WO2017005754A1 - Method for purifying and concentrating nucleic acids - Google Patents

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Publication number
WO2017005754A1
WO2017005754A1 PCT/EP2016/065879 EP2016065879W WO2017005754A1 WO 2017005754 A1 WO2017005754 A1 WO 2017005754A1 EP 2016065879 W EP2016065879 W EP 2016065879W WO 2017005754 A1 WO2017005754 A1 WO 2017005754A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
acid fragment
solution
elution
cation exchange
Prior art date
Application number
PCT/EP2016/065879
Other languages
French (fr)
Inventor
Célia FRANCOIS
Axelle Cadiere
Clément FAYE
Laurent Garrelly
Original Assignee
Gl-Biocontrol
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gl-Biocontrol filed Critical Gl-Biocontrol
Publication of WO2017005754A1 publication Critical patent/WO2017005754A1/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying and concentrating nucleic acids that may be present in a sample and materials for carrying out such a method.
  • the invention also includes diagnostic kits for implementing such a method.
  • non-compliant waters could be the cause of 10 to 30% of the total acute gastroenteritis observed in the areas served by these waters.
  • the bacteriological parameter deserves the greatest vigilance because it reflects the immediate risk for the health of the consumer.
  • the regulation imposes the search for indicators of contamination and the controls are carried out by the DDASS or the ARS.
  • the identification of bacteria in the environment is essential for public health.
  • Legionella-type bacteria which can be found in natural and artificial water sites and more particularly in hot water networks, particularly responsible for Legionella and Pontiac fever.
  • Legionella There are several species of Legionella, but the species L. pneumophila seems to have a greater virulence than the other species since it is involved in more than 90% of cases Legionella. It causes severe pneumonia resulting in respiratory failure and / or shock and polyvisceral insufficiency that may result in death.
  • the infection is due to the inhalation of microdroplets containing the bacteria.
  • Legionella pneumophila in a water system can have important consequences for the operation up to the shutdown of the circuit through long and expensive operations of cleaning and disinfection for the restoration of circuits .
  • Examples of bacteria found in water intended for human consumption and which are responsible for health problems Cryptosporidium sp., Cyanobacteria and their toxins, Pseudomonas aeruginosa and Bacillus sp.
  • the identification of bacteria in the environment is therefore essential for public health.
  • the detection of the presence of nucleic acid molecules is also applicable in the medical field, for example to detect in a biological sample collected from a subject, the presence of circulating nucleic acid, in particular circulating DNA, or to detect possible contamination by a microorganism.
  • the detection of the presence of nucleic acid molecules in a sample is also important in the field of the food industry, for detecting any contamination by a microorganism in an intermediate or final product of the food industry, or for detect any contamination by a microorganism in a device used for food production.
  • a first approach based on, for example, the AFNOR T 90-431 standardized method (last revision of November 2014), is based on the culture of germs and the enumeration of colony forming units. However, this method based on germ culture requires several days to establish a diagnosis.
  • a second approach consists in labeling the bacterium, in particular L. pneumophila or E. coli, with a specific fluorescent antibody and quantifying the bacterium by cytometry (Philippe Lebaron, Applied And Environmental Microbiology (2004), p 1651-1657;
  • the sensitivity threshold of the detection of bacterial cells in water is not less than a few tens of cells per liter.
  • pathogens likely to colonize water circuits, industrial or environmental water or air they are present at very low concentrations. It is therefore important to have a test that is both sensitive and rapid to detect contaminations, especially bacterial contamination at low concentrations.
  • Liu et al. discloses a biochip for the detection of bacteria in which the following steps are performed: immunomagnetic capture of the target bacteria; pre-concentration of bacteria and their purification; lysis of bacteria; PCR amplification of nucleic acids obtained and detection based on electrochemical DNA chips [Liu et al. Anal. Chem. (2004) 76, 1824-1831].
  • immunomagnetic capture of the target bacteria this device allows only a specific detection, targeting a particular bacterium.
  • European Patent Application EP2757156 teaches a method for purifying nucleic acids comprising a step of adsorbing the sample containing said nucleic acid on an ion exchange resin comprising a positive resin and a negative resin.
  • the international application WO 95/14087 describes a method for detecting oligonucleotides present in a biological fluid, in particular comprising the desorption of the oligonucleotides from the resin with a buffer having a molar concentration of between 1 and 2.5 M and a pH of between 6. , 5 and 7.5 and at a temperature between 40 and 65 ° C.
  • PEI polyethyleneimine
  • the terms “capture” and “complexation” are equivalent. Indeed, according to the invention, the nucleic acid fragments (AN) contained in the sample to be analyzed are captured or complexed by attachment to polycations forming a complex AN-polycations stable in water.
  • the invention relates to a method for fixing and purifying single-stranded or double-stranded DNA fragments.
  • the method further comprises a step of recovering the eluted DNA fragments.
  • the eluted DNA fragments are identified and / or quantified by any technique known to those skilled in the art, such as, in a nonlimiting manner: the polymerase chain reaction (PCR), the chain amplification by quantitative polymerization in vitro. real-time (qPCR), Southern blotting, sequencing, pyrosequencing, single nucleotide polymorphism (SNP), fingerprinting, and digestion with restriction enzymes.
  • the invention in a second aspect, relates to a method for capturing and purifying RNA fragments from a sample.
  • the method further comprises a step of recovering the eluted RNA fragments.
  • RNA fragments can be used for downstream applications such as, but not limited to: reverse transcription, RT-PCR, sequencing, RNA transfer (northern blotting).
  • the invention relates to the use of the method of the invention for the detection of eukaryotic bacteria, viruses, parasites and nucleic acids.
  • the invention relates to a kit for purifying and concentrating at least one nucleic acid fragment from a sample that may contain it using the method according to the invention.
  • the present invention relates to a method for purifying and concentrating at least one nucleic acid fragment, of a size greater than 20 nucleotides (or 20 bases) for a single-stranded nucleic acid fragment, and greater than 20 base pairs (bp) for a double-stranded nucleic acid fragment likely to be present in a sample, the method comprising the following steps:
  • step b) fixing the complex obtained in step a) on a cation exchange resin
  • steps a) to c) of the process are carried out at a pH of between about 6.0 and 10.0, preferably between about 7.5 and 9.5, and particularly preferably between about 8 and 9, the pH of each of these steps being identical or different from each other.
  • the steps a) to c) can either be carried out every 3 at the same pH, or two of the steps be carried out at the same pH and the third at a different pH, or each step be carried out at a different pH.
  • Step b) of the process is carried out by contacting the complex obtained during step a) and the cation exchange resin, and homogenizing the solution thus obtained by applying a stirring force.
  • limited stirring force is meant a mechanical stirring force whose intensity and / or duration is limited, and in particular:
  • a slow or gentle agitation ie a homogenization of the solution, in particular by successive reversals of the tube or microtube containing said solution, and particularly by manual reversals, the intensity of the agitation being limited.
  • Said slow or gentle agitation is applied for a duration of preferably less than or equal to 15 minutes, less than or equal to 10 minutes, less than or equal to 5 minutes, less than or equal to 2 minutes, less than or equal to 1 minute, less than or equal to at 30 seconds or equal to 20 seconds, or
  • Short-time stirring designating a stirring lasting less than or equal to 120 seconds, less than or equal to 60 seconds, less than or equal to 30 seconds, or equal to 10 seconds.
  • Said short-time stirring can be implemented by any means known to those skilled in the art, in particular by a vortex-type orbital stirrer.
  • nucleic acid fragment is understood to mean a single-stranded DNA fragment, a double-stranded DNA fragment, genomic DNA or RNA.
  • the size of said nucleic acid fragment is greater than or equal to 200 bases, or 200 bp; more particularly the size of said nucleic acid fragment is greater than or equal to 200 bases, or 200 bp, and less than or equal to 2000 bases, or 2000 bp.
  • said nucleic acid fragment is whole or fragmented genomic DNA, the size of which is generally between 1000 bp and 4 10 6 bp.
  • the amount of detectable nucleic acid is between 20 femtograms and 500 nanograms per sample.
  • the amount of detectable nucleic acid is between 5 and 100 million Genome Units of bacteria per sample.
  • sample for example, a sample of industrial water, environmental water or drinking water, intended for human or animal consumption; a sample is also understood to mean a liquid sample produced in the food industry, such as, for example, a beverage, or a sample of a biological liquid in which it is desired to determine the presence of a microorganism or to detect the presence of a specific sequence of eukaryotic DNA or RNA.
  • biological fluid there may be mentioned a blood sample, urine, saliva or plasma.
  • a sample may also be obtained by dissolving or suspending a solid sample, by example a tissue sample or a plant sample.
  • the extraction of the nucleic acid fragments from the samples is carried out by any technique known to those skilled in the art for releasing and extracting the nucleic acids contained in said samples.
  • the polycationic polymer is used in the form of a solution, that is to say in a homogeneous phase;
  • the polycationic polymer may be selected from the group consisting of linear polylysine, lysine grafted dendrimers (DGL), polyethylenimine (PEI), polyamidoamine (PAMAM) (Tang et al., Bioconjug Chemistry, (1996), 7). , 703-714, Plank et al., Hum Gene Ther., 1999, 10, 319-332), chitosan, polyarginine, polyornithine, protamine sulfate and polybrene.
  • DGL linear polylysine
  • PEI polyethylenimine
  • PAMAM polyamidoamine
  • the polycationic polymer is chosen from the group comprising poly-L-lysine (PLL), lysine-grafted dendrimers (DGL), polyethylenimine (PEI) or polyamidoamine (PAMAM).
  • PLL poly-L-lysine
  • DGL lysine-grafted dendrimers
  • PEI polyethylenimine
  • PAMAM polyamidoamine
  • the polycationic polymer is a polyethylenimine (PEI).
  • PEI polyethylenimine
  • the PEI has an average molecular weight of between 1 and 1000 kDa.
  • the PEI used is a PEI of 750 kDa, for example the product marketed under the name LU PASO L® P, BASF.
  • the polycationic polymer is a poly-L-lysine (PLL) with an average molecular weight ranging between 1 kDa and 1000 kDa, advantageously between 10 and 30 kDa, even more advantageously equal to 20 kDa. kDa.
  • PLL poly-L-lysine
  • the poly-L-lysine is used in an amount of from 0.1 to 10 mg, preferably at a level of about 1 mg per sample.
  • the polycationic polymer is a polylysine grafted dendrimer (DGL).
  • DGL polylysine grafted dendrimer
  • the term "polylysine grafted dendrimers” means polymers based on D- or L-lysine such as those described in the international application WO2006 / 114528. These dendrimers are either composed solely of lysine, in this case homopolylysines are referred to, consisting of more than 30 mol% of lysine and also containing units of other amino acids, in this case heteropolylysines.
  • dendrimers are used.
  • DGL of generations greater than 5 tend to form aggregates that make their use difficult.
  • the amount of polycationic polymer added is such that the charge ratio [+] / [-] (sometimes represented by the N / P ratio in mol / mol) between the polycationic polymer and the nucleic acid is greater than 2, advantageously greater than to 10.
  • the nucleic acid / polycationic polymer complex obtained in step a) is then fixed on a cation exchange resin.
  • Cation exchange resins are negatively charged cationic resins; mention may be made, for example, of strong resins carrying groups derived from strong acids such as phenylsulphonic and methylsulphonic acids and weak resins bearing, for example, carboxylic or carboxymethyl groups.
  • the cation exchange resin is a weak cationic exchange resin.
  • the cation exchange resins used in the present invention preferably have an ion exchange capacity of at least 2 mEq / g, preferably at least 10 mEq / g and in particular between 10 and 30 mEq / boy Wut.
  • the resin is used in an amount of from 20 to 200 mg, preferably at a level of about 80 mg per sample.
  • weak cation exchange resins include the copolymers of methacrylic acid and divinylbenzene, sold for example under the name AMBERLITE IRP88 from Rohm and Haas, under the name Indion 234 from Indion Resins, and the Oasis WCX denomination of the company Waters.
  • the fixing of the nucleic acid / polycationic polymer complex on the cation exchange resin is done by simply bringing these two components into contact in an aqueous medium.
  • said attachment is effected by the application of a limited stirring force, either by slow or gentle stirring, for a period of preferably less than or equal to 15 minutes, less than or equal to 10 minutes, less than or equal to at 5 minutes, less than or equal to 2 minutes, less than or equal to 1 minute, less than or equal to 30 seconds or equal to 20 seconds, or agitation lasting less than or equal to 120 seconds, less than or equal to 60 seconds, less than or equal to 30 seconds, or equal to at 10 seconds, by any known means, in particular by a vortex-type orbital stirrer.
  • the nucleic acid / polycationic polymer complex is retained on the cation exchange resin suspended by successive reversals of the tube containing said resin (batch process) or by percolation on a cartridge or chromatography column containing said resin.
  • the batch process there are 3 to 5 manual reversals of the tubes.
  • the elution step is carried out by applying a vigorous stirring force at an elevated temperature.
  • the stirring force is a mechanical stirring chosen from: stirring by orbital stirrer, in particular of the vortex type, by linear stirrer, by thermomixer (or heating vortex), by ultrasound or by microwaves.
  • the mechanical stirring is carried out using a vortex stirrer at a stirring speed greater than 1000 rpm, advantageously greater than 1500 rpm and particularly advantageously at a speed of 2500 rpm. per minute.
  • the mechanical agitation is carried out using a heating vortex, or thermomixer, thus allowing mechanical agitation to be applied at a controlled temperature.
  • the elution of the at least one nucleic acid fragment is performed by exposure to an ultrasound field using an ultrasonic bath.
  • the samples containing the complex polycations / nucleic acids fixed on the solid support are subjected to an ultrasound field, generally constant, for a duration of about 1 minute.
  • the molecules present in the samples are then subjected to vigorous stirring, causing the nucleic acids of the solid support to drop out and to put them in solution in the buffer (this stall constitutes the nucleic acid elution step).
  • the elution of the at least one nucleic acid fragment is carried out by exposure to microwaves with a frequency of between 2400 and 2500 MHz.
  • the mechanical stirring step is performed by a Vortex-type orbital stirrer coupled to a heating step.
  • the temperature must be raised to between about 30 ° C. and 100 ° C., advantageously at a temperature of between about 60 ° C. and 80 ° C. and particularly advantageously at a temperature of about 75 ° C.
  • the mechanical stirring step is carried out by a Vortex-type orbital stirrer at a temperature of between approximately 30 ° C. and 100 ° C., advantageously at a temperature of between approximately 60 ° C. and 80 ° C and particularly advantageously at a temperature of about 75 ° C.
  • any type of buffer known to those skilled in the art usually used for the elution of nucleic acids may be suitable.
  • a TE (Tris EDTA) buffer (10 mM Tris pH 8.5, 1 mM EDTA).
  • the pH of the TE buffer solution is from about 6.0 to 10.0, preferably from about 7.5 to 9.5, and particularly preferably from about 8.0 to 9.0.
  • One of the advantages of the process according to the invention is that it allows a stall of the nucleic acids of the solid phase without recovering the polycationic polymers which remain fixed on the solid support, thus making it possible to obtain pure nucleic acids which can be directly used for analyzes by molecular biology methods.
