WO2017010567A1 - ヒトｃｒｔｈ２に特異的に結合する抗体 - Google Patents

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宗稔 安藤
進也 小川
和樹 岡田
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-human CRTH2 antibody that specifically recognizes and binds to human CRTH2, the antibody fragment, DNA encoding the amino acid sequence of the antibody, a vector containing the DNA, a hybridoma that produces the antibody, and an antibody-producing cell , A method for producing the antibody, a composition containing the antibody or antibody fragment, an allergic disease using the antibody or antibody fragment, an autoimmune disease, a disease associated with eosinophilia or hyperfunction, an increase in Th2 cells, The present invention relates to a therapeutic method and a diagnostic method for diseases associated with hyperfunction, and a drug and a diagnostic agent containing the antibody or antibody fragment.
  • CRTH2 Human CRTH2 (Chemotractant receptor-homomologous molecular on Th2 cells) is a seven-transmembrane G protein-coupled receptor (G protein-coupled receptor, hereinafter known as GPR44, CD294, DP2, etc.) It is known to be one of the receptors for prostaglandin D2 (hereinafter referred to as PGD2) (Non-patent Document 1). CRTH2 was cloned as a human Th2-specific protein in 1996 and disclosed as B19 (Patent Document 1).
  • CRTH2 binds to PGD2 metabolites represented by ligands PGD2 and 13,14-dihydro-15-keto prostalandin D2 (hereinafter referred to as DKKGD2), and transmits a signal via G ⁇ i protein in the cell.
  • DKKGD2 13,14-dihydro-15-keto prostalandin D2
  • Non-patent Documents 1 and 2 Human CRTH2 is expressed in Th2 cells, eosinophils, basophils, and type 2 innate lymphocytes (hereinafter referred to as ILC2) (Non-patent Documents 1 and 2). CRTH2 has been reported to be a surface marker that is specifically expressed in Th2 cytokine-producing cells (Non-patent Document 3).
  • ILC2 is a novel cell population involved in allergic response identified in humans in 2011, and CRTH2 is mentioned as a specific surface marker that defines this cell (Non-patent Document 2). It has also been reported that CRTH2 is expressed in nonclassical monocyte and Th2 / Th17 cells (Non-patent Documents 4 and 5).
  • Non-patent Document 6 In allergic diseases such as asthma, CRTH2-expressing cells are known to contribute to the pathology. In cells in bronchoalveolar lavage fluid in asthmatic patients, it has been reported that CRTH2-positive T cells are observed more frequently than in healthy individuals (Non-patent Document 6). It has been reported that CRTH2-positive T cells increase in correlation with the degree (Non-patent Document 7).
  • Eosinophils contain a granular protein with cytotoxicity, and the deposition of the protein is observed in the airway tissue of patients with chronic bronchial asthma or the lesion site of patients with atopic dermatitis. It is considered to play an important role in the pathogenesis of allergic diseases such as asthma or atopic dermatitis (Non-Patent Documents 8 and 9).
  • Basophils accumulate inflammatory molecules such as histamine and leukotriene in the cell, and release these molecules by cross-linking of Fc ⁇ receptors and Fc ⁇ receptors expressed on the cell surface. (Non-Patent Document 10).
  • ILC2 is a locally present cell such as airway mucosa and skin, and produces a large amount of Th2 cytokine in response to cytokines such as interleukin (hereinafter referred to as IL) -25 and IL-33 produced by tissue damage. Therefore, it is considered to be involved in the pathogenesis of allergic diseases (Non-patent Document 11).
  • IL interleukin
  • 301108 (R & D) is commercially available as a monoclonal antibody against CRTH2.
  • BM16 is also known (Patent Document 2). These are rodent antibodies and have not been developed as pharmaceuticals.
  • the recombinant chimeric antibody and humanized antibody related to clone 19A2 remove CRTH2-expressing cells by effector activity
  • the humanized antibody related to clone 8B1 and mouse antibodies related to clones 3C12 and 31A5 have antagonist activity against CRTH2. It has been shown.
  • a plurality of human CRTH2 antibodies have been established so far, such as reactivity to various human immune cells, specific binding activity to human CRTH2, or influence on human CRTH2 ligand-dependent activity. Establishment of an anti-human CRTH2 antibody having activity has been desired.
  • An object of the present invention is to recognize an anti-human CRTH2 antibody having a desired activity by recognizing and binding to a characteristic epitope of human CRTH2, the antibody fragment, a DNA encoding the amino acid sequence of the antibody, and a vector containing the DNA , Hybridomas and antibody-producing cells that produce the antibodies, methods for producing the antibodies, compositions containing the antibodies or antibody fragments, allergic diseases, autoimmune diseases, eosinophilia and functions using the antibodies or antibody fragments It is to provide a therapeutic method and a diagnostic method for diseases associated with enhancement, diseases associated with increased Th2 cells and hyperfunction, and a medicine and diagnostic agent containing the antibody or antibody fragment.
  • the present invention relates to the following (1) to (26).
  • An antibody or antibody fragment that recognizes and binds to at least one of the 192nd glycine and the 194th aspartic acid of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2.
  • the antibody is the 12th proline, 13th isoleucine, 14th leucine, 15th glutamic acid, 177th aspartic acid, 178th glycine of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2; 179th arginine, 180th isoleucine, 181st methionine, 182nd cysteine, 183th tyrosine, 184th tyrosine, 185th asparagine, 186th valine, 187th leucine, 188th leucine, An antibody that recognizes and binds to at least one amino acid residue selected from the group consisting of 189th leucine, 195th arginine, 196th aspartic acid, 197th alanine, and 198th threonine (1 Or an antibody thereof Pieces.
  • Complementarity determining regions (hereinafter abbreviated as CDR) 1 to 3 of the antibody heavy chain variable region (hereinafter abbreviated as VH) each contain the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 20 to 22, and An antibody in which CDRs 1 to 3 of the antibody light chain variable region (hereinafter abbreviated as VL) each comprise an amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 23 to 25, (B) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 or the 18th leucine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 as methionine, the 77th asparagine as serine, the 93rd valine as threonine, and 117 A VH containing an amino acid sequence into which at least one modification selected from a modification replacing threonine with valine is introduced and the second
  • the antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (4), wherein the antibody is an antibody having at least one characteristic selected from the group consisting of the following (a) to (h).
  • A) the reactivity to human CRTH2 does not decrease in the presence of a ligand for human CRTH2,
  • B) has no neutralizing activity;
  • C) has antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity,
  • D) does not respond to at least one of mast cells and Th1 cells,
  • E It reacts with at least one cell selected from eosinophils, basophils, Th2 cells and type 2 natural lymphocytes (ILC2).
  • (F) has no agonist activity
  • (G) does not enhance the signal by the ligand of human CRTH2, and (h) does not change the reactivity of activated or inactivated human CRTH2.
  • (6) The antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (5), wherein the antibody is an antibody containing a human Fc region.
  • (7) The antibody or the antibody fragment thereof according to any one of (1) to (6), wherein the antibody is a monoclonal antibody.
  • the hybridoma according to (12) or the transformant according to (15) is cultured in a medium, and the antibody or antibody fragment according to any one of (1) to (11) is cultured in the culture.
  • the disease associated with CRTH2 is an allergic disease, an autoimmune disease, a disease associated with at least one of eosinophilia and hyperfunction, a disease associated with at least one of Th2 cell proliferation and hyperfunction, or type 2
  • the disease associated with human CRTH2 is an allergic disease, an autoimmune disease, a disease associated with at least one of eosinophilia and hyperfunction, a disease associated with at least one of Th2 cell proliferation and hyperfunction, or ILC2
  • a disease associated with human CRTH2 is an allergic disease, an autoimmune disease, a disease associated with at least one of eosinophilia and hyperfunction, a disease associated with at least one of Th2 cell proliferation and hyperfunction, or ILC2
  • the disease associated with human CRTH2 is an allergic disease, an autoimmune disease, a disease with at least one of eosinophilia and hyperfunction, a disease with at least one of Th2 cell proliferation and hyperfunction, or ILC2 (25)
  • the present invention provides an antibody or antibody fragment that recognizes and binds to at least one of the 192nd glycine and the 194th aspartic acid of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2.
  • the antibody of the present invention specifically reacts with cells expressing CRTH2, such as eosinophils, basophils Th2 cells, and ILC2, and exhibits high reactivity with CRTH2-expressing cells even in the presence of a high concentration of ligand. It does not have agonist activity, neutralization activity, or signal enhancement activity by the ligand of human CRTH2. Therefore, the antibody or antibody fragment of the present invention can exert a therapeutic effect targeting cells expressing CRTH2, such as eosinophils, basophils, Th2 cells, ILC2 and the like, which express CRTH2.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequences of the Lym2 antibody light chain variable region and the respective humanized Lym2 antibody light chain variable regions (LV0, LV1, LV2a, LV2b, LV2c, LV3a, LV3b and LV4) that do not contain a signal sequence.
  • a region surrounded by a frame in each sequence indicates a CDR sequence.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequences of the Lym2 antibody heavy chain variable region and the respective humanized Lym2 antibody heavy chain variable regions (HV0, HV1, HV2a, HV2b, HV3 and HV4) that do not contain a signal sequence.
  • a region surrounded by a frame in each sequence indicates a CDR sequence.
  • 3 (A) to (C) show flow cytometry of cytotoxic activity of rat / human chimeric Lym2 antibody (hereinafter sometimes referred to as chLym2) and humanized Lym2 antibody against human eosinophils and human basophils.
  • chLym2 human chimeric Lym2 antibody
  • FIG. 3 (A) o indicates chLym2
  • ⁇ indicates a humanized Lym2 antibody LV0HV0
  • ⁇ indicates an isotype control antibody.
  • FIG. 3 (B) o represents chLym2, ⁇ represents humanized Lym2 antibody LV0HV1, and ⁇ represents an isotype control antibody.
  • FIG. 3 (C) o represents chLym2, ⁇ represents humanized Lym2 antibody LV0HV2a, and ⁇ represents an isotype control antibody.
  • FIG. 4 (A) shows the reactivity of humanized Lym2 antibody LV0HV1
  • FIG. 4 (B) shows the reactivity of chLym2 to cells expressing each human CRTH2 amino acid substitution product.
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity of thistle green tag, and the relative fluorescence intensity corrected for the fluorescence intensity of each anti-human CRTH2 monoclonal antibody was defined as a reactivity value of 100% for wild-type human CRTH2-expressing cells. The reactivity value (%) for each amino acid substitution product-expressing cell is shown. On the horizontal axis, WT represents wild-type human CRTH2, and the others indicate the type of amino acid substitution product. * Means that the relative fluorescence intensity decreased by 90% or more from the relative fluorescence intensity of wild-type CRTH2. The same applies to FIGS. 5 to 7 below.
  • FIG. 5A shows the reactivity of hu19A2 v52 and FIG.
  • FIG. 5B shows the reactivity of hu8B1 v1 with each CRTH2 amino acid substitution product.
  • FIG. 6 (A) shows the reactivity of ch3C12 and
  • FIG. 6 (B) shows the reactivity of ch31A5 to each CRTH2 amino acid substitution product.
  • FIG. 7 shows the reactivity of BM16 against each CRTH2 amino acid substitution product.
  • FIG. 8 shows the results of flow cytometry analysis of the reactivity of the anti-human CRTH2 monoclonal antibody to human eosinophils.
  • FIG. 9 shows the results of analyzing the reactivity of chLym2 to human basophils by flow cytometry.
  • the filled portion indicates the reactivity of the isotype control antibody, the portion surrounded by a solid line indicates the reactivity of chLym2, the vertical axis indicates the number of cells, and the horizontal axis indicates the fluorescence intensity.
  • FIG. 10 shows the results of flow cytometry analysis of the reactivity of the humanized Lym2 antibody LV0HV1 against human CD4-positive T cells.
  • FIG. 11 (A) and FIG. 11 (B) show the results of analyzing the cytotoxic activity of anti-human CRTH2 monoclonal antibody against human eosinophils and human basophils by flow cytometry.
  • FIG. 12 (A) and FIG. 12 (B) show the results of analyzing the human Th2 and Th1 cytokine reduction activity of the anti-human CRTH2 monoclonal antibody.
  • FIG. 12 (B) show the results of analyzing the human Th2 and Th1 cytokine reduction activity of the anti-human CRTH2 monoclonal antibody.
  • FIG. 12 (A) shows the concentration of IL-5 or IL-13, which is a Th2 cytokine, when each antibody is added on the vertical axis.
  • FIG. 12B shows the concentration of IFN- ⁇ , which is a Th1 cytokine, when each antibody is added on the vertical axis.
  • FIG. 13 (A) to FIG. 13 (C) show the results of flow cytometry analysis of the reactivity change of anti-human CRTH2 monoclonal antibody in the presence of CRTH2 ligand DKKGD2, using human CRTH2-expressing 293EBNA cells. .
  • the vertical axis represents the ratio of the fluorescence intensity when the fluorescence intensity in the absence of DKKGD2 is 100%.
  • FIG. 14 shows the results of flow cytometry analysis of the reactivity of anti-human CRTH2 monoclonal antibody against human differentiation-induced mast cells stimulated by IgE and cross-linking antibody treatment.
  • FIG. 15 shows the results of flow cytometry analysis of the reactivity of the anti-human CRTH2 monoclonal antibody to human differentiation-induced Th1 cells.
  • Each figure shows the reactivity of the antibody shown on the top of the figure, with the number of cells on the vertical axis and the fluorescence intensity on the horizontal axis.
  • FIG. 16 shows the results of evaluation of antagonistic activity of Lym2 antibody using the morphological change of human eosinophils as an index.
  • the percentage of eosinophils detected in the high FSC region in the flow cytometer analysis when DKKGD2 at the concentration shown in the legend was treated in the presence or absence of each antibody shown below the graph is shown in the vertical direction. Shown on the axis.
  • FIG. 17 shows the results of evaluating the agonist activity of Lym2 antibody using the morphological change of human eosinophils as an index.
  • FIG. 18 (A) to FIG. 18 (C) show the results of the evaluation of the agonist activity, antagonist activity, and enhancement activity of activation by the ligand of the anti-human CRTH2 monoclonal antibody using the morphological change of human eosinophils as an index. Show. FIG. 18A shows the results for humanized antibody or chimeric antibody, FIG. 18B shows the results for rat antibody, and FIG. 18C shows the results for mouse antibody.
  • FIG. 19 shows the results of analysis by ELISA of the effect of CRTH2 conformational change on the reactivity of CRTH2 monoclonal antibody by GTP ⁇ S or GDP treatment of the membrane fraction of CRTH2-expressing cells.
  • the vertical axis shows the Fold change when the absorbance when GTP ⁇ S and GDP are not treated is 1.
  • FIG. 20 shows the results of flow cytometry analysis of thistle green expression in thistle green-fused human CRTH2-expressing CHO / DG44 cells and cynomolgus CRTH2-expressing CHO / DG44 cells.
  • the vertical axis represents the number of cells, and the horizontal axis represents the fluorescence intensity of thistle green.
  • Fluorescence intensity in CHO / DG44 cells whose solid-filled portion is the parent cell portions surrounded by a solid line are fluorescence intensities in thistle green-fused human CRTH2-expressing CHO / DG44 cells, and portions surrounded by a dotted line are thistle green-fused cynomolgus CRTH2
  • the fluorescence intensity in the expressed CHO / DG44 cells is shown respectively.
  • ⁇ is the reactivity of LV0HV1 to thistle green fusion human CRTH2-expressing CHO / DG44 cells
  • ⁇ is the reactivity of LV0HV1 to thistle green fusion cynomolgus CRTH2 expression CHO / DG44 cells
  • ⁇ is the isotype to thistle green fusion human CRTH2 expression CHO / DG44 cells
  • Antibody reactivity indicates the reactivity of the isotype antibody to thistle green-fused cynomolgus CRTH2-expressing CHO / DG44 cells
  • the vertical axis indicates the fluorescence intensity
  • the horizontal axis indicates the antibody concentration of each antibody.
  • human CRTH2 in the present invention there may be mentioned a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or GenBank accession number BAA74518.
  • a polypeptide having an amino acid sequence and having the function of human CRTH2 is also encompassed by human CRTH2 in the present invention.
  • polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added can be obtained by site-directed mutagenesis [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5 amino acids. It is.
  • Examples of the gene encoding human CRTH2 include GenBank Accession No. AB008535 or the base sequence represented by SEQ ID No. 1. Gene comprising DNA encoding a protein having a human CRTH2 function, comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence represented by GenBank Accession No. AB008535 or SEQ ID No. 1. , GenBank Accession No.
  • genes comprising DNA encoding that polypeptide are encompassed gene encoding CRTH2 of the present invention.
  • DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 was used as a probe, colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern blot hybridization method, Alternatively, it means a hybridizable DNA obtained by a DNA microarray method or the like.
  • 0.7 to 1.0 mol / L of sodium chloride is present using a DNA or DNA derived from a hybridized colony or plaque, or a filter or slide glass on which a PCR product or oligo DNA having the sequence is immobilized.
  • the DNA capable of hybridizing is DNA having at least 60% homology with the base sequence represented by GenBank Accession No. AB008535 or SEQ ID No. 1, preferably DNA having 80% or more homology, more preferably Mention may be made of DNA having a homology of 95% or more.
  • the gene used in the present invention includes a gene in which a small-scale mutation has occurred in the nucleotide sequence due to such a polymorphism, and is included in the gene encoding human CRTH2 of the present invention.
  • the numerical value of homology in the present invention may be a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art, but for the base sequence, BLAST [J. Mol. Biol ., 215, 403 (1990)], for amino acid sequences such as numerical values calculated using default parameters, BLAST2 [Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997), Genome Res., 7, 649 (1997) ), Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html] and numerical values calculated using default parameters.
  • the default parameters are 5 if G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 if it is an amino acid sequence, 2 if -E (Cost to extend gap) is a base sequence, and 1 if it is an amino acid sequence.
  • -Q (Penalty for nucleotide mismatch) is -3
  • -r (reward for nucleotide match) is 1
  • -e (expect value) is 10
  • 11 residues when -W (wordsize) is a base sequence
  • -y [Dropoff (X) for blast extensions in bits] is 20 if blastn, 7 for programs other than blastn
  • -X X dropoff value f
  • a polypeptide comprising a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or GenBank accession number BAA74518 can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, it can be produced by culturing a transformant into which a part of DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 has been deleted and an expression vector containing the DNA is introduced. Further, based on the polypeptide or DNA produced by the above method, one or more amino acids in the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or GenBank accession number BAA74518 are deleted by the same method as described above. A polypeptide having a substituted or added amino acid sequence can be obtained.
  • polypeptide comprising a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or GenBank accession number BAA74518, or one or more amino acids in the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or GenBank accession number BAA74518 is deleted.
  • a polypeptide having a substituted or added amino acid sequence can also be produced by a chemical synthesis method such as a fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) method or a t-butyloxycarbonyl (tBoc) method.
  • Human CRTH2 functions as human CRTH2 include human CRTH2-dependent intracellular signals transmitted by binding to its ligand, for example, PGD2, migration of cells expressing human CRTH2, increased cytokine production from the cells, or cell diameter In other words, cell shape change accompanied by changes in cell surface area is induced.
  • the extracellular region of human CRTH2 includes an N-terminal region containing amino acid residues 1 to 33 of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2, a loop 1 region containing amino acid residues 95 to 111, Examples include a loop 2 region containing amino acid residues 169-206 and a loop 3 region containing amino acid residues 264-285 [J Immunol, 1999. 162 (3): p.1278-86.].
  • the N-terminal region, loop 1 region, loop 2 region and loop 3 region respectively, the 1st to 33rd, 95th to 111th, 169th to 206th and 264 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, respectively. Examples thereof include a polypeptide part containing the amino acid residue at position 285.
  • the antibody in the present invention may be any antibody such as a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and preferably a monoclonal antibody.
  • Specific examples of the antibody of the present invention include an antibody produced by a hybridoma or a gene recombinant antibody produced by a gene recombination technique.
  • Examples of genetically engineered antibodies include mouse antibodies, rat antibodies, human chimeric antibodies, humanized antibodies, and human antibodies produced by genetic engineering techniques.
  • a monoclonal antibody is an antibody that is secreted by an antibody-producing cell of a single clone, recognizes only one epitope (also referred to as an antigenic determinant), and has a uniform amino acid sequence (primary structure) constituting the monoclonal antibody. .
  • the monoclonal antibody includes a recombinant antibody produced by a gene recombination technique such as an antibody produced by a hybridoma or an antibody produced by a transformant transformed with an expression vector containing an antibody gene. be able to.
  • a polyclonal antibody is an antibody group including two or more monoclonal antibodies, and a plurality of epitopes can be recognized by a plurality of antibodies constituting the antibody group.
  • the epitope includes a single amino acid sequence recognized and bound by a monoclonal antibody and a three-dimensional structure composed of the amino acid sequence, an amino acid sequence modified by post-translational modification, and a three-dimensional structure composed of the amino acid sequence.
  • the amino acid sequence modified by post-translational modification includes an O-linked sugar chain bonded to threonine and serine having an OH substituent, an N-linked sugar chain bonded to glutamine and asparagine having an NH 2 substituent, and An amino acid sequence in which a sulfate group bonded to threonine having an OH substituent on the sulfate molecule is bound.
  • the epitope of human CRTH2 recognized by the antibody of the present invention includes a deletion in which a part of human CRTH2 is deleted, a mutant in which a part of human CRTH2 is substituted with another amino acid residue, It can be determined by conducting antibody binding experiments using mutants substituted with domains derived from other proteins, partial peptide fragments of human CRTH2, and the like.
  • the epitope of human CRTH2 to which the antibody of the present invention binds should be determined by adding the antibody of the present invention to human CRTH2 digested with proteolytic enzyme and performing epitope mapping using known mass spectrometry. Can do.
  • amino acid residues contained in the epitope of human CRTH2 recognized by the antibody of the present invention include amino acid residues in which the reactivity of the antibody of the present invention is lost by substitution of the amino acid residue.
  • the reactivity of the antibody in the present invention is determined by, for example, the amount of antibody binding to a cell expressing wild type human CRTH2 receptor or amino acid substitution (corrected according to the expression level of the wild type and substitution) by flow cytometry. It can obtain
  • the amount of antibody bound can be determined by radioimmunoassay using a solid phase sandwich method or the like, a known immunological detection method for human CRTH2 using enzyme immunoassay (ELISA), or the Biacore system (GE Healthcare). ) Etc. can be confirmed by a method such as surface plasmon resonance.
  • the loss of antibody reactivity in the present invention means that the reactivity of an antibody to a cell expressing an amino acid substitution is 70% or more, preferably 80, compared to the reactivity of the antibody to a cell expressing wild type human CRTH2. % Or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more.
  • Examples of the epitope to which the antibody of the present invention binds include an epitope containing at least one amino acid residue of 192nd glycine and 194th aspartic acid of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2.
  • epitope to which the antibody of the present invention binds include the following epitopes (a) to (c).
  • the epitope to which the antibody of the present invention binds includes at least one amino acid residue of the 192nd glycine and the 194th aspartic acid of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 2
  • the 12th proline, 14th leucine, 15th glutamic acid, 177th aspartic acid, 178th glycine, 179th arginine, 180th isoleucine, 181th methionine of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by 183rd tyrosine, 184th tyrosine, 185th asparagine, 187th leucine, 188th leucine, 189th leucine, 195th arginine, 196th aspartic acid, and 198th threonine Choose from Epitope comprising at least one amino acid residue and the like that.
  • the epitope to which the antibody of the present invention binds contains at least one amino acid residue of the 192nd glycine and the 194th aspartic acid of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2, and the following (a ) To (g).
  • amino acid residues contained in the epitope to which the antibody of the present invention binds are present in the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2 when the antibody of the present invention binds to CRTH2, and Any amino acid residue may be used as long as it is a substantially recognized and bound amino acid residue.
  • the 12th proline of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2 the 14th leucine, 15th glutamic acid, 177th aspartic acid, 178th glycine, 179th arginine, 180th isoleucine, 181st methionine, 183rd tyrosine, 184th tyrosine, 185th asparagine, 187th leucine 188th leucine, 189th leucine, 192nd glycine, 194
  • Antibody molecules are also referred to as immunoglobulins (hereinafter referred to as Ig), and human antibodies are classified into IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 and IgM isotypes according to the difference in molecular structure. Is done. IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 having relatively high amino acid sequence homology are collectively referred to as IgG.
  • Antibody molecules are composed of polypeptides called heavy chains (hereinafter referred to as H chains) and light chains (hereinafter referred to as L chains).
  • H chains is an H chain variable region (also expressed as VH)
  • H chain constant region also expressed as CH
  • L chain is also expressed as an L chain variable region (VL) from the N terminal side.
  • CL Each region of the L chain constant region (also expressed as CL).
  • CH has known ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains for each subclass.
  • CH is further composed of each domain of the CH1 domain, hinge domain, CH2 domain, and CH3 domain from the N-terminal side.
  • a domain refers to a functional structural unit constituting each polypeptide of an antibody molecule.
  • the CH2 domain and the CH3 domain are collectively referred to as an Fc region or simply Fc.
  • CL C ⁇ chain and C ⁇ chain are known.
  • any CH can be used as long as it belongs to Ig, but IgG class is preferable, and any of subclasses such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 belonging to IgG class can be used. .
  • the amino acid sequence of CL in the antibody of the present invention may be either an amino acid sequence of a human antibody or an amino acid sequence of a non-human animal antibody, but C ⁇ or C ⁇ of an amino acid sequence of a human antibody is preferable.
  • the antibody of the present invention is an antibody that recognizes and binds to at least one amino acid residue of the 192nd glycine and the 194th aspartic acid of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2.
  • antibody of the present invention include antibodies selected from the following (a) to (c).
  • A an antibody that recognizes and binds to the 192nd glycine of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2
  • B an antibody that recognizes and binds to the 194th aspartic acid of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2
  • C An antibody that recognizes and binds to both the 192nd glycine and the 194th aspartic acid of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2.
  • the antibody of the present invention recognizes at least one amino acid residue of the 192nd glycine and the 194th aspartic acid of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2 and is represented by SEQ ID NO: 2.
  • the antibody of the present invention recognizes at least one amino acid residue of the 192nd glycine and the 194th aspartic acid of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2, and the following (a) to ( An antibody that recognizes and binds to at least one of g).
  • the antibody of the present invention include antibodies selected from the following (a) to (d).
  • the antibody (b) of the present invention refers to an anti-human CRTH2 antibody that inhibits the binding between the antibody (a) and human CRTH2.
  • the antibody of (c) of the present invention refers to an epitope containing the first epitope when the antibody described in (a) is the first antibody and the epitope to which the first antibody binds is the first epitope. Indicates an antibody that binds to.
  • antibody of the present invention include antibodies selected from the following (a) to (c).
  • A the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 or the 18th leucine in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 as methionine, the 77th asparagine as serine, the 93rd valine as threonine, and 117
  • a VH containing an amino acid sequence into which at least one modification selected from a modification replacing threonine with valine is introduced and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 or the second amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 Contains a VL comprising an amino acid sequence introduced with at least one modification selected from a modification that substitutes isoleucine for valine, 4th methionine for leucine, 15th proline for leucine, and 85th alanine for proline antibody,
  • B A VH containing any one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 49, 51, 53, 55, 57
  • Preferred examples of the antibody (b) include antibodies selected from the following (1) to (3).
  • An antibody comprising VH comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 and VL comprising any one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 and 47 (2)
  • an antibody comprising VH comprising any one of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 51, 53, 55 and 57 and VL comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 Particularly preferable examples of the antibody of (b) include an antibody containing VH containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 51 and VL containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33.
  • Examples of the antibody of the present invention include an antibody that loses reactivity with an amino acid substitution product in which at least one of 192nd glycine and 194th aspartic acid of human CRTH2 is substituted with alanine.
  • the antibody of the present invention includes an antibody whose reactivity to human CRTH2 does not decrease in the presence of a ligand of human CRTH2.
  • An antibody whose reactivity to human CRTH2 does not decrease in the presence of a ligand for human CRTH2 is a condition where the ligand for human CRTH2 is present at a high concentration, such as in the local area of inflammation, compared to an antibody whose reactivity to human CRTH2 is decreased. But it can show high reactivity. Therefore, it can specifically bind to human CRTH2 independent of human CRTH2 ligand, and can exhibit a medicinal effect.
  • the decrease in antibody reactivity in the presence of human CRTH2 ligand means that the antibody reactivity to human CRTH2-expressing cells in the absence of human CRTH2 ligand is higher in the presence of human CRTH2 ligand. It shows that the reactivity of is reduced by at least 5% or more. More strictly, it indicates a decrease of 10% or more.
  • the ligand for human CRTH2 includes any ligand that specifically binds to human CRTH2, and preferably includes PGD2 or DKKGD2. More preferably, DKKGD2 is mentioned.
  • responsiveness to activated or inactivated human CRTH2 does not change in the presence or absence of guanosine diphosphate (GDP) or GDP analog, or guanosine triphosphate (GTP) or GTP analog.
  • GDP guanosine diphosphate
  • GDP analog include guanosine 5′-O- ( ⁇ -thio) diphosphate (GDP ⁇ S).
  • GTP analog include guanosine 5′-O- ( ⁇ -thio) triphosphate (GTP ⁇ S).
  • the antibody of the present invention has an antibody having no neutralizing activity, an antibody having no agonist activity, an antibody that does not enhance the signal by the ligand of human CRTH2, or a change in reactivity to activated or inactivated human CRTH2.
  • Non-antibodies are included.
  • the neutralizing activity of an antibody refers to an activity that inhibits the biological activity of human CRTH2 possessed by the antibody.
  • it refers to an antagonist activity such as an activity that inhibits the binding between human CRTH2 and its ligand and an activity that inhibits signal transduction by human CRTH2.
  • agonist activity refers to an activity that mimics the biological activity of a ligand for human CRTH2, and refers to an activity that induces activation of CRTH2 and various reactions associated with the activation.
  • Specific examples of the agonist activity in the present invention include cell migration activity and cell shape change inducing activity.
  • the signal from the ligand of human CRTH2 refers to a signal associated with the activation of human CRTH2 by binding of the ligand of human CRTH2 to human CRTH2.
  • the signal and agonist activity of human CRTH2 ligand can be evaluated by analyzing various reactions associated with the activation of human CRTH2. For example, it can be evaluated by analyzing morphological changes of human CRTH2-expressing cells.
  • the human CRTH2-expressing cell may be any cell as long as it expresses human CRTH2.
  • eosinophils, basophils, Th2 cells, type 2 natural lymphocytes (ILC2), nonclassical monocyte, Th2 / Th17 Examples include cells.
  • the fact that the antibody does not enhance the signal from the ligand of human CRTH2 means that when the human CRTH2 ligand and the antibody are allowed to act on human CRTH2, compared to when the human CRTH2 ligand acts alone. , Refers to activation of human CRTH2 and not to enhance various reactions associated with the activation.
  • the antibody of the present invention includes an antibody exhibiting cytotoxic activity against human CRTH2-expressing cells.
  • Examples of the cytotoxic activity in the present invention include complement-dependent cytotoxic activity (hereinafter referred to as CDC activity) or antibody-dependent cytotoxic activity (hereinafter referred to as ADCC activity).
  • an antibody molecule bound to human CRTH2 on the cell surface binds to C1q of the complement system through the Fc portion, and as a result, each complement component of C1 to C9 is activated, Specifically, there is a reaction in which C5 to C9 form a pore-forming polymer called a membrane attack complex on the cell membrane to cause cell lysis [Immunol Today. 1999 Dec; 20 (12): 576-82.].
  • ADCC activity in the present invention includes, for example, natural killer cells (hereinafter referred to as NK cells) in which an antibody molecule bound to human CRTH2 on the cell surface expresses an Fc receptor via the Fc portion.
  • Activation may include cytotoxic reactions such as release of cytotoxic molecules such as perforin and granzyme and enhanced phagocytosis [Chemical Immunology, 65, 88 (1997); Immunol ; Today, 20, 576 (1999) )].
  • the antibody of the present invention includes an antibody having no cytotoxicity against mast cells. Such an antibody has the advantage that there is no concern of side effects due to the release of inflammatory mediators due to mast cell injury.
  • the antibody of the present invention includes an antibody in which an N-glycoside-linked sugar chain is bound to the Fc region of the antibody and fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-bound sugar chain.
  • An antibody in which an N-glycoside-linked sugar chain is bound to the Fc region of the antibody and fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain includes, for example, ⁇ 1,6-fucose transferase gene And antibodies produced using CHO cells deficient in (WO 2005/035586, WO 02/31140).
  • the antibody of the present invention in which an N-glycoside-linked sugar chain is bound to the Fc region of the antibody and fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain has high ADCC activity.
  • the antibody of the present invention includes an antibody in which an amino acid residue in the Fc region of the antibody is modified so that the binding activity to the Fc receptor is increased.
  • Examples of antibodies in which the amino acid residues in the Fc region of the antibody have been modified so as to increase the binding activity to the Fc receptor include antibody molecules produced by the method described in US Pat. No. 7,317,091. .
  • the antibody of the present invention includes an antibody having an increased blood half-life by modifying the surface charge of the polypeptide containing the variable region of the antibody or the antigen binding activity at a pH in the early endosome.
  • Examples of antibodies that have an increased blood half-life by modifying the surface charge of the polypeptide containing the variable region of the antibody molecule or the antigen-binding activity at an early endosome pH at pH include, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-165716, Japan An antibody produced by the method described in JP2012-021004A can be mentioned.
  • the antibodies of the present invention include recombinant antibodies such as human chimeric antibodies (hereinafter also simply referred to as chimeric antibodies), human CDR-grafted antibodies (hereinafter also referred to as humanized antibodies), and human antibodies.
  • Chimeric antibody refers to an antibody consisting of VH and VL of an antibody from a non-human animal (non-human animal) and CH and CL of a human antibody.
  • non-human animal any mouse, rat, hamster, rabbit or the like can be used as long as it can produce a hybridoma.
  • the chimeric antibody of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL of a non-human animal antibody that specifically reacts with human CRTH2, and has an expression vector for animal cells having genes encoding CH and CL of the human antibody
  • the chimeric antibody expression vector can be constructed by inserting each into, and introduced into animal cells for expression and production.
  • the humanized antibody means an antibody obtained by grafting CDRs of VH and VL of an antibody of a non-human animal into appropriate positions of VH and VL of a human antibody.
  • the humanized antibody of the present invention transplants the VH and VL CDRs of non-human animal antibodies that specifically react with human CRTH2 into the VH and VL frameworks (hereinafter referred to as FR) of any human antibody.
  • CDNA encoding the variable region (hereinafter also referred to as V region) is constructed, and inserted into an expression vector for animal cells having DNA encoding CH and CL to construct a humanized antibody expression vector, and the expression vector Can be expressed and produced by introducing it into animal cells.
  • human antibody VH and VL FRs any amino acid sequence derived from a human antibody can be used.
  • human antibody VH and VL FR amino acid sequences registered in databases such as Protein Data Bank, or human antibody VH and VL FR subgroup common amino acid sequences (Sequencesenceof Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991).
  • one or more amino acids are deleted, added, substituted or inserted, specifically bind to human CRTH2, and have an equivalent function in biological activities such as cytotoxic activity, for example
  • the antibody fragment is also encompassed by the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention includes an antibody that binds to monkey CRTH2.
  • monkey CRTH2 include marmoset CRTH2, cynomolgus CRTH2, and rhesus monkey CRTH2.
  • cynomolgus monkey CRTH2 is used.
  • the antibodies of the present invention include an Fc fusion protein in which Fc and an antibody fragment are bound, an Fc fusion protein in which Fc and a naturally occurring ligand or receptor are bound (also referred to as immunoadhesin), and a plurality of Fc regions. Fc fusion proteins and the like that have been made are also encompassed by the present invention.
  • Fc fusion proteins and the like that have been made are also encompassed by the present invention.
  • a modified Fc region containing an amino acid residue modification in which an amino acid residue substitution is performed to stabilize the antibody or control the blood half-life can also be used for the antibody of the present invention.
  • the antibody fragment includes an antigen-binding domain that recognizes and binds to at least one of the 192nd glycine and the 194th aspartic acid of the amino acid sequence of human CRTH2 represented by SEQ ID NO: 2; It is a fragment having activity.
  • the antibody fragment of the present invention include Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , single chain Fv (hereinafter referred to as scFv), diabody, dsFv, and a peptide containing a plurality of CDRs.
  • Fab is a fragment obtained by treating IgG with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain), and about half of the N chain side of the H chain and the entire L chain are disulfide bonds. It is an antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 50,000.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating an antibody that specifically binds to human CRTH2 of the present invention with the proteolytic enzyme papain. Alternatively, it can be produced by inserting a DNA encoding the Fab of the antibody into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • F (ab ′) 2 is a fragment obtained by treating IgG with the protease pepsin (cleaved at the amino acid residue at position 234 of the H chain), and Fab is bound via a disulfide bond in the hinge region. It is an antibody fragment having an antigen-binding activity having a molecular weight of about 100,000, which is slightly larger than those obtained.
