriormente (Gonzalez-Rubio S, Lopez-Sanchez L, Munoz-Castaneda J, Linares Cl, Aguilar-Melero P, Rodriguez-Peralvarez M, (2015). GCDCA down-regulates gene expression by increasing Sp1 binding to the NOS-3 promoter in an oxidative stress dependent manner. Biochem Pharmacol. 96:39-51). La línea celular pGL4-NOS3 se obtuvo por transfeccion estable de células HepG2 con el plásmido pGL4.20 [Iuc2 / Puro] (Promega, Wisconsin, EE.UU) que contiene el gen informador de la luciferasa bajo el control del promotor de la NOS-3 humana (pNOS- 3; 1601 nucleótidos, GenBank AF387340.1 ; Fig.1). La línea celular de control pGL4 se obtuvo por transfeccion estable de células HepG2 con el vector pGL4.20 [luc2/Puro] sin inserción de secuencia promotora.
Procedimiento experimental
Las células se sembraron en placas de cultivo a una densidad de 150.000 células/cm2. El GCDCA (Sigma-Aldrich) se administró a una concentración de 0,5 mM, 48 h después de la puesta en cultivo. El compuesto mimético de la superóxido dismutasa MnTBAP (manganeso (III) tetrakis (ácido) de cloruro de 4-porfirina benzoico) (Calbiochem, Darmstadt, Alemania) y los antioxidante mitocondrial MitoQ se administraron a una concentración de 0,1 mg/ml y 1 mM, respectivamente. La curcumina (diferuloylmethane), quercetina (Sigma-Aldrich, Missouri, EE.UU) y el inhibidor específico de AP-1 SR-1 1302 (Santa Cruz Biotechnology, California, EE.UU) se utilizaron a 4 μΜ, 20 μΜ y 50 μΜ, respectivamente. Las células se recogieron en diferentes momentos en función del parámetro en estudio. MitoQ se sintetizó según el procedimiento descrito por Kelso y col. (Kelso GF, Porteous CM, Coulter CV, Hughes G, Porteous WK, Ledgerwood EC, 2001. Selective targeting of a redox-active ubiquinone to mitochondria within cells: antioxidant and antiapoptotic properties. J. Biol. Chem.; 276:4588-96). Preparación de los extractos de proteínas celulares
Los extractos de proteínas de HepG2 se obtuvieron incubando las células en un tampón de lisis que contiene Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCI 100 mM, EDTA 2 mM, 1 % NP-40, 1 mM PMSF, 5 μg/ml aprotinina y 10 μg/ml leupeptina (Sigma-Aldrich). La integridad y la concentración de las muestras de proteína fueron determinadas a partir de la tinción rojo-Ponceau y el método de Bradford, respectivamente.
Análisis de la muerte celular
La inducción de la apoptosis se evaluó mediante la medida de la actividad caspasa-3 en los extractos de proteína (100 μg de proteína) como describimos previamente (Gonzalez-Rubio S, Lopez-Sanchez L, Munoz-Castaneda J, Linares Cl, Aguilar-Melero P, Rodriguez-Peralvarez M, (2015). GCDCA down-regulates gene expression by increasing Sp1 binding to the NOS-3 promoter in an oxidative stress dependent manner. Biochem. Pharmacol. 96:39-51 ; González- Rubio S, Hidalgo AB, Ferrin G, Bello Rl, González R, Gahete MD, 2009. Mitochondrial-driven ubiquinone enhances extracellular calcium-dependent nitric oxide production and reduces glycochenodeoxycholic acid-induced cell death in hepatocytes. Chem. Res. Toxicol. 22: 1984- 91 ; Gonzalez-Rubio S, Linares Cl, Bello Rl, González R, Ferrin G, Hidalgo AB, 2010. Calcium- dependent nitric oxide production is involved in the cytoprotective properties of n-acetylcysteine in glycochenodeoxycholic acid-induced cell death in hepatocytes. Toxicol. Appl. Pharmacol. 242: 165-72).
