WO2017048069A1 - 신규한 피라졸린 유도체 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2017048069A1 PCT/KR2016/010363 KR2016010363W WO2017048069A1 WO 2017048069 A1 WO2017048069 A1 WO 2017048069A1 KR 2016010363 W KR2016010363 W KR 2016010363W WO 2017048069 A1 WO2017048069 A1 WO 2017048069A1
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WO
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pyrazol
dihydro
methanone
cancer
compound
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French (fr)
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권영주
에프 엠 모티르 라만에이
에이 카디아드난
나영화
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Ewha Womans University
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    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D409/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond

Definitions

  • the present invention comprises a novel pyrazoline derivative compound, a pharmaceutically acceptable salt thereof, and the pyrazoline derivative compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer and cancer It relates to a food composition for the prevention or improvement of.
  • Cancer cells produce several types of peptide hormones, which stimulate the receptors on the cell wall and contribute to the normal growth and development of cancer.
  • Epidermal growth factor is one of the factors related to growth
  • epidermal growth factor receptor is one of a family of human epidermal growth factor receptors (HERs) expressed in various carcinomas.
  • the HER family consists of EGFR, HER2, HER3, and HER4, and factors related to cancer cell proliferation, among which HER2 is overexpressed in cancer patients such as breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, gastric cancer, uterine cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, etc. It is also known to be involved in the development, progression and metastasis of cancer (Ellina MI et al., Biochem Biophys Acta ., 2014, 1840, 2651-61).
  • Topoisomerase is an enzyme that regulates overwinding or underwinding of DNA, and is a topological disorder caused by the interwinded nature of the double helix structure in the transcription and replication process. It is one of the important factors to solve the topological hurdle. In the clinical application of cancer treatment, many drugs are showing efficacy through inhibition of topoisomerase and researches are being developed to develop various anticancer agents targeting topoisomerase.
  • the present inventors have made intensive studies to develop small molecule compounds capable of effectively inhibiting the activity of topoisomerase or HER2 to provide a prophylactic or therapeutic effect of cancer, and as a result, the novel pyrazoline derivative compounds are topoisomerase, It was confirmed that the activity of HER2 or both can be inhibited and the present invention was completed.
  • One object of the present invention is to provide novel pyrazoline derivative compounds.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the pyrazoline derivative, which comprises reacting a chalcone derivative with a hydrazide derivative under acidic conditions.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer diseases comprising the pyrazoline derivative compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pyrazoline derivative compound represented by the following formula (1), or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • n 1 or 2;
  • X is selected from the group consisting of carbon, oxygen, nitrogen and sulfur;
  • R 1 and R 2 are the same or different and each independently hydrogen, halogen, C 1 -C 6 alkyl, C 3 -C 8 cycloalkyl, C 1 -C 6 haloalkyl, C 1 -C 6 alkoxy, amino, Cyano and nitro;
  • R 3 is C 3 -C 12 heteroaryl, and R 3 may be substituted or unsubstituted with nitro.
  • R 1 and R 2 may be the same or different, and each independently may be hydrogen, halogen, C 1 -C 6 alkoxy or nitro. Specifically, R 1 and R 2 may be the same or different, and each independently may be hydrogen, chloro, methoxy or nitro.
  • R 1 may be hydrogen, chloro or methoxy
  • R 2 may be hydrogen, chloro, methoxy or nitro
  • R 3 may be furyl, pyridinyl or benzothiazolyl, and R 3 may be substituted or unsubstituted with nitro.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 may be a compound selected from the group consisting of the following compounds.
  • Furan-2-yl (5- (furan-2-yl) -3- (4-methoxyphenyl) -4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl) methanone
  • Furan-2 -yl (5- (furan-2-yl) -3- (4-methoxyphenyl) -4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl) methanone
  • Furan-2 -yl (5- (furan-2-yl) -3- (4-methoxyphenyl) -4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl) methanone
  • the pyrazoline derivative represented by Formula 1 of the present invention may exist in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • salts conventionally used in the art may be used without limitation, such as acid addition salts formed by pharmaceutically acceptable free acid.
  • pharmaceutically acceptable salt of the present invention is any concentration of the compound which is relatively nontoxic to the patient and has a harmless effective action, in which the side effects caused by the salt do not degrade the beneficial efficacy of the compound represented by the formula (1). Means any organic or inorganic addition salt.
  • Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • organic acids and inorganic acids may be used as the free acid
  • hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, etc. may be used as the inorganic acid
  • methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, and maleic acid may be used as the organic acid.
  • maleic acid succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid (gluconic acid), galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanic acid, hydroiodic acid, etc. It is not limited to these.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal salts or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable to prepare sodium, potassium, or calcium salt, but is not limited thereto.
  • Corresponding silver salts can also be obtained by reacting an alkali or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg silver nitrate).
  • Pharmaceutically acceptable salts of the compounds of Formula 1 include salts of acidic or basic groups which may be present in compounds of Formula 1 unless otherwise indicated.
  • pharmaceutically acceptable salts may include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, hydrogen phosphate , Dihydrogen phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p-toluenesulfonate (tosylate) salts, and the like. It can be prepared through the method.
  • the present invention provides a method for preparing a pyrazoline derivative represented by Formula 1 comprising reacting a chalcone derivative with a hydrazide derivative under acidic conditions.
  • the reaction between the chalcone derivative and the hydrazide derivative may be performed by mixing the reactant in an alcohol solvent including an acid and refluxing for 10 to 24 hours.
  • Glacial acetic acid may be used as the acid, but is not limited thereto.
  • ethanol may be used as the alcohol solvent, but is not limited thereto.
  • the reaction may be represented by the following Scheme 1.
  • the chalcone derivative compound may be prepared by reacting an acetophenone derivative and an aromatic aldehyde under an alcohol solvent containing a base through a Claisen-Schmidt reaction.
  • the hydrazide derivative compounds may be purchased commercially or prepared by reacting aromatic carboxylic acid mono esters with hydrazine hydrate under alcohol solvent conditions.
  • the method for preparing a compound represented by Formula 1 of the present invention may further include filtration, drying, washing, purifying, or a combination thereof.
  • the filtration, drying, washing, and purifying steps can be performed using any method known in the art without limitation.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising a pyrazoline derivative compound represented by the formula (1), or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the composition is characterized by inhibiting the activity of topoisomerase II, human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) or both.
  • topoisomerase is an enzyme that regulates overwinding or underwinding of DNA and is one of important factors in solving topological hurdle in transcription and replication processes. .
  • the winding problem of DNA is due to the interwinded nature of the double helix structure. For example, during DNA replication, DNA is overwhelmed in front of a replication fork. If this excessive winding remains undegraded, this tension will eventually stop DNA replication. Similar phenomena can occur in the transcription process.
  • topoisomerase binds to single- or double-stranded DNA and cleaves the phosphate backbone of DNA. This intermediate break causes the DNA to be released so that the DNA backbone is resealed at the end of the process.
  • Topoisomerase is divided into type 1 and type 2. Topoisomerase I (Top I) causes single-strand cleavage and recombination of single strands of the DNA duplex of the supercoiled chromosome, while Topoisomerase II (Top II) is Mg (II And ATP, which cuts both strands of DNA and mitigates DNA damage that can be caused by the tension the DNA strands are subjected to. In the clinical application of cancer treatment, many drugs are showing efficacy through inhibition of topoisomerase and researches are being developed to develop various anticancer agents targeting topoisomerase. Topoisomerase inhibitors are grouped into topoisomerase poisons and Top II catalytic inhibitors, depending on the mode of activity.
  • Topoisomerase venom is a compound that stabilizes the transiently formed topoisomerase-DNA complex known as the 'cleavable complex', which inhibits recombination of cleaved DNA strands, leading to unwanted truncated DNA accumulation.
  • Known anticancer agents acting on topoisomerase I function as topoisomerase catalyst inhibitors include irinotecan, topotecan and camptothecin, and doxorubicin and etoposide. It is known as an anticancer agent targeting topoisomerase II, and the compound which can suppress the topoisomerase enzyme is developed in addition.
  • HER2 gene in the present invention regulates the proliferation, division, repair of cells and produces HER2 protein with tyrosine kinase activity.
  • HER2 protein functions as a receptor on the cell membrane and, when activated by extracellular hormones, promotes cell proliferation and division.
  • the HER family consists of four receptors, epidermal growth factor receptors (EGFR), HER2, HER3 and HER4, and are responsible for amplifying and delivering signals reached by forming dimers with other receptors.
  • the HER family is all related to cancer cell proliferation.
  • HER2 is overexpressed in cancer patients such as breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, gastric cancer, uterine cancer, rectal cancer, body cancer and bladder cancer, and the HER2 receptor is overexpressed by genetic mutation. It has been reported that cancer cells proliferate rapidly.
  • the overexpressed HER2 is known to activate homologous and heterodimers to activate transcription of several oncogenes even without binding to a ligand.
  • Herceptin, Tykerb, and the like are known as target therapeutic agents that control overexpression of HER2 protein, but both drugs target only overexpressed HER2 and have poor resistance to prognosis due to the resistance. It is known.
  • the compound of the present invention which effectively inhibits the activity of topoisomerase II or HER2, which is mainly involved in the development or progression of cancer, may provide a prophylactic or therapeutic effect of cancer.
  • the HER2 and topoisomerase II ⁇ genes are located adjacent on the chromosome, so HER2 overexpression in various cancers is directly related to the phenomenon of topoisomerase II ⁇ amplification and deletion. . Therefore, the compound of the present invention targeting topoisomerase II and HER2 simultaneously may bring about better prophylactic or therapeutic effect of cancer.
  • HCT15 human HER2-positive rectal cancer cell line
  • T47D human HER2 negative breast cancer cell line
  • the pyrazoline derivative compound not only exhibits high inhibitory activity against ESX-Sur2 interaction that induces HER2 gene expression, but also has an excellent effect of inhibiting the growth of HER2 overexpressing cells. (Examples 8 and 9).
  • the HER2 inhibitory activity in addition to the HER2 inhibitory activity, it was confirmed to exhibit anticancer activity in the in vivo system (Examples 10 to 13).
  • prevention of the present invention means any action that inhibits or delays the occurrence, spread and recurrence of cancer by administration of the composition of the present invention, and “treatment” means improvement of the symptoms of cancer by administration of the composition of the present invention. Means any action that is or is beneficially altered.
  • Cancers that can be prevented or treated by the pharmaceutical compositions of the present invention include breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, gastric cancer, uterine cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer and the like.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention can be effectively used for the prevention or treatment of cancers caused by topoisomerase II, HER2 or both.
  • composition of the present invention may be formulated in various forms, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, oral formulations such as aerosols, and injections of sterile injectable solutions, according to conventional methods, for the purpose of each use. It may be used orally or may be administered through various routes including intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, rectal, topical, and the like.
  • compositions of the present invention may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may comprise at least one excipient in the composition, for example starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc. Are formulated by mixing. In addition to the simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc may be used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, syrups, and the like, and include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. Can be.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • the suppository base includes Uittepsol, Macrogol, and Twin 61. Cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • Injectables may include conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, and the like.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the term "pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment and that does not cause side effects.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered in single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the compound in the composition of the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and generally 1 to 10 mg, preferably 1 to 5 mg per kg body weight daily or every other day or 1 It can be administered in 1 to 3 times a day.
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject in need thereof a pyrazoline derivative compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof. .
  • the term "individual" of the present invention refers to monkeys, cows, horses, sheep, pigs, chickens, turkeys, quails, cats, dogs, mice, rats, rabbits or guinea pigs, including humans who may or may have the cancer. It means all animals, including, can be effectively prevented or treated by administering to the subject a pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in parallel with existing therapeutic agents.
  • administration means providing the patient with the desired substance in any suitable way, and the route of administration of the composition of the present invention may be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • Intraperitoneal administration intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered by any device in which the active substance may migrate to target cells. Preferred modes of administration and preparations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, injectable and the like.
  • Injections include non-aqueous solvents such as aqueous solvents such as physiological saline solution and ring gel solution, vegetable oils, higher fatty acid esters (e.g., oleic acid, etc.), and alcohols (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.).
  • aqueous solvents such as physiological saline solution and ring gel solution
  • vegetable oils e.g., oleic acid, etc.
  • alcohols e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, glycerin, etc.
  • Stabilizers e.g.
  • Preservatives eg, mercury nitrate, chimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc. may be included.
  • terapéuticaally effective amount used in combination with an active ingredient in the present invention means an amount of a pyrazoline derivative, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, effective for preventing or treating a subject disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include known anticancer agents in addition to pyrazoline derivatives, or pharmaceutically acceptable salts thereof, as an active ingredient, and may be used in combination with other known treatments for the treatment of these diseases.
  • Other therapies include, but are not limited to chemotherapy, radiation therapy, hormone therapy, bone marrow transplantation, stem-cell replacement therapy, other biological therapies, immunotherapy, and the like.
  • the present invention provides the use of a pyrazoline derivative compound of any one of claims 1 to 6, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for the manufacture of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer. .
  • the pyrazoline derivative compound represented by Formula 1 of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be usefully used for the prevention or treatment of cancer by inhibiting the activity of topoisomerase II, HER2 or both, and also HER2. It can be applied to the treatment of cancers resistant to Herceptin, which is a treatment for benign cancer.
  • FIG. 1 is a diagram showing the chemical structural formula of nine novel pyrazoline derivatives according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the recombinant topoisomerase I inhibitory activity of the pyrazoline derivative compound 5a-i according to the present invention. Final concentrations of 100 ⁇ M (A) and 20 ⁇ M (B) were used. Lane D: pBR322 DNA alone; Lane T: pBR322 DNA + topoisomerase I; Lane C: pBR322 DNA + topoisomerase I + chemtotesin; Lanes 5a-i: pBR322 DNA + topoisomerase I + pyrazoline derivative compound 5a-i.
  • FIG. 3 is a diagram showing the recombinant topoisomerase II inhibitory activity of the pyrazoline derivative compound 5a-i according to the present invention. Final concentrations of 100 ⁇ M (A) and 20 ⁇ M (B) were used. Lane D: pBR322 DNA alone; Lane T: pBR322 DNA + topoisomerase II; Lane E: pBR322 DNA + topoisomerase II ⁇ + etoposide; Lanes 5a-i: pBR322 DNA + topoisomerase II + pyrazoline derivative compound 5a-i.
  • FIGS. 4A to 4C are diagrams showing the results of molecular docking test of compound 5d among pyrazoline derivatives according to the present invention.
  • Compound 5d strongly bound to the ATP binding pocket in the ATPase domain of human topoisomerase II ⁇ .
  • Figure 4a shows an enlarged picture of compound 5d (R-5d: magenta, S-5d: cyan) bound to the active site of the ATPase domain of topoisomerase II ⁇ .
  • the transparent channel surface of the ATP binding pocket was observed and colored by electrostaticpotential (red: positive, purple: negative).
  • FIG. 4B is a diagram depicting an overlay of compounds 5d and AMP-PNPs (compound 5d: magenta, AMP-PNP: grey).
  • FIG. 4C shows an enlarged view of the ATP binding pocket of topoisomerase II ⁇ . Residues of topoisomerase IIa ATP-binding domain with van der Waals forces and adjacent R-compound 5d are shown as sticks. Sticks of the complex show color according to the atomic type (R-5d: magenta).
  • FIG. 5a to 5d show the results of evaluating the activity of compound 5d as an ATP-competitive topoisomerase II catalyst inhibitor among pyrazoline derivatives according to the present invention.
  • Figure 5a is a diagram showing the results of the ATPase test, topoisomerase II-based ATPase test was performed through the ATP dehydrogenase reaction. Free phosphate produced by the hydrolysis reaction of recombinant human topoisomerase II ⁇ was detected by incubation at room temperature for 30 minutes using malachite green phosphate test reagent. The amount of hydrolysis was analyzed by measuring the absorbance of the green complex.
  • the green complex was formed between malachite green and molybdate and free phosphate, and the absorbance of the formed green complex was 620 nm using an ELISA micro-plate reader. Measured at the wavelength.
  • Figure 5b is a diagram showing the results of the ATP competition test. Except for the ATP concentration, the same procedure as in the DNA topoisomerase II-based DNA relaxation test was performed. Final concentrations of ATP were used at 1 mM and 2 mM. Etoposide was used as a positive control.
  • 5C shows the quantitative result of FIG. 5B.
  • Figure 5d is a diagram showing the results of the incision complex test.
  • FIG. 6 is a diagram showing the activity of endogenous topoisomerase-based DNA relaxation of compound 5d among pyrazoline derivatives according to the present invention.
  • Nuclear lysates of HCT15 cells prepared after treatment with Compound 5d and etoposide for 24 hours were incubated with 100 ng of pBR322 plasmid at 37 ° C. for 30 minutes.
  • FIG. 7 is a diagram showing the inhibitory activity against ESX-Sur2 interaction of compound 5d (BTCP) among pyrazoline derivatives according to the present invention.
  • A shows the SEAP reporter gene test results.
  • the pyrazoline derivative compounds according to the present invention were treated with HEK293T cells for 12 hours, and the treatment simultaneously transfected (co-coated) an ESX expression plasmid fused with a GAL4 DNA-binding domain and a SEAP promoter reporter plasmid with five GAL4 sites. transfection).
  • Luminescence intensity through SEAP gene activation was inversely proportional to the inhibitory activity of ESX-Sur2 binding of the compounds according to the invention.
  • Bar graphs represent the percent inhibition of SEAP activity induced by each of the compounds according to the invention. The points in each data represent the average of the results from three replicates. Vertical error represents the standard deviation.
  • the results of the cytotoxicity test performed concurrently with the reporter gene test were graphed with black triangles (5 ⁇ M treatment) as cell viability. CI1033 (pan-HER inhibitor) and zefitinib (HER1 inhibitor) were used as controls.
  • (B) is a diagram showing the results of immunoprecipitation test. Lane IgG: test group without addition of compound 5d (BTCP) and with no anti-Sur2 antibody; Mock: HCT15 cells without addition of compound 5d (BTCP); BTCP: Compound 5d (BTCP) treated HCT15 cells. Only the test treated with 10 ⁇ M of compound 5d (BTCP) for 16 hours inhibited ESX immunoprecipitation by anti-Sur2 antibody.
  • FIG. 8A and 8b is a diagram showing the activity of HER2 gene transcription and HER2 reporter protein expression of compound 5d (BTCP) in the pyrazoline derivatives according to the present invention.
  • FIG. 8A shows the mRNA levels of HCT15 cells analyzed using quantitative RT-PCR after 16 hours of compound 5d (BTCP) treatment at various concentrations.
  • FIG. 8B is a result of Western blot analysis of protein levels of cell lysate treated with Compound 5d (BTCP) at various concentrations for 16 hours. All tests were performed in three replicates (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001 vs control).
  • FIG. 9 is a diagram showing the inhibitory activity of phosphorylation of HER1, HER2 and HER4, and HER2-based intracellular signal transduction of HCT15 cells of compound 5d (BTCP) among pyrazoline derivatives according to the present invention.
  • HCT15 cell lysate was analyzed by Western blot after compound 5d (BTCP) and zephytinib were treated for 16 hours. Analyzes the levels of HER1, p-HER1 (Y1068), p-HER2 (Y877, Y1248), HER4, p-HER4 (Y1284), MAPK, p-MAPK (T201 / T204), Akt and p-Akt (S473) ⁇ -actin was used as loading control.
  • FIGS. 10a to 10c are diagrams showing the activity of the compound 5d (BTCP) in the HCT15 cells of the pyrazoline derivatives according to the present invention for cell cycle and cell death induction.
  • Figure 10a is the result of analyzing the cell cycle distribution of HCT15 cells treated with compound 5d (BTCP) for 8 hours using FACS.
  • 10b and 10c show the results of Western blot analysis of HCT15 lysates treated with Compound 5d (BTCP) for 16 hours.
  • PARP, caspase-3, p27 kip1 , cyclin D1, cleaved PARP and cleaved caspase-3 were detected and ⁇ -actin was observed as a loading control.
  • Columns and error bars represent mean ⁇ standard deviation of three replicates (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001 vs control).
  • FIG. 11A to 11G are diagrams showing in vivo anticancer activity of compound 5d (BTCP) among pyrazoline derivatives according to the present invention.
  • FIG. 11A shows a single-cell suspension of HCT15 (5 ⁇ 10 6 cells) was injected into nude mice with a tumor volume of 500 mm 3 .
  • compound 5d BTCP, 25 mg / kg
  • FIG. 11B is a photograph showing tumors extracted from control and compound 5d (BTCP) -treated mice (pictured right).