  • F (ab ′) 2 of the present invention can be obtained by treating an antibody that specifically binds to human CRTH2 of the present invention with the proteolytic enzyme pepsin.
  • Fab ′ described below can be prepared by thioether bond or disulfide bond.
  • Fab ′ is an antibody fragment having an antigen-binding activity having a molecular weight of about 50,000, which is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 .
  • the Fab ′ of the present invention can be obtained by treating the F (ab ′) 2 composition that specifically binds to the human CRTH2 of the present invention with a reducing agent dithiothreitol.
  • the DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic organisms to be expressed and produced. it can.
  • scFv uses an appropriate peptide linker (P) such as a linker peptide in which one VH and one VL are connected to an arbitrary number of linkers (G4S) consisting of four Gly and one Ser residue.
  • P peptide linker
  • G4S linkers
  • VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide which is an antibody fragment having antigen-binding activity.
  • the scFv of the present invention obtains cDNA encoding the VH and VL of an antibody that specifically binds to human CRTH2 of the present invention, constructs a DNA encoding scFv, and uses the DNA as a prokaryotic expression vector or eukaryotic It can be produced by inserting it into a biological expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • Diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • the diabody of the present invention obtains cDNA encoding the VH and VL of the antibody that specifically binds to human CRTH2 of the present invention, and the amino acid sequence length of the DNA encoding scFv is 8 residues or less
  • the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic organism to be expressed and produced.
  • DsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue and bonded via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue substituted for the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994).
  • the dsFv of the present invention obtains cDNA encoding the VH and VL of an antibody that specifically binds to the human CRTH2 of the present invention, constructs a DNA encoding the dsFv, and uses the DNA to express a prokaryotic expression vector or eukaryotic It can be produced by inserting into an expression vector for living organisms and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • the peptide containing CDR is configured to contain at least one region of CDR of VH or VL.
  • Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • the peptide comprising the CDR of the present invention constructs DNA encoding the CDRs of the antibody VH and VL that specifically bind to human CRTH2 of the present invention, and the DNA is used as a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector. And can be expressed and produced by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • Monoclonal antibody or antibody fragment in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence constituting the antibody or the antibody fragment and have the same activity as the antibody or the antibody fragment are also encompassed by the antibodies or antibody fragments of the present invention.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted or added is one or more, and the number is not particularly limited.
  • the number is such that it can be deleted, substituted or added by known techniques such as site-directed mutagenesis, for example, 1 to several tens, preferably Is 1 to 20, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5.
  • One or more amino acids in any one or more amino acid sequences in the same sequence means that one or more amino acid residues have been deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence of human CRTH2 or antibody of the present invention. It means that there is a deletion, substitution, insertion or addition of a residue, and deletion, substitution, insertion or addition may occur simultaneously, and the amino acid residue to be substituted, inserted or added is a natural type and a non-natural type. It doesn't matter.
  • natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-glutamine, L-glutamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cysteine and the like.
  • amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine
  • B group aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid group
  • C asparagine, glutamine group
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid group
  • E proline, 3 -Hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • F group serine, threonine, homoser
  • the transformant of the present invention is a transformant obtained by introducing a DNA encoding an antibody molecule that specifically binds to human CRTH2 into a host cell, the transformant producing the antibody of the present invention. Any transformant, if any, is encompassed.
  • a transformant obtained by introducing a DNA encoding an antibody molecule that specifically binds to human CRTH2 into a host cell such as the following (a) to (i) is a good example.
  • B Rat myeloma cell line YB2 / 3HL. P2. G11.16 Ag.
  • mice 20 cells;
  • C mouse myeloma cell line NS0 cells;
  • D mouse myeloma cell line SP2 / 0-Ag14 cells;
  • E Syrian hamster kidney tissue-derived BHK cells;
  • F a hybridoma cell producing an antibody;
  • G human leukemia cell line Namalva cells;
  • H embryonic stem cells;
  • I Fertilized egg cells.
  • the transformant of the present invention produces an antibody in which an N-glycoside-linked sugar chain is bound to the Fc region of an antibody and fucose is not bound to N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-glycoside-linked sugar chain.
  • a host cell in which a DNA encoding an antibody molecule that specifically binds to human CRTH2 is produced by the method described in International Publication Nos. 2005/035586 and 02/31140 with reduced or deficient glycosyltransferase A good example is a transformant obtained by introduction into.
  • the method for producing the antibody or the antibody fragment of the present invention includes any antibody production method as long as it is a production method for culturing the transformant producing the antibody of the present invention or the antibody fragment.
  • the transformant producing the antibody or the antibody fragment of the present invention is cultured, the antibody or the antibody fragment is produced and accumulated in the culture, and the antibody or the antibody fragment is collected and purified.
  • a manufacturing method is mentioned.
  • the antibody or the antibody fragment produced by the above production method is also exemplified as the antibody or the antibody fragment of the present invention.
  • the composition of the present invention may be any composition as long as it comprises the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof, and the composition comprises a single antibody molecule in which the sugar chain that binds to the antibody comprises: Alternatively, it may be a composition containing an antibody molecule having a plurality of sugar chain structures. Moreover, the composition containing a suitable additive, a buffer, etc. may be sufficient.
  • the composition of the present invention preferably includes a drug, a diagnostic agent and the like containing the antibody of the present invention or the antibody fragment as an active ingredient.
  • the pharmaceutical or diagnostic agent of the present invention includes any pharmaceutical or diagnostic agent as long as it is a pharmaceutical or diagnostic agent containing the antibody of the present invention or the antibody fragment as an active ingredient.
  • a good example is a drug or diagnostic agent for a disease associated with human CRTH2-expressing cells.
  • the therapeutic method of the present invention includes any therapeutic method, as long as it is a therapeutic method in which an effective amount of the antibody or antibody fragment of the present invention is administered, and preferably includes a therapeutic method for diseases associated with human CRTH2-expressing cells. It is done.
  • any antibody or antibody fragment can be used as long as the antibody or the antibody fragment of the present invention is used for producing a therapeutic drug for a disease associated with human CRTH2-expressing cells. Use is also included. Moreover, the antibody or the antibody fragment of the present invention can be used for at least one of treatment and prevention of a disorder or disease associated with human CRTH2-expressing cells.
  • disorders or diseases related to human CRTH2-expressing cells include, but are not limited to, for example, allergic diseases, autoimmune diseases, diseases associated with at least one of eosinophilia and hyperfunction, increased Th2 cells And diseases associated with at least one of hyperfunction and diseases associated with at least one of increased ILC2 and hyperfunction.
  • Preferred disorders or diseases involving human CRTH2-expressing cells include asthma, childhood asthma, chronic obstructive pulmonary disease, atopic dermatitis, allergic rhinitis and acute or chronic sinusitis.
  • the medicament containing the antibody of the present invention or the antibody fragment or derivative thereof may contain only the antibody or the antibody fragment or derivative thereof as an active ingredient.
  • Examples of the administration route include oral administration and parenteral administration such as intraoral, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, or intraperitoneal.
  • Examples of the dosage form include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, or tapes.
  • preparations suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, and granules. *
  • the antibody of the present invention includes a derivative of an antibody in which a radioisotope, a low molecular drug, a high molecular drug, a protein, a nucleic acid or the like is chemically or genetically bound to the antibody of the present invention or an antibody fragment thereof. To do.
  • a preventive method a therapeutic agent or a therapeutic agent, a chemotherapeutic agent, antibody drug, immunostimulant, macromolecular agent is used as a drug that binds to the antibody of the present invention or an antibody fragment thereof.
  • examples include drugs.
  • proteins include cytokines, growth factors, and toxin proteins.
  • examples of the nucleic acid include decoy, antisense, siRNA, miRNA and the like.
  • the derivative of the antibody in the present invention includes the N- or C-terminal side of the H chain or L chain of the antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, an appropriate substituent or side chain in the antibody or the antibody fragment thereof, and further an antibody.
  • a radioisotope, a low molecular weight drug, a high molecular weight drug, a protein, or the like is bound to a sugar chain or the like in the antibody fragment by a chemical method [method of introduction to antibody engineering, method described in Jinjinshokan (1994)]. Can be manufactured.
  • the derivative of the antibody in the present invention is obtained by ligating DNA encoding the antibody or antibody fragment of the present invention and DNA encoding the protein to be bound and inserting the expression vector into an appropriate host cell. It can be produced by genetic engineering techniques that are introduced into and expressed.
  • radioisotope examples include 131 I, 125 I, 90 Y, 64 Cu, 99 Tc, 77 Lu, and 211 At.
  • the radioisotope can be directly bound to the antibody by the chloramine T method or the like.
  • a substance that kills the radioisotope may be bound to the antibody.
  • the chelating agent for example, 1-isothiocyanate benzyl-3-methyldiethylene sulamine pentaacetic acid (MX-DTPA) and the like can be mentioned.
  • low-molecular-weight drugs examples include luminescent materials such as acridinium esters or lophine, or fluorescent materials such as fluorescein isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC). .
  • luminescent materials such as acridinium esters or lophine
  • fluorescent materials such as fluorescein isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC).
  • Examples of the method of binding a low molecular weight drug and an antibody include, for example, a method of binding a drug and an amino group of an antibody via glutaraldehyde, or a drug amino group and an antibody carboxyl group via a water-soluble carbodiimide. And the like.
  • polymer drug examples include polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG), albumin, dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid copolymer, polyvinylpyrrolidone, pyrancopolymer, hydroxypropyl methacrylamide, and the like.
  • PEG polyethylene glycol
  • albumin dextran
  • polyoxyethylene polyoxyethylene
  • styrene maleic acid copolymer polyoxyethylene
  • polyvinylpyrrolidone polyvinylpyrrolidone
  • pyrancopolymer hydroxypropyl methacrylamide
  • the immunological detection or measurement method is a method of detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • Immunological detection or measurement methods include radiolabeled immunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), luminescent immunoassay, western blot method Or a physicochemical method etc. are mentioned.
  • a disease associated with human CRTH2 can be diagnosed.
  • a biological sample to be detected or measured for human CRTH2 includes tissue cells, blood, plasma, serum, pancreatic juice, urine, feces, tissue fluid, alveolar lavage fluid, culture fluid, and the like that are secreted extracellularly. It is not particularly limited as long as it may contain a peptide fragment containing CRTH2 or a part thereof, or a cell expressing human CRTH2.
  • the diagnostic agent containing the antibody of the present invention or an antibody fragment thereof, or a derivative thereof may contain a reagent for performing an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction, depending on the target diagnostic method.
  • the reagent for performing the antigen-antibody reaction include a buffer and a salt.
  • the detection reagent include a labeled secondary antibody that recognizes the antibody or an antibody fragment thereof, or a derivative thereof, or a reagent used in a normal immunological detection or measurement method such as a substrate corresponding to the label. It is done.
  • Antibody Production Method Preparation of Antigen Human CRTH2 or human CRTH2 as an antigen is expressed as an expression vector containing cDNA encoding the full length of human CRTH2 or a partial length thereof, E. coli, yeast, insect cells, or It can be obtained by introducing it into animal cells.
  • human CRTH2 can also be obtained by purifying human CRTH2 from various human cultured cells, human tissues, etc. that express a large amount of human CRTH2.
  • the cultured cells or the tissues can be used as they are as antigens.
  • a synthetic peptide having a partial sequence of human CRTH2 can be prepared by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method and used as an antigen.
  • a known peptide such as FLAG or His may be added to the C-terminus or N-terminus of the synthetic peptide having human CRTH2 or a partial sequence of human CRTH2.
  • Human CRTH2 used in the present invention is a method described in MolecularMCloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) or Current Protocols in molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), etc. Can be produced by expressing the DNA encoding human CRTH2 in a host cell by the following method, for example.
  • a recombinant vector is prepared by inserting a full-length cDNA containing a portion encoding human CRTH2 downstream of a promoter of an appropriate expression vector.
  • a DNA fragment of an appropriate length containing a polypeptide-encoding portion prepared based on the full-length cDNA may be used.
  • a transformant producing a polypeptide can be obtained by introducing the obtained recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • Any expression vector can be used so long as it can be autonomously replicated in the host cell to be used or integrated into the chromosome, and contains an appropriate promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide can be transcribed. Can do.
  • any microorganism that belongs to the genus Escherichia such as Escherichia coli, yeast, insect cells, or animal cells can be used so long as it can express the target gene.
  • the recombinant vector is capable of autonomous replication in a prokaryote, and at the same time a promoter, a ribosome binding sequence, DNA containing a portion encoding human CRTH2, and a transcription termination sequence. It is preferable that the vector contains
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for the recombinant vector, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • the recombinant vector may contain a gene that controls the promoter.
  • the recombinant vector it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence (also referred to as SD sequence), which is a ribosome binding sequence, and the start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • SD sequence also referred to as SD sequence
  • start codon is adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • the base sequence of DNA encoding the human CRTH2 can be substituted so that the codon is optimal for expression in the host, thereby improving the production rate of the target human CRTH2.
  • Any expression vector can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • pBTrp2, pBTac1, pBTac2 hereinafter, Roche Diagnostics
  • pKK233-2 Pharmacia
  • PSE280 Invitrogen Corp.
  • pGEMEX-1 Promega Corp.
  • pQE-8 Qiagen Corp.
  • pKYP10 Japanese Unexamined Patent Publication No. 58-110600
  • pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984) )]
  • PLSA1 Agric Biol. Chem. 53, 277 (1989)]
  • pGEL1 Proc. Natl. Acad. Sci.
  • any promoter can be used as long as it can function in the host cell to be used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, or T7 promoter can be mentioned.
  • An artificially designed and modified promoter such as a tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter, or letI promoter in which two Ptrps are connected in series can also be used.
  • Examples of host cells include E. coli XL-1 Blue, E. coli XL2-Blue, E. coli DH1, E. coli MC1000, E. coli KY3276, E. coli W1485, E. coli JM109, E. coli HB101, E. coli No. 49, E. coli W3110, E. coli NY49, or E. coli DH5 ⁇ . *
  • any method for introducing DNA into a host cell to be used can be used.
  • a method using calcium ion [Proc. Natl. Acad. Sci. USA] , 69, 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)].
  • any expression vector can be used as long as it can function in animal cells.
  • pcDNA I, pcDM8 (Funakoshi), pAGE107 Japanese Patent Laid-Open No. 03/1993] No. 22979; Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • pAS3-3 Japanese Unexamined Patent Publication No. 02-227075
  • pcDM8 [Nature, 329, 840 (1987)]
  • pcDNA I / Amp (Invitrogen) PcDNA3.1 (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE immediate early
  • SV40 early promoter a retroviral promoter
  • Metallothionein promoter a promoter for expressing a cytomegalovirus gene
  • heat shock promoter a promoter for expressing a cytomegalovirus gene
  • SR ⁇ promoter a promoter for expressing a cytomegalovirus gene
  • Moloney murine leukemia virus promoter or enhancer e.g., a promoter of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
  • an enhancer of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
  • host cells examples include human leukemia cells Namalwa cells, monkey cells COS cells, Chinese hamster ovary cells CHO cells [Journalourof Experimental Medicine, 108, 945 (1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Genetics, 55, 513 (1968); Chromosoma, 41, 129 (1973); Methods in Cell Science, 18, 115 (1996); Radiation Research, 148, 260 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, (4216 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968); Cell, 6, 121 (1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (pp.
  • Any method can be used for introducing a recombinant vector into a host cell as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • an electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • a calcium phosphate method Japanese Patent Laid-Open No. 02-227075
  • a lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987 )] And the like.
  • a transformant derived from a microorganism or animal cell having a recombinant vector incorporating a DNA encoding human CRTH2 obtained as described above is cultured in a medium, and the human CRTH2 is produced and accumulated in the culture.
  • the human CRTH2 can be produced by collecting from the culture.
  • the method of culturing the transformant in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • cultivating a microorganism transformed with a recombinant vector using the lac promoter cultivate a microorganism transformed with isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside or the like using a recombinant vector using the trp promoter.
  • indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • Examples of a medium for culturing a transformant obtained using an animal cell as a host include, for example, a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)], Iscove's Modified Dulbecco 's Medium (IMDM) medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum (FBS) or the like to these mediums.
  • RPMI 1640 medium The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)]
  • Eagle's MEM medium Science, 122, 501 (1952)]
  • Dulbecco's modified MEM medium Virology, 8, 396 (1959)]
  • 199 medium Proc. Soc. Exp. Biol
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C., and 5% CO 2 .
  • Methods for producing human CRTH2 include a method for production into a host cell, a method for secretion outside the host cell, and a method for production on the host cell outer membrane.
  • the host cell to be used or the structure of human CRTH2 to be produced is determined. By changing, an appropriate method can be selected.
  • the production amount of human CRTH2 can be increased by using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like (Japanese Patent Application Laid-Open No. 02-227075).
  • the obtained human CRTH2 can be isolated and purified as follows, for example.
  • human CRTH2 When human CRTH2 is expressed in a dissolved state in the cells, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, French press, Manton Gaurin homogenizer, or dynomill. Use to crush the cells to obtain a cell-free extract.
  • a normal protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, diethylamino Anion exchange chromatography using a resin such as ethyl (DEAE) -Sepharose, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical), cation exchange chromatography using a resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), A single method such as hydrophobic chromatography using a resin such as butyl sepharose or phenyl sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, or electrophoresis such as isoelectric focusing Or use it in combination to obtain a purified preparation. Kill. *
  • human CRTH2 When human CRTH2 is expressed by forming an insoluble substance in the cell, the cell is collected and then disrupted in the same manner as described above, and centrifuged to collect the insoluble substance of human CRTH2 as a precipitate fraction. The collected insoluble human CRTH2 is solubilized with a protein denaturant. By diluting or dialyzing the solubilized solution, the human CRTH2 is returned to a normal three-dimensional structure, and then a purified polypeptide preparation can be obtained by the same isolation and purification method as described above. *
  • the derivative such as human CRTH2 or a modified sugar thereof can be recovered from the culture supernatant.
  • a soluble fraction can be obtained by treating the culture by a method such as centrifugation as described above, and a purified preparation can be obtained from the soluble fraction by using the same isolation and purification method as described above. it can.
  • human CRTH2 used in the present invention can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method. Chemical synthesis can also be performed using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecel-Vega, Perceptive, or Shimadzu. *
  • Immunization is carried out by administering the antigen subcutaneously, ridge, intravenously or intraperitoneally, together with an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • an appropriate adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (bovine serum albumin) or KLH (Keyhole Limothemoyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA bovine serum albumin
  • KLH Keyhole Limothemoyanin
  • the antigen is administered 1 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus or tail vein, and the antibody titer of the serum is measured using an enzyme immunoassay [Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]. . An animal whose serum shows a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization is used as a source of antibody producing cells for fusion.
  • tissues containing antibody-producing cells such as the spleen are removed from the immunized animal, and antibody-producing cells are collected.
  • the spleen is shredded and loosened, and then centrifuged, and the erythrocytes are removed to obtain antibody producing cells for fusion.
  • a cell line obtained from a mouse is used.
  • an 8-azaguanine resistant mouse (BALB / c-derived) myeloma cell line P3-X63Ag8-U1 (P3-U1 ) [Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 (1978)]
  • P3-NS1 / 1Ag41 (NS-1) [European J. Immunology, 6, 511 (1976)]
  • P3-X63-Ag8653 (653) J. Immunology, 123, 1548 (1979)]
  • P3-X63-Ag8 (X63) [Nature, 256, 495 (1975) )] Etc.
  • the myeloma cells were subcultured in normal medium [RPMI 1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, FBS, and 8-azaguanine], and subcultured into normal medium 3-4 days before cell fusion. On the day of fusion, secure a cell count of 2 ⁇ 10 7 or more.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • PBS disodium phosphate 1. 83 g, monopotassium phosphate 0.21 g, sodium chloride 7.65 g, distilled water 1 liter, pH 7.2
  • the cells After loosening the precipitated cell group, the cells are gently suspended in the HAT medium [normal medium supplemented with hypoxanthine, thymidine, and aminopterin] on the antibody-producing cells for fusion. This suspension is cultured for 7 to 14 days in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • HAT medium normal medium supplemented with hypoxanthine, thymidine, and aminopterin
  • a part of the culture supernatant is extracted, and a cell group that reacts with an antigen containing human CRTH2 but does not react with an antigen not containing human CRTH2 by a hybridoma selection method such as reactivity analysis for human CRTH2-expressing cells described later Select.
  • cloning was repeated twice by the limiting dilution method [first time using HT medium (medium obtained by removing aminopterin from HAT medium), second time using normal medium], and stable and strong antibody titer was observed. Are selected as monoclonal antibody-producing hybridomas.
  • the monoclonal antibody-producing hybridoma obtained in (4) is cultured in an RPMI1640 medium supplemented with 10% FBS, the supernatant is removed by centrifugation, and the suspension is suspended in a Hybridoma-SFM medium and cultured for 3 to 7 days. To do.
  • the obtained cell suspension is centrifuged, and the resulting supernatant is purified by a protein A-column or protein G-column, and the IgG fraction is collected to obtain a purified monoclonal antibody.
  • 5% Daigo GF21 can be added to the Hybridoma-SFM medium. *
  • the antibody subclass is determined by enzyme immunoassay using a sub-clustering kit.
  • the amount of protein is calculated from the Raleigh method or absorbance at 280 nm. *
  • the monoclonal antibody is selected by analyzing the reactivity with respect to cells expressing human CRTH2 by flow cytometry as shown below.
  • Examples of cells that express human CRTH2 include gene-transferred cells obtained by introducing an expression vector containing cDNA encoding human CRTH2 obtained in (1) into animal cells, human eosinophils, and basophils. , Th2, ILC2, non-classical monocyte, Th2 / Th17 cells, and the like.
  • a test substance such as serum, hybridoma culture supernatant or purified monoclonal antibody is dispensed as a first antibody and allowed to react.
  • the cells after the reaction are thoroughly washed with PBS containing 1 to 10% bovine serum albumin (BSA) (hereinafter referred to as BSA-PBS), and then anti-immunoglobulin antibody labeled with a fluorescent reagent or the like as a second antibody. Dispense and react.
  • BSA-PBS bovine serum albumin
  • a monoclonal antibody that specifically reacts with the expressed cells is selected by measuring the fluorescence amount of the labeled antibody using a flow cytometer.
  • a monoclonal antibody that competes with the monoclonal antibody of the present invention and binds to human CRTH2 can be obtained by adding a test antibody to the above-described binding reaction detection system using flow cytometry and reacting.
  • an antibody that binds to the same epitope as that recognized by the monoclonal antibody that binds to the amino acid sequence of human CRTH2 of the present invention or to its three-dimensional structure is an antibody obtained by the above-described binding reaction detection system using flow cytometry. It can be obtained by preparing and immunizing a partial synthetic peptide of the identified epitope or a synthetic peptide mimicking the three-dimensional structure of the epitope.
  • a recombinant antibody expression vector is an expression vector for animal cells into which DNAs encoding the CH and CL of a human antibody are incorporated, and the expression vector for animal cells is human. It can be constructed by cloning DNAs encoding antibody CH and CL, respectively.
  • Any human antibody CH and CL can be used for the C region of a human antibody.
  • ⁇ 1 subclass CH and ⁇ class CL of human antibodies are used.
  • cDNA is used for the DNA encoding CH and CL of the human antibody, chromosomal DNA consisting of exons and introns can also be used.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • pAGE107 [Cytotechnol., 3, 133 (1990)]
  • pAGE103 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)]
  • pHSG274 [Gene, 27, 223 (1984)]
  • pKCR Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)]
  • pSG1bd2-4 [Cytotechnol., 4, 173 (1990)]
  • pSE1UK1Sed1-3 [Cytotechnol., 13, 79 (1993)].
  • promoters and enhancers include SV40 early promoter [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], Moloney murine leukemia virus LTR [Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960 ( 1987)] or an immunoglobulin heavy chain promoter [Cell, 41, 479 (1985)] and an enhancer [Cell, 33, 717 (1983)].
  • Recombinant antibody expression vectors balance the ease of construction of recombinant antibody expression vectors, the ease of introduction into animal cells, and the balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells.
  • a vector for expression of a recombinant antibody J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994) in which the antibody H chain and L chain are present on the same vector is used, A separate vector in which the antibody H chain and L chain are present on separate vectors can also be used.
  • pKANTEX93 International Publication No. 97/10354
  • pEE18 Hybridoma, 17, 559 (1998)] or the like is used.
  • MRNA is extracted from hybridoma cells producing non-human antibodies, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or a plasmid to prepare a cDNA library.
  • a recombinant phage or recombinant plasmid having cDNA encoding VH or VL is isolated.
  • the entire base sequence of VH or VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, respectively, and the total amino acid sequence of VH or VL is estimated from the base sequence, respectively.
  • non-human animal for producing a hybridoma cell producing a non-human antibody a mouse, rat, hamster, rabbit or the like is used, but any animal can be used as long as it can produce a hybridoma cell. .
  • RNA easy kit For preparation of total RNA from hybridoma cells, a kit such as guanidine thiocyanate-cesium acetate trifluoroacetate method [Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)] or RNA easy kit (Qiagen) is used. *
  • oligo (dT) -immobilized cellulose column method [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] or Oligo-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit
  • kit such as (Takara Bio).
  • mRNA can also be prepared from hybridoma cells using a kit such as Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen) or QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia). *
  • any vector can be used as a vector into which cDNA synthesized using mRNA extracted from a hybridoma cell as a template is incorporated.
  • Escherichia coli into which a cDNA library constructed by a phage or plasmid vector is introduced can be used as long as it can introduce, express and maintain the cDNA library.
  • XL-1 Blue MRF [Strategies, 5, 81 (1992)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], NM522 [J. Mol. Biol ., 166, 1 (1983)], K802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] or the like is used.
  • Selection of cDNA clones encoding non-human antibody VH or VL from a cDNA library can be achieved by colony hybridization method using isotope or fluorescently labeled probe, or plaque hybridization method [Molecular Cloning, A Laboratory Laboratory Manual , SecondCEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
  • PCR method Molecular® Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory (Press (1989) , “Current Protocols in molecular molecular biology, Supplements 1, John Wiley & Sons (1987-1997)] can also be used to prepare cDNA encoding VH or VL.
  • the selected cDNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme and then cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and the base sequence of the cDNA is determined by a commonly used base sequence analysis method or the like.
  • the base sequence analysis method includes, for example, a dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], ABI PRISM 3700 (PE Biosystems) or A.I. L. F. An automatic base sequence analyzer such as a DNA sequencer (Pharmacia) is used.
  • VH and VL complete amino acid sequences
  • the BLAST method J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] for any database such as SWISS-PROT or PIR-Protein is used. It is possible to confirm whether the complete amino acid sequences of VH and VL are novel.
  • a human chimeric antibody expression vector VH or VL of non-human antibody is respectively upstream of each gene encoding CH or CL of human antibody of the recombinant antibody expression vector obtained in (1).
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning each of the encoded cDNAs.
  • the base sequence of the linking portion encodes an appropriate amino acid, and VH and VL cDNAs designed to have appropriate restriction enzyme recognition sequences are prepared.
  • the prepared VH and VL cDNAs are cloned so that they are expressed in an appropriate form upstream of each gene encoding the human antibody CH or CL of the humanized antibody expression vector obtained in (1). Then, a human chimeric antibody expression vector is constructed.
  • a recombinant antibody expression vector obtained in (1) by amplifying cDNA encoding non-human antibody VH or VL by a PCR method using a synthetic DNA having an appropriate restriction enzyme recognition sequence at both ends, respectively. can also be cloned.
  • the amino acid sequence of the VH or VL FR of the human antibody to be transplanted with the VH or VL CDR amino acid sequence of the non-human antibody is selected. Any amino acid sequence can be used as long as it is derived from a human antibody.
  • human antibody FR amino acid sequences registered in databases such as Protein Data Bank, or common subsequences of human antibody FR subgroups [ALFDNA, US Dept. Health and Human Services (1991)] Is used.
  • an FR amino acid sequence having as high a homology as possible (at least 60% or more) with the VH or VL FR amino acid sequence of the original antibody is selected.
  • the amino acid sequence of CDR of the original antibody is transplanted to the amino acid sequence of VH or VL of the selected human antibody, respectively, and the amino acid sequence of VH or VL of the humanized antibody is designed.
  • the designed amino acid sequence is converted into a DNA sequence in consideration of the codon usage frequency [ALFDNA, US Dept. Health and Human Services (1991)] found in the base sequence of the antibody gene, and VH or VL of the humanized antibody DNA sequences encoding the amino acid sequences are designed respectively.
  • the amplified product is cloned into a plasmid such as pBluescript SK (-) (Stratagene), the base sequence is determined by the same method as described in (2), and the desired humanized antibody
  • a plasmid having a DNA sequence encoding the amino acid sequence of the full length of the H chain or the full length of the L chain is obtained.
  • a product obtained by synthesizing the full length VH and the full length VL as one long chain DNA based on the designed DNA sequence can be used in place of the PCR amplification product. Furthermore, by introducing a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme at both ends of the synthetic long-chain DNA, cDNA encoding the humanized antibody VH or VL can be easily transferred to the humanized antibody expression vector obtained in (1). Can be cloned.
  • a humanized antibody can only have its antigen-binding activity by transplanting only the VH and VL CDRs of a non-human antibody into the VH and VL FRs of a human antibody. [BIO / TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)].
  • the amino acid residues directly involved in binding to the antigen the amino acid residues that interact with the CDR amino acid residues, and the antibody Reduced antigen binding by identifying amino acid residues that maintain conformation and indirectly participate in antigen binding and replace those amino acid residues with the amino acid residues of the original non-human antibody
  • the activity can be increased.
  • amino acid residues of FR of human antibody VH and VL can be substituted by performing the PCR reaction described in (4) using the synthetic DNA for modification.
  • the base sequence is determined by the method described in (2) and it is confirmed that the target modification has been performed.
  • the humanized antibody expression vector obtained in (1) is cloned upstream of each gene encoding the human antibody CH or CL so that they are expressed in an appropriate form.
  • Any host cell capable of expressing the recombinant antibody can be used as the host cell into which the expression vector is introduced.
  • COS-7 cells ATCC number: CRL1651
  • CRL1651 Method of introducing an expression vector into COS-7 cells
  • the DEAE-dextran method Method of introducing an expression vector into COS-7 cells
  • the lipofection method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 ( 1987)].
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant are determined by enzyme-linked immunosorbent assay (Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), monoclonal antibody experiment manual, Kodansha Scientific (1987)], etc.
  • Any host cell capable of expressing a recombinant antibody can be used as a host cell into which the recombinant antibody expression vector is introduced.
  • CHO-K1 ATCC number: CCL-61
  • DUkXB11 ATCC number: CCL-9096
  • Pro-5 ATCC number: CCL-1781
  • CHO-S Life Technologies, Cat # 11619
  • mouse myeloma cell NS0 mouse myeloma cell SP2 / 0-Ag14 (ATCC number: CRL1581)
  • mouse P3-X63-Ag8653 cell ATCC number: CRL1580
  • dihydrofolate reductase gene CHO cells [Proc.fNatl. Acad. ⁇ Sci.
  • DHFR Dihydroformate Reductase
  • a transformant that stably expresses the recombinant antibody is selected by culturing in an animal cell culture medium containing a drug such as G418 sulfate (Japanese Patent Application Laid-Open No. 02-257891). ). *
  • Examples of the medium for animal cell culture include RPMI1640 medium (Invitrogen), GIT medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), EX-CELL301 medium (JRH), IMDM medium (Invitrogen), Hybridoma-SFM medium (Invitrogen), Or the culture medium etc. which added various additives, such as FBS, to these culture media are used.
  • RPMI1640 medium Invitrogen
  • GIT medium Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • EX-CELL301 medium JRH
  • IMDM medium Invitrogen
  • Hybridoma-SFM medium Invitrogen
  • the culture medium etc. which added various additives, such as FBS, to these culture media are used.
  • the resulting transformant is cultured in a medium to express and accumulate the recombinant antibody in the culture supernatant.
  • the expression level and antigen-binding activity of the recombinant antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA or the like.
  • the expression level of the recombinant antibody produced by the transformed strain can be increased using a DHFR amplification system (Japanese Patent Laid-Open No. 02-257891).
  • the recombinant antibody is purified from the culture supernatant of the transformant using a protein A-column [Monoclonal-Antibodies-Principles-and-practice, Third-edition, Academic-Press> (1996); Antibodies-A Laboratory, Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
  • methods used in protein purification such as gel filtration, ion exchange chromatography, and ultrafiltration can be combined.
  • the molecular weight of the purified recombinant antibody H chain, L chain or whole antibody molecule is determined by polyacrylamide gel electrophoresis [Nature, 227, 680 (1970)] or Western blotting [Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, “Academic” Press (1996); “Antibodies-A” Laboratory “Manual”, “Cold” Spring “Harbor Laboratory” (1988)].
  • the binding activity to a human CRTH2-expressing cell line is, for example, 1. (6) It can be measured using a fluorescent antibody method such as a binding reaction detection system using flow cytometry [Cancer Immunol.Immunother., 36, 373 (1993)].
  • CDC activity or ADCC activity against a human CRTH2 positive cultured cell line can be measured by a known measurement method [Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993); Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)].
  • Method for controlling effector activity of antibody As a method for controlling the effector activity of the monoclonal antibody of the present invention, it exists at the reducing end of the N-linked complex sugar chain that binds to the 297th asparagine (Asn) of the Fc region of the antibody. Method for controlling the amount of fucose (also referred to as core fucose) that binds ⁇ 1,6 to N-acetylglucosamine (GlcNAc) (International Publication No. 2005/035586, International Publication No. 2002/31140, International Publication No. 00/61739) Alternatively, a method of controlling by modifying amino acid residues in the Fc region of an antibody is known. The effector activity can be controlled by any method using the monoclonal antibody of the present invention.
  • the effector activity refers to antibody-dependent activity caused through the Fc region of an antibody, and includes ADCC activity, CDC activity, or antibody-dependent phagocytosis by phagocytic cells such as macrophages or dendritic cells (Antibody-dependent phagocytosis). , ADP activity) and the like are known.
  • inflammatory cells for example, inflammatory cells as a target, human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) as an effector, and inflammatory cell-specific antibodies are mixed and incubated for about 4 hours, and then an indication of cytotoxicity Lactate dehydrogenase (LDH) released as can be measured.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • LDH cytotoxicity Lactate dehydrogenase
  • human PBMC is mixed with an antibody recognizing a blood cell-specific antigen such as CD20, and after incubation, the decrease in the number of cells by measuring free LDH or flow cytometry is measured as effector activity. Can do.
  • the effector activity of the antibody can be increased or decreased.
  • a method for reducing the content of fucose bound to an N-linked complex sugar chain bound to Fc of an antibody include, for example, a method of expressing an antibody using CHO cells deficient in ⁇ 1,6-fucose transferase gene An antibody to which fucose is not bound can be obtained.
  • Antibodies without fucose binding have high ADCC activity.
  • an antibody is expressed using a host cell into which an ⁇ 1,6-fucose transferase gene has been introduced. And an antibody to which fucose is bound can be obtained.
  • An antibody to which fucose is bound has a lower ADCC activity than an antibody to which fucose is not bound.
  • ADCC activity or CDC activity can be increased or decreased by modifying amino acid residues in the Fc region of the antibody.
  • the CDC activity of an antibody can be increased by using the amino acid sequence of the Fc region described in US Patent Publication No. 2007/0148165. *
  • ADCC activity or CDC activity may be increased or decreased. it can.
  • the antibody of the present invention is subjected to amino acid modification described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-165716, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2012-021004, etc. in accordance with the amino acid modification and sugar chain modification in the antibody constant region described above. Also included are antibodies whose blood half-life is controlled by controlling reactivity to Fc receptors.
  • the antibody of the present invention can be used for treatment of diseases related to human CRTH2.
  • the administration route include oral administration, and parenteral administration such as intraoral, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, or intraperitoneal.
  • parenteral administration such as intraoral, intratracheal, rectal, subcutaneous, intramuscular, intravenous, or intraperitoneal.
  • the dosage form include sprays, capsules, tablets, powders, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, or tapes.
  • Suitable formulations for oral administration include, for example, emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, or granules.
  • Liquid preparations such as emulsions or syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol or fructose, glycols such as polyethylene glycol or propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil or soybean oil, p-hydroxybenzoic acid Manufactured using preservatives such as esters, or flavors such as strawberry flavor or peppermint as additives.
  • Capsules, tablets, powders or granules include excipients such as lactose, glucose, sucrose or mannitol, disintegrants such as starch or sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate or talc, polyvinyl alcohol, hydroxy A binder such as propylcellulose or gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin is used as an additive.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, and sprays.
  • Injection is manufactured using a carrier composed of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are produced using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat, or carboxylic acid.
  • the propellant is manufactured using a carrier that does not irritate the recipient's oral cavity and airway mucosa, and in which the monoclonal antibody of the present invention or the antibody fragment is dispersed as fine particles to facilitate absorption.
