WO2017078571A1 - Пролонгированный фактор эритропоэза человека и лекарственное средство на его основе - Google Patents

Пролонгированный фактор эритропоэза человека и лекарственное средство на его основе Download PDF

Info

Publication number
WO2017078571A1
WO2017078571A1 PCT/RU2016/000740 RU2016000740W WO2017078571A1 WO 2017078571 A1 WO2017078571 A1 WO 2017078571A1 RU 2016000740 W RU2016000740 W RU 2016000740W WO 2017078571 A1 WO2017078571 A1 WO 2017078571A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
depo
conjugate
anemia
erythropoiesis
alpha
Prior art date
Application number
PCT/RU2016/000740
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Дмитрий Валентинович МОРОЗОВ
Татьяна Вениаминовна ЧЕРНОВСКАЯ
Елена Георгиевна Руденко
Марина Викторовна ПЛОТЧЕНКОВА
Елена Леонидовна Морозова
Роман Алексеевич ИВАНОВ
Original Assignee
Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Закрытое Акционерное Общество "Биокад" filed Critical Закрытое Акционерное Общество "Биокад"
Publication of WO2017078571A1 publication Critical patent/WO2017078571A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol

Definitions

  • the present invention relates to pharmaceuticals and medicine, in particular, to new biologically active conjugates of erythropoiesis factor with prolonged action, in particular, to new conjugates of darbepoetin with polyethylene glycol, which can be used in medicine, for example, for the treatment and prevention of a number of anemias with insufficient production of endogenous EPO, including for the treatment of anemia associated with chronic renal failure, cytostatic chemotherapy and therapy of viral diseases, and anemia, causing massive blood loss of various origins and
  • EPO erythropoietin
  • dEPO darbepoetin
  • the EPO molecule consists of 165 amino acid residues and contains three ⁇ -glycosylation sites for asparagine residues at position 24, 38 and 83 and one O-glycosylation site for serine at position 126 [1-2]
  • the terminal position of the oligosaccharides is occupied by sialic acid residues, from the content which depends on stability and functional
  • CHO cells transformed with the target gene are usually used [5].
  • the recombinant human EPO produced by CHO cells is a mixture of 14 isoforms that differ in sialic acid content, so one a protein molecule may contain from 0 to 14 sialic acid residues.
  • the sialic acid-free EPO isoforms (asialo-EPO) more effectively bind to the cellular EPO receptor in vitro [5], but their in vivo functional activity is much lower from the rapid excretion of 5 asialo-EPO from the body as a result of interaction with asialoglycoprotein liver protein [6-7].
  • EPO isoforms containing the maximum amount of sialic acid residues have higher in vivo activity and therapeutic value, since the presence of sialic acid prevents the rapid clearance of sialylated EPO molecules from the body.
  • the functional activity of EPO in vivo is directly proportional to the content of sialic acids [7].
  • the darbepoetin molecule contains five amino acid substitutions (Ala30Asn, His32Thr, Pro87Val, Trp88Asn and Pro90Thr).
  • the DEPO molecule has 5 ⁇ -glycosylation sites for asparagines at position 24, 30, 38, 83 and 88, one serine O-glycosylation site at position 126, so that, as compared to EPO, the maximum possible
  • DEPO-alpha darbepoetin-alpha
  • Recombinant DEPO-alpha is obtained from transformed cells from CHO carrying the darbepoetin gene.
  • Synthesized in DEPO Cells is a heterogeneous mixture of isomers that differ in sialic acid content. .
  • the number of sialic acid molecules per protein molecule varies from 0 to 22.
  • the content of highly sialylated isoforms (18-22) varies from 5-30% depending on the cells used and 5 cultivation conditions.
  • the total mixture of DEPO isoforms is fractionated by ion chromatography, and highly salted purified isoforms 18-22 are used to produce DEPO-alpha.
  • Low-sialylated isoforms of darbepoetin (dEPO-ns) comprising at least 50% of the synthesized dEPO protein, are not used.
  • the Aranesp drug based on DEPO-alpha is mainly used to treat various anemia with insufficient production of endogenous EPO, mainly anemia associated with chronic renal failure.
  • drugs with a more prolonged action for example, based on pegylated EPO / DEPO, in which the native protein molecule is chemically bound to polyethylene glycol [13-17] or based on hybrid EPO / dEPO proteins fused to an immunoglobulin Fc fragment or synthetic peptide [eighteen].
  • each new in structure molecule of the PEGylated protein will have unique biological and physicochemical properties. Moreover, it is impossible to predict how the properties of the resulting PEGylated proteins will change. It is also impossible to theoretically predict the degree and direction (negative, positive) of the effect of PEGylation on the properties of the conjugates obtained [19-23], which can provide the most effective therapeutic effect of the PEGylated protein without negative side effects with subsequent use in clinical practice.
  • PEG-EPO conjugates were described in [27], in which PEG with a molecular weight of 12 kDa containing various activated groups (SC-PEG, SS-PEG, PEG-imidate or mPEG-cyanuric chloride) was coupled to EPO via available NH 2 - rpynnbi protein, in particular through the N-terminal alpha-amino group and epsilon of the amino group of lysines at positions 52, 116 and 154 with the formation of a carbamate bond.
  • the PEGylation reaction was carried out at pH 6.5-7.5. Depending on the reaction conditions, the ratio of various positional isomers in the resulting conjugates changed.
  • the resulting conjugates had biological activity and prolonged action.
  • the disadvantage of the proposed modification is the use of activated PEGs with a low molecular weight, which had the ability to bind to different parts of the protein, which led to the appearance of several positional isomers in the resulting conjugates.
  • PEG cEPO conjugate obtained using succinimidyl derivatives of PEG (SBA-PEG and SPA-PEG) with a molecular weight of 30 kDa, which are able to interact with free amino groups of the protein to form an amide bond, was described in [15, 28–29].
  • the PEGylation reaction was carried out at pH 7.5.
  • the content of modified PEG reached 75%, mono-PEGylated EPO was 30–40%, and 25–38% accounted for non-target diPEGylated molecules.
  • PEG-dEPO conjugates containing glyco-PEGylated EPO were described in [30–32].
  • the binding of PEG to the EPO molecule was carried out via native or oxidized carbohydrate residues using a number of enzymes.
  • PEGylation was carried out under conditions of a 250 fold excess of PEG ( ⁇ 007812). Data on the yield and purity of the obtained target mono-PEGylated conjugate are not indicated. It was shown that the obtained PEG-EPO conjugates [30–31] had a 5 prolonged action compared to unmodified EPO and hyperglycosylated EPO.
  • the disadvantages of obtaining the described conjugates is the use of expensive enzymes and the reaction in an excessive excess of expensive PEG.
  • conjugates obtained is the use of fragments of EPO and mutant forms of EPO, the primary structure of which differs from natural EPO, which can increase the immunogenicity of such conjugates in clinical use.
  • the resulting conjugates were purified from reaction products by high performance liquid chromatography.
  • the disadvantage of the obtained conjugates is the use of mutant forms of protein and two-stage PEGylation technology.
  • the prototype for the present invention is the PEG conjugate with the DEPO molecule described in [38–39].
  • the preparation DEPO-alpha and various activated MPEG, in particular MPEG-SPA, and MPEG-aldehyde were used.
  • the molecular weight of the attached MPEG was 5 and 20 kDa.
  • DEPO-alpha 25 molar excess of PEG with respect to DEPO-alpha for 1 hour at room temperature.
  • the resulting conjugates had improved pharmacokinetic parameters compared with unmodified DEPO-alpha.
  • the disadvantage is the use of DEPO-alpha, the preparation of which is characterized by a high cost price.
  • culture is used for the production of DEPO-alpha.
  • liquid of transformed CHO cells containing a mixture of DEPO isomers with different amounts of sialic acids per mole of protein from 0 to 22.
  • Highly salted DEPO isoforms with sialic acid content of 18-22 mol / mol protein, used to produce DEPO-alpha usually make up 5-30% of the protein synthesized in the cell.
  • DEPO-alpha due to its high degree of sialylation, has a lower affinity for binding to the EPR cell receptor in vitro than low-sialylated forms of DEPO.
  • the addition of the PEG molecule to the highly sialylated DEPO-alpha will further reduce the biological activity in vitro.
  • DEPO-ns low-sialylated forms of DEPO
  • PEG polyethylene glycol
  • new molecules may possess biological properties different from those of unmodified DEPO.
  • DEPO drugs with an erythropoiesis-stimulating effect
  • the possibility of developing hypoglycemia requires constant monitoring of the level of glucose in the blood of patients, and immediate correction when it decreases. Improving the safety of using DEPO in the clinic can be achieved through the use of new DEPO molecules that do not have a hypoglycemic effect.
  • the objective of the present invention was to obtain a new stable conjugate of PEG and DEPO-ns with improved pharmacokinetic parameters and improved safety due to the use of low-sialylated DEPO-ns and MPEG in the conjugate with a molecular weight of 30-40 kDa, suitable for creating a safe medicinal product for medical use, contributing to the expansion of the arsenal of drugs of a given orientation and pharmaceutical composition based on the obtained PEG-DEPO-ns conjugate.
  • the problem is solved by creating new molecules of functionally active PEG and DEPO conjugates with erythropoiesis-stimulating activity with prolonged action, not causing pronounced hypoglycemia, in which a linear PEG molecule with a molecular weight of 30,000 Da or a branched PEG molecule with a molecular weight of 40,000 Yes is associated with a low-sialylated DEPO molecule with a stable bond through the free amino groups of the protein, so that the general formulas of PEG-DEPO conjugates with a linear mPEG of 30,000 Da and a branched mPEG-40,000 Yes represent are the following compounds (I) and (II), respectively:
  • n is an integer> 4;
  • n are integer values from 284 to 398;
  • DEPO-ns is a low-sialylated darbepoetin containing less than 50% tetrasialized antenna structures.
  • DEPO-ns darbepoetin containing less than 50% tetrasialized antenna structures, whose in vitro functional activity (binding to a cell receptor that determines the proliferation activity of DEPO on TF 1 cells) is 4 times higher than that of DEPO-alpha (in the method -prototype used DEPO-alpha);
  • n are integer values from 568 to 795;
  • n is an integer> 3;
  • the conjugation reaction was carried out at a pH below 6.0 in the presence of a reducing agent at a temperature equal to or lower than 20 ° C for 20-24 hours.
  • the PEG / protein molar ratio was 1.5-6 / 1.
  • the conjugation reaction was carried out at a pH above 8.5 at a temperature equal to or below 20 ° C for 4 hours.
  • the PEG / protein molar ratio was 1.5-3 / 1.
  • PEG30-DEPO-ns and PEG40-dEPO-ns conjugates were performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in the presence of sodium dodecyl sulfate (DDS) under reducing conditions and reverse phase high performance chromatography (RP-HPLC).
  • the conjugates of mono-PEGZO-DEPO-ns and mono-PEG40-DEPO-ns were purified from the reaction products, unmodified DEPO-ns and undesirable PEGylated forms of DEPO-ns containing two or more PEG molecules per protein molecule, using single-stage chromatography on anion-exchange sorbents.
  • the target fractions of mono-PEG-DEPO-ns were eluted with a gradient of sodium chloride concentration from 0.05 to 0.2 M in a buffer solution with a pH below 6.
  • the purified preparation of mono-PEG-DEPO was dialyzed against a 1-20 mM buffer solution with a pH of 4-5; salts, or polysaccharides, or polyhydric alcohols, or polyvinylpyrrolidones, or monosaccharides, or amino sugars, or proteins, or amino acids and non-ionic detergents and were stored in plastic or glass vials with a siliconized surface at a temperature of 4-2 ° C.
  • the drug Aranesp manufactured by Amgen Europe B.V., was used as DEPO-alpha. Lot 1042847 or preparation DEPO-alpha, manufactured by JSC Biocad, series 1 15061212 ⁇ .
  • the distribution of isoforms of DEPO-ns and DEPO-alpha was carried out in comparison with epoetin-alpha (EPO-alpha, Eprex preparation manufactured by Janssen Pharmaceuticals HB, SSC6100 series).
  • FIG. 1 Analysis of drugs preparations DEPO-alpha (drug Aranesp, Amgen Europe BV, lot 1042847), DEPO-ns ("ZAO Biocad”) and EPO-alpha (Eprex drug,) by isoelectric focusing method.
  • FIG. 2 The content of oligosaccharide antenna structures
  • a - dEPO-alpha drug Aranesp, Amgen Europe B.V. lot 1042847
  • B-DEPO-ns obtained according to claim 1; 1-4 - oligosaccharide structures: 1 - monosialylated, 2 - disialylated, 3 - trisialylated, 4 - tetrasialized.
  • FIG. 3 Determination of the functional activity of DEPO-ns and DEPO-alpha in vitro by the ability to stimulate TF-1 cell proliferation. -! - DEPO-ns; -, - DEPO-alpha (CJSC Biocad,); -A- dEPO-alpha (drug
  • FIG. 4 Determination of the functional activity of DEPO-ns and d EPO-alpha in vivo. -! - DEPO-ns; -, - DEPO-alpha (CJSC Biocad,); -A- dEPO-alpha (preparation Aranesp Amgen Europe BV lot 1042847).
  • FIG. 6 Electrophoretic analysis of the obtained PEG-dEPO-ns conjugates. Mr - molecular weight standards (HMW). On the side are the molecular weights of the standards in kDa. Track 1 - drug DEPO-ns obtained according to claim 1; Track 2 - Conjugate PEGZO-DEPO-ns, obtained according to claim 9;
  • FIG. 7 Reverse phase HPLC conjugate PEGZO-DEPO-ns, obtained according to claim 9, the column "Symmetry C18" (4.6 x 150 mm).
  • FIG. 8 Exclusion HPLC conjugate PEGZO-DEPO-ns
  • FIG. 9 MALDI The mass spectrum of the PEGZO-DEPO-ns conjugate obtained according to claim 9, in the m / z region of 15,000-90,000.
  • FIG. 10 The effect of the conjugate PEGZO-DEPO-ns, obtained according to claim 9, on the level of glucose in the blood of animals with repeated administration to rats.
  • FIG. 1 Determination of the functional activity of the PEGZo-dEPO-ns conjugate in comparison with unmodified darbepoetin preparations (dEPO-ns and dEPO-alpha) in vitro by the ability to stimulate
  • FIG. 12 Determination of the functional activity of the conjugates PEGZO-dEPO-ns and PEG40-dEPO-ns in comparison with unmodified
  • darbepoetin preparations (dEPO-ns and dEPO-alpha in vivo), - ⁇ - Conjugate PEGZO-dEPO-ns - obtained according to claim 9; -7- Conjugate PEG40-dEPO-ns, obtained according to claim 10, -! - The drug dEPO-ns, obtained according to claim 1; - ⁇ - dEPO-alpha (drug Aranesp Amgen Europe BV lot 1042847).
  • FIG. 13 Pharmacokinetics of the conjugates PEGZO-dEPO-ns and PEG40-dEPO-ns in comparison with unmodified darbepoetin preparations (DEPO-alpha and DEPO-ns) with a single subcutaneous administration to mice, - ⁇ - PEGZO-dEPO-ns conjugate obtained according to p .9; -7- Conjugate PEG40-dEPO-ns, obtained according to claim 10, -! - The drug dEPO-ns, obtained according to claim 1; - ⁇ - dEPO-alpha (drug Aranesp Amgen Europe B.V. lot 1042847).
  • PEG-DEPO conjugates of the formula (I and II), which are the object of the present invention can be used to obtain drugs for the prevention and / or treatment of various anemia with 5 insufficient production of endogenous EPO, in particular anemia associated with chronic renal failure or cytostatic chemotherapy ; anemia associated with cardiovascular disorders; anemia caused by massive blood loss of various origins; anemia in patients with viral hepatitis C after antiviral therapy.
  • an object of the present invention are pharmaceutical compositions containing, as an active ingredient, an effective amount of conjugates of formula (I) or formula (II), which can be used both individually and in combination with other therapeutic agents for the prevention and / or treatment of anemia,
  • Conjugates of formula (I) of formula (II) with an optional pharmacologically acceptable excipient, diluent and / or pharmaceutically acceptable excipients are administered intravenously or subcutaneously.
  • the route of administration varies,
  • the frequency of administration and the interval between administrations vary depending on the disease and its severity or on the purpose (therapeutic or prophylactic use), the effective amount of the active principle of the PEG-DEPO-ns conjugates of formula (I) or formula (II ) is selected taking into account the above factors.
  • auxiliary components that may be included in a pharmaceutical composition containing the claimed conjugates of PEGZO-DEPO-ns of formula (I) or PEG40-DEPO-ns of formula (I), buffer salts (e.g., acetate, citrate, hydrogen-carbonate, phosphate, histidine buffers), stabilizers (e.g. polysorbates, EDTA, polyvinylpyrrolidones, dextrans, HSA, paraoxybenzoic acid esters, alcohols (e.g. benzyl alcohol), phenols, sorbic acid), a disinfecting component (e.g. benzyl alcohol), an osmotic pressure regulator (e.g.