  • the elution of the nucleic acid fragments does not require any buffer change and can be carried out in the same buffer and under the same conditions of pH and ionic strength as the complexation and attachment steps to the solid support by simple force. stirring in minutes.
  • the various undesirable elements can be retained either by the polycation or by the solid phase or else be eliminated during the first step of capture of the polyplex. As a result, cleaning efficiency is greater than with existing technologies.
  • the method may comprise at least one of the steps selected from a step of recovering the nucleic acid fragments and a step of quantifying the nucleic acid fragments.
  • the quantification step of the nucleic acid fragments can be carried out by any technique known to those skilled in the art, in particular by polymerase chain reaction (PCR), by RT-PCR, by pyrosequencing, by amplification. , by transcription (TMA or transcription mediated amplification), by ligase chain reaction (LCR), by isothermal nucleic acid amplification and initiated by chimeric primers (ICAN or isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid), by isothermal amplification of loop-mediated DNA (LAMP or Loop-mediated isothermal amplification of DNA).
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR RT-PCR
  • pyrosequencing by amplification.
  • TMA transcription mediated amplification
  • LCR ligase chain reaction
  • ICAN isothermal nucleic acid amplification and initiated by chimeric primers
  • ICAN isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic
  • the present invention also relates to the use of the method according to one of the preceding claims for the detection of bacteria, the detection of viruses, the detection of parasites and the identification of eukaryotic sequences.
  • the method according to the invention can be used not only in the sanitary engineering and microbiological monitoring of water and surfaces but also in biology and medicine.
  • the invention also relates to a method for the detection of bacteria, viruses and parasites or the detection of eukaryotic nucleic acids in a sample that may contain them by purification of a nucleic acid fragment. greater than 20 bases or 20 bp, said method comprising the following steps:
  • step b) fixing the complex obtained in step a) on a cation exchange resin
  • steps a) to c) of the process are carried out at a pH of between about 6.0 and 10.0, preferably between about 7.5 and 9.5, and particularly preferably between about 8 and 9, the pH of each of these steps being identical or different from each other.
  • Stage b) of the process is carried out by the application of a limited stirring force, either by slow or gentle stirring, for a period preferably of less than or equal to 15 minutes, more particularly for a period of less than or equal to at 10 minutes, less than or equal to 5 minutes, less than or equal to 2 minutes, less than or equal to 1 minute, less than or equal to 30 seconds or equal to 20 seconds, or a short duration of agitation, of a shorter duration or equal to 120 seconds, less than or equal to 60 seconds, less than or equal to 30 seconds, or equal to 10 seconds, by any known means, in particular by a vortex-type orbital stirrer.
  • steps a) to c) are followed by a step of analyzing the at least one nucleic acid fragment thus purified.
  • the invention finally relates to a kit for purifying and concentrating at least one nucleic acid fragment from a sample that may contain it using the method according to the invention.
  • a kit comprises a homogeneous phase soluble polycationic polymer, a cation exchange resin and a buffer solution at a pH of between 6.0 and 10.0.
  • Such a kit makes it possible to purify nucleic acid fragments larger than 20 nucleotides, for single-stranded nucleic acids, or larger than 20 bp, for double-stranded nucleic acids.
  • such a kit contains an explanatory note for the implementation of a method according to the invention.
  • FIG. 1 illustrates the effect of the power of the mechanical force (in rpm, for "revolutions per minute” or “revolutions per minute”) on the extraction yields according to Example 4, either in the form of a curve ( A) in the form of numerical values (B).
  • Figure 2 illustrates the comparison of the ability to remove PCR inhibitors present in industrial water samples between the method according to the invention. and a conventional ultrafiltration DNA purification method according to Example 10.
  • Figure 3 illustrates the follow-up of the genome units of Legionella pneumophila and the amount of linear polylysine (PLL) in the supernatant as a function of the agitation time (1800 rpm at 75 ° C vortex) after the formation of polypiexis and the contact with the cation exchange resin according to Example 11.
  • Figure 4 illustrates the purification efficiency of nucleic acids of different size: 20 bp DNA fragment, 150 bp DNA amplicon, plasmid DNA 2000 bp or genomic DNA, according to Example 12.
  • Figure 5 illustrates the ability to purify ribonucleic acid (RNA) and deoxyribonucleic acid (DNA) according to Example 13 either as a histogram (A) or in tabular form (B).
  • RNA ribonucleic acid
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • Figure 6 illustrates the nucleic acid extraction yield from different matrices, agri-food type matrices (A) or medical type matrices (B) according to Example 14.
  • Various genomic DNA solutions of Legionella pneumophila containing respectively 2,000, 36,000 and 328,000 MU (genome units) per sample, are placed in the presence of 100 ⁇ l of a 10 mg / ml linear polylysine solution (PLL) in a microtube.
  • PLL linear polylysine solution
  • the placing in contact of the PLL and the genomic DNA is achieved by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube.
  • the polypiex is then retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) suspended (batch process) by ten successive reversals of the microtube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed.
  • TE Tris HCl 10 mM pH 8.5, EDTA ImM
  • the tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant. 5 ⁇ l of the supernatant are used to titrate elution with qPCR (Biorad, kit iQ-Check TM legionella pneumophila).
  • the method according to the present invention makes it possible to obtain very satisfactory genomic DNA recovery yields of approximately 64 and 134%, in accordance with the requirements of standards NF T 90-471 and ISO TS 12869.
  • EXAMPLE 2 METHOD OF PURIFYING A NUCLEIC ACID OF 150PB 2.1. Materials and methods
  • Various solutions of a nucleic acid of 150 bp, respectively titrated at 1469, 4898 and 48989 units per sample are brought into contact with 100 ⁇ l of a linear polylysine solution at 10 mg / ml in a microtube.
  • the placing in contact of the PLL and the genomic DNA is achieved by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube.
  • the polypiexis is then retained on a suspension cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed.
  • a volume of 200 ⁇ l of a TE elution buffer (10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA) is added to the resin.
  • the tubes are then held at 75 ° C for 10 minutes in a water bath before being vortexed (2500 rpm) for 10 minutes.
  • the tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant. 5 ⁇ of the supernatant are used to titrate elution with qPCR (Perfecta qPCR ToughMix Quanta) with primers (RI 5'- CCA ATT GAG CGC TCA TCA TAG - 3 '/ FL 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C -3') and probe 5 '-FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3 'chosen according to NF T 90-431 standard. 2.1 Results
  • Table 2 Purification of a 150 bp nucleic acid.
  • the method according to the present invention makes it possible to recover between about 28 and 34% of a 150 bp nucleic acid.
  • Various genomic DNA solutions of Legionella pneumophila are respectively brought into contact in microtubes with 100 ⁇ l of a 10 mg / mL solution of polyethyleneimine (PEI) of different types under the names Lupasol® WF, Lupasol® PS, Lupasol® HF, and Lupasol® G100, either a 10 mg / mL solution of Polybrene or a 10 mg / mL solution of lysine grafted dendrimers (DGL) (either generations 2, 3, 4 or 5) and either a 10 mg / mL solution of linear polylysine.
  • PEI polyethyleneimine
  • the gDNA polyplex / polycationic polymer is formed with gentle stirring by three successive turns of said microtubes.
  • the polyplex is then batchwise retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed.
  • a volume of 200 ⁇ l of a TE elution buffer (10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA) is added to the resin.
  • the tubes are then held at 75 ° C for 10 minutes before being vortexed (2 500 rpm) for 10 minutes.
  • the tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant. 5 ⁇ l of the supernatant are used to titrate elution with qPCR (Biorad, kit iQ-Check TM legionella pneumophila).
  • a genomic DNA solution of Legionella pneumophila is placed in the presence of 100 ⁇ l of a linear polylysine solution (PLL). at 10 mg / mL in a microtube.
  • PLL linear polylysine solution
  • the gDNA-PLL polypiex is formed with gentle agitation by three successive reversals of the microtube.
  • the polypiexis is then batchwise retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube.
  • a cation exchange resin 80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g
  • the tubes are then held at 75 ° C for 10 minutes before being vortexed (Pulsing vortex mixer: 120 V / 50-60 Hz / 150 W / 500 - 2500 rpm) for 10 minutes at different powers (in rpm ), 0, 500, 1,000, 1,500, 2,000 or 2,500.
  • the tubes are centrifuged (10 000 g for 5 seconds) to remove the supernatant.
  • FIGS. 1A and 1B Optimum yields are achieved from agitation above 1500 rpm.
  • a genomic DNA solution of Legionella pneumophila, titrated at 404,000 MU per sample, is placed in the presence of 100 ⁇ l of a linear polylysine solution at 10 mg / ml in a microtube.
  • the gDNA-PLL polypiex is formed with gentle agitation by three successive reversals of the microtube.
  • the polypiexis is then batchwise retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed.
  • a volume of 200 ⁇ of a solution TE elution buffer is added to the resin. Elution is carried out according to different methods:
  • the tubes are then centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to remove the supernatant. 5 ⁇ l of the supernatant are then used to titrate elution with qPCR (Biorad, kit iQ-Check TM legionella pneumophila).
  • a genomic DNA solution of Legionella pneumophila titrated at 45 501 MU per sample is placed in the presence of 100 ⁇ l of a linear poly-lysine solution. (PLL) at 10 mg / mL in a microtube.
  • the placing in contact of the PLL and the genomic DNA is achieved by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube.
  • the polyplex is then batchwise retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed. 200 ⁇ l of a solution at different pHs, from 8.5 to 12, are added to the resin.
  • the tubes are then processed according to two methods:
  • the tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant. 2 ⁇ l of the supernatant are used to titrate the qPCR elution (Perfecta qPCR ToughMix Quanta) with the primers (RI 5'-CCA ATT CGC GAG CAC TCA TAG-3 '/ FL 5'-CCG ATG CCA CAT CAT TAG C- 3 ') and the 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT probe CCG-BHQ1-3 'selected according to standard NF T 90-431.
  • EXAMPLE 7 EFFECT OF IONIC FORCE DURING THE STAGE OF CAPTURE OF DNA BY POLYCATION
  • a volume of 2 ⁇ is dosed with nanodrop (Lq at 5 ng / ⁇ ) in order to evaluate the capture efficiency.
  • EXAMPLE 8 EFFECT OF THE IONIC FORCE OF THE ELUTION SOLUTION ON GENOMIC DNA RECOVERY YIELDS.
  • a genomic DNA solution of Legionella pneumophila, titrated at 58 025 UG per sample, is placed in the presence of 100 ⁇ l of a linear poly-lysine solution at 10 mg / ml in a microtube.
  • the placing in contact of the PLL and the genomic DNA is achieved by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube.
  • the polyplex is then batchwise retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed.
  • a TE elution buffer solution (10 mM Tris HCl pH 8.5, 1 mM EDTA) at varying NaCI concentrations, from 20 to 340 mM, are added to the resin.
  • the tubes are then held at 75 ° C for 10 minutes before being vortexed (2500 rpm) for 10 minutes.
  • the tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant.
  • 2 ⁇ l of the supernatant are used to titrate the elution with qPCR (Perfecta toughmix, Quanta) with the primers (RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3 '/ Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3 ') and the 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT probe CCG-BHQ1- 3 'selected according to standard NF T 90-431.
  • the process according to the present invention makes it possible to obtain good yields, namely greater than 25% by reference to standards N F T 90-471 and ISO TS 12869, regardless of the ionic strength of the elution solution.
  • a genomic DNA solution of Legionella pneumophila, titrated at 293 782 UG per sample, is placed in the presence of 100 ⁇ l of a linear polylysine solution at 10 mg / ml in a microtube.
  • the placing in contact of the PLL and the genomic DNA is achieved by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube.
  • the polyplex is then retained on a cartridge containing a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) per percolation.
  • a cation exchange resin 80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g
  • a volume of 100 ⁇ l of a TE elution solution (10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA) is then brought into contact with the resin.
  • the same volume was filtered (between 10 and 100 ml according to the properties of each sample) on a polycarbonate membrane (0.45 ⁇ ). The membrane is then deposited in a lysis solution and placed at 95 ° C. for 15 minutes.
  • the supernatant is recovered and then brought into the presence of 100 ⁇ l of a 10 mg / ml linear polylysine solution in a microtube.
  • the placing in contact of the PLL and the extracted genomic DNA is carried out by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube.
  • the polyplex is then retained in batch on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed.
  • a volume of 100 ⁇ l of a TE elution solution (10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA) is added to the resin.
  • the tubes are then held at 75 ° C for 10 minutes before being vortexed at 1800 rpm for 10 minutes.
  • the tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant.
  • the elution is recovered in a new microtube.
  • a genomic DNA solution of Legionella pneumophila containing 9.1 ⁇ 10 5 ⁇ G is placed in the presence of 100 ⁇ l of a linear polylysine solution (PLL) at 10 mg / ml.
  • PLL and genomic DNA are brought into contact by homogenization of the solution by three successive manual reversals of the micro-tube for less than 10 seconds.
  • the polyplex is then retained on a suspension cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by stirring at 1800 rpm at 75 ° C. using a thermomixer (thermomixer TS100 - MD33, Hangzhou Miu Instruments Co. Ltd). Samples of the supernatant are taken at different times to determine the kinetics of capture.
  • the samples are analyzed by qPCR (Quanta Perfecta tough mix) with the primers (RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG-3 '/ FL 5'-CCG ATG CCA CAT CAT TAG C-3') and probe 5 '-FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1-3 selected according to standard NF T 90-471.
  • PLL linear polylysine solution
  • the polyplexes are then retained batchwise on a cation exchange resin (80 mg to 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After centrifugation, the supernatant is removed.
  • the tubes are then shaken (1800 rpm) at 75 ° C. for 10 minutes using a thermomixer (TS100-MD33 thermomixer, Hangzhou Miu instruments Co. Ltd.).
  • the tubes are centrifuged at 5,000 g for 5 minutes. seconds to collect the supernatant. 5 ⁇ l of this eluate are used to titrate qPCR elution (Quanta Perfecta tough mix) with specific primers and probes (Table 10) for 150 bp genomic DNA samples.
  • the extracts are analyzed on agarose gel coupled to densitometry.
  • EXAMPLE 13 CAPACITY FOR EXTRACTING DNA AND RNA
  • a solution containing a mixture of DNA and RNA, respectively 1.10 5 UG (genome units) of Legionella pneumophila and 1.10 6 UG phage model MS2 is brought into the presence of 100 ⁇ of a solution of linear polylysine (PLL) to 10 mg / mL.
  • PLL linear polylysine
  • the placing in contact of the PLL and the nucleic acids is achieved by the homogenization of the solution (three successive manual reversals of the microtube).
  • the polyplexes are then retained batchwise on a cation exchange resin (80 mg to 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After centrifugation, the supernatant is removed.
  • TE 10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA
  • the tubes are then shaken (1800 rpm) at 75 ° C for 10 minutes using a thermomixer.