  • Tumor weights in each group were expressed as mean ⁇ standard deviation.
  • 11C and 11D show the results of immunohistochemical analysis of tumor portions of control and Compound 5d (BTCP) -treated samples. Samples were stained with Ki-67, cleaved caspase-3, CD31, HER2, p-HER2, HER1, and p-HER1.
  • Figures 11e, 11f, and 11g show the results of the immune blots on the frozen homogenized half tumor samples of mice compared to the control.
  • FIG. 12 is a diagram showing the inhibitory activity of the compound 5d (BTCP) of the pyrazoline derivatives according to the present invention on the neuroregulatory 1 (NRG1) -based HER3 phosphorylation in HCT15 cells.
  • BTCP Compound 5d
  • NRG1 neuroregulatory 1
  • HCT15 cells were activated for 10 minutes using Neuregulin 1 and HCT15 cell lysates were analyzed via Western blot. Levels of HER3 and p-HER3 (Y1289) were detected and ⁇ -actin was observed as a loading control.
  • the bar graphs show the relative amounts of p-HER3 relative to the untreated control group and are expressed as mean ⁇ standard deviation of three replicates. * For the control p ⁇ 0.001 (basal) and p ⁇ 0.05 (neuregulin 1 (NRG1) -based) for the young control.
  • FIG. 13A is a diagram of trastuzumab-resistant HCT15 cells prepared by treatment of trastuzumab at 0.687 ⁇ M for 4 months, and the level of HER2 phosphorylation was analyzed by Western blot to confirm intracellular resistance formation.
  • FIG. 13A is a diagram of trastuzumab-resistant HCT15 cells prepared by treatment of trastuzumab at 0.687 ⁇ M for 4 months, and the level of HER2 phosphorylation was analyzed by Western blot to confirm intracellular resistance formation.
  • FIG. 13B is a diagram showing the results of the analysis of the activity of Compound 5d (BTCP), Gefitinib, and Trastuzumab in HCT15 / R cells, and the compounds having final concentrations of 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, and 25 ⁇ M were 72.
  • FIG. The IC 50 value after processing for a time is shown using the Table Curve 2D program.
  • FIG. 13C is a diagram showing Western blot results after treatment of HCT15 / R cells with 10 ⁇ M of Compound 5d (BTCP) and zefitinib.
  • FIG. Results of analysis of the effect of compound 5d (BTCP) on HER2 phosphorylation and HER2-based downstream signals including MAPK and Akt are shown.
  • TLC Thin membrane column chromatography
  • IR Infrared spectra
  • Nuclear magnetic resonance (NMR) spectra were measured using a 500 MHz Avance Bruker Ultra Shield TM spectrometer and recorded in parts per million (ppm) using tetramethylsilane as an internal standard. Chemical shifts in 1 H-NMR and 13 C-NMR ( ⁇ ) are reported in ppm. The 1 H-working frequency and the 13 C-working frequency were 500 MHz and 125 MHz, respectively. CDCl 3 and DMSO- d6 were used as internal standards, and signals were observed at 7.24 and 2.49 ppm in 1 H-NMR and 77 and 39.5 ppm in 13 C-NMR, respectively. Mating constant J (coupling constants J) is hertz; reported in (Hertz Hz).
  • Peaks are broad singnals (br), singlets (s), doublets (d), doublets of doublets (dd), doublets of doublets of doublets ( doublets of doublets of doublets (ddd), triplets (t) and multiplets (m), doublets of triplets (dt), triplets of doublets (td). .
  • Mass spectrometry spectra were performed in positive and / or negative mode using Agilent's HPLC 1200 with an ISI ionization source equipped with an Ion Trap mass spectrometer (Agilent 6320). Elemental Analysis was performed using a PerkinElmer 2400 CHN analyzer.
  • HEK293 human kidney embryonic cell line; ATCC CRL-1573
  • BT474 human HER2-positive breast cancer cell line; ATCC HTB-20
  • T47D human HER2 negative breast cancer cell line; ATCC HTB-133
  • NCI-N87 human HER2-positive gastric cancer cell line ATCC CRL-5822
  • SNU638 human HER2 negative gastric cancer cell line
  • HCT15 human HER2-positive rectal cancer cell line; ATCC CCL-225)
  • HCT116 human HER2 negative rectal cancer cell line; ATCC CCL-247
  • HEK293 was incubated in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Welgene, Korea), while BT474, T47D, NCI-N87, SNU638, HCT15 and HCT116 were maintained at 37 ° C. in humid 5% using RPMI 1640 medium (Welgene, Korea). Incubated in a CO 2 incubator. To each medium was added 10% fetal bovine serum (FBS; HyClone, USA) and 1% penicillin (Sigma, USA). All media was changed every 2-3 days and cells were passaged from 1: 5 to 1:10.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin Sigma, USA
  • Trastuzumab was used from Roche (Roche, Swiss). Trastuzumab-resistant HCT15 cell line (HCT15 / R) was prepared by continuous treatment of 100 ⁇ g / mL of trastuzumab for 4 months. Medium was changed every 2-3 days during the preparation of resistant cells.
  • HER2, p-HER2 (Y877), p-HER2 (Y1248), MAPK, p-MAPK (T202 / 204), Akt, p-Akt (S473), HER1, p-HER1 (Y1068), HER4, p-HER4 Antibodies of (Y1284), caspase-3, PARP, ⁇ -actin and Anti-IgG were purchased from Cell Signaling Technology Inc.
  • ETS transcription factor epithelial cell-specific ETS transcription factor
  • ESX epithelial cell-specific ETS transcription factor
  • Antibodies were purchased from Thermo scientific (Runcorn, UK) and were derived from the metazoan-specific subunits of human mediator complexes (Sur2). Antibodies were purchased from Santa Cruz Inc. (Dallas, USA). Adriamycin, etoposide, camptothecin and gefitinib were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). All compounds used in the present invention were dissolved in DMSO (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) to prepare 10 mM stock solvent and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • DMSO Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
  • acetophenone derivatives and aromatic aldehydes were reacted to synthesize chalcone derivatives in quantitative yield (90% or more).
  • the structure of the synthesized chalcone derivatives was determined by nuclear magnetic resonance analysis (NMR) and Interpreted via mass spectrometry (MS) data and compared with previously reported spectral data.
  • NMR nuclear magnetic resonance analysis
  • MS mass spectrometry
  • the ethanol solution in which the equivalent molar (substituted) -acetophenone and (substituted) -benzaldehyde mixture was dissolved was stirred for 2-3 hours in the presence of alcoholic sodium hydroxide (10%).
  • Furan -2- Carbohydrazide Furan -2- carbohydrazide ; 4a ]
  • IR (KBr, cm ⁇ 1 ): 3116, 3062, 2953, 1648, 1611, 1560, 1512, 1472, 1429, 1246, 1174, 1036 cm ⁇ 1 ;
  • IR (KBr, cm ⁇ 1 ): 3141, 3120, 3007, 2968, 2836, 1636, 1607, 1558, 1473, 1435, 1331, 1246, 1148, 1040, 1018 cm ⁇ 1 ;
  • Example 2 DNA Topoisomerase I and Topoisomerase II based in vitro Mitigation Test (DNA topo I and II mediated relaxation assay in vitro)
  • DNA topoisomerase I inhibitory activity of the compounds of the present invention was confirmed according to the method known in (Riou JF et al., Cancer Res. , 1993, 53, 5987-5993).
  • the analyte compound prepared in Example 1 was dissolved in DMSO to prepare a stock solvent having a concentration of 20 mM.
  • DNA topoisomerase I activity was analyzed by measuring the degree of relaxation of supercoiled DNA pBR322 (Fermentas, USA).
  • a mixture of 100 ng of pBR322 DNA and 1 unit of recombinant human DNA topoisomerase I (TopoGEN INC., USA) was added for 30 minutes with or without the compound prepared in Example 1 above. Incubated at 37 ° C.
  • the culture was performed in conditions containing relaxation buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.9), 150 mM sodium chloride, 0.1% bovine serum albumin, 1 mM spermidine, 5% glycerol.
  • the reaction was terminated by adding 2.5 ⁇ L of reaction stopper containing 5% sarcosyl, 0.0025% bromophenol blue and 25% glycerol to 10 ⁇ L of the final volume of the culture.
  • DNA samples were subjected to electrophoresis for 1 hour at 60 V using a running buffer of Tri-acetate-EDTA (TAE) on a 0.8% agarose gel.
  • TAE Tri-acetate-EDTA
  • DNA topoisomerase II inhibitory activity of the compound prepared in Example 1 was measured by the following method. Add or add a compound of 100 ng of ultra helical pBR322 plasmid DNA (Fermentas, USA) and 1 unit of human DNA topoisomerase II (Usb Corp., USA) to the compound prepared in Example 1 above. Incubated at 37 ° C. for 30 minutes under conditions without. The culture was carried out using an assay buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.9) containing 50 mM sodium chloride, 5 mM magnesium chloride, 1 mM EDTA, 1 mM ATP and 15 ⁇ g / mL bovine serum albumin. The reaction was terminated by adding 3 ⁇ L of EDTA (7 mM) to 10 ⁇ L of the final volume of the culture and the reaction product was used for DNA topoisomerase I based in vitro relaxation assay.
  • an assay buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.9 containing 50 m
  • DNA topoisomerase I and II inhibitory activities of the compounds prepared in Example 1 were measured by topoisomerase I and II relaxation tests, and camptothecin and eto known as inhibitors of topoisomerase I and II.
  • Foside was used as a positive control.
  • Inhibitory activity was assessed at a concentration of 100 ⁇ M in all compounds, and further experiments were performed at a concentration of 20 ⁇ M only for compounds with moderate to high activity.
  • Topoisomerase I (% inhibition) Topoisomerase II (% inhibition) density 100 ⁇ M 20 ⁇ M 100 ⁇ M 20 ⁇ M Camptothecin 73.6 24.6 - - Etoposide - - 95.9 41.1 5a 0.0 - 91.6 0.0 5b 0.0 - 92.6 2.9 5c 0.0 - 91.2 0.0 5d 0.0 - 89.7 0.0 5e 0.0 - 92.5 0.0 5f 0.0 - 92.8 0.0 5 g 0.0 - 94.1 0.0 5h 96.8 4.0 93.1 1.3 5i 0.0 - 76.0 0.0
  • HCT15 human rectal cancer cells
  • BT474 human breast cancer cell lines
  • T47D human HER2 negative breast cancer cell lines
  • CCK-8 (10 ⁇ L) was added to each well and incubated for additional 4 hours at 37 ° C., and then absorbance was measured at 450 nm using an ELISA Microplate Reader (VersaMax, Molecular Devices). To analyze IC 50 values, absorbance at 450 nm was applied to a four-parameter logistic equation. Adriamycin, etoposide and camptothecin were purchased from Sigma (USA) and used as positive controls.
  • Cytotoxicity was evaluated using Compound 5a-i prepared in Example 1, and the results of measuring cell proliferation inhibitory activity against human cancer cell lines are shown in Table 2 below as IC 50 values.
  • the compounds 5c, 5d, 5f and 5i showed strong cytotoxicity against BT474 cells, the IC 50 value in this case was 6.3-7.2 ⁇ M.
  • the IC 50 values of adriamycin, etoposide and camptothecin used as controls were 3.2, 6.6 and 7.0 ⁇ M, respectively.
  • the crystal structure of the ATPase domain of human topoisomerase II ⁇ complexed with AMP-PNP was retrieved from the Brookhaven Protein Data Bank (PDB entry 1ZXM). Water molecules and ligands were removed and hydrogen atoms were added using the software package Sybyl-X-2.0 (Tripos Associates Inc., St. Louis, Mo.). Of Compound 5a-i prepared in Example 1 Coordinates were prepared and energy minimized using a Tripos force field with a Gasteiger-Huckel charge. Receptor and ligand files were prepared according to known protocols. Docking was performed by simulation using Lamarckian Genetic Algorithm. A default search parameter was used except for the population size of 270,000 and 50 docking runs. Finally, the docking was analyzed by grouping the orientations located within 2.0 ms from the root-mean square deviation (rmsd) tolerance, which indicated the most appropriate docking mode.
  • rmsd root-mean square deviation
  • Example 2 From the results of Example 2, it was confirmed that the compound 5a-i prepared in Example 1 specifically inhibits topoisomerase II than topoisomerase I except compound 5h.
  • Topoisomerase occurs during DNA replication, transcription, recombination, recovery and chromatin assembly through DNA single strand cleavage by topoisomerase I and DNA double strand cleavage by topoisomerase II. Solve the DNA topology problem.
  • topoisomerase II is distinguished from topoisomerase I in that ATP binds to the ATPase domain. Accordingly, we first analyzed whether compounds 5a-i bind to the ATPase domain through molecular docking tests.
  • AMP-PNP adenosine 5 '-( ⁇ , ⁇ -imido) triphosphate tetralithium salt hydrate
  • the compound 5d was selected as a representative compound of the compound of the present application. Hereinafter, the compound 5d was analyzed to compete with ATP and to inhibit ATP hydrolysis to inhibit catalytic activity of topoisomerase II.
  • the ATP competition test was performed in the same manner as the DNA topoisomerase II inhibitory activity test except that the ATP concentrations were different. ATP concentrations were 1 mM and 2 mM. Etoposide was used as a positive control.
  • the DNA-dependent ATPase activity of human topoisomerase II ⁇ was analyzed according to known methods using a malachite green phosphate assay kit (Gentaur, Belgium).
  • 0.1 unit of human topoisomerase II ⁇ and 3.4 nM of ultra-helix pUC18 were prepared using 10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 175 mM potassium chloride, 0.1 mM EDTA, 5 mM magnesium chloride, 2 mM DTT and 2.5% glycerol.
  • the cells were incubated in the reaction buffer.
  • the culture was performed for 30 minutes at 37 °C in the condition of adding or without the compound prepared in Example 1 of 400 ⁇ M or novobiocin (novobiocin).
  • the reaction was initiated by the addition of 400 ⁇ M of ATP (Sigma, USA) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the volume of the reaction solution after ATP addition was 80 ⁇ L.
  • Example 6 DNA- Topoisomerase Cleavable Complex Test (DNA- topo IIa cleavable complex assay
  • Cleavable complex tests were performed according to existing reported methods. Briefly, after the pre-incubation for 10 minutes with 3 units of human DNA topoisomerase II ⁇ (USB, USA) using 125 ng of ultra-stranded DNA pBR322 (Fermentas, USA) as a substrate, the above example The compound prepared in 1 was added and the total volume of 10 ⁇ L of the reaction solution was further incubated at 37 ° C. for 20 minutes. 1 ⁇ L of 10% SDS was added to terminate the reaction, digested with protease K, and incubated at 45 ° C. for 30 minutes. After the loading buffer was added, it was heated at 70 ° C. for 2 minutes.
  • Electrophoresis was performed in TAE buffer using 0.8% agarose gel containing an aqueous solution of ethidium bromide (0.5 ⁇ g / mL), and the gel was decolorized with distilled water for 20 minutes. DNA bands were visualized by transmitting UV light and quantified using AlphaImager TM (Alpha Innotech Corporation).
  • Topo which compound 5d prepared in Example 1, stabilizes the DNA-topoisomerase II ⁇ cleavable complex, which is temporarily formed, thereby inhibiting the relegation of the temporarily cleaved DNA to accumulate linear DNA. It was evaluated whether it functions as an isomerase II ⁇ poison. In the cleavable complex test, compound 5d was first treated after relaxation of the pBR322 plasmid by addition of topoisomerase II ⁇ .
  • Example 7 endogenous Topoisomerase Inhibition test (Endogenous topo inhibition assay)
  • HCT cells were harvested after treatment with 50 and 100 ⁇ M of compound 5d for 24 hours.
  • Nuclear lysates of each cell line were prepared using a nuclear / cytosol fraction kit (BioVision, USA) according to the protocol provided by the manufacturer of the kit. Protein concentration in each nuclear extract was measured by Bradford test.
  • the topoisomerase reaction was performed with 100 ⁇ g of the protein in nuclear lysate, pBR322 plasmid as 100 ng of substrate and 1 ⁇ reaction buffer (200 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM magnesium chloride, 10 mM ATP, 10 mM EDTA, 10 mM dithiothreitol, 1.5 mM potassium chloride and 300 g / mL bovine serum albumin). The final reaction volume of each tube was incubated at 37 ° C. for 30 minutes. A similar reaction was performed using the pBR322 plasmid containing no lysate as a control to analyze the effect of the reaction buffer.
  • SEAP secreted alkaline phosphatase tests were performed according to the methods known in (Kim HL et al., Cancer Lett . 2012, 325, 72-79). SEAP mimics physiological HER2 expression through the interaction between the GAL4-ESX fusion protein and endogenous Sur2.
  • HEK293T human kidney cells were placed in 96-well microplates (SPL, Korea) at 5 ⁇ 10 3 per well. At cell density Inoculated and incubated overnight. After incubation, 100 ng of each plasmid and transfection optimization medium (TOM, Welgene, Korea) were used to temporarily transfect (co-transfection) simultaneously.
  • Simultaneously transfected plasmids were SEAP reporter gene (pG5IL2SX) and GAL4-ESX expression vector (pBJ GAL4-ESX).
  • Cells were transfected by incubating for 3 hours with WelFectQ (Welgene, Korea), and then treated with the compound prepared in Example 1 or the truncated Sur2 protein construct (pcDNA_Sur2 352-625 ) after incubation . Incubated for hours. After treating the compound in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C., the plate was sealed with a sealing film (Simport, Canada) and incubated at 65 ° C. for 3 hours to inactivate enzymes other than SEAP.
  • Compound 5d (BTCP) is an endogenous ESX-Sur2 interaction. Strongly inhibited, which was in agreement with the SEAP test results (FIG. 7B).
  • Example 9 HER2 Positive cells and HER2 Cell viability assay of compounds with diverse HER2 positive- and negative-cells
  • EZ-CYTOX was used to measure anti-proliferative activity in various HER2 positive or negative cell lines of the compound prepared in Example 1 above.
  • Cells were seeded in 96-well plates at a density of 1.0 ⁇ 10 4 per well. After 1 day of inoculation, the cells were incubated for 4 hours in FBS free medium, and then the culture medium of each well was replaced with a medium containing a graded concentration of compound and incubated at 37 ° C. for 48 hours. After incubation, 10 ⁇ L of EZ-CYTOX was added to each well. After further incubation at 37 ° C.
  • Compound 5d (BTCP) prepared in Example 1 induces cell growth inhibition in HER2-overexpressing cells.
  • Compound 5d (BTCP) strongly inhibited the cell growth (10.9 ⁇ 0.32 ⁇ M) of HER2-positive HCT15 cells by about 2 times stronger than HER2- negative HCT16 cells (22.5 ⁇ 0.89 ⁇ M) (Table 3).
  • Example 10 RNA extraction and RT- PCR RNA extraction and reverse transcription polymerase chain reaction (RT- PCR analysis)
  • cDNA was synthesized using the extracted RNA in the following manner: 4 ⁇ L 5X RT buffer, 2 ⁇ L 2.5 mM dNTP, 2 ⁇ L random primer (0.1 ⁇ g / ⁇ L), 0.5 ⁇ L RNase inhibitor (Promega Corp., USA), 0.25 ⁇ L of M-MLV reverse transcriptase (Promega Corp., USA) and 2.0 ⁇ g of extracted RNA were added and then synthesized at 25 ° C. for 5 minutes, then at 42 ° C. for 1 hour, and at 70 ° C. 15 It was further synthesized for a minute. CDNA synthesized as above was stored at -70 °C until use.
  • Each synthesized DNA was amplified by PCR, using the following PCR cocktail: 38.5 ⁇ L of distilled water, 5 ⁇ L of 10X reaction buffer, 3 ⁇ L of 10 mM dNTP, 0.5 ⁇ L of Taq DNA polymerase, 2 ⁇ L of The volume of the final reaction solution was made up to 50 ⁇ L by adding cDNA and 0.5 ⁇ L of each forward / reverse primer.
  • PCR performed initial denaturation at 94 ° C for 1 minute, and 28 cycles of 94 ° C and 1 minute denaturation cycles, followed by annealing at 55 ° C for 30 seconds and extension reaction at 70 ° C for 90 seconds, followed by 10 minutes at 70 ° C. Termination was performed by performing a reaction. PCR products were subjected to electrophoresis on 1.2% agarose gel to analyze the expression level of each gene.