  • buffer salts e.g., acetate, citrate, hydrogen-carbonate, phosphate, histidine buffers
  • stabilizers e.g. polysorbates, EDTA, polyvinylpyrrolidones, dextrans, HSA, paraoxybenzoic acid esters, alcohols (
  • sodium chloride potassium chloride
  • polyols for example glycerin , arabitol, sorbitol, mannitol, lactose, dextran
  • amino acids e.g. methionine, glycine, leucine, iso-leucine, threonine, glutamic acid, phenylalanine
  • surfactants e.g.
  • HSA polyvinylpyrrolidone, lecithin, tween 80, tween-20 , poloxamer 188, polyoxy thylene-polyoxypropylene copolymer, casein
  • surfactants for example, block copolymers of ethylene oxide and propylene oxide, propylene oxide and ethylene oxide, sorbitan monolaurate, sorbitan ester, polyglycyrin fatty acid ester, cocamide DEA lauryl sulfate, alkanolamine polyethylene, glycol polyethylene, polyoxyethylene ether, polyoxyethylene cetyl ether, polysorbate, glycerol monostearate, glycerol distearate, sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxy sorbitan monolaurate ethylene and propylene glycol monostearate), antioxidants (e.g.
  • Trilon B Trilon B, ⁇ -cysteine, sodium sulfite, sodium ascorbate, glutathione, 2-mercaptoethanol, dithiothriitol, cysteine hydrochloride monohydrate, ascorbic acid) and diluents (e.g. water).
  • the clarified QOL was concentrated to 1 L, tangential diafiltration was performed on membranes with a cutoff limit of 10 kDa against 10 mM Tris-HCl buffer, pH 8.6, and the resulting concentrate was applied to a column (5x30 cm) with a Blue sepharose sorbent (270 ml). The column was washed 10
  • the DEPO-ns preparation obtained according to claim 1 the dEPO-alpha and EPO-alpha preparation (Eprex preparation) were concentrated using Amicon Ultra centrifuge tubes to a concentration of 10-12 mg / ml and dialyzed against water. Isoelectrofocusing of the obtained samples was carried out in plates of 4.5% polyacrylamide gel (PAG) containing a mixture of ampholytes 3-7 and 2-4 in a ratio of 1: 8, 4.8 M urea and 4.9% sucrose using the device. 1 1 1 Mini IEF Cell (BioRad).
  • PAG polyacrylamide gel
  • the analyzed samples were mixed with sample buffer containing solutions of ampholytes and urea, in a ratio of 1: 1 and 2 ⁇ l of the obtained samples were applied to the PAAG plate.
  • the IEF was carried out for 15 min at 100 V, 15 min at 200 V and 60 min at 450 V.
  • the PAAG plate was separated from the glass and kept for 30 min in a fixing solution containing 4% sulfosalicylic acid, 12, 5% trichloroacetic acid and 30% ethanol. Protein bands were stained with a solution containing 0.04% Coomassie R-250, 27% ethanol, 10% acetic acid and 0.5% CuS04, for 60 minutes. .
  • DEPO-ns preparation obtained according to claim 1, the DEPO-alpha preparations (CJSC Biocad), DEPO-alpha (Aranesp, Amgen) and EPO-alpha (Eprex preparation) were dialyzed against a buffer solution (1, 5 mM KH2RO4, 8 , 1 mM Na 2 HP04, 0.4 M NaCl, pH 7.4) and diluted with the indicated buffer to concentrations of 0.3 and 0.15 mg / ml.
  • a buffer solution (1, 5 mM KH2RO4, 8 , 1 mM Na 2 HP04, 0.4 M NaCl, pH 7.4
  • HPAEC high pH anion exchange HPLC method
  • DEPO-ns sample obtained according to claim 1
  • dEPO-alpha sample Biocad CJSC
  • DEPO-ns and DEPO-alpha in vitro were determined by their ability to stimulate the proliferation of TF-1 cells (Human erythroleukaemia cells).
  • TF-1 cells Human erythroleukaemia cells.
  • Cells were cultured in RPMI-1640 medium with 10% inactivated bovine serum supplemented with 2 ng / ml GM-CSF. Prepared cells were washed (by centrifugation) from growth medium with serum and GM-CSF factor, diluted in RPMI-1640 medium with 0.5% inactivated serum at a concentration of 0.2x106 cells / ml.
  • DEPO-ns dilutions prepared according to claim 1, dEPO-alpha and Aranesp were prepared in the range of 100,000 - 0 ng / ml.
  • a standard curve was constructed of the dependence of the level of TF 1 cell proliferation on the dose of the preparations added to the cells.
  • the curves were plotted in semi-logarithmic coordinates (the logarithm of the concentration of added drugs is the fluorescence level).
  • X is the concentration of the drug
  • EC50 the average effective dose of the drug, providing 50% induction of TF1 cell proliferation from the maximum possible value
  • p is a coefficient that determines the angle of inclination of the curve.
  • DEPO-ns and DEPO-alpha Determination of the functional activity of DEPO-ns and DEPO-alpha in vivo. The determination was carried out by biological test in a normocytemic model on CBA mice.
  • the DEPO-ns preparation obtained according to claim 1, the dEPO-alpha drug (CJSC Biocad) and the DEPO-alpha drug (Aranesp, Amgen) were administered to mice once at a dose of 0.5 ⁇ g / mouse subcutaneously in a volume of 0.5 ml.
  • the preparations were diluted with phosphate buffer. On days 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 16, and 20, blood was taken from the orbital sinus in animals in tubes containing 1% EDTA. The total number of red blood cells was counted on an Exigo hematology analyzer. The percentage of reticulocytes was determined on a FC 500 Beckman Coulter cytometer. The results are presented in fig. 4. 5 days after administration, the activity of DEPO-ns was 8
  • the gel was stained with Coomassie R-250.
  • the kinetics of PEG-dEPO-ns conjugate formation is shown in FIG. 5.
  • the reaction mixture was diluted 10 times with distilled water, the pH was adjusted to 6.8 with 0.1 M NaOH and sterile filtration was performed through 0.22 ⁇ m filters.
  • the DEPO-ns preparation prepared according to claim 1 was dialyzed against 50 mM borate buffer, pH 9.0. The concentration of DEPO was 1.55 mg / ml. To 15.5 ml of protein solution (24 mg) was added 73 mg of mPEG-NHS with molecular
  • the diluted PEG-DEPO-ns solution obtained according to claim 7 or claim 8 was applied to a column with an anion exchange sorbent (40) -sepharose Work Beads, BioWorks, CatN ° 40 100 210), balanced with 20 mM Na-phosphate buffer pH7 , 4 (buffer A. After applying the protein solution, the sorbent was washed with buffer A to the baseline (10-12 column volumes).
  • anion exchange sorbent 40
  • the bound mono-PEG-DEPO-ns was eluted with buffer A containing a NaCl concentration gradient (0-0.5 M NaCl (40 column volumes) at a speed of 30 cm / h in the obtained fractions, the optical density was measured at 280 nm and 260 nm, the protein concentration was determined and analyzed by SDS-electrophoresis in 8% PAAG as described in paragraph 7. Fractions containing mono-PEGylated conjugate of PEGZO-DEPO-ne with a purity of more than 95% were combined, dialyzed against 10 volumes of buffer A, pH 6.2 ⁇ 0.2, performed sterile filtration and stored at 4 ⁇ 2 ° C.
  • the diluted PEG-DEPO-ns solution obtained according to claim 8 was applied to a column with an anion-exchange sorbent (40 ( ⁇ - Sepharose Work Beads, BioWorks, CatNe 40 100 210), balanced with 20 mM Na-phosphate buffer pH 7.4 (buffer A) Chromatography was performed as described in paragraph 9. Fractions containing mono-PEGylated conjugate of PEG40-DEPO-ns with a purity of more than 95% were combined, dialyzed against 10 volumes of buffer A, pH 6.2 ⁇ 0.2, sterile filtration was performed and stored at 4 ⁇ 2 OS.
  • an anion-exchange sorbent 40 ( ⁇ - Sepharose Work Beads, BioWorks, CatNe 40 100 210)
  • Buffer A buffer A Chromatography was performed as described in paragraph 9. Fractions containing mono-PEGylated conjugate of PEG40-DEPO-ns with a purity of more than 95% were combined, dialyzed
  • the DEPO-ns preparation obtained according to claim 1, the PEG-dEPO-ns conjugates obtained according to claim 9 or claim 10, were analyzed by EF in 8% PAAG in the presence of 2-mercaptoethanol and DDS, as described in paragraph. 7.
  • the load on the track was 10 ⁇ g of protein. The results are shown in FIG. 6.
  • the PEGZO-DEPO-ns onyugate prepared according to claim 9, was diluted with 20 mM Na-phosphate buffer, pH 6.2 to a concentration of 0.1 mg / ml, and 100 ⁇ l of the obtained sample was applied to a Symmetry300 C4 column (4.6x150 mm). The study was performed on a Waters Breeze chromatograph at 214 nm. From the results presented in FIG. 7 it follows that according to RP HPLC, the purity of the claimed PEGZO-DEPO-ns conjugate is more than 99%.
  • the PEG-dEPO-ns conjugate obtained according to claim 9 was diluted with 20 mM IaPhosphate pH6.2 buffer to a concentration of 0.7 mg / ml and 40 ⁇ l of the obtained sample was added to a TSK Gel 4000 SW XL column (Tosoh bioscience, 7.8 mm x 300mm).
  • the analysis was performed on an Agilent series chromatograph. The flow rate was 0.4 ml / min, the chromatographic time was 60 minutes. Detection was carried out at a wavelength of 214 nm.
  • the results of the study are presented in Fig. 8. It can be seen that the 5th PEG-DEPO sample under investigation exits the column with one clearly pronounced symmetric peak of> 97%.
  • the PEG-dEPO-ns conjugate prepared according to claim 9 (10 ⁇ g) was concentrated and dialyzed using a ZipTip microcolumn
  • MALDI-TOF-TOF ABSciex 4800 spectrometer (Canada). Mass spectra were obtained in positive ion mode, in linear mode, the error in measuring the average mass does not exceed 10-15 Da.
  • the mass spectrum of the PEG-dEPO-ns conjugate is represented by a diffuse peak in the region of 60,000 - 70,000 Da, corresponding to a singly charged [M] + ion with a molecular weight of 65,450 ⁇ 5,000 Da.
  • Peak blur is due to the heterogeneity of the monomethoxyPEG preparation used to produce the PEGylated protein.
  • the measured value of zo m / z at the peak maximum (65450 ⁇ 5000) Yes coincides with the calculated data for the sum of the molecular weights of DEPO-ns (36-37 LLC Yes) and the attached PEG (30 LLC Yes).
  • Glucose concentration was determined using a Humalyzer 3000 semi-automatic biochemical analyzer (Human GmbH, Germany) with preliminary sample preparation according to the instructions for using a set of reagents for blood glucose analysis (CJSC Analytics, Russia). The results of the study are presented in FIG. 10 and table 4. Administration of the PEG-dEPO-ns conjugate, as well as the administration of unmodified darbepoetin preparations (dEPO-alpha and dEPO-ns), led to the stimulation of erythropoiesis in experimental animals (Table 4).
  • the functional activity in vitro of the PEGZO-dEPO-ns conjugate obtained according to claim 9 was determined by their ability to stimulate the proliferation of TF-1 cells (Human erythroleukaemia cells) as described in claim 5, in comparison with DEPO-ns obtained according to claim 1, and DEPO-alpha.
  • TF-1 cells Human erythroleukaemia cells
  • DEPO-ns obtained according to claim 1, and DEPO-alpha The results presented in FIG. 1 1 and Table 5 indicate that the average effective dose (EC50), which provides 50% induction of TF1 cell proliferation, for PEG-DEPO-ns is about 17 times higher than the same dose for DEPO-ns and 4 times higher than DEPO alpha.
  • PEG-DEPO-ns conjugates obtained according to claim 9 and claim 10 were several days higher than with the administration of DEPO-ns and DEPO-alpha.
  • the introduction of the PEGZO-DEPO-ns conjugate obtained according to claim 9 led to a more significant increase in the number of reticulocytes than the administration of the PEG40-DEPO conjugate 5 prepared according to claim 10, the DEPO-ns preparation (prepared according to claim 1) and DEPO- alpha.
  • the PEG40-DEPO conjugate prepared according to claim 10 provided the longest response.
  • mice 15 other groups of mice were injected subcutaneously with the unmodified DEPO-ns preparation obtained according to claim 1, and the DEPO-alpha preparation in the same dose. Blood samples were taken 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 and 240 hours after administration of the drugs. Serum was separated by centrifugation and stored at minus 20 ° C until analysis. To determine the level
  • 25 microtiter plates (Costar, Cat. N 3590) were sensitized with rabbit polyclonal anti-DEPO antibodies at a rate of 500 ng / 100 ⁇ l of 20 mM carbonate buffer (pH 9.0-9.5) per well and incubated for 16-18 hours at 4 ° C. Unbound immunoglobulins were removed from the wells. To block non-specific binding sites, 200 ⁇ l of 20 mM Tris-HCI buffer, pH 7.2-7.4 (TB) were added to the wells. containing 0.14 M NaCI and 0.5% NFDM (blocking buffer - BB) and incubated for 30 minutes at 37 ° C.
  • BB solution was removed, 100 ⁇ l of the test serum diluted 2-1000 times BB was added to the wells.
  • 100 ⁇ l of BB containing various concentrations of PEG30-DEPO-ns or PEG40-DEPO-ns (in the range of 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 and 0 ng / ml) or DEPO were added to the wells -ns (in the range of 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12 and 0 ng / ml) or DEPO-alpha (in the range of 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12 and 0 ng / ml
  • the plates were incubated for 30 minutes at 37 ° C.
  • the contents of the wells were removed, the wells were washed 3 times with 200 ⁇ l of TB containing 0.05 Tween-20, 100 ⁇ l of BB containing polyclonal rabbit anti-DEPO antibodies labeled with biotin in the worker was added to the wells dilution and incubated for 30 minutes at 37 ° C. After incubation, the contents the wells were aspirated and avidin conjugated with peroxidase of 100 ⁇ l / well was added to the wells in working dilution and incubated for 30 minutes at 37 ° C.
  • the contents of the wells were aspirated, the wells were washed 4 times with 200 ⁇ l of TB containing 0.05 Tween-20 and into the wells 100 ⁇ l of 0.1 M Na-acetate buffer, pH 5.0, containing 0.1 mg / ml tetramethylbenzidine and 0.003% H2O2 was added, to stop the reaction, 50 ⁇ l of 2M H 2 S0 4 was added to the wells and the optical density in the wells was measured using a Tesap plate spectrophotometer at 450 nm.
  • the PEG40-DEPO-ns conjugate was characterized by a slower excretion from the body than the PEGZO-DEPO-ns conjugate. Based on the results obtained (Fig. 13), the main pharmacokinetic parameters were calculated for the claimed conjugates of PEGZO-DEPO-ns and PEG40-dEPO-ns with a single subcutaneous administration to mice (Table 6). From the presented results it is seen that the clearance (C1) of the claimed conjugates of PEG40-DEPO-ns and PEGZO-DEPO-ns is significantly slowed down in comparison with modified darbepoetin preparations (DEPO-ns and DEPO-alpha).
  • the clearance values were 2.45 ⁇ 2.04; 7.68 ⁇ 2.80; 37.83 ⁇ 16.76 and 47.69 ⁇ 18.87 ml / h / kg for PEG40-DEPO-ns, PEGZO-DEPO-ns, DEPO-alpha and DEPO-ns, respectively.
  • the decrease in clearance of the claimed conjugates PEG40-dEPO-ns and PEGZO-dEPO-ns provided their long-term circulation in the blood.
  • the half-life (T 1/2 ) for the conjugates PEG40-dEPO-ns and PEGZO-dEPO was 93.55 ⁇ 37.73 and 56.50 ⁇ 32.76 hours, respectively.
  • the presented results indicate improved pharmacokinetic parameters of the claimed conjugates compared with unmodified darbepoetin preparations (DEPO-alpha and DEPO-ns).
  • DEPO-alpha and DEPO-ns unmodified darbepoetin preparations
  • compositions based on the claimed conjugates PEGZO-DEPO-ns and PEG40-dEPO-ns
  • PEGZO-DEPO-ns according to claim 9 5-1000 mcg
  • PEGZO-DEPO-ns according to claim 9 5-1000 mcg
  • PEG40-DEPO not according to claim 10 10-1000 mcg Histidine / 0.2-0.6 mg
  • a medicinal product comprising an effective amount of the claimed PEG-DEPO-ns 1a is poured under sterile conditions at 0.5, 0.8, 1, 0 and 1.2 ml (for a dosage of 5-50 ⁇ g / ml), 0.5, 0.6, 0.75 and 0.9 ml (for a dosage of 100-300 ⁇ g / ml), 0.5, 0 6, 0.8, 1.0, and 1, 2 ml (for a dosage of 500-1000 ⁇ g / ml) in syringes made of neutral glass of hydrolytic class I, with soldered needles, covered with protective caps, elastic or rigid, sealed with tips on pistons made of butyl rubber, lami th e fluoropolymer.
  • a medicine including an effective amount of PEGZO-DEPO-ns or PEGZO-DEPO-ns (Example 17), is poured under sterile conditions at 0.5, 0.8, 1, 0, and 1, 2 ml (for a dosage of 5-10 ⁇ g / ml), 0.5, 0.6, 0.75 and 0.9 ml (for a dosage of 100-300 ⁇ g / ml), 0.5, 0.6, 0.8, 1, 0 and 1 , 2 ml (for a dosage of 500-1000 ⁇ g / ml) in neutral glass bottles of hydrolytic class I, sealed with Teflon-coated fluorresin or butylresin caps, crimped with aluminum caps.
  • a kit including a drug packaged in containers containing PEGZO-DEPO-ns, 0.5, 0.8, 1, 0 and 1.2 ml (for dosage 5-10 ⁇ g / ml), 0.5, 0.6, 0.75 and 0.9 ml each (for a dosage of 100-300 ⁇ g / ml), 0.5, 0.6, 0.8, 1, 0 and 1.2 ml (for a dosage of 500-1000 ⁇ g / ml)
  • the kit contains 1 or 4 syringes complete with a piston (1 or 4, respectively) / bottle in a blister strip of a polymer film along with instructions for use, which are placed in a pack from cardboard.
  • Patent RU 2409389
  • Patent RU 2 476 439
  • Patent EAPO 007812
  • Patent RU 2437675 34. Ikeda Y., Nagasaki Y. (2012), PEGylation Technology in Nanomedicine, Adv. Polym. Sc, v. 247, p. 115-140;