Ensayo de actividad del promotor La actividad del pNOS-3 se midió en las células pGL4-NOS3 y pGL4 utilizando el sistema de ensayo de luciferasa "One-Glow" (Promega). Brevemente, las células se sembraron en una placa de 384 pocilios con paredes negras y fondo transparente (15.000 células/pocilio) y, después de la administración del tratamiento, se lisaron con 20 μΙ de tampón de lisis 1X. 40 μΙ del extracto celular fueron utilizaron para el ensayo de luciferasa de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Análisis de la expresión génica
La expresión génica a nivel de ARNm se determinó mediante PCR cuantitativa en tiempo real, utilizando un el kit comercial "QuantiTect SYBR Green One-Step" (Qiagen, Limburg, Países Bajos). El ARN celular total fue extraído, tratado con ADNasa libre de ARNasa, y utilizado como molde para la amplificación del ARNm de NOS-3 con oligonucleótidos específicos. La expresión de la Proteína Ribosomal L13A (RPL13A) se utilizó para fines de normalización.
Análisis de la expresión de proteínas por western blot
Entre 80-100 μg de proteína de extractos celulares fueron separados en un gel del 10-12% de acrilamida:bisacrilamida (37,5:1) mediante SDS-PAGE, transferidos a membrana de nitrocelulosa y sometidos a inmunodetección mediante el uso de anticuerpos primarios monoclonales o policlonales. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-NOS3 (sc-654, dilución 1 : 200), anti-cJun (sc-1694 / X, dilución 1 :2000), anti-fosfo-cJun (sc-822, dilución 1 :300), anti-cFos (ref. sc-52G, dilución 1 :200), anti-fosfo-cFos (sc-81.485, dilución 1 :100), anti- fosfo-SP1 (ab37707, dilución 1 :1000) y β-actina (sc-47778, dilución 1 : 10.000). Todos los anticuerpos eran de Santa Cruz Biotechnology (California, EE.UU), con excepción de anti- fosfo-SP1 (Abcam, Cambridge, Reino Unido). El análisis de densitometría se realizó mediante el software Quantity One (v.4.4.0) (Bio-Rad, California, EE.UU), utilizando la señal de β-actina como control de carga de proteína.
Producción de óxido nítrico La producción de ON se determinó mediante la reacción de Griess, tal y como se ha descrito previamente (Gonzalez-Rubio S, Lopez-Sanchez L, Munoz-Castaneda J, Linares Cl, Aguilar- Melero P, Rodriguez-Peralvarez M, (2015). GCDCA down-regulates gene expression by increasing Sp1 binding to the NOS-3 promoter in an oxidative stress dependent manner. Biochem. Pharmacol. 96:39-51 ; Gonzalez-Rubio S, Hidalgo AB, Ferrin G, Bello Rl, González R, Gahete MD, 2009. Mitochondrial-driven ubiquinone enhances extracellular calcium-dependent nitric oxide production and reduces glycochenodeoxycholic acid-induced cell death in hepatocytes. Chem. Res. Toxicol. 22: 1984-91 ; Gonzalez-Rubio S, Linares Cl, Bello Rl, González R, Ferrin G, Hidalgo AB, 2010. Calcium-dependent nitric oxide production is involved in the cytoprotective properties of n-acetylcysteine in glycochenodeoxycholic acid-induced cell death in hepatocytes. Toxicol. Appl. Pharmacol. 242: 165-72). A fin de permitir la acumulación de los productos finales relacionados con el ON, nitratos y nitritos, el medio de cultivo extracelular se recogió 24 h después de la administración del tratamiento. Esto aseguró la sensibilidad y la reproducibilidad de la reacción. Las concentraciones de nitrito se determinaron con precisión a partir de una curva de calibración de concentraciones conocidas.