  • the tubes are centrifuged at 5,000 g for 5 seconds to collect the supernatant. 5 ⁇ l of this eluate are used to titrate the elution of DNA by qPCR (Quanta Perfecta tough mix) with primers RI 5'-CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG-3 '/ FL 5'-CCG ATG CCA CAT CAT TAG C-3 'and the 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1-3 'probe.
  • RNA 5 ⁇ l of this eluate are used to titrate the elution of RNA by qRT-PCR (qScript One step qRT-PCR, Quanta SYBR Green) with the primers Fl 5'-TCG ATG GTC CAT ACC TTA GAT GC-3 '/ RL 5'-CCG ACCTA TTA GCG AAG TTG CT-3 '.
  • qRT-PCR qScript One step qRT-PCR, Quanta SYBR Green
  • EXAMPLE 14 EXTRACTION FROM DIFFERENT TYPES OF SAMPLES OR MATRICES
  • the different food matrices were doped with a suspension of 1000 Genome Units of Legionella pneumophila. After concentration of the sample volume (filtration or centrifugation, see table), thermal lysis was performed. The lysate is brought into contact with 100 ⁇ l of a linear polylysine solution (PLL) at 10 mg / ml. The rest of the process is identical to the protocol of Example 13.
  • PLL linear polylysine solution
  • 5 ⁇ l of the eluate are used to titrate the elution of DNA by qPCR (Quanta Perfecta tough mix) with primers RI 5'-CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG-3 '/ FL 5'-CCG ATG CCA CAT CAT TAG C-3 'and the 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3 'probe.
  • a synthetic "inhibition control" DNA is added in each qPCR reaction to control the rise of the inhibition. It is amplified with the same pair of primers as the Fl and RI target and is detected by a specific probe (5'-HEX-GGA GTT AGC CAG ATT TGG AG-BHQ1-3 ').
  • PLL linear polylysine solution
  • 5 ⁇ l of the eluate are used to titrate DNA elution by qPCR (Quanta Perfecta tough mix) with primers RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG-3 '/ FL 5'-CCG ATG CCA CAT CAT TAG C-3' and probe 5 '-FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG- BHQ1- 3 '.
  • the internal inhibition control makes it possible to control the lifting of the inhibition.
  • the nucleic acid is amplified with the same pair of primers as the target F1 and R1 and is detected by a specific probe (5 '- H EX-GGA GTT CAG AGC ATT TGG AG-BHQ1-3').
  • a genomic DNA solution of Legionella pneumophila titrated at 57 258 UG per sample is placed in the presence of 100 ⁇ ⁇ of a linear poly-lysine solution (PLL) at 10 mg / ml in a microtube.
  • PLL linear poly-lysine solution
  • the PLL and the genomic DNA are brought into contact either by manual overthrow of the microtube for 20 seconds or by vortexing at 1500 rpm for 20 seconds.
  • the polypiexis is then retained batchwise on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 m Eq / g) or by successive turns of the bebe during 20s or 10 min or by vortex 1500 rpm for 20s or 10 minutes. After centrifugation, the supernatant is removed.
  • ⁇ ⁇ of a TE solution are added to the resin. Elution of the nucleic acids is performed either by vortexing for 20s at 75 ° C at 2500 rpm or by vortexing for 10 minutes at 75 ° C at 2500 rpm.
  • the tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to remove the supernatant. 2 ⁇ l of the supernatant are used to titrate elution by q PCR (Perfecta qPCR ToughMix Quanta) with primers (RI 5'- CCA ATT GAG CGC TCA TCA TAG - 3 '/ FL 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C -3') and probe 5 '-FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3 'chosen according to NF T 90-431 standard.
  • q PCR Perfecta qPCR ToughMix Quanta
  • the process according to the invention is carried out in the experiments 2, 4, 6, 8, 10 and 14, in which the fixing step b) is carried out either by reversals of the tube for 20 seconds or by vortexing for 20 seconds. s, while the elution is carried out by applying a vortex stirring force for 10 minutes.
  • the purification yields obtained show the efficiency of a process according to the invention.

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Abstract

A method for purifying and concentrating at least one nucleic acid fragment having a size greater than 20 nucleotides, or 20 bases, for a single-stranded nucleic acid fragment, and greater than 20 base pairs (bp) for a double-stranded nucleic acid fragment, by formation of a complex between a nucleic acid and a polycationic polymer in a homogeneous phase, binding of the complex to a cation-exchange resin and elution by mechanical agitation.

Description

Procédé de purification et de concentration d'acides nucléiques  Process for purification and concentration of nucleic acids
La présente invention concerne un procédé pour purifier et concentrer des acides nucléiques susceptibles d'être présents dans un échantillon et des matériaux pour la mise en œuvre d'un tel procédé. L'invention comprend également des kits de diagnostic permettant de mettre en œuvre un tel procédé. The present invention relates to a method for purifying and concentrating nucleic acids that may be present in a sample and materials for carrying out such a method. The invention also includes diagnostic kits for implementing such a method.
Le risque bactérien d'origine hydrique a été historiquement le plus grave et le plus fréquent. En Europe, au 19ème siècle, plusieurs épidémies mortelles ont été transmises par l'eau (typhoïde, choléra). L'eau est un milieu favorable au développement des bactéries et des parasites. Les déjections animales ou les rejets des matières fécales d'origine humaine ont été les principales sources de contamination bactérienne de l'eau. Ce risque a été considérablement réduit par la mise en place de procédés de désinfection des eaux et des installations de traitement des eaux usées, mais il n'a pas disparu. L'eau reste aujourd'hui à l'origine de la mort de 3 à 10 millions de personnes par an dans le monde, contaminées par des bactéries. Le contrôle de la qualité microbiologique de l'eau repose sur la recherche d'indicateurs de contamination fécale, qui est la contamination bactérienne la plus répandue. Elle peut être aisément suivie par la présence d'une bactérie témoin : Escherichia coli ou E. coli, germe habituel de la flore intestinale des animaux et des hommes, qui se retrouve dans les matières fécales. La présence d'E. coli dans l'eau révèle une contamination fécale. The bacterial risk of waterborne origin has historically been the most serious and the most frequent. In Europe, in the 19th century, several deadly epidemics were transmitted by water (typhoid, cholera). Water is a favorable environment for the development of bacteria and parasites. Animal waste or human faeces was the main source of bacterial contamination of water. This risk has been significantly reduced by the implementation of water disinfection and sewage treatment facilities, but has not disappeared. Today, water still causes the death of 3 to 10 million people a year worldwide, contaminated by bacteria. The control of the microbiological quality of water is based on the search for indicators of faecal contamination, which is the most widespread bacterial contamination. It can easily be followed by the presence of a control bacterium: Escherichia coli or E. coli, the usual germ of the intestinal flora of animals and humans, found in faeces. The presence of. coli in the water reveals faecal contamination.
Les contaminations de ce type se traduisent par des diarrhées, ou des gastro-entérites (diarrhées + vomissements + fièvre) plus ou moins graves, mais susceptibles d'engager le pronostic vital pour les personnes les plus fragiles. Contamination of this type results in diarrhea, or gastroenteritis (diarrhea + vomiting + fever) more or less serious, but potentially life-threatening for the most fragile people.
Selon une estimation de l'Institut de veille sanitaire, des eaux non conformes à la réglementation pourraient être la cause de 10 à 30 % du total de gastro-entérites aiguës observées dans les secteurs desservis par ces eaux.  According to an estimate of the Institut de veille sanitaire, non-compliant waters could be the cause of 10 to 30% of the total acute gastroenteritis observed in the areas served by these waters.
Le cas le plus fréquent de contamination est celui d'une mise en contact accidentelle d'eaux usées et de l'eau destinée à la distribution. Une autre situation classique consiste à relier, par erreur, les installations de distribution d'eau et les installations de traitement d'eaux usées ou les réseaux d'eau non potables. Une autre situation à risque est liée aux remises en service de canalisations, après arrêt de plusieurs semaines, les eaux stagnantes constituant un milieu favorable au développement de films bactériens propices aux contaminations. The most frequent case of contamination is that of accidental contacting of wastewater with water intended for distribution. Another classic situation is to mistakenly connect the water supply facilities with the facilities. wastewater treatment or non-potable water systems. Another risk situation is related to the re-commissioning of pipelines, after stopping for several weeks, stagnant water constituting a favorable environment for the development of bacterial films conducive to contamination.
Parmi les critères de qualité de l'eau distribuée, le paramètre bactériologique mérite la plus grande vigilance car il reflète le risque immédiat pour la santé du consommateur. La réglementation impose la recherche d'indicateurs de contamination et les contrôles sont réalisés par les DDASS ou les ARS. Among the criteria of quality of the water distributed, the bacteriological parameter deserves the greatest vigilance because it reflects the immediate risk for the health of the consumer. The regulation imposes the search for indicators of contamination and the controls are carried out by the DDASS or the ARS.
L'identification de bactéries dans l'environnement est indispensable pour la santé publique. Par exemple, parmi les autres bactéries responsables de nombreuses pathologies, on trouve les bactéries de genre Legionella, qui peuvent être trouvées dans des sites hydriques naturels et artificiels et plus particulièrement dans les réseaux d'eau chaude sanitaire, responsables notamment de la légionellose et de la fièvre de Pontiac. Il existe plusieurs espèces de Legionella, mais l'espèce L. pneumophila semble avoir une virulence plus importante que les autres espèces puisqu'elle est en cause dans plus de 90% des cas de légionellose. Elle est à l'origine de pneumonies sévères entraînant une insuffisance respiratoire et/ou un état de choc et une insuffisance polyviscérale pouvant entraîner le décès. L'infection est due à l'inhalation de microgouttelettes contenant la bactérie. The identification of bacteria in the environment is essential for public health. For example, among the other bacteria responsible for many pathologies, we find the Legionella-type bacteria, which can be found in natural and artificial water sites and more particularly in hot water networks, particularly responsible for Legionella and Pontiac fever. There are several species of Legionella, but the species L. pneumophila seems to have a greater virulence than the other species since it is involved in more than 90% of cases Legionella. It causes severe pneumonia resulting in respiratory failure and / or shock and polyvisceral insufficiency that may result in death. The infection is due to the inhalation of microdroplets containing the bacteria.
En outre la présence de Legionella pneumophila dans un réseau d'eau peut avoir des conséquences importantes pour l'exploitation allant jusqu'à l'arrêt du circuit en passant par des opérations longues et coûteuses de nettoyage et désinfection pour la remise en état des circuits. On peut également citer à titre d'exemples des bactéries que l'on trouve dans l'eau destinée à la consommation humaine et qui sont responsables de problèmes sanitaires, Cryptosporidium sp., les cyanobactéries et de leurs toxines, Pseudomonas aeruginosa et Bacillus sp. In addition, the presence of Legionella pneumophila in a water system can have important consequences for the operation up to the shutdown of the circuit through long and expensive operations of cleaning and disinfection for the restoration of circuits . Examples of bacteria found in water intended for human consumption and which are responsible for health problems, Cryptosporidium sp., Cyanobacteria and their toxins, Pseudomonas aeruginosa and Bacillus sp.
L'identification de bactéries dans l'environnement est donc indispensable pour la santé publique.  The identification of bacteria in the environment is therefore essential for public health.
La détection de la présence de molécules d'acide nucléique est également applicable dans le domaine médical, par exemple pour détecter dans un échantillon biologique recueilli d'un sujet, la présence d'acide nucléique circulant, notamment d'ADN circulant, ou pour détecter une éventuelle contamination par un micro-organisme. La détection de la présence de molécules d'acide nucléique dans un échantillon est également importante dans le domaine de l'industrie agroalimentaire, pour détecter une éventuelle contamination par un micro-organisme dans un produit intermédiaire ou final de l'industrie agroalimentaire, ou pour détecter une éventuelle contamination par un micro-organisme dans un dispositif utilisé pour la production agroalimentaire. The detection of the presence of nucleic acid molecules is also applicable in the medical field, for example to detect in a biological sample collected from a subject, the presence of circulating nucleic acid, in particular circulating DNA, or to detect possible contamination by a microorganism. The detection of the presence of nucleic acid molecules in a sample is also important in the field of the food industry, for detecting any contamination by a microorganism in an intermediate or final product of the food industry, or for detect any contamination by a microorganism in a device used for food production.
Pour évaluer la présence et le nombre de cellules bactériennes telles que les légionnelles plusieurs approches sont possibles. To assess the presence and number of bacterial cells such as Legionella several approaches are possible.
Une première approche, sur laquelle s'appuie par exemple la méthode normalisée AFNOR T 90-431 (dernière révision de novembre 2014), repose sur la mise en culture des germes et le dénombrement des unités formant colonie. Toutefois, cette méthode basée sur la culture des germes nécessite plusieurs jours pour établir un diagnostic. Une deuxième approche consiste à marquer la bactérie notamment L. pneumophila ou E. coli par un anticorps fluorescent spécifique et à quantifier la bactérie par cytométrie (Philippe Lebaron; Applied And Environnemental Microbiology (2004), p 1651-1657 ;  A first approach, based on, for example, the AFNOR T 90-431 standardized method (last revision of November 2014), is based on the culture of germs and the enumeration of colony forming units. However, this method based on germ culture requires several days to establish a diagnosis. A second approach consists in labeling the bacterium, in particular L. pneumophila or E. coli, with a specific fluorescent antibody and quantifying the bacterium by cytometry (Philippe Lebaron, Applied And Environmental Microbiology (2004), p 1651-1657;
Paul E. Johnson et al. International Society for Analytical Cytology Cytometry Part A 69A: 1212-1221 (2007)). Cette méthode présente l'avantage de permettre de dénombrer les bactéries en quelques heures et d'apprécier la viabilité des cellules dénombrées mais elle présente de nombreux inconvénients notamment le risque plus ou moins élevé de réactions croisées avec d'autres cellules bactériennes et l'absence de normalisation.  Paul E. Johnson et al. International Society for Analytical Cytology Cytometry Part A 69A: 1212-1221 (2007)). This method has the advantage of making it possible to count the bacteria in a few hours and to assess the viability of the cells counted, but it has many disadvantages, in particular the higher or lower risk of cross-reactions with other bacterial cells and the absence of standardization.