  • HER2 primer forward 5'-GAGCACCCAAGTGTGCAC (SEQ ID NO: 1), reverse 5'-TTGGTTGTGAGCGATGAG (SEQ ID NO: 2)
  • GAPDH primers forward 5'-GAGCCAAACGGGTCATCA (SEQ ID NO: 3), reverse 5'-CATATTTCTCGTGGTTCACACC (SEQ ID NO: 4)
  • Compound 5d (BTCP) is HER2 mRNA level in HCT15 cells in a concentration-dependent manner. Significantly reduced (FIG. 8A).
  • immunoblotting analysis of HCT15 cells treated with Compound 5d (BTCP) resulted in a concentration-dependent decrease in HER2 protein levels (FIG. 8B). The results suggest that reduction of HER2 gene transcription rate by compound 5d (BTCP) induced down-regulation of HER2 reporter protein expression.
  • Example 11 Weston Blot (Western blot) and Immunoprecipitation (Immunoprecipitation)
  • HCT15 cells were inoculated in 60 mm dishes at a density of 5 x 10 5 cells per dish and incubated until 80% cell saturation.
  • Cells in FB free medium were treated with the compound prepared in Example 1 at the concentrations indicated in the figure legends. After treatment with the compound, cells were washed with cold PBS (pH 7.4) and harvested by centrifugation at 2000 rpm for 5 minutes. Cell pellets were suspended in lysis buffer, wherein the lysis buffer used was as follows:
  • HER2 ⁇ 50 mM Tris-Cl (pH 7,4), the buffer was 150 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, 1% Triton-X, 2 mM sodium orthovana, 1 mM NaF, 0.25% Deoxycholate, 100 ⁇ g / mL phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) and 1% protease inhibitor cocktail.
  • PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride
  • the buffer solution was 150 mM sodium chloride, 0.1% SDS, 0.5% sodium deoxycholate, 1% NP -40, 100 ⁇ g / mL phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) and 1% protease inhibitor cocktail.
  • PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride
  • Protein content was measured using a LAS-3000 film (Fuji photo film Co., Ltd., Japan) and analyzed by Multi-Guage software (Fuji Photo Film Co. Ltd., Japan).
  • cell lysates were prepared by the same procedure as Western blot except for pre-clearing. 500 ⁇ g of cell lysate was prepared in RIPA buffer, and 50 ⁇ L of normal IgG and 20 ⁇ L of protein A-agarose beads (Santa Cruz, CA) were added and stirred slowly at 4 ° C. for 15 minutes. After culturing while centrifuged at 12000 rpm for 10 minutes at 4 °C.
  • BTCP compound 5d
  • EGFR selective HER1
  • HER2 Y1248 is the major autophosphorylation site at HER2 in the Ras-MAP kinase signal transduction pathway
  • HER2 Y877 is included in the Ras-MAP kinase and PI3k / Akt signal transduction pathways.
  • the MAPK signal transduction pathway which plays an important role in the regulation of cell proliferation and cell death, is activated by phosphorylation of T202 / T204 residues through various extracellular stimulants, including mitogens, growth factors and cytokines. do.
  • Akt signal transduction pathways are involved in cellular processes such as cell survival and apoptosis and are activated through phosphorylation of S473.
  • the levels of HER2 downstream signal proteins such as phospho-MAPK and phospho-Akt were also significantly reduced by treatment with 25 ⁇ M of compound 5d (BTCP) and 10 ⁇ M of zephytinib.
  • BTCP compound 5d
  • zephytinib phosphorylation at HER1 Y1068 and HER4 Y1284 was reduced by treatment with Compounds 5d (BTCP) and zephytinib, while HER1 and HER4 expression was not affected (FIG. 9).
  • HER1 Y1068 has been reported as one of the phosphorylation sites and induces the binding of the SH2 domain of growth factor receptor-binding protein 2 to activate MAPK via the Ras-signal pathway.
  • HER4 forms a homodimer or heterodimer with HER2 through ligand neuregulin binding, leading to autophosphorylation and activation.
  • HER4 Y1284 is an autophosphorylation site of HER4.
  • Example 12 kinase inhibitory activity test ( Kinase inhibition assay)
  • Kinase inhibitory activity of the compounds prepared in Example 1 was evaluated using Millipore kinase profiling services for HER1, HER4, ICF1R, MAPK1 and MAPK2 kinases. The activity assessment was performed at final concentrations of 10 ⁇ M and 25 ⁇ M according to the Kinase Profiler Service Test Protocol. Scintillation values from each replicate were calculated as percent inhibition of kinase activity on the control.
  • Verification of phosphorylation of HER1, HER2, HER4, MAPK and Akt by compound 5d (BTCP) prepared in Example 1 was induced as a result of decreased HER2 expression or promoted by blocking kinase activity of HER family members
  • Compound 5d (BTCP) did not inhibit IGF1R, MAPK1 and MAPK2 kinases, but significantly inhibited HER1 and HER4 at a concentration of 25 ⁇ M (Table 4).
  • the results indicate that the activity of compound 5d (BTCP) not only inhibits HER1 and HER4 kinases but also inhibits ESX-Sur2 interaction to regulate HER2 downstream signal. Influences on dimer formation with HER2 itself or other HER family members, consequently reducing HER2 signal cascade.
  • HCT15 cells were seeded and cultured in 60 mm dishes at a density of 5 x 10 5 cells per dish. When the cells reached 80% confluence, the cells were treated with the compounds shown in the figure legends, washed with cooled PBS (pH 7.4) and centrifuged at 2000 rpm for 5 minutes. Cell pellets were fixed with 70% ethanol and stored at 4 ° C. for 1 day. Ethanol was removed by centrifugation at 3200 rpm for 2 minutes and the final cell pellet was resuspended in 1 mL PBS.
  • the PBS contains 10 ⁇ L of propidium iodide solution (5 mg / mL, Sigma, USA) and 10 ⁇ L of RNase (10 mg / mL, Sigma, USA).
  • the resuspended cell pellet was incubated at 37 ° C. for 30 minutes and analyzed using Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS; BD Biosciences, USA). At least 5000 cells were measured for each sample.
  • Topoisomerase is closely related to the cell cycle, and HER2 overexpression induces a decrease in the G1-phase and early S-phase of the cell cycle, leading to a mechanism of cell proliferation and cell growth. Improperly adjust The effect of compound 5d (BTCP) prepared in Example 1 on cell cycle regulation in HCT15 cells was investigated.
  • BTCP compound 5d
  • FIG. 10A The G1-phase arrest by Compound 5d (BTCP) is believed to be similar to the result of compound 5d (BTCP) inhibiting phosphorylation of MAPK (T201 / T204) and Akt (S473) (FIG. 9).
  • the transition from G1-phase to S-phase5 in the cell cycle is up-regulation of CDKs (Cyclin-dependent kinases), in particular cyclin D1 and E and downregulation of p27 kip1 , one of the CDK inhibitors. controlled by down-regulation.
  • CDKs Cyclin-dependent kinases
  • activation of Akt regulates the cell cycle through upregulation of cyclin D1 and downregulation of p27 kip1 .
  • Compound 5d prepared in Example 1 (BTCP) reduced phospho-MAPK and phospho-Akt and induced downregulation of cyclin D1 and upregulation of p27 kip1 (FIG. 10B).
  • Example 14 Tumor xenograft test of nude mouse (Tumor Xenografts in Nude Mice) and isolated tumors Weston Blot Western blot test
  • Single-cell suspensions (5 ⁇ 10 6 cells) of HCT15 exhibiting survival rates of 95% or higher were injected subcutaneously on the left side of 5 week old BALB / c-nu / nu nude mice (SLC Inc., Hamamatsu, Japan). Each mouse was injected with 100 ⁇ L to avoid leakage and injected in different parts at each injection. The volume of the tumor is 500 mm 3 When done, mice were randomly grouped and grouped into 3 animals in each group.
  • Example 2 The compound prepared in Example 1 was dissolved in 20% DMSO diluted in a saline solution, and the dissolved compound was subjected to intratumoral injection at intervals of 3 days for 15 days (final injection amount). 25 mg / kg). A group of mice injected with 20% DMSO diluted in saline solution was used as a control. All protocols included in the tumor xenograft trial were approved by the Animal Experimental Ethics Committee of the National Cancer Center. After treating the compound, tumor volume was calculated according to formula (L ⁇ l 2 ) / 2, and tumor length (L) and width ( l ) were measured by caliper.
  • the mouse was lethal and the tumor was weighed, and half of the tumor was frozen at -80 ° C for later use, and the other half was fixed at 10% NBF to fix the paraffin block portion for immunohistochemistry.
  • paraffin block section was prepared.
  • Antibodies of Ki67, caspase-3, CD31, HER2, p-HER2, HER1, and p-HER1 were incubated with automated immunohistochemical staining instruments (Ventana, Arlington, AZ).
  • IHC was rated as 0 (0% positive), 1 (1-25% positive), 2 (25-50% positive), 3 (51-75% positive), or 4 (76-100% positive) Immunochemical analysis was performed using Axiophot 2 apparatus (Carl Zeiss Micro Imaging Inc., Thornwood, NY).
  • Axiophot 2 apparatus Carl Zeiss Micro Imaging Inc., Thornwood, NY.
  • the other half frozen tumors were homogenized in ice cold lysis buffer, incubated on ice, stirred at 4 ° C. for 2 hours, and then centrifuged (4 ° C., 12,000 rpm, 20 Minutes).
  • Bradford protein assay was performed to determine protein concentration.
  • 20- ⁇ g sample protein was applied to the SDS-PAGE electrophoresis gel followed by Western blot analysis as the standard method.
  • BTCP compound 5d
  • Tumors treated with Compound 5d (BTCP) and control tumors were Ki-67, a cell proliferative marker, cleaved caspase-3, an apoptosis marker, and a tumor angiogenesis marker.
  • CD31 and HER2 signal related markers HER1, p-HER1, HER2, and p-HER2. Expression levels of Ki-67 and CD31 in the Compound 5d (BTCP) treated group were significantly lower than in the control group, and the expression of cleaved caspase-3 was increased compared to the control group (FIG. 11C).
  • Progression of the G1 phase in the cell cycle is affected by c-Jun, a weakening that results in increased expression of p53 and p21.
  • Activation of c-FOS induces the overexpression of cyclin D1 through heterodimer formation between c-Jun and c-Fos, creating an AP-1 complex that directly binds to the cyclin D1 promoter and mitigates cyclin D1 protein levels.
  • MAPK signaling also increases the activation of AP-1.
  • compound 5d (BTCP) of the present invention inhibits the signal cascade of HER1 / HER2 including the MAPK / ERK / GSK-3 ⁇ pathway, and consequently the systemic cyclin D1, CDK4, c- Inhibition of Jun, c-Fos, PCNA, Ki-67, COX-2, Bcl-2, XIAP, and survivin reduced tumor growth.
  • Compound 5d also reduced tumor angiogenic markers in xenograft mouse models of HCT15. Tumor growth and metastasis depend on angiogenesis, and rectal cancer is an angiogenesis dependent malignancy in particular. Meta-analysis of literature on Vascular endothelial growth factor and microvascular density in tumors in colorectal cancer includes CD31 (also called PECAM-1), hypoxia induced growth factor (HIF), COX-2, VEGF, and VEGFR2 was confirmed to be the most important angiogenesis regulator in CRC. Immunohistochemical staining analysis of tumor sites treated with Compound 5d (BTCP) showed a decrease in CD31 expression (FIG. 11C). In addition, Western blot analysis of changes in the markers of angiogenesis showed a marked decrease in phosphorylation of VEGF, HIF-1, COX-2, and VEGFR2 Tyr1175.
  • HER3 is known to be significantly involved in rectal cancer progression, and HER3 protein overexpression and increased HER3 phosphorylation have been observed in rectal cancer cells. Downregulation of HER3 reduced heregulin- ⁇ 1-based migration and invasion and also induced apoptosis in rectal cancer cells. HER3 overexpression was reported in 56% of the 16 rectal cancer patients tested (Beji A et al., Clin Cancer Res. , 2012, 18, 956-968). HER3 requires ligand binding to form a homodimer or a heterodimer with HER2. Homodimerization of HER3 inactivates the downstream signal cascade due to a defect in the kinase domain. In contrast, heterodimerization of HER3 and HER2 activates both the signal cascades of MAPK and Akt through tyrosine phosphorylation, and HER2-HER3 dimerization is considered a carcinogenic unit.
  • HER3 has been reported to act as a major activator of the Akt and MAPK downstream signaling pathways. It has also been reported that HER3 induces resistance of trastuzumab and phosphorylation of HER3 c-terminal tyrosine residues through dimerization with other HER family members in both HER2 low and overexpressing cancer cells (Choi BK et al., Cancer Med. , 2012, 1, 28-38).
  • the blockage of NRG1-promoted HER3 phosphorylation was stronger by treatment with 25 ⁇ M of compound 5d (BTCP) than with 10 ⁇ g / mL trazumab (FIG. 12).
  • the concentration of trastuzumab used in the present invention is in the therapeutic dosage range used for the patient.
  • administration of 2-8 mg / kg of trastuzumab may or may not be combined with chemotherapeutic agents such as paclitaxel, doxorubicin and / or 5-fluorouracil. Dosing is suitable for HER2-positive cancer patients.
  • Compound 5d (BTCP) is applicable to the treatment of HER2-positive rectal cancer patients who are resistant to trastuzumab.
  • trastuzumab-resistant cells were prepared.
  • Trastuzumab-resistant HCT15 cells were prepared by treatment with trastuzumab for 4 months at a concentration of 0.687 ⁇ M lower than the IC 50 concentration.
  • Trastuzumab resistance produced in HCT15 cells was confirmed by increased levels of phospho-HER2 at Y1248 (FIG. 13A).
  • IC 50 values for trastuzumab were 1.04 ⁇ 0.01 ⁇ M in HCT15 parental cells, 13.79 in cells treated for 2 months. ⁇ 0.14 ⁇ , 14.66 ⁇ 0.65 ⁇ in cells treated for 4 months. Based on IC 50 values and increased phosphorylation-HER2 (Y1248), full trastuzimab resistance in HCT15 cells was estimated to be obtained after 4 months of treatment.
  • trastuzumab-resistant HCT15 cells HCT15 / R
  • Compound 5d (BTCP) reduced phosphorylation of Y877 and Y1248 residues of HER2 at concentrations similar to zefitinib and downregulated p-MAPK and p-Akt in trastuzumab-resistant HCT15 cells (FIG. 13c).
  • Compound 5d (BTCP) also showed stronger activity in trastuzumab-resistant HCT15 cells than in non-resistant HCT15 parent cells (FIG. 13B).

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Abstract

본 발명은 신규한 피라졸린 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 상기 피라졸린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화학식 1로 표시되는 피라졸린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 토포이소머라제 II, HER2 또는 둘 다의 활성을 억제함으로써 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 HER2 양성 암의 치료제인 허셉틴(Herceptin)에 내성을 나타내는 암의 치료에 적용할 수 있다.

Description

신규한 피라졸린 유도체 및 이의 용도
본 발명은 신규한 피라졸린 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 상기 피라졸린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
전 세계적으로 암 발생률 및 사망률은 꾸준히 증가하는 추세에 있으며 국내에서도 사망 원인 1위를 차지하는 중대 질환으로 암을 정복하기 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 암에 대한 기존의 치료법으로는 수술, 화학 요법 및 방사선 치료 등이 있으며, 이 중에서 항암제를 이용한 화학요법은 현재 암 치료를 위해 폭넓게 사용되고 있으며, 비교적 잘 확립된 치료방법 중 하나이다. 그러나 대부분의 항암제는 특정 표적인자만을 선택적으로 억제하여 항암 활성을 나타내므로, 매우 복잡한 경로로 발전하는 암에 있어서 항암제의 장기 투여에 의하여 내성이 생기는 문제점이 있으며 특정 유전자의 돌연변이 상태에 따라 선택적인 치료효과를 나타내는 단점이 있다. 이러한 문제점을 극복할 수 있는 항암제 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이며, 항암제에 대한 내성을 극복할 수 있는 효과적인 항암제 개발의 중요성 또한 증가하고 있다.
암세포는 여러 종류의 펩타이드성 호르몬들을 생산하는데 이러한 호르몬들은 세포벽에 있는 수용체를 자극하여 세포의 정상적인 성장과 암 발생에 관여한다. 성장과 관련이 있는 인자 중 상피세포 성장인자(epidermal growth factor; EGF)가 대표적으로 알려져 있으며, 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)는 다양한 암종에서 발현되는 HER(human epidermal growth factor receptor) 패밀리 중의 하나이다. HER 패밀리는 EGFR, HER2, HER3 및 HER4로 구성되는, 암세포 증식과 관련된 인자들로, 이 중에 HER2는 유방암, 난소암, 폐암, 위암, 자궁암, 직장암, 췌장암, 방광암 등의 암환자에서 과다발현되어 있으며, 암의 발병, 진행 및 전이에도 관여하는 것으로 알려져 있다(Ellina MI et al., Biochem Biophys Acta., 2014, 1840, 2651-61).
한편, 토포이소머라제는 DNA의 과도한 감김(overwinding) 또는 덜 감김(underwinding)을 조절하는 효소로, 전사 및 복제 과정에 있어서 이중나선구조의 서로 얽히는 성질(interwinded nature)에 기인하는 위상적 장애(topological hurdle)를 해결하는 중요한 인자 중 하나이다. 암치료의 임상 적용에 있어서, 많은 약물이 토포이소머라제의 억제를 통해 효능을 나타내며 토포이소머라제를 표적하는 다양한 항암제를 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다.
이에 본 발명자들은 토포이소머라제 또는 HER2의 활성을 효과적으로 저해하여 암의 예방 또는 치료 효과를 제공할 수 있는 소분자 화합물을 개발하기 위해 예의 연구노력한 결과, 신규한 피라졸린 유도체 화합물이 토포이소머라제, HER2 또는 둘 다의 활성을 저해할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 피라졸린 유도체 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 산조건 하에서 칼콘 유도체와 하이드라지드 유도체를 반응시키는 단계를 포함하는 상기 피라졸린 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 피라졸린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 피라졸린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2016010363-appb-I000001
상기 식에서,
n은 1 또는 2이고;
X는 탄소, 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C6 알킬, C3-C8 사이클로알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알콕시, 아미노, 시아노 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R3은 C3-C12 헤테로아릴이고, 상기 R3은 니트로로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
상기 R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C6 알콕시 또는 니트로일 수 있다. 구체적으로, 상기 R1 및 R2는 동일하거나 상이할 수 있으며, 각각 독립적으로 수소, 클로로, 메톡시 또는 니트로일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 R1은 수소, 클로로 또는 메톡시일 수 있으며, 상기 R2는 수소, 클로로, 메톡시 또는 니트로일 수 있다.
또한, 상기 R3은 퓨릴, 피리디닐 또는 벤조티아졸릴일 수 있고, 상기 R3은 니트로로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물들로 이루어진 군에서 선택되는 화합물일 수 있다.
1) 퓨란-2-일(5-(4-메톡시페닐)-3-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Furan-2-yl(5-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone]
2) (3-(2-메톡시페닐)-5-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(5-니트로퓨란-2-일)메타논[(3-(2-Methoxyphenyl)-5-(4-nitrophenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(5-nitrofuran-2-yl)methanone]
3) 벤조[d]티아졸-2-일(5-(4-메톡시페닐)-3-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Benzo[d]thiazol-2-yl(5-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone]
4) 벤조[d]티아졸-2-일(3-(4-클로로페닐)-5-(4-메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Benzo[d]thiazol-2-yl(3-(4-chlorophenyl)-5-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone]
5) (5-(4-메톡시페닐)-3-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(피리딘-4-일)메타논[(5-(4-Methoxyphenyl)-3-phenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(pyridin-4-yl)methanone]
6) (3-(2-메톡시페닐)-5-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(피리딘-4-일)메타논[(3-(2-Methoxyphenyl)-5-(4-nitrophenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(pyridin-4-yl)methanone]
7) 퓨란-2-일(5-(퓨란-2-일)-3-(4-메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Furan-2-yl(5-(furan-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone]
8) (3-(4-클로로페닐)-5-(퓨란-2-일)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(퓨란-2-일)메타논[(3-(4-Chlorophenyl)-5-(furan-2-yl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(furan-2-yl)methanone]
9) (3-(4-클로로페닐)-5-(퓨란-2-일)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(피리딘-4-일)메타논[(3-(4-Chlorophenyl)-5-(furan-2-yl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(pyridin-4-yl)methanone]
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸린 유도체는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염과 같이, 당 업계에서 통상적으로 사용되는 염을 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기 또는 무기부가염을 의미한다.