Identificación de sitios de unión para factores de transcripción en pNOS-3
La identificación de los sitios de unión para factores de transcripción (SUFTs) teóricos en la secuencia de pNOS-3 se realizó mediante tres programas de predicción gratuitos disponibles en internet: "Transcription Factor Search" (TFsearch v.1.3; http://www.cbrc.jp. reserach/db/TFSEARCH. html), "Transcription Element Search System" (TESS; http://www.cbil.upenn.edu/tess) y "Transcription Factor Site Sean" (TF site sean; http://www.ifti.org/cgi-bin/ifti/Tfsitescan.pl).
Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP-RT-qPCR)
El ensayo de ChIP se realizó como se ha descrito previamente, usando núcleos aislados a partir de las células HepG2 fijadas con formaldehído Fernandez-Alvarez A, Soledad Alvarez M, Cucarella C, Casado M, 2010. Characterization of the human insulin-induced gene 2 (INSIG2) promoter: the role of Ets-binding motifs. J. Biol. Chem. 285: 1 1765-74). La inmunoprecipitación se realizó utilizando anticuerpos primarios anti-cJun o anti-cFos, junto con bolas magnéticas (Dynabeads® proteína G, Life Technologies). La ARN polimerasa II (Poli I) y la IgG de conejo se utilizaron como controles positivo y negativo, respectivamente, utilizando anticuerpos anti- Polll (sc-899) y anti-lgG (sc-2027). 4 μg de anticuerpo fueron utilizados para cada experimento. Todos los anticuerpos primarios fueron de Santa Cruz Biotechnology. Las muestras purificadas fueron analizadas mediante RT-qPCR, utilizando el kit "SensiFast SYBR" (Bioline, Londres, Reino Unido) y los siguientes oligonucleótidos específicos para detectar secuencias diana: Sitio -666 para AP-1 , 5'-CTTTTGTGTCCCCCACTTGAG-3' y 5'-CAATTTCCTGGAACCCCCAC-3'; Sitio -235 para GATA-1 , 5'-AGGGCTCTGCTGGACACCT-3' y 5'- GCTGTGAGGACTGAGGCTGAT-3'; Sitio -1 144 para GATA-1/-4, 5'- CCCACCCCAACCTTATCCTC-3' y 5'-TTGTGTTGGCCAGACTCCTCT-3' . Los cebadores para detectar las regiones codificantes para NOS-3 (NM_000603.4) y gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; NM_002046.4) están recogidas en [7]. Para los propósitos de cuantificación, se elaboró una curva de calibración para cada amplificado mediante la dilución seriada 1 : 10 del "imput" total. Los resultados se expresaron como porcentaje del "imput", considerando a este como el 100% y al control negativo como el 0%.
Análisis estadístico
Los resultados se expresaron como media ± error estándar de un mínimo de 3 experimentos independientes. Los datos se compararon mediante el método no paramétrico de Kruskal- Wallis y la prueba T3 de Dunnett como el análisis de comparación múltiple post-hoc. Los datos del análisis de ChIP, involucrando las muestras control y las muestras tratadas con GCDCA, se analizaron con la prueba de U de Mann-Whitney. Las diferencias estadísticas se establecieron en p<0,05 en todos los estudios. Todas las pruebas y cálculos se realizaron con el paquete estadístico Statview 5.0 (SAS Institute, Inc.) y SPSS 15.0 (IBM) para Windows.
Resultados
El estrés oxidativo inducido por GCDCA estimula la expresión y activación de cJun y cFos
El análisis bioinformático de la secuencia del pNOS-3 identificó sitios de unión para FTs (SUFTs) candidatos, que podrían participar en la modulación de la expresión de NOS-3. Sólo aquellos SUFTs (diferentes de SP1) que fueron identificados por las tres herramientas bioinformáticas de predicción utilizadas fueron seleccionados para su posterior análisis. Así pues, fueron considerados los SUFTs para AP-1 y GATA-1 en las posiciones descritas en la Tabla 1.