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и медицины, в частности, к новым ПЭГилированным производным факторов эритропоэза и касается создания новых молекул коньюгатов низкосиалированного дарбепоетина и полиэтиленгликоля, обладающих эритропоэз-стимулирующей активностью, не вызывающих резкого снижения глюкозы с улучшенными фармакокинетичскими и фармакодинамическими параметрами общей формулы (I) или (II). Также изобретение относится к лекарственным средствам, содержащим заявляемый коньюгат формулы (I) или коньюгат формулы (II), фармацевтическим композициям, пригодным для лечения и профилактики различных анемий с недостаточной продукцией эндогенного эритропетина, содержащим заявляемые коньюгаты ПЭГилированного низкосиалированного дарбепоетина и терапевтически приемлемые вспомогательные компоненты. Изобретение относится к применению коньюгата формулы (I) или коньюгата формулы (II) для получения лекарственного средства, обладающего эритропоэзстимулирующей активностью и не вызывающего резкого снижения глюкозы, способу профилактики и/или лечения анемий различного генеза, включающему введение терапевтически эффективного количества коньюгата формулы (I) или коньюгата формулы (II), контейнеру, включающему фармацевтическую композицию и набору.

Description

ПРОЛОНГИРОВАННЫЙ ФАКТОР ЭРИТРОПОЭЗА ЧЕЛОВЕКА И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ
5 Описание
Настоящее изобретение относится к фармацевтике и медицине, а именно, к новым биологически активным конъюгатам фактора эритропоэза с пролонгированным действием, в частности, к новым коньюгатам дарбепоетина с полиэтиленгликолем, которые могут быть использованы в ю медицине, например, для лечения и профилактики целого ряда анемий с недостаточной продукцией эндогенного ЭПО, в том числе для лечения анемий, ассоциированных с хронической почечной недостаточностью, цитостатической химиотерапией и терапией вирусных заболеваний, и анемий, вызванных массивными кровопотерями различного генеза и
15 вирусными заболеваниями.
В настоящее время для лечения анемий различного генеза используют рекомбинантные препараты эритропоетина (ЭПО) и дарбепоетина (дЭПО). Рекомбинантный ЭПО по своей структуре идентичен природному ЭПО человека и представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 30,4
20 кДа. Молекула ЭПО состоит из 165 аминокислотных остатка и содержит три сайта Ν-гликозилирования по остаткам аспарагина в положении 24, 38 и 83 и один сайт О-гликозилирования по серину в положении 126 [1-2] Терминальное положение олигосахаридов занимают остатки сиаловой кислоты, от содержания которых зависит стабильность и функциональная
25 активность ЭПО in vivo [3-4].
Для получения рекомбинантного белков с корректным гликозилированием обычно применяют клетки яичников китайского хомячка (СНО), трансформированные целевым геном [5]. Рекомбинантный человеческий ЭПО, продуцируемый клетками СНО, представляет смесь из 14 зо изоформ, различающихся по содержанию сиаловых кислот, так что одна молекула белка может содержать от 0 до 14 остатков сиаловых кислот. Изоформы ЭПО, не содержащие сиаловой кислоты (асиало-ЭПО), более эффективно связываются с клеточным рецептором ЭПО in vitro [5], однако их функциональная активность in vivo намного ниже из быстрого выведения 5 асиало-ЭПО из организма в результате взаимодействия с асиалогликопротеин-связывающим белком печени [6-7]. Изоформы ЭПО, содержащие максимальное количество остатков сиаловой кислоты, обладают более высокой активностью in vivo и терапевтической ценностью, поскольку наличие сиаловой кислоты предотвращает быстрый клиренс молекул ю сиалированных молекул ЭПО из организма. Функциональная активность ЭПО in vivo прямо пропорциональна содержанию сиаловых кислот [7].
Для получения более стабильного фактора эритропоэза был создан гипергликозилированный аналог человеческого ЭПО (novel erythropoiesis stimulating protein,NESP) - рекомбинантный дарбепоетин [8]. По сравнению с
15 природным ЭПО, молекула дарбепоетина (дЭПО) содержит пять аминокислотных замен (Ala30Asn, His32Thr, Pro87Val, Trp88Asn и Pro90Thr). Молекула дЭПО имеет 5 сайтов Ν-гликозилирования по аспарарагинам в положении 24, 30, 38, 83 и 88 один сайт О-гликозилирования по серину в положении 126, так что, по сравнению с ЭПО, максимально возможное
20 количество остатков сиаловых кислот на молекулу белка увеличилось с 14 до 22. Белок дЭПО, состоящий из изоформ 18-22, получил название дарбепоетин-альфа (дЭПО-альфа). По сравнению с ЭПО, эффективность связывания дЭПО-альфа с рецептором ЭПО на клетках in vitro меньше, однако, in vivo препарат дЭПО-альфа является более стабильным и обладает
25 улучшенными фармакокинетическими характеристиками по сравнению с ЭПО. Общий клиренс препарата дЭПО значительно меньше, чем у ЭПО, в результате время полувыведения дЭПО из крови больных в три раза выше, чем у ЭПО.
Рекомбинантный дЭПО-альфа получают из трансформированных клеток зо СНО, несущих ген дарбепоетина. Синтезируемый в клетках дЭПО представляет собой гетерогенную смесь изомеров, отличающихся по содержанию сиаловых кислот. .Количество молекул сиаловых кислот на молекулу белка варьирует от 0 до 22. Содержание высокосиалированных изоформ (18-22) варьирует от 5 30% в зависимости от используемых клеток и 5 условий культивирования. Суммарную смесь изоформ дЭПО фракционируют методом ионной хроматографии, и высокосиалированные очищенные изоформы 18-22 используют для получения дЭПО-альфа. Низкосиалированные изоформы дарбепоетина (дЭПО-нс), составляющие не менее 50% синтезированного белка дЭПО, не используют.
ю В клинической практике препарат Аранесп на основе дЭПО-альфа в основном используется для лечения различных анемий с недостаточной продукцией эндогенного ЭПО, в основном анемии, ассоциированной с хронической почечной недостаточностью.
Однако, применяемые факторы эритропоэза обладают рядом негативных
15 побочных действий. Так, например, показано, что введение препаратов на основе ЭПО и дЭПО-альфа приводит к снижению уровня глюкозы в крови пациентов [9-12].
Кроме того, следует отметить, что терапевтическая эффективность препаратов, стимулирующих эритропоэз, может быть повышена при
20 использовании препаратов более пролонгированного действия, например, на основе ПЭГ-илированных ЭПО/дЭПО, в которых нативная молекула белка химически связана с полиэтиленгликолем [13-17] или на основе гибридных белков ЭПО/дЭПО, слитых с Fc-фрагметом иммуноглобулина или синтетическим пептидом [18].
25 Известно, что использование пролонгированных белковых препаратов приводит к улучшению фармакокинетики, повышению стабильности, увеличению времени полувыведения из крови, снижению колебаний концентрации в крови, увеличению активности in vivo. Среди пролонгированных форм терапевтических белков, ПЭГилированные зо препараты являются наиболее распространенными. Известны коньюгаты терапевтических цитокинов с ПЭГ, которые успешно применяются в клинике для лечения различных заболеваний [19].
Следует отметить, что каждая новая по структуре молекула ПЭГилированного белка будет обладать уникальными биологическими и физико-химическими свойствами. Причем, предсказать каким образом будут меняться свойства получаемых ПЭГилированных белков - невозможно. Также невозможно теоретически предсказать степень и направленность (отрицательное, положительное) влияния ПЭГилирования - на свойства полученных коньюгатов [19-23], которые могут обеспечить наиболее эффективный терапевтический эффект ПЭГилированного белка без негативных побочных действиях при последующем применении в клинической практике.
Из уровня техники известны различные коньюгаты ПЭГ с ЭПО и дЭПО.
Так, в работах [14, 24] описан коньюгат рекомбинантного ЭПО, в котором ПЭГ присоединен к эритропоэтину посредством ароматической азогруппы. Использованный ПЭГ, содержащий ароматическую азогруппу, связывается с белком по аминокислотным остаткам тирозина и гистидина [24]. Полученный коньюгат обладал биологической активностью, однако, в приведенных примерах нет данных о молекулярной массе использованных ПЭГ.
В работах [13, 25-26] описаны коньюгаты различных производных ЭПО с ПЭГ через бифункциональный линкер который сначала связывался со свободными аминогруппами белка через стабильную амидную связь, образуя промежуточный продукт, который через SH-группу линкера затем связывался с активированными йодацетилметокси-ПЭГ, метокси-ПЭГ- винилсульфон и метокси-ПЭГ-малеимид. Молекулярная масса использованных ПЭГ варьировала от 20 до 40 кДа. Для получения моноПЭГилированного ЭПО реакционную смесь подвергали двух этапной хроматографии на колонке с катионообменным сорбентом. Полученные коньюгаты моноПЭГилированного ЭПО обладали пролонгированным действием и сохраняли биологическую активность in vivo. Недостатком описанной технологии является сложная двухэтапная технология, реализация которой требует дорогостоящих ресурсов.
В работе [27] описаны конъюгаты ПЭГ-ЭПО, в котором ПЭГ с молекулярной массой 12 кДа, содержащий различные активированные группы (SC-PEG, SS-PEG, PEG-imidate или mPEG- cyanuric chloride) связывались с ЭПО через доступные NH2-rpynnbi белка, в частности через N- концевую альфа-аминогруппу и эпсилон аминогруппы лизинов в положении 52, 116 и 154 с образованием карбаматной связи. Реакцию ПЭГилирования проводили при рН 6.5-7.5. В зависимости от условий проведения реакции менялось соотношение различных позиционных изомеров в полученных коньюгатах. Полученные коньюгаты обладали биологической активность и пролонгированным действием. Недостаком предложенной модификации является использование активированных ПЭГ с низкой молекулярной массой, которые обладали способностью связываться с различными участками белка, что приводило к появлению в полученных коньюгатов нескольких позиционных изомеров.
В работах [15, 28-29] описан коньюгат ПЭГ сЭПО, полученный с использованием сукцинимидиловых производных ПЭГ (SBA-PEG и SPA- PEG) с молекулярной массой 30 к Да, которые способны взаимодействовать со свободными аминогруппами белка с образованием амидной связи. Реакция ПЭГилирования проходила при рН 7,5. Содержание модифицированного ПЭГ достигало 75%, моноПЭГилированный ЭПО составлял 30-40% , и 25-38% приходилось на нецелевые диПЭГилированные молекулы.
В работах [30-32] описаны коньюгаты ПЭГ-дЭПО, содержащие гликоПЭГилиро ванный ЭПО. В описанных коньюгатах связывание ПЭГ с молекулой ЭПО проводили через нативные или окисленные углеводные остатки с использованием ряда ферментов. ПЭГилирование проводили в условиях 250 кратного избытка ПЭГ (ЕАРО 007812). Данные о выходе и чистоте получаемого целевого моноПЭГилированного коньюгата - не указаны. Показано, что полученные коньюгаты ПЭГ-ЭПО [30-31] обладали 5 пролонгированным действием, по сравнению с немодифицированным ЭПО и гипергликозилированным ЭПО. Недостатками получения описанных коньюгатов является использование дорогостоящих ферментов и проведение реакции в условиях чрезмерного избытка дорогостоящего ПЭГ.
В работе [33] описана коньюгация ЭПО с ПЭГ с молекулярной массой 400- ю 4000 Да при помощи ионизирующего излучения. Описанные коньюгаты обладали специфической активностью. Недостатками полученных коньюгатов является использование ПЭГ с низкой молекулярной массой, поскольку ранее было показано, что присоединение к белку ПЭГ с молекулярной массой менее 5 кДа практически не влияет на
15 фармакокинетические свойства получаемых коньюгатов [34].
В работе [16] описана коньюгация ЭПО с дендример подобным ПЭГ (четырехразветвленыным). Описанный коньюгат обладал улучшенной стабильностью по сравнению с немодифицированным ЭПО. Данных о пролонгированных свойствах и биологической активности полученного
20 коньюгата ПЭГ-ЭПО- не представлены.
В работе [35] описаны варианты коньюгатов фрагментов ЭПО и мутированных вариантов ЭПО с NHS-производными ПЭГ. Полученные коньюгаты обладали специфической активностью, однако их фармакокинетические свойства в патенте - не представлены. Недостатком
25 полученных коньюгатов является использование фрагментов ЭПО и мутантных форм ЭПО, первичная структура которых отличается от природного ЭПО, что может увеличивать иммуногенность таких коньюгатов при клиническом применении.
В работе[36] описано ПЭГилирование различных вариантов зо негликозилированного ЭПО. Недостатками полученных коньюгатов является использование рекомбинантного ЭПО, полученного из клеток Е. coli и обладающего низкой биологической активностью in vivo.
В работе [37] описано получение конъюгатов ПЭГ с Ν-концевым фрагментом или с мутантной формой ЭПО. Связывание ПЭГ проводили 5 прямо по амино или опосредованно через тиололовые группу белка.
Полученные коньюгаты очищали от продуктов реакции при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии. Недостатком полученных коньюгатов является использование мутантных форм белка и двухэтапной технологии ПЭГилирования.
ю Прототипом для настоящего изобретения является коньюгат ПЭГ с молекулой дЭПО, описанный в работах [38-39]. Для реакции ПЭГилирования использовали препарат дЭПО-альфа и различные активированные мПЭГ, в частности мПЭГ-SPA, и мПЭГ-альдегид. Молекулярная масса присоединенных мПЭГ составляла 5 и 20 кДа. Наибольшую биологическую
15 активность in vivo показали коньюгаты ПЭГ-дЭПО, полученные при использовании активированных мПЭГ-ALD и мПЭГ-SPA с молекулярной массой 20 кДа. Для очистки полученных коньюгатов использовали хроматографическую очистку в одну стадию с использованием ионообменной хроматографии. Реакцию дЭПО-альфа с мПЭГ-альдегидом
20 проводили при рН 5 в условиях 5-20 кратного молярного избытка ПЭГ по отношению к дЭПО-альфа в течении 1 часа при комнатной температуре с последующей инкубацией реакционной смеси при температуре 5°С Очищенный коньюгат содержал до 20% диПЭГилированных форм. Реакцию дЭПО-альфа с мПЭГ-SPA проводили при рН 8 в условиях 10-20 кратного
25 молярного избытка ПЭГ по отношению к дЭПО-альфа в течение 1 часа при комнатной температуре. В экспериментах на животных полученные коньюгаты обладали улучшенными фармакокинетическими параметрами по сравнению с немодифицированным дЭПО-альфа. Недостатком является использование дЭПО-альфа, получение которого отличается высокой зо себестоимостью. Для получения дЭПО-альфа используют культуральную жидкость трансформированных клеток СНО, содержащую смесь изомеров дЭПО, с разным количеством сиаловых кислот на моль белка (от 0 до 22). Высокосиалированные изоформы дЭПО с содержанием сиаловых кислот от 18-22 моль/моль белка, используемые для получения дЭПО-альфа, обычно составляют 5-30% от синтезируемого в клетке белка. Низкосиалированные изоформы дЭПО (8-17), составлющие не менее 50% синтезированного дЭПО, не используют. Кроме того, дЭПО-альфа из за высокой степени сиалирования обладает более низкой аффинностью при связывании с клеточным рецептором ЭПР in vitro, чем низкосиалированные формы дЭПО. Присоединение молекулы ПЭГ к высоко сиализированному дЭПО-альфа будет приводит к дальнейшему снижению биологической активности in vitro.
Улучшение фармакокинетических параметров дЭПО с сохранением относительно высокой аффинности связывания с клеточным рецептором in vitro, может быть достигнуто за счет использования низкосиалированных форм дЭПО (дЭПО-нс), обладающих более высоким сродством к рецептору ЭПО in vitro. Коньюгирование таких форм дЭПО-нс с ПЭГ с большей молекулярной массой приведет к созданию новых молекул дЭПО с улучшенными терапевтическими свойствами за счет более эффективного связывания с рецептором, с одной стороны, и за счет более пролонгированного действием , с другой стороны. Более того, новые молекулы могут обладать биологическими свойствами, отличными от характеристик немодифицированного дЭПО.
Например, известно, что использование препаратов с эритропоэз- стимулирующим действием, в частности дЭПО, сопровождается выраженным побочным действием - снижением концентрации глюкозы в крови пациентов [9-12]. Возможность развития гипогликемии требует постоянного мониторинга уровня глюкозы в крови пациентов, и незамедлительной коррекции при его снижении. Улучшение безопасности применения дЭПО в клинике может быть достигнуто за счет использования новых молекул дЭПО, не обладающих гипогликемическим действием.