산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
상기 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식 1의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당 업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 산조건 하에서 칼콘 유도체와 하이드라지드 유도체를 반응시키는 단계를 포함하는 화학식 1로 표시되는 피라졸린 유도체의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 칼콘 유도체와 하이드라지드 유도체의 반응은 산을 포함하는 알콜용매에 상기 반응물을 혼합하고 10 내지 24시간 동안 환류하여 수행할 수 있다. 상기 산으로는 빙초산을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 알콜용매로는 에탄올을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 반응은 하기 반응식 1로 표시될 수 있다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2016010363-appb-I000002
상기 칼콘 유도체 화합물은, 클라이젠-슈미트 반응(Claisen-Schmidt reaction)을 통해 아세토페논 유도체 및 방향족 알데히드를 염기를 포함하는 알콜용매 하에서 반응시켜 제조할 수 있다. 또한, 상기 하이드라지드 유도체 화합물은 상업적으로 구매하거나 방향족 카르복실산 모노 에스테르와 하이드라진 수화물(hydrazine hydrate)을 알콜용매 조건하에서 반응시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법은 여과, 건조, 세척, 정제하는 단계 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 상기 여과, 건조, 세척, 및 정제하는 단계는 당업계에서 공지된 방법을 제한 없이 이용하여 수행할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 조성물은 토포이소머라제 II, HER2(human epidermal growth factor receptor 2) 또는 둘 다의 활성을 저해하는 것이 특징이다.
본 발명에서 용어 "토포이소머라제"는 DNA의 과도한 감김(overwinding) 또는 덜 감김(underwinding)을 조절하는 효소로, 전사 및 복제 과정에 있어서 위상적 장애(topological hurdle)를 해결하는 중요한 인자 중 하나이다. DNA의 감김 문제는 이중나선구조의 서로 얽히는 성질(interwinded nature)에 기인한다. 예컨대, DNA 복제과정 동안 DNA는 복제포크(replication fork) 앞에서 과하게 감긴다. 이러한 과도한 감김이 저하되지 않고 남아있다면 이러한 장력은 결과적으로 DNA 복제를 중단시킨다. 이와 유사한 현상은 전사과정에서도 일어날 수 있다. 이와 같은 이중나선에 의해 야기되는 위상문제를 극복하기 위하여 토포이소머라제는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA에 결합하여 DNA의 인산골격을 절단한다. 이러한 중간절단(intermediate break)은 DNA를 풀어지도록 하여 과정의 마지막에서 DNA 골격은 다시 봉해진다.
토포이소머라제는 제1형과 제2형으로 구분된다. 토포이소머라제 I(Top I)은 단가닥 절단 및 초나선 염색체(supercoiled chromosome)의 DNA 이중나선(duplex)의 단일 가닥의 재결합을 유발하며, 토포이소머라아제 II(Top II)는 Mg (II) 와 ATP를 소모하여 DNA 두 가닥을 잘라 DNA 가닥이 받게 되는 긴장감에 의해 발생될 수 있는 DNA 손상을 완화 시키는 역할을 한다. 암치료의 임상 적용에 있어서, 많은 약물이 토포이소머라제의 억제를 통해 효능을 나타내며 토포이소머라제를 표적하는 다양한 항암제를 개발하기 위한 연구가 진행되고 있다. 토포이소머라제 저해제는 활성 모드에 따라 토포이소머라아제 독(poison)과 Top II 촉매억제제로 그룹화된다. 토포이소머라아제 독은 '절개가능 복합체(cleavable complex)'로 알려진 일시적으로 형성된 토포이소머라제-DNA 복합체를 안정화하는 화합물로, 절단된 DNA 가닥의 재결합을 억제하여 원하지 않는 잘라진 DNA 축적을 유도한다. 토포이소머라제 촉매억제제로서 토포이소머라제 I 기능에 작용하는 알려진 항암제로 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan) 및 캠토테신(camptothecin)이 있고, 독소루비신(doxorubicin) 및 에토포시드(etoposide)는 토포이소머라제 II를 표적으로 하는 항암제로 알려져 있으며, 이외에도 토포이소머라제 효소를 억제할 수 있는 화합물이 개발되고 있다.
본 발명에서 용어 "HER2" 유전자는 세포의 증식, 분열, 수복을 조절하며 티로신 키나아제 활성을 갖는 HER2 단백질을 생산한다. HER2 단백질은 세포막 상에서 수용체 기능을 하며 세포외 호르몬에 의해 활성화되면 세포의 증식과 분열을 촉진하는 역할을 한다. HER 패밀리는 4개의 수용체인 상피세포 성장인자 수용체(EGFR), HER2, HER3 및 HER4로 구성되며, 다른 수용체들과 이합체를 형성하여 도달된 신호를 증폭하여 전달하는 역할을 담당한다. 상기 HER 패밀리는 모두 암세포 증식과 관련되어 있으며, 특히 HER2는 유방암, 난소암, 폐암, 위암, 자궁암, 직장암, 체장암, 방광암 등의 암환자에서 과다발현되어 있고, 유전자 변이에 의해 HER2 수용체가 과잉 생산되어 암세포가 급격하게 증식하는 것으로 보고된 바 있다. 특히, 과발현된 HER2는 리간드와 결합하지 않은 상태에서도 동종 및 이종이합체를 형성하여 여러 암유전자의 전사를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. HER2 단백질의 과발현을 컨트롤하는 표적 치료제로 허셉틴(Herceptin), 티커브(Tykerb) 등이 알려져 있으나, 두 약물 모두 과발현된 HER2만을 타겟으로 하며, 내성을 유발함으로 인해 상기 약물에 의한 치료 예후가 좋지 않은 것으로 알려져 있다.
상기와 같이 암의 발병 또는 진행에 주요하게 관여하는 토포이소머라제 II 또는 HER2의 활성을 효과적으로 저해하는 본 발명의 화합물은 암의 예방 또는 치료효과를 제공할 수 있다. 또한, HER2 및 토포이소머라제 IIα 유전자는 염색체 상에서 인접하여 위치하고 있어, 다양한 암에서의 HER2 과발현은 토포이소머라제 IIα 증폭(amplification) 및 삭제(deletion)의 이상(abnormality) 현상과 직접적으로 연관된다. 따라서, 토포이소머라제 II 및 HER2를 동시에 타겟으로 하는 본 발명의 화합물은 보다 우수한 암의 예방 또는 치료효과를 가져올 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 치환기의 종류에 따라 정도의 차이는 있으나, 합성된 대부분의 피라졸린 유도체 화합물은 토포이소머라제 II 저해효과와 더불어 대표적인 암세포주인 HCT15(인간 HER2 양성 직장암 세포주), BT474(인간 HER2 양성 유방암 세포주) 및/또는 T47D(인간 HER2 음성 유방암 세포주)에 대한 세포독성을 나타냄을 확인하였다(실시예 2 및 3).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 피라졸린 유도체 화합물이 HER2 유전자 발현을 유도하는 ESX-Sur2 상호작용에 대한 높은 억제활성을 나타낼 뿐만 아니라 HER2 과발현 세포의 성장을 저해하는 효과도 우수함을 확인하였다(실시예 8 및 9). 특히, 화합물 4)의 경우, HER2 저해활성과 더불어 in vivo 시스템에서 항암활성을 나타냄을 확인하였다(실시예 10 내지 13).
본 발명의 용어 "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여로 암의 발생, 확산 및 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여로 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 유방암, 난소암, 폐암, 위암, 자궁암, 직장암, 췌장암 및 방광암 등을 포함한다. 특히, 본 발명의 약학적 조성물은 토포이소머라제 II, HER2 또는 둘 다로 인해 발병하는 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토즈, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제가 사용될 수 있다.
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 암의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 조성물에서 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 kg 당 1 내지 10 mg, 바람직하게는 1 내지 5 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피라졸린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란, 상기 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 피라졸린 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 양을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 피라졸린 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 이외에 공지된 항암제를 추가로 포함할 수 있고, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다. 다른 치료에는 화학요법, 방사선 치료, 호르몬 치료, 골수 이식, 줄기-세포 대체치료, 다른 생물학적 치료, 면역치료 등이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 피라졸린 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 토포이소머라제 II, HER2 또는 둘 다의 활성을 억제함으로써 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 HER2 양성 암의 치료제인 허셉틴(Herceptin)에 내성을 나타내는 암의 치료에 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 9종의 신규한 피라졸린 유도체의 화학구조식을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 화합물 5a-i의 재조합 토포이소머라제 I 저해 활성을 나타낸 도이다. 최종 농도 100 μM (A) 및 20 μM (B)로 사용하였다. 레인D: pBR322 DNA 단독; 레인T: pBR322 DNA + 토포이소머라제 I; 레인C: pBR322 DNA + 토포이소머라제 I + 켐토테신; 레인 5a-i: pBR322 DNA + 토포이소머라제 I + 피라졸린 유도체 화합물 5a-i.
도 3은 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 화합물 5a-i의 재조합 토포이소머라제 II 저해 활성을 나타낸 도이다. 최종 농도 100 μM (A) 및 20 μM (B)로 사용하였다. 레인D: pBR322 DNA 단독; 레인T: pBR322 DNA + 토포이소머라제 II; 레인E: pBR322 DNA + 토포이소머라제 IIα + 에토포시드; 레인 5a-i: pBR322 DNA + 토포이소머라제 II + 피라졸린 유도체 화합물 5a-i.
도 4a 내지 도 4c는 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 가운데 화합물 5d의 분자 도킹 시험 결과를 나타낸 도이다. 상기 화합물 5d는 인간 토포이소머라제 IIα의 ATPase 도메인 내의 ATP 결합 포켓에 강하게 결합하였다. 도 4a는 토포이소머라제 IIα의 ATPase 도메인의 활성부위에 결합한 화합물 5d(R-5d: 마젠타, S-5d: 시안)의 확대된 그림을 나타낸다. ATP 결합 포켓의 투명한 채널 표면이 관찰되었으며 정전기적 전위(electrostaticpotential)에 의해 색을 나타내었다(적색: 양성, 보라색: 음성). 도 4b는 화합물 5d 및 AMP-PNP의 오버레이된 그림을 나타낸 도이다(화합물 5d: 마젠타, AMP-PNP: 회색). 도 4c는 토포이소머라제 IIα의 ATP 결합 포켓의 확대 그림을 나타낸다. 반데르발스힘을 가진 토포이소머라제 IIα ATP-결합 도메인의 잔기 및 인접한 R-화합물 5d를 스틱으로 나타내었다. 복합체의 스틱은 원자 타입에 따른 색을 나타낸다(R-5d: 마젠타).
도 5a 내지 5d는 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 가운데 화합물 5d의 ATP-경쟁적 토포이소머라제 II 촉매 저해제로서의 활성을 평가한 결과를 나타낸 도이다. 도 5a는 ATPase 시험 결과를 나타낸 도이며, ATP 탈수소효소 반응을 통해 토포이소머라제 II-기반의 ATPase 시험을 수행하였다. 재조합 인간 토포이소머라제 IIα의 가수분해 반응에 의해 생성된 유리 포스페이트는 말라카이트 그린 포스페이트 시험 시약을 이용하여 실온에서 30분간 배양하여 검출하였다. 가수분해 반응량은 그린 복합체의 흡광도를 측정하여 분석하였으며, 상기 그린 복합체는 말라카이트 그린 및 몰리브데이트와 유리 포스페이트 사이에서 형성되며, 형성된 그린 복합체의 흡광도는 ELISA 마이크로-플레이트 리더를 이용하여 620 nm의 파장에서 측정하였다. 도 5b는 ATP 경쟁 시험 결과를 나타낸 도이다. ATP 농도 이외에는, DNA 토포이소머라제 II-기반의 DNA 완화 시험과 동일한 과정으로 수행하였다. ATP의 최종 농도는 1 mM 및 2 mM로 사용하였다. 에토포시드는 양성 대조군으로 사용하였다. 도 5c는 상기 도 5b의 정량적 결과를 나타낸다. 도 5d는 절개 복합체 시험 결과를 나타낸 도이다. 100 ng/μL의 초나선 DNA pBR322를 3 유닛(unit)의 재조합인간 DNA 토포이소머라제 IIα와 5분간 배양한 후 본 발명에 따른 화합물 5d를 첨가하였다. 반응 생성 혼합물은 에티듐 브로마이드 수용액(0.5 μg/mL)을 포함하는 0.8% 아가로스 겔을 이용하여 TAE 버퍼에서 전기영동을 수행하였으며, Alpha Tech Imager를 이용하여 가시화하였다. 선상의 DNA는 화살표로 나타내었다.
도 6은 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 가운데 화합물 5d의 내생의 토포이소머라제-기반의 DNA 완화에 있어서의 활성을 나타낸 도이다. 상기 화합물 5d 및 에토포시드를 24시간 동안 처리한 후 제조한 HCT15 세포의 핵 용해물(nuclear lysate)은 100 ng의 pBR322 플라스미드와 37℃에서 30분간 배양하였다.
도 7은 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 가운데 화합물 5d(BTCP)의 ESX-Sur2 상호작용에 대한 저해활성을 나타낸 도이다. (A)는 SEAP 리포터 유전자 시험 결과를 나타낸다. 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 화합물을 HEK293T 세포에 12시간 동안 처리하였으며, 상기 처리는 GAL4 DNA-결합 도메인과 융합된 ESX 발현 플라스미드 및 5개의 GAL4 부위를 보유한 SEAP 프로모터 리포터 플라스미드를 동시에 트랜스팩션(co-transfection)한 후에 수행하였다. SEAP 유전자 활성화를 통한 발광 강도는 본 발명에 따른 화합물의 ESX-Sur2 결합의 저해활성에 비례하여 역으로 나타났다. 막대 그래프는 본 발명에 따른 화합물 각각에 의해 유도된 SEAP 활성의 저해%를 나타낸다. 각 데이터의 점은 3회 반복실험으로부터 나타난 결과의 평균값을 나타낸다. 수직 오차(Vertical error)는 표준편차를 나타낸다. 리포터 유전자 시험과 동시에 수행한 세포독성 시험의 결과는 세포생존률로서 흑색 삼각형(5 μM 처리)으로 그래프화하였다. CI1033 (pan-HER 저해제) 및 제피티닙(HER1 저해제)은 대조군으로 사용하였다. (B)는 면역침강 시험 결과를 나타낸 도이다. 레인 IgG: 화합물 5d(BTCP)를 첨가하지 않고 항-Sur2 항체(anti-Sur2 antibody)를 첨가하지 않은 시험구; Mock: 화합물 5d(BTCP)를 첨가하지 않은 HCT15 세포; BTCP: 화합물 5d(BTCP) 처리 HCT15 세포. 10 μM의 화합물 5d(BTCP)를 16시간 동안 처리한 시험구만 항-Sur2 항체에 의한 ESX 면역침강이 저해되었다.
도 8a 및 8b는은 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 가운데 화합물 5d(BTCP)의 HER2 유전자 전사 및 HER2 리포터 단백질 발현에 대한 활성을 나타낸 도이다. 도 8a는 화합물 5d(BTCP)를 다양한 농도로 16시간 동안 처리한 후에 정량적 RT-PCR을 이용하여 분석한 HCT15 세포의 mRNA 레벨을 나타낸 결과이다. 도 8b는 화합물 5d(BTCP)를 다양한 농도로 16시간 동안 처리한 세포 용해물(cell lysate)의 단백질 레벨을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다. 모든 시험은 3회 반복시험으로 수행하였다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 vs 대조군).
도 9는 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 가운데 화합물 5d(BTCP)의 HCT15 세포에 있어서의 HER1, HER2 및 HER4, 및 HER2-기반의 세포내 시그널 전달의 인산화 과정에 대한 저해활성을 나타낸 도이다. 화합물 5d(BTCP) 및 제피티닙을 16시간 동안 처리한 후에 HCT15 세포 용해물(cell lysate)을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. HER1, p-HER1(Y1068), p-HER2(Y877, Y1248), HER4, p-HER4(Y1284), MAPK, p-MAPK (T201/T204), Akt 및 p-Akt(S473)의 레벨을 분석하였고 β-액틴을 로딩 대조군으로 이용하였다.
도 10a 내지 10c는 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 가운데 화합물 5d(BTCP)의 HCT15 세포에 있어서의 세포 주기 및 세포 사멸 유도에 대한 활성을 나타낸 도이다. 도 10a는 화합물 5d(BTCP)를 8시간 동안 처리한 HCT15 세포의 세포 주기 분포를 FACS를 이용하여 분석한 결과이다. 도 10b 및 10c는 화합물 5d(BTCP)를 16시간 동안 처리한 HCT15 세포용해물을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다. PARP, caspase-3, p27kip1, 사이클린(cyclin) D1, 절개된(cleaved) PARP 및 절개된 caspase-3가 검출되었으며, β-액틴을 로딩 대조군으로 관찰하였다. 컬럼 및 오차 막대는 3회 반복시험의 평균±표준편차를 나타낸다(* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 vs 대조군).
도 11a 내지 11g는 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 가운데 화합물 5d(BTCP)의 in vivo 항암활성을 나타낸 도이다. 도 11a는 HCT15의 단일-세포 현탁액(5×106 세포)을 누드 마우스에 주사하였으며, 종양의 부피가 500 mm3가 되었을 때, 마우스 당 50 μL의 화합물 5d(BTCP, 25 mg/kg)를 3일 간격으로 15일 동안 종양내 주입하였다(적색 화살표로 표시). 각 그룹당 3마리의 마우스를 사용하였다. 종양 부피(mm3)는 평균±표준편차로 나타내었다. 도 11b는 대조군 및 화합물 5d(BTCP)-처리 마우스로부터 적출한 종양을 나타낸 사진이다(오른쪽 사진). 각 그룹의 종양 무게는 평균±표준편차로 나타내었다. 도 11c 및 11d는 대조군 및 화합물 5d(BTCP)-처리 시료의 종양부분을 면역조직화학적 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 견본들은 Ki-67, cleaved caspase-3, CD31, HER2, p-HER2, HER1, 및 p-HER1을 이용하여 염색되었다. 도, 11e, 11f, 및 11g는 마우스의 동결 균질화된 절반의 종양샘플에 대한 면역 블롯의 결과를 대조군과 비교하여 나타내었다.
도 12는 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 가운데 화합물 5d(BTCP)의 HCT15 세포에 있어서의 뉴레귤린 1(NRG1)-기반의 HER3 인산화에 대한 저해활성을 나타낸 도이다. 화합물 5d(BTCP) 또는 트라스트주맵(허셉틴)을 16시간 동안 처리한 후, HCT15 세포는 뉴레귤린 1을 이용하여 10분간 활성화하였으며 HCT15 세포 용해물은 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다. HER3 및 p-HER3(Y1289)의 레벨을 검출하였으며 β-액틴을 로딩 대조군으로 관찰하였다. 막대 그래프는 화합물을 처리하지 않은 대조군에 대한 p-HER3의 상대적인 양을 나타낸 결과이며, 3회 반복시험의 평균±표준편차로 나타내었다. * 는 대조군에 대해 p < 0.001(basal)을, ＃은 대조군에 대해 p < 0.05(뉴레귤린 1(NRG1)-기반)를 나타낸다.