Con objeto de dilucidar si AP-1 (heterodímero formado por cJun y cFos) estaba involucrado en la regulación NOS-3 durante la citotoxicidad por GCDCA, se determinó su tasa de expresión y activación en las células HepG2. GCDCA aumentó la expresión de las proteínas cJun (233% p=0,024) y cFos (185% p=0,006), y sus estados de fosforilación (233% p=0,035 y 202% p=0,009, respectivamente). La protección celular contra el daño oxidativo mediante el tratamiento con los antioxidantes MnTBAP o MitoQ redujo las tasas de expresión y fosforilación de cJun y cFos durante la citotoxicidad inducida por GCDCA (Figura 1A).
Tabla 1. Sitios de unión propuestos para los factores de transcripción (FTs) AP-1 y GATA-1 en la región del promotor de NOS-3 (1.6 Kb). TFSEARCH TESS TFSITESCAN
FT Posición Secuencia Posición Secuencia Posición Secuencia
AP-1 -666 TTGAGTCAT -665 TGAGTCA -665 TGAGTCA
-1 144 CCTTATCCTC -1 142 TTATC
GATA-1
CCACTTATCA
-235 -232 CTTATCA -232 WGATAMS
GCCT
"TFSEARCH", "TESS" y "TFSITESCAN" son tres programas de acceso libre en internet que funcionan como herramientas para la predicción de sitios de unión para factores de transcripción en secuencias de ADN. 'Posición' hace referencia a la secuencia del pNOS-3 (NCBI, número de acceso Gl: 14669582). W es A/T, M es A/C, S es C/G, K es G/T, R es A/G.
AP-1 participa en la desregulación de NOS-3 durante la citotoxicidad inducida por GCDCA
A continuación, se evaluó la participación de AP-1 en la regulación de NOS-3 durante la muerte celular inducida por GCDCA probando diferentes inhibidores del FT (IFT). Así, utilizamos curcumina, quercetina y el retinoide sintético SR-1 1302. Este último, es bien conocido por ser un inhibidor específico de AP-1. Sin embargo, cuando ensayamos curcumina y quercetina encontramos que, además de su papel inhibitorio sobre AP-1 , también afectaban al estado de fosforilación de SP1 (Figura 1 B).
Cuando más tarde se investigó el efecto de la inhibición de AP-1 en las células pGL4-NOS3 tratadas con GCDCA, encontramos que todos los IFTs ensayados, curcumina, quercetina y SR-1 1302, eran capaces de restaurar la actividad transcripcional del pNOS-3 (Figura 2A) y la expresión de la proteína NOS-3 (Figura 2B). Este hecho se relacionó con una marcada reducción en la actividad de la caspasa-3 (Figura 2C).
GCDCA incrementa la unión de AP-1 al pNOS-3
Con el fin de probar el efecto de la administración GCDCA en la capacidad de unión de AP-1 a la secuencia pNOS-3, se realizaron ensayos de ChIP. Para ello, seleccionamos un SUFT para AP-1 localizado en la posición -666 del promotor (Tabla 1). La GAPDH y NOS-3 se utilizaron como controles positivos de la inmunoprecipitación y de la expresión génica, respectivamente (Figura 3A). La inmunoprecipitación de las muestras de HepG2 con anticuerpos anti-cJun o anti-cFos, mostró unión de cJun (p=0,021) y cFos (p=0,034) en esta posición del pNOS-3 tras la administración de GCDCA (Figura 3B). Adicionalmente, probamos la unión de los FTs GATA-1 y GATA-4 en las posiciones descritas en la Tabla 1. Sin embargo, no encontramos unión de GATA-4 a ninguna de esas posiciones en condiciones básales ni tras la administración de GCDCA. Tampoco se observaron diferencias significativas tras la administración de GCDCA cuando se estudió la unión de GATA-1 a estas mismas posiciones (datos no mostrados).