  • a carrier for example, lactose or glycerin is used. It can also be produced as an aerosol or dry powder.
  • Disease diagnosis method using the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof Diseases associated with human CRTH2 by detecting or measuring cells expressing human CRTH2 or human CRTH2 using the antibody or the antibody fragment of the present invention Can be diagnosed.
  • Diagnosis of allergic disease which is one of the diseases related to human CRTH2 is performed by, for example, using a flow cytometer to express human CRTH2 expressed in inflammatory cells present in peripheral blood, sputum, nasal discharge or alveolar lavage fluid derived from a patient. It can carry out by detecting using immunological techniques, such as.
  • the immunological technique is a method for detecting or measuring the amount of antibody or the amount of antigen using a labeled antigen or antibody.
  • a radioactive substance-labeled immunoantibody method an enzyme immunoassay method, a fluorescence immunoassay method, a luminescence immunoassay method, a Western blot method, or a physicochemical method is used.
  • the radioactive substance-labeled immunoantibody method is, for example, a method in which an antibody of the present invention or the antibody fragment thereof is reacted with an antigen or a cell expressing the antigen and further reacted with a radiolabeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment. Measure with a scintillation counter.
  • an antigen or a cell expressing the antigen is reacted with the antibody of the present invention or the antibody fragment, and further, a labeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment is reacted, and then a coloring dye. Is measured with an absorptiometer. For example, a sandwich ELISA method is used. *
  • a known enzyme label [enzyme immunoassay, Medical School (1987)] can be used.
  • enzyme immunoassay Medical School (1987)
  • alkaline phosphatase label, peroxidase label, luciferase label, biotin label or the like is used.
  • the sandwich ELISA method is a method in which after binding an antibody to a solid phase, an antigen to be detected or measured is trapped, and a second antibody is reacted with the trapped antigen.
  • the ELISA method two types of antibodies or antibody fragments that recognize an antigen to be detected or measured and having different antigen recognition sites are prepared, and the first antibody or antibody fragment is pre-plated on a plate (for example, 96 Next, the second antibody or antibody fragment is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or biotin.
  • the above-mentioned antibody-adsorbed plate is reacted with cells or a lysate thereof, tissue or a lysate thereof, cell culture supernatant, serum, pleural effusion, ascites or ocular fluid, etc.
  • the detected monoclonal antibody or antibody fragment is reacted, and a detection reaction corresponding to the labeling substance is performed.
  • the antigen concentration in the test sample is calculated from a calibration curve prepared by diluting antigens with known concentrations stepwise.
  • an antibody used for the sandwich ELISA method either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used, and an antibody fragment such as Fab, Fab ′, or F (ab ′) 2 may be used.
  • the combination of two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of monoclonal antibodies or antibody fragments that recognize different epitopes, or a combination of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody or antibody fragment.
  • Fluorescence immunoassay is performed by the method described in the literature [Monoclonal Antibodies-Principles and Practices, Third Edition, Academic Press (1996), Monoclonal Antibody Experiment Manual, Kodansha Scientific (1987)].
  • a label used in the fluorescence immunoassay for example, a known [fluorescent antibody method, Soft Science (1983)] fluorescent label can be mentioned.
  • fluorescent label for example, fluorescein isothiocyanate (FITC), tetramethylrhodamine isothiocyanate (RITC), etc. are mentioned.
  • Luminescent immunoassay is performed by the method described in the literature [Bioluminescence and chemiluminescence, clinical examination 42, Yodogawa Shoten (1998)].
  • Examples of the label used in the luminescence immunoassay include known phosphor labels, such as acridinium ester and lophine.
  • antigens or cells expressing the antigens are fractionated by SDS (sodium dodecyl sulfate) -PAGE [Antibodies-A Laboratory, Cold, Spring, Harbor Laboratory, (1988)], and the gel is then washed with polyvinylidene fluoride (PVDF).
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • a cell or tissue expressing a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is lysed, and 0.1 to 30 ⁇ g of protein per lane is electrophoresed by SDS-PAGE under reducing conditions.
  • the migrated protein is transferred to a PVDF membrane and reacted with 1-10% BSA-PBS for 30 minutes at room temperature to perform a blocking operation.
  • the antibody of the present invention was reacted, washed with PBS containing 0.05 to 0.1% Tween-20 (hereinafter referred to as Tween-PBS), and peroxidase-labeled goat anti-mouse IgG was allowed to stand at room temperature for 2 hours. React.
  • the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is detected by washing with Tween-PBS and detecting the band to which the monoclonal antibody is bound using ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham) or the like.
  • ECL Western Blotting Detection Reagents Amersham
  • an antibody capable of binding to a polypeptide that does not have a natural three-dimensional structure is used.
  • the physicochemical method is performed by, for example, forming an aggregate by binding human CRTH2 as an antigen and the monoclonal antibody or the antibody fragment of the present invention, and detecting the aggregate.
  • Other physicochemical methods include, for example, the capillary method, the one-dimensional immunodiffusion method, the immunoturbidimetric method, or the latex immunoturbidimetric method [Presentation of clinical testing method, Kanbara Publishing (1998)].
  • Latex immunoturbidimetry is a method in which an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m is used to cause an antigen-antibody reaction with the corresponding antigen or antibody. Scattered light increases and transmitted light decreases. By detecting this change as absorbance or integrating sphere turbidity, the antigen concentration or the like in the test sample is measured.
  • an antibody or antigen-sensitized carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m
  • Examples of the method for determining the therapeutic efficacy of the antibody before the start of treatment using the antibody of the present invention or the antibody fragment include the following.
  • the antibody of the present invention or the antibody fragment is added to the suspension, and after a certain time, inflammatory cells
  • the anti-inflammatory cell activity is measured, including the removal activity and the inhibitory activity against biological function molecules such as Th2-type cytokines.
  • anti-inflammatory cell activity is detected as a result of the measurement, it is determined before the start of treatment that the antibody of the present invention or the antibody fragment thereof is effective for treating a patient having peripheral blood, sputum, nasal discharge, etc. be able to.
  • Example 1 Construction of human CRTH2-expressing cells (1) Preparation of human CRTH2 expression vector The cDNA of human CRTH2 (hereinafter sometimes referred to as CRTH2) was totally synthesized and used in the subsequent tests. The cDNA sequence of human CRTH2 is described in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence is described in SEQ ID NO: 2.
  • the human CRTH2 gene expression pKANTEX93 vector prepared in (1)-(i) was cleaved by restriction enzyme AatII treatment, and the obtained linear DNA was purified and dissolved in sterilized water.
  • This DNA was introduced into CHO / DG44 cells by electroporation and cultured in IMDM culture medium from which HT supplement was removed for about 3 days.
  • IMDM drug-resistant cells
  • IMDM selection medium 10% dFBS, 0.5 mg / mL G418 (Nacalai Tesque) and 50 ⁇ g / mL gentamicin (Nacalai Tesque).
  • the selected drug resistant cells were seeded in a 96-well plate at 75 cells / plate and further cultured in IMDM selective medium for about 2 weeks. Each well was observed under a microscope, and single clones were sequentially expanded and cultured.
  • the obtained drug-resistant cells were detached with 0.02% EDTA solution (Nacalai Tesque), washed with PBS (phosphate buffered saline), 2% fetal bovine serum (FBS), 0.05% NaN 3 and 1 mM. It was suspended in PBS containing EDTA (Staining Medium, hereinafter abbreviated as SM). Next, it seed
  • PE labeled anti-human CRTH2 antibody (Beckman Coulter, Inc.) prepared in SM was added and reacted at 4 ° C. for 1 hour. After washing the cells, the cells were suspended in SM and the fluorescence intensity was analyzed with a flow cytometer (BD Bioscience, FACS Canto II). A clone that highly expresses human CRTH2 was selected, and this cell was designated as a human CRTH2-expressing CHO / DG44 cell.
  • the FLAG-fused human CRTH2 gene expression pKANTEX93 vector prepared in (3)-(ii) was cleaved by restriction enzyme AatII treatment, and the resulting linear DNA was purified and dissolved in sterile water.
  • This DNA was introduced into 3Y1-B cells by the Lipofection method using Fugene 6 (Promega) and cultured in DMEM culture medium for about 3 days. Thereafter, drug-resistant cells were selected with DMEM (hereinafter, DMEM selective medium) supplemented with 10% FBS, 0.8 mg / mL G418 (Nacalai Tesque) and 50 ⁇ g / mL gentamicin (Nacalai Tesque).
  • the obtained drug-resistant cells were detached with 0.05% trypsin solution (Invitrogen), washed with PBS, and suspended in SM. Next, it seed
  • the removed iliac lymph nodes were ground with a glass slide to loosen the tissue.
  • This iliac lymph node tissue was suspended in Minimum Essential Media (MEM) (Invitrogen) and passed through a cell strainer to remove excess tissue. The supernatant was removed by centrifuging at 1200 rpm for 5 minutes, and then suspended again in MEM to obtain iliac lymph node cells.
  • MEM Minimum Essential Media
  • the mouse myeloma cell line P3-U1 (ATCC) of 1/5 cells was mixed with the obtained iliac lymph node cells. After removing the supernatant by centrifugation, 1 mL each of 500 ⁇ L of PEG solution [Polyethylene glycol 1000 (Pure Chemical Co., Ltd.) and MEM was mixed while warming in a 37 ° C. warm bath, and DMSO (dimethyl sulfoxide) (Sigma Aldrich). Was added gently, 1 mL of MEM was added 5 times every minute, and then 45 mL of MEM was further added.
  • PEG solution Polyethylene glycol 1000 (Pure Chemical Co., Ltd.) and MEM was mixed while warming in a 37 ° C. warm bath, and DMSO (dimethyl sulfoxide) (Sigma Aldrich).
  • HAT medium 500 mL of RPMI-1640 (Wako Pure Chemical Industries), 10 mL of HAT (hypoxanthine (H), aminopterin (A)]. , Thymidine (T) solution (GIBCO), 0.5 mL 55 mmol / L 2-Mercaptoethanol (Invitrogen), 50 mL fetal bovine serum (Molegate Biotech), and 0.5 mL 10 mg / mL gentamicin solution (Nacalai) Sustained with Tesque), seeded in a 96-well plate, and cultured.
  • the cells were washed, suspended in 100 ⁇ L of Anti-rat IgG (Fc) -Dylight 488 (abcam) diluted 300 times with SM, and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. After washing the cells again, the cells were suspended in SM, and the fluorescence intensity was analyzed by flow cytometry (BD Bioscience, FACS Canto II).
  • Fc Anti-rat IgG
  • abcam Anti-rat IgG-Dylight 488
  • Hybridomas in wells in which a reaction specific to human CRTH2-expressing CHO / DG44 cells was observed were mixed with 0.5 mL of a 10 mg / mL gentamicin solution (Nacalai Tesque) in a cloning medium [S-Clone Cloning Medium CM-B (Edia)). Single cell cloning by limiting dilution method was performed twice using 5 ml of HT supplement (Gibco)]. Finally, a hybridoma Lym2 clone (hereinafter referred to as hybridoma Lym2) showing the strongest flow cytometry reactivity in human CRTH2-expressing CHO / DG44 cells was established.
  • Lym2 antibody the rat anti-human CRTH2 monoclonal antibody contained in the culture supernatant of the hybridoma Lym2 is a rat IgG2b antibody.
  • Hybridoma Lym2 was cultured for 1 week in a medium in which 5% Fetal Bovine Serum Ultra Low IgG (Invitrogen) was added to Hybridoma-SFM (Invitrogen). The culture supernatant was collected and subjected to purification.
  • the Lym2 antibody was purified from the culture supernatant using Prosep-G (GE Healthcare). First, the culture supernatant was loaded onto the column, the column was washed with PBS, and then eluted with pH 5.0, 3.5 and 3.0 elution buffers (0.1 M citric acid monohydrate-NaOH / pH 5.0, 3.5 and 3.0) were eluted in order. The eluted fraction was immediately neutralized with a neutralization buffer (2M Tris-HCl / pH 8.5).
  • a neutralization buffer (2M Tris-HCl / pH 8.5).
  • the absorbance (280 nm) of each fraction was measured, and a continuous fraction having a high measured value was recovered as an antibody fraction. Dialyzed with PBS, and passed through a 0.22 ⁇ m filter as purified protein. The concentration was calculated by setting the extinction coefficient at 280 nm to 1.4.
  • Example 3 Antigen binding evaluation of Lym2 antibody by flow cytometry FLAG-fused human CRTH2-expressing 3Y1-B cells were detached with 0.05% trypsin solution (Invitrogen), washed with PBS, and then suspended in SM. Next, it seed
  • trypsin solution Invitrogen
  • Example 4 Cloning of Lym2 Antibody Heavy Chain and Light Chain Variable Region Genes Using RNAiso plus (Takara Bio Inc.), hybridoma Lym2 washed with PBS was dissolved according to the attached instructions to prepare total RNA. The obtained total RNA was dissolved in DEPC treated water (Invitrogen). Next, using the Oligotex-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit (From Total RNA) (Takara Bio Inc.), mRNA was purified from the obtained total RNA according to the attached instructions. Further, cDNA was prepared from the purified mRNA using SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) according to the attached instruction.
  • the rat IgG2b heavy chain gene was converted into primers Ratk-A (SEQ ID NO: 10) and Ratk-B.
  • each rat light chain ( ⁇ chain) gene was amplified by PCR. The amplified gene was subcloned and the nucleotide sequence was analyzed.
  • VH and VL base sequences and amino acid sequences of the Lym2 antibody including the signal sequence were identified.
  • the nucleotide sequences of VH and VL are shown in SEQ ID NOs: 12 and 14, and amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 13 and 15, respectively.
  • the VH and VL sequences of Lym2 antibody not containing a signal sequence were identified.
  • the base sequences of VH and VL excluding the signal sequence are shown in SEQ ID NOs: 16 and 18, and amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 17 and 19, respectively.
  • the amino acid sequences of the VH CDR1, CDR2, and CDR3 of the Lym2 antibody are shown in SEQ ID NOs: 20, 21, and 22, respectively.
  • the amino acid sequences of the VL CDR1, CDR2, and CDR3 of the Lym2 antibody are shown in SEQ ID NO: 23, respectively. 24 and 25.
  • VH was used using primer chLym2VH-A (SEQ ID NO: 28) and primer chLym2VH-B (SEQ ID NO: 29), primer chLym2VL-A (SEQ ID NO: 30) and primer chLym2VL-B (SEQ ID NO: 31).
  • VL was amplified by PCR using primer chLym2VH-A (SEQ ID NO: 28) and primer chLym2VH-B (SEQ ID NO: 29), primer chLym2VL-A (SEQ ID NO: 30) and primer chLym2VL-B (SEQ ID NO: 31).
  • VL was amplified by PCR using primer chLym2VH-A (SEQ ID NO: 28) and primer chLym2VH-B (SEQ ID NO: 29), primer chLym2VL-A (SEQ ID NO: 30) and primer chLym2VL-
  • the gene fragment was subjected to agarose gel electrophoresis and purified by QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Using this fragment, human ⁇ chain constant region expression vector (BglII / BsiWI treatment) and human heavy chain (IgG1) constant region expression vector (Sal1 / Nhe1 treatment), a vector by In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) Subcloning was performed according to the attached instructions.
  • E. coli DH5 ⁇ competent cells (Takara Bio Inc.) were transformed, and plasmid extraction and sequence confirmation were performed to prepare a rat / human chimeric Lym2 antibody (hereinafter referred to as chLym2) expression vector.
  • chLym2 antibody expression vector (mixture of light chain expression vector and heavy chain expression vector 1: 2) prepared in (1) was added to 20 mL of Opti-Pro SFM (Invitrogen), and 312. 5 ⁇ L of Freestyle MAX Reagent (Invitrogen) was dissolved in 20 mL of Opti-Pro SFM and left at room temperature for 5 minutes. The two solutions were mixed and left at room temperature for 15 minutes. The total amount of the mixed solution was added to 250 mL of a host cell culture solution (1 ⁇ 10 6 cells / mL) to obtain a chLym2 transient expression cell line.
  • a host cell culture solution (1 ⁇ 10 6 cells / mL
  • ChLym2 was purified from the prepared culture supernatant using MabSelect SuRe (GE Healthcare). First, the culture supernatant was loaded onto the column, the column was washed with PBS, and then eluted with pH 5.0, 3.5, 3.0 elution buffer (0.1 M citric acid monohydrate-NaOH / pH 5.0, 3.5, 3.0). The eluted fraction was immediately neutralized with a neutralization buffer (2M Tris-HCl / pH 8.5).
  • the absorbance at 280 nm (A 280 ) of each fraction was measured, and a continuous fraction having a high measured value was recovered as an antibody fraction.
  • the antibody fraction was dialyzed with PBS, and the purified protein was filtered through a 0.22 ⁇ m filter. The concentration was calculated by setting the extinction coefficient at 280 nm to 1.37.
  • Example 6 Preparation of humanized antibody (1) Design of humanized Lym2 antibody heavy and light chain variable regions (i) Design of amino acid sequence of VL and VH of humanized Lym2 antibody The amino acid sequence of VL of humanized Lym2 antibody is as follows: Designed. First, the VL FR amino acid sequence of a human antibody suitable for transplantation of the VL CDR1-3 amino acid sequences of the Lym2 antibody (SEQ ID NOs: 23, 24, 25) was selected as follows.
  • the amino acid sequence of VH of the humanized Lym2 antibody was designed as follows.
  • the FR amino acid sequence of human antibody VH suitable for transplantation of VH CDR1 to 3 amino acid sequences of Lym2 antibody was selected as follows. Similar to VL, a human antibody sequence having high homology with the FR sequence of Lym2's VH was searched from the BLASTP database.
  • GeneBank ID: AAY333331.1 was the human antibody sequence with the highest homology, so the FR of this antibody was selected.
  • HV0 SEQ ID NO: 49
  • the amino acid sequence LV0 of the VL of the humanized Lym2 antibody designed above and the amino acid sequence HV0 of the VH were transplanted only with the amino acid sequence of the CDR derived from the rat monoclonal antibody Lym2 into the FR amino acid sequence of the selected human antibody. Is an array.
  • the binding activity is often reduced simply by transplanting the CDR amino acid sequence of a rodent-derived antibody to the FR of a human antibody.
  • LV0HV0 the three-dimensional structure of the antibody variable region (hereinafter referred to as LV0HV0) composed of the amino acid sequence LV0 of the VL of the humanized Lym2 antibody designed above and the amino acid sequence HV0 of VH using a computer modeling technique. It was constructed.
  • a computer model of the three-dimensional structure of the variable region of Lym2 antibody was also constructed in the same manner. Furthermore, amino acid residues different from the Lym2 antibody are selected from the VL0HV0 VL and VH FR amino acid sequences, and amino acid sequences modified to the Lym2 antibody amino acid residues are prepared. Similarly, a three-dimensional structural model is prepared. Built. The three-dimensional structures of the variable regions of the Lym2 antibody, LV0HV0, and the variant thus produced were compared, and amino acid residues predicted to affect the binding activity of the antibody were identified.
  • LV0 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33. 2nd Ile, 4th Met, 15th Pro, and 85th Ala, in HV0, 18th Leu of amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, 77th Asn, 93rd Val, and 117th Of Thr were selected respectively.
  • amino acid modification is performed to replace at least one amino acid sequence with an amino acid residue present at the same site of Lym2 antibody, and VL and VH of humanized antibodies having various modifications are changed. Designed. Specifically, for VL, the second Ile of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 is replaced with Val, the fourth Met is replaced with Leu, the 15th Pro is replaced with Leu, or the 85th Ala is replaced with Pro. Among amino acid modifications, at least one modification was introduced.
  • the humanized Lym2 antibodies containing the above-mentioned variable regions are designated as LV0HV0, LV1HV0, LV2aHV0, LV2bHV0, LV2cHV0, V4H4V4 Abbreviated as LV0HV1, LV0HV2a, LV0HV2b, and LV0HV3.
  • Light chain variable region LV0 (SEQ ID NO: 33), LV1 (SEQ ID NO: 35), LV2a (SEQ ID NO: 37), LV2b (SEQ ID NO: 39), LV2c (SEQ ID NO: 41), LV3a (SEQ ID NO: 43), LV3b (SEQ ID NO: 43) 45), LV4 (SEQ ID NO: 47), and heavy chain variable region HV0 (SEQ ID NO: 49), HV1 (SEQ ID NO: 51), HV2a (SEQ ID NO: 53), HV2b (SEQ ID NO: 55), HV3 (SEQ ID NO: 57), The amino acid sequence of HV4 (SEQ ID NO: 59) is shown in FIGS. 1 and 2, respectively.
  • variable region gene of humanized Lym2 antibody The base sequence encoding the amino acid sequence of the variable region of humanized antibody was designed using codons frequently used in animal cells. Using these base sequences, the following humanized Lym2 antibody expression vector was constructed and the corresponding antibody was expressed.
  • a humanized Lym2 antibody expression vector was constructed according to the method described in Example 5- (1). That is, SEQ ID NOs: 32, 34, 36, and 38 encoding the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, and 59, respectively. , 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 and 58, and the corresponding VL and VH gene fragments were synthesized using the primers shown in SEQ ID NOs: 28-31. Amplified by PCR. The gene fragment was subjected to agarose gel electrophoresis and purified by QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • This VL or VH fragment was expressed in human kappa chain constant region expression vector (BglII / BsiWI treatment) and human heavy chain (IgG1) constant region expression using In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) according to the attached instructions. Subcloning into a vector (Sal1 / Nhe1 treatment) was performed. Escherichia coli DH5 ⁇ competent cell (Takara Bio Inc.) is transformed with the prepared vector, plasmid extraction and sequence confirmation are performed, colonies with the correct sequence inserted are selected, and plasmids are used for transient expression. Mass preparation was performed.
  • the culture volume was 200 mL, and the cells were cultured for 5 days under the conditions of 37 ° C., 8% CO 2 and 125 rpm. After the culture, the cell suspension was centrifuged, and the culture supernatant containing the humanized Lym2 antibody was collected through a 0.2 ⁇ m filter (Thermo Scientific).
  • Humanized Lym2 antibody was purified by affinity purification using MabSelect SuRe (GE Healthcare) shown below. After the resin was equilibrated with PBS, the culture supernatant obtained in (3) was loaded and washed twice with PBS.
  • the antibody was eluted using an elution buffer (20 mM citric acid, 50 mM NaCl, pH 3.4), and neutralized by adding 1/10 volume of neutralization buffer (1M phosphate-NaOH, pH 7.0). . Subsequently, the buffer was replaced with PBS using NAP25 (GE Healthcare). It was concentrated by ultrafiltration using Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units (Millipore), and measuring the Nanodrop8000 absorbance at 280nm using (Thermo Scientific, Inc.) (A 280), density measurement and preparation of antibody solution Went.
  • Example 7 Antigen binding activity of chLym2 and humanized Lym2 antibody FLAG-fused human CRTH2-expressing 3Y1-B cells were detached with 0.25% Trypsin-EDTA (Nacalai Tesque), washed with PBS, and then suspended in SM. The cells are then seeded in 96-well plates at 1 ⁇ 10 5 cells per well, and 50,000, 12500, 3125, 781, 195, 49, 12, and 3 ng / mL final concentrations of chLym2 or humanized, respectively. Lym2 antibody was added and a reaction was performed at 4 ° C. for 60 minutes.
  • Example 8 Depletion activity of chLym2 and humanized Lym2 antibody against eosinophils and basophils Human peripheral blood collected by adding heparin sodium injection was centrifuged at 4 ° C. and 1500 rpm for 30 minutes to collect plasma.
  • PBS Nacalai Tesque
  • erythrocytes erythrocytes
  • 1 mL of the suspension is added to a solution for hemolysis [10 ⁇ RBC Lysis buffer (e-bioscience). 10 ml diluted with sterilized water] was added and mixed by inversion. After standing at room temperature for 10 minutes, centrifugation was performed at room temperature, 1500 rpm, and 5 minutes, the supernatant was removed, and the plate was washed twice with PBS.
  • the cell pellet is suspended in the collected plasma and seeded on a 48-well plate at 300 ⁇ L / well, 1000, 100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.4 and 0.01 ng / mL.
  • DNP dinitrophenol
  • PE anti-human Siglec-8 Antibody BioLegend
  • PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD123 BD Biotechnology for basophil detection
  • Anti-Human Fc epsilon Receptor I alpha Fc ⁇ R1 APC (eBioscience) were added at 5 ⁇ L / well and reacted at 4 ° C. for 40 minutes.
  • Human eosinophils were detected as a 7-AAD negative single8-PE positive fraction in the granulocyte fraction developed by FSC-SSC. Human basophils were detected as 7-AAD negative, CD123-PC-Cy7 positive, and Fc ⁇ RI-APC positive fractions in the lymphocyte fraction developed by FSC-SSC. Cell depletion activity was assessed by analyzing the count of each cell per count of CountBright counts.
  • the evaluated humanized Lym2 antibodies LV0HV0, LV0HV1 and LV0HV2a are all cells against eosinophils and basophils equivalent to the chimeric Lym2 antibody chLym2. It became clear that it showed an injury activity.
  • Example 9 Preparation of anti-human CRTH2 antibody for comparison control (1) Preparation of anti-human CRTH2 antibody expression vector for comparison control And VL amino acid sequences (represented in SEQ ID NOs: 57 and 40, 64 and 52, 62 and 50, 63 and 51, and 65 and 53 in WO 2014/144865, respectively) The sequence was fully synthesized.
  • Example 5- (1) the above base sequences are incorporated into an antibody expression vector so as to be a combination of VH and VL of each antibody, and five types of humanized or chimeric anti-humans for comparison are used.
  • Expression vectors for CRTH2 antibodies (hu19A2, v52, hu8B1, v1, ch8B1, ch3C12 and ch31A5, respectively) were prepared.
  • Example 10 Epitope analysis of anti-human CRTH2 monoclonal antibody using human CRTH2 amino acid substitution expression cells (1) Preparation of human CRTH2 amino acid substitution expression vector Partial amino acid residues in the extracellular region of the amino acid sequence of human CRTH2 An expression vector of an amino acid substitution product substituted with another amino acid residue was prepared.
  • the symbol for amino acid substitution represents [one-letter code of amino acid residue before substitution] [position of substitution counted from N-terminal] [single-character code of amino acids
  • phmAG1-MNLinker (MBL) was used, and by inserting genes encoding various amino acid substitutions in which the stop codon was deleted at the restriction enzyme sites of BamHI and HindIII, the intracellular C-terminal region was inserted. Added thistle green tag.
  • the vector expressing the above amino acid substitution is 1) a method in which a gene sequence encoding the amino acid substitution is fully synthesized and inserted into the vector, or 2) the wild type human CRTH2 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is encoded. It was prepared by carrying out site-directed mutagenesis from a vector into which DNA was inserted.
  • CHO-S cells (Life Technologies) were used to prepare cell lines expressing human CRTH2 amino acid substitutes. For passage of cells, Free style CHO expression medium (Invitrogen) containing 8 mM L-Glutamine (Invitrogen) was used, and cultured under shaking at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Free style CHO expression medium Invitrogen
  • 8 mM L-Glutamine Invitrogen
  • 25 ⁇ g of the human CRTH2 amino acid substitution expression vector prepared in (1) was dissolved in 400 ⁇ L of Opti-Pro SFM (Invitrogen), and 25 ⁇ L of Freestyle MAX Reagent (Invitrogen) was dissolved in 400 ⁇ L of Opti-Pro SFM. And left at room temperature for 5 minutes. The two solutions were mixed and left at room temperature for 15 minutes. The mixed solution was added to the above CHO-S culture solution and cultured for 24 hours to obtain a human CRTH2 amino acid substituted expression cell line.
  • goat anti-Human IgG alexa 647 (Molecular Probes) diluted with SM is added to wells to which chLym2, LV0HV1, hu19A2, v52, hu8B1, v1, ch3C12 or ch31A5 have been added, and BM16 is added to wells to which BM16 has been added.
  • Goat anti-RatIgG alexa647 (Molecular Probes) diluted with SM was added at a final concentration of 10 ⁇ g / mL, and the reaction was performed at 4 ° C. for 1 hour.
  • the humanized Lym2 antibody LV0HV1 was produced by P12A, L14A and E15A; D177A, G178A and R179A; I180A and M181A; Y183A, Y184A and N185A; L187A, L188A and L189A; It became clear that the reactivity of D194A; R195A; or D196A and T198A to cells expressing human CRTH2 amino acid substitutions disappeared.
  • the other anti-human CRTH2 antibodies compared this time had significantly reduced reactivity to cells expressing human CRTH2 amino acid substitution products at sites different from the anti-human CRTH2 antibody of the present invention. It was revealed that the anti-human CRTH2 antibody recognizes a different epitope from the antibody of the present invention.
  • the reactivity of the existing anti-human CRTH2 antibody to the amino acid substitution expression cell containing G192A or D194A does not decrease. Since only the antibody had reduced reactivity to the cells, it was revealed that the anti-human CRTH2 antibody of the present invention binds to an epitope containing at least one amino acid residue of Gly192 and Asp194 of human CRTH2. .
  • Example 11 Evaluation of reactivity to human eosinophils An equal amount of physiological saline for injection was added to and mixed with human peripheral blood collected by adding heparin sodium injection. 15 mL of Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 (GE Healthcare) was added to a 50 mL centrifuge tube, 30 mL of the above-described human peripheral blood diluted with physiological saline was layered, and centrifuged at 1500 rpm at room temperature for 30 minutes.
  • MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotech
  • autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotech
  • eosinophils were isolated by the negative selection method using CD16 MicroBeads and human (Miltenyi Biotech) according to the attached instructions.
  • the isolated cells were washed with SM, seeded in a 96-well plate at 1 ⁇ 10 5 cells per well, and centrifuged at 2000 rpm for 2 minutes. After removing the supernatant, diluted with SM, 103.3, 1.1, 0.37, and 0.12 ⁇ g / mL final concentrations of Lym2 antibody, commercially available CRTH2 antibody BM16 (Santa cruz) or 301108 (R & D) was added and the reaction was carried out at 4 ° C. for 1 hour.
  • CELL LAB Mouse Anti-Rap Kappa (kappa light chain specific) FITC (Beckman Coulter) diluted with SM was added to wells to which Lym2 antibody or BM16 was added.
  • CELL LAB Goat Anti-Mouse IgG ( ⁇ chain specific) Fluorescein (FITC) Conjugate (Beckman Coulter, Inc.) diluted with SM was added at a final concentration of 10 ⁇ g / mL and reacted at 4 ° C. for 1 hour. After washing the cells again, the cells were suspended in SM, and the fluorescence intensity was analyzed by flow cytometry (BD Biosciences, FACS Canto II).
  • the rat anti-human CRTH2 antibody Lym2 has a stronger reactivity against human eosinophils than the commercially available rat anti-human CRTH2 antibody BM16 and mouse anti-human CRTH2 antibody 301108 (FIG. 8). .
  • Example 12 Reactivity of chLym2 to human basophils
  • an equal volume of physiological saline for injection was added and mixed.
  • 15 mL of Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 (GE Healthcare) was added to a 50 mL centrifuge tube, 30 mL of human peripheral blood diluted with physiological saline was layered, and centrifuged at 1500 rpm at room temperature for 30 minutes.
  • basophils were isolated by the negative selection method using Basophil Isolation Kit II, human (Miltenyi Biotech) according to the attached instructions.
  • the isolated cells were washed with SM, seeded in a 96-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells per well, and centrifuged at 2000 rpm for 2 minutes. After removing the supernatant, the cells were suspended in 100 ⁇ L of SM, and labeled according to the attached instructions using Zenon Alexa Fluor 647 Human IgG Labeling Kit (Molecular Probes). Isotype control antibody was added to a final concentration of 10 ⁇ g / mL, and a reaction was performed at 4 ° C. for 1 hour. After washing the cells, the cells were suspended in SM, and the fluorescence intensity was analyzed by flow cytometry (BD Bioscience, FACS Canto II).
  • Example 13 Reactivity of humanized Lym2 antibody against human CD4-positive T cells Mononuclear cell layer cells prepared according to Example 12 using Ficoll-Paque PREMIUM (GE Healthcare) instead of Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 The suspension was seeded in a 96-well plate at 100 ⁇ L / well, and biotinylated humanized Lym2 antibody LV0HV1 using EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weight Format (PIERCE) according to the attached instructions. was added to a final concentration of 10 ⁇ g / mL, and the reaction was performed at 4 ° C. for 1 hour.
  • Ficoll-Paque PREMIUM GE Healthcare
  • the lymphocytes were fractionated by FSC-SSC development, and further, the CD4 antibody was obtained with the fluorescence intensity of fluorescence staining with the humanized Lym2 antibody LV0HV1 on the vertical axis for the cell group fractionated with CD3 positive and CD4 positive cells.
  • the ratio of the reactive fraction of the humanized Lym2 antibody LV0HV1 in the CD3-positive CD4-positive cells was calculated by showing the fluorescence intensity of the fluorescence staining by ⁇ on the horizontal axis.
  • the humanized Lym2 antibody LV0HV1 reacted with about 2-3% of the CD3 positive CD4 positive T cell fraction (FIG. 10).
  • Example 14 Cytotoxic activity against eosinophils and basophils A cell suspension prepared in the same manner as in Example 8 was seeded on a 96-well plate at 95 ⁇ L / well and 1000, 10, 3, 1, 0.3,. A test antibody having a final concentration of 1 ng / mL was added and reacted at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 20 hours. As test antibodies, humanized Lym2 antibody LV0HV1, anti-human CRTH2 antibodies hu19A2 v52, hu8B1 v1, ch3C12 and ch31A5 prepared in Example 9 were used. Anti-DNP IgG1 antibody was used as an isotype control antibody.
  • SM was added to each well after reaction at 100 ⁇ L / well, and CountBright Absolute Counting Beads, for flow cytometry (Molecular Probes) was added as control beads at 20 ⁇ L / well, and centrifugation was performed at 4 ° C., 2000 rpm for 2 minutes. And the supernatant was removed. After washing with SM twice, 10000 ⁇ g / mL IgG from human serum (Sigma Aldrich) diluted with SM was added at 100 ⁇ L / well and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the same method as in Example 8 was performed.
  • humanized anti-human CRTH2 antibody LV0HV1 removed both eosinophil and basophil cells depending on the antibody concentration.
  • the existing anti-human CRTH2 antibody ch3C12 had a weaker cell-removing activity than the humanized anti-human CRTH2 antibody LV0HV1 [FIG. 11 (A) and FIG. 11 (B)]. Therefore, it is suggested that the anti-human CRTH2 antibody of the present invention can exert a therapeutic effect targeting eosinophils or basophils expressed by CRTH2.
  • Example 15 Cytotoxic activity against Th2 cells A mononuclear cell layer prepared in the same manner as in Example 13 was added to 1/10 volume FBS (Gibco), 200 mM-L-Glutamine Stock Solution (Nacalai Tesque), 10 mM MEM Non-Essential Amino Acids.
  • RPMI1MC RPMI1MC (hereinafter referred to as “RPMI1MC”) containing Solution (Gibco), 100 mM Sodium Pyruvate (Gibco), 1M HEPES Buffer Solution (Gibco) and 1/100 volume Penicillin-Streptomycin, Liquid (Gibco) washed twice with "peripheral blood mononuclear cell”) And, to prepare 1 ⁇ 10 7 cells / mL cell suspension.
  • RPMI1MC RPMI1MC
  • the prepared cell suspension is seeded in a 96-well plate at 100 ⁇ L / well, and chLym2 antibody, humanized anti-human CRTH2 antibody LV0HV1 or the isotype control antibody described in Example 8 is added at a final concentration of 10 ⁇ g / mL, at 37 ° C., 5 ° C. The reaction was allowed to proceed for 20 hours in a% CO 2 incubator.
  • the cells after the reaction were washed 7 times with PBMC culture medium, and the test antibody was sufficiently removed, then suspended in 100 ⁇ L of PBMC culture medium, and anti-CD3 antibody OKT3 (Abcam) was immobilized at a concentration of 1 ⁇ g / mL. Seeded on the plate. Thereafter, an anti-CD28 antibody (BD Bioscience) prepared to 2 ⁇ g / mL was added at 100 ⁇ L / well and allowed to react in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 3 days.
  • the chimeric anti-human CRTH2 antibody chLym2 and the humanized anti-human CRTH2 antibody LV0HV1 decreased the production of the Th2 cytokines IL-5 and IL-13, whereas the Th1 cytokine IFN- ⁇ was reduced. Production was not changed. That is, it was suggested that the antibody of the present invention selectively removes Th2 cells [FIG. 12 (A) and FIG. 12 (B)]. Therefore, it was suggested that the anti-human CRTH2 antibody of the present invention can exert a therapeutic effect targeting Th2 cells.