도 13a 내지 13c는 본 발명에 따른 피라졸린 유도체 가운데 화합물 5d(BTCP)의 트라스트주맵-내성 HCT15(HCT15/R) 세포에서의 활성을 나타낸 도이다. 도 13a는 0.687 μM의 트라스트주맵을 4달 동안 처리하여 제조한 트라스트주맵-내성 HCT15 세포에 대한 도이며, HER2 인산화의 레벨을 웨스턴 블롯으로 분석하여 세포내 내성 형성을 확인하였다. 도 13b는 HCT15/R 세포에서의 화합물 5d(BTCP), 제피티닙 및 트라스트주맵의 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이며, 최종농도 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10 및 25 μM의 화합물을 72시간 동안 처리한 후의 IC50 값을 테이블 곡선 2D 프로그램(Table Curve 2D program)을 이용하여 분석한 결과를 나타낸다. 도 13c는 10 μM의 화합물 5d(BTCP) 및 제피티닙을 HCT15/R 세포에 처리한 후의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다. HER2 인산화 및 MAPK 및 Akt를 포함한 HER2-기반의 하류 시그널에서의 화합물 5d(BTCP)의 영향을 분석한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
재료 및 기기
화합물 및 용매는 시약용 등급을 사용하였고, 추가 정제 없이 사용하였다. 화합물 4a, 4d, 4e 및 4f는 상업적으로 구입하여 사용하였다. 얇은 막 컬럼크로마토그래피(TLC) 분석은 유리판 TLC 실리카 플레이트(실리카겔 60 F254, 0.25 mm)로 수행하였으며 형광 지시약(Merck art. 1.05554)으로 확인하였다. 컬럼 크로마토그래피는 60-120 메쉬의 Merck사의 실리카겔로 수행하였다. 용융점은 Fisher ScientificTM사의 용융점 기기(모델번호 IA9100)로 측정하였다. 적외선 스펙트럼(IR)은 고체 및 액체 상태의 KBr 펠렛을 사용하여 Perkin Elmer사의 Spectrum BX FT-IR 분광계로 측정하였다. 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼은 500 MHz의 Avance Bruker Ultra ShieldTM 분광계를 이용하여 측정하였으며 테트라메틸실란(tetramethylsilane)을 내부 표준물질로 하여 ppm(parts per million) 단위로 기록하였다. 1H-NMR 및 13C-NMR (δ)에서의 화학적 이동은 ppm으로 기록하였다. 1H-작동 주파수(working frequency) 및 13C-작동 주파수는 각각 500 MHz 및 125 MHz이었다. CDCl3 및 DMSO-d6를 내부 표준물질로 사용하였으며, 1H-NMR에서는 7.24 및 2.49 ppm, 13C-NMR에서는 77 및 39.5 ppm에서 각각의 신호가 관측되었다. 짝지음 상수 J(coupling constants J)는 헤르츠(Hertz; Hz)로 기록하였다. 피크는 폭넓은 시그널(broad singnals; br), 싱글렛(singlet; s), 더블렛(doublet; d), 더블렛 오브 더블렛(doublets of doublets; dd), 더블렛 오브 더블렛 오브 더블렛(doublets of doublets of doublets; ddd), 트리플렛(triplets; t) 및 멀티플렛(multiplets; m), 더블렛 오브 트리플렛(doublets of triplets; dt), 트리플렛 오브 더블렛(triplets of doublets; td)으로 나타내었다. 질량분석 스펙트럼은 ESI 이온화 소스가 장착된 이온 트랩 질량분석기(Ion Trap mass spectrometer; Agilent 6320)가 연결된 Agilent사의 HPLC 1200을 이용하여 포지티브 및/또는 네거티브 모드에서 수행하였다. 원소 분석(Elemental Analysis)은 PerkinElmer 2400 CHN 분석기를 이용하여 수행하였다.
세포주, 세포배양 및 시약
HEK293(인간 신장 배아 세포주; ATCC CRL-1573), BT474(인간 HER2 양성 유방암 세포주; ATCC HTB-20), T47D(인간 HER2 음성 유방암 세포주; ATCC HTB-133), NCI-N87(인간 HER2 양성 위암 세포주; ATCC CRL-5822), SNU638(인간 HER2 음성 위암 세포주), HCT15(인간 HER2 양성 직장암 세포주; ATCC CCL-225) 및 HCT116(인간 HER2 음성 직장암 세포주; ATCC CCL-247)은 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였다. HEK293은 Dulbecco's modified Eagle's 배지(DMEM, Welgene, Korea)에서 배양하였고, BT474, T47D, NCI-N87, SNU638, HCT15 및 HCT116은 RPMI 1640 배지(Welgene, Korea)를 이용하여 37℃로 유지된 습한 5% CO2 인큐베이터 내에서 배양하였다. 상기 각각의 배지에는 10% 소태아혈청(FBS; HyClone, USA) 및 1% 페니실린(Sigma, USA)을 첨가하였다. 모든 배지는 2-3일마다 교환하였으며, 세포는 1:5로부터 1:10까지 계대배양하였다.
트라스투주맵(Trastuzumab)은 Roche(Roche, Swiss)로부터 제공받아 사용하였다. 트라스투주맵-내성 HCT15 세포주(HCT15/R)는 100 μg/mL의 트라스투주맵을 4개월 동안 연속적으로 처리하여 제조하였다. 내성 세포를 제조하는 과정 중에 배지는 2-3일마다 교체하였다. HER2, p-HER2(Y877), p-HER2(Y1248), MAPK, p-MAPK(T202/204), Akt, p-Akt(S473), HER1, p-HER1(Y1068), HER4, p-HER4(Y1284), caspase-3, PARP, β-actin 및 Anti-IgG의 항체는 Cell Signaling Technology Inc.(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다. 상피세포-특이적인 ETS 전사 인자(ESX)의 항체는 Thermo scientific(Runcorn, UK)에서 구입하였으며, 인간 매개자 복합체(human mediator complexes; Sur2)의 후생동물-특이적인 서브유닛(metazoan-specific subunit)의 항체는 Santa Cruz Inc.(Dallas, USA)에서 구입하였다. 아드리아마이신(adriamycin), 에토포시드(etoposide), 캠토테신(camptothecin) 및 제피티닙(gefitinib)은 시그마-알드리치(St. Louis, USA)에서 구입하였다. 본 발명에 사용된 모든 화합물은 DMSO(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)에 용해하여 10 mM의 스톡 용매를 제조한 후 사용시까지 -20℃에 보관하였다.
통계학적 분석
하기 실시예의 시험은 최소 3회 수행하였고 모든 데이터는 평균값±표준편차로 나타내었다. 통계는 GraphPad InStat version 3.1(GraphPad Software, USA)을 이용하여 스튜던트 t-검정(student t-test)으로 유의성을 측정하였으며, 두가지 값 사이의 차이는 p value가 <0.05일 경우에 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.
제조예 1 : 칼콘 유도체( Chalcone ; 3a-e)의 제조
Figure PCTKR2016010363-appb-I000003
클라이젠-슈미트(Claisen-Schmidt) 반응에 따라 아세토페논 유도체 및 방향족 알데히드를 반응시켜 정량적 수율(90% 이상)로 칼콘 유도체를 합성하였으며, 합성된 칼콘 유도체의 구조는 핵자기 공명 분석(NMR) 및 질량분석(MS) 데이터를 통해 해석하고 종래 보고된 스펙트럼 데이터와 비교하였다. 구체적으로, 당량몰의 (치환된)-아세토페논 및 (치환된)-벤즈알데히드 혼합물이 용해된 에탄올 용액을 알콜성 수산화나트륨(10%)의 존재하에서 2-3시간 동안 교반하였다. 교반한 혼합물을 냉각수에 첨가한 후 고체상의 침전물을 여과하고 오픈된 공기하에서 건조하여 정량적 수율의 칼콘 화합물(3a-d)을 수득하였다. 에탄올로 결정화하여 순수한 칼콘을 수득하였으며, 스펙트럼 데이터는 문헌상의 값과 일치하였다. 기록되어 있지 않은 화합물의 스펙트럼 데이터는 하기에 나타내었다.
(E)-3-(4- 메톡시페닐 )-1- 페닐프롭 -2-엔-1-온[(E)-3-(4- methoxyphenyl )-1-phenylprop-2-en-1-one; 3a ]
백색 고체(CAS no. 959-33-1, 98 %); 녹는점 = 61℃ [lit. mp. = 60-63℃];
ESI mass (m/z) 238.9 [M+H]+, 260.9 [M+Na]+ (calculated exact mass 238.1).
(E)-1-(2- 메톡시페닐 )-3-(4- 니트로페닐 ) 프롭 -2-엔-1-온[(E)-1-(2-methoxyphenyl)-3-(4-nitrophenyl)prop-2-en-1-one; 3b ]
황색 고체(96 %); 녹는점 = 71-72℃;
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.17 (d, J = 8.5 Hz 2H), 7.65 (d, J = 8.5 Hz 2H), 7.61-7.56 (overlapped, 2H), 7.48-7.42 (overlapped, 2H), 6.98 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H) ppm;
13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ 190.64, 157.45, 147.31, 140.52, 138.18, 132.71, 129.70, 129.63, 127.80, 127.52, 123.11, 119.95, 110.70 및 54.79 ppm
ESI mass (m/z) 284.0 [M+H]+, 305.9 [M+Na]+ (calculated exact mass 283.1)
(E)-1-(4- 클로로페닐 )-3-(4- 메톡시페닐 ) 프롭 -2-엔-1-온[(E)-1-(4-chlorophenyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-en-1-one; 3c ]
백색 고체(98 %); 녹는점 = 117-118℃ [lit. mp. = 117℃];
ESI mass (m/z) 273.1 [M+H]+, 294.9 [M+Na]+ (calculated exact mass 272.1)
(E)-1-(4- 클로로페닐 )-3-( 퓨란 -2-일) 프롭 -2-엔-1-온[(E)-1-(4-chlorophenyl)-3-(furan-2-yl)prop-2-en-1-one; 3d ]
백색 고체(CAS no. 114570-70-6, 95 %);
ESI mass (m/z) 232.9 [M+H]+, 254.8 [M+Na]+ (calculated exact mass 233.0)
(E)-1-(4- 메톡시페닐 )-3-( 퓨란 -2-일) 프롭 -2-엔-1-온[(E)-1-(4-methoxyphenyl)-3-(furan-2-yl)prop-2-en-1-one; 3e ]
*125백색 고체(98 %); 녹는점 = 68-69℃ [lit. mp. = 68℃];
ESI mass (m/z) 228.9 [M+H]+, 250.8 [M+Na]+ (calculated exact mass 228.0)
제조예 2 : 하이드라지드 유도체( Hydrazide ; 4a-d)의 제조
Figure PCTKR2016010363-appb-I000004
퓨란 -2- 카르보하이드라지드 [ Furan -2- carbohydrazide ; 4a ]
상업적으로 구입(CAS no. 3326-71-4); 녹는점 = 77-79℃;
ESI mass (m/z) 126.9 [M+H]+ (calculated for 129.1)
5- 니트로퓨란 -2- 카르보하이드라지드 [5- Nitrofuran -2- carbohydrazide ; 4b ]
하이드라진 수화물(11 mmol) 및 에틸 5-니트로퓨란-2-카르복실레이트(10 mmol; 4e)가 용해된 에탄올 용액(100 mL)을 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 실온에서 1시간 동안 추가로 교반하였다. 생성된 고체를 여과하고 에탄올로 세척한 후 흡인하여 건조하였다. 메탄올로 결정화하여 연한 황색 바늘형상의 5-니트로퓨란-2-카르보하이드라지드(4b)를 수득하였다(수율 73%).
녹는점 = 171-172℃ [lit. mp. = 171-172℃];
ESI mass (m/z) 171.8 [M+H]+ (calculated exact mass 171.0); CAS no. 5469-78-3.
벤조[ d ]티아졸 -2- 카르보하이드라지드 [ Benzo[ d ]thiazole -2- carbohydrazide ; 4c]
하이드라진 수화물(22 mmol) 및 에틸 벤조[d]티아졸-2-카르복실레이트(10 mmol; 4f)가 용해된 에탄올 용액(50 mL)을 1시간 동안 환류하였다. 생성된 고체를 여과하고 에탄올로 세척한 후 건조하였다. 에탄올로 결정화하여 연한 황색 결정의 벤조[d]티아졸-2-카르보하이드라지드(4c)를 90% 수율로 수득하였다.
녹는점 = 175-176℃ [lit. mp. 175-176℃];
ESI mass (m/z) 193.8 [M+H]+ (calculated exact mass 193.0); CAS no. 28891-34-1.
이소니코티노하이드라지드 [ Isonicotinohydrazide ; 4d ]
상업적으로 구입(CAS no. 54-85-3);
ESI mass (m/z) 137.9 [M+H]+ (calculated exact mass 137.0)
실시예 1 : 피라졸린 유도체( Pyrazoline ; 5a-i)의 제조
Figure PCTKR2016010363-appb-I000005
상기 제조예 1에서 제조한 칼콘 유도체(1 당량) 및 상기 제조예 2에서 제조한 하이드라지드 유도체(1.2 당량)의 혼합물을 에탄올에 용해한 후 촉매량의 빙초산(1-3 방울) 존재하에서 밤새도록 환류하였다. 과량의 용매를 증발시킨 후 반응 혼합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통과시켰으며, 에틸아세테이트 및 n-헥산을 이동상으로 사용하였다. 제조한 피라졸린 유도체 5a-i의 구조는 하기의 스펙트럼 데이터를 통해 분석하였다: KBr 펠렛 상의 IR 스펙트럼은 1510-1612 cm-1에서 C=N 신축진동(stretching), 1626-1704 cm-1 에서 아미드카르보닐기(N-C=O) 신축진동(stretching)의 흡수 밴드를 나타내었다. NMR 분석 결과, 피라졸린 유도체 5a-i의 특정 메틸렌 양성자(4-Hα 및 4-Hβ)가 나타났으며, 3.52-4.04 ppm에서 4-Hα, 및 3.13-3.50 ppm에서 4-Hβ에 해당하는 더블 더블렛 피크가 관찰되었고, 이때의 커플링 상수 'J'는 4-Hα에 대해 18.0 및 11.5 Hz이었으며, 4-Hβ에 대해 18.0 및 4.5 Hz이었다. 또 다른 특정 인접 메틴(vicinal methine)의 양성자 5-H는 5.68-5.92 ppm에서 더블 더블렛으로 관찰되었으며, 커플링 상수는 11.5 및 4.5 Hz이었다. 제조된 피라졸린 유도체는 질량 분석을 통해 분석하였으며, 포지티브 모드에서는 분자 질량에 양성자가 첨가된 [M+H]+ 및/또는 나트륨이 결합된 [M+Na]+ 값을, 네거티브 모드에서는 분자 질량에서 양성자가 제거된 [M-H]- 값으로 나타내었다. 또한, 제조한 피라졸린 유도체의 구조는 탄소, 수소 및 질소(CHN) 백분율로 측정되는 원자 분석(Elemental analysis)을 통해 추가로 확인하였다. 이외의 기록되지 않은 화합물의 스펙트럼 데이터를 하기에 나타내었다.
화합물 1 : 퓨란-2-일(5-(4-메톡시페닐)-3-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Furan-2-yl(5-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone; 5a ]
연한 갈색 고체(94 %); 녹는점 = 243-244℃;
IR (KBr, cm-1): 3116, 3062, 2953, 1648, 1611, 1560, 1512, 1472, 1429, 1246, 1174, 1036 cm-1;
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 7.23-7.16 (m, 2H), 7.59 (d, J = 2.5 Hz 1H), 7.53 (s, 1H), 7.39-7.37 (m, 3H), 7.14 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.76 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.48 (t, J = 1.5 Hz, 1H), 5.68 (dd, J = 11.5, 4.0 Hz, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.66 (overlapped, 1H), 3.13 (dd, J = 18.0, 4.0 Hz, 1H) ppm;
13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ 159.11, 155.86, 155.40, 146.37, 145.37, 133.67, 131.39, 130.56, 128.87, 127.13, 126.81, 118.94, 114.25, 111.52, 60.58, 55.30 및 41.26 ppm;
ESI mass (m/z) 347.1 [M+H]+ (calculated exact mass 346.1);
Anal. Calculated for C21H18N2O3: C, 72.82; H, 5.24; N, 8.09. Found: C, 72.03; H, 5.24; N, 7.87.
화합물 2 : (3-(2-메톡시페닐)-5-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(5-니트로퓨란-2-일)메타논[(3-(2-Methoxyphenyl)-5-(4-nitrophenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(5-nitrofuran-2-yl)methanone; 5b ]
황색 고체(92 %); 녹는점 = 140-141℃;
IR (KBr, cm-1): 3326, 3106, 3060, 2949, 1704, 1596, 1513, 1470, 1257, 1031 cm-1;
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 7.82 (s, 2H), 7.69 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.49 (m, 2H), 7.25 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.86 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.58 (s, 1H), 5.80 (dd, J = 11.5, 4.0 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.77 (overlapped, 1H), 3.24 (dd, J = 18.0, 4.0 Hz, 1H) ppm;
13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ 159.13, 155.86, 155.36, 146.39, 145.36, 133.68, 131.41, 130.55, 128.86, 127.14, 126.80, 118.91, 114.26, 111.50, 60.58, 55.30 및 41.25 ppm;
ESI mass (m/z) 434.5 [M-H]- (calculated exact mass 436.0);
Anal. Calculated for C21H16N4O7: C, 57.80; H, 3.70; N, 12.84. Found: C, 57.69; H, 3.77; N, 12.95.
화합물 3 : 벤조[d]티아졸-2-일(5-(4-메톡시페닐)-3-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Benzo[d]thiazol-2-yl(5-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone; 5c ]
미색(off-white) 고체(92%); 녹는점 = 199-200℃;
IR (KBr, cm-1): 3062, 2957, 1646, 1610, 1513, 1469, 1417, 1249, 1184, 1036 cm-1;
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ 8.29 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 8.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.96 (s, 2H), 7.63-7.56 (m, 5H), 7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.83-5.81 (m, 1H), 4.01 (dd, J = 18, 11.5 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 3.34 (overlapped, 1H) ppm;
13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz): δ 158.69, 157.46, 155.05, 151.41, 136.76, 133.19, 131.06, 130.54, 128.99, 127.35, 127.16, 127.15, 126.88, 124.43, 122.53, 114.14, 60.65, 55.10 및 41.57 ppm;
ESI mass (m/z) 414.0 [M+H]+,436.0 [M+Na]+(calculated exact mass 413.1);
Anal. Calculated for C24H19N3O2S: C, 69.71; H, 4.63; N, 10.16. Found: C, 68.81; H, 4.76; N, 10.21.
화합물 4 : 벤조[d]티아졸-2-일(3-(4-클로로페닐)-5-(4-메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Benzo[d]thiazol-2-yl(3-(4-chlorophenyl)-5-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone; 5d ]
백색 고체(94%); 녹는점 = 139-140℃;
IR (KBr, cm-1): 3012, 1918, 1648, 1593, 1515, 1430, 1400, 1333, 1252, 1178, 1031 cm-1;
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.74 (m, 2H), 7.80 (m, 2H), 7.62 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.39 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.88 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.75 (dd, J = 11.5, 4.0 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 3.76 (overlapped, 1H), 3.21 (dd, J = 18.0, 4.5 Hz, 1H) ppm;
13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ 171.12, 164.25, 159.32, 154.90, 149.70, 141.74, 136.76, 133.19, 130.00, 129.47, 128.09, 127.09, 123.65, 114.43, 60.92, 55.29 및 41.60 ppm;
ESI mass (m/z) 448.3 [M(35Cl)+H]+, 450.3 [M(37Cl)+H]+, 470.4 [M+Na]+ (calculated exact mass 447.08);
Anal. Calculated for C24H18ClN3O2S: C, 64.35; H, 4.05; N, 9.38. Found: C, 67.19; H, 4.82; N, 10.61.
화합물 5 : (5-(4-메톡시페닐)-3-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(피리딘-4-일)메타논[(5-(4-Methoxyphenyl)-3-phenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(pyridin-4-yl)methanone; 5e ]
백색 고체(93%); 녹는점 = 187-188℃;
IR (KBr, cm-1): 3028, 2947, 1641, 1593, 1516, 1454, 1439, 1339, 1244, 1182, 1034 cm-1;
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.76 (d,J = 3.0 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 3.46 (overlapped, 1H), 7.46 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.77 (dd, J = 16.5 Hz, 1H), 3.83 (overlapped, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.28 (dd, J = 18.0, 4.5 Hz, 1H) ppm;
13C NMR (CDCl3, 125 MHz): d164.17, 159.29, 156.04, 149.62, 141.90, 133.37, 130.94, 130.83, 128.88, 127.14, 126.87, 123.78, 114.42, 60.80, 55.31 및 41.68 ppm;
ESI mass (m/z) 458.0 [M+H]+, 480.0 [M+Na]+ (calculated exact mass 457.14);
Anal. Calculated for C22H19N3O2: C, 73.93; H, 5.36; N, 11.76. Found: C, 73.88; H, 5.06; N, 11.65.
화합물 6 : (3-(2-메톡시페닐)-5-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(피리딘-4-일)메타논[(3-(2-Methoxyphenyl)-5-(4-nitrophenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(pyridin-4-yl)methanone; 5f ]
백색 크림상의 고체(white creamy solid; 93%); 녹는점 = 156-157℃;
IR (KBr, cm-1): 3041, 2937, 1701, 1625, 1599, 1516, 1490, 1428, 1340, 1245, 1122, 1024 cm-1;
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.77 (dd, J = 4.5, 1.5 Hz, 2H), 8.24 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.89 (dd, J = 4.5, 1.5 Hz, 2H), 7.84 (dd, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 7.53 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.46 (td, J = 7.5, 1.5 Hz, 1H), 7.04 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 5.82 (dd, J = 11.5, 5.0 Hz, 1H), 4.04 (dd, J = 18.0, 12.0 Hz, 1H), 3.88 (s, 3H), 3.42 (dd, J = 18.0,5.0 Hz, 1H) ppm;
13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ 164.18, 158.47, 155.99, 149.68, 148.54, 147.50, 141.28, 132.47, 129.33, 126.86, 124.40, 123.80, 121.08, 119.37, 11.72, 60.79, 55.53 및 44.66 ppm;
ESI mass (m/z) 403.1 [M+H]+, 425.0 [M+Na]+(calculated exact mass 402.13);
Anal. Calculated for C22H18N4O4: C, 65.64; H, 4.51; N, 13.92. Found: C, 65.04; H, 4.48; N, 13.93.