Previamente, se ha publicado que la expresión de NOS-3 en el hígado tiene un papel protector (Biecker E, Trebicka J, Kang A, Hennenberg M, Sauerbruch T, Heller J. (2008). Treatment of bile duct-ligated rats with the nitric oxide synthase transcription enhancer AVE 9488 ameliorates portal hypertension. Liver lnt. 28:331-8; Lee KC, Yang YY, Huang YT, Lee FY, Hou MC, Lin HC. (2010). Administration of a low dose of sildenafil for 1 week decreases intrahepatic resistance in rats with biliary cirrhosis: the role of NO bioavailability. Clin. Sci. (Lond). 1 19:45-55). Además, diferentes condiciones que están relacionadas con la generación de estrés oxidativo pueden regular la actividad del pNOS-3 (Gonzalez-Rubio S, Lopez-Sanchez L, Munoz-Castaneda J, Linares Cl, Aguilar-Melero P, Rodriguez-Peralvarez M, (2015). GCDCA down-regulates gene expression by increasing Sp1 binding to the NOS-3 promoter in an oxidative stress dependent manner. Biochem. Pharmacol. 96:39-51 ; Kumar S, Sun X, Wedgwood S, Black SM. 2008. Hydrogen peroxide decreases endothelial nitric oxide synthase promoter activity through the inhibition of AP-1 activity. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.; 295:L370-7; Kumar S, Sun X, Wiseman DA, Tian J, Umapathy NS, Verin AD. 2009. Hydrogen peroxide decreases endothelial nitric oxide synthase promoter activity through the inhibition of Sp1 activity. DNA Cell Biol.; 28: 119-29. Min J, Jin YM, Moon JS, Sung MS, Jo SA, Jo I. 2006. Hypoxia-induced endothelial NO synthase gene transcriptional activation is mediated through the tax-responsive element in endothelial cells. Hypertension. 47: 1189-96. La colestasis es un trastorno que se asocia con el daño oxidativo y con la regulación de la expresión de NOS-3 (Biecker E, Trebicka J, Kang A, Hennenberg M, Sauerbruch T, Heller J. (2008). Treatment of bile duct-ligated rats with the nitric oxide synthase transcription enhancer AVE 9488 ameliorates portal hypertension. Liver Int. 28:331-8. Recientemente hemos demostrado evidencias acerca de la participación de SP-1 en la regulación de la actividad del pNOS-3 dependiente de estrés oxidativo, durante la citotoxicidad inducida por GCDCA. Por lo tanto, SP1 regularía negativamente la actividad transcripcional de pNOS-3 y, por tanto, la expresión y actividad de NOS-3 (Gonzalez-Rubio S, Lopez-Sanchez L, Munoz-Castaneda J, Linares Cl, Aguilar-Melero P, Rodriguez-Peralvarez M, (2015). GCDCA down-regulates gene expression by increasing Sp1 binding to the NOS-3 promoter in an oxidative stress dependent manner. Biochem. Pharmacol. 96:39-51).
En el presente estudio, hemos identificado nuevos SU FTs candidatos en la secuencia del pNOS-3, que podrían estar implicados en la regulación de la expresión génica por ácidos biliares. Entre ellos, el sitio de unión para AP-1 fue particularmente interesante porque, como hemos señalado anteriormente en el caso de SP-1 , es un FT sensible al estado redox celular, implicado en una variedad de procesos celulares incluyendo la regulación de la expresión NOS-3 (Marsden P.A., Heng H.H., Scherer S.W., Stewart R.J., Hall A.V., Shi X.M. 1993. Structure and chromosomal localization of the human constitutive endothelial nitric oxide synthase gene. J. Biol. Chem. 268: 17478-88) y la apoptosis celular inducida por ácidos biliares (Bernt C, Vennegeerts T, Beuers U, Rust C. 2006. The human transcription factor AP-1 is a mediator of bile acid-induced liver cell apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340:800-6; Higuchi H, Grambihler A, Canbay A, Bronk SF, Gores GJ. 2004. Bile acids up-regulate death receptor 5/TRAIL-receptor 2 expression via a c-Jun N-terminal kinase-dependent pathway involving Sp1. J Biol Chem.279:51-60. La respuesta celular a GCDCA se caracterizó por un aumento de la expresión y activación de cJun y cFos, así como de la unión de estos al SUFT identificado en el pNOS-3 en la posición -666. Esto sugiere