  • Example 16 Reactivity evaluation in the presence of ligand (293EBNA)
  • the human CRTH2 gene expression pAMoh vector prepared in Example 1- (1)-(ii) was introduced into 293EBNA cells (Invitrogen) using Fugene 6 (Promega), 10% FBS, 0.25 mg / mL G418 (Nacalai Tesque), 100 ⁇ g / mL penicillin, 100 U / mL streptomycin (Nacalai Tesque), and 300 ⁇ g / mL hygromycin B (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Was established.
  • Human CRTH2-expressing 293EBNA cells were detached with 0.02% EDTA solution (Nacalai Tesque), washed with PBS, and suspended in the above medium. Next, it seed
  • the antibody of the present invention has high reactivity even in the presence of a high concentration of ligand. Therefore, the anti-human CRTH2 antibody of the present invention can bind to human CRTH2-expressing cells in the presence of a ligand in the same manner as the reactivity in the absence of the ligand, and acts on the human CRTH2-expressing cells. It was suggested to be a useful antibody that can be used.
  • Example 17 Analysis of reactivity to differentiation-induced human mast cells Mast cells were prepared according to the method described in Nature Protocols 2006, 1 (4), 2178-2183. Mast cells at 11 weeks from the start of differentiation induction were washed with SM, seeded in a 96-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells per well, and PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody (manufactured by BioLegend) ), Brilliant Violet 421 (trademark) anti-human CD117 (c-kit) Antibody (manufactured by BioLegend), Anti-Human Fc epsilon Receptor I alpha (Fc ⁇ R1) PE (eBioscience) at 4 ° C. The reaction was performed. After washing the cells, the cells were suspended in SM, and the fluorescence intensity was analyzed by flow cytometry (BD Bioscience, FACS Canto II).
  • the mast cells that had undergone differentiation induction expressed all of mast cell surface markers CD203c, CD117, and Fc ⁇ RI.
  • Human IgE in which the constant region of the anti-DNP IgG1 antibody was recombined to IgE type was added at a final concentration of 10 ⁇ g / mL to the mast cell culture medium at 15 weeks from the start of differentiation induction, and 3% in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. The reaction was allowed for days.
  • the mast cells were added at a final concentration of 100 ⁇ g / mL penicillin, 100 U / mL streptomycin (Nacalai Tesque) and 55 ⁇ M ⁇ -ME (Gibco) IMDM (Gibco) (hereinafter abbreviated as basic culture medium). Washed twice, suspended in 4 mL of basic culture medium, added with final concentration of 10 ⁇ g / mL rabbit polyclonal anti human IgEantibody (Dako), and used MACS mix tube rotator (Milteny Biotech) at 37 ° C. using a 37 ° C. rotation. The reaction was allowed to proceed for 1 hour in a 5% CO 2 incubator.
  • basic culture medium Washed twice, suspended in 4 mL of basic culture medium, added with final concentration of 10 ⁇ g / mL rabbit polyclonal anti human IgEantibody (Dako), and used MACS mix tube rotator (Milteny Biotech) at 37 ° C. using a
  • the cells after the reaction were washed twice with SM, seeded in a 96-well plate at 5 ⁇ 10 4 per well, and centrifuged at 2000 rpm for 2 minutes. After removing the supernatant, 10000 ⁇ g / mL IgG from human serum (Sigma Aldrich) diluted with SM was added at 100 ⁇ L / well, reacted at 4 ° C.
  • hu19A2 v52 showed reactivity to mast cells, while antibodies other than hu19A2v52 containing LV0HV1 showed no reactivity.
  • Example 18 Analysis of reactivity to differentiation-inducing Th1 (1) Separation of naive T cells from PBMC 20 mL of PBMC culture medium containing frozen PBMC (Allcells) derived from healthy subjects and 50 ⁇ L of DNase I recombinant, RNase-free (Roche Diagnostics) The plate was washed once with, and suspended again in 20 mL of PBMC culture medium containing 50 ⁇ L of DNase I recombinant and RNase-free, and left in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 2 hours.
  • naive CD4 + T cell isolation kit II human (Miltenyi Biotech) was used to perform naive CD4 positive T cells by the negative selection method according to the attached instructions. Isolated. In order to increase the purity of naive CD4 positive T cells, the negative selection was performed twice.
  • the cells are collected, and the supernatant is removed by centrifugation. Then, the cells are suspended in culture medium at 1 ⁇ 10 6 cells / mL, and a final concentration of 100 ng / mL recombinant human IL-12 (Peprotech) is used as a growth step. , 10ng / mL recombinant human IL- 2 (peprotech Co.) and 5 [mu] g / mL added to 37 ° C. the anti-IL-4 antibody (BD Biosciences) was allowed to react for 3 days in a 5% CO 2 incubator.
  • the differentiation-inducing Th1 cells were established by repeating the above stimulation and proliferation processes three times in total.
  • dead cells were stained according to the attached instructions using LIVE / DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation (Molecular Probes), washed twice with PBS, the supernatant was removed, and Fixation Buffer ( BD Biosciences) for 4 minutes at 4 ° C.
  • PEanti-human IFN- ⁇ Antibody (BioLegend) with a final concentration of 2.5 ⁇ L, 5 ⁇ L of APC anti- Human IL-4 Antibody (BioLegend), 10 ⁇ L of anti-IL-5 antibodies APC (Miltenyi Biotech) and 20 ⁇ L of APC anti-human IL-13 Antibody (BioLegend) were added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. I let you.
  • the cells were washed twice with 1 ⁇ Perm / Wash Buffer, the cells were suspended in SM, and the fluorescence intensity was analyzed by flow cytometry (BD Bioscience, FACS Canto II).
  • Th1 differentiation-inducing Th1 was negative for IL-4 / 5/13 and 90% of the population was IFN ⁇ -positive population, and was confirmed to be a cell that selectively produces Th1 cytokines. .
  • Negative Control Mouse IgG2a (Dako) was used.
  • the rat anti-human CRTH2 antibody Lym2 and the commercially available rat anti-human CRTH2 antibody BM16 showed no reactivity to differentiation-inducing Th1.
  • commercially available mouse anti-human CRTH2 antibody 301108 showed reactivity to differentiation-inducing Th1.
  • the anti-human CRTH2 antibody of the present invention reacts with eosinophils, basophils and Th2 cells but does not react with Th1 cells.
  • 301108 exhibits non-specific reactivity in addition to cells expressing CRTH2.
  • Example 19 Evaluation of antagonistic activity of Lym2 antibody using morphological changes of human eosinophils as an index.
  • Eosinophils were separated from human peripheral blood by the same method as in Example 11.
  • the isolated human eosinophils were suspended in Dulbecco's phosphate buffered saline (hereinafter referred to as D-PBS ( ⁇ )) (Nacalai Tesque), and the suspension was maintained at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 1 hour 30 It was made to react for minutes. Then, it seed
  • D-PBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • an isotype control antibody [CELL LAB Rat IgG2b Isotype Control (Beckman Coulter)] at a final concentration of 10 ⁇ g / mL, or Lym2 antibody, or OC000459 (Cayman chemical) at a final concentration of 10 ⁇ M CRTH2 small molecule antagonist as a positive control is added.
  • the reaction was allowed to proceed for 30 minutes in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • DKKGD2 (Cayman chemical) at final concentrations of 0.1, 1, 10, 100, and 1000 nM was added, and further reacted at 37 ° C. in a 5% CO 2 incubator for 60 minutes. After the reaction, the plate was washed twice with ice-cold PBS, FixationBuffer (BD Bioscience) was added at 200 ⁇ L / well, suspended well, and left at 4 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the plate was washed twice with SM, and the eosinophil shape change was analyzed by flow cytometry (BD Bioscience, FACS Canto II).
  • the change in eosinophil morphology was analyzed using an increase in the Forward Scatter Light (FSC) plot, which is an index of cell size, cell surface area or cell diameter, in the analysis using a flow cytometer.
  • FSC Forward Scatter Light
  • the ratio (%) of eosinophils detected in the high FSC gate was calculated based on the acid sphere FSC.
  • the human CRTH2 ligand DKKGD2 induced a concentration-dependent eosinophil shape change
  • the CRTH2 small molecule antagonist OC000459 showed a DKKGD2-dependent eosinophil shape change. Suppressed.
  • neither the anti-human CRTH2 antibody Lym2 nor the isotype control antibody of the present invention inhibited DKKGD2-dependent eosinophil shape change. That is, it was suggested that the anti-human CRTH2 antibody of the present invention has no antagonist activity.
  • Example 20 Evaluation of agonist activity of Lym2 antibody using morphological change of human eosinophils as an index
  • rat anti-rats at 0, 0.01, 0.1, 1 and 10 ⁇ g / mL final concentrations were used.
  • Human CRTH2 antibody Lym2 was added and allowed to react for 1 hour to analyze eosinophil shape change.
  • the Lym2 antibody did not cause eosinophil shape change even when the antibody concentration was treated in the range of 0-10 ⁇ g / mL. That is, it was suggested that the anti-human CRTH2 antibody of the present invention has no agonist activity.
  • Example 21 Evaluation of anti-human CRTH2 antibody agonistic activity, antagonistic activity, and ligand enhancement activity using human eosinophil shape change as an index Separation of eosinophils from human peripheral blood by the same method as in Example 11. went. However, the operation of adding an equal amount of physiological saline for injection to the blood was not performed, and it was directly layered on Ficoll-Paque PREMIUM 1.084 (GE Healthcare). The isolated human eosinophils were suspended in D-PBS ( ⁇ ) (Nacalai Tesque) and reacted at 37 ° C. for 1 hour 30 minutes in a 5% CO 2 incubator.
  • hu19A2 v52 and BM16 enhanced the morphological changes induced by DKKGD2.
  • hu19A2 v52 was found to enhance the morphological change induced by 100 nM DKKGD2 up to about 2-fold.
  • the hu19A2 v52 and BM16 antibodies do not induce morphological changes in the absence of the ligand, suggesting that these antibodies have a signal enhancement activity by DCKGD2 which is a CRTH2 ligand.
  • LV0HV1 and 301108 did not show any effect on morphological changes in the absence or presence of DKKGD2, and thus did not have a signal enhancing activity by DKKGD2. It has been suggested.
  • the anti-human CRTH2 antibody of the present invention is preferable in that it does not block or enhance physiological signals.
  • Example 22 (1) Preparation of horseradish peroxidase (HRP) -labeled antibody Using Peroxidase Labeling Kit-NH2 (Dojindo) according to the package insert, human HRP was directly labeled on the modified Lym2 antibodies LV0HV1 and hu19A2 v52, and then diluted to 1 mg / mL with D-PBS ( ⁇ ) (Nacalai Tesque).
  • HRP horseradish peroxidase
  • an ELISA reaction solution supplemented with 500 ⁇ M GTP ⁇ S (Roche Diagnostics) or 500 ⁇ M GDP (Sigma-Aldrich) was added at 50 ⁇ L / tube and incubated at 30 ° C. for 1 hour.
  • IgG from human serum Sigma-Aldrich
  • 30% w / v BSA-PBS fatty acid free Wako
  • IgG from human serum Sigma-Aldrich
  • 30% w / v BSA-PBS fatty acid free Wako
  • IgG from human serum Sigma-Aldrich
  • 30% w / v BSA-PBS fatty acid free Wako
  • IgG from human serum Sigma-Aldrich
  • 30% w / v BSA-PBS fatty acid free Wi-
  • the HRP-labeled LV0HV1 or hu19A2 v52 prepared in (1) was diluted to 5 ⁇ g / mL with an ELISA reaction solution, added at 50 ⁇ L / tube, and then incubated at 30 ° C. for 1 hour to obtain a membrane fraction.
  • Antibody reaction against was carried out. After centrifugation at 16000 g for 30 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed.
  • the ELISA reaction solution with 100 ⁇ M GTP ⁇ S added to the tube to which GTP ⁇ S was originally added and the ELISA reaction solution with 100 ⁇ M GDP added to the tube to which GDP was added were each added at 1 mL / tube, and again 16000 g. After centrifugation at 4 ° C. for 30 minutes, the supernatant was removed. After the same operation was repeated 4 times, D-PBS ( ⁇ ) was added at 100 ⁇ L / tube to sufficiently suspend the membrane fraction.
  • the suspension was added to a 96-well plate at 30 ⁇ L / well, and 1-Step Ultra TMB-ELISA reagent (Thermo Scientific) was added at 100 ⁇ L / well. After reacting at room temperature for 10 minutes, 0.5 mol / L sulfuric acid (Wako) was added at 100 ⁇ L / well to stop the reaction.
  • 1-Step Ultra TMB-ELISA reagent Thermo Scientific
  • CRTH2 is a GPCR, and it is generally known that GTP is bound in an activated conformation and GDP is bound in an inactivated conformation. As described above, the anti-human CRTH2 antibody of the present invention did not change the reactivity to CRTH2 regardless of the treatment with GTP analog GTP ⁇ S or GDP. The possibility of showing a certain reactivity was suggested without being influenced.
  • Example 23 Preparation of thistle green fusion human and cynomolgus monkey CRTH2 expression phmAG1-MNLinker vector
  • Thistle green fusion human CRTH2 expression phmAG1-MNLinker vector The human CRTH2 gene expression pAMoh prepared in (1)-(ii) of Example 1
  • the target fragment was amplified by PCR using primers humanCRTH2azami-A (SEQ ID NO: 60) and humanCRTH2azami-B (SEQ ID NO: 61), and ligated with the vector phmAG1-MNLinker (MBL) using restriction enzymes BamHI and HindIII. Then, thistle green fusion human CRTH2 expression phmAG1-MNLinker vector was constructed.
  • Example 24 Construction of thistle green fusion human CRTH2 expressing CHO / DG44 cells and cynomolgus monkey CRTH2 expressing CHO / DG44 cells The strand DNA was purified and dissolved in sterilized water. This DNA was introduced into CHO / DG44 cells by electroporation and cultured in IMDM culture medium for about 3 days.
  • drug-resistant cells were selected with an IMDM selective medium supplemented with 0.5 mg / mL G418 (Nacalai Tesque).
  • the selected drug resistant cells were detached with 0.25% Trypsin-EDTA (Nacalai Tesque), washed with PBS, and suspended in IMDM selective medium.
  • Cell Sorter SH800 Cell Sorter SH800 (Sony)
  • cell populations showing the same level of thistle green fluorescence in human CRTH2-expressing cells and cynomolgus monkey CRTH2-expressing cells were respectively gated, sorted at 1 cell / well, and expanded.
  • Thistle green fusion human CRTH2-expressing CHO / DG44 cells and cynomolgus CRTH2-expressing CHO / DG44 cells were established, respectively.
  • Thistle green fusion human CRTH2-expressing CHO / DG44 cells and cynomolgus CRTH2-expressing CHO / DG44 cells were prepared in the same manner as described above, and thistle green expression was performed using flow cytometry (BD Biosciences, FACS CantoII). Confirmed. As a result, as shown in FIG. 20, it was confirmed that the expression of thistle green in each cell was equivalent.
  • Example 25 Evaluation of binding activity of humanized Lym2 antibody LV0HV1 to human or cynomolgus monkey CRTH2 Thistle green-fused human or cynomolgus CRTH2-expressing CHO / DG44 cells established in Example 24 were detached with a 0.02% EDTA solution (Nacalai Tesque). After washing with PBS, it was suspended in SM. Next, the cells were seeded in a 96-well plate so that the number of cells was 2 ⁇ 10 5 per well, and humanized Lym2 antibodies at final concentrations of 30000, 7500, 1875, 469, 117, 29, 7 and 2 ng / mL were used. LV0HV1 or anti-DNP IgG1 antibody was added, and the reaction was performed at 4 ° C. for 40 minutes.
  • an anti-human CRTH2 antibody having a desired activity by recognizing and binding to a characteristic epitope of human CRTH2, the antibody fragment, a DNA encoding the amino acid sequence of the antibody, a vector containing the DNA, the antibody With a hybridoma and an antibody-producing cell producing the same, a method for producing the antibody, a composition containing the antibody or antibody fragment, an allergic disease using the antibody or antibody fragment, an autoimmune disease, eosinophilia and hyperfunction It is possible to provide a method for treating and diagnosing a disease, a disease associated with an increase in Th2 cells or hyperfunction, and a medicine and a diagnostic agent containing the antibody or antibody fragment.
  • SEQ ID NO: 3 Description of artificial sequence: nucleotide sequence of humanCRTH2FLAG-A
  • SEQ ID NO: 4 Description of artificial sequence: nucleotide sequence of humanCRTH2FLAG-B
  • SEQ ID NO: 5 Description of artificial sequence: Base sequence of human CRTH2 cDNA with FLAG tag
  • SEQ ID NO: 6 description of artificial sequence: nucleotide sequence of humanCRTH2FLAG-C
  • SEQ ID NO: 7 description of artificial sequence: nucleotide sequence of humanCRTH2FLAG-D
  • SEQ ID NO: 9 Description: Base sequence of RatIgG2bH-B
  • 10 Description of artificial sequence: Base sequence of Rat-A SEQ ID NO: 11: Description of artificial sequence: Base sequence of Ratk-B SEQ ID NO: 20: Description of artificial sequence: Lym2 antibody VH CDR1 amino acid sequence

Abstract

本発明は、ヒトＣＲＴＨ２を特異的に認識し、結合する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体、該抗体断片、該抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該抗体を生産するハイブリドーマおよび抗体生産細胞、該抗体の製造方法、該抗体または抗体断片を含む組成物、該抗体または抗体断片を用いるアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多や機能亢進を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多や機能亢進を伴う疾患などの治療方法および診断方法、並びに該抗体または抗体断片を含む医薬および診断薬に関する。

Description

ヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体
　本発明は、ヒトＣＲＴＨ２を特異的に認識し、結合する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体、該抗体断片、該抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該抗体を生産するハイブリドーマおよび抗体生産細胞、該抗体の製造方法、該抗体または抗体断片を含む組成物、該抗体または抗体断片を用いるアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多や機能亢進を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多や機能亢進を伴う疾患などの治療方法および診断方法、並びに該抗体または抗体断片を含む医薬および診断薬に関する。
　ヒトＣＲＴＨ２（Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｏｎ　Ｔｈ２　ｃｅｌｌｓ）は、ＧＰＲ４４、ＣＤ２９４、ＤＰ２などの別名でも知られる７回膜貫通型Ｇタンパク質共役型受容体（Ｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＧＰＣＲと記す）であり、プロスタグランジンＤ２（以下、ＰＧＤ２と記す）に対する受容体の一つであることが知られている（非特許文献１）。ＣＲＴＨ２は、１９９６年にヒトＴｈ２特異的タンパク質としてクローニングされ、Ｂ１９と称して開示されている（特許文献１）。
　ＣＲＴＨ２は、リガンドであるＰＧＤ２および１３，１４－ｄｉｈｙｄｒｏ－１５－ｋｅｔｏ　ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｄ２（以下、ＤＫＰＧＤ２と記す）に代表されるＰＧＤ２代謝物と結合し、細胞内にＧαｉタンパク質を介したシグナルを伝達し、その結果、ＣＲＴＨ２発現細胞の遊走および活性化に関与することが知られている（非特許文献１）。
　ヒトＣＲＴＨ２はＴｈ２細胞、好酸球、好塩基球および２型自然リンパ球（Ｔｙｐｅ　２　ｉｎｎａｔｅ　ｌｙｍｐｈｏｉｄ　ｃｅｌｌｓ、以下、ＩＬＣ２と記す）などに発現が認められている（非特許文献１、２）。ＣＲＴＨ２は、Ｔｈ２サイトカイン産生細胞に特異的に発現する表面マーカーであることが報告されている（非特許文献３）。
　また、ＩＬＣ２は２０１１年にヒトにおいて同定されたアレルギー応答に関与する新規細胞集団であり、本細胞を規定する特異的な表面マーカーとしてＣＲＴＨ２が挙げられている（非特許文献２）。また、ｎｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｍｏｎｏｃｙｔｅやＴｈ２／Ｔｈ１７細胞にＣＲＴＨ２が発現していることが報告されている（非特許文献４、５）。
　喘息をはじめとするアレルギー疾患において、ＣＲＴＨ２発現細胞は病態に寄与することが知られている。喘息患者における気管支肺胞洗浄液中の細胞においては、健常人と比較して高頻度でＣＲＴＨ２陽性Ｔ細胞が認められることが報告されており（非特許文献６）、アトピー性皮膚炎においては、重症度と相関してＣＲＴＨ２陽性Ｔ細胞が増加することが報告されている（非特許文献７）。
　好酸球は細胞傷害性を有する顆粒蛋白質を含んでおり、該蛋白質の沈着が慢性気管支喘息患者の気道組織あるいはアトピー性皮膚炎患者の病変部位に認められることなどから、好酸球は慢性気管支喘息またはアトピー性皮膚炎などのアレルギー性疾患の病態形成において重要な働きをしているものと考えられている（非特許文献８、９）。
　好塩基球は細胞内にヒスタミンやロイコトリエンといった炎症性分子を貯留し、細胞表面に発現するＦｃε受容体やＦｃγ受容体のクロスリンクにより、該分子を放出することにより、アレルギー反応の惹起に関わっている（非特許文献１０）。
　ＩＬＣ２は気道粘膜や皮膚といった局所に存在する細胞であり、組織障害に伴い産生されるインターロイキン（以下、ＩＬと記す）－２５、ＩＬ－３３といったサイトカインに応答し、大量のＴｈ２サイトカインを産生するという特性を持ち、アレルギー疾患の病態形成に関与していると考えられている（非特許文献１１）。
　ＣＲＴＨ２に対するモノクローナル抗体として、３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）が市販されている。またＢＭ１６が知られている（特許文献２）。これらはげっ歯類抗体であり医薬品としては開発されていない。
　さらに、クローン１９Ａ２に関する遺伝子組換えキメラ抗体およびヒト化抗体が、エフェクター活性によりＣＲＴＨ２発現細胞の除去を行うこと、クローン８Ｂ１に関するヒト化抗体やクローン３Ｃ１２および３１Ａ５に関するマウス抗体が、ＣＲＴＨ２に対するアンタゴニスト活性を有することが示されている。
　またクローン１９Ａ２に関する抗体はヒトマスト細胞に対しても反応性を有することが示されている（特許文献３）。
日本国特許第３１４４８０５号公報 国際公開第９７／４６６７７号 国際公開第２０１４／１４４８６５号
The Journal of Experimental Medicine, 2001. 193(2):p.255-261. Nature Immunology, 2011. 12(11):p.1055-1062. European Journal of Immunology, 2000. 30(10):p.2972-2979. Blood, 2011. 118(5):e16-31. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2014.134(5):p. 1175-1186. e7. Clinical & Experimental Immunology, 2010. 161(1):p. 34-40. Journal of Investigative Dermatology, 2002. 119(3):p. 609-616. Advances in Immunology, 1986. 39:p. 177-253. Immunology Today, 1992. 13(12):p. 501-507. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2013. 132(4):p. 789-801. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2014. 134(3):p. 671-678.
　これまでに複数のヒトＣＲＴＨ２抗体が確立されているが、種々のヒト免疫細胞への反応性や、ヒトＣＲＴＨ２への特異的結合活性、またはヒトＣＲＴＨ２リガンド依存的な活性への影響など、所望の活性を有する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の確立が望まれていた。
　本発明の目的は、ヒトＣＲＴＨ２の特徴的なエピトープを認識し、結合することで所望の活性を有する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体、該抗体断片、該抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該抗体を生産するハイブリドーマおよび抗体生産細胞、該抗体の製造方法、該抗体または抗体断片を含む組成物、該抗体または抗体断片を用いるアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多や機能亢進を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多や機能亢進を伴う疾患などの治療方法および診断方法、並びに該抗体または抗体断片を含む医薬および診断薬を提供することである。
　本発明は、以下の（１）～（２６）に関する。
（１）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方を認識し、結合する抗体または該抗体断片。
（２）抗体が、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１３番目のイソロイシン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８２番目のシステイン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８６番目のバリン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸、１９７番目のアラニン、および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを認識し、結合する抗体である（１）に記載の抗体または該抗体断片。
（３）抗体が、以下の（ａ）～（ｇ）からなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを認識する抗体である、（１）または（２）に記載の抗体または該抗体断片。
（ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシンおよび１５番目のグルタミン酸、
（ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、および１７９番目のアルギニン、
（ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８０番目のイソロイシンおよび１８１番目のメチオニン、
（ｄ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシンおよび１８５番目のアスパラギン、
（ｅ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシンおよび１８９番目のロイシン、
（ｆ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９５番目のアルギニン、並びに
（ｇ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９６番目のアスパラギン酸および１９８番目のスレオニン。
（４）抗体が、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群から選ばれるいずれか１つの抗体である、（１）～（３）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（ａ）抗体重鎖可変領域（以下、ＶＨと略記する）の相補性決定領域（以下、ＣＤＲと略記する）１～３が、それぞれ配列番号２０～２２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体軽鎖可変領域（以下、ＶＬと略記する）のＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号２３～２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列または配列番号４９で表されるアミノ酸配列中の１８番目のロイシンをメチオニンに、７７番目のアスパラギンをセリンに、９３番目のバリンをスレオニンに、および１１７番目のスレオニンをバリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＨ並びに配列番号３３で表されるアミノ酸配列または配列番号３３で表されるアミノ酸配列中の２番目のイソロイシンをバリンに、４番目のメチオニンをロイシンに、１５番目のプロリンをロイシンに、および８５番目のアラニンをプロリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｃ）配列番号４９、５１、５３、５５、５７および５９で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ並びに配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および４７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＬを含む抗体、並びに
（ｄ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
（５）抗体が、下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの特徴を有する抗体である（１）～（４）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（ａ）ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下でヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が低下しない、
（ｂ）中和活性を有しない、
（ｃ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、
（ｄ）マスト細胞およびＴｈ１細胞の少なくとも一方に反応しない、
（ｅ）好酸球、好塩基球、Ｔｈ２細胞および２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）から選ばれる少なくとも一つの細胞に反応する。
（ｆ）アゴニスト活性を有しない、
（ｇ）ヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルを増強しない、並びに
（ｈ）活性化状態または不活性化状態のヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が変化しない。
（６）抗体が、ヒトＦｃ領域を含む抗体である、（１）～（５）のうちのいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（７）抗体が、モノクローナル抗体である（１）～（６）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（８）抗体が、遺伝子組換え抗体である（１）～（７）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（９）遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体およびヒト抗体から選ばれるいずれか１つの遺伝子組換え抗体である、（８）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１０）抗体が、サルＣＲＴＨ２に結合する抗体である（１）～（９）のいずれか1つに記載の抗体または該断片。
（１１）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドから選ばれるいずれか１つの抗体断片である（１）～（１０）のいずれか１に記載の該抗体断片。
（１２）（１）～（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を産生するハイブリドーマ。
（１３）（１）～（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（１４）（１３）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（１５）（１４）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（１６）（１２）に記載のハイブリドーマまたは（１５）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）～（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を生産蓄積させ、該培養物から抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする（１）～（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
（１７）（１）～（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療剤。
（１８）（１）～（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の診断剤。
（１９）ＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、または２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である（１７）または（１８）に記載の剤。
（２０）（１）～（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の有効量を投与することを含む、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療方法。
（２１）（１）～（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の有効量を投与することを含む、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の診断方法。
（２２）ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、またはＩＬＣ２の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である（２０）または（２１）に記載の方法。
（２３）ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療および診断の少なくとも一方に使用するための、（１）～（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片。
（２４）ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、またはＩＬＣ２の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である（２３）に記載の抗体または該抗体断片。
（２５）ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療および診断剤の少なくとも一方の製造のための、（１）～（１１）のいずれか１に記載の抗体または該抗体断片の使用。
（２６）ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、またはＩＬＣ２の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である（２５）に記載の使用。
　本発明により配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方を認識し、結合する抗体または該抗体断片などが提供される。
　本発明の抗体は、好酸球、好塩基球Ｔｈ２細胞、ＩＬＣ２などのＣＲＴＨ２を発現する細胞に特異的に反応し、高濃度のリガンド存在下においてもＣＲＴＨ２発現細胞に高い反応性を示すとともに、アゴニスト活性、中和活性、およびヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルの増強活性を有しない。したがって本発明の抗体または該抗体断片は、ＣＲＴＨ２が発現する好酸球、好塩基球、Ｔｈ２細胞、ＩＬＣ２などのＣＲＴＨ２を発現する細胞を標的とする治療効果を発揮し得る。
図１は、シグナル配列を含まないＬｙｍ２抗体軽鎖可変領域及び各ヒト化Ｌｙｍ２抗体軽鎖可変領域（ＬＶ０、ＬＶ１、ＬＶ２ａ、ＬＶ２ｂ、ＬＶ２ｃ、ＬＶ３ａ、ＬＶ３ｂおよびＬＶ４）のアミノ酸配列を示す。各配列中の枠で囲まれた領域は、ＣＤＲ配列を示す。 図２は、シグナル配列を含まないＬｙｍ２抗体重鎖可変領域及び各ヒト化Ｌｙｍ２抗体重鎖可変領域（ＨＶ０、ＨＶ１、ＨＶ２ａ、ＨＶ２ｂ、ＨＶ３およびＨＶ４）のアミノ酸配列を示す。各配列中の枠で囲まれた領域は、ＣＤＲ配列を示す。 図３（Ａ）～（Ｃ）は、ラット／ヒトキメラ型Ｌｙｍ２抗体（以下、ｃｈＬｙｍ２と記す場合もある）およびヒト化Ｌｙｍ２抗体のヒト好酸球およびヒト好塩基球に対する細胞傷害活性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。図３（Ａ）～（Ｃ）において、それぞれ、左側の図はヒト好酸球に対する細胞傷害活性を、右側の図はヒト好塩基球に対する細胞傷害活性を示す。それぞれの図において縦軸はコントロールビーズ２０００個あたりの各細胞の個数を、横軸は抗体濃度を示す。図３（Ａ）○はｃｈＬｙｍ２、●はヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ０、△はアイソタイプコントロール抗体を示す。図３（Ｂ）○はｃｈＬｙｍ２、■はヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、△はアイソタイプコントロール抗体を示す。図３（Ｃ）○はｃｈＬｙｍ２、▲はヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ２ａ、△はアイソタイプコントロール抗体を示す。 図４（Ａ）はヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、図４（Ｂ）はｃｈＬｙｍ２の各ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞に対する反応性をそれぞれ示したものである。それぞれの図において、縦軸はアザミグリーンタグの蛍光強度で、各抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の蛍光強度を補正した相対的蛍光強度に関して、野生型ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対する反応性の値を１００％とした際の、各アミノ酸置換体発現細胞に対する反応性の値（％）を示す。横軸においてＷＴは野生型ヒトＣＲＴＨ２を示し、それ以外は、アミノ酸置換体の種類を示す。＊は野生型ＣＲＴＨ２の相対的蛍光強度から９０％以上の相対的蛍光強度の低下が認められたことを意味する。以下、図５～図７も同様である。 図５（Ａ）はｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、図５（Ｂ）はｈｕ８Ｂ１　ｖ１の各ＣＲＴＨ２アミノ酸置換体に対する反応性をそれぞれ示したものである。 図６（Ａ）はｃｈ３Ｃ１２、図６（Ｂ）はｃｈ３１Ａ５の各ＣＲＴＨ２アミノ酸置換体に対する反応性をそれぞれ示したものである。 図７は、ＢＭ１６の各ＣＲＴＨ２アミノ酸置換体に対する反応性を示したものである。 図８は、ヒト好酸球に対する抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。●はＬｙｍ２抗体、○はＢＭ１６、▲は３０１１０８を示し、縦軸は蛍光強度を、横軸は各抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の抗体濃度を示す。 図９は、ヒト好塩基球に対するｃｈＬｙｍ２の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。塗りつぶし部分がアイソタイプコントロール抗体の反応性、実線で囲まれた部分がｃｈＬｙｍ２の反応性を、それぞれ示し、縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度を示す。 図１０は、ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞に対するヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。Ｆｏｒｗａｒｄ　ｓｃａｔｔｅｒ（以下、ＦＳＣと記す）－Ｓｉｄｅ　ｓｃａｔｔｅｒ（以下、ＳＳＣと記す）展開によりリンパ球を分画し、さらにＣＤ３陽性かつＣＤ４陽性細胞で分画した細胞群に対する、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１による蛍光染色の蛍光強度およびＣＤ４抗体による蛍光染色の蛍光強度をそれぞれ縦軸および横軸に示す。 図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）は、抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体のヒト好酸球およびヒト好塩基球に対する細胞傷害活性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。上段はヒト好酸球、下段はヒト好塩基球に対する細胞傷害活性を示す。それぞれの図において、縦軸にコントロールビーズ１０００個あたりの各細胞の個数を、横軸に抗体濃度を示す。○はヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、□はｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、▲はｈｕ８Ｂ１　ｖ１、△はｃｈ３Ｃ１２、◆はｃｈ３１Ａ５、×はアイソタイプコントロール抗体を示す。 図１２（Ａ）および図１２（Ｂ）は、抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体のヒトＴｈ２およびＴｈ１サイトカイン減少活性を解析した結果を示す。図１２（Ａ）は各抗体を添加した時のＴｈ２サイトカインであるＩＬ－５またはＩＬ－１３の濃度を縦軸に示す。また図１２（Ｂ）は各抗体を添加した時の、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ－γの濃度を縦軸に示す。 図１３（Ａ）～図１３（Ｃ）は、ＣＲＴＨ２リガンドであるＤＫＰＧＤ２存在下における抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性変化を、ヒトＣＲＴＨ２発現２９３ＥＢＮＡ細胞を用いて、フローサイトメトリーで解析した結果を示す。凡例に示す抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の濃度が０．３μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、および３μｇ／ｍＬにおける結果をそれぞれ図１３（Ａ）、図１３（Ｂ）および図１３（Ｃ）に示す。それぞれの図において、縦軸はＤＫＰＧＤ２非存在下での蛍光強度を１００％としたときの蛍光強度の割合を示す。 図１４は、ＩｇＥおよびクロスリンク抗体処理により刺激したヒト分化誘導マスト細胞に対する抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。それぞれの図は、図の上に示す抗体の反応性を示しており、縦軸に細胞数を、横軸に蛍光強度を示す。塗りつぶし部分がアイソタイプコントロール抗体の反応性を、実線で囲まれた部分が抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性を、それぞれ示す。 図１５は、ヒト分化誘導Ｔｈ１細胞に対する抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。それぞれの図は、図の上に示す抗体の反応性を示しており、縦軸に細胞数を、横軸に蛍光強度を示す。塗りつぶし部分がアイソタイプコントロール抗体の反応性を、実線で囲まれた部分が抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性を、それぞれ示す。 図１６は、ヒト好酸球の形態変化を指標にしたＬｙｍ２抗体のアンタゴニスト活性評価の結果を示す。グラフの下に示す各抗体の存在下または非存在下で、凡例に示す濃度のＤＫＰＧＤ２を処理した際に、フローサイトメーター解析における高ＦＳＣ領域に検出される好酸球の割合（％）を縦軸に示す。 図１７は、ヒト好酸球の形態変化を指標にしたＬｙｍ２抗体のアゴニスト活性評価の結果を示す。凡例に示す濃度のＬｙｍ２抗体を処理した際に、高ＦＳＣ領域に検出される好酸球の割合（％）を縦軸に示す。 図１８（Ａ）～図１８（Ｃ）はいずれも、ヒト好酸球の形態変化を指標にした抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体のアゴニスト活性、アンタゴニスト活性およびリガンドによる活性化の増強活性の評価の結果を示す。図１８（Ａ）はヒト化抗体またはキメラ抗体、図１８（Ｂ）はラット抗体、図１８（Ｃ）はマウス抗体についての結果をそれぞれ示す。各図において、縦軸は、ＤＫＰＧＤ２の存在、または非存在下で、凡例に示す各抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体またはアイソタイプ抗体を処理した際に、フローサイトメーター解析における高ＦＳＣ領域に検出される好酸球の割合（％）を示す。 図１９はＣＲＴＨ２発現細胞の膜画分へのＧＴＰγＳまたはＧＤＰ処理による、ＣＲＴＨ２のコンフォメーションの変化がＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性に与える影響を、ＥＬＩＳＡ法により解析した結果を示す。縦軸はＧＴＰγＳおよびＧＤＰ未処理時の吸光度を１とした際のＦｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅを示す。横軸はＧＴＰγＳおよびＧＤＰ処理の有無、および、評価抗体（ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２およびヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１）を示す。 図２０は、アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるアザミグリーンの発現を、フローサイトメトリーで解析した結果を示す。縦軸に細胞数を、横軸にアザミグリーンの蛍光強度を示す。塗りつぶし部分が親細胞であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞における蛍光強度を、実線で囲まれた部分がアザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞における蛍光強度を、点線で囲まれた部分がアザミグリーン融合カニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞における蛍光強度をそれぞれ示す。 アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対するヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１およびアイソタイプ抗体の反応性をフローサイトメトリーで解析した結果を示す。○はアザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対するＬＶ０ＨＶ１の反応性、●はアザミグリーン融合カニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対するＬＶ０ＨＶ１の反応性、△はアザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対するアイソタイプ抗体の反応性、▲はアザミグリーン融合カニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対するアイソタイプ抗体の反応性を示し、縦軸は蛍光強度を、横軸は各抗体の抗体濃度を示す。