Enfin une troisième approche permet des réponses plus spécifiques. L'utilisation de sondes nucléiques marquées permet une détection très spécifique après hybridation avec leurs cibles. L'inconvénient réside dans le faible nombre de cibles par cellules qui rend cette technique peu sensible et mal adaptée à la détection de microorganismes peu concentrés. Depuis quelques années, cet inconvénient a été surmonté par l'utilisation des techniques d'amplification génique en temps réel, par exemple par réaction en chaîne par polymérisation (PCR) ou par amplification d'acides nucléiques par séquence (NASBA, nucleic acid sequence-based amplification) [Stolhaug A. & Bergh K. (2006) ; Appl. Environ. Microbiol., Vol. 72(9) ; 6394-6398]. Toutefois la plupart des techniques nécessitent d'abord une préparation de l'échantillon lourde par filtration, centrifugation ou par précipitation . Or, les filtres ou culots générés sont respectivement souvent saturés ou compacts et contiennent de nombreuses molécules et particules qui interfèrent fortement avec les procédés biologiques d'analyses notamment les amplifications géniques. Il est donc souvent nécessaire de diluer très fortement les échantillons pour éviter les inhibitions des réactions d'amplification, et éviter des faux résultats négatifs. Finally a third approach allows more specific answers. The use of labeled nucleic probes allows a very specific detection after hybridization with their targets. The disadvantage lies in the low number of targets per cell which makes this technique insensitive and poorly adapted to the detection of low-concentrated microorganisms. In recent years, this disadvantage has been overcome by the use of gene amplification techniques in real time, for example by polymerase chain reaction (PCR) or nucleic acid amplification by sequence (NASBA, nucleic acid sequence). based amplification) [Stolhaug A. & Bergh K. (2006); Appl. About. Microbiol., Vol. 72 (9); 6394-6398]. However, most techniques require first of all a preparation of the heavy sample by filtration, centrifugation or precipitation. However, the filters or pellets generated are respectively often saturated or compact and contain numerous molecules and particles that strongly interfere with the biological methods of analysis including gene amplifications. It is therefore often necessary to dilute the samples very strongly to avoid inhibitions of the amplification reactions, and avoid false negative results.
Dans les trois méthodes, le seuil de sensibilité de la détection des cellules bactériennes dans les eaux n'est pas inférieur à quelques dizaines de cellules par litre. Or, dans le cas des pathogènes susceptibles de coloniser les circuits d'eaux, les eaux industrielles ou environnementales ou l'air ceux-ci sont présents à de très faibles concentrations. Il est donc important de disposer d'un test à la fois sensible et rapide permettant de détecter des contaminations, notamment bactériennes, à de faibles concentrations. In all three methods, the sensitivity threshold of the detection of bacterial cells in water is not less than a few tens of cells per liter. However, in the case of pathogens likely to colonize water circuits, industrial or environmental water or air they are present at very low concentrations. It is therefore important to have a test that is both sensitive and rapid to detect contaminations, especially bacterial contamination at low concentrations.
Des dispositifs miniaturisés de détection de microorganismes ont été mis au point. Liu et al. décrit une biopuce pour la détection de bactéries au sein de laquelle sont effectuées les étapes suivantes : la capture immunomagnétique des bactéries cibles ; la pré-concentration des bactéries et leur purification ; la lyse des bactéries ; l'amplification par PCR des acides nucléiques obtenus et la détection basée sur des puces à ADN électrochimiques [Liu et al. Anal . Chem. (2004) 76, 1824-1831] . De par la capture immunomagnétique des bactéries cibles, ce dispositif ne permet qu'une détection spécifique, visant une bactérie particulière.  Miniaturized microorganism detection devices have been developed. Liu et al. discloses a biochip for the detection of bacteria in which the following steps are performed: immunomagnetic capture of the target bacteria; pre-concentration of bacteria and their purification; lysis of bacteria; PCR amplification of nucleic acids obtained and detection based on electrochemical DNA chips [Liu et al. Anal. Chem. (2004) 76, 1824-1831]. By immunomagnetic capture of the target bacteria, this device allows only a specific detection, targeting a particular bacterium.
La demande internationale WO2008/097342 décrit un procédé de liaison et d'isolement d'une molécule biologique, notamment d'un acide nucléique, comprenant la mise en contact d'un mélange susceptible de contenir ladite molécule avec un milieu de séparation ayant un polyion, notamment un polycation, lié de manière non covalente à sa surface, lequel polyion est destiné se lier à ladite molécule biologique. Le procédé nécessite une première solution de lavage pour éliminer les impuretés du milieu de séparation, une seconde solution de lavage pour éliminer le polyion et une solution d'élution pour éluer la molécule biologique.  International Application WO2008 / 097342 describes a method for binding and isolating a biological molecule, in particular a nucleic acid, comprising contacting a mixture capable of containing said molecule with a separation medium having a polyion , especially a polycation, non-covalently bound to its surface, which polyion is intended to bind to said biological molecule. The method requires a first wash solution to remove impurities from the separation medium, a second wash solution to remove the polyion, and an elution solution to elute the biological molecule.
La demande de brevet européen EP2757156 enseigne une méthode pour purifier les acides nucléiques comprenant une étape d'adsorption de l'échantillon contenant ledit acide nucléique sur une résine échangeuse d'ions comprenant une résine positive et une résine négative. European Patent Application EP2757156 teaches a method for purifying nucleic acids comprising a step of adsorbing the sample containing said nucleic acid on an ion exchange resin comprising a positive resin and a negative resin.
La demande internationale WO 2013/181651 divulgue un procédé de purification d'acides nucléiques utilisant un tampon de liaison et comprenant une étape de fixation sur un support solide, tel qu'une membrane de silice. Ce procédé de purification est utilisé dans les protocoles de séquençage dans le but de distinguer des fragments d'oligonucléotides de taille différente. D'après ce document, la liaison des fragments d'ADN dépendrait de leur taille et du pH des tampons de liaison .  International application WO 2013/181651 discloses a method for purifying nucleic acids using a binding buffer and comprising a step of attachment to a solid support, such as a silica membrane. This purification method is used in sequencing protocols for the purpose of distinguishing oligonucleotide fragments of different size. According to this document, the binding of the DNA fragments would depend on their size and the pH of the binding buffers.
La publication de Lilia Clima et al (« Expérimental design, modeling and optimisation of polyplex formation between DNA oligonucleotides », Organic and Biomolecular chemistry, vol.13, N°36, pp 9445-56, 2015) décrit l'optimisation de la liaison de fragments double brin d'oligonucléotides avec la polyéthylèneimine (PEI) pour une utilisation de thérapie génique. The publication of Lilia Clima et al ("Experimental design, modeling and optimization of polyplex formation between DNA oligonucleotides", Organic and Biomolecular Chemistry, vol.13, No. 36, pp 9445-56, 2015) describes the optimization of the link Double-stranded fragments of oligonucleotides with polyethyleneimine (PEI) for use in gene therapy.
La demande internationale WO 95/14087 décrit une méthode de détection d'oligonucléotides présents dans un fluide biologique comprenant notamment la désorption des oligonucléotides de la résine avec un tampon ayant une concentration moolaire comprise entre 1 et 2,5 M et un pH compris entre 6,5 et 7,5 et à une température comprise entre 40 et 65°C.  The international application WO 95/14087 describes a method for detecting oligonucleotides present in a biological fluid, in particular comprising the desorption of the oligonucleotides from the resin with a buffer having a molar concentration of between 1 and 2.5 M and a pH of between 6. , 5 and 7.5 and at a temperature between 40 and 65 ° C.
La demande internationale WO 2006/081957 décrit également l'utilisation de polyions et de polymères chargés pour la purification d'acides nucléiques à partir de lysats cellulaires et en présence de tensioactifs.  International Application WO 2006/081957 also describes the use of polyions and charged polymers for the purification of nucleic acids from cell lysates and in the presence of surfactants.
Il a été également montré que certains polymères échangeurs d'ions, comme la polyéthylèneimine (PEI), permettent la capture de molécules chimiques (Ziebarth J. et Wang Y., Biophys J. 2009;97(7) : 1971-83).  It has also been shown that certain ion exchange polymers, such as polyethyleneimine (PEI), allow the capture of chemical molecules (Ziebarth J. and Wang Y., Biophys J. 2009; 97 (7): 1971-83).
Toutefois, le besoin persiste de disposer d'un procédé qui présente les avantages suivants :  However, the need persists to have a method that has the following advantages:
être techniquement simple et rapidement réalisable,  be technically simple and quickly achievable,
avoir une forte capacité de purification et de concentration pour permettre l'analyse de tout échantillon et permettre la détection de traces d'acides nucléiques qui proviennent notamment d'ADN génomique ou d'ARN humain, bactérien ou viral, - avoir un fort rendement de récupération,  have a strong ability of purification and concentration to allow the analysis of any sample and allow the detection of traces of nucleic acids which originate in particular from genomic DNA or human RNA, bacterial or viral, - have a high yield of recovery,
- permettre une élimination des contaminants et inhibiteurs de PCR qui peuvent être présent dans l'eau analysée, - avoir un faible coût, - allow elimination of the contaminants and PCR inhibitors that may be present in the analyzed water, - have a low cost,
- être automatisable,  - be automatable,
- ne pas mettre en œuvre de composés chimiques dangereux pour l'environnement et la santé humaine.  - not to use chemicals that are dangerous for the environment and human health.
Au cours de leurs travaux, les inventeurs ont mis au point un procédé de capture de fragments d'acides nucléiques à partir d'un échantillon à analyser, qui permet de satisfaire toutes ces exigences en un minimum d'étapes mettant en œuvre des techniques facilement automatisables. During their work, the inventors have developed a method of capturing nucleic acid fragments from a sample to be analyzed, which makes it possible to satisfy all these requirements in a minimum of steps implementing techniques easily. automatable.
Au sens de la présente invention, les termes «capture» et «complexation» sont équivalents. En effet, conformément à l'invention, les fragments d'acides nucléiques (AN) contenus dans l'échantillon à analyser sont capturés ou complexés par fixation sur des polycations formant un complexe AN-polycations stable dans l'eau. For the purposes of the present invention, the terms "capture" and "complexation" are equivalent. Indeed, according to the invention, the nucleic acid fragments (AN) contained in the sample to be analyzed are captured or complexed by attachment to polycations forming a complex AN-polycations stable in water.
Selon un premier aspect, l'invention concerne un procédé pour fixer et purifier des fragments d'ADN simple brin ou double brin. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape de récupération des fragments d'ADN élués. Les fragments d'ADN élués sont identifiés et/ou quantifiés par toute technique connue de l'homme du métier, telle que, de façon non limitative : la réaction en chaîne par polymérisation (PCR), l'amplification en chaîne par polymérisation quantitative en temps réel (qPCR), le transfert d'ADN (southern blotting), le séquençage, le pyroséquençage, les analyses de polymorphisme d'un seul nucléotide (SNP, single- nucleotide polymorphism), les empreintes génétiques (fingerprinting) et les digestions avec des enzymes de restriction . According to a first aspect, the invention relates to a method for fixing and purifying single-stranded or double-stranded DNA fragments. In a preferred embodiment, the method further comprises a step of recovering the eluted DNA fragments. The eluted DNA fragments are identified and / or quantified by any technique known to those skilled in the art, such as, in a nonlimiting manner: the polymerase chain reaction (PCR), the chain amplification by quantitative polymerization in vitro. real-time (qPCR), Southern blotting, sequencing, pyrosequencing, single nucleotide polymorphism (SNP), fingerprinting, and digestion with restriction enzymes.
Selon un second aspect, l'invention concerne un procédé pour capturer et purifier des fragments d'ARN à partir d'un échantillon. Dans un mode de réalisation préféré, le procédé comprend en outre une étape de récupération des fragments d'ARN élués. In a second aspect, the invention relates to a method for capturing and purifying RNA fragments from a sample. In a preferred embodiment, the method further comprises a step of recovering the eluted RNA fragments.
Les fragments d'ARN élués sont utilisables pour des applications prévues en aval telles que, de façon non limitative : de la transcription inverse, de la RT-PCR, du séquençage, du transfert d'ARN (northern blotting) . The eluted RNA fragments can be used for downstream applications such as, but not limited to: reverse transcription, RT-PCR, sequencing, RNA transfer (northern blotting).
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation du procédé de l'invention pour la détection de bactéries, de virus, de parasites et d'acides nucléiques eucaryotes.In another aspect, the invention relates to the use of the method of the invention for the detection of eukaryotic bacteria, viruses, parasites and nucleic acids.
Selon encore un dernier aspect, l'invention concerne un kit pour purifier et concentrer au moins un fragment d'acides nucléiques à partir d'un échantillon susceptible d'en contenir en utilisant le procédé selon l'invention . According to yet another aspect, the invention relates to a kit for purifying and concentrating at least one nucleic acid fragment from a sample that may contain it using the method according to the invention.
Description détaillée detailed description
La présente invention porte sur un procédé pour purifier et concentrer au moins un fragment d'acides nucléiques, d'une taille supérieure à 20 nucléotides (ou 20 bases) pour un fragment d'acides nucléiques simple brin, et supérieure à 20 paires de bases (pb) pour un fragment d'acides nucléiques double brin, susceptible d'être présent dans un échantillon, le procédé comprenant les étapes suivantes : The present invention relates to a method for purifying and concentrating at least one nucleic acid fragment, of a size greater than 20 nucleotides (or 20 bases) for a single-stranded nucleic acid fragment, and greater than 20 base pairs (bp) for a double-stranded nucleic acid fragment likely to be present in a sample, the method comprising the following steps:
a) mise en contact d'au moins un desdits fragments d'acides nucléiques avec une solution d'un polymère polycationique en vue de former un complexe entre ledit au moins un fragment d'acides nucléiques et le polymère polycationique, a) contacting at least one of said nucleic acid fragments with a solution of a polycationic polymer to form a complex between said at least one nucleic acid fragment and the polycationic polymer,
b) fixation du complexe obtenu à l'étape a) sur une résine échangeuse de cations et b) fixing the complex obtained in step a) on a cation exchange resin and
c) élution dudit au moins un fragment d'acides nucléiques de la résine échangeuse de cations par application d'une force d'agitation, c) eluting said at least one nucleic acid fragment of the cation exchange resin by applying a stirring force,
ledit procédé étant caractérisé en ce que les étapes a) à c) du procédé sont réalisées à un pH compris entre environ 6,0 et 10,0, avantageusement entre environ 7,5 et 9,5, et de manière particulièrement avantageuse entre environ 8 et 9, le pH de chacune de ces étapes pouvant être identique ou différent l'un de l'autre. Ainsi selon l'invention, les étapes a) à c) peuvent soit, être réalisées toutes les 3 au même pH, soit deux des étapes être réalisées au même pH et la troisième à un pH différent, soit chaque étape être mise en œuvre à un pH différent. said method being characterized in that steps a) to c) of the process are carried out at a pH of between about 6.0 and 10.0, preferably between about 7.5 and 9.5, and particularly preferably between about 8 and 9, the pH of each of these steps being identical or different from each other. Thus according to the invention, the steps a) to c) can either be carried out every 3 at the same pH, or two of the steps be carried out at the same pH and the third at a different pH, or each step be carried out at a different pH.