que el complejo AP-1 se une en esta posición como un heterodímero. Esto dio lugar a una disminución de la actividad del pNOS-3 y de la expresión de la proteína NOS-3. La administración de la curcumina o quercetina como inhibidores de AP-1 revirtió la activación del FT inducida por GCDCA, así como la disminución de la expresión de NOS-3. Sin embargo, y puesto que estos dos compuestos también han sido descritos como inhibidores de SP1 con propiedades antioxidantes (referencia), y ambos, SP1 y el estrés oxidativo, están relacionados con la regulación de la expresión de NOS-3 durante la colestasis (Gonzalez-Rubio S, Lopez-Sanchez L, Munoz-Castaneda J, Linares Cl, Aguilar-Melero P, Rodriguez-Peralvarez M, (2015). GCDCA down-regulates gene expression by increasing Sp1 binding to the NOS-3 promoter in an oxidative stress dependent manner. Biochem. Pharmacol. 96:39-51), no pudimos atribuir estos resultados a la inhibición específica de AP-1. Como esperábamos, la inhibición específica de AP-1 con el compuesto SR-1 1302 resultó en la protección celular contra la muerte celular inducida por GCDCA a través del mismo mecanismo descrito anteriormente para el tratamiento antioxidante o la inhibición de SP-1. Por lo tanto, el retinoide se recuperó la actividad pNOS-3 y la expresión de NOS-3 mediante la inhibición de AP-1.
Es sabido que AP-1 está implicado en la regulación de NOS-3 por ciclosporina A e hipoxia (Navarro-Antolin J, Rey-Campos J, Lamas S. 2000. Transcriptional induction of endothelial nitric oxide gene by cyclosporine A. A role for activator protein-1. J. Biol. Chem. 275:3075-80; Hoffmann A, Gloe T, Pohl U. 2001. Hypoxia-induced upregulation of eNOS gene expression is redox-sensitive: a comparison between hypoxia and inhibitors of cell metabolism. J. Cell Physiol. 188: 33-44), los cuales están relacionados con el estrés oxidativo. Por el contrario, el antioxidante ácido nordihidroguaiarético regula positivamente la expresión de NOS-3 a través del incremento de la unión de AP-1 al pNOS-3 en las células endoteliales arteriales pulmonares (Kumar S, Wedgwood S, Black SM. 2007. Nordihydroguaiaretic acid increases endothelial nitric oxide synthase expression via the transcription factor AP-1. DNA Cell Biol. 26:853-62). Kumar et al. demostraron que la unión de AP-1 en la misma posición del pNOS-3 que discutimos aquí, regula la actividad del promotor en respuesta al estrés oxidativo. Sin embargo, en dicho estudio, la adición de peróxido de hidrógeno reducía la actividad pNOS-3 mediante la disminución de la unión de AP-1 al pNOS-3 (Kumar S, Sun X, Wedgwood S, Black SM. 2008. Hydrogen peroxide decreases endothelial nitric oxide synthase promoter activity through the inhibition of AP-1 activity. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295:L370-7). Aquí, también hemos observado una disminución de la actividad del promotor como consecuencia del aumento de la producción intracelular de ROS. Sin embargo, dicha disminución se asoció con un aumento de la unión de AP-1 en esa posición del promotor. Este resultado concuerda con nuestros hallazgos previos sobre el papel de SP-1 como represor transcripcional de NOS-3, en el mismo modelo celular de colestasis (Gonzalez-Rubio S, Lopez-Sanchez L, Munoz- Castaneda J, Linares Cl, Aguilar-Melero P, Rodriguez-Peralvarez M, (2015). GCDCA down- regulates gene expression by increasing Sp1 binding to the NOS-3 promoter in an oxidative stress dependent manner. Biochem. Pharmacol. 96:39-51). En este sentido, llama la atención que AP-1 regula numerosos genes de mamíferos a menudo en cooperación con FTs como SP- 1. Curiosamente, la actividad de AP-1 en el pNOS-3 es dependiente de la presencia de SP-1 , siendo ambos necesarios para la activación del pNOS-3 (Xing F, Jiang Y, Liu J, Zhao K, Mo Y, Qin Q, 2006. Role of AP1 element in the activation of human eNOS promoter by lysophosphatidylcholine. J. Cell Biochem. 98:872-84).