　本発明におけるヒトＣＲＴＨ２としては、配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつヒトＣＲＴＨ２の機能を有するポリペプチド並びに配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で表されるアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒトＣＲＴＨ２の機能を有するポリペプチドも、本発明におけるヒトＣＲＴＨ２に包含される。
　配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、部位特異的変異導入法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons (1987-1997)、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)］などを用いて、例えば配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個～数十個、例えば、１～２０個、より好ましくは１個～数個、例えば、１～５個のアミノ酸である。
　ヒトＣＲＴＨ２をコードする遺伝子としては、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＢ００８５３５または配列番号１で表される塩基配列が挙げられる。ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＢ００８５３５または配列番号１で表される塩基配列において、１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、かつヒトＣＲＴＨ２の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む遺伝子、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＢ００８５３５または配列番号１で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつヒトＣＲＴＨ２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子、並びに配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなり、かつヒトＣＲＴＨ２の機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む遺伝子なども本発明のＣＲＴＨ２をコードする遺伝子に包含される。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡをプローブに用いた、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、またはＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味する。
　具体的には、ハイブリダイズしたコロニー若しくはプラーク由来のＤＮＡ、または該配列を有するＰＣＲ産物もしくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７～１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーション［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, OxfordUniversity, (1995)］を行った後、０．１～２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターまたはスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
　ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＢ００８５３５または配列番号１で表される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
　真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のヒトＣＲＴＨ２をコードする遺伝子に包含される。
　本発明における相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ［J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２［Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997)、Genome Res., 7, 649 (1997)、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html］においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などが挙げられる。
　デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｏｐｅｎ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、－Ｅ（Ｃｏｓｔ　ｔｏ　ｅｘｔｅｎｄ　ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、－ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｓｍａｔｃｈ）が－３、－ｒ（ｒｅｗａｒｄ　ｆｏｒ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍａｔｃｈ）が１、－ｅ（ｅｘｐｅｃｔ　ｖａｌｕｅ）が１０、－Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、－ｙ［Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ　ｂｌａｓｔ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ　ｂｉｔｓ］がｂｌａｓｔｎ　の場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、－Ｘ（Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）が１５および－Ｚ（ｆｉｎａｌ　Ｘ　ｄｒｏｐｏｆｆ　ｖａｌｕｅ　ｆｏｒ　ｇａｐｐｅｄ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html)。
　配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができる。例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、上記の方法で作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。さらに、配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチド、または配列番号２またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ７４５１８で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）法、ｔ－ブチルオキシカルボニル（ｔＢｏｃ）法などの化学合成法によって製造することもできる。
　ヒトＣＲＴＨ２としての機能としては、そのリガンド、例えばＰＧＤ２との結合により、ヒトＣＲＴＨ２依存的な細胞内シグナルが伝達され、ヒトＣＲＴＨ２を発現する細胞の遊走、該細胞からのサイトカイン産生亢進、または細胞径、細胞表面積などの変化を伴う細胞形態変化が誘導されることなどが挙げられる。
　ヒトＣＲＴＨ２の細胞外領域としては、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１～３３番目のアミノ酸残基を含むＮ末領域、９５～１１１番目のアミノ酸残基を含むループ１領域、１６９～２０６番目のアミノ酸残基を含むループ２領域および２６４～２８５番目のアミノ酸残基を含むループ３領域が挙げられる［J Immunol, 1999. 162(3): p.1278-86.］。Ｎ末領域、ループ１領域、ループ２領域およびループ３領域として、具体的には、それぞれ、配列番号２で表されるアミノ酸配列における１～３３番目、９５～１１１番目、１６９～２０６番目および２６４～２８５番目のアミノ酸残基を含むポリペプチド部分が挙げられる。
　本発明における抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等いずれの抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。本発明の抗体として具体的には、ハイブリドーマにより産生される抗体、または遺伝子組換え技術によって産生される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。また遺伝子組換え抗体としては、例えば、遺伝子組換え技術によって作製されるマウス抗体、ラット抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体などが挙げられる。
　モノクローナル抗体とは、単一クローンの抗体産生細胞が分泌する抗体であり、ただ一つのエピトープ（抗原決定基ともいう）を認識し、モノクローナル抗体を構成するアミノ酸配列（１次構造）が均一である。
　本発明においてモノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、または抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される抗体など、遺伝子組換え技術によって作製される遺伝子組換え抗体を挙げることができる。
　ポリクローナル抗体とは、２つ以上のモノクローナル抗体が含まれる抗体群であり、その抗体群を構成する複数の抗体によって複数のエピトープを認識することができる。
　本発明においてエピトープとしては、モノクローナル抗体が認識し、結合する単一のアミノ酸配列およびアミノ酸配列からなる立体構造並びに翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列および該アミノ酸配列からなる立体構造などが挙げられる。
　翻訳後修飾により修飾されたアミノ酸配列としては、糖鎖がＯＨ置換基を有するスレオニンおよびセリンに結合したＯ結合型糖鎖、ＮＨ２置換基を有するグルタミンおよびアスパラギンに結合したＮ結合型糖鎖並びに硫酸分子がＯＨ置換基を有するスレオニンに結合した硫酸基などが結合したアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明の抗体が認識するヒトＣＲＴＨ２のエピトープは、ヒトＣＲＴＨ２の一部のドメインを欠失させた欠損体、ヒトＣＲＴＨ２の一部のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換させた変異体、他のタンパク質由来のドメインと置換させた変異体およびヒトＣＲＴＨ２の部分ペプチド断片等を用いた抗体の結合実験を行うことにより決定することができる。また、本発明の抗体が結合するヒトＣＲＴＨ２のエピトープは、タンパク質分解酵素にて消化したヒトＣＲＴＨ２に本発明の抗体を添加し、既知の質量分析法を用いたエピトープマッピングを行うことにより決定することができる。
　本発明の抗体が認識するヒトＣＲＴＨ２のエピトープに含まれるアミノ酸残基としては、例えば該アミノ酸残基の置換により、本発明の抗体の反応性が消失するアミノ酸残基が挙げられる。
　本発明における抗体の反応性は、例えば、野生型ヒトＣＲＴＨ２受容体またはアミノ酸置換体を発現する細胞に対する抗体の結合量（野生型及び置換体の発現量に応じて補正される）をフローサイトメトリー等を用いて測定することによって求めることができる。また、抗体の結合量は、固相サンドイッチ法などを用いたラジオイムノアッセイ、または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などを用いたヒトＣＲＴＨ２に対する公知の免疫学的検出法、またはＢｉａｃｏｒｅシステム（ジーイーヘルスケア社）などを用いた表面プラズモン共鳴などの方法で確認することができる。
　また、公知の免疫学的検出法［Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Third edition, Academic Press(1996)、Antibodies－A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、単クローン抗体実験マニュアル,講談社サイエンティフィック(1987)］などを組み合わせて確認することもできる。
　本発明における抗体の反応性の消失とは、野生型ヒトＣＲＴＨ２を発現する細胞に対する抗体の反応性と比較して、アミノ酸置換体を発現する細胞に対する抗体の反応性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上低下することを示す。
　本発明の抗体が結合するエピトープとしては、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも１つのアミノ酸残基を含むエピトープが挙げられる。
　また、本発明の抗体が結合するエピトープとして、具体的には、下記の（ａ）～（ｃ）のエピトープが挙げられる。
（ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンを含むエピトープ、
（ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９４番目のアスパラギン酸を含むエピトープ、
（ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸を含むエピトープ。
　また、本発明の抗体が結合するエピトープとしては、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、かつ配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸、および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを含むエピトープが挙げられる。
　また、本発明の抗体が結合するエピトープとしては配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも１つのアミノ酸残基を含み、かつ下記の（ａ）～（ｇ）の少なくともいずれか１つを含むエピトープが挙げられる。
（ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシンおよび１５番目のグルタミン酸、
（ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、および１７９番目のアルギニン、
（ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８０番目のイソロイシンおよび１８１番目のメチオニン、
（ｄ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシンおよび１８５番目のアスパラギン、
（ｅ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシンおよび１８９番目のロイシン、
（ｆ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９５番目のアルギニン、並びに
（ｇ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９６番目のアスパラギン酸および１９８番目のスレオニン。
　また、本発明の抗体が結合するエピトープに含まれる他のアミノ酸残基としては、本発明の抗体がＣＲＴＨ２へ結合する際に、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列に存在し、かつ実質的に認識し結合しているアミノ酸残基であればいずれのアミノ酸残基でもよく、具体的には配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９２番目のグリシン、１９４番目のアスパラギン酸、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸、および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸残基と立体構造上近接して存在しているアミノ酸残基、並びに配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９２番目のグリシン、１９４番目のアスパラギン酸、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸、および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸から選ばれるアミノ酸残基と１次配列上近接しているアミノ酸残基などが挙げられる。
　抗体分子はイムノグロブリン（以下、Ｉｇと表記する）とも称され、ヒト抗体は、分子構造の違いに応じて、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭのアイソタイプに分類される。アミノ酸配列の相同性が比較的高いＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を総称してＩｇＧともいう。
　抗体分子は重鎖（Ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ、以下Ｈ鎖と記す）および軽鎖（Ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ、以下Ｌ鎖と記す）と呼ばれるポリペプチドより構成される。また、Ｈ鎖はＮ末端側よりＨ鎖可変領域（ＶＨとも表記される）、Ｈ鎖定常領域（ＣＨとも表記される）、Ｌ鎖はＮ末端側よりＬ鎖可変領域（ＶＬとも表記される）、Ｌ鎖定常領域（ＣＬとも表記される）の各領域により、それぞれ構成される。
　ＣＨは各サブクラスごとに、α、δ、ε、γおよびμ鎖がそれぞれ知られている。ＣＨはさらに、Ｎ末端側よりＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインの各ドメインにより構成される。ドメインとは、抗体分子の各ポリペプチドを構成する機能的な構造単位をいう。また、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインを併せてＦｃ領域または単にＦｃという。ＣＬは、Ｃλ鎖およびＣκ鎖が知られている。
　本発明の抗体におけるＣＨとしては、Ｉｇに属すればいかなるものでもよいが、ＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにＩｇＧクラスに属するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。
　本発明の抗体におけるＣＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のアミノ酸配列または非ヒト動物抗体のアミノ酸配列のいずれでもよいが、ヒト抗体のアミノ酸配列のＣκまたはＣλが好ましい。
　本発明の抗体は配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方のアミノ酸残基を認識し、結合する抗体である。
　本発明の抗体として具体的には、下記の（ａ）～（ｃ）から選ばれる抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンを認識し結合する抗体、
（ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９４番目のアスパラギン酸を認識し結合する抗体、
（ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の両方を認識し、結合する抗体。
　また、本発明の抗体としては、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも１つのアミノ酸残基を認識し、かつ配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを認識し、結合する抗体が挙げられる。
　また、本発明の抗体としては配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも１つのアミノ酸残基を認識し、かつ下記の（ａ）～（ｇ）の少なくともいずれか１つを認識して結合する抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシンおよび１５番目のグルタミン酸、
（ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、および１７９番目のアルギニン、
（ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８０番目のイソロイシンおよび１８１番目のメチオニン、
（ｄ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシンおよび１８５番目のアスパラギン、
（ｅ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシンおよび１８９番目のロイシン、
（ｆ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９５番目のアルギニン、および
（ｇ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９６番目のアスパラギン酸および１９８番目のスレオニン。
　また本発明の抗体として、具体的には、下記の（ａ）～（ｄ）から選ばれる抗体が挙げられる。
（ａ）ＶＨの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ、以下ＣＤＲと略記する）１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２０、２１および２２で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２３、２４および２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体、
（ｂ）前記（ａ）に記載の抗体と競合してヒトＣＲＴＨ２に結合する抗体、
（ｃ）前記（ａ）に記載の抗体が結合するエピトープを含むエピトープに結合する抗体、および
（ｄ）前記（ａ）に記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
　本発明の上記（ｂ）の抗体とは、上記（ａ）の抗体とヒトＣＲＴＨ２との結合を阻害する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体のことを示す。また、本発明の上記（ｃ）の抗体とは、上記（ａ）に記載の抗体を第１抗体、および第１抗体が結合するエピトープを第１エピトープとした場合、当該第１エピトープを含むエピトープに結合する抗体のことを示す。
　また本発明の抗体として、具体的には、下記の（ａ）～（ｃ）から選ばれる抗体が挙げられる。
（ａ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列または配列番号４９で表されるアミノ酸配列中の１８番目のロイシンをメチオニンに、７７番目のアスパラギンをセリンに、９３番目のバリンをスレオニンに、および１１７番目のスレオニンをバリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３３で表されるアミノ酸配列または配列番号３３で表されるアミノ酸配列中の２番目のイソロイシンをバリンに、４番目のメチオニンをロイシンに、１５番目のプロリンをロイシンに、および８５番目のアラニンをプロリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
（ｂ）配列番号４９、５１、５３、５５、５７および５９で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ並びに配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および４７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＬを含む抗体、並びに
（ｃ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
　上記（ｂ）の抗体として、好ましくは以下の（１）～（３）から選ばれる抗体が挙げられる。
（１）配列番号４９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ並びに配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および４７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＬを含む抗体、
（２）配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含むＶＨ並びに配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および４７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＬを含む抗体、並びに
（３）配列番号５１、５３、５５および５７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ並びに配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
　上記（ｂ）の抗体として、特に好ましくは、配列番号５１で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体が挙げられる。
　本発明の抗体としては、ヒトＣＲＴＨ２の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方をアラニンに置換したアミノ酸置換体に対し反応性が消失する抗体が挙げられる。
　また、本発明の抗体には、ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下で、ヒトＣＲＴＨ２への反応性が低下しない抗体が包含される。ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下でヒトＣＲＴＨ２への反応性が低下しない抗体は、ヒトＣＲＴＨ２への反応性が低下する抗体に比べて、炎症局所のようにヒトＣＲＴＨ２のリガンドが高濃度で存在する条件下でも、高い反応性を示すことができる。従って、ヒトＣＲＴＨ２リガンド非依存的にヒトＣＲＴＨ２へ特異的に結合することができ、薬効を発揮することができる。
　本発明において、ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下で抗体の反応性が低下するとは、ヒトＣＲＴＨ２のリガンド非存在下でのヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対する抗体の反応性と比較して、ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下での該反応性が少なくとも５％以上低下することを示す。より厳密には１０％以上低下することを示す。
　ヒトＣＲＴＨ２のリガンドとしては、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合するものであればいずれも包含されるが、好ましくはＰＧＤ２またはＤＫＰＧＤ２が挙げられる。より好ましくはＤＫＰＧＤ２が挙げられる。
　本発明において、活性化状態または不活性化状態のヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が変化しないとは、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）もしくはＧＤＰアナログまたはグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）もしくはＧＴＰアナログ存在下と非存在下で、抗体の、ヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が変化しないことをいう。
　ＧＤＰアナログとしては例えばグアノシン 5'-O-(β-チオ)二リン酸（ＧＤＰβＳ）が挙げられる。ＧＴＰアナログとしては、例えばグアノシン 5'-O-(γ-チオ)三リン酸（ＧＴＰγＳ）が挙げられる。
　本発明の抗体には、中和活性を有しない抗体、アゴニスト活性を有しない抗体、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルを増強しない抗体、または活性化状態または不活性化状態のヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が変化しない抗体が包含される。
　本発明において、抗体の中和活性とは、抗体が持つヒトＣＲＴＨ２の生物活性を阻害する活性のことをいう。例えば、ヒトＣＲＴＨ２とそのリガンドとの結合を阻害する活性や、ヒトＣＲＴＨ２によるシグナル伝達を阻害する活性などのアンタゴニスト活性をいう。
　本発明において、アゴニスト活性とは、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドの生物学的活性を模倣する活性をいい、ＣＲＴＨ２の活性化及び、活性化に伴う種々の反応を誘導する活性をいう。本発明におけるアゴニスト活性として、具体的には細胞遊走活性、細胞の形態変化誘導活性などが挙げられる。
　本発明において、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルとは、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドがヒトＣＲＴＨ２に結合し、ヒトＣＲＴＨ２を活性化させることに伴うシグナルのことをいう。
　ヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルおよびアゴニスト活性は、ヒトＣＲＴＨ２の活性化に伴う種々の反応を解析することにより評価できる。例えば、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞の形態変化を解析することにより評価できる。
　ヒトＣＲＴＨ２発現細胞としては、ヒトＣＲＴＨ２を発現していればいずれの細胞でもよいが、例えば、好酸球、好塩基球、Ｔｈ２細胞、２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）、ｎｏｎｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｍｏｎｏｃｙｔｅ、Ｔｈ２／Ｔｈ１７細胞などが挙げられる。
　本発明において、抗体がヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルを増強しないとは、ヒトＣＲＴＨ２に対し、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドを単独で作用させたときと比べ、ヒトＣＲＴＨ２のリガンドと抗体を共に作用させたときに、ヒトＣＲＴＨ２の活性化及び、該活性化に伴う種々の反応を増強しないことを指す。
　本発明の抗体には、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対し細胞傷害活性を示す抗体が含まれる。本発明における細胞傷害活性としては、補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）あるいは抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と表記する）などが挙げられる。
　本発明におけるＣＤＣ活性としては、細胞表面上のヒトＣＲＴＨ２に結合した抗体分子が、Ｆｃ部分を介して補体系のＣ１ｑに結合し、その結果、Ｃ１からＣ９の各補体成分が活性化し、最終的にはＣ５からＣ９が膜侵襲複合体と呼ばれる孔形成重合体を細胞膜上で形成して細胞溶解を引き起こす反応が挙げられる［Immunol Today. 1999 Dec;20(12):576-82.］。
　本発明におけるＡＤＣＣ活性としては、細胞表面上のヒトＣＲＴＨ２に結合した抗体分子が、Ｆｃ部分を介して、Ｆｃ受容体を発現した、例えば、ナチュラルキラー細胞（以下、ＮＫ細胞と表記する）などを活性化することによる、パーフォリンやグランザイムなどの細胞傷害性分子の放出や貪食作用の亢進などによって生じる細胞傷害反応が挙げられる［Chemical Immunology, 65, 88 (1997)；Immunol Today, 20, 576 (1999)］。
　本発明の抗体にはマスト細胞に対する細胞傷害性を有しない抗体が含まれる。このような抗体は、マスト細胞の傷害に起因する炎症性メディエーターの遊離による副作用の懸念が無いという利点を有する。
　本発明の抗体には抗体のＦｃ領域にＮ－グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ－グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体が包含される。抗体のＦｃ領域にＮ－グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ－グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体としては、例えばα１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）を用いて作製される抗体が挙げられる。抗体のＦｃ領域にＮ－グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ－グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない本発明の抗体は、高いＡＤＣＣ活性を有する。
　本発明の抗体には抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を、Ｆｃ受容体との結合活性が高くなるように改変した抗体が包含される。抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を、Ｆｃ受容体との結合活性が高くなるように改変した抗体としては、例えば米国特許第７３１７０９１号明細書記載の方法で作製された抗体分子を挙げることができる。
　本発明の抗体には、抗体の可変領域を含むポリペプチドの表面電荷や早期エンドソーム内でのｐＨにおける抗原結合活性を改変し血中半減期が伸びた抗体が包含される。
　抗体分子の可変領域を含むポリペプチドの表面電荷や早期エンドソーム内でのｐＨにおける抗原結合活性を改変し血中半減期が延びた抗体としては、例えば日本国特開２０１３－１６５７１６号公報、日本国特開２０１２－０２１００４号公報記載の方法で作製された抗体を挙げることができる。
　本発明の抗体には、ヒト型キメラ抗体（以下、単にキメラ抗体とも表記する）、ヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下ヒト化抗体とも表記する）およびヒト抗体などの遺伝子組換え抗体が包含される。
　キメラ抗体は、ヒト以外の動物（非ヒト動物）の抗体のＶＨおよびＶＬとヒト抗体のＣＨとおよびＣＬからなる抗体をいう。非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
　本発明のキメラ抗体は、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してキメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体を意味する。
　本発明のヒト化抗体は、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）に移植した可変領域（以下Ｖ領域とも表記する）をコードするｃＤＮＡを構築し、ＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）などが挙げられる。
　これらのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換または挿入され、かつヒトＣＲＴＨ２と特異的に結合して、かつ、例えば、細胞傷害活性等の生物活性において同等の機能を有する抗体または該抗体断片も本発明の抗体に包含される。
　本発明の抗体にはサルＣＲＴＨ２に結合する抗体が包含される。サルＣＲＴＨ２としては例えばマーモセットＣＲＴＨ２、カニクイザルＣＲＴＨ２およびアカゲザルＣＲＴＨ２が挙げられる。好ましくはカニクイザルＣＲＴＨ２が挙げられる。
　本発明の抗体としては、Ｆｃと抗体断片とが結合したＦｃ融合タンパク質、Ｆｃと天然に存在するリガンドまたは受容体とが結合したＦｃ融合タンパク質（イムノアドヘシンともいう）、複数のＦｃ領域を融合させたＦｃ融合タンパク質等も本発明に包含される。また、抗体を安定化させるためまたは血中半減期を制御するためにアミノ酸残基置換を行ったアミノ酸残基改変を含む改変Ｆｃ領域なども本発明の抗体に用いることができる。
　本発明において、抗体断片とは、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方を認識し、結合する抗原結合ドメインを含み、且つ抗原結合活性を有する断片である。本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｉｎｇｌｅ　ｃｈａｉｎ　Ｆｖ（以下、ｓｃＦｖと記す）、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよび複数のＣＤＲを含むペプチドなどが挙げられる。
　Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明のＦａｂは、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
　Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明のＦａｂ’は、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合するＦ（ａｂ’）２組成物を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを４個のＧｌｙおよび１個のＳｅｒ残基からなるリンカー（Ｇ４Ｓ）を任意の個数つなげたリンカーペプチドなどの適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ－Ｐ－ＶＬないしはＶＬ－Ｐ－ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
　本発明のｓｃＦｖは、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
　本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Protein Engineering, 7,697-704, 1994）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
　本発明のｄｓＦｖは、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
　本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
　また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
　上述の抗体または該抗体断片を構成するアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加され、かつ上述の抗体または該抗体断片と同様な活性を有するモノクローナル抗体または該抗体断片も、本発明の抗体または該抗体断片に包含される。欠失、置換、挿入または付加されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13,4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１～数十個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個である。
　本発明のヒトＣＲＴＨ２または抗体のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。
　天然型アミノ酸残基としては、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、Ｌ－システインなどが挙げられる。
　以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸、２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン、４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
　本発明の形質転換体としては、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体分子をコードするＤＮＡを宿主細胞に導入して得られる形質転換体であって、本発明の抗体を生産する形質転換体であればいかなる形質転換体でも包含される。具体的な例としては、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体分子をコードするＤＮＡを以下の（ａ）～（ｉ）などの宿主細胞に導入して得られる形質転換体が好例として挙げられる。
（ａ）チャイニーズハムスター卵巣組織由来ＣＨＯ細胞；
（ｂ）ラットミエローマ細胞株ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞；
（ｃ）マウスミエローマ細胞株ＮＳ０細胞；
（ｄ）マウスミエローマ細胞株ＳＰ２／０－Ａｇ１４細胞；
（ｅ）シリアンハムスター腎臓組織由来ＢＨＫ細胞；
（ｆ）抗体を産生するハイブリドーマ細胞；
（ｇ）ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞；
（ｈ）胚性幹細胞；
（ｉ）受精卵細胞。
　また、抗体のＦｃ領域にＮ－グリコシド結合糖鎖が結合し、該Ｎ－グリコシド結合糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースが結合していない抗体を生産する本発明の形質転換体としては、ヒトＣＲＴＨ２に特異的に結合する抗体分子をコードするＤＮＡを国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号に記載の方法で作製された糖転移酵素の低下または欠損した宿主細胞に導入して得られる形質転換体が好例として挙げられる。
　本発明の抗体または該抗体断片の製造法としては、本発明の抗体または該抗体断片を生産する形質転換体を培養する製造方法であれば、いかなる抗体製造方法でも包含されるが、好例として、本発明の抗体または該抗体断片を生産する形質転換体を培養し、培養物中に抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該抗体または該抗体断片を採取し、精製する抗体または該抗体断片の製造方法が挙げられる。
　上記製造法により製造される抗体または該抗体断片も、本発明の抗体または該抗体断片として挙げられる。
　本発明の組成物としては、本発明の抗体または該抗体断片を含む組成物であればいずれの組成物であってもよく、抗体に結合する糖鎖が単一の抗体分子を含む組成物、または複数の糖鎖構造を有する抗体分子を含む組成物であってもよい。また、適当な添加剤、バッファー等を含む組成物であってもよい。本発明の組成物としては、好ましくは本発明の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬、診断薬等が挙げられる。
　本発明の医薬または診断薬としては、本発明の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬または診断薬であればいかなる医薬または診断薬も含有される。好例として、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に関連した疾患の医薬または診断薬が挙げられる。
　本発明の治療方法としては、本発明の抗体または該抗体断片を有効量投与する治療方法であればいかなる治療方法も含まれるが、好ましくは、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に関連した疾患の治療方法が挙げられる。
　本発明の抗体または該抗体断片の使用としては、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に関連した疾患の治療薬を製造するための本発明の抗体または該抗体断片の使用であれば、いかなる抗体または該抗体断片の使用も含まれる。また、本発明の抗体または該抗体断片はヒトＣＲＴＨ２発現細胞が関係する障害または疾患の治療および予防の少なくとも一方に用いることができる。
　ヒトＣＲＴＨ２発現細胞が関係する障害または疾患としては、限定するものではないが、例えば、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患並びにＩＬＣ２の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患などが挙げられる。
　より具体的には、例えば、アレルギー性又は非アレルギー性鼻炎又は副鼻腔炎、慢性副鼻腔炎又は鼻炎、鼻ポリープ、鼻ポリープを伴う慢性副鼻腔炎、抗酸球性副鼻腔炎、急性副鼻腔炎、喘息、小児喘息、アレルギー性気管支炎、肺胞炎、農夫の疾患（Ｆａｒｍｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ）、過敏性気道、感染、例えば、細菌又はウイルス又は蠕虫又は真菌又は原生動物その他の病原に起因するアレルギー性結膜炎、気管支炎又は肺臓炎、気管支拡張症、成人呼吸促迫症候群、気管支及び肺浮腫、様々な起源、例えば毒ガス、蒸気の吸引、吸入に起因する気管支炎又は肺臓炎又は間質性肺臓炎、心不全、Ｘ線、放射線、化学療法に起因する気管支炎又は肺臓炎又は間質性肺臓炎、膠原病、例えばエリテマトーデス、全身性強皮症に関連する気管支炎又は肺臓炎又は間質性肺臓炎、肺線維症、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、様々な起源の間質性肺疾患又は間質性肺臓炎、例えば、石綿肺症、珪肺症、ｍ．Ｂｏｅｃｋ又はサルコイドーシス、肉芽腫症、嚢胞性線維症又はムコビシドーシス、又はα１－抗トリプシン欠乏症、好酸球性セルライト（例えば、Ｗｅｌｌ症候群）、好酸球性肺炎（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ症候群、慢性好酸球性肺炎）、好酸球性筋膜炎（例えば、Ｓｈｕｌｍａｎ症候群）、抗酸球性食道炎、抗酸球増加症候群、遅延型過敏、非アレルギー性喘息、運動誘発性気管支収縮；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性気管支炎、慢性気管支炎、肺気腫；全身性アナフィラキシー又は過敏性反応、薬物アレルギー（例えば、ペニシリン、セファロスポリンに対して）、汚染トリプトファンの摂取による好酸球増多筋痛症候群、昆虫刺傷アレルギー；自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、免疫性血小板減少症（成人ＩＴＰ、新生児血小板減少症、小児ＩＴＰ）、免疫性溶血性貧血（自己免疫及び薬物誘発）、Ｅｖａｎｓ症候群（血小板及び赤血球免疫性血球減少症）、新生児のＲｈ疾患、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ症候群（抗ＧＢＭ疾患）、セリアック病（Ｃｅｌｉａｃ）、自己免疫性心筋症、若年発症糖尿病；糸球体腎炎、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病；移植片拒絶（例えば、移植において）、例えば、同種移植片拒絶又は移植片対宿主病；炎症性腸疾患、例えばクローン病及び潰瘍性大腸炎；脊椎関節症；強皮症；乾癬（Ｔ細胞媒介乾癬を含めて）及び炎症性皮膚病、例えば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹（例えば、慢性突発性、慢性自発性、物理的蕁麻疹）、水疱性類天疱瘡；血管炎（例えば、壊死性、皮膚性、肉芽腫性及び過敏性血管炎、抗酸球性多発血管炎性肉芽腫症）；結節性紅斑；好酸球性筋炎、好酸球性筋膜炎、皮膚又は器官の白血球浸潤を伴う癌を含めた炎症性又はアレルギー性疾患及び状態が挙げられる。
　ヒトＣＲＴＨ２発現細胞が関係する障害または疾患として、好ましくは喘息、小児喘息、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎および急性または慢性副鼻腔炎が挙げられる。
　本発明の抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体を含有する医薬は、有効成分としての該抗体もしくは該抗体断片、又はこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において公知の方法により製造した医薬製剤として提供される。
　投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは腹腔内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。　
　経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などでが挙げられる。　
　本発明の抗体には、本発明の抗体またはその抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質、核酸などを化学的または遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
　抗体の誘導体を治療方法、予防方法、治療薬または治療薬として使用する場合には、本発明の抗体またはその抗体断片に結合する薬剤として、化学療法剤、抗体医薬、免疫賦活剤、高分子の薬剤などが挙げられる。タンパク質としては、サイトカイン、増殖因子、毒素タンパク質などが挙げられる。核酸としては、デコイ、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられる。
　抗体の誘導体を検出方法、定量方法、検出用試薬、または定量用試薬として使用する場合には、本発明の抗体またはその抗体断片に結合する薬剤として、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体が挙げられる。
　本発明における、抗体の誘導体は、本発明の抗体またはその抗体断片のＨ鎖またはＬ鎖のＮ末端側またはＣ末端側、抗体またはその抗体断片中の適当な置換基または側鎖、さらには抗体または該抗体断片中の糖鎖などに、放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法［抗体工学入門、地人書館（１９９４）記載の方法など］により結合させることにより製造することができる。
　また、本発明における、抗体の誘導体は、本発明の抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させる遺伝子工学的手法より製造することができる。
　放射性同位元素としては、例えば、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、または２１１Ａｔなどが挙げられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法などによって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレー卜する物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、例えば、１－イソチオシアネートベンジル－３－メチルジエチレン卜リアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）などが挙げられる。
　低分子の薬剤としては、例えば、アクリジニウムエステルもしくはロフィンなどの発光物質、またはフルオレセインイソチオシアネ一卜（ＦＩＴＣ）もしくはテトラメチルローダミンイソチオシアネ一卜（ＲＩＴＣ）などの蛍光物質などが挙げられる。
　低分子の薬剤と抗体とを結合させる方法としては、例えば、グルタールアルデヒドを介して薬剤と抗体のアミノ基聞を結合させる方法、または水溶性カルボジイミドを介して薬剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などが挙げられる。
　高分子の薬剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマ一、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマ一、またはヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどが挙げられる。
　免疫学的検出または測定方法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウエスタンブロット法または物理化学的手法などが挙げられる。
　本発明の抗体または該抗体断片を用いて、上記の方法に従いヒトＣＲＴＨ２が発現した細胞を検出または測定することにより、ヒトＣＲＴＨ２が関連する疾患を診断することができる。
　本発明においてヒトＣＲＴＨ２を検出または測定する対象となる生体試料としては、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液、肺胞洗浄液または培養液など、細胞外に分泌されたヒトＣＲＴＨ２もしくはその一部を含むペプチド断片、又はヒトＣＲＴＨ２を発現している細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
　本発明の抗体若しくはその抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、緩衝剤、塩などが挙げられる。検出用試薬としては、該抗体若しくはその抗体断片、またはこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、または標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬が挙げられる。
　以下に、本発明の抗体の製造方法、疾患の治療方法、及び疾患の診断方法について、具体的に説明する。
１．抗体の製造方法
（１）抗原の調製
　抗原となるヒトＣＲＴＨ２又はヒトＣＲＴＨ２を発現させた細胞は、ヒトＣＲＴＨ２全長又はその部分長をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞などに導入することにより、得ることができる。
　また、ヒトＣＲＴＨ２を多量に発現している各種ヒト培養細胞、ヒト組織などからヒトＣＲＴＨ２を精製することによっても、得ることができる。また、該培養細胞、又は該組織などをそのまま抗原として用いることもできる。さらに、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によりヒトＣＲＴＨ２の部分配列を有する合成ペプチドを調製し、抗原に用いることもできる。
　ヒトＣＲＴＨ２またはヒトＣＲＴＨ２の部分配列を有する合成ペプチドには、Ｃ末端もしくはＮ末端にＦＬＡＧもしくはＨｉｓなどの公知のタグが付加されていてもよい。
　本発明で用いられるヒトＣＲＴＨ２は、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)又はCurrent Protocols in molecular Biology、John Wiley ＆ Sons (1987-1997)などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ヒトＣＲＴＨ２をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
　まず、ヒトＣＲＴＨ２をコードする部分を含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。上記完全長ｃＤＮＡの代わりに、完全長ｃＤＮＡをもとにして調製された、ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を用いてもよい。次に、得られる該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞における自律複製又は染色体中への組込みが可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に、適当なプロモーターを含有しているものであればいずれも用いることができる。
　宿主細胞としては、大腸菌などのエシェリヒア属などに属する微生物、酵母、昆虫細胞、又は動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
　大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合、組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、ヒトＣＲＴＨ２をコードする部分を含むＤＮＡ、及び転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。
　また、該組換えベクターには、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。さらに、該組換えベクターには、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
　該組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ配列（ＳＤ配列ともいう）と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
　また、該ヒトＣＲＴＨ２をコードするＤＮＡの塩基配列としては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより目的とするヒトＣＲＴＨ２の生産率を向上させることができる　
　発現ベクターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（以上、ロシュ・ダイアグノスティックス社）、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社）、ｐＧＥＭＥＸ－１（プロメガ社）、ｐＱＥ－８（キアゲン社）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８－１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Agricultural Biological Chemistry、48、669(1984)］、ｐＬＳＡ１［Agric Biol. Chem.、53、277(1989)］、ｐＧＥＬ１［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４００）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＧＫＡ２［大腸菌ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ６７９８）より調製、日本国特開昭６０－２２１０９１号公報］、ｐＴｅｒｍ２（米国特許第４６８６１９１号明細書、米国特許第４９３９０９４号明細書、米国特許第５１６０７３５号明細書）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［J.Bacteriol., 172, 2392 (1990)］、ｐＧＥＸ（ファルマシア社）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社）、又はｐＭＥ１８ＳＦＬ３などが挙げられる。　
　プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、又はＴ７プロモーターなどの、大腸菌又はファージなどに由来するプロモーターを挙げることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、又はｌｅｔＩプロモーターなどの人為的に設計改変されたプロモーターなども用いることができる。