Задача настоящего изобретения состояла в получении нового стабильного коньюгата ПЭГ и дЭПО-нс с улучшенными фармакокинетическими параметрами и улучшенной безопасностью за счет использования в составе коньюгата низкосиалированного дЭПО-нс и мПЭГ с молекулярной массой 30-40 кДа, пригодного для создания безопасного лекарственного препарата медицинского назначения, способствующего расширению арсенала лекарственных средств заданной направленности и фармацевтической композиции на основе полученного коньюгата ПЭГ- дЭПО-нс.
Поставленная задача решается созданием новых молекул функционально активных коньюгатов ПЭГ и дЭПО, обладающих эритропоэз-стимулирующей активностью с пролонгированным действием, не вызывающих выраженной гипогликемии, в которых линейная молекула ПЭГ с молекулярной массой 30 000 Да или разветвленная молекула ПЭГ с молекулярной массой 40 000 Да связана с низкосиалированной молекулой дЭПО стабильной связью через свободные аминогруппы белка, так, что общие формулы коньюгатов ПЭГ-дЭПО с линейным мПЭГ 30 000 Да и разветвленным мПЭГ-40000 Да представляют собой следующие соединения (I) и (II), соответственно:
CH30-(CH2CH20)n-(CH2)m- NaH -дЭПО-нс ( I )
где: п - целые значения от 568 до 796;
m - целое число > 4;
дЭПО-нс - низкосиалированный дарбепоетин, содержащий менее 50% тетрасиалированных антеннарных структур С— NH— дЭПО- не
Figure imgf000012_0001
о и
СНэО-(СН2СН20)п- С NH
о
( ID где: n - целые значения от 284 до 398;
дЭПО-нс - низкосиалированный дарбепоетин, содержащий менее 50% тетрасиалированных антеннарных структур.
5
Новым по сравнению с прототипом является:
1. Для получения коньюгата ПЭГ-дЭПО использован низкосиалированный
дарбепоетин (дЭПО-нс), содержащий менее 50% тетрасиалированных антеннарных структур, функциональная активность которого in vitro ю (связывание с клеточным рецептором, определяющим пролиферационную активность дЭПО на клетках TF 1 ,) в 4 раза выше, чем у дЭПО-альфа (в способе-прототипе использовали дЭПО-альфа);
2. Для получения коньюгатов ПЭГ-дЭПО-нс использовали различные
активированные мПЭГи с молекулярной массой 30000 и 40000 Да (в способе-
15 прототипе приведены примеры с использованием мПЭГ с молекулярной
массой 5 и 20 кДа).
3. Структурная формула полученных коньюгата ПЭГ-дЭПО-нс.
4. Увеличение молекулярной массы коньюгатов ПЭГ-дЭПО за счет размера присоединенного ПЭГ;
2(5. Улучшенная безопасность заявляемых коньюгатов ПЭГ-дЭПО-нс, связанная с отсутствием резко выраженного гипогликемического эффекта.
6. Улучшенные фармакокинетические параметры заявляемых коньюгатов ПЭГ-дЭПО-нс по сравнению с немодифицированными дЭПО-нс и дЭПО- альфа.
Для получения заявляемых коньюгатов ПЭГЗО-дЭПО-нс и ПЭГ40- дЭПО-нс был использован рекомбинантный низкосиалированный дЭПО (дЭПО-нс, производства ЗАО «Биокад») и бутиральдегидное производное мПЭГ формулы (III) с молекулярной массой 30 ООО Да или сукциниимидное производное мПЭГ формулы (IV)c молекулярной массой 40 ООО Да , соответственно .
CH30-(CH2CH20)n-(CH2L- <j"H
о
(III) где: п - целые значения от 568 до 795;
m - целое число > 3 ;
Figure imgf000013_0001
(IV)
где: п - целые значения от от 284 до 398;
Для получения коньюгата формулы (I), реакцию коньюгирования проводили при рН ниже 6.0 в присутствии восстанавливающего агента при температуре, равной или ниже 20 °С в течении 20-24 часов. Молярное соотношение ПЭГ/белок составляло 1 ,5-6/1. Для получения коньюгата формулы (II), реакцию коньюгирования проводили при рН выше 8,5 при температуре, равной или ниже 20 °С в течение 4 часов. Молярное соотношение ПЭГ/белок составляло 1,5-3/1 Контроль образования коньюгатов ПЭГ30-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс проводили при помощи электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС) в восстанавливающих условиях и обратно- фазной высокоэффективной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Очистку коньюгатов моноПЭГЗО-дЭПО-нс и моноПЭГ40-дЭПО-нс от продуктов реакции, немодифицированного дЭПО-нс и от нежелательных ПЭГилированныхформ дЭПО-нс, содержащих две и более молекулы ПЭГ на молекулу белка, проводили при помощи одноэтапной хроматографии на анионообменных сорбентах. Элюцию целевых фракций моноПЭГ-ДЭПО-нс проводили градиентом концентрации хлористого натрия от 0,05 до 0,2 М в буферном растворе с рН ниже 6. Очищенный препарат моноПЭГ-дЭПО диализовали против 1-20 мМ буферного раствора с рН 4-5, добавляли соли, или полисахариды, или многоатомные спирты, или поливинилпирролидоны, или моносахариды, или аминосахара, или белки, или аминокислоты и неионные детергенты и хранили в пластиковых или стеклянных флаконах с силиконизированной поверхностью при температуре 4-2 °С.
Для характеристики полученных коньюгатов ПЭГЗО-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс исследовали его чистоту, гомогенность, физико-химические свойства, влияние на уровень глюкозы в крови при многократном введении, функциональную активность in vivo и in vitro и фармакокинетические параметры в сравнении с немодифицированным дЭПО-альфа и дЭПО-нс.
В качестве дЭПО-альфа использовали препарат Аранесп, производства Амджен Европа Б.В. лот 1042847 или препарат дЭПО-альфа, производства «ЗАО Биокад», серия 1 15061212Р. Распределение изоформ дЭПО-нс и дЭПО- альфа проводили в сравнении с эпоетином-альфа (ЭПО-альфа, препарат Эпрекс производства Янссен Фармацевтика НВ, серия SSC6100).
Предлагаемое изобретение иллюстрируется фигурами графического изображения, где представлены:
Фиг. 1. Анализ препаратов препаратов дЭПО-альфа (препарат Аранесп, Амджен Европа Б.В., лот 1042847), дЭПО-нс («ЗАО Биокад») и ЭПО-альфа (препарат Эпрекс, ) методом изоэлектрофокусирования.
Трек 1 - препарат ЭПО-альфа; Трек 2 - препарат дЭПО-нс, полученный по п.1 ; Трек 3 - препарат дЭПО-альфа (препарат Аранесп, Амджен Европа Б.В., лот 1042847.).
5 Фиг. 2. Содержание олигосахаридных антеннарных структур,
терминированных сиаловыми кислотами в препаратах дЭПО-нс и дЭПО- альфа.
А - дЭПО-альфа (препарат Аранесп, Амджен Европа Б.В. лот 1042847); В-дЭПО-нс, полученный по п.1 ; 1-4 - олигосахаридные структуры: 1 - ю моносиалированные, 2 - дисиалированные, 3 - трисиалированные, 4 - тетрасиалированные.
Фиг. 3. Определение функциональной активности дЭПО-нс и дЭПО- альфа in vitro по способности стимулировать пролиферацию клеток TF-1. -!- дЭПО-нс; -,- дЭПО-альфа (ЗАО Биокад, ); -А- дЭПО-альфа (препарат
15 Аранесп Амджен Европа Б.В. лот 1042847)
Фиг. 4. Определение функциональной активности дЭПО-нс и д ЭПО- альфа in vivo. -!- дЭПО-нс; -,- дЭПО-альфа(ЗАО Биокад, ); -А- дЭПО-альфа (препарат Аранесп Амджен Европа Б.В. лот 1042847).
Фиг 5. Анализ кинетики образования коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс при 20 проведении реакции с использованием бутиральдегидного производного
мПЭГ с молекулярной массой 30 000 Да методом ЭФ в 8% ПААГ в
присутствии ДДС. Mr- стандарты молекулярных масс (HMW). Сверху указано время реакции в часах. Слева указаны молекулярные массы
стандартов в кДа.
25 Фиг. 6. Электрофоретический анализ полученных коньюгатов ПЭГ- дЭПО-нс. Mr - стандарты молекулярных масс (HMW). Сбоку указаны молекулярные массы стандартов в кДа. Трек 1 - препарат дЭПО-нс, полученный по п.1 ; Трек 2 - Коньюгат ПЭГЗО-дЭПО-нс, полученный по п.9;
Трек 3 - Коньюгат ПЭГ40-дЭПО-нс, полученный по п.10.
зо Фиг. 7. Обратно-фазная ВЭЖХ коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс, полученного по п. 9, колонке "Symmetry С18 " (4,6 х 150 mm).
Фиг. 8. Эксклюзионная ВЭЖХ коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс,
полученного по п. 9, колонке " TSK Gel 4000 SW XL " (7.8 х 300mm).
Фиг. 9. MALDI Масс-спектр коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс, полученного по п. 9, в области m/z 15 000-90 000.
Фиг. 10. Влияние коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс, полученного по п. 9, на уровень глюкозы в крови животных при многократном введении крысам. 1 - 3- коньюгат ПЭГЗО-дЭПО-нс; 1 - 4 мкг/кг; 2 - 8 мкг/кг; 3- 20 мкг/кг; 5- дЭПО-альфа (20 мкг/кг), 6- дЭПО-нс (20 мкг/кг); 7 - плацебо.
Фиг. 1 1. Определение функциональной активности коньюгата ПЭГЗО- дЭПО-нс в сравнении с немодифицированными препаратами дарбепоетинов (дЭПО-нс и дЭПО-альфа) in vitro по способности стимулировать
пролиферацию клеток TF-1. -ξ- коньюгат ПЭГЗО-дЭПО-нс, полученный по п. 9; -!- дЭПО-нс; -Λ- дЭПО-альфа (препарат Аранесп Амджен Европа Б.В. лот 1042847).
Фиг. 12. Определение функциональной активности коньюгатов ПЭГЗО- дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс в сравнении с немодифицированными
препаратами дарбепоетинов (дЭПО-нс и дЭПО-альфа in vivo), -ξ- Коньюгат ПЭГЗО-дЭПО-нс -, полученный по п.9; -7- Коньюгат ПЭГ40-дЭПО-нс, полученный по п.10, -!- Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1 ; -Λ- дЭПО- альфа (препарат Аранесп Амджен Европа Б.В. лот 1042847).
Фиг. 13. Фармакокинетика коньюгатов ПЭГЗО-дЭПО-нс и ПЭГ40- дЭПО-нс в сравнении с немодифицированными препаратами дарбепоетинов (дЭПО-альфа и дЭПО-нс) при однократном подкожном введении мышам, -ξ- Коньюгат ПЭГЗО-дЭПО-нс -, полученный по п.9; -7- Коньюгат ПЭГ40- дЭПО-нс, полученный по п.10, -!- Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1 ; - Λ- дЭПО-альфа (препарат Аранесп Амджен Европа Б.В. лот 1042847).
Примеры конкретного выполнения способа получения коньюгатов ПЭГ30-ДЭПО-нс формулы (I) и ПЭГ40-дЭПО-нс формулы (И) и исследования их свойств приведены ниже.
Коньюгаты ПЭГ-дЭПО формулы (I и II), являющиеся объектом настоящего изобретения, могут быть использованы для получения лекарственных средств для профилактики и/или лечения различных анемий с 5 недостаточной продукцией эндогенного ЭПО, в частности анемии, ассоциированной с хронической почечной недостаточностью или цитостатической химиотерапией; анемии, ассоциированной с сердечно- сосудистыми нарушениями; анемии, вызванной массивными кровопотерями различного генеза; анемии у пациентов с вирусным гепатитом С после ю противовирусной терапии. Также объектом настоящего изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента эффективное количество коньюгатов формулы (I) или формулы (II), которые могут использоваться как отдельно, так и совместно с другими терапевтическими средствами для профилактики и/или лечения анемий,
15 вызванных недостаточной продукцией эндогенного ЭПО.
Коньюгаты формулы (I) формулы (II) с необязательным фармакологически приемлемым наполнителем, разбавителем и/или фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами вводят внутривенно или подкожно. Путь введения варьирует в зависимости,
20 например, от симптомов и возраста, частота введения и интервал между введениями варьируют в зависимости от заболевания и его тяжести или от цели (терапевтическое или профилактическое использование), эффективное количество активного начала коньюгатов ПЭГ-дЭПО-нс формулы (I) или формулы (II) выбирается с учетом вышеизложенных факторов.
25 В качестве фармацевтически приемлемых вспомогательных компонентов, которые могут входить в фармацевтическую композицию, сод ежащую заявляемые коньюгаты ПЭГЗО-дЭПО-нс формулы (I) или ПЭГ40-дЭПО-нс формулы (И), могут быть использованы: буферные соли (например, ацетатный, цитратный, водород-карбонатный, фосфатный, зо гистидиновый буферы), стабилизаторы (например, полисорбаты, ЭДТА, поливинилпирролидоны, декстраны, ЧСА, эфиры параоксибензойной кислоты, спирты (например, бензиловый спирт), фенолы, сорбиновая кислота), обеззараживающий компонент (например, бензиловый спирт), регулятор осмотического давления (например, хлорид натрия, хлорид калия, полиолы, например, глицерин, арабитол, сорбитол, маннитол, лактоза, декстран), аминокислоты (например, метионин, глицин, лейцин, изо-лейцин, треонин, глютаминовпая кислота, фенилаланин), сурфактанты (например, ЧСА, поливинилпирролидон, лецитин, Твин 80, Твин-20, полоксамер 188, полиоксиэтилен-полиоксипропилен сополимер, казеин), поверхностно- активные вещества (например, блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, пропиленоксида и этиленоксида, сорбитанмонолаурат, сложный эфир сорбита, сложный эфир жирной кислоты полиглицирина, кокамид DEA лаурилсульфат, алканоламид, стеарит полиоксиэтилен пропилен гликоля, лауриновый эфир полиоксиэтилена, цетиловый эфир полиоксиэтилена, полисорбат, моностеарат глицерина, дистеарат глицерина, монопальмитат сорбита, сорбитанмоноолеат полиоксиэтилена, сорбитанмонолаурат полиоксиэтилена и моностеарат пропиленгликоля), антиоксиданты (например, Трилон Б, Ζ-цистеин, сульфит натрия, аскорбат натрия, глутатион, 2-меркаптоэтанол, дитиотриитол, цистеингидрохлорид моногидрат, аскорбиновая кислота) и разбавители (например, вода).
Примеры
Пример 1.
Получение очищенного низкосиалированного дарбепоетина
5 (дЭПО-нс)
Для выделения дЭПО-нс использовали культральную жидкость (КЖ) генетически модифицированных клеток яичника китайского хомячка (СНО), трансформированных геном дЭПО. Через 6 дней культивирования 20 л КЖ ю фильтровали черезг лубинный фильтр с варьирующим размером пор.
Осветленную КЖ концентрировали до 1 л, проводили тангенциальную диафильтрацию на мембранах с пределом отсечения 10 кДа против 10 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,6 и полученный концентрат наносили на колонку (5x30 см) с сорбентом "Blue sepharose" (270 мл). Колонку промывали 10
15 объемами 10 мМ Трис-HCl буфера, рН 8,6. Элюцию связавшегося с сорбентом дЭПО-нс проводили 20 мМ Трис-HCl, рН 7,3, содержащим 0,3 М NaCI. Полученный элюат концентрировали в 10 раз и наносили на колонку с аффинным сорбентом (200 мл), содержащим моноклональные антитела к ЭПО-альфа. Колонку промывали 10 объемами 10 мМ Трис-HCl буфера, рН
20 8,0, содержащего 1М NaCI. Элюцию связавшегося белка дЭПО-нс проводили 10 мМ Трис-ОН, содержащим ЗМ MgCI2, рН 7,2. Далее проводили диафильтрацию полученного белкового раствора на мембранах с пределом отсечения 10 кДа против буфера 10 мМ Трис-HCl буфера, рН 7,5 и наносили на колонку с анионообменным сорбентом 40Q (100 мл). Сорбент промывали
25 20 мМ ацетатом натрия, рН 4. Элюцию дЭПО-нс проводили 20 объемами 10 мМ Трис-HCl буфера, рН 7,5, содержащим градиент концентрации NaCI от 0 до 300 мМ. Фракции, содержащие дЭПО-нс, объединяли, концентрировали и диализовали против 50 мМ ацетата Na, рН 5.0. Полученный пул (400 мг, 3,6 мг/мл). анализировали и использовали для реакции ПЭГилирования.
зо Пример 2.
Анализ распределения изоформ в препарате дЭПО-нс методом изоэлектрофокусирования в сравнении с дЭПО-альфа и ЭПО-альфа. Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1 , препарат дЭПО-альфа и ЭПО- альфа (препарат Эпрекс) концентрировали при помощи центрифужных пробирок Amicon Ultra до концентрации 10-12 мг/мл и диализовали против воды. Изоэлектрофокусирование полученных образцов проводили в пластинах 4.5% полиакриламидного геля (ПААГ), содержащего смесь амфолитов 3-7 и 2-4 в соотношении 1 :8, 4,8М мочевины и 4,9 % сахарозы с использованием прибора . 1 1 1 Mini IEF Cell (BioRad). Анализируемые пробы смешивали с буфером для образцов, содержащим растворы амфолитов и мочевину, в соотношении 1 : 1 и 2 мкл полученных образцов наносили на пластину ПААГ. ИЭФ проводили в течение 15 мин при 100 В, 15 мин при 200В и 60 мин при 450 В. После завершения процесса ИЭФ пластину ПААГ отделяли от стекла и выдерживали в течение 30 мин в фиксирующем растворе, содержащем 4% сульфосалициловой к-ты, 12,5 % трихлоруксусной кислоты и 30% этанола. Окрашивание белковых полос проводили раствором, содержащим 0,04% Кумасси R-250, 27% этанола, 10% уксусной к-ты и 0,5% CuS04, в течении 60 мин. .После окрашивания гель обесцвечивали раствором, содержащим 12% этанола, 7% уксусной к-ты и 0,5% CuS04, высушивали при комнатной температуре и сканировали. Результаты анализа распределения изоформ в исследуемых пробах (дЭПО- нс, дЭПО-альфа и ЭПО-альфа) представлены на рис.1.