화합물 7 : 퓨란-2-일(5-(퓨란-2-일)-3_(4-메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Furan-2-yl(5-(furan-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone; 5g ]
백색 고체(90 %); 녹는점 = 159-160℃;
IR (KBr, cm-1): 3141, 3120, 3007, 2968, 2836, 1636, 1607, 1558, 1473, 1435, 1331, 1246, 1148, 1040, 1018 cm-1;
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 7.77 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.65 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 7.30 (d, J = 15.5 Hz, 2H), 7.00 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 6.44 (s, 1H), 6.34 (s, 1H), 5.92 (dd, J = 11.0, 3.5 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.60 (dd, J = 17.5, 11.5 Hz, 1H), 3.50 (dd, J = 16.5, 3.5 Hz, 1H) ppm;
20813C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ 161.56, 155.78, 155.35, 151.66, 146.27, 145.34, 141.96, 128.45, 123.86, 118.98, 114.27, 111.51, 110.63, 108.15, 55.45, 54.33 및 37.19 ppm;
ESI mass (m/z) 337.0 [M+H]+,359.0 [M+Na]+ (calculated exact mass 336.1);
Anal. Calculated for C19H16N2O4: C, 67.85; H, 4.79; N, 8.33. Found: C, 67.62; H, 4.38; N, 8.21.
화합물 8 : (3-(4-클로로페닐)-5-(퓨란-2-일)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(퓨란-2-일)메타논[(3-(4-Chlorophenyl)-5-(furan-2-yl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(furan-2-yl)methanone; 5h ]
미색(off-white) 고체(96 %); 녹는점 = 186-187℃;
IR (KBr, cm-1): 33131, 3110, 2962, 1635, 1597, 1557, 1470, 1439, 1400, 1329, 1226, 1152, 1011 cm-1;
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 7.66 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 11.5 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.21 (s, 1H), 6.48 (s, 1H), 6.35 (s, 1H), 6.18 (s, 1H), 5.84 (dd, J = 17.5, 11.5 Hz, 1H), 3.52 (dd, J = 17.5, 11.5 Hz, 1H), 3.41 (dd, J = 17.5, 4.5 Hz, 1H) ppm;
13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ 155.91, 154.41, 151.29, 146.04, 145.57, 142.08, 136.60, 129.77, 129.15, 128.02, 119.13, 111.58, 110.69, 108.31, 54.60 및 36.99 ppm;
ESI mass (m/z) 341.1 [M+H]+,363.0 [M+Na]+(calculated exact mass 340.13);
Anal. Calculated for C18H13ClN2O3: C, 63.44; H, 3.85; N, 8.22. Found: C, 62.99; H, 4.39; N, 8.31.
화합물 9 : (3-(4-클로로페닐)-5-(퓨란-2-일)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(피리딘-4-일)메타논[(3-(4-Chlorophenyl)-5-(furan-2-yl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(pyridin-4-yl)methanone; 5i ]
연한 갈색 고체(96 %); 녹는점 = 156-157℃;
IR (KBr, cm-1): 3041, 2925, 1626, 1542, 1441, 1335, 1214, 1146, 1092, 1010 cm-1;
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ 8.76 (s, 2H), 8.04 (s, 2H), 7.55 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.35(d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.29 (s, 1H), 6.42 (s, 1H), 6.31 (s, 1H), 5.84 (dd, J = 17.5, 10.5 Hz, 1H), 3.60 (dd, J = 17.5, 11.5 Hz, 1H), 3.49 (dd, J = 17.5, 4.0 Hz, 1H) ppm;
13C NMR (CDCl3, 125 MHz): δ 157.16, 150.95, 145.05, 139.80, 137.37, 132.18, 124.05, 123.54, 122.93, 120.30, 105.56, 103.76, 49.58 및 32.43 ppm;
ESI mass (m/z) 352.0 [M (35Cl)+H]+, 354.0 [M (37Cl)+H]+(calculated exact mass 351.08);
Anal. Calculated for C19H14ClN3O2: C, 64.87; H, 4.01; N, 11.94. Found: C, 64.08; H, 4.17; N, 10.58.
실시예 2 : DNA 토포이소머라제 I 및 토포이소머라제 II 기반의 in vitro 완화 시험(DNA topo I and II mediated relaxation assay in vitro)
Cancer Res.에 공지된 방법에 따라 본 발명 화합물의 DNA 토포이소머라제 I 저해 활성을 확인하였다(Riou JF et al., Cancer Res., 1993, 53, 5987-5993). 상기 실시예 1에서 제조한 분석대상 화합물을 DMSO에 용해시켜 20 mM 농도의 스톡 용매를 제조하였다. DNA 토포이소머라제 I 활성은 초나선 DNA pBR322(supercoiled DNA pBR322; Fermentas, USA)의 완화(relaxation) 정도를 측정하여 분석하였다. 100 ng의 pBR322 DNA 및 1 유닛(unit)의 재조합된 인간 DNA 토포이소머라제 I(TopoGEN INC., USA)의 혼합물을 상기에서 실시예 1에서 제조한 화합물을 첨가하거나 첨가하지 않은 조건에서 30분간 37℃에서 배양하였다. 상기 배양은 완화 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 7.9), 150 mM 염화나트륨, 0.1% 소혈청알부민, 1 mM 스페르미딘(spermidine), 5% 글리세롤이 함유된 조건에서 수행하였다. 배양액의 최종 부피 10 μL에 대해 5% 사코실(sarcosyl), 0.0025% 브로모페놀 블루(bromophenol blue) 및 25% 글리세롤을 함유한 반응정지액 2.5 μL 를 첨가하여 반응을 종료하였다. 반응종료 후, DNA 시료는 0.8% 아가로스 겔 상에서 TAE(Tris-acetate-EDTA)의 러닝 버퍼를 이용하여 60 V에서 1시간 동안 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 종료된 후, 겔은 에티듐 브로마이드 수용액(0.5 μg/mL)에서 30분간 염색하였다. DNA 밴드는 UV 광선을 투과시켜 가시화하였으며, AlphaImagerTM(Alpha Innotech Corporation)를 이용하여 정량화하였다.
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 화합물의 DNA 토포이소머라제 II 억제 활성은 하기와 같은 방법으로 측정하였다. 100 ng의 초나선 pBR322 플라스미드 DNA(Fermentas, USA) 및 1 유닛(unit)의 인간 DNA 토포이소머라제 II(Usb Corp., USA)의 혼합물을 상기에서 실시예 1에서 제조한 화합물을 첨가하거나 첨가하지 않은 조건에서 30분간 37℃에서 배양하였다. 상기 배양은 50 mM 염화나트륨, 5 mM 염화마그네슘, 1 mM EDTA, 1 mM ATP 및 15 μg/mL 소혈청알부민을 함유한 분석 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 7.9)를 이용하여 수행하였다. 배양액의 최종 부피 10 μL에 대해 3 μL의 EDTA(7 mM)를 첨가하여 반응을 종료하고, 반응 생성물을 DNA 토포이소머라제 I 기반의 in vitro 완화 시험(relaxation assay)에 이용하였다.
토포이소머라제 I 및 II 완화 시험을 통해 상기 실시예 1에서 제조한 화합물의 DNA 토포이소머라제 I 및 II 억제 활성을 측정하였으며, 토포이소머라제 I 및 II의 저해제로 알려져 있는 캠토테신 및 에토포시드를 양성 대조군으로 사용하였다. 저해활성은 모든 화합물에서 100 μM의 농도로 평가하였으며, 중간이상의 높은 활성을 나타낸 화합물만 20 μM의 농도로 추가 실험을 수행하였다.
토포이소머라제 I의 저해활성 분석 결과, 화합물 5h 이외의 화합물들에서는 100 μM의 농도에서 토포이소머라제 I 저해 활성을 나타내지 않은 반면, 화합물 5h는 100 μM의 농도에서 97%의 매우 강한 토포이소머라제 I 저해 활성(캠토테신의 경우, 74%)을 나타내었으며, 20 μM의 농도에서 4%의 약한 토포이소머라제 I 저해 활성(캠토테신의 경우, 25%)을 나타내었다(도 2 및 표 1).
한편, 토포이소머라제 II 의 저해활성 분석 결과, 화합물 5a-i 모두 100 μM의 농도에서 90-94%의 높은 저해활성(에토포시드의 경우, 96%)을 나타내었으나, 20 μM의 농도에서는 불활성 또는 매우 약한 활성을 나타내었으며, 화합물 5b 및 5h의 경우에만 각각 3% 및 1%의 토포이소머라제 II 저해활성(에토포시드의 경우, 41%)을 나타내었다(도 3 및 표 1). 상기 결과로부터 화합물 5h는 토포이소머라제 I 및 II 에 이중으로 저해활성을 나타내고, 나머지 화합물은 토포이소머라제 II에 특이적인 저해활성을 보임을 확인하였다.
화합물 토포이소머라제 I(% 저해) 토포이소머라제 II(% 저해)
농도 100 μM 20 μM 100 μM 20 μM
캠토테신 73.6 24.6 - -
에토포시드 - - 95.9 41.1
5a 0.0 - 91.6 0.0
5b 0.0 - 92.6 2.9
5c 0.0 - 91.2 0.0
5d 0.0 - 89.7 0.0
5e 0.0 - 92.5 0.0
5f 0.0 - 92.8 0.0
5g 0.0 - 94.1 0.0
5h 96.8 4.0 93.1 1.3
5i 0.0 - 76.0 0.0
실시예 3 : 세포생존율 분석(Cell viability assay)
상기 실시예 1에서 제조한 화합물의 다양한 암 세포주에서의 항증식 활성(anti-proliferative activity)을 분석하기 위해, 세포 계수 키트(Cell Counting Kit; CCK-8, Dojindo Laboratories; Japan)를 이용하여 미토콘드리아 탈수소효소 활성을 측정하여 세포생존율을 분석하였다. HCT15(인간 직장암 세포), BT474(인간 유방암 세포주) 및 T47D(인간 HER2 음성 유방암 세포주)는 웰(well) 당 104 의 세포 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하였고 37에서 24시간 동안 배양한 후 72시간 동안 화합물을 처리하였다. CCK-8(10 μL)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 추가로 4시간 동안 배양한 후, ELISA Microplate Reader(VersaMax, Molecular Devices)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. IC50 값을 분석하기 위해, 450 nm에서의 흡광도를 4-변수 로지스틱 방정식(four-parameter logistic equation)에 적용하였다. 아드리아마이신, 에토포시드및 캠토테신을 시그마(USA)에서 구입하여 양성 대조군으로 사용하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5a-i를 이용하여 세포독성(cytotoxicity)을 평가하였으며, 인간 암세포주에 대한 세포 증식 저해 활성의 측정 결과를 IC50 값으로 하기 표 2에 나타내었다.
화합물 IC50 (μM)
HCT15 BT474 T47D
아드리아마이신 23.0±7.6 3.2±0.1 2.9±0.1
에토포시드 6.9±1.1 6.6±0.1 6.4±0.3
캠토테신 7.1±2.3 7.0±1.2 4.1±0.1
5a 3.9±0.3 >50 27.3±2.2
5b >50 >50 >50
5c 1.9±0.8 6.3±0.1 >50
5d 4.1±0.01 7.2±0.03 6.6±0.8
5e 10.4±1.1 >50 >50
5f 2.6±1.2 7.2±1.1 >50
5g 4.3±0.1 >50 7.5±1.1
5h >50 >50 >50
5i 3.1±0.2 6.5±0.1 7.9±0.8
대부분의 화합물은 HCT15 세포에 대해 강한 세포 독성을 나타내었으며, 이때 IC50 값은 1.9-10.4 μM이었다. 반면, 대조군으로 사용된 아드리아마이신, 에토포시드 및 캠토테신의 IC50 값은 각각 23.0, 6.9 및 7.1 μM이었다.
한편, 화합물 5c, 5d, 5f 및 5i의 경우, BT474 세포에 대해 강한 세포독성을 나타내었으며, 이 경우의 IC50 값은 6.3-7.2 μM로 나타났다. 반면, 대조군으로 사용된 아드리아마이신, 에토포시드 및 캠토테신의 IC50 값은 각각 3.2, 6.6 및 7.0 μM이었다.
인간 유방 상피조직 암세포주(T47D)의 경우에는 화합물 5a, 5d, 5g 및 5i에서 보통이상의 강한 세포독성이 관찰되었다.
실시예 4 : 분자 도킹 시험(Molecular docking study)
AMP-PNP와 복합체를 형성한 인간 토포이소머라제 IIα의 ATPase 도메인의 결정 구조는 Brookhaven 단백질 데이터 은행(PDB entry 1ZXM)에서 검색하였다. 소프트웨어 패키지 Sybyl-X-2.0(Tripos Associates Inc., St. Louis, MO)을 이용하여 물분자 및 리간드는 제거하고 수소 원자를 첨가하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5a-i의 코디네이트(coordinate)를 준비하고 Gasteiger-Huckel 전하를 적용한 트리포스 역장(Tripos force field)을 이용하여 에너지적으로 최소화하였다. 리셉터 및 리간드 파일은 기존의 알려진 프로토콜에 따라 준비하였다. 도킹은 Lamarckian Genetic Algorithm을 이용하여 시뮬레이션으로 수행하였다. 270,000 및 50 도킹 런(docking run)의 집단 크기(population size)를 제외하고는 기본 탐색 파라미터(default search parameter)가 사용되었다. 최종적으로, 도킹은 평균 제곱근 편차(root-mean square deviation; rmsd) 공차한계(tolerance)에서 2.0 Å내에 위치한 오리엔테이션(orientation)을 집단화하여 분석하였으며, 이를 통해 가장 적절한 도킹 모드를 나타내었다.
상기 실시예 2의 결과로부터, 상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5a-i는 화합물 5h를 제외하고는 토포이소머라제 I 보다는 토포이소머라제 II를 특이적으로 저해함을 확인하였다.
토포이소머라제는 토포이소머라제 I에 의한 DNA 단일 가닥 절단 및 토포이소머라제 II에 의한 DNA 이중 가닥 절단을 통해, DNA 복제, 전사, 재조합, 회복 및 염색질 조립(chromatin assembly) 과정 중에 발생하는 DNA 토폴로지 문제를 해결한다. DNA의 단일 가닥 절단 또는 이중 가닥 절단의 차이점 이외에, 토포이소머라제 II는 ATP가 ATPase 도메인에 결합하는 점에서 토포이소머라제 I와 구별된다. 이에 따라, 본 발명자들은 먼저 화합물 5a-i가 ATPase 도메인에 결합하는지를 분자 도킹 시험을 통해 분석하였다. 상기 분자 도킹 시험은 인간 토포이소머라제 II의 ATP-결합 도메인에 결합된 아데노신 5'-(β,γ-이미도) 트리포스페이트 테트라리튬염 수화물(AMP-PNP)의 결정체 구조로 종래에 보고된 코디네이트(PDB entry 1ZXM)를 이용하여 수행하였다. AMP-PNP는 토포이소머라제 II의 ATP-결합 포켓에 유사한 결합 친화력(binding affinity)를 가지는, ATP와 구조적으로 유사한 아날로그이나, 가수분해될 수 없으며 토포이소머라제 II와 결정화될 수 있다. AMP-PNP를 참고 리간드(reference ligand)로 사용하여 활성부위를 확인하였으며 re-docking을 통해 본 발명의 도킹 과정을 검증하였다.
분자 도킹 시험 결과, 상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5a-i는 5b>5f>5d의 순서로 ATP-결합 도메인에의 결합 활성을 나타내었다. 한편, 상기 실시예 1에서 제조한 화합물은 모두 피라졸린 환에 키랄 센터를 보유하고 있다. 이에, 모든 화합물의 R 및 S 이성질체를 제조하고 모든 이성질체에 대해 분자 도킹 시험을 수행하였다.
그 결과, 화합물 5d의 두 입체이성질체는 동일한 결합 부위에 결합하기 위해 플립(flip)되었다. 화합물 5d는 공간-채움 모드(space-filled mode)로 그려진 ATP-결합 부위에 잘 들어맞았으며(도 4a), AMP-PNP와 오버레이(overlay)되었다(도 4b). 화합물 5d는 Arg162 및 Gly164 잔기와 수소 결합을 형성하였으며, 토포이소머라제 II의 ATP-결합 포켓의 Asn91, Asn95, Asn120, Ile141, Phe142, Thr147, Ser148, Ser149, Arg162, Asn163, Gly164, Tyr165, Gly166, Ala167, Gln376 및 Lys378과 소수성 상호작용을 나타내었다(도 4c).
상기 화합물 5d를 본원 화합물의 대표적인 화합물로 선정하였으며, 이하에서는 상기 화합물 5d를 이용하여 ATP와 경쟁하는지 및 ATP 가수분해를 저해하여 토포이소머라제 II의 촉매 활성을 저해하는지에 대하여 분석하였다.
실시예 5 : ATP 경쟁 시험 및 ATPase 시험(ATP competition assay and ATPase assay)
ATP 경쟁 시험은 ATP 농도가 상이한 것을 제외하고는 DNA 토포이소머라제 II 저해활성 시험과 동일하게 수행하였다. ATP 농도는 1 mM 및 2 mM이었다. 에토포시드(etoposide)를 양성 대조군으로 사용하였다. 또한, 인간 토포이소머라제 IIα의 DNA-의존적인 ATPase 활성은 말라카이트 그린 포스페이트 실험 키트(malachite green phosphate assay kit; Gentaur, Belgium)를 이용하여 공지된 방법에 따라 분석하였다. 0.1 유닛(unit)의 인간 토포이소머라제 IIα 및 3.4 nM의 초나선 pUC18을 10 mM Tris-Cl(pH 7.5), 175 mM 염화칼륨, 0.1 mM EDTA, 5 mM 염화마그네슘, 2 mM DTT 및 2.5% 글리세롤이 함유된 반응 버퍼 내에서 배양하였다. 상기 배양은 400 μM의 상기 실시예 1에서 제조한 화합물 또는 노보비오신(novobiocin)을 첨가하거나 첨가하지 않은 조건에서 37℃에서 30분간 수행하였다. 반응은 400 μM의 ATP(Sigma, USA)를 첨가하여 개시하였으며 37℃에서 30분간 배양하였다. ATP 첨가 후의 반응 용액의 부피는 80 μL이었다. 말라카이트 그린 포스페이트 실험 키트의 시약 A 및 B의 혼합물(A:B = 100:1) 20 μL를 상기 반응 용액에 첨가하였다. 반응 용액의 흡수는 VERSAmax microplate reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 620 nm에서 측정하였다. OD 값은 말라카이트 그린 및 산성 몰리브데이트와 복합체를 형성한 무기 인산염의 양으로 계산하였다. 무기 인산염은 인간 토포이소머라제 IIα에 의해 진행된 ATP 가수분해에 의해 생성된 생성물이다. 블랭크(blank)의 OD 값는 0.1 미만이었으며, 이는 무기 인산염이 ATP 가수분해 이전에 존재하지 않을 경우에 나타나는 수치이다. ATP 가수분해의 저해 정도(%)는 화합물을 첨가하지 않은 대조군을 0% 저해로 설정하여 계산하였다.
*261ATPase 시험 결과, 상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5d는 경쟁적 토포이소머라제 II 촉매 저해제로 알려진 노보비오신(novobiocin)과 유사한 범위에서 농도의존적으로 토포이소머라제 II의 ATP 가수분해를 저해하였다(도 5a).
한편, ATP 경쟁 시험 결과, 화합물 5d는 ATP 농도-의존적인 형태로 토포이소머라제 II의 활성을 저해한 반면(도 5b 및 5c), 에토포시드는 ATP 농도 증가에 따라 활성이 변화하지 않았다(도 5c의 막대그래프). 상기 결과는 화합물 5d가 ATP-경쟁적인 저해제로서 작용하나, 에토포시드는 작용하지 않음을 나타낸다.