　宿主細胞としては、例えば、大腸菌ＸＬ－１Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９、又は大腸菌ＤＨ５αなどが挙げられる。　
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、使用する宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972); Gene, 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)］が挙げられる。　
　動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ｐｃＤＮＡ　Ｉ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平０３－２２９７９号公報； Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、ｐＡＳ３－３（日本国特開平０２－２２７０７５号公報）、ｐｃＤＭ８［Nature, 329, 840 (1987)］、ｐｃＤＮＡ　Ｉ／Ａｍｐ（インビトロジェン社）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６００１３５８号明細書）、ＩＮＰＥＰ４（Ｂｉｏｇｅｎ－ＩＤＥＣ社）およびトランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などが挙げられる。　
　プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ　ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーター若しくはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。　
　宿主細胞としては、例えば、ヒト白血病細胞Ｎａｍａｌｗａ細胞、サル細胞ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞［Journal of Experimental Medicine, 108, 945(1958); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275(1968); Genetics, 55, 513(1968); Chromosoma, 41, 129(1973); Methods in Cell Science, 18, 115(1996); Radiation Research, 148, 260(1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980); Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 60, 1275(1968); Cell, 6, 121(1975); Molecular Cell Genetics, Appendix I、II(pp.883-900)］、ＣＨＯ／ＤＧ４４、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｔ＃１１６１９）、Ｐｒｏ－３、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ又はＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３－０００２９９号公報）などが挙げられる。
　宿主細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、エレクトロポレーション法［Cytotechnology、3、133(1990)］、リン酸カルシウム法（日本国特開平０２－２２７０７５号公報）、又はリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)］などが挙げられる。　
　以上のようにして得られるヒトＣＲＴＨ２をコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、又は動物細胞などの由来の形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ヒトＣＲＴＨ２を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ヒトＣＲＴＨ２を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
　真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖又は糖鎖が付加されたヒトＣＲＴＨ２を得ることができる。　
　誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する場合にはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。　
　動物細胞を宿主として得られる形質転換体を培養する培地としては、例えば、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［The Journal of the American Medical Association、199、519(1967)］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Science, 122, 501(1952)］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Virology, 8, 396(1959)］、１９９培地［Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1(1950)］、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などを添加した培地などが挙げられる。培養は、通常ｐＨ６～８、３０～４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１～７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン又はペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。　
　ヒトＣＲＴＨ２をコードする遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、分泌生産又は融合蛋白質発現などの方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］を用いることができる。　
　ヒトＣＲＴＨ２の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、又は宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞、又は生産させるヒトＣＲＴＨ２の構造を変えることにより、適切な方法を選択することができる。
　ヒトＣＲＴＨ２が宿主細胞内又は宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［J. Biol. Chem., 264, 17619(1989)］、ロウらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,8227 (1989); Genes Develop., 4, 1288 (1990)］、日本国特開平０５－３３６９６３号公報、又は国際公開第９４／２３０２１号などに記載の方法を用いることにより、ヒトＣＲＴＨ２を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。　
　また、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系（日本国特開平０２－２２７０７５号公報）を利用してヒトＣＲＴＨ２の生産量を上昇させることもできる。
　得られるヒトＣＲＴＨ２は、例えば、以下のようにして単離、精製することができる。ヒトＣＲＴＨ２が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、又はダイノミルなどを用いて細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
　前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ　ＨＰＡ－７５（三菱化学社）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ファルマシア社）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、又は等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独又は組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。　
　ヒトＣＲＴＨ２が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、上記と同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ヒトＣＲＴＨ２の不溶体を回収する。回収した該ヒトＣＲＴＨ２の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ヒトＣＲＴＨ２を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。　
　ヒトＣＲＴＨ２又はその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清において該ヒトＣＲＴＨ２又はその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。該培養物を上記と同様に遠心分離などの手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。　
　また、本発明において用いられるヒトＣＲＴＨ２は、Ｆｍｏｃ法、又はｔＢｏｃ法などの化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンストケムテック社、パーキン・エルマー社、ファルマシア社、プロテインテクノロジインストルメント社、シンセセル－ベガ社、パーセプチブ社、又は島津製作所社などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。　
（２）動物の免疫と融合用抗体産生細胞の調製
　３～２０週令のマウス、ラット又はハムスターなどの動物に、（１）で得られる抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。また、免疫原性が低く上記の動物で充分な抗体価の上昇が認められない場合には、ヒトＣＲＴＨ２ノックアウトマウスを被免疫動物として用いることもできる。
　免疫は、動物の皮下、尾根部、静脈内又は腹腔内に、例えば、フロインドの完全アジュバント、又は水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどの適当なアジュバントとともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、又はＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。　
　抗原の投与は、１回目の投与の後、１～２週間おきに１～１０回行う。各投与後３～７日目に眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、その血清の抗体価を酵素免疫測定法［Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］などを用いて測定する。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示した動物を融合用抗体産生細胞の供給源とする。
　抗原の最終投与後３～７日目に、免疫した動物より脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を細断、ほぐした後、遠心分離し、さらに赤血球を除去して融合用抗体産生細胞を取得する。　
（３）骨髄腫細胞の調製
　骨髄腫細胞としては、マウスから得られる株化細胞を用い、例えば、８－アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来）骨髄腫細胞株Ｐ３－Ｘ６３Ａｇ８－Ｕ１（Ｐ３－Ｕ１）［Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1(1978)］、Ｐ３－ＮＳ１／１Ａｇ４１（ＮＳ－１）［European J. Immunology,6, 511(1976)］、ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＳＰ－２）［Nature, 276, 269(1978)］、Ｐ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３（６５３）［J. Immunology, 123, 1548(1979)］、又はＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８（Ｘ６３）［Nature, 256, 495(1975)］などを用いる。 
　該骨髄腫細胞は、正常培地［グルタミン、２－メルカプトエタノール、ジェンタマイシン、ＦＢＳ、及び８－アザグアニンを加えたＲＰＭＩ１６４０培地］で継代し、細胞融合の３～４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合とモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製
　（２）で得られる融合用抗体産生細胞と（３）で得られる骨髄腫細胞をＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地又はＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸一カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、融合用抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５～１０：１になるよう混合し、遠心分離した後、上清を除く。
　沈澱した細胞群をよくほぐした後、ポリエチレングリコール－１０００（ＰＥＧ－１０００）、ＭＥＭ培地及びジメチルスルホキシドの混液を３７℃で、攪拌しながら加える。さらに１～２分間毎にＭＥＭ培地１～２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離後、上清を除く。
　沈澱した細胞群をゆるやかにほぐした後、融合用抗体産生細胞にＨＡＴ培地［ヒポキサンチン、チミジン、及びアミノプテリンを加えた正常培地］中にゆるやかに細胞を懸濁する。この懸濁液を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中、７～１４日間培養する。　
　培養後、培養上清の一部を抜き取り、後述のヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対する反応性解析などのハイブリドーマの選択方法により、ヒトＣＲＴＨ２を含む抗原に反応し、ヒトＣＲＴＨ２を含まない抗原に反応しない細胞群を選択する。次に、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し［１回目はＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は正常培地を使用する］、安定して強い抗体価の認められるものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択する。　
（５）精製モノクローナル抗体の調製
　プリスタン処理［２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する］した８～１０週令のマウス又はヌードマウスに、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを腹腔内に注射する。１０～２１日でハイブリドーマは腹水がん化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離して固形分を除去後、４０～５０％硫酸アンモニウムで塩析し、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ－セファロースカラム、プロテインＡ－カラム又はゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ又はＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
　また、（４）で得られるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、１０％ＦＢＳ添加を添加したＲＰＭＩ１６４０培地などで培養した後、遠心分離により上清を除き、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地に懸濁し、３～７日間培養する。得られる細胞懸濁液を遠心分離し、得られる上清よりプロテインＡ－カラム又はプロテインＧ－カラムによる精製を行ない、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得ることもできる。なお、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地には５％ダイゴＧＦ２１を添加することもできる。　
　抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法又は２８０ｎｍでの吸光度より算出する。　
（６）モノクローナル抗体の選択
　モノクローナル抗体の選択は、以下に示す通り、ヒトＣＲＴＨ２を発現する細胞に対する反応性をフローサイトメトリーで解析することにより行う。
　ヒトＣＲＴＨ２を発現する細胞としては、例えば（１）で得られるヒトＣＲＴＨ２をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを動物細胞などに導入して得られる遺伝子導入細胞や、ヒトの好酸球、好塩基球、Ｔｈ２、ＩＬＣ２、ｎｏｎ　ｃｌａｓｓｉｃａｌ　ｍｏｎｏｃｙｔｅおよびＴｈ２／Ｔｈ１７細胞などが挙げられる。
　細胞を９６ウェルプレートなどのプレートに分注した後、第１抗体として血清、ハイブリドーマの培養上清又は精製モノクローナル抗体などの被験物質を分注し、反応させる。反応後の細胞を１～１０％ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ－ＰＢＳと記す）などで、よく洗浄した後、第２抗体として蛍光試薬などで標識した抗イムノグロブリン抗体を分注して反応させる。ＢＳＡ－ＰＢＳなどでよく洗浄した後、フローサイトメーターを用いて標識化抗体の蛍光量を測定することにより、発現細胞に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を選択する。
　また、本発明のモノクローナル抗体と競合してヒトＣＲＴＨ２に結合するモノクローナル抗体は、上述のフローサイトメトリーを用いた結合反応検出系に、被検抗体を添加して反応させることで取得できる。
　すなわち、被検抗体を加えた時に本発明のモノクローナル抗体の結合が阻害される抗体をスクリーニングすることにより、ヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列、又はその立体構造への結合について、本発明で取得したモノクローナル抗体と競合するモノクローナル抗体を取得することができる。　
　さらに、本発明のヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列、又はその立体構造に結合するモノクローナル抗体が認識するエピトープと同じエピトープに結合する抗体は、上述のフローサイトメトリーを用いた結合反応検出系で取得された抗体のエピトープを同定し、同定したエピトープの、部分的な合成ペプチド、又はエピトープの立体構造に擬態させた合成ペプチド等を作製し、免疫することで、取得することができる。　
２．遺伝子組換え抗体の作製
　遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体及びヒト化抗体の作製方法を示す。
（１）遺伝子組換え抗体発現用ベクターの構築
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターは、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。　
　ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨ及びκクラスのＣＬなどを用いる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡには、ｃＤＮＡを用いるが、エキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることもできる。
　動物細胞用発現ベクターには、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７［Cytotechnol.,3, 133(1990)］、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochem., 101, 1307(1987）］、ｐＨＳＧ２７４［Gene, 27, 223(1984)］、ｐＫＣＲ［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527(1981)］、ｐＳＧ１ｂｄ２－４［Cytotechnol., 4, 173(1990)］、又はｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１－３［Cytotechnol., 13, 79(1993)］などを用いる。
　動物細胞用発現ベクターのうちプロモーターとエンハンサーには、ＳＶ４０の初期プロモーター［J. Biochem., 101, 1307(1987)］、モロニーマウス白血病ウイルスＬＴＲ［Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 960(1987)］、又は免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター［Cell, 41, 479(1985)］とエンハンサー［Cell, 33, 717(1983)］などを用いる。
　遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、遺伝子組換え抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点から、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が同一のベクター上に存在するタイプ(タンデム型)の遺伝子組換え抗体発現用ベクター［J. Immunol. Methods, 167, 271 (1994)］を用いるが、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するセパレートベクターを用いることもできる。タンデム型の遺伝子組換え抗体発現用ベクターには、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、ｐＥＥ１８［Hybridoma, 17, 559 (1998)］などを用いる。 
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析
　非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡの取得及びアミノ酸配列の解析は以下のようにして行うことができる。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ又はプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。
　前記ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分又はＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ又は組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨ又はＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨ又はＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
　非ヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製するヒト以外の動物には、マウス、ラット、ハムスター、又はラビットなどを用いるが、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。
　ハイブリドーマ細胞からの全ＲＮＡの調製には、チオシアン酸グアニジン－トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)］、又はＲＮＡ　ｅａｓｙ　ｋｉｔ（キアゲン社）などのキットなどを用いる。　
　全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製には、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)］、又はＯｌｉｇｏ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などのキットなどを用いる。また、Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社）、又はＱｕｉｃｋＰｒｅｐ　ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ファルマシア社）などのキットを用いてハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製することもできる。　
　ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリーの作製には、公知の方法［Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in molecular Biology、Supplement 1, John Wiley＆Sons(1987-1997)］、SperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(インビトロジェン社)、又はＺＡＰ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ストラタジーン社）などのキットなどを用いる。　
　ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターには、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。
　例えば、ＺＡＰ　ＥｘＰｒｅｓｓ［Strategies, 5, 58(1992)］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）［Nucleic Acids Research, 17, 9494(1989)］、λＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［DNA Cloning:A Practical Approach, I, 49(1985)］、Ｌａｍｂｄａ　ＢｌｕｅＭｉｄ（クローンテック社）、λＥｘ　Ｃｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３－１８Ｕ（ファルマシア社）、ｐｃＤ２［Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)］、又はｐＵＣ１８［Gene, 33, 103 (1985)］などを用いる。 
　ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌には、該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ－１Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ［Strategies, 5, 81(1992)］、Ｃ６００［Genetics, 39, 440(1954)］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Science, 222, 778(1983)］、ＮＭ５２２［J. Mol. Biol., 166, 1(1983)］、Ｋ８０２［J. Mol. Biol., 16, 118(1966)］、又はＪＭ１０５［Gene, 38, 275(1985)］などを用いる。 
　ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択には、アイソトープ又は蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法、又はプラーク・ハイブリダイゼーション法［Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Edition、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)］などを用いる。
　また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ法［以下、PCR法と記す、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in molecular Biology, Supplement 1, John Wiley＆Sons(1987-1997)］を行うことよりＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。　
　選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社）などのプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法などにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定する。塩基配列解析方法には、例えば、ジデオキシ法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)］などの反応を行った後、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７００（ＰＥバイオシステムズ社）又はＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（ファルマシア社）などの塩基配列自動分析装置などを用いる。
　決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認する。 
　分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)］と比較することによって見出すことができる。 
　また、得られるＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて、例えば、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ又はＰＩＲ－Ｐｒｏｔｅｉｎなどの任意のデータベースに対してＢＬＡＳＴ法［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］などの相同性検索を行い、ＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列が新規なものかを確認できる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれ非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングすることで、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。　
　非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡの３’末端側と、ヒト抗体のＣＨ又はＣＬの５’末端側とを連結するために、連結部分の塩基配列が適切なアミノ酸をコードし、かつ適当な制限酵素認識配列になるように設計したＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを作製する。　
　作製されたＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築する。　
　また、非ヒト抗体ＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
（４）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
　ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。
　非ヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列をそれぞれ選択する。選択するＦＲのアミノ酸配列には、ヒト抗体由来のものであれば、いずれのものでも用いることができる。
　例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列、又はヒト抗体のＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［A.L.F.DNA, US Dept. Health and Human Services(1991)］などを用いる。抗体の結合活性の低下を抑えるため、元の抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）のＦＲのアミノ酸配列を選択する。
　次に、選択したヒト抗体のＶＨ又はＶＬのＦＲのアミノ酸配列に、もとの抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［A.L.F.DNA,US Dept. Health and Human Services(1991)］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。
　設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ反応を行う。この場合、ＰＣＲ反応での反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、好ましくはＨ鎖、Ｌ鎖それぞれについて各６本の合成ＤＮＡを設計する。また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、容易に、ヒト化抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターに、クローニングすることができる。　
　ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（－）（ストラタジーン社）などのプラスミドにそれぞれクローニングし、（２）に記載の方法と同様の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＨ鎖全長又はＬ鎖全長のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
　または、設計したＤＮＡ配列に基づき、ＶＨ全長およびＶＬ全長を各々１本の長鎖ＤＮＡとして合成したものを、上記ＰＣＲ増幅産物に代えて用いることもできる。さらに、合成長鎖ＤＮＡの両端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、ヒト化抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターへ容易にクローニングすることができる。
（５）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
　ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト抗体に比べて低下する［BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)］。ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、及び抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらのアミノ酸残基を元の非ヒト抗体のアミノ酸残基に置換することにより、低下した抗原結合活性を上昇させることができる。
　抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を同定するために、Ｘ線結晶解析［J. Mol. Biol.、112、535 (1977)］又はコンピューターモデリング［Protein Engineering, 7, 1501 (1994)］などを用いることにより、抗体の立体構造の構築及び解析を行うことができる。また、それぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討することを繰り返し、試行錯誤することで必要な抗原結合活性を有するヒト化抗体を取得できる。 
　ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基は、改変用合成ＤＮＡを用いて（４）に記載のＰＣＲ反応を行うことにより、置換することができる。ＰＣＲ反応後の増幅産物について（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。　
（６）ヒト化抗体発現ベクターの構築
　（１）で得られる遺伝子組換え抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築した遺伝子組換え抗体のＶＨ又はＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。
　例えば、（４）及び（５）で得られるヒト化抗体のＶＨ又はＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、（１）で得られるヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨ又はＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングする。
（７）遺伝子組換え抗体の一過性発現
　（３）及び（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクター、又はそれらを改変した発現ベクターを用いて遺伝子組換え抗体の一過性発現を行い、作製した多種類の遺伝子組換え抗体の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
　発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、例えばＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５１）を用いる［Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press, 283(1991)］。
　ＣＯＳ－７細胞への発現ベクターの導入には、ＤＥＡＥ－デキストラン法［Methods in Nucleic Acids Res., CRC Press(1991)］、又はリポフェクション法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413(1987)］などを用いる。 
　発現ベクターの導入後、培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック(1987)］などを用いて測定する。 
（８）遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株の取得と遺伝子組換え抗体の調製
　（３）及び（６）で得られる遺伝子組換え抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。　
　宿主細胞への発現ベクターの導入には、エレクトロポレーション法［日本国特開平０２－２５７８９１号公報；Cytotechnology, 3, 133(1990)］などを用いる。 
　遺伝子組換え抗体発現ベクターを導入する宿主細胞には、遺伝子組換え抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－６１）、ＤＵｋＸＢ１１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－９０９６）、Ｐｒｏ－５（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ－１７８１）、ＣＨＯ－Ｓ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ＃１１６１９）、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ　Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、以下、ＤＨＦＲと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216(1980)］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 55(1986)］、α1,6－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２）などを用いる。　
　発現ベクターの導入後、遺伝子組換え抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８硫酸塩などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平０２－２５７８９１号公報）。　
　動物細胞培養用培地には、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社）、ＧＩＴ培地（日本製薬社）、ＥＸ－ＣＥＬＬ３０１培地（ジェイアールエイチ社）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ培地（インビトロジェン社）、又はこれら培地にＦＢＳなどの各種添加物を添加した培地などを用いる。　
　得られる形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に遺伝子組換え抗体を発現蓄積させる。培養上清中の遺伝子組換え抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、ＤＨＦＲ増幅系（日本国特開平０２－２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換株が産生する遺伝子組換え抗体の発現量を上昇させることができる。
　遺伝子組換え抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡ－カラムを用いて精製する［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］。また、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過などの蛋白質の精製で用いられる方法を組み合わすこともできる。 
　精製した遺伝子組換え抗体のＨ鎖、Ｌ鎖または抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Nature, 227, 680(1970)］、又はウエスタンブロッティング法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)］など用いて測定することができる。 
３.精製モノクローナル抗体又は該抗体断片の活性評価
　精製した本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片の活性評価は、以下のように行うことができる。 
　ヒトＣＲＴＨ２発現細胞株に対する結合活性は、例えば前述の１．（６）記載のフローサイトメトリーを用いた結合反応検出系などの蛍光抗体法［Cancer Immunol.Immunother., 36, 373(1993)］を用いて測定できる。 
　ヒトＣＲＴＨ２陽性培養細胞株に対するＣＤＣ活性、又はＡＤＣＣ活性は公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373(1993); Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons,Inc.,(1993)］により測定する。 
４．抗体のエフェクター活性を制御する方法
　本発明のモノクローナル抗体のエフェクター活性を制御する方法としては、抗体のＦｃ領域の２９７番目のアスパラギン（Ａｓｎ）に結合するＮ結合複合型糖鎖の還元末端に存在するＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）、又は抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することで制御する方法などが知られている。本発明のモノクローナル抗体にはいずれの方法を用いても、エフェクター活性を制御することができる。
　エフェクター活性とは、抗体のＦｃ領域を介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、又はマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＡＤＰ活性）などが知られている。　
　エフェクター活性の測定法として、例えば、標的として炎症性細胞、エフェクターとしてヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、そして炎症性細胞特異的な抗体を混合し、４時間程度インキュベーションした後、細胞障害の指標として遊離してきた乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定することができる。もしくは、ヒトＰＢＭＣに、例えばＣＤ２０の様な血液細胞特異的な抗原を認識する抗体を混合し、インキュベーションした後、遊離ＬＤＨの測定やフローサイトメトリーによる該細胞数の減少をエフェクター活性として測定することができる。
　抗体のＦｃのＮ結合複合型糖鎖のコアフコースの含量を制御することで、抗体のエフェクター活性を増加又は低下させることができる。抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を低下させる方法としては、例えば、α１，６－フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞を用いて抗体を発現させる方法が挙げられ、フコースが結合していない抗体を取得することができる。フコースが結合していない抗体は高いＡＤＣＣ活性を有する。　
　一方、抗体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に結合するフコースの含量を増加させる方法としては、例えば、α１，６－フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いて抗体を発現させる方法が挙げられ、フコースが結合している抗体を取得することができる。フコースが結合している抗体は、フコースが結合していない抗体よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。　
　また、抗体のＦｃ領域のアミノ酸残基を改変することでＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を増加又は低下させることができる。例えば、米国特許公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃ領域のアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。　
　また、米国特許第６７３７０５６号明細書、米国特許第７２９７７７５号明細書又は米国特許第７３１７０９１号明細書に記載のアミノ酸改変を行うことで、ＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を、増加させることも低下させることもできる。
　また本発明の抗体には、上述の抗体定常領域におけるアミノ酸改変や糖鎖改変に合わせて例えば日本国特開２０１３－１６５７１６号公報、日本国特開２０１２－０２１００４号公報などに記載のアミノ酸改変を行うことにより、Ｆｃ受容体への反応性を制御することで血中半減期を制御した抗体も含まれる。
　さらに、上述の方法を組み合わせて、一つの抗体に使用することにより、抗体のエフェクター活性や血中半減期が制御された抗体を取得することができる。
５．本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を用いた疾患の治療方法
　本発明の抗体は、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療に用いることができる。投与経路としては、例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは腹腔内などの非経口投与が挙げられる。投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、坐剤、注射剤、軟膏、又はテープ剤などが挙げられる。
　経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、又は顆粒剤などが挙げられる。
　乳剤又はシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール若しくは果糖などの糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油若しくは大豆油などの油類、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、又はストロベリーフレーバー若しくはペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造する。
　カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトールなどの賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤又はグリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造する。
　非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、坐剤、又は噴霧剤などが挙げられる。
　注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、又はその両者の混合物からなる担体などを用いて製造する。
　坐剤はカカオ脂、水素化脂肪、又はカルボン酸などの担体を用いて製造する。
　噴霧剤は受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片を微細な粒子として分散させ、吸収を容易にさせる担体などを用いて製造する。担体としては、例えば乳糖又はグリセリンなどを用いる。また、エアロゾル又はドライパウダーとして製造することもできる。
　さらに、上記非経口剤においても、経口投与に適当な製剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
６．本発明の抗体又は該抗体断片を用いた疾患の診断方法
　本発明の抗体又は該抗体断片を用いて、ヒトＣＲＴＨ２又はヒトＣＲＴＨ２が発現した細胞を検出又は測定することにより、ヒトＣＲＴＨ２が関連する疾患を診断することができる。
　ヒトＣＲＴＨ２が関連する疾患の一つであるアレルギー疾患の診断は、例えば、患者由来の末梢血、喀痰、鼻汁または肺胞洗浄液などに存在する炎症性細胞に発現しているヒトＣＲＴＨ２をフローサイトメーターなどの免疫学的手法を用いて検出することにより行うことができる。
　免疫学的手法とは、標識を施した抗原又は抗体を用いて、抗体量又は抗原量を検出又は測定する方法である。例えば、放射性物質標識免疫抗体法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウエスタンブロット法又は物理化学的手法などを用いる。
　放射性物質標識免疫抗体法は、例えば、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体又は該抗体断片を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する。
　酵素免疫測定法は、例えば、抗原又は抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体又は該抗体断片を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体又は結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する。例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などを用いる。　
　酵素免疫測定法で用いる標識体としては、公知［酵素免疫測定法、医学書院（１９８７）］の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、又はビオチン標識などを用いる。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出又は測定対象である抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出又は測定したい抗原を認識する抗体又は抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、第１の抗体又は抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、次に第２の抗体又は抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、又はビオチンなどで標識しておく。
　上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞又はその破砕液、組織又はその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、又は眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体又は抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出する。
　サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体又は抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体又は抗体断片との組み合わせでもよい。
　蛍光免疫測定法は、文献［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996)、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック(1987)］などに記載された方法で測定する。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、例えば、公知［蛍光抗体法、ソフトサイエンス社（１９８３）］の蛍光標識が挙げられる。例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、又はテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）などが挙げられる。
　発光免疫測定法は文献［生物発光と化学発光　臨床検査４２、廣川書店（１９９８）］などに記載された方法で測定する。発光免疫測定法で用いる標識体としては、例えば、公知の発光体標識が挙げられ、アクリジニウムエステル、ロフィンなどが挙げられる。
　ウエスタンブロット法は、抗原又は抗原を発現した細胞などをＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）－ＰＡＧＥ［Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］で分画した後、該ゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜又はニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体又は抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、又はビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体又は結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって測定する。一例を以下に示す。
　配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞又は組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりの蛋白量として０．１～３０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動された蛋白質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１～１０％ＢＳＡ－ＰＢＳに室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。
　ここで本発明の抗体を反応させ、０．０５～０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳと記す）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ－ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（アマシャム社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出する。ウエスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。
　物理化学的手法は、例えば、抗原であるヒトＣＲＴＨ２と本発明のモノクローナル抗体又は該抗体断片とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法として、例えば、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法又はラテックス免疫比濁法［臨床検査法提要、金原出版（１９９８）］などが挙げられる。
　ラテックス免疫比濁法は、抗体又は抗原を感作させた粒径０．１～１μｍ程度のポリスチレンラテックスなどの担体を用い、対応する抗原又は抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度又は積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定する。
　本発明の抗体又は該抗体断片を用いて、当該抗体による治療有効性を治療開始前に判断する方法としては、例えば以下が挙げられる。
　まず、治療開始前に、患者体内から例えば末梢血、喀痰、肺胞洗浄液、鼻汁などを採取し、その懸濁液に本発明の抗体又は該抗体断片を添加し、一定時間後、炎症性細胞の除去やＴｈ２タイプサイトカインなどの生体機能分子に対する阻害活性をはじめとした、抗炎症性細胞活性を測定する。測定の結果、抗炎症性細胞活性が検出された場合、その末梢血、喀痰、鼻汁などを有する患者の治療には、本発明の抗体又は該抗体断片が有効であると治療開始前に判断することができる。
　以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
ヒトＣＲＴＨ２発現細胞の造成
（１）ヒトＣＲＴＨ２発現ベクターの作製
　ヒトＣＲＴＨ２（以下ＣＲＴＨ２と記すこともある）のｃＤＮＡは全合成し、以降の試験に用いた。ヒトＣＲＴＨ２のｃＤＮＡ配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に記載する。
（ｉ）ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターの構築
　制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩを用いて、ヒトＣＲＴＨ２のｃＤＮＡをベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）と連結し、ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを構築した。
（ｉｉ）ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターの構築
　ｐＡＭｏｈ（国際公開第０３／０８７３６６号）に対しても、制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてヒトＣＲＴＨ２遺伝子を組み込み、ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターを構築した。
（２）ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の造成
　ＤＨＦＲ遺伝子欠損ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞ＤＧ４４株（ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞）を、三菱化学株式会社・横浜総合研究所より入手し、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞造成に使用した。培養には１０％透析ウシ胎児血清（ｄＦＢＳ）（ＧＩＢＣＯ社）、ＨＴ［ヒポキサンチン（Ｈ）、チミジン（Ｔ）］ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ社）、及び５０μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシン（ナカライテスク社）を添加したＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ社）（以下、ＩＭＤＭ培養培地と略記する）を用いた。
　まず、（１）－（ｉ）で作製されたヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを制限酵素ＡａｔＩＩ処理によって切断し、得られた直鎖状ＤＮＡを精製し、滅菌水に溶解した。このＤＮＡをエレクトロポレーション法により、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に導入し、ＨＴ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを抜いたＩＭＤＭ培養培地にて３日程度培養した。
　その後、１０％ｄＦＢＳ、０．５ｍｇ／ｍＬ　Ｇ４１８（ナカライテスク社）、及び５０μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシン（ナカライテスク社）を加えたＩＭＤＭ（以下、ＩＭＤＭ選択培地と略記する）で薬剤耐性細胞を選択した。選択した薬剤耐性細胞を、９６ウェルプレートに７５ｃｅｌｌｓ／プレートとなる様に播種し、さらに２週間ほどＩＭＤＭ選択培地にて培養した。ウェル毎に顕微鏡下で観察し、シングルクローンとなっているものを順次拡大培養した。
　得られた薬剤耐性細胞を０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社）で剥離し、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．０５％ＮａＮ３及び１ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｍｅｄｉｕｍ、以下ＳＭと略記する）で懸濁した。次に、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレートに播種し、１７００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。