Пример 3.
Определение содержания сиаловых кислот в препарате дЭПО-нс методом изоэлектрофокусирования в сравнении с дЭПО-альфа и ЭПО- альфа Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1 , препараты дЭПО-альфа (ЗАО «Биокад»), дЭПО-альфа (Аранесп, Amgen) и ЭПО-альфа (препарат Эпрекс) диализовали против буферного раствора (1 ,5 мМ КН2РО4, 8, 1 мМ Na2HP04, 0,4 М NaCl, рН 7,4) и разбавляли указанным буфером до концентраций 0,3 и 0,15 мг/мл. К полученным пробам, объемом 100 мкл, добавили 1 мл раствора реагента резорцинола, инкубировали в кипящей водяной бане в течение 30 минут. Пробы охладили во льду, добавили 2 мл смеси бутанола/бутил ацетата (1 :4), интенсивно перемешали и затем инкубировали в течение 10 минут для разделения фаз. Отобрали верхнюю органическую фазу и измерили поглощение всех образцов при 580 нм. Содержание сиаловых кислот определяли по калибровочной кривой приготовленных стандартных образцов с концентрациями 0,1, 0,08, 0,06, 0,04, 0,02 и 0 мг/мл. Содержание сиаловых кислот в исследуемых образцах представлено в табл. 1. Таблица 1. Содержание сиаловых кислот в исследуемых образцах
Figure imgf000021_0001
Пример 4.
Анализ олигосахаридных антеннарных структур, терминированных сиаловыми кислотами, в препарате дЭПО-нс в сравнении с дЭПО-альфа
Для анализа олигосахаридных антеннарных структур, терминированных сиаловыми кислотами, использовали метод анионообменной ВЭЖХ при высоких рН (НРАЕС) с использованием импульсного амперометрического детектора с золотым электродом. В раствор образца дЭПО-нс, полученного по п.1 , и образца дЭПО-альфа (ЗАО «Биокад»), содержащих 50 мкг белка/20 мкл, добавили 2 U PNGase F (Ν-гликозидазы), довели объем смеси до 30 мкл водой и инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 20 часов. После инкубации к раствору добавили 90 мкл охлажденного этанола (-20 °С), инкубировали реакционные смеси в течение 30 минут при температуре -20°С. После инкубации раствор отцентрифугировали 10 минут (10000 оборотов) при 4°С. Полученные супернатанты инкубировали 20 часов при температуре 37°С до полного высушивания. Высушенные образцы растворили в 50 мкл воды дистиллированной. Анализ полученных проб (10 мкл) проводили на хроматографе Waters Aliance с электрохимическим детектором с использованием колонки CarboPac РА- 100 (4 х 250 мм) при температура 25 °С. Результаты исследования представлены в табл. 2. и на рис. 2.
Таблица 2. Содержание олигосахаридных антеннарных структур, терминированных сиаловыми кислотами
Figure imgf000022_0001
Пример 5
Определение функциональной активности дЭПО-нс и дЭПО- альфа на in vitro
Функциональную активность дЭПО-нс и дЭПО-альфа in vitro определяли по способности стимулировать пролиферацию клеток TF-1 (Human erythroleukaemia cells). Клетки культивировали в среде RPMI- 1640 с 10 % инактивированной бычьей сыворотки с добавлением 2 нг/мл GM-CSF. Подготовленные клетки отмыли (центрифугированием) от ростовой среды с сывороткой и фактора GM-CSF, развели в среде RPMI- 1640 с 0,5 % инактивированной сыворотки в концентрации 0,2x106 кл./мл. Приготовили разведения дЭПО-нс, полученному по п.1 , дЭПО- альфа и препарата Аранесп в диапазоне 100 000 - 0 нг/мл. В 96-луночный планшет внесли по 50 мкл/лунку подготовленных разведений исследуемых препаратов в трех повторах. Добавили к растворам по 50 мкл/лунку подготовленных клеток TF- 1. Планшеты инкубировали при 37оС, 5 % С02 в течение 72 часа. Количество живых пролиферирующих клеток измеряли с помощью витального красителя AlamarBlue по интенсивности флюоресценции.
Для определения пролиферирующей активности препаратов строили стандартную кривую зависимости уровня пролиферации клеток TF 1 от дозы добавленных к клеткам препаратов. Построение кривых проводили в полулогарифмических координатах (логарифм концентрации добавленных препаратов - уровень флюоресценции). Статистический анализ кривых проводили при помощи программы "Origin 7.0" методом аппроксимации экспериментальных данных четырехпараметрическому логистическому уравнению сигмоидальной кривой: Ух = А2 + (А}-А2)/(1 + (Х/Хо)р
Где:
Ух - интенсивность флюоресценции в зависимости от дозы препарата X; A2 -максимальный уровень флюоресценции;
Ai- минимальная уровень флюоресценции;
Х- концентрация препарата;
Хо - среднеэффективная доза (ЕС50) препарата, обеспечивающая 50% индукцию пролиферации клеток TF1 от максимально возможной величины; р - коэффициент, определяющий угол наклона кривой.
Полученные результаты, представленые на фиг. 3 и табл.3, свидетельствуют о том, что среднеэффективная доза (ЕС50), обеспечивающая 50% индукцию пролиферации клеток TF1 , для дЭПО-нс в 4,6 раза ниже, чем аналогичная доза для дЭПО-альфа.
Таблица 3. Среднеэффективная доза (ЕС50) исследуемых препаратов, обеспечивающая 50% индукцию пролиферации клеток TF1 от максимально возможной величины
Figure imgf000024_0001
Пример 6
Определение функциональной активности дЭПО-нс и дЭПО-альфа in vivo Определение проводили методом биологического теста в нормоцитемической модели на мышах линии СВА. Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1 , препарат дЭПО-альфа («ЗАО Биокад») и препарат дЭПО- альфа(Аранесп, Амджен) вводили мышам однократно в дозе 0,5 мкг/мышь подкожно в объеме 0,5 мл. Препараты разводили фосфатным буфером На 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 16 и 20 сутки у животных забирали кровь из орбитального синуса в пробирки с содержанием 1 % ЭДТА. Общее количество эритроцитов подсчитывали на гематологическом анализаторе «Exigo». Процентное содержание ретикулоцитов определяли на цитометре FC 500 Beckman Coulter. Результаты представлены на рис. 4. Через 5 дней после введения активность дЭПО-нс составляла 82% от дЭПО-альфа.
Пример 7
Получение коньюгата ПЭГ-ДЭПО 1а с использованием линейного мПЭГ-бутиральдегид с молекулярной массой 30 000 Да
К 113мл буферного раствора (50 мМ ацетат натрия, рН 5.0±0.2), содержащего 403 мг очищенного дЭПО-нс, полученного по п.1 , добавляли 2,54 мл 1 М раствора цианборгидрида натрия, перемешивали и добавляли 2 г сухого бутиральдегидного производного мПЭГ с молекулярной массой 30 000 дальтон (Laysan Bio Inc (M-PEG-BALD Lot#123-121). Пробу инкубировали 24 часа при постоянном перемешивании при температуре (20±2) °С. Через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл и анализировали кинетику образования коньюгата ПЭГ-ДЭПО при помощи метода электрофореза (ЭФ) в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС) в редуцирующих условиях. Для этого к отобранной пробе добавляли 1/3 объема буфера, содержащего 125 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 20 % глицерин, 3 % ДДС, 15% 2-меркаптоэтанола, 0,005% бромфенолового синего, и нагревали 3 мин на кипящей водяной бане. Пробы в объеме 5 мкл вносили в лунки подготовленных пластин ПААГ и 5 проводили ЭФ в 12,5 % ПААГ в присутствии ДДС. По окончании электрофореза гель окрашивали при помощи Кумасси R-250. Кинетика образования коньюгата ПЭГ-дЭПО-нс представлена на фиг. 5. В момент времени, когда содержание ПЭГ-дЭПО-нс составляло более 70 %, реакционную смесь в 10 раз разводили дистиллированной водой, доводили ю рН до 6.8 раствором 0.1М NaOH и проводили стерильную фильтрацию через фильтры 0.22 мкм.
Пример 8
Получение коньюгата ПЭГ-ДЭПО-нс с использованием
15 разветвленного мПЭГ-NHS с молекулярной массой 40 000 Да
Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1, диализовали против 50 мМ боратного буфера рН 9.0. Концентрация дЭПО составляла 1,55 мг/мл. К 15.5 мл белкового раствора (24 мг) добавляли 73 мг мПЭГ-NHS с молекулярной
20 массой 40 000 дальтон (SUNBRIGHT(LY-400NS LotNs M12D541), предварительно растворенного в 3 мл 1 мМ соляной кислоты, охлажденной до 0°С во льду. Пробу инкубировали 4 часа при постоянном перемешивании при температуре (0-н4) °С. Через различные промежутки времени из реакционной смеси отбирали аликвоты по 50 мкл и анализировали кинетику образования
25 коньюгата ПЭГ-дЭПО при помощи метода электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС как описано в п.7. Реакцию останавливали разведением в 10 раз очищенной водой и переводили рН до 6.8 разбавленной уксусной кислотой. зо Пример 9
Очистка коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс при помощи ионообменной хроматографии на анионообменном сорбенте.
Разбавленный раствор ПЭГ-дЭПО-нс, полученный по п.7 или по п.8, наносили на колонку с анионообменным сорбентом (40 )-сефароза Work Beads, BioWorks, CatN° 40 100 210), уравновешенным 20 мМ Na-фосфатным буфером рН7,4 (буфер А. После нанесения раствора белка, сорбент промывали буфером А до базовой линии (10-12 объемов колонки). Элюцию связавшегося моно-ПЭГ-дЭПО-нс проводили буфером А, содержащим градиент концентрации NaCl (0-0,5 М NaCl (40 объемов колонки) со скоростью 30 см/час. В полученных фракциях измеряли оптическую плотность при 280 нм и 260 нм, определяли концентрацию белка и проводили анализ при помощи SDS-электрофореза в 8% ПААГе, как описано в п. 7. Фракции, содержащие моноПЭГилированный коньюгат ПЭГЗО-дЭПО- не с чистотой более 95%, объединяли, диализовали против 10 объемов буфера А, рН 6.2±0.2, проводили стерильную фильтрацию и хранили при температуре 4±2 °С.
Пример 10
Очистка коньюгата ПЭГ40-дЭПО-нс при помощи ионообменной хроматографии на анионообменном сорбенте
Разбавленный раствор ПЭГ-дЭПО-нс, полученный по п.8, наносили на колонку с анионообменным сорбентом (40(^-сефароза Work Beads, BioWorks, CatNe 40 100 210), уравновешенным 20 мМ Na-фосфатным буфером рН7,4 (буфер А). Хроматографию проводили, как описано в п. 9. Фракции, содержащие моноПЭГилированный коньюгат ПЭГ40-дЭПО-нс с чистотой более 95%, объединяли, диализовали против 10 объемов буфера А, рН 6.2±0.2, проводили стерильную фильтрацию и хранили при температуре 4±2 ОС. Пример 11
Анализ чистоты полученных коньюгатов ПЭГ-дЭПО-нс при помощи метода электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС
Препарат дЭПО-нс, полученный по п.1 , коньюгаты ПЭГ-дЭПО-нс, полученные по п.9 или по п. 10, анализировали при помощи ЭФ в 8% ПААГ в присутствии 2-меркаптоэтанола и ДДС, как описано в п.7. Нагрузка на трек составляла 10 мкг белка. Результаты представлены на фиг. 6.
Пример 12
Анализ гомогенности коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс при помощи метода обратно-фазной высокоэффективной жидкостной
хроматографии. оньюгат ПЭГЗО-дЭПО-нс, полученный по п.9, разводили 20 мМ Na- фосфатным буфером, рН6,2 до концентрации 0,1 мг/мл и 100 мкл полученной пробы вносили на колонку Symmetry300 С4 (4.6x150 mm). Исследование проводили на хроматографе «Breeze» фирмы "Waters" при 214 нм. Из результатов, представленных на фиг. 7 следует, что по данным ОФ ВЭЖХ чистота заявляемого коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс составляет более 99 %.
Пример 13
Анализ гомогенности коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс при помощи метода эксклюзионной высокоэффективной жидкостной
хроматографии.
Коньюгат ПЭГ-дЭПО-нс, полученный по п.9, разводили 20 мМ ИаФосфатным рН6,2 буфером до концентрации 0,7 мг/мл и 40 мкл полученной пробы вносили на колонку TSK Gel 4000 SW XL (Tosoh bioscience, 7.8 mm x 300mm). Анализ проводили на хроматографе Agilent series. Скорость потока составляла 0,4 мл/мин, время хроматографирования - 60 мин. Детекцию проводили на длине волны 214 нм. Результаты исследования представлены на фиг.8. Видно, что 5 исследуемый образец ПЭГ-ДЭПО выходит с колонки одним, четко выраженным симметричным пиком, составляющим >97%.
Пример 14
Определение молекулярной массы оньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс при ю помощи метода эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Коньюгат ПЭГ-дЭПО-нс, полученному по п.9 (10 мкг), сконцентрировали и отдиализовали с использованием микроколонки ZipTip
15 С18 (Millipore, США). На мишень наносили обессоленный раствор коньюгата ПЭГ-дЭП-нс и элюировали раствором матрицы (2 мг синапиновой кислоты в 100 мкл 75 % раствора ацетонитрила в 0,1 % растворе трифтроуксусной кислоты). Образец, нанесенный на мишень, высушивали на воздухе. Масс-спектры были получены на Масс-
20 спектрометре MALDI-TOF-TOF ABSciex 4800 (Канада). Масс-спектры получены в режиме положительных ионов, в линейном режиме, погрешность измерения средней массы не превышает 10-15 Да.
Результаты по масс-спектрометрическому анализу коньюгата ПЭГ- дЭПО-нс, полученного по п.9, в диапазоне m/z от 15 000 - 90 000 приведены
25 на фиг.9. Видно, что масс-спектр коньюгата ПЭГ-дЭПО-нс представлен размытым пиком в области 60 000 - 70 000 Да, соответствующим однозарядному иону [М]+ с молекулярной массой 65 450 ±5 000 Да. Размытость пика обусловлена гетерогенностью препарата монометоксиПЭГ, используемого для получения ПЭГилированного белка. Измеренное значение зо m/z в максимуме пика (65450±5000) Да совпадает с расчетными данными по сумме молекулярных масс дЭПО-нс (36-37 ООО Да) и присоединенного ПЭГ (30 ООО Да).
Пример 15
Влияние оньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс на уровень глюкозы в сравнении с дЭПО-нс и дЭПО-альфа
Животным (беспородные крысы) вводили коньюгат ПЭГЗО-дЭПО-нс, полученный по п.9, 1 раз в 6 дней в течение 30 суток в различных дозах (4, 8 и 20 мкг/кг). Параллельно другим группам животных вводили препараты немодифицированных дарбепоетинов (дЭПО-альфа и дЭПО-нс) 1 раз в день в течение 30 сут в дозе 20 мкг/кг. На 30 сутки исследования проводили определение эритроцитов в крови (как описано в п. 6) и определение глюкозы в сыворотке крови подопытных животных. Концентрацию глюкозы определяли при помощи полуавтоматического биохимического анализатора Humalyzer 3000 (Human GmbH, Германия) с предварительной пробоподготовкой согласно инструкции по применению набора реагентов на анализ глюкозы крови (ЗАО «Аналитика», Россия). Результаты исследования представлены на фиг. 10 и табл.4 . Введение коньюгата ПЭГ-дЭПО-нс, также как и введение препаратов немодифицированных дарбепоетинов (дЭПО- альфа и дЭПО-нс), приводило к стимуляции эритропоэза у подопытных животных (табл. 4). Однако, следует отметить тот факт, что при введении препаратов немодифицированных дарбепоетинов, наряду с увеличением числа эритроцитов в крови, у животных наблюдалась также резко выраженная гипогликемия, при этом концентрация глюкозы в крови животных снижалась в 2.6 -5.2 раза по сравнению с контролем. Ввведение коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс, полученного по п.9, вызывало стимуляцию эритропоэза практически без гипогликемии. По сравнению с контролем, концентрация глюкозы в крови снижалась незначительно в 1 ,1-1,25 раза в зависимости от дозы введенного конюгата,, ПЭГЗО-дЭПО-нс (табл. 4). Полученные результаты свидетельствуют о том, что присоединение ПЭГ к молекуле дЭПО-нс предотвращает развитие резко выраженной гипогликемии при сохраненной эритропоэз-стимулирующей активности коньюгата ПЭГ30- дЭПО-нс. Применение заявляемого коньюгата в клинике для стимуляции эритропоэза является более безопасным, так как не приводит к резкому снижению уровня глюкозы в крови, в отличие от препаратов немодифицированных дарбепоетинов.
Табл. 4. Содержание эритроцитов и глюкозы в крови подопытных животных при многократном введении коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс в различных дозах в сравнении с препаратами немодифицированных дЭПО (дЭПО-альфа и дЭПО-нс)
Figure imgf000031_0001
Пример 16
Определение функциональной активности коньюгата ПЭГЗО- дЭПО-нс in vitro в сравнении с дЭПО-нс и дЭПО-альфа
Функциональную активность in vitro коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс, полученного по п. 9, определяли по способности стимулировать пролиферацию клеток TF-1 (Human erythroleukaemia cells) как описано в п. 5, в сравнении с дЭПО-нс, полученному по п. 1, и дЭПО-альфа. Результаты, представленные на фиг. 1 1 и табл.5, свидетельствуют о том, что среднеэффективная доза (ЕС50), обеспечивающая 50% индукцию пролиферации клеток TF1 , для ПЭГ-дЭПО-нс примерно в 17 раз выше, чем аналогичная доза для дЭПО-нс и в 4 раз выше, чем дЭПО-альфа.