L'étape b) du procédé est réalisée par la mise en contact du complexe obtenu lors de l'étape a) et de la résine échangeuse de cations, et homogénéisation de la solution ainsi obtenue par l'application d'une force d'agitation limitée. Par « force d'agitation limitée » on entend une force mécanique d'agitation dont l'intensité et/ou la durée est limitée, et notamment : Step b) of the process is carried out by contacting the complex obtained during step a) and the cation exchange resin, and homogenizing the solution thus obtained by applying a stirring force. limited. By "limited stirring force" is meant a mechanical stirring force whose intensity and / or duration is limited, and in particular:
· une agitation lente ou douce, c'est à dire une homogénéisation de la solution, notamment par retournements successifs du tube ou du microtube contenant ladite solution, et particulièrement par retournements manuels, l'intensité de l'agitation étant limitée. Ladite agitation lente ou douce est appliquée pendant une durée de préférence inférieure ou égale à 15 minutes, inférieure ou égale à 10 minutes, inférieure ou égale à 5 minutes, inférieure ou égale à 2 minutes, inférieure ou égale à 1 minute, inférieure ou égale à 30 secondes ou égale à 20 secondes, ou A slow or gentle agitation, ie a homogenization of the solution, in particular by successive reversals of the tube or microtube containing said solution, and particularly by manual reversals, the intensity of the agitation being limited. Said slow or gentle agitation is applied for a duration of preferably less than or equal to 15 minutes, less than or equal to 10 minutes, less than or equal to 5 minutes, less than or equal to 2 minutes, less than or equal to 1 minute, less than or equal to at 30 seconds or equal to 20 seconds, or
• une agitation de courte durée, l'expression « agitation de courte durée» désignant une agitation d'une durée inférieure ou égale à 120 secondes, inférieure ou égale à 60 secondes, inférieure ou égale à 30 secondes, ou égale à 10 secondes. Ladite agitation de courte durée peut être mise en œuvre par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment par un agitateur orbital de type vortex.  Short-time stirring, the expression "short-time stirring" designating a stirring lasting less than or equal to 120 seconds, less than or equal to 60 seconds, less than or equal to 30 seconds, or equal to 10 seconds. Said short-time stirring can be implemented by any means known to those skilled in the art, in particular by a vortex-type orbital stirrer.
Selon l'invention on entend par fragment d'acides nucléiques un fragment d'ADN simple brin, un fragment d'ADN double brin, de l'ADN génomique ou de l'ARN . Selon un mode de réalisation particulier, la taille dudit fragment d'acide nucléique est supérieure ou égale à 200 bases, ou 200 pb ; plus particulièrement la taille dudit fragment d'acide nucléique est supérieure ou égale à 200 bases, ou 200 pb, et inférieure ou égale à 2000 bases, ou 2000 pb. Selon un autre mode de réalisation, ledit fragment d'acides nucléiques est de l'ADN génomique entier ou fragmenté, dont la taille est généralement comprise entre 1000 pb et 4 106 pb. Selon un mode de réalisation particulier, la quantité d'acide nucléique détectable est comprise entre 20 femtogrammes et 500 nanogrammes par échantillon. Selon un mode de réalisation plus particulier, la quantité d'acide nucléique détectable est comprise entre 5 et 100 millions d'Unités Génome de bactéries par échantillon . According to the invention, the term nucleic acid fragment is understood to mean a single-stranded DNA fragment, a double-stranded DNA fragment, genomic DNA or RNA. According to a particular embodiment, the size of said nucleic acid fragment is greater than or equal to 200 bases, or 200 bp; more particularly the size of said nucleic acid fragment is greater than or equal to 200 bases, or 200 bp, and less than or equal to 2000 bases, or 2000 bp. According to another embodiment, said nucleic acid fragment is whole or fragmented genomic DNA, the size of which is generally between 1000 bp and 4 10 6 bp. According to a particular embodiment, the amount of detectable nucleic acid is between 20 femtograms and 500 nanograms per sample. According to a more particular embodiment, the amount of detectable nucleic acid is between 5 and 100 million Genome Units of bacteria per sample.
Conformément à l'invention, on entend par échantillon, par exemple, un prélèvement d'eau industrielle, d'eau environnementale ou d'eau potable, destinée à la consommation humaine ou animale ; on entend également par échantillon un échantillon liquide produit dans l'industrie agro-alimentaire, tel que par exemple une boisson, ou encore un prélèvement d'un liquide biologique dans lequel on souhaite déterminer la présence d'un microorganisme ou détecter la présence d'une séquence spécifique d'ADN ou d'ARN d'eucaryote. Comme liquide biologique, on peut citer un prélèvement de sang, d'urine, de salive ou de plasma. Un échantillon peut également être obtenu par dissolution ou mise en suspension d'un échantillon solide, par exemple un prélèvement tissulaire ou un échantillon de plante . According to the invention, the term sample, for example, a sample of industrial water, environmental water or drinking water, intended for human or animal consumption; a sample is also understood to mean a liquid sample produced in the food industry, such as, for example, a beverage, or a sample of a biological liquid in which it is desired to determine the presence of a microorganism or to detect the presence of a specific sequence of eukaryotic DNA or RNA. As biological fluid, there may be mentioned a blood sample, urine, saliva or plasma. A sample may also be obtained by dissolving or suspending a solid sample, by example a tissue sample or a plant sample.
L'extraction des fragments d'acides nucléiques à partir des échantillons est réalisée par toute technique connue de l'homme du métier permettant de libérer et d'extraire les acides nucléiques contenus dans lesdits échantillons. The extraction of the nucleic acid fragments from the samples is carried out by any technique known to those skilled in the art for releasing and extracting the nucleic acids contained in said samples.
Conformément à la présente invention, le polymère polycationique est utilisé sous forme d'une solution, c'est à dire en phase homogène ; le polymère polycationique peut être sélectionné dans le groupe constitué par la polylysine linéaire, les dendrimères greffés de lysine (DGL), la polyéthylènimine (PEI), la polyamidoamine (PAMAM) (Tang et al., Bioconjug. Chemistry, (1996), 7, 703-714 ; Plank et al ., Hum. Gene Ther. 1999, 10, 319-332), le chitosane, la polyarginine, la polyornithine, le sulfate de protamine et le polybrène. De manière préférée, le polymère polycationique est choisi dans le groupe comprenant la poly-L-lysine (PLL), des dendrimères greffés de lysine (DGL), le polyéthylènimine ( PEI) ou la polyamidoamine (PAMAM) . According to the present invention, the polycationic polymer is used in the form of a solution, that is to say in a homogeneous phase; the polycationic polymer may be selected from the group consisting of linear polylysine, lysine grafted dendrimers (DGL), polyethylenimine (PEI), polyamidoamine (PAMAM) (Tang et al., Bioconjug Chemistry, (1996), 7). , 703-714, Plank et al., Hum Gene Ther., 1999, 10, 319-332), chitosan, polyarginine, polyornithine, protamine sulfate and polybrene. Preferably, the polycationic polymer is chosen from the group comprising poly-L-lysine (PLL), lysine-grafted dendrimers (DGL), polyethylenimine (PEI) or polyamidoamine (PAMAM).
Selon un mode particulier de la présente invention, le polymère polycationique est une polyéthylènimine (PEI). De préférence, la PEI présente un poids moléculaire moyen compris entre 1 et 1000 kDa . De manière encore plus préférée, la PEI utilisée est une PEI de 750 kDa comme par exemple le produit commercialisé sous le nom LU PASO L® P, BASF. According to a particular embodiment of the present invention, the polycationic polymer is a polyethylenimine (PEI). Preferably, the PEI has an average molecular weight of between 1 and 1000 kDa. Even more preferably, the PEI used is a PEI of 750 kDa, for example the product marketed under the name LU PASO L® P, BASF.
Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, le polymère polycationique est une poly-L-lysine (PLL) d'un poids moléculaire moyen se situant entre 1 kDa et 1000 kDa, avantageusement entre 10 et 30 kDa, encore plus avantageusement égal à 20 kDa . De manière particulièrement préférée, la poly-L- lysine est utilisée à une quantité comprise entre 0, 1 et 10 mg, de préférence à une quantité d'environ lmg par échantillon .  According to another particularly advantageous embodiment, the polycationic polymer is a poly-L-lysine (PLL) with an average molecular weight ranging between 1 kDa and 1000 kDa, advantageously between 10 and 30 kDa, even more advantageously equal to 20 kDa. kDa. Particularly preferably, the poly-L-lysine is used in an amount of from 0.1 to 10 mg, preferably at a level of about 1 mg per sample.
Selon un autre mode de réalisation, le polymère polycationique est un dendrimère greffé de polylysine (DGL) . Au sens de la présente invention, on entend par «dendrimères greffés de polylysine» des polymères à base de D- ou de L-lysine tels que ceux décrits dans la demande internationale WO2006/114528. Ces dendrimères sont soit constitués uniquement de lysine, on parle dans ce cas d'homopolylysines, soit constitués de plus de 30% en mole de lysine et contenant également des unités d'autres aminoacides, on parle dans ce cas d'hétéropolylysines. According to another embodiment, the polycationic polymer is a polylysine grafted dendrimer (DGL). For the purposes of the present invention, the term "polylysine grafted dendrimers" means polymers based on D- or L-lysine such as those described in the international application WO2006 / 114528. These dendrimers are either composed solely of lysine, in this case homopolylysines are referred to, consisting of more than 30 mol% of lysine and also containing units of other amino acids, in this case heteropolylysines.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, on utilise des dendrimères greffés de polylysine de générations 1 à 5. Les DGL de générations supérieures à 5 ont tendance à former des agrégats qui rendent difficile leur utilisation . In an advantageous embodiment of the invention, dendrimers are used. polylysine grafts of generations 1 to 5. DGL of generations greater than 5 tend to form aggregates that make their use difficult.
La quantité de polymère polycationique ajoutée est telle que le rapport de charge [+] / [-] (parfois représenté par le rapport N/P en mol/mol) entre le polymère polycationique et l'acide nucléique soit supérieur à 2, avantageusement supérieur à 10. The amount of polycationic polymer added is such that the charge ratio [+] / [-] (sometimes represented by the N / P ratio in mol / mol) between the polycationic polymer and the nucleic acid is greater than 2, advantageously greater than to 10.
L'ensemble de ces polymères est disponible dans le commerce ou peut-être préparé par toute technique connue de l'homme du métier.  All of these polymers are commercially available or may be prepared by any technique known to those skilled in the art.
Le complexe acides nucléiques/polymère polycationique obtenu à l'étape a) est ensuite fixé sur une résine échangeuse de cations. On entend par résines échangeuses de cations des résines cationiques chargées négativement ; on peut citer à titre d'exemple les résines fortes porteuses de groupements issus d'acides forts comme les acides phénylsulfonique et méthylsulfonique et les résines faibles porteuses par exemple de groupements carboxyliques ou carboxyméthyles. Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, la résine échangeuse de cations est une résine cationique échangeuse faible. Les résines échangeuse de cations utilisées dans la présente invention ont de préférence une capacité d'échange d'ions au moins égale à 2 mEq/g, de préférence au moins égale à 10 mEq/g et en particulier comprise entre 10 et 30 mEq/g. La résine est utilisée à une quantité comprise entre 20 et 200 mg, de préférence à une quantité d'environ 80 mg par échantillon.  The nucleic acid / polycationic polymer complex obtained in step a) is then fixed on a cation exchange resin. Cation exchange resins are negatively charged cationic resins; mention may be made, for example, of strong resins carrying groups derived from strong acids such as phenylsulphonic and methylsulphonic acids and weak resins bearing, for example, carboxylic or carboxymethyl groups. According to an advantageous embodiment of the invention, the cation exchange resin is a weak cationic exchange resin. The cation exchange resins used in the present invention preferably have an ion exchange capacity of at least 2 mEq / g, preferably at least 10 mEq / g and in particular between 10 and 30 mEq / boy Wut. The resin is used in an amount of from 20 to 200 mg, preferably at a level of about 80 mg per sample.
Toutes résines connues de l'homme du métier et présentant ces caractéristiques peuvent être utilisées. On peut citer à titre d'exemples de résines échangeuses de cations faibles, les copolymères d'acide méthacrylique et de divinylbenzène, commercialisées par exemple sous la dénomination AMBERLITE IRP88 de la société Rohm et Haas, sous la dénomination Indion 234 de Indion Resins et sous la dénomination Oasis WCX de la société Waters.  Any resins known to those skilled in the art and having these characteristics can be used. Examples of weak cation exchange resins include the copolymers of methacrylic acid and divinylbenzene, sold for example under the name AMBERLITE IRP88 from Rohm and Haas, under the name Indion 234 from Indion Resins, and the Oasis WCX denomination of the company Waters.
Conformément à l'invention, la fixation du complexe acide nucléique/polymère polycationique sur la résine échangeuse de cations se fait par simple mise en contact de ces deux composants dans un milieu aqueux. De préférence, ladite fixation se fait par l'application d'une force d'agitation limitée, soit par une agitation lente ou douce, pendant une durée de préférence inférieure ou égale à 15 minutes, inférieure ou égale à 10 minutes, inférieure ou égale à 5 minutes, inférieure ou égale à 2 minutes, inférieure ou égale à 1 minute, inférieure ou égale à 30 secondes ou égale à 20 secondes, soit par une agitation d'une durée inférieure ou égale à 120 secondes, inférieure ou égale à 60 secondes, inférieure ou égale à 30 secondes, ou égale à 10 secondes, par tout moyen connu, notamment par un agitateur orbital de type vortex. De préférence, le complexe acide nucléique/polymère polycationique est retenu sur la résine échangeuse de cations mise en suspension par des retournements successifs du tube contenant la dite résine (procédé en batch) ou par percolation sur une cartouche ou colonne de chromatographie contenant ladite résine. De manière avantageuse, dans le procédé en batch, on procède à 3 à 5 retournements manuels des tubes. According to the invention, the fixing of the nucleic acid / polycationic polymer complex on the cation exchange resin is done by simply bringing these two components into contact in an aqueous medium. Preferably, said attachment is effected by the application of a limited stirring force, either by slow or gentle stirring, for a period of preferably less than or equal to 15 minutes, less than or equal to 10 minutes, less than or equal to at 5 minutes, less than or equal to 2 minutes, less than or equal to 1 minute, less than or equal to 30 seconds or equal to 20 seconds, or agitation lasting less than or equal to 120 seconds, less than or equal to 60 seconds, less than or equal to 30 seconds, or equal to at 10 seconds, by any known means, in particular by a vortex-type orbital stirrer. Preferably, the nucleic acid / polycationic polymer complex is retained on the cation exchange resin suspended by successive reversals of the tube containing said resin (batch process) or by percolation on a cartridge or chromatography column containing said resin. Advantageously, in the batch process, there are 3 to 5 manual reversals of the tubes.