Para los otros FTs candidatos analizados, o bien no se observó ninguna unión al promotor (GATA-4), o bien no se encontraron diferencias en la capacidad de unión tras la administración de GCDCA (GATA-1). Por lo tanto, si la unión de GATA al pNOS-3 en la posición -235 es requerida para modular la actividad de SP-1 en la posición -103 durante la actividad basal del promotor (Zhang R, Min W, Sessa WC. 1995. Functional analysis of the human endothelial nitric oxide synthase promoter. Sp1 and GATA factors are necessary for basal transcription in endothelial cells. J. Biol. Chem. 270: 15320-6), dicho fenómeno no implica a GATA-4.
Nuestros datos muestran que AP-1 puede funcionar como represor transcripcional de la expresión de NOS-3 mediante la unión directa a la secuencia promotora en la posición -666. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que identifica un papel inhibitorio para AP-1 en la expresión NOS-3. Sin embargo, este no es un caso excepcional ya que la sobreexpresión de cJun y cFos en células epiteliales se ha asociado con una reducción de la actividad del promotor de NOS-2 (Kleinert H, Wallerath T, Fritz G, Ihrig-Biedert I, Rodríguez-Pascual F, Geller DA. 1998. Cytokine induction of NO synthase I I in human DLD-1 cells: roles of the JAK- STAT, AP-1 and NF-kappaB-signaling pathways. Br J Pharmacol. 125: 193-201).
En resumen, el estrés oxidativo inducido por GCDCA causó la activación de los FTs cJun y cFos, y su unión al pNOS-3 en la posición -666. Este hecho fue relacionado con la represión de la actividad promotora, la disminución de la expresión/actividad de NOS-3 y la muerte celular. En un modelo experimental de colestasis in vivo, el daño hepatocelular observado se asoció con la inhibición de la expresión NOS-3 y la activación de los FTs cJun y cFos (datos no mostrados).
La regulación de la actividad de cJun y cFos por estrés oxidativo y la participación de NOS-3 en este proceso representa un nuevo mecanismo por el cual la acumulación de ácidos biliares causa un efecto citotóxico, y proporciona una nueva diana terapéutica para las EHC. Es sabido que las actividades biológicas de los retinoides están mediadas por la activación transcripcional del elemento de respuesta a ácido retinoico (RARE) y la inhibición de la actividad AP-1. Sin embargo, el uso clínico de los retinoides es limitado debido a sus efectos secundarios (Pfahl M, Apfel R, Bendik I, Fanjul A, Graupner G, Lee MO, 1994. Nuclear retinoid receptors and their mechanism of action. Vitam Horm. 49:327-82), lo cual podría deberse a la activación transcripcional de los RARE. Así, sólo la transrepresión de AP-1 , pero no la transactivación de los RARE, por los retinoides parece estar causalmente relacionada con su actividad antitumoral (Li JJ, Dong Z, Dawson MI, Colburn NH. 1996. Inhibition of tumor promoter-induced transformation by retinoids that transrepress AP-1 without transactivating retinoic acid response element. Cáncer Res. 56:483-9). Afortunadamente, hay una clase de retinoides sintéticos capaces de inhibir la actividad AP-1 sin necesidad de activar la transcripción de los RARE (Li JJ, Dong Z, Dawson MI, Colburn NH. 1996. Inhibition of tumor promoter-induced transformation by retinoids that transrepress AP-1 without transactivating retinoic acid response element. Cáncer Res. 56:483-9; Lehmann JM, Jong L, Fanjul A, Cameron JF, Lu XP, Haefner P. 1992. Retinoids selective for retinoid X receptor response pathways. Science. 