Таблица 5. Среднеэффективная доза (ЕС50) исследуемых препаратов, обеспечивающая 50% индукцию пролиферации клеток TF1 от максимально возможной величины
Figure imgf000032_0001
Пример 17
Определение функциональной активности коньюгатов ПЭГ- дЭПО-нс в сравнении с дЭПО-нс и дЭПО-альфа in vivo
Определение проводили методом биологического теста в нормоцитемической модели на мышах линии СВА. Коньюгат ПЭГЗО-дЭПО- нс (полученный по п. 9) или коньюгат ПЭГ40-дЭПО-нс (полученный по. п.10) , препарат дЭПО-нс (полученный по п.1 , и препарат дЭПО-альфа вводили разным группам мышей однократно в дозе 0,5 мкг/мышь подкожно в объеме 0,5 мл. Препараты разводили фосфатным буфером. Через 3, 4, 5, 6,
7, 8, 10 и 12 суток после введения у животных забирали кровь из орбитального синуса. Содержание ретикулоцитов определяли, как описано в п.6. Результаты представлены на рис. 12. Длительность ответа на введение коньюгатов ПЭГ-дЭПО-нс, полученных по п.9 и п.10, была на несколько дней выше, чем при введении дЭПО-нс и дЭПО-альфа. Введение коньюгата ПЭГЗО-дЭПО-нс, полученного по п. 9, приводило к более значительному увеличению числа ретикулоцитов, чем введение коньюгата ПЭГ40-дЭПО, 5 приготовленного по п.10, препарата дЭПО-нс (приготовленного по п. 1) и дЭПО-альфа. Коньюгат ПЭГ40-дЭПО, приготовленный по п.10, обеспечивал самый длительный ответ.
Пример 18
ю Исследование фармакокинетики коньюгатов ПЭГ-дЭПО-нс при однократном подкожном введении мышам.
Пробы коньюгатов ПЭГ-дЭПО-нс, полученных по п.9 или по п.10, вводили однократно подкожно мышам в дозе 400 нг/животное. Параллельно
15 другим группам мышей вводили подкожно препарат немодифицированного дЭПО-нс, полученного по п.1 , и препарат дЭПО-альфа в той же дозе. Пробы крови отбирали через 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168 и 240 часов после ведения препаратов. Сыворотки отделяли центрифугированием и хранили при температуре минус 20°С до проведения анализа. Для определения уровня
20 ПЭГ-дЭПО, дЭПО-нс, и дЭПО-альфа в сыворотке крови мышей была использована тест-система, разработанная в ОП ЗАО «Биокад». Уровень исследуемых препаратов в сыворотке крови оценивался с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Лунки 96-луночного
25 микропланшета для микротитрования ("Costar", Cat. N 3590) сенсибилизировали поликлональными антителами кролика против дЭПО из расчета 500 нг/100 мкл 20 мМ карбонатного буфера (рН 9.0-9.5) на лунку и инкубировали 16-18 часов при 4°С. Не связавшиеся иммуноглобулины удаляли из лунок. Для блокирования неспецифических участков связывания, зо в лунки вносили по 200 мкл 20 мМ Трис-HCI буфера, рН 7.2-7.4 (ТБ), содержащего 0.14 M NaCI и 0,5% NFDM (блокирующий буфер - ББ) и инкубировали 30 минут при 37°С. Раствор ББ удаляли, в лунки вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки, разведенной в 2 - 1000 раз ББ. Параллельно в лунки вносили 100 мкл ББ, содержащего различные концентрации ПЭГ30- дЭПО-нс или ПЭГ40-дЭПО-нс (в диапазоне 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 и 0 нг/мл) или дЭПО-нс (в диапазоне 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 и 0 нг/мл) или дЭПО-альфа ( в диапазоне 50, 25, 12,5, 6,25, 3,12 и 0 нг/мл. Планшеты инкубировали 30 минут при 37°С. Содержимое лунок удаляли, лунки промывали 3 раза по 200 мкл ТБ, содержащего 0.05 Твина-20 в лунки вносили по 100 мкл ББ, содержащего поликлональные антитела кролика против дЭПО, меченые биотином в рабочем разведении и инкубировали 30 минут при 37°С. После инкубации содержимое лунок отсасывали и в лунки вносили авидин, коньюгированный с пероксидазой по 100 мкл/лунку в рабочем разведении и инкубировали 30 минут при 37°С. Содержимое лунок отсасывали, лунки промывали 4 раза по 200 мкл ТБ, содержащим 0.05 Твина-20, и в лунки вносили по 100 мкл 0.1 М Na-ацетатного буфера, рН 5.0, содержащего 0.1 мг/мл тетраметилбензидина и 0.003% Н2О2. Для остановки реакции в лунки вносили по 50 мкл 2М H2S04 и оптическую плотность в лунках измеряли при помощи планшетного спектрофотометра Тесап при 450 нм. Для определения концентрации препаратов в исследуемых образцах сыворотки, строили калибровочную кривую зависимости оптической плотности раствора от концентрации стандартных разведений препаратов в полулогарифмических координатах и по оптической плотности тестируемого образца находили концентрацию исследуемого препарата. Результаты исследования фармакокинетики представлены на фиг. 13.
Из результатов следует, что заявляемые коньюгаты ПЭГЗО-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс обладают значительным пролонгированным эффектом по сравнению с ^модифицированными препаратами дарбепоетина (дЭПО-нс и дЭПО-альфа). При введении немодифицированных препаратов дЭПО-нс и дЭПО-альфа, их содержание в крови животных достигало максимума через 12 часов после введения и затем очень быстро снижалось. При введении коньюгатов ПЭГЗО-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс, максимальное содержание дЭПО в крови животных наблюдалось через 24 и 36 часов, соответственно. Для ПЭГЗО-дЭПО-нс этот уровень сохранялся в течение 150 часов и только затем происходило медленное снижение содержания дЭПО. Коньюгат ПЭГ40-дЭПО-нс характеризовался более медленным выведением из организма, чем коньюгат ПЭГЗО-дЭПО-нс. Исходя из полученных результатов (фиг. 13) были рассчитаны основные фармакокинетические параметры для заявляемых коньюгатов ПЭГЗО-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс при однократном подкожном введении мышам (табл. 6). Из представленных результатов видно, что клиренс (С1) заявляемых коньюгатов ПЭГ40-дЭПО-нс и ПЭГЗО-дЭПО-нс значительно замедлен по сравнению с ^модифицированными препаратами дарбепоетина (дЭПО-нс и дЭПО- альфа). Значения клиренса составляли 2,45±2,04; 7,68±2,80; 37,83±16,76 и 47,69±18,87 мл/час/кг для ПЭГ40-дЭПО-нс, ПЭГЗО-дЭПО-нс, дЭПО-альфа и дЭПО-нс, соответственно. Снижение клиренса заявляемых коньюгатов ПЭГ40-дЭПО-нс и ПЭГЗО-дЭПО-нс обеспечило их длительную циркуляцию в крови. Время полувыведения (Т1/2) для коньюгатов ПЭГ40-дЭПО-нс и ПЭГЗО-дЭПО составило 93,55±37,73 и 56,50±32,76 часов, соответственно. Для препаратов дЭПО-альфа и дЭПО-нс время полувыведения (Тщ) составило 6,20±2,09 и 9,00±3,14 часов, соответственно. Площадь под кривой (AUC) для заявляемых коньюгатов ПЭГЗО-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс превышала соответствующее значение для немодифицированных дЭПО-нс и дЭПО-альфа в 6 -20 раз. Таблица 6. Усредненные фармакокинетические параметры исследуемых препаратов при однократном подкожн введении мышам в дозе 400 нг/мышь
Figure imgf000036_0001
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют об улучшенных фармакокинетических параметрах заявляемых коньюгатов в сравнении с немодифицированными препаратами дарбепоетинов (дЭПО- альфа и дЭПО-нс). Использование дЭПО-нс в составе заявляемых коньюгатов позволит значительно снизить себестоимость их получения.
На основании полученных данных по фармакокинетике и фармакодинамике полученных коньюгатов ПЭГЗО-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО- нс можно сделать рекомендации по снижению частоты введения лекарственного средства на основе заявляемых коньюгатов ПЭГЗО-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс с сохранением эквивалентного уровня биологического ответа по сравнению с немодифицированными препаратами на основе немодифицированного дЭПО-альфа. Пример 19
Примеры фармацевтических композиций на основе заявляемых коньюгатов ПЭГЗО-дЭПО-нс и ПЭГ40-дЭПО-нс
(А)
ПЭГЗО-дЭПО нс по п. 9 5-1000 мкг
Гистидин/ 0,2-0,6 мг
Гистидин гидрохлорид 0,2-0,6 мг до рН 5,6-6,4
Натрий хлористый 8 -9 мг
Метионин 1-2 мг
Полисорбат 20 0,01-0,1 мг
Вода для иньекций 1,0 мл (Б)
ПЭГЗО-дЭПО нс по п. 9 5-1000 мкг
Натрия фосфат 1,5 - 4,6 мг
Натрий гидроксид до рН 6,2-7,2
Маннитол 20-45 мг
Метионин 1-2 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
Вода для инъекций 1 ,0 мл
(В)
ПЭГЗО-дЭПО нс по п. 9 5-1000 мкг
Натрия фосфат 1 ,5 - 4,6 мг
Натрий гидроксид до рН 6,2-7,2
Сорбитол 20-40 мг
Метионин 1-2 мг
ЭДТА динатриевая соль 0,01- 0,1 мг
Вода для инъекций 1 ,0 мл
(Г)
ПЭГЗО-дЭПО-нс по п. 9 5-1000 мкг
Гистидин/ 0,2-0,6 мг
Гистидин гидрохлорид 0,2-0,6 мг до рН 5,6-6,4
Маннитол 20-40 мг
Метионин 1-2 мг
ЭДТА динатриевая соль 0,01- 0,1 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг Вода для инъекций 1,0 мл
(Д)
ПЭГЗО-дЭПО-нс по п. 9 5-1000 мкг
Гистидин/ 0,2-0,6 мг
Гистидин гидрохлорид 0,2-0,6 мг до рН 5,6-6,4 Маннитол 20-40 мг
Натрия сульфат 5-6 мг
Метионин 0,1-3 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
Вода для иньекций 1 ,0 мл (Е)
ПЭГЗО-дЭПО не по п. 9 5-1000 мкг
Натрия фосфат 1,5 - 4,6 мг
Натрий гидроксид до рН 6,2-7,2
Маннитол 30 мг
Глицин 4,5-5,5 мг
Метионин 0,1-3 мг
Полисорбат 20 0,01-0,1 мг
ЭДТА динатриевая соль 0,01- 0,1 мг
Вода для иньекций 1,0 мл
(Ж)
ПЭГ40-дЭПО не по п. 10 10-1000 мкг
Гистидин/ 0,2-0,6 мг Гистидин гидрохлорид 0,2-0,6 мг до рН 5,6-6,4 Натрий хлористый 8 -9 мг
Метионин 1-2 мг
Полисорбат 20 0,01-0,1 мг
Вода для иньекций 1,0 мл
(3)
ПЭГ40-дЭПО не по п. 10 10-1000 мкг
Натрия фосфат 1 ,5 - 4,6 мг
Натрий гидроксид до рН 6,2-7,2
Маннитол 20-45 мг
Метионин 1 -2 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
Вода для иньекций (И)
ПЭГ40-дЭПО не по п. 10 10-1000 мкг
Натрия фосфат 1,5 - 4,6 мг
Натрий гидроксид до рН 6,2-7,2
Сорбитол 20-40 мг
Метионин 1-2 мг
ЭДТА динатриевая соль 0,01- 0,1 мг
Вода для иньекций 1,0 мл
(К)
ПЭГ40-дЭПО не по п. 10 10-1000 мкг Гистидин/ 0,2-0,6 мг
Гистидин гидрохлорид 0,2-0,6 мг до рН 5,6-6,4
Маннитол 20-40 мг
Метионин 1-2 мг
ЭДТА динатриевая соль 0,01- 0,1 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
Вода для иньекций 1 ,0 мл
(Л)
ПЭГ40-дЭПО не по п. 10 10-1000 мкг
Гистидин/ 0,2-0,6 мг
Гистидин гидрохлорид 0,2-0,6 мг до рН 5,6-6,4 Маннитол 20-40 мг
Натрия сульфат 5-6 мг
Метионин 0,1-3 мг
Полисорбат 80 0,01-0,1 мг
Вода для иньекций 1 ,0 мл (М)
ПЭГ40-дЭПО не по п. 10 10-1000 мкг
Натрия фосфат 1 ,5 - 4,6 мг
Натрий гидроксид до рН 6,2-7,2
Маннитол 30 мг
Глицин 4,5-5,5 мг
Метионин 0,1-3 мг
Полисорбат 20 0,01-0,1 мг
ЭДТА динатриевая соль 0,01- 0,1 мг
Вода для иньекций 1 ,0 мл Пример 20
Упаковка в контейнер лекарственного средства, содержащего ПЭГЗО-дЭПО-нс или ПЭГ40-дЭПО-нс Лекарственное средство, включающее эффективное количество заявляемого ПЭГ-ДЭПО 1а (Пример 17), разливают в стерильных условиях по 0,5, 0,8, 1 ,0 и 1,2 мл (для дозировки 5-50 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,75 и 0,9 мл (для дозировки 100-300 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,8, 1,0 и 1 ,2 мл (для дозировки 500-1000 мкг/мл) в шприцы из нейтрального стекла I гидролитического класса, с впаянными иглами, покрытыми колпачками защитными эластичными или жесткими, укупоренные наконечниками на поршни из бутилкаучука, ламинированного фторполимером.
Пример 21
Упаковка в контейнер лекарственного средства, содержащего
ПЭГЗО-дЭПО-нс или ПЭГ40-дЭПО-нс
Лекарственное средство, включающее эффективное количество ПЭГЗО- дЭПО-нс или ПЭГЗО-дЭПО-нс (Пример 17), разливают в стерильных условиях по 0,5, 0,8, 1 ,0 и 1 ,2 мл (для дозировки 5-10 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,75 и 0,9 мл (для дозировки 100-300 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,8, 1 ,0 и 1,2 мл (для дозировки 500-1000 мкг/мл) во флаконы из нейтрального стекла I гидролитического класса, укупоренные фторрезиновыми или бутилрезиновыми пробками с тефлоновым покрытием, обжатых алюминиевыми колпачками.
Пример 22
Набор, включающий упакованное в контейнеры лекарственное средство, содержащее ПЭГЗО-ДЭПО-нс, 0,5, 0,8, 1 ,0 и 1,2 мл (для дозировки 5-10 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,75 и 0,9 мл (для дозировки 100-300 мкг/мл), по 0,5, 0,6, 0,8, 1 ,0 и 1,2 мл (для дозировки 500- 1000 мкг/мл) Набор содержит по 1 или 4 шприца в комплекте с поршнем (1 или 4 соответственно) /флакона в контурной ячейковой упаковке из пленки полимерной вместе с инструкцией по применению, которые помещают в пачку из картона.
ЛИТЕРАТУРА
1 Egrie J.C., Strickland T.W., Lane J. et al. (1986) ((Characterization and biological effects of recombinant human erythropoietin)). Immunobiology, v. 172, p.213-224.
2. Egrie J.C., Grant J.R., Gillies D.K, Aoki K.H, Strickland T.W. (1993), «The role of carbohydrate on the biological activity of erythropoietin)). Glycoconjugate Journal, v. 10, p. 263-269.
3. Storring P.L, Tiplady RJ, Gaines Das R.E, Stenning B.E.et al. (1998), « Epoetin alfa and beta differ in their erythropoietin isoform compositions and biological properties)). Br. J. Haematol. , v.100, p.79-89.
4. Yuen C.T, Storring P.L, Tiplady R.J. et al. (2003), ((Relationships between the N-glycan structures and biological activities of recombinant human erythropoietins producedusing different culture conditions and purification procedures)), Br. J. Haematol., v. 121 , p. 511-526;
5. Kim J.Y„ Kim Y.G, Lee G.M. (2012), «СНО cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential)), Appl. Microbiol. BiotechnoL, v. 93(3), p. 917-930.
6. Briggs D.W, Fisher J.W, George W.J. (1974), ((Hepatic clearance of intact and desialylated erythropoietin)), . Am. J. Physiol., v. 227, p. 1385-1388;
7 Goldwasser E, Kung CK, Eliason J. (1974). «On the mechanism of erythropoietin-induced differentiation. The role of sialic acid in erythropoietin action)). J. Biol. Chem., v. 249, p. 4202-4206; 8. Egrie J.C., Browne J. . (2001), ((Development and characterization of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP)». Br. J. Cancer, v. 84 Suppl 1 :3-10.
9. Brown J.N., Kemp D.W., Brice K. R. (2009) «Class Effect of Erythropoietin Therapy on Hemoglobin Ale in a Patient with Diabetes Mellitus and Chronic
Kidney Disease Not Undergoing Hemodialysis)), Pharmacotherapy, v. 29, N. 4, p. 468-472.
10. Katz O., StuibleM., Golishevski N., Lifshitz L., TremblayM.L., Gassmann M., Mittelman M. and Neumann D. (2010). ((Erythropoietin treatment leads to reduced blood glucose levels and body mass: insights from murine models)), J.
Endocrinology, v. 205, p. 87-95;
1 1. Mikolas E. , Cseh J., Pap M., Szijarto I. A., Balogh A., Laczy В., Веко V., Fisi V., Molnar G. A. Merei A., Szeberenyi J., Wittmann I. (2012), ((Effects of
Erythropoietin on Glucose Metabolism)), Horm. Metab. Res., v. 44, p. 279-285;
12. Woo M. and Hawkins M. ((Beyond Erythropoiesis: Emerging Metabolic Roles of Erythropoietin)) (2014), Diabetes, v. 63 , p.2229-2231 ;
13. Патент RU 2232163; 14 Патент RU 2433134; 15. Патент RU 2318004;
16. Патент RU 2409389;
П.Патент EA 0181 16; 18. Патент RU 2356909;
19. Jevsevar S., Kunstelj M.,Gaberc P. (2010), «PEGylation of therapeutic proteins», Biotechnology Journal, v. 5, (1), p. 1 13-128;
20. Delgado C, Francis G.E., Fisher D. (1992), «The uses and properties of PEG- linked proteins)), Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys.t, v. 9, p. 249-304;
21. Mehvar R. (2003), «Modulation of pharmacokinetics and pharmacodynamics of protein by polyethetelene glycol conjugate)), J. Pharm. Pharmaceut. Sci., v. 3,
(1), p.125-136;
22. Bailon P., Won C.Y. (2009), «PEG-modified biopharmaceuticals», Expert Opin. Drug Deliv. , v. 6(1), p.1-16;
23. Gonzalez- Valdez J., Rito-Palomares M., Benavides J. (2012), «Advances and trends in the design, analysis, and characterization of polymer-protein conjugates for "PEGylaided" bioprocesses)), Anal. Bioana.l Chem., v. 403, p.2225-2235; 24. Патент RU 2 439 091 ;
25. Патент RU 2 476 439;,
26. Патент US 889837;
27. Патент US 8765924;
28. Патент US 6583272; 29. Патент ЕАПО 003777; 30. Патент RU 2006122540;
31. Патент US 8916360;
32. Патент EAPO 007812;
33. Патент RU 2437675; 34. Ikeda Y., Nagasaki Y. (2012), «PEGylation Technology in Nanomedicine», Adv. Polym. Sc , v. 247, p.115-140;
35. Патент WO2003029291 ; 36. Заявка на изобретение WO2000032772;
37. Заявка на изобретение WO2003029291 ;
38. Патент US 6,586,398,
39. Заявка на изобретение WO2001076640