Conformément à l'invention, l'étape d'élution est effectuée par application d'une force d'agitation énergique à une température élevée. Selon l'invention, la force d'agitation est une agitation mécanique choisie parmi : une agitation par agitateur orbital, notamment de type vortex, par agitateur linéaire, par thermomixer (ou vortex chauffant), par ultrasons ou par micro-ondes. De manière avantageuse, l'agitation mécanique est réalisée à l'aide d'un agitateur vortex à une vitesse d'agitation supérieure à 1000 tours par minute, avantageusement supérieure à 1500 tours par minute et de manière particulièrement avantageuse à une vitesse de 2500 tours par minute. De manière particulièrement avantageuse, l'agitation mécanique est réalisée à l'aide d'un vortex chauffant, ou thermomixer, permettant ainsi d'appliquer une agitation mécanique à une température contrôlée.  According to the invention, the elution step is carried out by applying a vigorous stirring force at an elevated temperature. According to the invention, the stirring force is a mechanical stirring chosen from: stirring by orbital stirrer, in particular of the vortex type, by linear stirrer, by thermomixer (or heating vortex), by ultrasound or by microwaves. Advantageously, the mechanical stirring is carried out using a vortex stirrer at a stirring speed greater than 1000 rpm, advantageously greater than 1500 rpm and particularly advantageously at a speed of 2500 rpm. per minute. Particularly advantageously, the mechanical agitation is carried out using a heating vortex, or thermomixer, thus allowing mechanical agitation to be applied at a controlled temperature.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'élution du au moins un fragment d'acides nucléiques est réalisée par exposition à un champ d'ultrasons en utilisant un bain à ultrasons. Les échantillons contenant le complexe polycations/acides nucléiques fixé sur le support solide sont soumis à un champ ultrasonore, en général constant, pendant une durée d'environ 1 minute. Les molécules présentes dans les échantillons sont alors soumises à une forte agitation entraînant le décrochage des acides nucléiques du support solide et la mise en solution de ces derniers dans le tampon (ce décrochage constitue l'étape d'élution des acides nucléiques).  According to another embodiment of the invention, the elution of the at least one nucleic acid fragment is performed by exposure to an ultrasound field using an ultrasonic bath. The samples containing the complex polycations / nucleic acids fixed on the solid support are subjected to an ultrasound field, generally constant, for a duration of about 1 minute. The molecules present in the samples are then subjected to vigorous stirring, causing the nucleic acids of the solid support to drop out and to put them in solution in the buffer (this stall constitutes the nucleic acid elution step).
Selon encore un autre mode de réalisation de l'invention, l'élution du au moins un fragment d'acides nucléiques est réalisée par exposition à des micro-ondes d'une fréquence comprise entre 2400 et 2500MHz. Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'étape d'agitation mécanique est réalisée par un agitateur orbital de type Vortex couplée à une étape de chauffage. Selon un mode avantageux de l'invention, pour tous les modes d'agitation mécanique utilisées, la température doit être portée à entre environ 30°C et 100°C, avantageusement à une température comprise entre environ 60°C et 80°C et de manière particulièrement avantageuse à une température d'environ 75°C. According to yet another embodiment of the invention, the elution of the at least one nucleic acid fragment is carried out by exposure to microwaves with a frequency of between 2400 and 2500 MHz. According to an advantageous embodiment of the invention, the mechanical stirring step is performed by a Vortex-type orbital stirrer coupled to a heating step. According to an advantageous embodiment of the invention, for all the mechanical stirring modes used, the temperature must be raised to between about 30 ° C. and 100 ° C., advantageously at a temperature of between about 60 ° C. and 80 ° C. and particularly advantageously at a temperature of about 75 ° C.
Dans un mode particulièrement avantageux de l'invention, l'étape d'agitation mécanique est réalisée par un agitateur orbital de type Vortex à une température comprise entre environ 30°C et 100°C, avantageusement à une température comprise entre environ 60°C et 80°C et de manière particulièrement avantageuse à une température d'environ 75°C. In a particularly advantageous embodiment of the invention, the mechanical stirring step is carried out by a Vortex-type orbital stirrer at a temperature of between approximately 30 ° C. and 100 ° C., advantageously at a temperature of between approximately 60 ° C. and 80 ° C and particularly advantageously at a temperature of about 75 ° C.
Conformément à l'invention, tout type de tampon connu de l'homme du métier habituellement utilisé pour l'élution des acides nucléiques peut convenir. On peut citer, à titre d'exemple, un tampon TE (Tris EDTA) (10 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA). Le pH de la solution de tampon TE est compris entre environ 6,0 et 10,0, avantageusement entre environ 7,5 et 9,5 et de manière particulièrement avantageuse entre environ 8,0 et 9,0.  According to the invention, any type of buffer known to those skilled in the art usually used for the elution of nucleic acids may be suitable. By way of example, mention may be made of a TE (Tris EDTA) buffer (10 mM Tris pH 8.5, 1 mM EDTA). The pH of the TE buffer solution is from about 6.0 to 10.0, preferably from about 7.5 to 9.5, and particularly preferably from about 8.0 to 9.0.
L'un des avantages du procédé selon l'invention est qu'il permet un décrochage des acides nucléiques de la phase solide sans récupérer les polymères polycationiques qui restent fixés sur le support solide, permettant ainsi d'obtenir des acides nucléiques purs qui peuvent être directement utilisés pour des analyses par des méthodes de biologie moléculaire. L'élution des fragments d'acides nucléiques ne nécessite aucun changement de tampon et peut être réalisée dans le même tampon et dans les mêmes conditions de pH et de force ionique que les étapes de complexation et de fixation au support solide par simple force d'agitation en quelques minutes. Les différents éléments indésirables peuvent être retenus soit par le polycation, soit par la phase solide ou encore être éliminés lors de la première étape de capture du polyplexe. De ce fait, l'efficacité de nettoyage est plus importante qu'avec les technologies existantes.  One of the advantages of the process according to the invention is that it allows a stall of the nucleic acids of the solid phase without recovering the polycationic polymers which remain fixed on the solid support, thus making it possible to obtain pure nucleic acids which can be directly used for analyzes by molecular biology methods. The elution of the nucleic acid fragments does not require any buffer change and can be carried out in the same buffer and under the same conditions of pH and ionic strength as the complexation and attachment steps to the solid support by simple force. stirring in minutes. The various undesirable elements can be retained either by the polycation or by the solid phase or else be eliminated during the first step of capture of the polyplex. As a result, cleaning efficiency is greater than with existing technologies.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, après l'étape d'élution des fragments d'acides nucléiques, le procédé peut comprendre au moins une des étapes sélectionnées parmi une étape de récupération des fragments d'acides nucléiques et une étape de quantification des fragments d'acides nucléiques. In an advantageous embodiment of the invention, after the step of eluting the nucleic acid fragments, the method may comprise at least one of the steps selected from a step of recovering the nucleic acid fragments and a step of quantifying the nucleic acid fragments.
L'étape de quantification des fragments d'acides nucléiques peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, notamment par réaction en chaîne par polymérisation (PCR ou polymerase chain reaction), par RT-PCR, par pyroséqunçage, par amplification, par transcription (TMA ou Transcription Mediated Amplification), par réaction en chaîne de ligase (LCR ou ligase chain reaction), par amplification d'acides nucléiques isothermique et initiée par des amorceurs chimériques (ICAN ou isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid), par amplification isothermique d'ADN médiée par des boucles (LAMP ou Loop-mediated isothermal amplification of DNA). The quantification step of the nucleic acid fragments can be carried out by any technique known to those skilled in the art, in particular by polymerase chain reaction (PCR), by RT-PCR, by pyrosequencing, by amplification. , by transcription (TMA or transcription mediated amplification), by ligase chain reaction (LCR), by isothermal nucleic acid amplification and initiated by chimeric primers (ICAN or isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid), by isothermal amplification of loop-mediated DNA (LAMP or Loop-mediated isothermal amplification of DNA).
La présente invention concerne également l'utilisation du procédé selon l'une des revendications précédentes pour la détection de bactéries, la détection de virus, la détection de parasites et l'identification de séquences eucaryotes. The present invention also relates to the use of the method according to one of the preceding claims for the detection of bacteria, the detection of viruses, the detection of parasites and the identification of eukaryotic sequences.
Ainsi le procédé selon l'invention peut être utilisé non seulement dans l'ingénierie sanitaire et la surveillance microbiologique des eaux et des surfaces mais également en biologie et en médecine. Selon encore un autre aspect, l'invention concerne également une méthode pour la détection de bactéries, de virus et de parasites ou la détection d'acides nucléiques eucaryotes dans un échantillon susceptible d'en contenir par purification d'un fragment d'acides nucléiques d'une taille supérieure à 20 bases ou 20 pb, ladite méthode comprenant les étapes suivantes :  Thus the method according to the invention can be used not only in the sanitary engineering and microbiological monitoring of water and surfaces but also in biology and medicine. According to yet another aspect, the invention also relates to a method for the detection of bacteria, viruses and parasites or the detection of eukaryotic nucleic acids in a sample that may contain them by purification of a nucleic acid fragment. greater than 20 bases or 20 bp, said method comprising the following steps:
a) mise en contact d'au moins un desdits fragments avec une solution d'un polymère polycationique en vue de former un complexe entre ledit au moins un fragment d'acides nucléiques et le polymère polycationique, a) contacting at least one of said fragments with a solution of a polycationic polymer to form a complex between said at least one nucleic acid fragment and the polycationic polymer,
b) fixation du complexe obtenu à l'étape a) sur une résine échangeuse de cations et b) fixing the complex obtained in step a) on a cation exchange resin and
c) élution dudit au moins un fragment d'acides nucléiques de la résine échangeuse de cations par application d'une force d'agitation, ledit procédé étant caractérisé en ce que les étapes a) à c) du procédé sont réalisées à un pH compris entre environ 6,0 et 10,0, avantageusement entre environ 7,5 et 9,5, et de manière particulièrement avantageuse entre environ 8 et 9, le pH de chacune de ces étapes pouvant être identique ou différent l'un de l'autre. c) eluting said at least one nucleic acid fragment of the cation exchange resin by applying a stirring force, said method being characterized in that steps a) to c) of the process are carried out at a pH of between about 6.0 and 10.0, preferably between about 7.5 and 9.5, and particularly preferably between about 8 and 9, the pH of each of these steps being identical or different from each other.
L'étape b) du procédé est réalisée par l'application d'une force d'agitation limitée, soit par une agitation lente ou douce, pendant une durée de préférence inférieure ou égale à 15 minutes, plus particulièrement pendant une durée inférieure ou égale à 10 minutes, inférieure ou égale à 5 minutes, inférieure ou égale à 2 minutes, inférieure ou égale à 1 minute, inférieure ou égale à 30 secondes ou égale à 20 secondes, soit par une agitation de courte durée, d'une durée inférieure ou égale à 120 secondes, inférieure ou égale à 60 secondes, inférieure ou égale à 30 secondes, ou égale à 10 secondes, par tout moyen connu, notamment par un agitateur orbital de type vortex. De manière avantageuse, les étapes a) à c) sont suivies d'une étape d'analyse du au moins un fragment d'acides nucléiques ainsi purifié. Stage b) of the process is carried out by the application of a limited stirring force, either by slow or gentle stirring, for a period preferably of less than or equal to 15 minutes, more particularly for a period of less than or equal to at 10 minutes, less than or equal to 5 minutes, less than or equal to 2 minutes, less than or equal to 1 minute, less than or equal to 30 seconds or equal to 20 seconds, or a short duration of agitation, of a shorter duration or equal to 120 seconds, less than or equal to 60 seconds, less than or equal to 30 seconds, or equal to 10 seconds, by any known means, in particular by a vortex-type orbital stirrer. Advantageously, steps a) to c) are followed by a step of analyzing the at least one nucleic acid fragment thus purified.
L'invention concerne enfin un kit pour purifier et concentrer au moins un fragment d'acides nucléiques à partir d'un échantillon susceptible d'en contenir en utilisant le procédé selon l'invention. Un tel kit comprend un polymère polycationique soluble en phase homogène, une résine échangeuse de cations et une solution tampon à un pH compris entre 6,0 et 10,0. Un tel kit permet de purifier des fragments d'acide nucléique de taille supérieure à 20 nucléotides, pour les acides nucléique simple brin, ou de taille supérieure à 20 pb, pour les acides nucléiques double brin. De préférence, un tel kit contient une notice explicative pour la mise en œuvre d'un procédé selon l'invention. The invention finally relates to a kit for purifying and concentrating at least one nucleic acid fragment from a sample that may contain it using the method according to the invention. Such a kit comprises a homogeneous phase soluble polycationic polymer, a cation exchange resin and a buffer solution at a pH of between 6.0 and 10.0. Such a kit makes it possible to purify nucleic acid fragments larger than 20 nucleotides, for single-stranded nucleic acids, or larger than 20 bp, for double-stranded nucleic acids. Preferably, such a kit contains an explanatory note for the implementation of a method according to the invention.
Les exemples 1 à 15 et les figures 1 à 6 qui suivent illustrent l'invention. Examples 1 to 15 and Figures 1 to 6 which follow illustrate the invention.
La Figure 1 illustre l'effet de la puissance de la force mécanique (en rpm, pour « révolutions per minute » ou « tours par minute) sur les rendements d'extraction conformément à l'exemple 4 soit sous forme d'une courbe (A) soit sous forme de valeurs numériques (B). FIG. 1 illustrates the effect of the power of the mechanical force (in rpm, for "revolutions per minute" or "revolutions per minute") on the extraction yields according to Example 4, either in the form of a curve ( A) in the form of numerical values (B).
La Figure 2 illustre la comparaison de la capacité à éliminer les inhibiteurs de PCR présent dans des échantillons d'eaux industrielles entre la méthode selon l'invention et une méthode classique de purification d'ADN par ultra-filtration conformément à l'exemple 10. Figure 2 illustrates the comparison of the ability to remove PCR inhibitors present in industrial water samples between the method according to the invention. and a conventional ultrafiltration DNA purification method according to Example 10.
La Figure 3 illustre le suivi des unités génomes de Legionella pneumophila et de la quantité de polylysine linéaire (PLL) dans le surnageant en fonction du temps d'agitation (1 800 rpm à 75°C au vortex) après la formation du polypiexe et la mise en contact avec la résine échangeuse de cations conformément à l'exemple 11. La Figure 4 illustre le rendement de purification d'acides nucléiques de taille différente : fragment d'ADN de 20 pb, amplicon d'ADN de 150 pb, ADN plasmidique de 2000 pb ou ADN génomique, conformément à l'exemple 12.  Figure 3 illustrates the follow-up of the genome units of Legionella pneumophila and the amount of linear polylysine (PLL) in the supernatant as a function of the agitation time (1800 rpm at 75 ° C vortex) after the formation of polypiexis and the contact with the cation exchange resin according to Example 11. Figure 4 illustrates the purification efficiency of nucleic acids of different size: 20 bp DNA fragment, 150 bp DNA amplicon, plasmid DNA 2000 bp or genomic DNA, according to Example 12.
La Figure 5 illustre la capacité de purification d'acide ribonucléique (ARN) et d'acide déoxyribonucléique (ADN), conformément à l'exemple 13 soit sous forme d'histogramme (A) soit sous forme de tableau (B). Figure 5 illustrates the ability to purify ribonucleic acid (RNA) and deoxyribonucleic acid (DNA) according to Example 13 either as a histogram (A) or in tabular form (B).
La Figure 6 illustre le rendement d'extraction d'acide nucléique à partir de différentes matrices, matrices de type agro-alimentaire (A) ou matrices de type médical (B) conformément à l'exemple 14.  Figure 6 illustrates the nucleic acid extraction yield from different matrices, agri-food type matrices (A) or medical type matrices (B) according to Example 14.