실시예 6 : DNA- 토포이소머라제 절개가능 복합체 시험(DNA- topo IIa cleavable complex assay)
절개가능 복합체 시험은 기존의 보고된 방법에 따라 수행하였다. 간략하게, 125 ng의 초나선 DNA pBR322(Fermentas, USA)를 기질로 사용하여 3 유닛(unit)의 인간 DNA 토포이소머라제 IIα(USB, USA)와 함께 10분간 전배양한 후, 상기 실시예 1에서 제조한 화합물을 첨가하여 총 부피 10 μL의 반응 용액을 추가로 20분간 37℃에서 배양하였다. 1 μL의 10% SDS를 첨가하여 반응을 종료하고, 단백질 분해효소 K로 절단한 후 45℃에서 30분간 배양하였다. 로딩 버퍼를 첨가한 후, 70℃에서 2분간 가열하였다. 전기영동은 에티듐 브로마이드 수용액(0.5 μg/mL)을 포함하는 0.8% 아가로스 겔을 이용하여 TAE 버퍼에서 수행하였으며, 겔은 증류수로 20분간 탈색하였다. DNA 밴드는 UV 광선을 투과시켜 가시화하였으며, AlphaImagerTM(Alpha Innotech Corporation)를 이용하여 정량화하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5d가 일시적으로 형성되는 DNA-토포이소머라제 IIα 절개 가능 복합체를 안정화시켜 일시적으로 절개된 DNA가 재연결(relegation)되는 것을 억제하여 선상의 DNA가 축적되도록 하는 토포이소머라제 IIα 독으로서의 기능을 수행하는지를 평가하였다. 상기 절개가능 복합체 시험에서는, 먼저 토포이소머라제 IIα의 첨가에 의해 pBR322 플라스미드의 완화가 일어난 후에 화합물 5d를 처리하였다.
그 결과, 기존에 알려진 토포이소머라제 IIα 저해제인 에토포시드와 달리, 화합물 5d를 300 μM 농도까지 처리한 경우, 선상의 DNA는 형성되지 않았으며, 이는 효소-DNA 절개가능 복합체가 안정화되지 않았음을 나타낸다(도 5d). 상기 결과로부터, 화합물 5d는 ATP-경쟁적인 촉매 저해제로서 작용함을 재확인하였다.
실시예 7 : 내생 토포이소머라제 저해 시험(Endogenous topo inhibition assay)
세포내 토포이소머라제 기능을 저해하는데 있어서의 상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5d의 활성을 평가하기 위해, HCT 세포에 50 및 100 μM의 화합물 5d를 24시간 동안 처리한 후 수확하였다. 각 세포주의 핵 용해물(nuclear lysate)은 핵/시토졸 분리 키트(nuclear/cytosol fraction kit; BioVision, USA)를 이용하여 상기 키트의 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 제조하였다. 각 핵 추출물에서의 단백질 농도는 Bradford 시험으로 측정하였다. 토포이소머라제 반응은 100 μg의 핵 용해물의 단백질, 100 ng의 기질로서의 pBR322 플라스미드 및 1×반응 버퍼(200 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM 염화마그네슘, 10 mM ATP, 10 mM EDTA, 10 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 1.5 mM 염화칼륨 및 300 g/mL 소혈청알부민)를 이용하여 수행하였다. 각 튜브의 최종 반응 부피를 동일하게 하여 37℃에서 30분간 배양하였다. 용해물을 포함하지 않는 pBR322 플라스미드를 대조군으로 이용하여 상기와 유사한 반응을 수행하여 반응 버퍼의 효과를 분석하였다. 배양 후, 정해진 양의 모든 시료를 에티듐 브로마이드를 포함하는 0.9% 수평식 아가로스 겔 전기영동 장치에 로딩하고 15-20 V로 4-5시간 동안 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, 가시화하고 AlphaImagerTM(Alpha Innotech Corporation)를 이용하여 정량화하였다.
세포 내생의 토포이소머라제-기반의 DNA 완화에 있어서의 화합물 5d의 효능을 확인하였으며, 화합물을 처리하지 않은 핵 추출물을 네거티브 대조군으로 사용하여 내생의 토포이소머라제가 초나선 pBR322 플라스미드를 완화시키는지 확인하였다(도 6의 2nd 라인). 그 결과, 화합물 5d는 세포 내생의 토포이소머라제-기반의 pBR322 플라스미드 완화작용을 저해하였으며, 에토포시드보다 높은 활성을 나타내었다. 구체적으로, 화합물 5d의 DNA 완화 저해율은 50 μM의 농도에서 78.0 ± 4.7%이었으며, 같은 농도의 에토포시드의 저해율은 36.0 ± 1.7%로 나타났다(도 6).
실시예 8 : 리포터 유전자 시험(Reporter gene assay)
Cancer Lett .에 공지된 방법에 따라 분비성 알칼라인 포스파타아제(Secreted alkaline phosphatase; SEAP) 시험을 수행하였다(Kim HL et al., Cancer Lett . 2012, 325, 72-79). SEAP는 GAL4-ESX 융합 단백질 및 내인성 Sur2 사이의 상호작용을 통한 생리학적 HER2 발현을 모방한다. HEK293T 인간 신장 세포를 96-웰 마이크로플레이트(SPL, Korea)에 웰당 5 x 103의 세포 밀도로 접종하고 밤새도록 배양하였다. 배양 후, 100 ng의 각 플라스미드 및 트랜스펙션(transfection) 최적화 배지(TOM, Welgene, Korea)를 이용하여 일시적으로 동시에 트랜스펙션(co-transfection)하였다. 동시에 트랜스펙션된 플라스미드는 SEAP 리포터 유전자(pG5IL2SX) 및 GAL4-ESX 발현벡터(pBJ GAL4-ESX)이었다. 세포는 WelFectQ (Welgene, Korea)로 3시간 동안 배양하여 트랜스펙션하였으며, 배양 후 상기 실시예 1에서 제조한 화합물 또는 절단된(truncated) Sur2 단백질 컨스트럭트(pcDNA_Sur2352-625)를 처리하고 12시간 동안 배양하였다. 상기 화합물을 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 처리한 후, 플레이트를 밀봉 필름(Simport, Canada)으로 밀봉하고 65℃에서 3시간 동안 배양하여 SEAP 이외의 효소들은 불활성화하였다. 25 μL의 불활성화된 배지 및 75 μL의 이중 증류수 혼합물을 100 μL의 기질 용액에 첨가하였다. 기질 용액은 1.19 μL의 0.1 M 4-methylumbelliferyl phosphate (4-MUP, Sigma, USA) 및 98.81 μL의 2 M 디에탄올아민(DEA, pH 10), Sigma, USA)으로 제조하였다. 상기 혼합 용액을 37℃에서 밤새도록 배양한 후, 형광계(SPECTRAmax GEMINIEM, Molecular Devices, USA)를 이용하여 여기 360 nm 및 방출 440 nm의 파장에서 형광 강도를 측정하였다. 시그널 감소가 세포 사멸에 의한 것이 아닌 ESX-Sur2 상호작용에 대한 화합물의 저해 활성에 의한 것인지를 확인하기 위해, 10 μL의 EZ-CYTOX(DaeilLabService, Korea)를 SEAP 시험에 사용된 분액(aliquot)을 제거한 후의 세포 배양액이 남아있는 각 웰에 첨가하였다. 상기 용액은 최소한 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 흡광도는 Automatic Elisa Reader System(Bio-Rad 3550, USA)을 이용하여 450 nm의 파장에서 측정하였다.
토포이소머라제 IIα를 선택적으로 저해하는 상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5a-i의 ESX-Sur2 상호작용의 저해활성을 분석한 결과, 상기 화합물은 ESX-Sur2 상호작용에 대해 강력한 저해활성을 나타내었다(도 7A).
상기 결과로부터, 본 발명의 화합물은 토포이소머라제 IIα 뿐만 아니라 ESX-Sur2 상호작용에 대해 저해활성을 나타냄을 확인하였다. 상기 화합물 중에서 화합물 5d(BTCP)를 토포이소머라제 IIα 및 ESX-Sur2 상호작용에 대해 저해활성을 나타내는 이중저해제(dual inhibitor)로 선정하여 별도의 시험에 이용하였다.
또한, 면역침강 시험(immunoprecipitation analysis)을 통해 HCT15 세포에 있어서의 내생 ESX 및 Sur2의 상호작용에 대한 화합물 5d(BTCP)의 저해활성을 분석한 결과, 화합물 5d(BTCP)는 내생 ESX-Sur2 상호작용을 강하게 저해하였으며, 이는 상기 SEAP 시험 결과와 일치하였다(도 7B).
실시예 9 : HER2 양성 세포 및 HER2 음성 세포에서의 세포생존율 시험(Cell viability assay of compounds with diverse HER2 positive- and negative-cells)
상기 실시예 1에서 제조한 화합물의 다양한 HER2 양성 또는 음성 세포주에서의 항증식 활성(anti-proliferative activity)을 측정하기 위해 EZ-CYTOX를 이용하였다. 세포는 웰당 1.0 x 104의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 접종 1일 후, 무-FBS 배지(FBS free medium)에서 4시간 동안 배양한 다음, 각 웰의 배양 배지는 등급별 농도의 화합물을 함유한 배지로 교체하고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 μL의 EZ-CYTOX를 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 동안 추가로 배양한 후, 각 웰의 흡광도는 ELISA Microplate Reader(VersaMax, Molecular Devices, USA)를 이용하여 450 nm의 파장에서 측정하였다. IC50 값을 분석하기 위해, Table Curve 2D program(SPSS Inc, USA)을 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 4-변수 로지스틱 방정식(four-parameter logistic equation)에 적용하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5d(BTCP)의 ESX-Sur2상호작용에 대한 저해활성이 HER2-과발현 세포에서의 세포 성장 저해를 유도하는지에 대하여 분석하였다. 그 결과, 화합물 5d(BTCP)는 HER2-양성 HCT15 세포의 세포성장(10.9 ± 0.32 μM) 을 HER2-음성 HCT16 세포(22.5 ± 0.89 μM) 에 비해 2배 정도 강하게 저해하였다(표 3).
화합물 5d(BTCP)의 IC50(μM)
HCT15 HCT16 BT474 T47D NCI-N87 SNU638
10.9±0.32 22.5±0.89 13.9±0.03 10.7±0.02 11.6±0.34 10.6±0.02
실시예 10 : RNA 추출 및 RT- PCR 분석(RNA extraction and reverse transcription polymerase chain reaction (RT- PCR ) analysis)
세포는 각 접시당 5 x 105 세포 밀도로 60 mm 접시에 접종하고 80%의 세포포화상태(confluence)가 될 때까지 배양하였다. 세포는 무-FBS 배지로 세척한 후, 도면 레전드에 나타낸 농도로 각각의 화합물을 16시간 동안 처리하고 PBS로 두번 세척하였다. 세척 후, 세포는 4℃에서 3분간 3200 rpm으로 원심분리하여 수확하였다. 총 RNA는 RNeasy Kit(Fuji Photo Film Co., LTD., Japan)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포로부터 추출하였다. cDNA는 추출한 RNA를 이용하여 다음의 방법으로 합성하였다: 4 μL의 5X RT buffer, 2 μL의 2.5 mM dNTP, 2 μL의 랜덤 프라이머(0.1 μg/μL), 0.5 μL의 RNase 저해제(Promega Corp., USA), 0.25 μL의 M-MLV 역전사효소(Promega Corp., USA) 및 2.0 μg의 추출한 RNA를 첨가한 후, 25℃에서 5분간 합성한 후, 42℃에서 1시간 동안 합성하고 70℃에서 15분간 추가로 합성하였다. 상기와 같이 합성된 cDNA는 사용시까지 -70℃에 보관하였다.
각각의 합성된 DNA는 PCR을 이용하여 증폭하였으며, 다음의 PCR cocktail을 이용하였다: 38.5 μL의 증류수, 5 μL의 10X 반응버퍼, 3 μL의 10 mM dNTP, 0.5 μL의 Taq DNA polymerase, 2 μL의 cDNA 및 0.5 μL의 각 정방향/역방향 프라이머를 첨가하여 최종 반응 용액의 부피를 50 μL로 제조하였다. PCR은 94℃에서 1분간 초기 변성을 수행하고 94℃, 1분간의 변성 사이클을 28 사이클 수행한 후 55℃에서 30초간 annealing하고 70℃에서 90초간 신장반응을 수행한 다음 70℃에서 10분간 최종 신장반응을 수행하여 종료하였다. PCR 산물은 1.2% 아가로스 겔 상에서 전기영동을 수행하여 각 유전자의 발현 레벨을 분석하였다.
HER2 프라이머 : 정방향 5'-GAGCACCCAAGTGTGCAC(서열목록 1), 역방향 5'-TTGGTTGTGAGCGATGAG(서열목록 2)
GAPDH 프라이머 : 정방향 5'-GAGCCAAACGGGTCATCA(서열목록 3), 역방향 5'-CATATTTCTCGTGGTTCACACC(서열목록 4)
상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5d(BTCP)의 ESX-Sur2상호작용에 대한 저해활성이 HER2 유전자 증폭에 영향을 주는지 분석한 결과, 화합물 5d(BTCP)는 농도의존적으로 HCT15 세포에서의 HER2 mRNA 레벨을 상당히 감소시켰다(도 8a). 또한, 화합물 5d(BTCP)(0.5, 2, 10 및 25 μM, 16시간)를 처리한 HCT15 세포의 면역블롯팅 시험(Immunoblotting analysis) 결과, HER2 단백질 레벨이 농도의존적으로 감소하였다(도 8b). 상기 결과는, 화합물 5d(BTCP)에 의한 HER2 유전자 전사 속도의 감소가 HER2 리포터 단백질 발현의 하향 조절(down-regulation)을 유도하였음을 시사한다.
실시예 11 : 웨스턴 블롯 (Western blot) 및 면역침강반응 (Immunoprecipitation)
HCT15 세포는 각 접시당 5 x 105 세포 밀도로 60 mm 접시에 접종하고 80%의 세포포화상태(confluence)가 될 때까지 배양하였다. 무-FBS 배지내의 세포에 도면 레전드에 나타낸 농도로 상기 실시예 1에서 제조한 화합물을 처리하였다. 상기 화합물을 처리한 후, 세포는 냉각된 PBS(pH 7.4)로 세척하고, 2000 rpm으로 5분간 원심분리하여 수확하였다. 세포 펠렛을 세포용해 버퍼(lysis buffer)에 현탁시켰으며, 이때 사용된 세포용해 버퍼는 다음과 같다:
i) HER2:　50 mM Tris-Cl(pH 7,4), 상기 버퍼는 150 mM 염화나트륨, 1 mM EDTA, 1% Triton-X, 2 mM 소디움 오르소바나(sodium orthovana), 1 mM NaF, 0.25% 데옥시콜레이트(deoxycholate), 100 μg/mL 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF) 및 1% 단백질 분해효소 저해제 칵테일을 포함한다.
ii) PARP, caspase-3, p27, cyclin D1: 50 mM Tris-HCl 용액(pH 8.0), 상기 버퍼 용액은 150 mM 염화나트륨, 0.1% SDS, 0.5% 소디움 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 1% NP-40, 100 μg/mL 페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF) 및 1% 단백질 분해효소 저해제 칵테일을 포함한다.
세포 용해물(cell lysate)은 4℃에서 20분간 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 총 단백질량은 BCATM Protein Assay Kit(Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하여, 화합물을 처리하지 않은 세포 용해물(대조군) 및 화합물을 처리한 세포 용해물을 모두 표준화(normalization)하였다. Eur J Pharm Sci .에 공지된 방법에 따라, 세포 용해물 시료를 12% SDS-PAGE 겔에 적용시킨 후에 임모빌론 멤브레인(Immobilon membrane; Millipore, USA)으로 이동시켰다(Nam JM et al., Eur J Pharm Sci ., 50, 181-190). 단백질을 이동시킨 후에 0.05% Tween 20이 포함된 PBS 용액(TBST)에 희석시킨 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 블락킹(blocking)한 후, TBST로 세척하였다. 세척 후, 1:1000의 비율로 1차 항체(primary antibody)를 첨가하고 5% 소혈청알부민이 포함된 TBST에서 4℃로 밤새도록 배양한 후 TBST로 세척하였다. 블롯(blot)은 1:2000 비율의 anti-rabbit IgG horseradish peroxidase가 부착된 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 반응시키고 향상된 화학발광계(enhanced chemiluminescence; PowerOpti-ECL, Animal Genetics Inc., Korea)를 이용하여 가시화하였다. 단백질 함량은 LAS-3000 film(Fuji photo film Co., Ltd., Japan)을 이용하여 측정하였으며 Multi-Guage 소프트웨어(Fuji Photo Film Co. Ltd., Japan)로 분석하였다. 면역침강반응(immunoprecipitation)을 위해, 세포 용해물은 pre-clearing을 제외하고는 웨스턴 블롯과 동일한 과정으로 준비하였다. 500 μg의 세포 용해물은 RIPA 버퍼로 준비하였으며, 50 μL의 normal IgG 및 20 μL의 단백질 A-아가로스 비드(protein A-agarose beads; Santa Cruz, CA)을 첨가하여 4℃에서 15분간 서서히 교반하면서 배양한 후 4℃에서 10분간 12000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액만을 모아서 4℃의 회전기(rotator) 상에서 밤새도록 배양하면서 anti-Sur2와 혼합하였다. 단백질 A-아가로스 비드를 첨가하고 1시간 동안 회전시킨 후 4℃에서 10분간 12000 rpm으로 원심분리하였다. 원심분리하여 생성된 세포 펠렛(cell pellet)을 수거하고 RIPA 버퍼로 두차례 세척하였다. 면역 복합체(immune complexes)는 30 μL의 2 x SDS 로딩 버퍼에 재현탁하고 93℃에서 5분간 가열한 후 SDS-PAGE 전기영동으로 분리하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5d(BTCP)에 의한 ESX-Sur2 상호작용의 저해가 HER2-기반의 하류 시그널 전달에 영향을 주는지 확인하기 위해 화합물 5d(BTCP) 및 선택적 HER1 (EGFR) 저해제로 알려진 제피티닙을 HCT15 세포에 처리하였다.
그 결과, 25 μM의 화합물 5d(BTCP)는 HER2 Y1248 및 HER2 Y877에서의 인산화를 강력하게 억제하였다(도 9). HER2 Y1248는 Ras-MAP 키나아제 시그널 전달 경로 중의 HER2에서의 주요 자동인산화 부위이며, HER2 Y877은 Ras-MAP 키나아제 및 PI3k/Akt 시그널 전달 경로에 포함된다. 세포 증식 및 세포 사멸의 조절에 있어서 중요한 역할을 수행하는 MAPK 시그널 전달 경로는 미토겐(mitogen), 성장 인자 및 사이토카인(cytokine)을 포함한 다양한 세포외 자극제를 통한 T202/T204 잔기의 인산화에 의해 활성화된다. Akt 시그널 전달 경로는 세포 생존 및 세포 사멸(apoptosis)과 같은 세포 과정에 포함되며 S473의 인산화를 통해 활성화된다. phospho-MAPK 및 phospho-Akt와 같은 HER2 하류 시그널 단백질의 레벨도 25 μM의 화합물 5d(BTCP) 및 10 μM의 제피티닙의 처리에 의해 상당히 감소하였다. 또한, HER1 Y1068 및 HER4 Y1284에서의 인산화는 화합물 5d(BTCP) 및 제피티닙의 처리에 의해 감소한 반면, HER1 및 HER4 발현은 영향을 받지 않았다(도 9). HER1 Y1068는 인산화 부위 중의 하나로 보고되었으며 성장인자 수용체-결합 단백질 2의 SH2 도메인의 결합을 유도하여 Ras-시그널 경로를 통해 MAPK를 활성화시킨다. HER4는 리간드뉴레귤린 결합(ligand neuregulin binding,)으로 HER2와 호모다이머 또는 헤테로다이머를 형성하여, 자동인산화반응 및 활성화를 유도한다. HER4 Y1284는 HER4의 자동인산화반응 부위이다.
실시예 12 : 키나아제 저해활성 시험( Kinase inhibition assay)
상기 실시예 1에서 제조한 화합물의 키나아제 저해 활성은 HER1, HER4, ICF1R, MAPK1 및 MAPK2 키나아제에 대한 밀리포어 키나아제 프로파일링 서비스를 이용하여 평가하였다. 상기 활성 평가는 키나아제 프로파일러 서비스 시험 프로토콜에 따라 최종 농도 10 μM 및 25 μM로 수행하였다. 각 반복시험으로부터의 값(scintillation value)은 대조군에 대한 키나아제 활성의 저해(%)로 계산하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5d(BTCP)에 의한 HER1, HER2, HER4, MAPK 및 Akt 의 인산화 감소가 HER2 발현 감소의 결과로 유도되었는지, 또는 HER 패밀리 멤버의 키나아제 활성을 블록킹하여 촉진된 것인지 검증하기 위해 키나아제 저해활성을 분석한 결과, 화합물 5d(BTCP)는 IGF1R, MAPK1 및 MAPK2 키나아제를 저해하지 않았으나, 25 μM의 농도에서 HER1 및 HER4를 상당히 저해하였다(표 4). 상기 결과는, 화합물 5d(BTCP)의 활성이 HER1 및 HER4 키나아제를 저해할 뿐만 아니라 ESX-Sur2 상호작용을 저해하여 HER2 하류시그널을 조절하고 있음을 나타낸다. HER2 자체 또는 다른 HER 패밀리 멤버와의 이량체 형성에 영향을 주어 결과적으로 HER2 시그널 캐스케이드(HER2 signal cascade)을 감소시킴을 시사한다.