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Коньюгат низкосиалированного дарбепоетина и полиэтиленгликоля, обладающий эритропоэз стимулирующей активностью, пролонгированным действием и не вызывающий резкого снижения глюкозы в крови, формулы
(I):
CH30-(CH2CH20)n-(CH2)m- N*H -дЭПО-нс ( I )
где:
п - целые значения от 568 до 796;
m - целое число = 4;
дЭПО-нс - низкосиалированный дарбепоетин, содержащий менее 50% тетрасиалированных антеннарных.
2. Коньюгат по п.1 , в котором низкосиалированный дарбепоетин представляет собой природный или рекомбинантный рекомбинантный дарбепоетин.
3. Коньюгат по п.1 , в котором полиэтиленгликоль имеет линейную структуру с молекулярной массой от 25 до 35 кДа.
4. Коньюгат по п.1 , в котором Ν-концевая группа представлена остатком аланина (ALA).
5. Коньюгат низкосиалированного дарбепоетина и полиэтиленгликоля, обладающий эритропоэз стимулирующей активностью и пролонгированным действием, формулы (II):
Figure imgf000049_0001
( I I ) где:
п - целые значения от 284 до 398;
дЭПО-нс - низкосиалированный дарбепоетин, содержащий менее 50% тетрасиалированных антеннарных олигосахаридных структур.
6. Коньюгат по п.5, в котором низкосиалированный дарбепоетин представляет собой природный или рекомбинантный рекомбинантный дарбепоетин.
7. Коньюгат по п.5, в котором полиэтил енгликоль имеет разветвленную структуру с молекулярной массой от 35 до 45 кДа.
8. Фармацевтическая композиция, обладающая эритропоэз стимулирующей активностью, не вызывающая резкого снижения уровня глюкозы, содержащая коньюгат по п. 1 или коньюгат по п. 5 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемые вспомогательные компоненты.
9. Фармацевтическая композиция по п. 8 для применения в качестве лекарственного средства для лечения и профилактики различных анемий с недостаточной продукцией эндогенного ЭПО.
10. Фармацевтическая композиция по п. 8, где анемия ассоциирована с хронической почечной недостаточностью.
1 1. Фармацевтическая композиция по п. 8, где анемия ассоциирована с цитостатической химиотерапией.
12. Фармацевтическая композиция по п. 8, где анемия ассоциирована с массивной кровопотерью различного генеза
13. Фармацевтическая композиция по п. 8, где анемия ассоциирована с химиотерапией вирусных заболеваний.
14. Лекарственное средство, включающее коньюгат по п. 1 или коньюгат по п. 2, обладающее эритропоэз-стимулирующей активностью.
15. Лекарственное средство, по п. 14, включающее буфер, изотонирующий агент, антиокислитель, стабилизатор и воду.
16. Лекарственное средство по п. 14, включающее натрия фосфат, или гистидин, натрий хлористый и/или маннитол, и/или сорбитол, полисорбат 80 или полисорбат 20, ЭДТА, метинонин, воду для инъекций.
17. Применение коньюгата по п. 1 или коньюгата по п. 5 для получения лекарственного средства, обладающего эритропоэз- стимулирующей активностью и не вызывающего резкого снижения глюкозы.
18. Применение по п. 17 для получения лекарственного средства, обладающего эритропоэз-стимулирующей активностью и не вызывающего резкого снижения глюкозы, для лечения анемий, ассоциированных с хронической почечной недостаточностью.
19. Применение по п. 17 для получения лекарственного средства обладающего эритропоэз-стимулирующей активностью и не вызывающего резкого снижения глюкозы, для лечения анемий, ассоциированных с цитостатической терапией.
20. Применение по п. 17 для получения лекарственного средства обладающего эритропоэз-стимулирующей активностью и не вызывающего резкого снижения глюкозы, для лечения анемий, вызванных массивной кровопотерью различного генеза.
21. Применение по п. 17 для получения лекарственного средства обладающего эритропоэз-стимулирующей активностью и не вызывающего резкого снижения глюкозы, для лечения анемий, ассоциированных с терапией вирусных заболеваний.
22. Способ профилактики и/или лечения анемий, с недостаточной продукцией эндогенного ЭПО, включающий введение терапевтически эффективного количества коньюгата по п. 1 или коньюгата по п. 5.
23. Способ по п. 22, где анемия ассоцирована с хронической почечной недостаточностью.
24. Способ по п. 22, где анемия ассоцирована с цитостатической терапией.
25. Способ по п. 22, где анемия ассоцирована с массивными кровопотерями различного генеза.
26. Способ по п. 22, где анемия ассоцирована с ассоциированных с терапией вирусных заболеваний.
27. Контейнер, герметично запаянный в стерильных условиях и соответствующих хранению перед применением, включающий фармацевтическую композицию по п. 8.
28. Контейнер по п. 27, где указанный контейнер представляет собой предварительно заполненный шприц, флакон или автоинжектор.
29. Набор, включающий контейнер по п. 31 и инструкцию по применению.
PCT/RU2016/000740 2015-11-05 2016-11-01 Пролонгированный фактор эритропоэза человека и лекарственное средство на его основе WO2017078571A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015147544A RU2664588C2 (ru) 2015-11-05 2015-11-05 Пролонгированный фактор эритропоэза человека и лекарственное средство на его основе
RU2015147544 2015-11-05