　上清を除いた後、ＳＭで調製したＰＥ標識抗ヒトＣＲＴＨ２抗体（ベックマンコールター社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。ヒトＣＲＴＨ２が高発現するクローンを選択し、この細胞をヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞とした。
（３）ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現ベクターの作製
（ｉ）ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターの構築
　（１）－（ｉｉ）で作製されたヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈから、プライマーｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ－Ａ（配列番号３）及びｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ－Ｂ（配列番号４）を用いて、Ｃ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＣＲＴＨ２（配列番号５）をｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲと記す）で増幅し、制限酵素ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ベクターｐＡＭｏｈ（国際公開第０３／０８７３６６号）と連結し、ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターを構築した。
（ｉｉ）ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターの構築
　（３）－（ｉ）で構築されたＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターから、プライマーｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ－Ｃ（配列番号６）及びｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ－Ｄ（配列番号７）を用いて、Ｃ末端にＦＬＡＧタグが付加されたヒトＣＲＴＨ２をＰＣＲで増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩを用いて、ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）と連結し、ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを構築した。
（４）ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１－Ｂ細胞の造成
　ラット３Ｙ１－Ｂ細胞を、理研バイオリソースセンターより入手し、ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現細胞造成に使用した。培養には１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社）、及び５０μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシン（ナカライテスク社）を添加したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）（以下、ＤＭＥＭ培養培地と略記する）を用いた。
　（３）－（ｉｉ）で作製されたＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＫＡＮＴＥＸ９３ベクターを制限酵素ＡａｔＩＩ処理によって切断し、得られた直鎖状ＤＮＡを精製し、滅菌水に溶解した。このＤＮＡを、Ｆｕｇｅｎｅ６（プロメガ社）を用いたＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ法により３Ｙ１－Ｂ細胞に導入し、ＤＭＥＭ培養培地にて３日間程度培養した。その後、１０％ＦＢＳ、０．８ｍｇ／ｍＬ　Ｇ４１８（ナカライテスク社）、及び５０μｇ／ｍＬ　ゲンタマイシン（ナカライテスク社）を添加したＤＭＥＭ（以下、ＤＭＥＭ選択培地）で薬剤耐性細胞を選択した。
　得られた薬剤耐性細胞を０．０５％トリプシン溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＳＭで懸濁した。次に、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレートに播種し、１７００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで調製したＰＥ標識抗ヒトＣＲＴＨ２抗体（ベックマンコールター社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ）で解析した。ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２を高発現する画分をシングルセルソーティングし、拡大培養を行い、ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１－Ｂ細胞とした。
［実施例２］
ヒトＣＲＴＨ２に対する抗体モノクローナル抗体の作製
（１）ラットへの免疫
　ヒトＣＲＴＨ２に対するモノクローナル抗体を取得するために、初回投与時の週齢が９週齢の雌性ＷＫＹ／ＮＣｒｌＣｒｌｊラット（ＷＫＹラット）（チャールスリバー社）に免疫した。
　初回投与は、５×１０６ｃｅｌｌｓのＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１－Ｂ細胞を１００μＬの生理食塩液（大塚製薬工場社）に懸濁し、Ｓｉｇｍａ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（シグマアルドリッチ社）１００μＬと合わせて２００μＬの細胞懸濁液を調製し、１ヶ所あたり１００μＬをＷＫＹラットの尾根部に左右２ヶ所筋肉内投与した。
　また初回投与２週間後に、５×１０６ｃｅｌｌｓのＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１－Ｂ細胞を２００μＬの生理食塩液に懸濁し、同様の方法で投与を行った。
（２）ハイブリドーマの作製
　（１）で２回目の免疫を行った３日後に、外科的にＷＫＹラットから腸骨リンパ節を摘出し、細胞融合に供した。
　まず、摘出した腸骨リンパ節をスライドガラスですりつぶし、組織をほぐした。この腸骨リンパ節組織をＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉａ（ＭＥＭ）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、セルストレーナーを通すことにより、余分な組織を除いた。１２００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより上清を除いた後、再びＭＥＭで懸濁し、腸骨リンパ節細胞とした。
　得られた腸骨リンパ節細胞数に対し、１／５細胞数のマウスミエローマ細胞株Ｐ３－Ｕ１（ＡＴＣＣ）を混合した。遠心分離により上清を除いた後、３７℃の温浴の中で温めつつ、５００μＬのＰＥＧ溶液［Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　１０００（純正化学社）及びＭＥＭをそれぞれ１ｍＬずつ混合し、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）（シグマアルドリッチ社）を３５０μＬ加えたもの］を穏やかに添加し、そこに１分毎にＭＥＭ　１ｍＬを５回加えた後さらに４５ｍＬのＭＥＭを添加した。
　９００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより上清を除いた後、細胞をＨＡＴ培地［５００ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０（和光純薬社）に対し、１０ｍＬのＨＡＴ（ヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、チミジン（Ｔ））溶液（ＧＩＢＣＯ社）、０．５ｍＬの５５ｍｍｏｌ／Ｌ　２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、５０ｍＬのウシ胎児血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）、および０．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン溶液（ナカライテスク社）を添加したもの］で懸濁し、９６ウェルプレートに播種し、培養した。
（３）ハイブリドーマスクリーニング
　（２）で播種されたハイブリドーマを７日間培養した後、各ウェルの培養上清を採取し、ヒトＣＲＴＨ２に対する反応性を解析した。陽性対照細胞及び陰性対照細胞は、それぞれヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ／ＤＧ４４細胞とした。まず、陽性対照細胞及び陰性対照細胞を０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製）で剥離し、１ウェルあたりそれぞれ１×１０５ｃｅｌｌｓ／５０μＬとなるように９６ウェルプレートに播種し、５０μＬの培養上清を添加し、４℃で３０分間の反応を行った。
　細胞を洗浄した後、ＳＭで３００倍に希釈したＡｎｔｉ－ｒａｔ　ＩｇＧ（Ｆｃ）－Ｄｙｌｉｇｈｔ４８８（ａｂｃａｍ社）１００μＬで懸濁し、４℃で３０分間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
　ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に特異的な反応が見られたウェルのハイブリドーマについて、クローニング培地［エス・クロン　クローニングメデュームＣＭ－Ｂ（エーディア社）に、０．５ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン溶液（ナカライテスク社）、５ｍＬのＨＴ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したもの］を用いて限界希釈法によるシングルセルクローニングを２回行った。最終的に、ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に最も強いフローサイトメトリー反応性を示すハイブリドーマＬｙｍ２クローン（以下、ハイブリドーマＬｙｍ２と記す）を樹立した。
（４）ハイブリドーマＬｙｍ２の培養上清に含まれる抗体のサブクラスの同定
　ハイブリドーマＬｙｍ２を３日間培養した培養上清をＰＢＳ（ナカライテスク社製）で１０倍に希釈し、その希釈液を１５０μＬ用いてＲａｔ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ　Ｔｅｓｔ　Ｋｉｔ（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ社）で添付の説明書に従いサブクラスの解析を行った。
　その結果、ハイブリドーマＬｙｍ２の培養上清中に含まれるラット抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体（以下、単にＬｙｍ２抗体と略記する場合もある）はラットＩｇＧ２ｂ抗体であることが明らかになった。
（５）Ｌｙｍ２抗体の精製
　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に５％のＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　ＩｇＧ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を加えた培地で、ハイブリドーマＬｙｍ２を１週間培養した。培養上清を回収し精製に供した。
　培養上清から、Ｐｒｏｓｅｐ－Ｇ（ＧＥヘルスケア社）を用いて、Ｌｙｍ２抗体を精製した。まず、培養上清をカラムにロードし、ＰＢＳでカラムを洗浄した後、ｐＨ５．０、３．５および３．０の溶出バッファー（０．１Ｍクエン酸一水和物－ＮａＯＨ／ｐＨ５．０、３．５および３．０）で順に溶出した。溶出したフラクションは速やかに中和バッファー（２Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ｐＨ８．５）で中和した。
　それぞれのフラクションの吸光度（２８０ｎｍ）を測定し、測定値の高い連続フラクションを抗体画分として回収した。ＰＢＳで透析を行い、０．２２μｍのフィルターを通したものを精製タンパク質とした。２８０ｎｍの吸光係数を１．４として、濃度を算出した。
［実施例３］
Ｌｙｍ２抗体のフローサイトメトリーによる抗原結合性評価
　ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１－Ｂ細胞を０．０５％トリプシン溶液（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＳＭで懸濁した。次に、１ウェルあたり２×１０５ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、１７００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで１０μｇ／ｍＬになるように調製したＬｙｍ２抗体を１００μＬ添加し、４℃で１時間の反応を行った。
　細胞を洗浄した後、ＳＭで１００倍に希釈したＡｎｔｉ－ｒａｔＩｇＧ－ＦＩＴＣ（ベックマンコールター社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社製、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。その結果、Ｌｙｍ２抗体のＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１－Ｂ細胞への結合が認められた。
［実施例４］
Ｌｙｍ２抗体重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子のクローニング
　ＲＮＡｉｓｏ　ｐｌｕｓ（タカラバイオ社）を用いて、添付の説明書に従い、ＰＢＳで洗浄したハイブリドーマＬｙｍ２を溶解し、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製した。得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡは、ＤＥＰＣ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗａｔｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に溶解した。次に、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ－ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞ｍＲＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＦｒｏｍＴｏｔａｌ　ＲＮＡ）（タカラバイオ社）を用いて、添付の説明書に従い、得られたｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｍＲＮＡを精製した。さらに、ＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、添付の説明書に従い、精製したｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。
　得られたｃＤＮＡを鋳型に、プライマーＲａｔＩｇＧ２ｂＨ－Ａ（配列番号８）及びＲａｔＩｇＧ２ｂＨ－Ｂ（配列番号９）を用いて、ラットＩｇＧ２ｂ重鎖遺伝子を、プライマーＲａｔｋ－Ａ（配列番号１０）及びＲａｔｋ－Ｂ（配列番号１１）を用いて、ラット軽鎖（κ鎖）遺伝子を、それぞれＰＣＲにより増幅した。増幅した遺伝子をサブクローニングし、塩基配列を解析した。
　その結果、シグナル配列を含むＬｙｍ２抗体のＶＨおよびＶＬの塩基配列およびアミノ酸配列を同定した。ＶＨ、ＶＬそれぞれの塩基配列を配列番号１２、１４、アミノ酸配列を配列番号１３、１５に示した。また、Ｋａｂａｔら［Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services(1991)］の報告から、シグナル配列を含まないＬｙｍ２抗体のＶＨおよびＶＬの配列を同定した。
　シグナル配列を除いたＶＨ、ＶＬそれぞれの塩基配列を配列番号１６、１８に、アミノ酸配列を配列番号１７、１９に示した。また、Ｌｙｍ２抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２０、２１、及び２２に、Ｌｙｍ２抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３、２４、及び２５に示した。
［実施例５］
ラット／ヒトキメラ型Ｌｙｍ２抗体の作製
（１）ラット／ヒトキメラ型Ｌｙｍ２抗体発現ベクターの構築
　ラット／ヒトキメラ型Ｌｙｍ２抗体発現ベクターは、以下の方法で、Ｌｙｍ２抗体重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子を、それぞれヒトＩｇＧ１重鎖及びκ鎖定常領域遺伝子に連結することにより作製した。
　まずＶＨとして、配列番号２６の配列を、ＶＬとして、配列番号２７の配列を全合成した。合成された配列から、プライマーｃｈＬｙｍ２ＶＨ－Ａ（配列番号２８）およびプライマーｃｈＬｙｍ２ＶＨ－Ｂ（配列番号２９）を用いてＶＨを、プライマーｃｈＬｙｍ２ＶＬ－Ａ（配列番号３０）およびプライマーｃｈＬｙｍ２ＶＬ－Ｂ（配列番号３１）を用いてＶＬをＰＣＲにより増幅した。
　遺伝子断片はアガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）によって精製した。この断片と、ヒトκ鎖定常領域発現ベクター（ＢｇｌＩＩ／ＢｓｉＷＩ処理）およびヒト重鎖（ＩｇＧ１）定常領域発現ベクター（Ｓａｌ１／Ｎｈｅ１処理）を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｉｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社）によるベクターへのサブクローニングを添付の説明書に従い行った。
　大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社）に形質転換して、プラスミド抽出、シーケンス確認を実施することで、ラット／ヒトキメラ型Ｌｙｍ２抗体（以下、ｃｈＬｙｍ２と記す）発現ベクターを作製した。
（２）ｃｈＬｙｍ２一過性発現細胞株の調製
　ｃｈＬｙｍ２の一過性発現株を作製するため、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ　ＣＨＯ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を、添付の説明書に従って使用し、以下の方法で、宿主細胞に（１）で作製された発現ベクターを導入した。宿主細胞には、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に馴化した株を使用した。
　（１）で作製した３１２．５μｇのｃｈＬｙｍ２抗体発現ベクター（軽鎖発現ベクターと重鎖発現ベクターを１：２で混合したもの）を２０ｍＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、また、３１２．５μＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ　ＭＡＸ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２０ｍＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭにそれぞれ溶解し、室温で５分間放置した。上記二液を混合し、室温で１５分間放置した。該混合溶液を２５０ｍＬの宿主細胞培養液（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）に全量添加しｃｈＬｙｍ２一過性発現細胞株を得た。
（３）ｃｈＬｙｍ２の精製
　（２）で得られたｃｈＬｙｍ２一過性発現細胞株を、８ｍＭのＬ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加したＦｒｅｅ　ｓｔｙｌｅ　ＣＨＯ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、三角フラスコで５日間培養した後、培養上清を回収した。回収した培養上清を遠心分離し、０．２２μｍフィルターを用いてろ過することでｃｈＬｙｍ２を含む培養上清を調製した。
　調製した培養上清からＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社）を用いて、ｃｈＬｙｍ２を精製した。まず、培養上清をカラムにロードし、ＰＢＳでカラムを洗浄した後、ｐＨ５．０、３．５、３．０の溶出バッファー（０．１Ｍクエン酸一水和物－ＮａＯＨ／ｐＨ５．０、３．５、３．０）で順に溶出した。溶出したフラクションは速やかに中和バッファー（２Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／ｐＨ８．５）で中和した。
　それぞれのフラクションの２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）を測定し、測定値の高い連続フラクションを抗体画分として回収した。抗体画分をＰＢＳで透析し、０．２２μｍのフィルターを通したものを精製タンパク質とした。２８０ｎｍの吸光係数を１．３７として、濃度を算出した。
［実施例６］
ヒト化抗体の作製
（１）ヒト化Ｌｙｍ２抗体重鎖及び軽鎖可変領域の設計
（ｉ）ヒト化Ｌｙｍ２抗体のＶＬおよびＶＨのアミノ酸配列の設計
　ヒト化Ｌｙｍ２抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
　まずＬｙｍ２抗体のＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列（配列番号２３、２４、２５）の移植に適したヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を、以下のようにして選択した。
　既知のヒト抗体重鎖可変領域配列はＴｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが提供するＢＬＡＳＴＰデータベースにより、Ｌｙｍ２抗体のＶＬのＦＲ配列と相同性の高いヒト抗体配列を検索した。その結果、ＧｅｎｅＢａｎｋ　ＩＤ：ＡＢＡ７１３７４．１が最も相同性の高いヒト抗体配列であったため、この抗体のＦＲを選択した。以上のようにして決定したヒト抗体ＦＲ配列の適切な位置に配列番号２３、２４、２５で表されるＬｙｍ２抗体のＶＬのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を移植することで、ＬＶ０（配列番号３３）を設計した。
　次に、ヒト化Ｌｙｍ２抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。Ｌｙｍ２抗体のＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列（配列番号２０、２１、２２）の移植に適したヒト抗体ＶＨのＦＲのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。ＶＬ同様にＢＬＡＳＴＰデータベースにより、Ｌｙｍ２のＶＨのＦＲ配列と相同性の高いヒト抗体配列を検索した。
　その結果、ＧｅｎｅＢａｎｋ　ＩＤ：ＡＡＹ３３３３１．１が最も相同性の高いヒト抗体配列であったため、この抗体のＦＲを選択した。以上のようにして決定したヒト抗体ＦＲ配列の適切な位置に配列番号２０、２１、２２で表されるＬｙｍ２抗体のＶＨのＣＤＲ１～３のアミノ酸配列を移植することで、ＨＶ０（配列番号４９）を設計した。
　上記で設計したヒト化Ｌｙｍ２抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０、およびＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に、ラットモノクローナル抗体であるＬｙｍ２由来のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列である。しかし、一般に、ヒト化抗体を作製する場合には、単にげっ歯類由来抗体のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＦＲへ移植するのみでは、結合活性が低下してしまうことが多い。
　このような結合活性の低下を回避するため、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、ヒト抗体とげっ歯類抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を置換することが行われている。そこで、本実施例においても、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定し、置換した。
　まず、上記で設計したヒト化Ｌｙｍ２抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０、およびＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０より構成される抗体可変領域（以下、ＬＶ０ＨＶ０と表記する）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。
　三次元構造座標作製および三次元構造の表示には、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｓｔｕｄｉｏ（アクセルリス社）を用いた。また、Ｌｙｍ２抗体の可変領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ＬＶ０ＨＶ０のＶＬおよびＶＨのＦＲのアミノ酸配列の中で、Ｌｙｍ２抗体と異なっているアミノ酸残基を選択し、Ｌｙｍ２抗体のアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列を作製し、同様に三次元構造モデルを構築した。これら作製したＬｙｍ２抗体、ＬＶ０ＨＶ０および改変体の各可変領域の三次元構造を比較し、抗体の結合活性に影響を与えると予測されるアミノ酸残基を同定した。
　その結果、ＬＶ０ＨＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、ＬＶ０では、配列番号３３のアミノ酸配列の２番目のＩｌｅ、４番目のＭｅｔ、１５番目のＰｒｏ、および８５番目のＡｌａを、ＨＶ０では、配列番号４９のアミノ酸配列の１８番目のＬｅｕ、７７番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、および１１７番目のＴｈｒを、それぞれ選択した。
　これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列をＬｙｍ２抗体の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ置換するアミノ酸改変をし、様々な改変を有するヒト化抗体のＶＬおよびＶＨを設計した。具体的には、ＶＬについては、配列番号３３のアミノ酸配列の２番目のＩｌｅをＶａｌに、４番目のＭｅｔをＬｅｕに、１５番目のＰｒｏをＬｅｕに、または８５番目のＡｌａをＰｒｏに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。ＶＨについては、配列番号４９のアミノ酸配列の１８番目のＬｅｕをＭｅｔに、７７番目のＡｓｎをＳｅｒに、９３番目のＶａｌをＴｈｒに、または１１７番目のＴｈｒをＶａｌに置換するアミノ酸改変のうち、少なくとも１つの改変を導入した。
　ＬＶ０ＨＶ０、またはＬＶ０ＨＶ０のＦＲに存在する少なくとも１つのアミノ酸残基を改変したヒト化Ｌｙｍ２抗体の抗体可変領域として、ＬＶ０ＨＶ０、ＬＶ１ＨＶ０、ＬＶ２ａＨＶ０、ＬＶ２ｂＨＶ０、ＬＶ２ｃＨＶ０、ＬＶ３ａＨＶ０、ＬＶ３ｂＨＶ０、ＬＶ４ＨＶ０、ＬＶ０ＨＶ４、ＬＶ１ＨＶ４、ＬＶ２ａＨＶ４、ＬＶ２ｂＨＶ４、ＬＶ２ｃＨＶ４、ＬＶ３ａＨＶ４、ＬＶ３ｂＨＶ４、ＬＶ４ＨＶ４、ＬＶ０ＨＶ１、ＬＶ０ＨＶ２ａ、ＬＶ０ＨＶ２ｂ、および、ＬＶ０ＨＶ３をそれぞれ設計した。
　以降の記述においては、上述の可変領域を含むヒト化Ｌｙｍ２抗体をそれぞれＬＶ０ＨＶ０、ＬＶ１ＨＶ０、ＬＶ２ａＨＶ０、ＬＶ２ｂＨＶ０、ＬＶ２ｃＨＶ０、ＬＶ３ａＨＶ０、ＬＶ３ｂＨＶ０、ＬＶ４ＨＶ０、ＬＶ０ＨＶ４、ＬＶ１ＨＶ４、ＬＶ２ａＨＶ４、ＬＶ２ｂＨＶ４、ＬＶ２ｃＨＶ４、ＬＶ３ａＨＶ４、ＬＶ３ｂＨＶ４、ＬＶ４ＨＶ４、ＬＶ０ＨＶ１、ＬＶ０ＨＶ２ａ、ＬＶ０ＨＶ２ｂ、および、ＬＶ０ＨＶ３と略記する。
　軽鎖可変領域ＬＶ０（配列番号３３）、ＬＶ１（配列番号３５）、ＬＶ２ａ（配列番号３７）、ＬＶ２ｂ（配列番号３９）、ＬＶ２ｃ（配列番号４１）、ＬＶ３ａ（配列番号４３）、ＬＶ３ｂ（配列番号４５）、ＬＶ４（配列番号４７）、および重鎖可変領域ＨＶ０（配列番号４９）、ＨＶ１（配列番号５１）、ＨＶ２ａ（配列番号５３）、ＨＶ２ｂ（配列番号５５）、ＨＶ３（配列番号５７）、ＨＶ４（配列番号５９）のアミノ酸配列をそれぞれ図１および図２に示す。
（ｉｉ）ヒト化Ｌｙｍ２抗体の可変領域遺伝子の設計
　ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、動物細胞で高頻度で使用されるコドンを用いて設計した。これら塩基配列を用いて、以下に示すヒト化Ｌｙｍ２抗体発現ベクターの構築および対応する抗体の発現を行った。
（２）ヒト化Ｌｙｍ２抗体発現ベクターの構築
　実施例５－（１）に記載の方法に準じて、ヒト化Ｌｙｍ２抗体発現ベクターを構築した。すなわち、配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７および５９で示されるアミノ酸配列をそれぞれコードする、配列番号３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６および５８で示される塩基配列のＤＮＡを全合成し、配列番号２８－３１で示すプライマーにより、対応するＶＬ、ＶＨ遺伝子断片をＰＣＲによって増幅した。遺伝子断片はアガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）によって精製した。
　このＶＬまたはＶＨ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｉｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社）を用いて添付の説明書に従い、それぞれヒトκ鎖定常領域発現ベクター（ＢｇｌＩＩ／ＢｓｉＷＩ処理）およびヒト重鎖（ＩｇＧ１）定常領域発現ベクター（Ｓａｌ１／Ｎｈｅ１処理）へサブクローニングした。作製したベクターを用いて大腸菌　ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社）を形質転換して、プラスミド抽出、シーケンス確認を実施し、正しい配列が挿入されたコロニーを選抜し、一過性発現のためにプラスミド大量調製を行った。
（３）ヒト化Ｌｙｍ２抗体の一過性発現
　作製したヒト化Ｌｙｍ２抗体の一過性発現は、実施例５－（２）に記載のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に馴化したＣＨＯ細胞を宿主とし、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ　ＣＨＯ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して行った。プラスミド導入の方法は添付の説明書に従った。軽鎖発現ベクターと重鎖発現ベクターは、１：２の比率で混合して使用した。
　培養液量は２００ｍＬで行い、３７℃、８％ＣＯ２、１２５ｒｐｍの設定条件下で、５日間培養した。培養後、細胞懸濁液の遠心分離を行い、０．２μｍフィルター（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を通してヒト化Ｌｙｍ２抗体を含む培養上清を回収した。
（４）ヒト化Ｌｙｍ２抗体の精製
　以下に示す、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いたアフィニティー精製により、ヒト化Ｌｙｍ２抗体を精製した。レジンをＰＢＳで平衡化した後、（３）で取得された培養上清をロードし、ＰＢＳで２回洗浄した。
　洗浄後、溶出バッファー（２０ｍＭ　クエン酸、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ３．４）を用いて抗体を溶出し、中和バッファー（１Ｍ　リン酸－ＮａＯＨ、ｐＨ　７．０）を１／１０量加えて中和した。続いてＮＡＰ２５（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてＰＢＳにバッファー置換を行った。Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－４　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔｓ（ミリポア社）を用いて限外濾過による濃縮を行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐ８０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を測定し、抗体溶液の濃度測定および調製を行った。
［実施例７］
ｃｈＬｙｍ２およびヒト化Ｌｙｍ２抗体の抗原結合活性
　ＦＬＡＧ融合ヒトＣＲＴＨ２発現３Ｙ１－Ｂ細胞を０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（ナカライテスク社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＳＭで懸濁した。次に、細胞数を１ウェルあたり１×１０５個となるように９６ウェルプレートに播種し、５００００、１２５００、３１２５、７８１、１９５、４９、１２および３ｎｇ／ｍＬ各最終濃度のｃｈＬｙｍ２またはヒト化Ｌｙｍ２抗体を添加し、４℃で６０分間の反応を行った。
　細胞をＳＭで洗浄した後、ＳＭで５００倍に希釈したＧｏａｔ　Ｆ（ａｂ’）２　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　ＰＥ（γｃｈａｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を添加し、４℃で６０分間の反応を行った。ＳＭで細胞を洗浄した後、細胞を５０μＬのＳＭで再懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で測定した。
　データはＦｌｏｗＪｏ　７．６５（トミーデジタルバイオロジー社）によって解析し、各濃度におけるＧｅｏｍｅａｎ値からＬｏｇｉｓｔｉｃ曲線によるカーブフィッティングを行い、統計解析言語Ｒ（Ｖｅｒ．３．０２）を用いてｃｈＬｙｍ２および各ヒト化Ｌｙｍ２抗体の結合の５０％ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＥＣ５０）値およびそのｓｔａｎｄａｒｄ　ｅｒｒｏｒ（ＳＥ）値を算出した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　その結果、表１に示すように、各種ヒト化抗体がキメラ抗体と同等のヒトＣＲＴＨ２反応性を有することが示唆された。
［実施例８］
　ｃｈＬｙｍ２およびヒト化Ｌｙｍ２抗体の好酸球、好塩基球に対する除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）活性
　へパリンナトリウム注射液を加えて採取したヒト末梢血を４℃、１５００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、血漿を回収した。
　血漿を回収した後の赤血球を含むペレットに、ＰＢＳ（ナカライテスク社）を加えて元の血液容量に戻し、懸濁したもの１ｍＬに対して、溶血用溶液［１０×ＲＢＣ　Ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（ｅ－ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を滅菌水で１０倍に希釈したもの］を１０ｍＬ添加して転倒混和した。室温で１０分間放置した後、常温、１５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離を行い、上清を除き、ＰＢＳで２回洗浄した。
　その後、細胞ペレットを、回収していた血漿で懸濁し、３００μＬ／ｗｅｌｌで４８ｗｅｌｌプレートに播種し、１０００、１００、３３、１１、３．７、１．２、０．４および０．０１ｎｇ／ｍＬ各最終濃度のｃｈＬｙｍ２、各ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ０、ＬＶ０ＨＶ１、ＬＶ０ＨＶ２ａ、またはアイソタイプコントロール抗体［Clin Cancer Res 2005, 11(8), 3126-3135記載の抗２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＤＮＰ）ＩｇＧ１抗体をコードするベクターを用い、実施例５に記載の方法に準じて作製したＩｇＧ１抗体（以下、抗ＤＮＰ　ＩｇＧ１抗体と記す）］を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で、２０時間反応させた。
　反応後、各ｗｅｌｌの細胞液を回収し、ＳＭを１０ｍＬ添加し、コントロールビーズとしてＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ　Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｂｅａｄｓ、ｆｏｒ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を２００μＬ／サンプルで添加した後、４℃、２０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、上清を除いた。ＳＭで２回洗浄し、ＳＭで希釈した１００００μｇ／ｍＬ　ＩｇＧ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社）を３００μＬ／サンプルで添加して、懸濁した後、４℃、３０分間反応させた。
　その後、４０μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、好酸球の検出として、ＰＥ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　Ｓｉｇｌｅｃ－８　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、好塩基球の検出としてＰＥ－Ｃｙ７　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＣＤ１２３（ＢＤバイオサイエンス社）およびＡｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　Ｆｃ　ｅｐｓｉｌｏｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｉ　ａｌｐｈａ（ＦｃεＲ１）ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を、それぞれ５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、４０分間反応させた。
　ＳＭで２回洗浄後、７－ＡＡＤ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＤバイオサイエンス社）を１％含有したＳＭで細胞を懸濁し、４℃、１０分間放置した後、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社製、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）を用いて解析した。
　ヒト好酸球は、ＦＳＣ－ＳＳＣ展開の顆粒球画分における７－ＡＡＤ陰性ｓｉｇｌｅｃ８－ＰＥ陽性画分として検出した。ヒト好塩基球は、ＦＳＣ－ＳＳＣ展開のリンパ球画分における７－ＡＡＤ陰性、ＣＤ１２３－ＰＣ－Ｃｙ７陽性、ＦｃεＲＩ－ＡＰＣ陽性画分として検出した。細胞除去活性は、一定数のＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔのｃｏｕｎｔ数当たりのそれぞれの細胞のｃｏｕｎｔ数を解析することで評価した。
　その結果、図３（Ａ）～図３（Ｃ）に示すように、評価したヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ０、ＬＶ０ＨＶ１およびＬＶ０ＨＶ２ａはいずれも、キメラＬｙｍ２抗体ｃｈＬｙｍ２と同等の好酸球および好塩基球に対する細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。
［実施例９］
比較対照用抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の作製
（１）比較対照用抗ヒトＣＲＴＨ２抗体発現ベクターの作製
　国際公開第２０１４／１４４８６５号記載の抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１　ｖ１、ｍｕ８Ｂ１、ｍｕ３Ｃ１２およびｍｕ３１Ａ５のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（それぞれ、国際公開第２０１４／１４４８６５号中ではＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯｓ：５７および４０、６４および５２、６２および５０、６３および５１、並びに６５および５３で表される）をコードする塩基配列を、全合成した。
　実施例５－（１）に記載の方法に準じて、それぞれの抗体のＶＨおよびＶＬの組み合わせとなるよう、上記塩基配列を抗体発現ベクターに組み込み、５種の比較対照用ヒト化またはキメラ抗ヒトＣＲＴＨ２抗体（それぞれｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１　ｖ１、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２およびｃｈ３１Ａ５）発現ベクターをそれぞれ作製した。
（２）比較対照用抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の一過性発現細胞の作製および抗体の精製
　実施例５－（２）および（３）に記載の方法に準じて、ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１　ｖ１、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２またはｃｈ３１Ａ５の抗体発現ベクターを宿主細胞に一過性発現させ、培養上清からそれぞれの抗体の精製を行った。
［実施例１０］
ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞を用いた、抗ヒトＣＲＴＨ２モノクローナル抗体のエピトープ解析
（１）ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現ベクターの作製
　ヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列のうち、細胞外領域のアミノ酸残基を部分的に別のアミノ酸残基に置換したアミノ酸置換体の発現ベクターを作製した。具体的には、配列番号２で表されるアミノ酸配列にＳ２Ａ；Ｎ４Ａ；Ｔ６ＡおよびＬ７Ａ；Ｋ８Ａ、Ｐ９ＡおよびＬ１０Ａ；Ｐ１２Ａ、Ｌ１４ＡおよびＥ１５Ａ；Ｑ１６Ｅ、Ｒ１９ＨおよびＱ２１Ｒ；Ｈ２３Ａ、Ｓ２４ＡおよびＮ２５Ａ；Ｔ２６Ａ、Ｓ２７ＡおよびＩ２８Ａ；Ｄ１７１Ａ、Ｔ１７２ＡおよびＩ１７３Ａ；Ｓ１７４Ａ、Ｒ１７５ＡおよびＬ１７６Ａ；Ｄ１７７Ａ、Ｇ１７８ＡおよびＲ１７９Ａ；Ｉ１８０ＡおよびＭ１８１Ａ；Ｙ１８３Ａ、Ｙ１８４ＡおよびＮ１８５Ａ；Ｌ１８７Ａ、Ｌ１８８ＡおよびＬ１８９Ａ；Ｎ１９０Ａ；Ｐ１９１Ａ；Ｇ１９２Ａ；Ｐ１９３Ａ；Ｄ１９４Ａ；Ｒ１９５Ａ；Ｄ１９６ＡおよびＴ１９８Ａ；Ｎ２７５Ａ、Ｇ２７７ＡおよびＬ２７８Ａ；Ｐ２７６Ａ；Ｐ２７９ＡおよびＬ２８１Ａ；Ｐ２８０Ａ；またはＶ２８２Ａ、Ｒ２８３ＡおよびＲ２８４Ａの置換をしたアミノ酸置換体を発現するベクターをそれぞれ作製した。なお、前記アミノ酸置換の記号は［置換前のアミノ酸残基の１文字表記］［Ｎ末端から数えた置換の位置］［置換後のアミノ酸残基の１文字表記］を表す。
　発現ベクターとしては、ｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒ（ＭＢＬ社）を用い、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトに終始コドンを欠失させた各種アミノ酸置換体をコードする遺伝子を挿入することで、細胞内Ｃ末端領域にアザミグリーンのタグが付加されるようにした。
　上記のアミノ酸置換体を発現するベクターは、１）アミノ酸置換体をコードする遺伝子配列を全合成し、ベクターに挿入する方法または、２）配列番号１で示される野生型ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸配列をコードするＤＮＡが挿入されたベクターから、部位特異的変異導入を行うことにより作製した。
（２）ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体一過性発現細胞の造成
　ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体の発現細胞株の調製には、ＣＨＯ－Ｓ細胞（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いた。細胞の継代には８ｍＭ　Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＦｒｅｅ　ｓｔｙｌｅ　ＣＨＯ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で振とう培養した。
　（１）で作製された２５μｇのヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現ベクターを４００μＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、また、２５μＬのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ　ＭＡＸ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を４００μＬのＯｐｔｉ－Ｐｒｏ　ＳＦＭにそれぞれ溶解し、室温で５分間放置した。上記二液を混合し、室温で１５分間放置した。該混合溶液を上記ＣＨＯ－Ｓ培養液に添加し、２４時間培養することでヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞株を得た。
（３）ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞を用いた、取得抗体の反応性解析
　（２）で樹立されたヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現ＣＨＯ－Ｓ細胞を、ＳＭで洗浄した後、１ウェルあたり２×１０５ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、１７００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで１０μｇ／ｍＬになるように調製したｃｈＬｙｍ２、ＬＶ０ＨＶ１、実施例９で作製された抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１　ｖ１、ｃｈ３Ｃ１２もしくはｃｈ３１Ａ５、または市販ラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＢＭ１６（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。
　細胞を洗浄した後、ｃｈＬｙｍ２、ＬＶ０ＨＶ１、ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１　ｖ１、ｃｈ３Ｃ１２またはｃｈ３１Ａ５が添加されたウェルにはＳＭで希釈したｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ＨｕｍａｎＩｇＧ　ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を、ＢＭ１６が添加されたウェルにはＳＭで希釈した　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ＲａｔＩｇＧ　ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、４℃で１時間の反応を行った。
　反応後、細胞を洗浄し、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。解析に関しては、全細胞からアザミグリーンの陽性細胞をｇａｔｉｎｇし、その集団における各抗体の反応性を解析した。
　また、各変異体間での発現レベルを補正するため、各抗体の結合によるＡｌｅｘａ６４７の蛍光強度を、Ｃ末端領域に付加したアザミグリーンの蛍光強度で除して相対的蛍光強度を算出し、各抗体の反応性とした。そして、野生型ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対する各抗体の蛍光強度を１００％とした際の、ヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞への相対的蛍光強度を、各抗体に関して解析した。
　その結果、図４～図７に示すように、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１は、Ｐ１２Ａ、Ｌ１４ＡおよびＥ１５Ａ；Ｄ１７７Ａ、Ｇ１７８ＡおよびＲ１７９Ａ；Ｉ１８０ＡおよびＭ１８１Ａ；Ｙ１８３Ａ、Ｙ１８４ＡおよびＮ１８５Ａ；Ｌ１８７Ａ、Ｌ１８８ＡおよびＬ１８９Ａ；Ｇ１９２Ａ；Ｄ１９４Ａ；Ｒ１９５Ａ；またはＤ１９６ＡおよびＴ１９８ＡのヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞への反応性が消失することが明らかになった。
　また、キメラＬｙｍ２抗体ｃｈＬｙｍ２は、加えて、Ｄ１７１Ａ、Ｔ１７２ＡおよびＩ１７３ＡのヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞への反応性が消失することが明らかになった。ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１のＤ１７１Ａ、Ｔ１７２ＡおよびＩ１７３Ａを含むヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞への反応性は、大幅に低下していることから、ＬＶ１ＨＶ０およびｃＬｙｍ２はいずれも同じエピトープに結合していることが示唆された。
　一方、今回比較した他の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体とは異なる部位のヒトＣＲＴＨ２アミノ酸置換体発現細胞への反応性が顕著に低下していたことから、既存の他の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、本願発明の抗体とは異なるエピトープを認識していることが明らかになった。
　更に、各アミノ酸置換体発現細胞への反応性を詳細に確認した結果、既存の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体はいずれもＧ１９２ＡまたはＤ１９４Ａを含むアミノ酸置換体発現細胞への反応性は低下せず、本願発明の抗体のみが、該細胞への反応性が低下したことから、本願発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、ヒトＣＲＴＨ２のＧｌｙ１９２およびＡｓｐ１９４の少なくとも１つアミノ酸残基を含むエピトープに結合することが明らかになった。
［実施例１１］
ヒト好酸球に対する反応性評価
　へパリンナトリウム注射液を加えて採取したヒト末梢血に対し、等量の注射用生理食塩水を添加し、混和した。５０ｍＬ容量の遠沈管にＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ１．０８４（ＧＥヘルスケア社）を１５ｍＬ添加し、生理食塩水で希釈した上記ヒト末梢血を３０ｍＬ重層し、室温、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。
　遠心分離後、血漿層、単核球層およびＦｉｃｏｌｌ層の半量をアスピレーターで除去し、並びに遠心間の壁面に付着している血小板を滅菌した綿棒を用いて除いた。その後、滅菌した氷冷水２７ｍＬを各チューブに分注し３０秒間溶血させた。
　その後、氷冷した１０×ＰＩＰＥＳ緩衝液［５００ｍＬの蒸留水に、３２．１５ｇの塩化ナトリウム（和光純薬社）、１．８５ｇの塩化カリウム（ナカライテスク社）、３８ｇのＰＩＰＥＳ（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ナカライテスク社）、８．４ｇの水酸化ナトリウム（ナカライテスク社）を溶解させたもの］を３ｍＬ添加して等張に戻し、４℃、１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。遠心分離終了後、上清を吸引し、２ｍＬの１×ＰＩＰＥＳ緩衝液［蒸留水を用いて１０×ＰＩＰＥＳ緩衝液を１０倍に希釈した溶液］を加えて細胞ペレットをほぐした。
　再度上記溶血操作を繰り返し、得られた細胞ペレットを、ａｕｔｏＭＡＣＳ　Ｒｉｎｓｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ミルテニーバイオテク社）にＭＡＣＳ　ＢＳＡ　Ｓｔｏｃｋ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ミルテニーバイオテク社）を添加したもの（以下、ＭＡＣＳバッファーと略記する）を用いて２回洗浄した。
　細胞数をカウントした後、ＣＤ１６　ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、添付の説明書に従い好酸球をネガティブセレクション法により単離した。
　単離された細胞をＳＭで洗浄した後、１ウェルあたり１×１０５ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで希釈した、１０、３．３、１．１、０．３７、および０．１２μｇ／ｍＬ各最終濃度のＬｙｍ２抗体、市販ＣＲＴＨ２抗体のＢＭ１６（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社）または３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。
　細胞を洗浄した後、Ｌｙｍ２抗体またはＢＭ１６が添加されたウェルには、ＳＭで希釈したＣＥＬＬ　ＬＡＢ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｒａｔ　Ｋａｐｐａ（ｋａｐｐａ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＦＩＴＣ（ベックマンコールター社）を、３０１１０８が添加されたウェルには、ＳＭで希釈したＣＥＬＬ　ＬＡＢ　Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（γ　ｃｈａｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ベックマンコールター社）をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、４℃で１時間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社製、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
　その結果、ラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体Ｌｙｍ２はヒト好酸球に対して、市販のラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＢＭ１６およびマウス抗ヒトＣＲＴＨ２抗体３０１１０８よりも強い反応性を示すことが明らかとなった（図８）。
［実施例１２］
ヒト好塩基球に対するｃｈＬｙｍ２の反応性
　へパリンナトリウム注射液を加えて採取したヒト末梢血に対し、等量の注射用生理食塩水を添加し、混和した。５０ｍＬ容量の遠沈管にＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ　１．０８４（ＧＥヘルスケア社）を１５ｍＬ添加し、生理食塩水で希釈したヒト末梢血を３０ｍＬ重層し、室温、１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。
　遠心分離後、単核球層をピペットで回収し、ＭＡＣＳバッファーを用いて２回洗浄した。細胞数をカウントした後、Ｂａｓｏｐｈｉｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＩＩ，ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテク社製）を用いて、添付の説明書に従い好塩基球をネガティブセレクション法により単離した。
　単離された細胞をＳＭで洗浄した後、１ウェルあたり５×１０４ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、１００μＬのＳＭで細胞を懸濁し、Ｚｅｎｏｎ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて添付の説明書に従い標識を行った、ｃｈＬｙｍ２または実施例８記載のアイソタイプコントロール抗体を、最終濃度１０μｇ／ｍＬになるように添加し、４℃で１時間の反応を行った。細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
　その結果、ヒト好塩基球に対して、ｃｈＬｙｍ２の反応性が確認された（図９）。従って、本願発明のキメラ抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｃＬｙｍ２は、好塩基球に結合することが明らかになった。
［実施例１３］
ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞に対するヒト化Ｌｙｍ２抗体の反応性
　実施例１２に準じ、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ　１．０８４の代わりにＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥヘルスケア社）を用いて調製した単核球層の細胞懸濁液を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、ＥＺ－Ｌｉｎｋ　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ，Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ　Ｆｏｒｍａｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて添付の説明書に従いビオチン標識したヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１を最終濃度１０μｇ／ｍＬになるように添加し、４℃で１時間の反応を行った。
　細胞を洗浄した後、ＳＭで希釈した最終濃度１０μｇ／ｍＬ　ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、および添付の説明書に記載された量のＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６４７　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）、ＦＩＴＣ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ３　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（バイオレジェンド社）およびＣＤ４　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｃｌｏｎｅ　ＳＫ３、ＰＥ－Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。
　再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。解析は、ＦＳＣ－ＳＳＣ展開によりリンパ球を分画し、さらにＣＤ３陽性かつＣＤ４陽性細胞で分画した細胞群に対して、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１による蛍光染色の蛍光強度を縦軸に、ＣＤ４抗体による蛍光染色の蛍光強度を横軸に示すことで、ＣＤ３陽性ＣＤ４陽性細胞におけるヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１の反応性画分の割合を算出した。その結果、ＣＤ３陽性ＣＤ４陽性のＴ細胞画分の約２～３％にヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１が反応した（図１０）。
［実施例１４］
好酸球、好塩基球に対する細胞傷害活性
　実施例８と同様にして調製した細胞懸濁液を、９５μＬ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌプレートに播種し、１０００、１０、３、１、０．３、０．１ｎｇ／ｍＬ各最終濃度の被験抗体を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２０時間反応させた。被験抗体としては、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、実施例９で作製された抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１　ｖ１、ｃｈ３Ｃ１２およびｃｈ３１Ａ５を用いた。アイソタイプコントロール抗体としては抗ＤＮＰ　ＩｇＧ１抗体を用いた。
　反応後の各ｗｅｌｌにＳＭを１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、コントロールビーズとしてＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ　Ａｂｓｏｌｕｔｅ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｂｅａｄｓ，ｆｏｒ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を２０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃、２０００ｒｐｍ、２分間の遠心分離を行い、上清を除いた。ＳＭで２回洗浄し、ＳＭで希釈した１００００μｇ／ｍＬ　ＩｇＧ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して、４℃、３０分間反応させた。以降は、実施例８と同様の方法で行った。
　その結果、ヒト化抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＬＶ０ＨＶ１は、抗体濃度依存的に好酸球および好塩基球のいずれの細胞も除去した。既存の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｃｈ３Ｃ１２は、ヒト化抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＬＶ０ＨＶ１と比べて細胞を除去する活性が弱かった［図１１（Ａ）および図１１（Ｂ）］。従って、本願発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、ＣＲＴＨ２が発現する好酸球または好塩基球を標的とした治療効果を発揮し得ることが示唆される。
［実施例１５］
Ｔｈ２細胞に対する細胞傷害活性