258: 1944-6; Fanjul A, Dawson MI, Hobbs PD, Jong L, Cameron JF, Harlev E. 1994. A new class of retinoids with selective inhibition of AP-1 inhibits proliferation. Nature.372: 107-11), que han sido previamente propuestos como agentes terapéuticos con efectos secundarios reducidos. Por lo tanto, estos retinoides son transcripcionalmente inactivos y han perdido los efectos diferenciadores del ácido retinoico, pero conservan sus efectos antiproliferativos resultantes de la inhibición de la actividad AP-1. SR-1 1302 pertenece a esta nueva clase de retinoides y su uso ha sido descrito en patologías humanas tales como la inflamación peritoneal (Catar R, Witowski J, Wagner P, Annett Schramm I, Kawka E, Philippe A. 2013. The proto-oncogene c-Fos transcriptionally regulates VEGF production during peritoneal inflammation. Kidney Int. 84: 11 19-28) y el cáncer (Huang C, Ma WY, Dawson MI, Rincón M, Flavell RA, Dong Z. 1997. Blocking activator protein- 1 activity, but not activating retinoic acid response element, is required for the antitumor promotion effect of retinoic acid. Proc. Nati. Acad. Sci. U S A. 94:5826-30; Li JJ, Dong Z, Dawson MI, Colburn NH. 1996. Inhibition of tumor promoter-induced transformation by retinoids that transrepress AP-1 without transactivating retinoic acid response element. Cáncer Res. 56:483-9). En nuestro modelo experimental de colestasis, la inhibición de AP-1 por el bloqueo farmacológico con SR-11302 se asoció con la protección contra la muerte celular inducida por GCDCA. La aparente seguridad de SR-1 1302 en comparación con otros agentes candidatos tales como mitramicina A y ácido tolfenámico, hace del retinoide sintético una herramienta terapéutica alternativa interesante para el tratamiento de las EHC.

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Uso de un inhibidor del factor de transcripción AP-1 en la elaboración de un medicamento para el alivio, mejora, prevención y/o tratamiento de la enfermedad hepática colestásica.
2. - El uso de un inhibidor del factor de transcripción AP-1 según la reivindicación anterior, donde el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es el ácido retinoico, un análogo o un derivado del mismo, o cualquiera de sus sales, ésteres, tautómeros, solvatos e hidratos farmacéuticamente aceptables, o cualquiera de sus combinaciones.
3. - El uso de un inhibidor del factor de transcripción AP-1 según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es un derivado del ácido retinoico que se selecciona de la lista que consiste en: SR 1 1302, SR 1 1238, SR 1 1327, SR 11220 y SR11228.
4. - El uso de un inhibidor del factor de transcripción AP-1 según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es el SR 1 1302.
5. - Una composición que comprende al menos un inhibidor del factor de transcripción AP-1 según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. - La composición según la reivindicación anterior, donde el inhibidor del factor de transcripción AP-1 es el SR 1 1302.
7. - La composición según cualquiera de las reivindicaciones 5-6, que además comprende al menos otro principio activo.
8.- La composición según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, que es una composición farmacéutica.
9. - Una forma farmacéutica que comprende la composición según cualquiera de las reivindicaciones 5-8.
10. - La forma farmacéutica según la reivindicación anterior que se selecciona de la lista que consiste en: emplasto, pomada, pasta, crema, solución, suspensión, emulsión, loción, linimento, gel, hidrogel, hidrocoloide, espuma, polvo, o cualquiera de sus combinaciones.
1 1.- La forma farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 que es una solución o suspesión.
12. - Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, o de una forma farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 , en la elaboración de un medicamento.
13. - Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, o de una forma farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 , en la elaboración de un medicamento para el alivio, mejora, prevención y/o tratamiento de la enfermedad hepática colestásica.
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