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017078571A1 true WO2017078571A1 (ru) 2017-05-11

Family

ID=58662480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2016/000740 WO2017078571A1 (ru) 2015-11-05 2016-11-01 Пролонгированный фактор эритропоэза человека и лекарственное средство на его основе

Country Status (2)

Country Link
RU (1) RU2664588C2 (ru)
WO (1) WO2017078571A1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001076640A2 (en) * 2000-04-07 2001-10-18 Amgen Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
WO2002049673A2 (en) * 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
EA007812B1 (ru) * 2002-09-09 2007-02-27 Уоррен Фармасьютикалз, Инк. Эритропоэтины длительного действия, которые сохраняют тканезащитную активность эндогенного эритропоэтина

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001076640A2 (en) * 2000-04-07 2001-10-18 Amgen Inc. Chemically modified novel erythropoietin stimulating protein compositions and methods
WO2002049673A2 (en) * 2000-12-20 2002-06-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Conjugates of erythropoietin (pep) with polyethylene glycol (peg)
EA007812B1 (ru) * 2002-09-09 2007-02-27 Уоррен Фармасьютикалз, Инк. Эритропоэтины длительного действия, которые сохраняют тканезащитную активность эндогенного эритропоэтина

Also Published As

Publication number Publication date
RU2664588C2 (ru) 2018-08-21
RU2015147544A (ru) 2017-05-15
RU2015147544A3 (ru) 2018-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100758044B1 (ko) 신규한 약학 조성물
KR100510624B1 (ko) 폴리에틸렌글리콜과의 에리트로포이에틴 결합체
JP4025727B2 (ja) Ｐｅｇ化およびジグリコシル化されたエリスロポエチン
RU2446173C1 (ru) Новый функционально активный, высокоочищенный стабильный конъюгат гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (г-ксф) с полиэтиленгликолем с пролонгированным биологическим действием, пригодный для медицинского применения, и иммунобиологическое средство на его основе
RU2485134C2 (ru) Интерферон альфа 2в, модифицированный полиэтиленгликолем, получение препарата и его применение
JP3727009B2 (ja) エリスロポエチン誘導体
RU2447083C1 (ru) НОВЫЙ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫЙ ВЫСОКООЧИЩЕННЫЙ СТАБИЛЬНЫЙ КОНЪЮГАТ ИНТЕРФЕРОНА α С ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ ОДНИМ ПОЗИЦИОННЫМ ИЗОМЕРОМ ПЭГ-NαH-ИФН, С УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, С ПРОЛОНГИРОВАННЫМ БИОЛОГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, ПРИГОДНЫЙ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ, И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ
JP5961730B2 (ja) 修飾されたエリスロポエチン
CA2549486A1 (en) Use of erythropoietin in the treatment of disturbances of iron distribution in chronic inflammatory intestinal diseases
US8597634B2 (en) Interferon alpha-2a modified by polyethylene glycol and methods of preparation thereof
US11931417B2 (en) Methods of preparing a pegylated human IL-11 composition
RU2664588C2 (ru) Пролонгированный фактор эритропоэза человека и лекарственное средство на его основе
WO2011041376A1 (en) Modified granulocyte colony stimulating factor (g-csf)
RU2232163C2 (ru) Конъюгаты эритропоэтина и полиэтиленгликоля, фармацевтические композиции (варианты), способ профилактического и/или терапевтического лечения нарушений и способ получения коньюгата или композиции
RU2576372C2 (ru) МОЛЕКУЛА ИНТЕРФЕРОНА-β-1а ЧЕЛОВЕКА, МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕМ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВОВИРУСНОЙ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ И АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТЯМИ, С ПОВЫШЕННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ, УМЕНЬШЕННОЙ ИММУНОГЕННОСТЬЮ, УЛУЧШЕННЫМИ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИМИ И ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКИМИ ПАРАМЕТРАМИ, ПРИГОДНАЯ ДЛЯ МЕДИЦИНСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕЕ ОСНОВЕ
US20150329601A1 (en) Methoxypolyethyleneglycol succinimidyl propionate modified recombinant Ganoderma Lucidum immunoregulatory protein, preparing method and application thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 16862546

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 16862546

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1