EXEMPLE 1 : METHODE DE PURIFICATION D'ADN GENOMIQUE EXAMPLE 1 Method of Purification of Genomic DNA
1.1 Matériels et méthodes 1.1 Materials and methods
Différentes solutions d'ADN génomique de Legionella pneumophila, contenant respectivement 2 000, 36 000 et 328 000 UG (unités génome) par échantillon sont mises en présence de 100 μί d'une solution de polylysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube. Le polypiexe est ensuite retenu sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) mise en suspension (procédé en batch) par dix retournements successifs du microtube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 200 μί d'un tampon d'élution, le TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA ImM) est ajouté sur la résine. Les tubes sont ensuite maintenus à 75°C pendant 10 minutes avant d'être agités au vortex (2 500 rpm) pendant 10 minutes. Various genomic DNA solutions of Legionella pneumophila, containing respectively 2,000, 36,000 and 328,000 MU (genome units) per sample, are placed in the presence of 100 μl of a 10 mg / ml linear polylysine solution (PLL) in a microtube. The placing in contact of the PLL and the genomic DNA is achieved by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube. The polypiex is then retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) suspended (batch process) by ten successive reversals of the microtube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed. A volume of 200 μl of an elution buffer, TE (Tris HCl 10 mM pH 8.5, EDTA ImM) is added to the resin. The tubes are then held at 75 ° C for 10 minutes before being vortexed (2500 rpm) for 10 minutes.
Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes afin de prélever le surnageant. 5 μΙ_ du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Biorad, kit iQ-Check™ legionella pneumophila). The tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant. 5 μl of the supernatant are used to titrate elution with qPCR (Biorad, kit iQ-Check ™ legionella pneumophila).
1.2 Résultats 1.2 Results
Les résultats sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous. The results are given in Table 1 below.
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Figure imgf000017_0001
Tableau 1 : Purification d'ADN génomique  Table 1: Purification of genomic DNA
Le procédé selon la présente invention permet d'obtenir des rendements de récupération d'ADN génomique très satisfaisants, d'environ 64 et 134 %, conformément aux exigences des normes NF T 90-471 et ISO TS 12869. The method according to the present invention makes it possible to obtain very satisfactory genomic DNA recovery yields of approximately 64 and 134%, in accordance with the requirements of standards NF T 90-471 and ISO TS 12869.
EXEMPLE 2 : METHODE DE PURIFICATION D'UN ACIDE NUCLEIQUE DE 150PB 2.1. Matériels et méthodes EXAMPLE 2: METHOD OF PURIFYING A NUCLEIC ACID OF 150PB 2.1. Materials and methods
Différentes solutions d'un acide nucléique de 150 pb, respectivement titrées à 1469, 4898 et 48989 unités par échantillon sont mises en présence de 100 μί d'une solution de polylysine linéaire à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube. Le polypiexe est ensuite retenu sur une résine échangeuse de cations mise en suspension (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 200 μί d'un tampon d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA ImM) est ajouté sur la résine. Les tubes sont ensuite maintenus à 75°C pendant 10 minutes au bain-marie avant d'être agités au vortex (2 500 rpm) pendant 10 minutes.  Various solutions of a nucleic acid of 150 bp, respectively titrated at 1469, 4898 and 48989 units per sample are brought into contact with 100 μl of a linear polylysine solution at 10 mg / ml in a microtube. The placing in contact of the PLL and the genomic DNA is achieved by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube. The polypiexis is then retained on a suspension cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed. A volume of 200 μl of a TE elution buffer (10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA) is added to the resin. The tubes are then held at 75 ° C for 10 minutes in a water bath before being vortexed (2500 rpm) for 10 minutes.
Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes afin de prélever le surnageant. 5 μί du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Perfecta qPCR ToughMix Quanta) avec les amorces (RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3') et la sonde 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3' choisies d'après la norme NF T 90-431. 2.1 Résultats The tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant. 5 μί of the supernatant are used to titrate elution with qPCR (Perfecta qPCR ToughMix Quanta) with primers (RI 5'- CCA ATT GAG CGC TCA TCA TAG - 3 '/ FL 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C -3') and probe 5 '-FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3 'chosen according to NF T 90-431 standard. 2.1 Results
Les résultats sont donnés dans le tableau 2 ci-dessous.  The results are given in Table 2 below.
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Figure imgf000018_0001
Tableau 2 : Purification d'un acide nucléique de 150 pb. Le procédé selon la présente invention permet de récupérer entre environ 28 et 34 % d'un acide nucléique de 150 pb.  Table 2: Purification of a 150 bp nucleic acid. The method according to the present invention makes it possible to recover between about 28 and 34% of a 150 bp nucleic acid.
EXEMPLE 3 : IMPACT DE LA NATURE DU POLYCATION SUR LE RENDEMENT D'ELUTION EXAMPLE 3 IMPACT OF THE NATURE OF POLYCATION ON ELUTION EFFICIENCY
3.1 Matériels et méthodes 3.1 Materials and methods
Différentes solutions d'ADN génomique de Legionella pneumophila, titrées à 86000, 64000 et 4130000 UG par échantillon, sont respectivement mises en contact dans des microtubes avec 100 μί d'une solution à 10 mg/mL soit de polyéthylène-imine (PEI) de différents types sous les dénominations Lupasol® WF, Lupasol® PS, Lupasol® HF, et Lupasol® G100, soit d'une solution à 10 mg/mL de Polybrène, soit d'une solution à 10 mg/mL de dendrimères greffés de lysine (DGL) (soit de générations 2, 3, 4 ou 5) et soit d'une solution à 10 mg/mL de polylysine linéaire. Le polyplexe ADNg/polymère polycationique est formé sous agitation douce par trois retournements successifs desdits microtubes. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 200 μί d'un tampon d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA ImM) est ajouté sur la résine. Les tubes sont ensuite maintenus à 75°C pendant 10 minutes avant d'être agités au vortex (2 500 rpm) pendant 10 minutes. Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes afin de prélever le surnageant. 5 μΙ_ du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Biorad, kit iQ-Check™ legionella pneumophila) . 3.2 Résultats Various genomic DNA solutions of Legionella pneumophila, titrated at 86000, 64000 and 4130000 MU per sample, are respectively brought into contact in microtubes with 100 μl of a 10 mg / mL solution of polyethyleneimine (PEI) of different types under the names Lupasol® WF, Lupasol® PS, Lupasol® HF, and Lupasol® G100, either a 10 mg / mL solution of Polybrene or a 10 mg / mL solution of lysine grafted dendrimers (DGL) (either generations 2, 3, 4 or 5) and either a 10 mg / mL solution of linear polylysine. The gDNA polyplex / polycationic polymer is formed with gentle stirring by three successive turns of said microtubes. The polyplex is then batchwise retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed. A volume of 200 μl of a TE elution buffer (10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA) is added to the resin. The tubes are then held at 75 ° C for 10 minutes before being vortexed (2 500 rpm) for 10 minutes. The tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant. 5 μl of the supernatant are used to titrate elution with qPCR (Biorad, kit iQ-Check ™ legionella pneumophila). 3.2 Results
Les résultats sont donnés dans le tableau 3 ci-dessous.  The results are given in Table 3 below.
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Tableau 3 : Purification d'ADN génomique avec différents types de Table 3: Purification of genomic DNA with different types of
polycations  polycations
Une grande diversité de polycations solubles permettent d'obtenir des rendements satisfaisants, à savoir supérieurs à 25 %, en référence aux normes N F T 90-471 et ISO TS 12869 de décembre 2012. EXEMPLE 4 : EFFET DE LA PUISSANCE DE LA FORCE MÉCANIQUE A great diversity of soluble polycations makes it possible to obtain satisfactory yields, namely greater than 25%, with reference to standards N F T 90-471 and ISO TS 12869 of December 2012. EXAMPLE 4: EFFECT OF THE POWER OF MECHANICAL FORCE
4.1 Matériels et méthodes 4.1 Materials and methods
Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila, titrée à 19 013 UG par échantillon, est mise en présence de 100 μί d'une solution de polylysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL dans un microtube. A genomic DNA solution of Legionella pneumophila, titrated at 19 013 UG per sample, is placed in the presence of 100 μl of a linear polylysine solution (PLL). at 10 mg / mL in a microtube.
Le polypiexe ADNg-PLL se forme sous agitation douce par trois retournements successifs du microtube.  The gDNA-PLL polypiex is formed with gentle agitation by three successive reversals of the microtube.
Le polypiexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube.  The polypiexis is then batchwise retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube.
Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé.  After decantation or centrifugation, the supernatant is removed.
Un volume de 200 μί d'une solution tampon d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA ImM) est ajouté sur la résine. Les tubes sont ensuite maintenus à 75°C pendant 10 minutes avant d'être agités au vortex (Pulsing vortex mixer : 120 V / 50-60 Hz / 150 W / 500 - 2 500 rpm) pendant 10 minutes à différentes puissances (en rpm), soit de 0, 500, 1 000, 1 500, 2 000 ou 2 500. A volume of 200 μl of a TE elution buffer solution (10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA) is added to the resin. The tubes are then held at 75 ° C for 10 minutes before being vortexed (Pulsing vortex mixer: 120 V / 50-60 Hz / 150 W / 500 - 2500 rpm) for 10 minutes at different powers (in rpm ), 0, 500, 1,000, 1,500, 2,000 or 2,500.
Les tubes sont centrifugés (xlO 000 g pendant 5 secondes) afin de prélever le surnageant.  The tubes are centrifuged (10 000 g for 5 seconds) to remove the supernatant.
5 μί du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Biorad, kit iQ-Check™ legionella pneumophila). 5 μl of the supernatant are used to titrate the qPCR elution (Biorad, iQ-Check ™ legionella pneumophila kit).
4.2 Résultats : 4.2 Results:
Ils sont donnés dans les figures 1A et 1B. Les rendements optimums sont atteints à partir d'une agitation supérieure à 1500 rpm.  They are given in FIGS. 1A and 1B. Optimum yields are achieved from agitation above 1500 rpm.
EXEMPLE 5 : IMPACT DE LA MISE EN ŒUVRE DE L'ETAPE D'AGITATION LORS DE L'ELUTION 5.1 Matériels et méthodes EXAMPLE 5 IMPACT OF IMPLEMENTATION OF THE STAGE OF AGITATION DURING ELUTION 5.1 Materials and methods
Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila, titrée à 404 000 UG par échantillon, est mise en présence de 100 μί d'une solution de polylysine linéaire à 10 mg/mL dans un microtube. Le polypiexe ADNg-PLL se forme sous agitation douce par trois retournements successifs du microtube. Le polypiexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 200 μί d'une solution tampon d'élution TE est ajouté sur la résine. L'élution est réalisée selon différentes méthodes : A genomic DNA solution of Legionella pneumophila, titrated at 404,000 MU per sample, is placed in the presence of 100 μl of a linear polylysine solution at 10 mg / ml in a microtube. The gDNA-PLL polypiex is formed with gentle agitation by three successive reversals of the microtube. The polypiexis is then batchwise retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed. A volume of 200 μί of a solution TE elution buffer is added to the resin. Elution is carried out according to different methods:
Vortex pendant 10 minutes à 75°C,  Vortex for 10 minutes at 75 ° C,
Ultrasons pendant 30 secondes (45 kHz) à 75°C, ou  Ultrasound for 30 seconds (45 kHz) at 75 ° C, or
- Application de micro-ondes pendant 30 secondes (800 watts) + 10 minutes à 180 watts (2450 MHz). - Microwave application for 30 seconds (800 watts) + 10 minutes at 180 watts (2450 MHz).
Les tubes sont ensuite centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes pour pouvoir prélever le surnageant. 5 μΙ_ du surnageant sont alors utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Biorad, kit iQ-Check™ legionella pneumophila).  The tubes are then centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to remove the supernatant. 5 μl of the supernatant are then used to titrate elution with qPCR (Biorad, kit iQ-Check ™ legionella pneumophila).
5.2 Résultats 5.2 Results
Les résultats sont donnés dans le tableau 4 ci-dessous.  The results are given in Table 4 below.
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Tableau 4 : Purification d'ADN génomique en utilisant différentes méthodes physiques d'élution Table 4: Purification of genomic DNA using different physical methods of elution
Ces résultats montrent que dans la présente invention, différentes méthodes d'élution mécanique peuvent être utilisées, tels que l'agitation orbitale, les microondes et les ultrasons. Ces différentes méthodes permettent d'obtenir de bons rendements de purification. These results show that in the present invention different methods of mechanical elution can be used, such as orbital shaking, microwaves and ultrasound. These different methods make it possible to obtain good purification yields.
EXEMPLE 6 : EFFET DU PH DE LA SOLUTION D'ELUTION ET DE LA METHODE D'ELUTION SUR LES RENDEMENTS DE RECUPERATION D'ADN GENOMIQUE. 6.1 Matériels et méthodes EXAMPLE 6 EFFECT OF THE PH OF THE ELUTION SOLUTION AND THE ELUTION METHOD ON THE RECOVERY RESULTS OF GENOMIC DNA. 6.1 Materials and methods
Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila titrée à 45 501 UG par échantillon, est mise en présence de 100 μί d'une solution de poly-lysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. 200 μί d'une solution à différents pH, de 8,5 à 12, sont ajoutés sur la résine. Les tubes sont ensuite traités selon deux méthodes : A genomic DNA solution of Legionella pneumophila titrated at 45 501 MU per sample is placed in the presence of 100 μl of a linear poly-lysine solution. (PLL) at 10 mg / mL in a microtube. The placing in contact of the PLL and the genomic DNA is achieved by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube. The polyplex is then batchwise retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed. 200 μl of a solution at different pHs, from 8.5 to 12, are added to the resin. The tubes are then processed according to two methods:
agitation au vortex pendant 10 minutes à 75°C à 2500 rpm (méthode A), - agitation douce en effectuant 10 retournements du tube à température ambiante (méthode B).  vortex stirring for 10 minutes at 75 ° C. at 2500 rpm (method A), gentle stirring by making 10 turns of the tube at room temperature (method B).
Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes pour pouvoir prélever le surnageant. 2 μί du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Perfecta qPCR ToughMix Quanta) avec les amorces (RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3') et la sonde 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3' choisies d'après la norme NF T 90-431.  The tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant. 2 μl of the supernatant are used to titrate the qPCR elution (Perfecta qPCR ToughMix Quanta) with the primers (RI 5'-CCA ATT CGC GAG CAC TCA TAG-3 '/ FL 5'-CCG ATG CCA CAT CAT TAG C- 3 ') and the 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT probe CCG-BHQ1-3 'selected according to standard NF T 90-431.
6.2 Résultats 6.2 Results
Les résultats sont donnés dans le tableau 5 ci-dessous.  The results are given in Table 5 below.
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Tableau 5 : Effet de la variation du pH sur le rendement d'élution Table 5: Effect of pH Change on Elution Yield
Pour chacune des méthodes d'élutions décrites (méthode A : agitation au vortex pendant 10 minutes à 75°C, méthode B : agitation douce en effectuant 10 retournements du tube) les valeurs hautes de pH de la solution d'élution ne permettent pas d'améliorer les rendements. En revanche l'agitation mécanique forte (2 500 rpm, méthode d'élution A) permet d'obtenir de bons rendements quel que soit le pH de la solution d'élution. De plus ces bons rendements sont obtenus que le pH de capture soit identique ou non au pH d'élution. For each of the elution methods described (method A: vortex stirring for 10 minutes at 75 ° C., method B: gentle stirring by making 10 tube turns), the high pH values of the elution solution do not vary. do not improve yields. On the other hand, the strong mechanical agitation (2500 rpm, elution method A) makes it possible to obtain good yields whatever the pH of the elution solution. In addition, these good yields are obtained whether the capture pH is identical or not to the elution pH.