키나아제 저해 %
10 μM 25 μM
HER1 58 98
HER4 18 33
IGF1R 0 0
MAPK1 0 21
MAPK2 0 0
실시예 13 : 세포 주기 분석(Cell cycle analysis)
HCT15 세포는 각 접시당 5 x 105 세포 밀도로 60 mm 접시에 접종하고 배양하였다. 세포가 80%의 세포포화상태(confluence)에 도달하였을 때, 세포에 도면 레전드에 나타낸 화합물을 처리한 후, 냉각된 PBS(pH 7.4)로 세척하고, 2000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 세포 펠렛(cell pellet)은 70% 에탄올로 고정하고 4℃에서 1일 동안 보관하였다. 3200 rpm으로 2분간 원심분리하여 에탄올을 제거하고 최종 세포 펠렛을 1 mL의 PBS에 재현탁하였다. 이때 상기 PBS는 10 μL의 propidium iodide solution(5 mg/mL, Sigma, USA) 및 10 μL의 RNase(10 mg/mL, Sigma, USA)를 함유한다. 상기 재현탁한 세포 펠렛은 37℃에서 30분간 배양한 후 형광활성 세포 분리 분석(Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS; BD Biosciences, USA)을 이용하여 분석하였다. 각 시료 당 최소 5000개의 세포가 측정되었다.
토포이소머라제는 세포주기와 밀접하게 관련되어 있으며, HER2 과발현은 세포주기의 G1-기(G1-phase) 및 초기 S-기(S-phase)의 감소를 유도하여 세포 증식 및 세포 성장의 메커니즘을 부적절하게 조절한다. 이에, HCT15 세포에서의 세포 주기 조절에 있어서의 상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5d(BTCP)의 영향을 조사하였다.
그 결과, 세포주기의 G1-기 부분은 화합물 5d(BTCP)의 농도의존적으로 증가하였다(도 10a). 화합물 5d(BTCP)에 의한 G1-기 정지(G1 arrest)는, 화합물 5d(BTCP)가 MAPK (T201/T204) 및 Akt (S473)의 인산화를 저해하는 결과(도 9)와 유사한 결과로 여겨진다.
세포 주기에서 G1-기로부터 S-기5로의 전환은 CDKs(사이클린(Cyclin)-의존적인 키나아제), 특히 사이클린 D1 및 E의 상향조절(up-regulation) 및 CDK 저해제 중의 하나인 p27kip1의 하향조절(down-regulation)에 의해 조절된다. 또한, Akt의 활성화는 사이클린 D1의 상향조절 및 p27kip1의 하향조절을 통해 세포 주기를 조절한다. 상기 실시예 1에서 제조한 화합물 5d(BTCP)는 phospho-MAPK 및 phospho-Akt를 감소시켰으며 사이클린 D1의 하향조절 및 p27kip1의 상향조절을 유도하였다(도 10b).
한편, 세포사멸 단백질에서의 화합물 5d(BTCP)의 영향을 분석한 결과, 세포사멸 단백질의 cleaved PARP 및 cleaved caspase-3 발현량은 화합물 5d(BTCP)의 처리에 의해 증가하였다(도 10c). 상기 결과는 화합물 5d(BTCP)가 HCT15 세포에 있어서 G1-기 정지(G1 arrest) 및 세포 사멸을 유도함을 나타낸다.
실시예 14 : 누드 마우스의 종양 이종이식 시험(Tumor Xenografts in Nude Mice) 및 적출한 종양의 웨스턴 블롯 (Western blot) 시험
95% 이상의 생존율을 나타내는 HCT15의 단일-세포 현탁액(5×106 세포)을 5주령 BALB/c-nu/nu 누드 마우스(SLC Inc., Hamamatsu, Japan)의 좌측에 피하 주사하였다. 각 마우스에 100 μL를 주사하여 누출(leakage) 현상을 피하고 주사시마다 상이한 부분에 주사하였다. 종양의 부피가 500 mm3가 되었을 때, 마우스를 랜덤으로 그룹화하여 각 그룹당 3마리로 그룹화하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 화합물을 염류 용액(saline solution)에 희석된 20% DMSO에 용해시키고, 상기 용해된 화합물을 15일 동안 3일 간격으로 종양내 주입(intratumoral injection)을 수행하였다(최종 주입량 25 mg/kg). 염류 용액(saline solution)에 희석된 20% DMSO를 주입한 마우스 그룹을 대조군으로 이용하였다. 종양 이종이식 시험에 포함된 모든 프로토콜은 국립암센터 연구소의 동물실험윤리위원회의 승인을 받았다. 화합물을 처리한 후, 종양 부피는 화학식 (L×l 2) /2에 따라 계산하였으며, 종양 길이(L) 및 넓이(l)는 캘리퍼(caliper)로 측정하였다. 측정 후 마우스는 치사시키고 종양의 무게를 측정하였으며, 종양의 절반은 추후 사용을 위하여 -80 °C 로 냉동시키고 나머지 절반은 10% NBF로 고정하여 면역조직화학(immunohistochemistry) 시험을 위한 파라핀 블록 부분(paraffin block section)을 제조하였다. Ki67, caspase-3, CD31, HER2, p-HER2, HER1, 및 p-HER1의 항체(Abcam, Cambridge, UK)는 자동화 면역조직화학 염색 기기(Ventana, Tucson, AZ)와 배양하였다. IHC는 0 (0% 양성), 1(1~25% 양성), 2(25 ~ 50% 양성), 3(51 ~ 75% 양성), 또는 4(76 ~ 100 % 양성)로 매겼으며, 모든 면역화학적 분석은 Axiophot 2 apparatus (Carl Zeiss MicroImaging Inc., Thornwood, NY)을 사용하여 수행하였다. 종양 조직의 면역블롯 분석을 위하여, 나머지 절반의 냉동 종양은 얼음 처럼 차가운 용해 버퍼에서 균질화하고, 얼음에서 배양하고, 2시간 동안 4℃를 유지하며 저은 후, 원심분리(4℃, 12,000 rpm, 20 분)하였다. 단백질 농도를 결정하기 위하여 Bradford 단백질 분석법을 수행하였다. 다음으로, 20-μg의 표본 단백질을 SDS-PAGE 전기영동 겔에 적용시킨 후 웨스턴 블럿 분석을 표준 방법으로 하였다.
상기 실시예를 통해 분석한 ESX-Sur2, HER1, HER2 및 토포이소머라제 II에 대한 화합물 5d(BTCP)의 저해작용이 in vivo 시스템에서 항암활성과 일치하는지 조사하였다.
그 결과, 화합물 5d(BTCP)를 처리한 종양의 부피 및 중량은 대조군에 비해 상당히 감소하였다(도 11A 및 도 11B). 화합물 5d(BTCP)가 처리된 종양 및 대조군의 종양을 세포 증식 마커(cell proliferative marker)인 Ki-67, 괴사의 마커(apoptosis marker)인 cleaved caspase-3, 종양혈관형성 마커(tumor angiogenesis marker)인 CD31, 그리고 HER2 신호 관련 마커인 HER1, p-HER1, HER2, 및 p-HER2로 염색하였다. 화합물 5d(BTCP) 처리 그룹에서의 Ki-67 및 CD31의 발현 레벨은 대조군에 비해 상당히 낮게 나타났으며, cleaved caspase-3의 발현은 대조군에 비해 증가하였다(도 11c). 게다가, 화합물 5d(BTCP)의 처리는 통계적으로 유의한 HER2의 하향조절을 보여주었다. 우리는 또한 HER2 인산화, HER1 발현, 및 HER1 인산화가 감소된 경향을 관측하였다(도 11d). 상기 결과는 화합물 5d(BTCP)의 암세포에서 나타난 항증식 활성과 일치하며, in vivo 시스템에서 항암활성을 나타낼 것이라는 추측을 입증한다.
상기 내용을 보다 구체적으로 확인하기 위하여 전술한 방법의 면역블롯을 수행하였다. HCT15 암세포에서와 동일한 경향이 잘라낸 종양 샘플에서도 관찰되었다: 첫째로, 화합물 5d(BTCP)가 명료하게 HER2 발현의 수준을 감소하지는 않았으나, HER1 및 HER2 인산화의 뚜렷한 감소가 관측되어, 결과적으로 MAKPK, ERK, PI3K, Akt, 및 GSK-3β와 같은, HER1 및 HER2의 시그널 캐스케이드 분자 하류의 하향 조절이 있었다(도 9 및 11e). 둘째로, 화합물 5d(BTCP)를 처리한 군에서 cyclin D1 및 CDK4의 하향조절과 p21(CDK의 억제제)의 상향조절 즉, G1 세포 주기 정지를 위해 요구되는 변화가 꾸준히 관찰되었다(도 10b 및 11f). Cyclin D1 및 CDK4는 중요한 역할을 하고, p21의 불활성화와 협력하여 증식하는 암세포에서 가장 먼저 활성화된다. 화합물 5d(BTCP)의 처리후에 HCT15 세포에서 보이듯 Cleaved caspase-3 및 cleaved PARP의 증가외에도, 괴사 단백질(예를들어 Bax 및 p53)의 도입이, 안티-괴사 마커 Bcl-2, XIAP(X-linked inhibitor of apoptosis protein), 및 survivin의 감소와 함께 관찰되었다. 증식의 마커인 PNCA, Ki-67, 및 COX-2는 화합물 5d(BTCP)를 처리한 종양 샘플에서 더욱 확실히 감소되었다(도 11f 및 11g). 화합물 5d의 항암제 활성은 명백히 G1 정지의 도입 및 HER2 과발현된 CRC 세포의 이종 이식 마우스 모델의 괴사에 의해 확인되었다. 화합물 5d(BTCP)에 의해 유도된 ERK 및 GSK-3β 인산화의 억제는 c-Jun 전사의 감소를 야기하였고 결과적으로 c-Jun 및 c-Jun의 하류 타겟인 cyclin D의 불활성화를 야기하였다. 세포 주기에서 G1 단계의 진행은 p53 및 p21의 증가된 발현을 야기시키는 약화인 c-Jun에 의하여 영향을 받는다. c-FOS의 활성화는 c-Jun 및 c-Fos 간에 헤테로다이머 형성하여, cyclin D1 프로모터 에 직접적으로 결합하고 cyclin D1 단백질 수준을 완화하는 AP-1 콤플렉스의 생성을 통해, cyclin D1의 과발현을 유도한다. MAPK 신호는 AP-1의 활성화 또한 높인다. 그러므로 본 발명의 실험 결과를 통해 본 발명의 화합물 5d(BTCP)가 MAPK/ERK/GSK-3β 패스웨이를 포함하는 HER1/HER2의 신호 캐스케이드를 억제하고, 결과적으로 전신적인 cyclin D1, CDK4, c-Jun, c-Fos, PCNA, Ki-67, COX-2, Bcl-2, XIAP, 및 survivin의 억제를 통하여 종양의 성장을 감소시킴을 확인하였다.
또한, 화합물 5d(BTCP)는 HCT15의 이종이식 마우스 모델에서 종양 혈관형성 마커를 감소시켰다. 종양 성장 및 전이는 혈관형성에 의존하고, 직장암은 특히 혈관형성 의존적인 악성종양이다. 혈관내피성장인자(Vascular endothelial growth factor) 및 대장암에서 종양 내 미세혈관 밀도에 대한 문헌의 메타 분석은 CD31(PECAM-1라고도 불림), 저산소증 유도 성장인자(HIF), COX-2, VEGF, 및 VEGFR2는 CRC에서 가장 중요한 혈관형성 조절인자임을 확인하여 주었다. 화합물 5d(BTCP)가 처리된 종양 부위의 면역화학적 염색 분석에서 CD31 발현의 감소가 나타났다(도 11c). 또한, 웨스턴 블롯 분석으로 혈관형성의 마커의 변화를 분석한 결과 VEGF, HIF-1, COX-2, 및 VEGFR2 Tyr1175의 인산화에서 뚜렷한 감소를 보임을 확인하였다.
HER3은 직장암 진행에 상당히 관련되어 있는 것으로 알려져 있으며, HER3 단백질 과발현 및 HER3 인산화 증가가 직장암 세포에서 관찰되었다. HER3의 하향조절은 heregulin-β1-기반의 이동(migration) 및 침윤(invasion)을 감소시켰으며, 또한 직장암 세포에서 세포사멸을 유도하였다. 테스트를 실시한 16명의 직장암 환자 중의 56%에서 HER3 과발현이 나타난 것으로 보고되었다(Beji A et al., Clin Cancer Res., 2012, 18, 956-968). HER3는 호모이합체(homodimer) 또는 HER2와의 헤테로이합체(heterodimer)를 형성하기 위해 리간드 결합이 필요하다. HER3의 호모이합체화(homo-dimerization)는 키나아제 도메인의 결함으로 인해 하류 시그널 캐스케이드(cascade)를 불활성화한다. 반면, HER3 및 HER2의 헤테로이합체화는 티로신 인산화를 통해 MAPK 및 Akt의 시그널 캐스케이드를 모두 활성화하며, HER2-HER3 이합체화는 발암성 유닛으로 여겨진다.
상기 실시예 8 및 실시예 11의 결과에서, 화합물 5d(BTCP)에 의해 유도된 MAPK 및Akt 시그널 저해는 ESX-Sur2 상호작용의 교란(perturbation)을 일으키고 HER1, HER2 및 HER4 키나아제 활성을 저해하였다(도 7D, 도 9 및 표 5). 이에 본 발명자들은 뉴레귤린 1(NRG1)-기반의 HER3 활성에 있어서의 화합물 5d(BTCP)의 영향을 조사하였다.
그 결과, HER2-HER3 이합체 형성을 유도하는 HER3 결합 리간드로 알려진 NRG1의 처리는 HER3 활성을 향상시킨 반면, 화합물 5d(BTCP)를 동시에 처리한 경우에는 HER3 인산화가 감소하였다(도 12).
트라스트주맵 내성 발생(trastuzumab resistance occurrence)의 여러 가지 메커니즘 중에서, HER3가 Akt 및 MAPK 하류 시그널 경로의 주요 활성제로 작용하는 것으로 보고되었다. 또한, HER3가 HER2 저발현 및 과발현 암세포 모두에서 다른 HER 패밀리 멤버와의 이합체화를 통해 트라스트주맵의 내성을 유도하고 HER3 c-말단 티로신 잔기의 인산화를 유도하는 것으로 보고되었다(Choi BK et al., Cancer Med., 2012, 1, 28-38).
NRG1-촉진 HER3 인산화의 차단(blockage)은 10 μg/mL의 트라스트주맵보다는 25 μM의 화합물 5d(BTCP)의 처리에 의해 더욱 강하게 나타났다(도 12). 상기 본 발명에서 사용된 트라스트주맵의 농도는 환자에게 사용하는 치료상 복용량 범위이다. 미국 종합 암네트워크(National Comprehensive Cancer Network; NCCN)의 가이드라인에 따르면, 2 내지 8 mg/kg의 트라스트주맵 투여는 파클리탁셀, 독소루비신 및/또는 5-플루오로우라실과 같은 화학치료제를 함께 사용하거나 사용하지 않는 HER2-양성 암환자에게 적합한 투약방법이다. 상기 결과는, 화합물 5d(BTCP)가 트라스트주맵에 내성을 나타내는 HER2-양성 직장암 환자 치료에 적용가능함을 시사한다.
트라스트주맵-내성 세포에서의 화합물 5d(BTCP)의 영향을 분석하기 위해, 트라스트주맵-내성 세포를 제조하였다. 트라스트주맵-내성 HCT15 세포는 IC50 농도보다 낮은 0.687 μM의 농도로 4개월 동안 트라스트주맵을 처리하여 제조하였다. HCT15 세포에 생성된 트라스트주맵 내성은 Y1248에서의 phospho-HER2의 레벨 증가로 확인하였고(도 13a), 트라스트주맵에 대한 IC50값은 HCT15 모세포에서 1.04 ± 0.01 μM로, 2달간 처리한 세포에서 13.79 ± 0.14 μM로, 4달간 처리한 세포에서 14.66 ± 0.65 μM 로 나타났다. IC50값 및 증가된 인산화-HER2(Y1248)에 근거하여, HCT15 세포에서 완전한 트라스트주맵 저항성은 4개월 처리후에 얻어지는 것으로 추정되었다.
한편, 다양한 농도(0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 25 μM)의 화합물 5d(BTCP), 제피티닙 또는 트라스트주맵을 72시간 동안 처리한 트라스트주맵-내성 HCT15세포(HCT15/R)의 생존율을 조사하였다. 그 결과, 화합물 5d(BTCP)는 제피티닙과 유사한 농도에서 HER2의 Y877 및 Y1248 잔기의 인산화를 감소시켰으며, 트라스트주맵-내성 HCT15 세포에서의 p-MAPK 및 p-Akt를 하향조절하였다(도 13c). 또한, 화합물 5d(BTCP)는 내성이 없는 HCT15 모(parent)세포에서 보다는 트라스트주맵-내성 HCT15 세포에서 보다 강한 활성을 나타내었다(도 13b).

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016010363-appb-I000006
    상기 식에서,
    n은 1 또는 2이고;
    X는 탄소, 산소, 질소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C6 알킬, C3-C8 사이클로알킬, C1-C6 할로알킬, C1-C6 알콕시, 아미노, 시아노 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R3은 C3-C12 헤테로아릴이고, 상기 R3은 니트로로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C6 알콕시 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 각각 독립적으로 수소, 클로로, 메톡시 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 R3은 퓨릴, 피리디닐 또는 벤조티아졸릴이고, 상기 R3은 니트로로 치환되거나 치환되지 않은 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 R1은 수소, 클로로 및 메톡시로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 R2는 수소, 클로로, 메톡시 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    상기 R3은 퓨릴, 피리디닐 또는 벤조티아졸릴이고, 상기 R3은 니트로로 치환되거나 치환되지 않은 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물들로 이루어진 군에서 선택되는 것인 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    1) 퓨란-2-일(5-(4-메톡시페닐)-3-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Furan-2-yl(5-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone]
    2) (3-(2-메톡시페닐)-5-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(5-니트로퓨란-2-일)메타논[(3-(2-Methoxyphenyl)-5-(4-nitrophenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(5-nitrofuran-2-yl)methanone]
    3) 벤조[d]티아졸-2-일(5-(4-메톡시페닐)-3-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Benzo[d]thiazol-2-yl(5-(4-methoxyphenyl)-3-phenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone]
    4) 벤조[d]티아졸-2-일(3-(4-클로로페닐)-5-(4-메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Benzo[d]thiazol-2-yl(3-(4-chlorophenyl)-5-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone]
    5) (5-(4-메톡시페닐)-3-페닐-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(피리딘-4-일)메타논[(5-(4-Methoxyphenyl)-3-phenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(pyridin-4-yl)methanone]
    6) (3-(2-메톡시페닐)-5-(4-니트로페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(피리딘-4-일)메타논[(3-(2-Methoxyphenyl)-5-(4-nitrophenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(pyridin-4-yl)methanone]
    7) 퓨란-2-일(5-(퓨란-2-일)-3-(4-메톡시페닐)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)메타논[Furan-2-yl(5-(furan-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)methanone]
    8) (3-(4-클로로페닐)-5-(퓨란-2-일)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(퓨란-2-일)메타논[(3-(4-Chlorophenyl)-5-(furan-2-yl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(furan-2-yl)methanone]
    9) (3-(4-클로로페닐)-5-(퓨란-2-일)-4,5-디하이드로-1H-피라졸-1-일)(피리딘-4-일)메타논[(3-(4-Chlorophenyl)-5-(furan-2-yl)-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-yl)(pyridin-4-yl)methanone]
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 토포이소머라제 II, HER2(human epidermal growth factor receptor 2) 또는 둘 다의 활성을 저해하는 것이 특징인 약학적 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 암은 유방암, 난소암, 폐암, 위암, 자궁암, 직장암, 췌장암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 특징인 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법.
  11. 암의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 피라졸린 유도체 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
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