　実施例１３と同様にして調製した単核球層を、１／１０ｖｏｌｕｍｅ　ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、２００ｍＭ－Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　Ｓｔｏｃｋ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ナカライテスク社）、１０ｍＭ　ＭＥＭ　Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ社）、１００ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ社）、１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ社）および１／１００ｖｏｌｕｍｅ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ，Ｌｉｑｕｉｄ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０（和光純薬社）［以下、ＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌ）培養培地と記す］で２回洗浄し、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ細胞懸濁液を調製した。
　調製した細胞懸濁液を１００μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、ｃｈＬｙｍ２抗体、ヒト化抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＬＶ０ＨＶ１または実施例８記載のアイソタイプコントロール抗体を最終濃度１０μｇ／ｍＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２０時間反応させた。
　反応後の細胞をＰＢＭＣ培養培地で７回洗浄し、被験抗体を十分に除去した後、１００μＬのＰＢＭＣ培養培地に懸濁し、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（Ａｂｃａｍ社）を１μｇ／ｍＬの濃度で固相化したプレートに播種した。その後、２μｇ／ｍＬに調製した抗ＣＤ２８抗体（ＢＤバイオサイエンス社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間反応させた。
　反応後の上清を回収し、Ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γ　Ｆｌｅｘ　Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス社）、Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－５　Ｆｌｅｘ　Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス社）、Ｈｕｍａｎ　ＩＬ－１３　Ｆｌｅｘ　Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて、添付の説明書に従い上清中サイトカインの定量を行った。
　その結果、キメラ抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｃｈＬｙｍ２およびヒト化抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＬＶ０ＨＶ１は、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ－５およびＩＬ－１３の産生を減少させたが、その一方で、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ－γの産生は変化させなかった。即ち、本発明の抗体はＴｈ２細胞を選択的に除去していることが示唆された［図１２（Ａ）および図１２（Ｂ）］。従って、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、Ｔｈ２細胞を標的とした治療効果を発揮できることが示唆された。
［実施例１６］
リガンド存在下における反応性評価（２９３ＥＢＮＡ）
　実施例１－（１）－（ｉｉ）で作製したヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈベクターを、Ｆｕｇｅｎｅ６（プロメガ社）を用いて２９３ＥＢＮＡ細胞（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入し、１０％ＦＢＳ、０．２５ｍｇ／ｍＬ　Ｇ４１８（ナカライテスク社）、１００μｇ／ｍＬ　ペニシリン、１００Ｕ／ｍＬ　ストレプトマイシン（ナカライテスク社）および３００μｇ／ｍＬ　ハイグロマイシンＢ（和光純薬社）ＤＭＥＭからなる培地で薬剤耐性細胞を選択し、ヒトＣＲＴＨ２発現２９３ＥＢＮＡ細胞を樹立した。
　ヒトＣＲＴＨ２発現２９３ＥＢＮＡ細胞を０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、上記培地で懸濁した。次に、１×１０５ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレートに播種し、ＤＫＰＧＤ２（Ｃａｙｍａｎ　ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を最終濃度１０μＭになるように添加した。
　３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１５分間放置した後、０．３、１および３μｇ／ｍＬ各最終濃度のヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、公知の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１　ｖ１、ｃｈ３Ｃ１２、ｃｈ３１Ａ５、ＢＭ１６（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社）または３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）を添加し、常温で３０分間の反応を行った。
　細胞をＳＭで５回洗浄した後、ＬＶ０ＨＶ１、ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、ｈｕ８Ｂ１　ｖ１、ｃｈ３Ｃ１２またはｃｈ３１Ａ５が添加されたウェルにはＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ＨｕｍａｎＩｇＧ　Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を、ＢＭ１６が添加されたウェルにはＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ＲａｔＩｇＧ　Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を、３０１１０８が添加されたウェルには、ＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬ　ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）をそれぞれ最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、４℃、４０分間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
　その結果、図１３（Ａ）～（Ｃ）に示すように、既存の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、いずれもヒトＣＲＴＨ２リガンドであるＤＫＰＧＤ２存在下で、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞への結合が低下したのに対して、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１は、検討したいずれの抗体濃度においても、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞への結合は殆ど低下しなかった。
　即ち、本発明の抗体は、高濃度のリガンド存在下でも高い反応性を有することが明らかになった。従って、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、リガンド存在下でもヒトＣＲＴＨ２発現細胞に対して、リガンド非存在下での反応性と同等に結合することができ、該ヒトＣＲＴＨ２発現細胞に作用することができる有用な抗体であることが示唆された。
［実施例１７］
分化誘導ヒトマスト細胞に対する反応性解析
　Nature Protocols 2006, 1(4), 2178-2183記載の方法に準じてマスト細胞を調製した。分化誘導開始から１１週時点のマスト細胞をＳＭで洗浄し、１ウェルあたり５×１０４ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、ＰＥ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ２０３ｃ（Ｅ－ＮＰＰ３）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｖｉｏｌｅｔ　４２１（商標）ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　Ｆｃ　ｅｐｓｉｌｏｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｉ　ａｌｐｈａ（ＦｃεＲ１）ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。細胞を洗浄した後、ＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社製、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
　その結果、分化誘導を行ったマスト細胞は、マスト細胞表面マーカーであるＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１１７、ＦｃεＲＩをいずれも発現していることが確認できた。
　分化誘導開始から１５週間時点のマスト細胞培養液に、抗ＤＮＰ　ＩｇＧ１抗体の定常領域をＩｇＥ型に組み換えたヒトＩｇＥを最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間反応させた。
　反応後のマスト細胞を最終濃度１００μｇ／ｍＬ　ペニシリン、１００Ｕ／ｍＬ　ストレプトマイシン（ナカライテスク社）および５５μＭ　β－ＭＥ（Ｇｉｂｃｏ社）を添加したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ社）（以下、ｂａｓｉｃ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍと略記する）で２回洗浄し、４ｍＬのｂａｓｉｃ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍで懸濁し、最終濃度１０μｇ／ｍＬ　ｒａｂｂｉｔ　ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＥａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｄａｋｏ社）を添加し、ＭＡＣＳ　ｍｉｘ　ｔｕｂｅ　ｒｏｔａｔｏｒ（ミルテニーバイオテク社）を用いて回転させながら３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１時間反応させた。
　反応後の細胞をＳＭで二回洗浄し、１ウェルあたり５×１０４個となるように９６ウェルプレートに播種し、２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで希釈した１００００μｇ／ｍＬ　ＩｇＧ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して、４℃、３０分間反応させ、ＥＺ－Ｌｉｎｋ　Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ，Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ　Ｆｏｒｍａｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて添付の説明書に従い、それぞれビオチン標識したヒト化抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２もしくはｃｈ３１Ａ５、または未標識の市販の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＢＭ１６（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社）もしくは３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）を最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、４℃で１時間の反応を行った。
　なお、アイソタイプコントロール抗体として、ＢＭ１６に対してはＰｕｒｉｆｉｅｄ　Ｒａｔ　ＩｇＧ２ａ，κ　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｔｒｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を、３０１１０８に対してはＮｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ａ（Ｄａｋｏ社）を、それ以外の抗体に対しては抗ＤＮＰ　ＩｇＧ１抗体を、それぞれ用いた。
　細胞を洗浄した後、ビオチン標識したＬＶ０ＨＶ１、ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２またはｃｈ３１Ａ５を添加したウェルにはＳＭで希釈したｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７　ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を、ＢＭ１６を添加したウェルにはＳＭで希釈したｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ＲａｔＩｇＧ　Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を、３０１１０８を添加したウェルにはＳＭで希釈したｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ＭｏｕｓｅＩｇＧ　Ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、４℃、４０分間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
　その結果、図１４に示すように、ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２がマスト細胞に対して反応性を示す一方で、ＬＶ０ＨＶ１を含むｈｕ１９Ａ２ｖ５２以外の抗体は反応性を示さなかった。
［実施例１８］
分化誘導Ｔｈ１に対する反応性解析
（１）ＰＢＭＣからのナイーブＴ細胞の分離
　健常人由来凍結ＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ社）を、ＤＮａｓｅ　Ｉ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を５０μＬ含有した２０ｍＬのＰＢＭＣ培養培地で１回洗浄し、再びＤＮａｓｅ　Ｉ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅを５０μＬ含有した２０ｍＬのＰＢＭＣ培養培地に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２時間放置した。
　その後、実施例１１に記載のＭＡＣＳ　ｂｕｆｆｅｒで二回洗浄し、Ｎａｉｖｅ　ＣＤ４＋　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ＩＩ　ｈｕｍａｎ（ミルテニーバイオテク社）を用いて、添付の説明書に従いナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞をネガティブセレクション法により単離した。ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞の純度を高めるため、上記ネガティブセレクションを２回実施した。
（２）ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞からのＴｈ１細胞の分化誘導
　J Immunol, 2002. 169(5):p. 2498-2506記載の方法に準じて分離したナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社）および２ｍＭ　グルタミン酸（ナカライテスク社）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ社）（以下、培養培地と略記する）で１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁し、刺激の工程として、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（Ａｂｃａｍ社）を１μｇ／ｍＬの濃度で固相化したプレートに播種し、最終濃度２μｇ／ｍＬ　抗ＣＤ２８抗体（ＢＤバイオサイエンス社）、１００ｎｇ／ｍＬ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＩＬ－１２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１０ｎｇ／ｍＬ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＩＬ－２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、および５μｇ／ｍＬ　抗ＩＬ－４抗体（ＢＤバイオサイエンス社）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４日間反応させた。
　その後、細胞を回収し、遠心分離により上清を除去した後、培養培地で１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁し、増殖の工程として、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＩＬ－１２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）、１０ｎｇ／ｍＬ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＩＬ－２（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）および５μｇ／ｍＬ　抗ＩＬ－４抗体（ＢＤバイオサイエンス社）を添加し３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３日間反応させた。
　上記の刺激、増殖の工程を合計３回繰り返すことで、分化誘導Ｔｈ１細胞を樹立した。
（３）分化誘導Ｔｈ１細胞からのサイトカイン産生解析
　（２）の分化誘導Ｔｈ１細胞培養液に、最終濃度２０ｎｇ／ｍＬのＰｈｏｒｂｏｌ　１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ　１３－ａｃｅｔａｔｅ（シグマアルドリッチ社）、１μｇ／ｍＬのＩｏｎｏｍｙｃｉｎ　ｃａｌｃｉｕｍ　ｓａｌｔ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（シグマアルドリッチ社）および１０μｇ／ｍＬの　Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ　Ａ　ｆｒｏｍ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｂｒｅｆｅｌｄｉａｎｕｍ（シグマアルドリッチ社）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６時間反応させた。その後、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種し、ＰＢＳ（ナカライテスク社）で洗浄した。
　その後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ　Ｆｉｘａｂｌｅ　Ａｑｕａ　Ｄｅａｄ　Ｃｅｌｌ　Ｓｔａｉｎ　Ｋｉｔ，ｆｏｒ　４０５ｎｍ　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を用いて添付の説明書に従い死細胞を染色し、ＰＢＳで二回洗浄した後、上清を除き、Ｆｉｘａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて４℃、４５分間反応させた。
　反応後、ＰＢＳで１回、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤバイオサイエンス社）で２回洗浄した後、最終濃度２．５μＬのＰＥａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩＦＮ－γ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、５μＬのＡＰＣ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩＬ－４　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、１０μＬのａｎｔｉ－ＩＬ－５　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ＡＰＣ（ミルテニーバイオテク社）および２０μＬのＡＰＣ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩＬ－１３　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を添加し、４℃で３０分間反応させた。
　その後、１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ　Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
　その結果、分化誘導Ｔｈ１は、ＩＬ－４／５／１３が陰性であり、９０％がＩＦＮγ陽性のｐｏｐｕｌａｔｉｏｎであることが確認され、Ｔｈ１サイトカインを選択的に産生する細胞であることが確認できた。
（４）分化誘導Ｔｈ１細胞に対する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の反応性解析
　（２）において樹立された分化誘導Ｔｈ１細胞をＳＭで洗浄した後、１ウェルあたり５×１０４ｃｅｌｌｓとなるように９６ウェルプレートに播種し、２０００ｒｐｍで２分間の遠心分離を行った。上清を除いた後、ＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体Ｌｙｍ２、公知の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体　ＢＭ１６（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社）または３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）を添加し、４℃で１時間の反応を行った。
　アイソタイプコントロール抗体として、Ｌｙｍ２に対してはＲａｔ　ＩｇＧ２ｂ、ｋａｐｐａ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ［ＲＴＫ４５３０］－ＢＳＡ／Ａｚｉｄｅ　ｆｒｅｅ（ａｂｃａｍ社）を、ＢＭ１６に対してはＰｕｒｉｆｉｅｄ　Ｒａｔ　ＩｇＧ２ａ、κ　Ｉｓｏｔｙｐｅ　ＣｔｒｌＡｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を、３０１１０８に対してはＮｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ａ（Ｄａｋｏ社）を、それぞれ用いた。
　細胞を洗浄した後、Ｌｙｍ２抗体またはＢＭ１６を添加したウェルにはＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬ　ＣＥＬＬ　ＬＡＢ　Ｍｏｕｓｅ　Ａｎｔｉ－Ｒａｔ　Ｋａｐｐａ（ｋａｐｐａ　ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＦＩＴＣ（ベックマンコールター社）を、３０１１０８を添加したウェルには、ＳＭで希釈した１０μｇ／ｍＬ　ＣＥＬＬ　ＬＡＢ　Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（γ　ｃｈａｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ）Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ベックマンコールター社）を最終濃度１０μｇ／ｍＬでそれぞれ添加し、４℃で１時間の反応を行った。再び細胞を洗浄した後、細胞をＳＭで懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で解析した。
　その結果、図１５に示すように、ラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体Ｌｙｍ２および市販のラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＢＭ１６は分化誘導Ｔｈ１には反応性を示さなかった。一方で、市販のマウス抗ヒトＣＲＴＨ２抗体３０１１０８は分化誘導Ｔｈ１に対して反応性を示した。
　したがって、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、好酸球、好塩基球およびＴｈ２細胞には反応するものの、Ｔｈ１細胞には反応しないことが明らかになった。また、３０１１０８は、ＣＲＴＨ２を発現する細胞以外にも非特異的に反応性を示すことが明らかになった。
［実施例１９］
ヒト好酸球の形態変化を指標にした、Ｌｙｍ２抗体のアンタゴニスト活性評価
　実施例１１と同様の方法により、ヒト末梢血から好酸球の分離を行った。単離されたヒト好酸球をダルベッコりん酸緩衝生理食塩水（以下、Ｄ－ＰＢＳ（－）と記す）（ナカライテスク社）で懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１時間３０分反応させた。その後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種した。その後、最終濃度１０μｇ／ｍＬのアイソタイプコントロール抗体［ＣＥＬＬ　ＬＡＢ　Ｒａｔ　ＩｇＧ２ｂ　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ（ベックマンコールター社）］、もしくはＬｙｍ２抗体、またはポジティブコントロールとして最終濃度１０μＭ　ＣＲＴＨ２低分子拮抗薬ＯＣ０００４５９（Ｃａｙｍａｎ　ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分間反応させた。
　次に、０．１、１、１０、１００および１０００ｎＭ各最終濃度のＤＫＰＧＤ２（Ｃａｙｍａｎ　ｃｈｅｍｉｃａｌ社）を添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６０分間反応させた。反応後、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦｉｘａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ（ＢＤバイオサイエンス社）を２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、よく懸濁した後、４℃で３０分間放置した。その後、ＳＭで二回洗浄し、フローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で好酸球の形態変化を解析した。
　好酸球の形態変化は、フローサイトメーターによる解析において細胞の大きさ、細胞の表面積または細胞径の指標であるＦｏｗａｒｄ　Ｓｃａｔｔｅｒ　Ｌｉｇｈｔ（ＦＳＣ）プロットの増加を指標に解析を行い、ＤＫＰＧＤ２未処理の好酸球のＦＳＣを基準として、高ＦＳＣのｇａｔｅに検出される好酸球の割合（％）を算出した。
　その結果、図１６に示すように、ヒトＣＲＴＨ２リガンドＤＫＰＧＤ２は、濃度依存的な好酸球の形態変化誘導をしたが、ＣＲＴＨ２低分子拮抗薬ＯＣ０００４５９は、ＤＫＰＧＤ２依存的な好酸球の形態変化を抑制した。これに対して、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体Ｌｙｍ２およびアイソタイプコントロール抗体は、いずれもＤＫＰＧＤ２依存的な好酸球の形態変化を抑制しなかった。即ち、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体はアンタゴニスト活性を有しないことが示唆された。
［実施例２０］
ヒト好酸球の形態変化を指標にした、Ｌｙｍ２抗体のアゴニスト活性評価
　上述実施例１９と同様の実験系において、０、０．０１、０．１、１および１０μｇ／ｍＬ各最終濃度のラット抗ヒトＣＲＴＨ２抗体Ｌｙｍ２を加え、１時間反応させて、好酸球の形態変化を解析した。
　その結果、図１７に示すように、Ｌｙｍ２抗体は抗体濃度０－１０μｇ／ｍＬの範囲で処理を行っても好酸球の形態変化を起こさないことが示された。即ち、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体はアゴニスト活性を有しないことが示唆された。
［実施例２１］　
ヒト好酸球の形態変化を指標にした、抗ヒトＣＲＴＨ２抗体のアゴニスト活性、アンタゴニスト活性、リガンドによるシグナルの増強活性の評価
　実施例１１と同様の方法により、ヒト末梢血から好酸球の分離を行った。但し、血液に等量の注射用生理食塩水を添加する操作は行わず、直接Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ　ＰＲＥＭＩＵＭ　１．０８４（ＧＥヘルスケア社）に重層した。単離されたヒト好酸球をＤ－ＰＢＳ（－）（ナカライテスク社）で懸濁し、５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、１時間３０分反応させた。
　その後、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を用いて０．７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで９６ウェルプレートに播種した。その後、アイソタイプコントロール抗体、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１、実施例９で作成された抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２もしくはｃｈ３１Ａ５、または市販の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体ＢＭ１６（ｓａｎｔａ　ｃｒｕｚ社）もしくは３０１１０８（Ｒ＆Ｄ社）を最終濃度１０μｇ／ｍＬで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で３０分間反応させた。
　なお、アイソタイプコントロール抗体として、ＢＭ１６に対してはＰｕｒｉｆｉｅｄ　Ｒａｔ　ＩｇＧ２ａ、κ　Ｉｓｏｔｙｐｅ　Ｃｔｒｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）、３０１１０８に対してはＮｅｇａｔｉｖｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ２ａ（Ｄａｋｏ社）、その他の抗体に対しては抗ＤＮＰ　ＩｇＧ１抗体を用いた。
　次に、１００ｎＭ最終濃度のＤＫＰＧＤ２（Ｃａｙｍａｎ　ｃｈｅｍｉｃａｌ社）または１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０を添加し、さらに３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で６０分間反応させた。反応後、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、Ｆｉｘａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤバイオサイエンス社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、よく懸濁した後、４℃で３０分間放置した。その後、ＳＭで二回洗浄し、実施例１９と同様の方法で好酸球の形態変化を解析した。
　その結果、図１８（Ａ）～（Ｃ）に示すように、リガンド非存在下における抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の処理による形態変化に関しては、ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２において若干の形態変化の傾向が認められるものの、強い形態変化を起こす抗体は存在せず、いずれの抗体もアゴニスト活性を有しないことが示唆された。
　また、ＤＫＰＧＤ２処理条件下における抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の処理による形態変化に関しては、ｃｈ８Ｂ１、ｃｈ３Ｃ１２、ｃｈ３１Ａ５の処理により、ＤＫＰＧＤ２により誘発される形態変化が抑制されたことから、これらの抗体はアンタゴニスト活性を有することが示唆された。本結果は、先行特許文献（国際公開２０１４／１４４８６５号）における知見と一致する。
　一方、ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２およびＢＭ１６は、ＤＫＰＧＤ２により誘発される形態変化を増強した。特にｈｕ１９Ａ２　ｖ５２は、１００ｎＭのＤＫＰＧＤ２により誘発される形態変化を約２倍まで増強することが明らかになった。
　上述の通り、ｈｕ１９Ａ２　ｖ５２およびＢＭ１６抗体はリガンド非存在下では形態変化を誘発しないことから、これらの抗体はＣＲＴＨ２リガンドであるＤＫＰＧＤ２によるシグナルの増強活性を有することが示唆された。
　一方ＬＶ０ＨＶ１および３０１１０８は、アイソタイプコントロール抗体と同様に、ＤＫＰＧＤ２非存在下、存在下のいずれの条件下においても、形態変化に影響を示さなかったことから、ＤＫＰＧＤ２によるシグナルの増強活性を有していないことが示唆された。
　本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、生理的シグナルを遮断または増強することがない点で好ましい。
［実施例２２］　
ＣＲＴＨ２活性化状態の変遷に伴うコンフォメーション変化に対するＣＲＴＨ２モノクローナル抗体の反応性評価
（１）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体の作製
　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ－ＮＨ２（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を用いて、添付文書に従い、ヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１およびｈｕ１９Ａ２　ｖ５２にＨＲＰを直接標識した後、Ｄ－ＰＢＳ（－）（ナカライテスク社）で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。
（２）ヒトＣＲＴＨ２発現細胞の膜画分の調製
　実施例１で樹立したヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社）に剥離し、４℃に冷却したＤ－ＰＢＳ（－）を用いて細胞を洗浄した。Ｍｉｎｕｔｅ　Ｐｌａｓｍａ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｅｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、添付文書に従い膜画分を調製した。
（３）ヒトＣＲＴＨ２発現細胞の膜画分に対する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体の反応性の評価
　５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ社）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２（ナカライテスク社）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ（ナカライテスク社）および１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社）を添加した５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ７．４（ナカライテスク社）（以下、ＥＬＩＳＡ反応液と記す）を、（２）にて調製した膜画分に加え、１ｍｇ／ｍＬになるように調製し、プロテオセーブ１．５ｍＬマイクロチューブ（住友ベークライト社）に、５０μＬ／ｔｕｂｅで添加した。
　次に、５００μＭ　ＧＴＰγＳ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）または５００μＭ　ＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したＥＬＩＳＡ反応液を５０μＬ／ｔｕｂｅで添加し、３０℃にて、１時間インキュベートした。
　続いて、Ｄ－ＰＢＳ（－）で１０ｍｇ／ｍＬに希釈したＩｇＧ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）および３０％ｗ／ｖ　ＢＳＡ－ＰＢＳ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｆｒｅｅ（Ｗａｋｏ社）をそれぞれ５０μＬ／ｔｕｂｅで添加し、３０℃で、３０分間インキュベートした。
　次に、（１）で作製した、ＨＲＰ標識されたＬＶ０ＨＶ１またはｈｕ１９Ａ２　ｖ５２をＥＬＩＳＡ反応液により５μｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬ／ｔｕｂｅで添加した後３０℃で１時間インキュベートすることにより、膜画分に対する抗体反応を行った。１６０００ｇにて４℃で３０分間遠心した後、上清を除去した。
　その後、もともとＧＴＰγＳを添加していたチューブには１００μＭ　ＧＴＰγＳを添加したＥＬＩＳＡ反応液、ＧＤＰを添加していたチューブには１００μＭ　ＧＤＰを添加したＥＬＩＳＡ反応液をそれぞれ１ｍＬ／ｔｕｂｅで添加して、再度１６０００ｇにて４℃で３０分間遠心した後、上清を除去した。同様の操作を４回繰り返した後、Ｄ－ＰＢＳ（－）を１００μＬ／ｔｕｂｅで添加し、膜画分を十分に懸濁した。
　懸濁液を９６ウェルプレートに３０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、１－Ｓｔｅｐ　Ｕｌｔｒａ　ＴＭＢ－ＥＬＩＳＡ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で１０分間反応させた後、０．５ｍｏｌ／Ｌ　硫酸（Ｗａｋｏ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加し、反応を停止させた。
　ＳＰＥＣＴＲＡ　ｍａｘ　３４０ＰＣにより４８０ｎｍにおける吸光度を測定し、得られた結果をＧｒａｐｈｐａｄ　Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒ．６．０５）を用いて解析した。また、Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ　ｔｅｓｔを適応し、有意差検定を併せて実施した。
　その結果、図１９に示すようにＧＤＰ処理時におけるｈｕ１９Ａ２　ｖ５２の膜画分に対する反応性は、ＧＴＰγＳ処理時に比べて有意に低下した（ｐ＜０．０００１）。一方、ＬＶ０ＨＶ１の反応性は、ＧＴＰγＳまたはＧＤＰ処理時においても、変化しなかった（ｐ＞０．１）。
　ＣＲＴＨ２はＧＰＣＲであり、ＧＰＣＲは一般的に、活性化型コンフォメーションではＧＴＰが結合し、不活性化型コンフォメーションではＧＤＰが結合していることが知られている。上記結果の通り、本発明の抗ヒトＣＲＴＨ２抗体は、ＧＴＰアナログのＧＴＰγＳまたはＧＤＰによる処理の有無に関わらずＣＲＴＨ２への反応性が変化しなかったことから、ＣＲＴＨ２の活性化に伴うコンフォメーション変化に影響されず、一定の反応性を示す可能性が示唆された。
［実施例２３］　
アザミグリーン融合ヒトおよびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターの作製
（１）アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターの作製
　実施例１の（１）－（ｉｉ）で作製されたヒトＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐＡＭｏｈに対し、プライマーｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ａｚａｍｉ－Ａ（配列番号６０）及びｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ａｚａｍｉ－Ｂ（配列番号６１）を用いて目的断片をＰＣＲで増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、ベクターｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒ（ＭＢＬ社）と連結し、アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターを構築した。
（２）アザミグリーン融合カニクイザルＣＲＴＨ２発現ｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターの作製
　全合成されたカニクイザルＣＲＴＨ２のｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ配列：配列番号６２、アミノ酸配列：配列番号６３）を用い、実施例１の（１）－（ｉｉ）と同様の方法で構築したカニクイザルＣＲＴＨ２発現ｐＭｏｈベクターに対し、プライマーｃｙｎｏＣＲＴＨ２ａｚａｍｉ－Ａ（配列番号６４）およびｃｙｎｏＣＲＴＨ２ａｚａｍｉ－Ｂ（配列番号６５）を用い、（１）と同様にしてアザミグリーン融合カニクイザルＣＲＴＨ２発現ｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターを構築した。
［実施例２４］　
アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の造成
　実施例２３で作製されたヒトおよびカニクイザルＣＲＴＨ２遺伝子発現ｐｈｍＡＧ１－ＭＮＬｉｎｋｅｒベクターを制限酵素ＢｓａＩ処理によって切断し、得られた直鎖状ＤＮＡを精製し、滅菌水に溶解した。このＤＮＡをエレクトロポレーション法により、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に導入し、ＩＭＤＭ培養培地にて３日程度培養した。
　その後、０．５ｍｇ／ｍＬ　Ｇ４１８（ナカライテスク社）を加えたＩＭＤＭ選択培地で薬剤耐性細胞を選択した。選択した薬剤耐性細胞を、０．２５％　Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（ナカライテスク社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＩＭＤＭ選択培地で懸濁した。その後、Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ　ＳＨ８００（Ｓｏｎｙ社）を用いて、ヒトＣＲＴＨ２発現細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現細胞で同程度のアザミグリーン蛍光強度を示す細胞集団をそれぞれゲートし、１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌでソーティングを行い、拡大培養し、アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞をそれぞれ樹立した。
　アザミグリーン融合ヒトＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞について、上記と同様の方法で細胞調製を行い、フローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）を用いてアザミグリーンの発現確認を行った。その結果、図２０に示すように、それぞれの細胞のアザミグリーンの発現が同等であることを確認した。
［実施例２５］　
ヒトまたはカニクイザルＣＲＴＨ２に対するヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１の結合活性評価
　実施例２４で樹立されたアザミグリーン融合ヒトまたはカニクイザルＣＲＴＨ２発現ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社）で剥離し、ＰＢＳで洗浄した後、ＳＭで懸濁した。次に、細胞数を１ウェルあたり２×１０５個となるように９６ウェルプレートに播種し、３００００、７５００、１８７５、４６９、１１７、２９、７および２ｎｇ／ｍＬ各最終濃度のヒト化Ｌｙｍ２抗体ＬＶ０ＨＶ１または抗ＤＮＰ　ＩｇＧ１抗体を添加し、４℃で４０分間の反応を行った。
　細胞をＳＭで３回洗浄した後、ＳＭで１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈したｇｏａｔ　ａｎｔｉ－ＨｕｍａｎＩｇＧ　ａｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で４０分間の反応を行った。ＳＭで細胞を洗浄した後、細胞を１００μＬのＳＭで再懸濁し、蛍光強度をフローサイトメトリー（ＢＤバイオサイエンス社、ＦＡＣＳ　ＣａｎｔｏＩＩ）で測定した。
　データはＦｌｏｗＪｏ　７．６５（トミーデジタルバイオロジー社）によって解析した。その結果、図２１に示す通り、ＬＶ０ＨＶ１が、ヒトＣＲＴＨ２およびサルＣＲＴＨ２に対し、ほぼ同等の結合性を示すことが明らかとなった。
　本発明によりヒトＣＲＴＨ２の特徴的なエピトープを認識し、結合することで所望の活性を有する抗ヒトＣＲＴＨ２抗体、該抗体断片、該抗体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該抗体を生産するハイブリドーマおよび抗体生産細胞、該抗体の製造方法、該抗体または抗体断片を含む組成物、該抗体または抗体断片を用いるアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多や機能亢進を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多や機能亢進を伴う疾患などの治療方法および診断方法、並びに該抗体または抗体断片を含む医薬および診断薬を提供することができる。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１５年７月１５日付けで出願された日本特許出願（特願２０１５－１４１６３３）に基づいており、その全体が引用により援用される。
配列番号３：人工配列の記載：ｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ－Ａの塩基配列
配列番号４：人工配列の記載：ｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ－Ｂの塩基配列
配列番号５：人工配列の記載：ＦＬＡＧタグ付ヒトＣＲＴＨ２　ｃＤＮＡの塩基配列
配列番号６：人工配列の記載：ｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ－Ｃの塩基配列
配列番号７：人工配列の記載：ｈｕｍａｎＣＲＴＨ２ＦＬＡＧ－Ｄの塩基配列
配列番号８：人工配列の記載：ＲａｔＩｇＧ２ｂＨ－Ａの塩基配列
配列番号９：人工配列の記載：ＲａｔＩｇＧ２ｂＨ－Ｂの塩基配列
配列番号１０：人工配列の記載：Ｒａｔｋ－Ａの塩基配列
配列番号１１：人工配列の記載：Ｒａｔｋ－Ｂの塩基配列
配列番号２０：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体　ＶＨ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２１：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体　ＶＨ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２２：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体　ＶＨ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２３：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体　ＶＬ　ＣＤＲ１のアミノ酸配列
配列番号２４：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体　ＶＬ　ＣＤＲ２のアミノ酸配列
配列番号２５：人工配列の記載：Ｌｙｍ２抗体　ＶＬ　ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号２６：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２発現ベクター用ＶＨの合成ＤＮＡ
配列番号２７：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２発現ベクター用ＶＬの合成ＤＮＡ
配列番号２８：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２　ＶＨ－Ａの塩基配列
配列番号２９：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２　ＶＨ－Ｂの塩基配列
配列番号３０：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２　ＶＨ－Ｃの塩基配列
配列番号３１：人工配列の記載：ｃｈＬｙｍ２　ＶＨ－Ｄの塩基配列
配列番号３２：人工配列の記載：ＬＶ０の塩基配列
配列番号３３：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号３４：人工配列の記載：ＬＶ１の塩基配列
配列番号３５：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号３６：人工配列の記載：ＬＶ２ａの塩基配列
配列番号３７：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号３８：人工配列の記載：ＬＶ２ｂの塩基配列
配列番号３９：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号４０：人工配列の記載：ＬＶ２ｃの塩基配列
配列番号４１：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号４２：人工配列の記載：ＬＶ３ａの塩基配列
配列番号４３：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号４４：人工配列の記載：ＬＶ３ｂの塩基配列
配列番号４５：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号４６：人工配列の記載：ＬＶ４の塩基配列
配列番号４７：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号４８：人工配列の記載：ＨＶ０の塩基配列
配列番号４９：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号５０：人工配列の記載：ＨＶ１の塩基配列
配列番号５１：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号５２：人工配列の記載：ＨＶ２ａの塩基配列
配列番号５３：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号５４：人工配列の記載：ＨＶ２ｂの塩基配列
配列番号５５：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号５６：人工配列の記載：ＨＶ３の塩基配列
配列番号５７：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号５８：人工配列の記載：ＨＶ４の塩基配列
配列番号５９：人工配列の記載：合成コンストラクトのアミノ酸配列
配列番号６０：人工配列の記載：ｈｕｍａｎ　ＣＲＴＨ２　ａｚａｍｉ－Ａの塩基配列
配列番号６１：人工配列の記載：ｈｕｍａｎ　ＣＲＴＨ２　ａｚａｍｉ－Ｂの塩基配列
配列番号６４：人工配列の記載：ｃｙｎｏ　ＣＲＴＨ２　ａｚａｍｉ－Ａの塩基配列
配列番号６５：人工配列の記載：ｃｙｎｏ　ＣＲＴＨ２　ａｚａｍｉ－Ｂの塩基配列

Claims (26)

  1. 　配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９２番目のグリシンおよび１９４番目のアスパラギン酸の少なくとも一方を認識し、結合する抗体または該抗体断片。
  2. 　抗体が、配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１３番目のイソロイシン、１４番目のロイシン、１５番目のグルタミン酸、１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、１７９番目のアルギニン、１８０番目のイソロイシン、１８１番目のメチオニン、１８２番目のシステイン、１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシン、１８５番目のアスパラギン、１８６番目のバリン、１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシン、１８９番目のロイシン、１９５番目のアルギニン、１９６番目のアスパラギン酸、１９７番目のアラニン、および１９８番目のスレオニンからなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを認識し、結合する抗体である請求項１に記載の抗体または該抗体断片。
  3. 　抗体が、以下の（ａ）～（ｇ）からなる群から選ばれるアミノ酸残基の少なくとも１つを認識する抗体である、請求項１または２に記載の抗体または該抗体断片。
    （ａ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１２番目のプロリン、１４番目のロイシンおよび１５番目のグルタミン酸、
    （ｂ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１７７番目のアスパラギン酸、１７８番目のグリシン、および１７９番目のアルギニン、
    （ｃ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８０番目のイソロイシンおよび１８１番目のメチオニン、
    （ｄ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８３番目のチロシン、１８４番目のチロシンおよび１８５番目のアスパラギン、
    （ｅ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１８７番目のロイシン、１８８番目のロイシンおよび１８９番目のロイシン、
    （ｆ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９５番目のアルギニン、並びに
    （ｇ）配列番号２で表されるヒトＣＲＴＨ２のアミノ酸配列の１９６番目のアスパラギン酸および１９８番目のスレオニン。
  4. 　抗体が、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群から選ばれるいずれか１つの抗体である、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
    （ａ）抗体重鎖可変領域（以下、ＶＨと略記する）の相補性決定領域（以下、ＣＤＲと略記する）１～３が、それぞれ配列番号２０～２２で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体軽鎖可変領域（以下、ＶＬと略記する）のＣＤＲ１～３が、それぞれ配列番号２３～２５で表されるアミノ酸配列を含む抗体、
    （ｂ）配列番号４９で表されるアミノ酸配列または配列番号４９で表されるアミノ酸配列中の１８番目のロイシンをメチオニンに、７７番目のアスパラギンをセリンに、９３番目のバリンをスレオニンに、および１１７番目のスレオニンをバリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＨ並びに配列番号３３で表されるアミノ酸配列または配列番号３３で表されるアミノ酸配列中の２番目のイソロイシンをバリンに、４番目のメチオニンをロイシンに、１５番目のプロリンをロイシンに、および８５番目のアラニンをプロリンに置換する改変から選ばれる少なくとも１つの改変が導入されたアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体、
    （ｃ）配列番号４９、５１、５３、５５、５７および５９で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＨ並びに配列番号３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５および４７で表されるアミノ酸配列のいずれか１つを含むＶＬを含む抗体、並びに
    （ｄ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列を含むＶＨおよび配列番号１９で表されるアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体。
  5. 　抗体が、下記（ａ）～（ｈ）からなる群から選ばれる少なくとも１つの特徴を有する抗体である請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
    （ａ）ヒトＣＲＴＨ２のリガンド存在下でヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が低下しない、
    （ｂ）中和活性を有しない、
    （ｃ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、
    （ｄ）マスト細胞およびＴｈ１細胞の少なくとも一方に反応しない、
    （ｅ）好酸球、好塩基球、Ｔｈ２細胞および２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）から選ばれる少なくとも一つの細胞に反応する。
    （ｆ）アゴニスト活性を有しない、
    （ｇ）ヒトＣＲＴＨ２のリガンドによるシグナルを増強しない、並びに
    （ｈ）活性化状態または不活性化状態のヒトＣＲＴＨ２に対する反応性が変化しない。
  6. 　抗体が、ヒトＦｃ領域を含む抗体である、請求項１～５のうちのいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
  7. 　抗体が、モノクローナル抗体である請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
  8. 　抗体が、遺伝子組換え抗体である請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
  9. 　遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体およびヒト抗体から選ばれるいずれか１つの遺伝子組換え抗体である、請求項８に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
  10. 　抗体が、サルＣＲＴＨ２に結合する抗体である請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体または該断片。
  11. 　Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドから選ばれるいずれか１つの抗体断片である請求項１～１０のいずれか１項に記載の該抗体断片。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を産生するハイブリドーマ。
  13. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
  14. 　請求項１３に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
  15. 　請求項１４に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
  16. 　請求項１２に記載のハイブリドーマまたは請求項１５に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を生産蓄積させ、該培養物から抗体または該抗体断片を採取することを特徴とする請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片の製造方法。
  17. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療剤。
  18. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片を有効成分として含有する、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の診断剤。
  19. 　ＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、または２型自然リンパ球（ＩＬＣ２）の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である請求項１７または１８に記載の剤。
  20. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片の有効量を投与することを含む、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療方法。
  21. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片の有効量を投与することを含む、ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の診断方法。
  22. 　ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、またはＩＬＣ２の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 　ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療および診断の少なくとも一方に使用するための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片。
  24. 　ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、またはＩＬＣ２の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である請求項２３に記載の抗体または該抗体断片。
  25. 　ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患の治療および診断剤の少なくとも一方の製造のための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片の使用。
  26. 　ヒトＣＲＴＨ２が関係する疾患がアレルギー性疾患、自己免疫疾患、好酸球増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、Ｔｈ２細胞の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患、またはＩＬＣ２の増多および機能亢進の少なくとも一方を伴う疾患である請求項２５に記載の使用。
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