EXEMPLE 7 : EFFET DE LA FORCE IONIQUE LORS DE L'ETAPE DE CAPTURE DE L'ADN PAR LE POLYCATION EXAMPLE 7 EFFECT OF IONIC FORCE DURING THE STAGE OF CAPTURE OF DNA BY POLYCATION
7.1 Matériels et méthodes 7.1 Materials and methods
Plusieurs solutions d'ADN génomique de Legionella pneumophila, contenant 2 544 ng par échantillon sont mises en présence de 100 μΙ_ d'une solution de polylysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est récupéré dans un nouveau microtube. Several genomic DNA solutions of Legionella pneumophila, containing 2544 ng per sample are placed in the presence of 100 μl of a linear polylysine solution (PLL) at 10 mg / ml in a microtube. The placing in contact of the PLL and the genomic DNA is achieved by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube. The polyplex is then batchwise retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is recovered in a new microtube.
Un volume de 2 μί est dosé au nanodrop (Lq à 5 ng/μΙ) dans le but d'évaluer le rendement de capture. A volume of 2 μί is dosed with nanodrop (Lq at 5 ng / μΙ) in order to evaluate the capture efficiency.
7.2 Résultats 7.2 Results
Ils sont donnés dans le tableau 6 ci-dessous.  They are given in Table 6 below.
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Tableau 6 : Effet de la variation de la force ionique sur le rendement d'élution Selon le procédé de la présente invention, la force ionique n'influe pas sur les rendements de capture. Table 6: Effect of variation of ionic strength on elution efficiency According to the method of the present invention, ionic strength does not affect capture yields.
EXEMPLE 8 : EFFET DE LA FORCE IONIQUE DE LA SOLUTION D'ELUTION SUR LES RENDEMENTS DE RECUPERATION D'ADN GENOMIQUE. EXAMPLE 8 EFFECT OF THE IONIC FORCE OF THE ELUTION SOLUTION ON GENOMIC DNA RECOVERY YIELDS.
8.1 Matériels et méthodes 8.1 Materials and methods
Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila, titrée à 58 025 UG par échantillon, est mise en présence de 100 μΙ_ d'une solution de poly-lysine linéaire à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. 200 μΙ d'une solution tampon d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA ImM) à des concentrations en NaCI variables, de 20 à 340 mM, sont ajoutés sur la résine. Les tubes sont ensuite maintenus à 75°C pendant 10 minutes avant d'être agités au vortex (2 500 rpm) pendant 10 minutes.  A genomic DNA solution of Legionella pneumophila, titrated at 58 025 UG per sample, is placed in the presence of 100 μl of a linear poly-lysine solution at 10 mg / ml in a microtube. The placing in contact of the PLL and the genomic DNA is achieved by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube. The polyplex is then batchwise retained on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed. 200 μl of a TE elution buffer solution (10 mM Tris HCl pH 8.5, 1 mM EDTA) at varying NaCI concentrations, from 20 to 340 mM, are added to the resin. The tubes are then held at 75 ° C for 10 minutes before being vortexed (2500 rpm) for 10 minutes.
Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes afin de prélever le surnageant. The tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant.
2 μί du surnageant sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Perfecta toughmix, Quanta) avec les amorces (RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3') et la sonde 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG- BHQ1- 3' choisies d'après la norme NF T 90-431.  2 μl of the supernatant are used to titrate the elution with qPCR (Perfecta toughmix, Quanta) with the primers (RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3 '/ Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3 ') and the 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT probe CCG-BHQ1- 3 'selected according to standard NF T 90-431.
8.2 Résultats 8.2 Results
Les résultats sont donnés dans le tableau 7 ci-dessous.  The results are given in Table 7 below.
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340 29,5
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340 29.5
Tableau 7 : Effet de la variation de force ionique sur le rendement d'élution Table 7: Effect of ionic strength variation on elution efficiency
Le procédé selon la présente invention, permet d'obtenir de bons rendements, à savoir supérieurs à 25 % en référence aux normes N F T 90-471 et ISO TS 12869, quelle que soit la force ionique de la solution d'élution. The process according to the present invention makes it possible to obtain good yields, namely greater than 25% by reference to standards N F T 90-471 and ISO TS 12869, regardless of the ionic strength of the elution solution.
EXEMPLE 9 : IMPACT DE LA MISE EN ŒUVRE DU PROCEDE 9.1 Matériels et méthodes EXAMPLE 9 IMPACT OF THE IMPLEMENTATION OF THE PROCESS 9.1 Materials and Methods
Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila, titrée à 293 782 UG par échantillon, est mise en présence de 100 μί d'une solution de polylysine linéaire à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube.  A genomic DNA solution of Legionella pneumophila, titrated at 293 782 UG per sample, is placed in the presence of 100 μl of a linear polylysine solution at 10 mg / ml in a microtube. The placing in contact of the PLL and the genomic DNA is achieved by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube.
Le polyplexe est ensuite retenu sur une cartouche contenant une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par percolation.  The polyplex is then retained on a cartridge containing a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) per percolation.
Un volume de 100 μΐ d'une solution d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA ImM) est alors mis en contact avec la résine.  A volume of 100 μl of a TE elution solution (10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA) is then brought into contact with the resin.
L'élution est réalisée selon différentes méthodes :  Elution is carried out according to different methods:
Vortex à 2 500 rpm pendant 10 minutes à 75°C,  Vortex at 2500 rpm for 10 minutes at 75 ° C,
Ultrasons pendant 30 secondes (45 kHz) à 75°C, ou  Ultrasound for 30 seconds (45 kHz) at 75 ° C, or
Application de micro-ondes pendant 30 secondes (800 watts) + 10 minutes à 180 watts (2450 MHz).  Microwave application for 30 seconds (800 watts) + 10 minutes at 180 watts (2450 MHz).
2 μί de l'éluat sont utilisés pour titrer l'élution par qPCR (Perfecta toughmix, Quanta) avec les amorces (RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3') et la sonde 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3' choisies d'après la norme NF T 90-431. 9.2 Résultats 2 μl of the eluate are used to titrate the elution with qPCR (Perfecta toughmix, Quanta) with the primers (RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3 '/ FL 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C-3 ') and the 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3 'probe chosen according to the NF T 90-431 standard. 9.2 Results
Ils sont donnés dans le tableau 8 ci-dessous  They are given in Table 8 below
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Tableau 8 : Effet de la mise en œuvre en cartouche du procédé Table 8: Effect of the implementation in cartridge of the process
Le procédé avec une mise en œuvre en cartouche selon la présente invention, permet d'obtenir de bons rendements d'extraction avec les différentes méthodes d'élution. The process with a cartridge implementation according to the present invention makes it possible to obtain good extraction yields with the various elution methods.
EXEMPLE 10 : CAPACITE DU PROCEDE A ELIMINER LES INHIBITEURS DE PCR D'ECHANTILLONS REELS EXAMPLE 10 CAPACITY OF THE PROCESS TO ELIMINATE THE PCR INHIBITORS OF REAL SAMPLES
10.1 Matériels et méthodes 10.1 Materials and methods
La capacité du procédé à enlever les inhibiteurs d'un échantillon a été évaluée sur 24 échantillons d'eau provenant de différentes tours aéro-réfrigérantes. Ces échantillons sont connus pour être fortement chargés en inhibiteurs de PCR après une purification par ultrafiltration (méthode B) .  The ability of the process to remove inhibitors from one sample was evaluated on 24 water samples from different cooling towers. These samples are known to be heavily loaded with PCR inhibitors after ultrafiltration purification (method B).
L'extraction de l'ADN a été réalisée par la présente invention (méthode A) .  The extraction of the DNA was carried out by the present invention (Method A).
Méthode B Method B
Un même volume a été filtré (entre 10 et 100 ml selon les propriétés de chaque échantillon) sur une membrane en polycarbonate (0,45 μηι) . La membrane est ensuite déposée dans une solution de lyse et placée 15 minutes à 95°C.  The same volume was filtered (between 10 and 100 ml according to the properties of each sample) on a polycarbonate membrane (0.45 μηι). The membrane is then deposited in a lysis solution and placed at 95 ° C. for 15 minutes.
Une fois la lyse terminée, les membranes sont retirées des tubes. Once lysis is complete, the membranes are removed from the tubes.
Méthode A Method A
Le surnageant est récupéré puis mis en présence de 100 μί d'une solution de poly- lysine linéaire à 10 mg/mL dans un microtube. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique extrait est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du microtube. Le polyplexe est ensuite retenu en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après décantation ou centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 100 μΙ_ d'une solution d'élution TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA ImM) est ajouté sur la résine. Les tubes sont ensuite maintenus à 75°C pendant 10 minutes avant d'être agités au vortex à 1800 rpm pendant 10 minutes. The supernatant is recovered and then brought into the presence of 100 μl of a 10 mg / ml linear polylysine solution in a microtube. The placing in contact of the PLL and the extracted genomic DNA is carried out by homogenizing the solution by three successive manual reversals of the microtube. The polyplex is then retained in batch on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After decantation or centrifugation, the supernatant is removed. A volume of 100 μl of a TE elution solution (10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA) is added to the resin. The tubes are then held at 75 ° C for 10 minutes before being vortexed at 1800 rpm for 10 minutes.
Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes afin de prélever le surnageant.  The tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to collect the supernatant.
L'élution est récupérée dans un nouveau microtube.  The elution is recovered in a new microtube.
Pour chaque extrait, 5μί sont déposés en qPCR (Biorad, kit iQ-Check™ legionella pneumophila ou iQ-Check™ legionella spp.), lorsqu'une inhibition est observée des dilutions successives de l'échantillon sont réalisées jusqu'à la levée de l'inhibition . For each extract, 5μί are deposited in qPCR (Biorad, iQ-Check ™ kit legionella pneumophila or iQ-Check ™ legionella spp.), When an inhibition is observed successive dilutions of the sample are carried out until the lifting of inhibition.
10.2 Résultats 10.2 Results
Ils sont donnés dans la figure 2. 96% des échantillons connus pour être inhibés après une purification par ultrafiltration ne sont pas inhibés dans le cas d'une purification par ce procédé. Ainsi le procédé selon l'invention permet d'éliminer les inhibiteurs de PCR EXEMPLE 11 : EFFET DU TEMPS D'AGITATION They are given in FIG. 2. 96% of the samples known to be inhibited after purification by ultrafiltration are not inhibited in the case of purification by this method. Thus, the process according to the invention makes it possible to eliminate PCR inhibitors. EXAMPLE 11: EFFECT OF AGITATION TIME
11.1 Matériels et méthodes 11.1 Materials and methods
Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila contenant 9,1.105 UG est mise en présence de 100 μί d'une solution de polylysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL. La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée par l'homogénéisation de la solution par trois retournements manuels successifs du micro-tube pendant moins de 10 secondes. Le polyplexe est ensuite retenu sur une résine échangeuse de cations en suspension (80 mg de résine présentant une densité de charges de 10 mEq/g) par agitation à 1 800 rpm à 75°C à l'aide d'un thermomixer (thermomixer TS100 - MD33, Hangzhou Miu instruments co. Ltd). Des prélèvements du surnageant sont faits à différents temps pour déterminer la cinétique de capture. Les prélèvements sont analysés par qPCR (Quanta Perfecta tough mix) avec les amorces (RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3') et la sonde 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3' choisies d'après la norme NF T 90-471. 11.2 Résultats A genomic DNA solution of Legionella pneumophila containing 9.1 × 10 5 μG is placed in the presence of 100 μl of a linear polylysine solution (PLL) at 10 mg / ml. PLL and genomic DNA are brought into contact by homogenization of the solution by three successive manual reversals of the micro-tube for less than 10 seconds. The polyplex is then retained on a suspension cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 mEq / g) by stirring at 1800 rpm at 75 ° C. using a thermomixer (thermomixer TS100 - MD33, Hangzhou Miu Instruments Co. Ltd). Samples of the supernatant are taken at different times to determine the kinetics of capture. The samples are analyzed by qPCR (Quanta Perfecta tough mix) with the primers (RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG-3 '/ FL 5'-CCG ATG CCA CAT CAT TAG C-3') and probe 5 '-FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1-3 selected according to standard NF T 90-471. 11.2 Results
Les résultats présentés dans la figure 3 et dans le tableau 9 suivant montrent le nombre d'Unités génome et la quantité de PLL retrouvés dans le surnageant en fonction du temps (de to à t = 3 600 secondes) d'agitation au vortex (1 800 rpm) à 75°C.  The results presented in FIG. 3 and in the following table 9 show the number of genome Units and the amount of PLL found in the supernatant as a function of time (from 1 to 3 = 3600 seconds) of vortex agitation (1 800 rpm) at 75 ° C.
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Tableau 9 : Nombre d'Unités génome (UG) en fonction du temps Table 9: Number of Genome Units (MUs) vs. Time
Ces résultats montrent que le polypiexe est très rapidement capturé (moins de 10 secondes) . De manière étonnante les fragments d'ADNg sont ensuite relargués en quelques minutes dans la phase liquide alors que la PLL reste accrochée sur la résine. En effet après 120 secondes minutes d'agitation au vortex à 1 800 rpm à 75°C, 70 % des unités génomes initialement dopées sont retrouvées dans le surnageant et après 300 secondes 100% des unités génomes sont en solution libre dans le surnageant. Le polypiexe est donc très rapidement capturé dans un premier temps puis, dans un second temps, seul l'ADN est libéré du fait de l'agitation continue. Le relargage de l'acide nucléique est donc complet dès 300 secondes, soit 5 mn, après l'élution. EXEMPLE 12 : EFFET DE LA TAILLE DE L'ACIDE NUCLEIQUE These results show that polypiexis is very quickly captured (less than 10 seconds). Surprisingly, the gDNA fragments are then salted out in a few minutes in the liquid phase while the PLL remains attached to the resin. Indeed, after 120 seconds of vortexing at 1,800 rpm at 75 ° C., 70% of the initially doped genome units are found in the supernatant and after 300 seconds 100% of the genome units are in free solution in the supernatant. The polypiexe is thus very quickly captured at first and then, in a second step, only the DNA is released because of the continuous stirring. The release of the nucleic acid is complete after 300 seconds, or 5 minutes, after elution. EXAMPLE 12 EFFECT OF SIZE OF NUCLEIC ACID
12.1. Matériels et méthodes 12.1. Materials and methods
La capacité du procédé à extraire des fragments d'ADN de différentes tailles a été testée. Une solution contenant soit de l'ADN génomique, soit de l'ADN plasmidique (2.000 pb) soit des amplicons d'ADN de 150 pb, soit des fragments d'ADN de 20 pb, est mise en présence de 100 μί d'une solution de polylysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL. La mise en contact de la PLL et des acides nucléiques est réalisée par l'homogénéisation de la solution (trois retournements manuels successifs du microtube). Les polyplexes sont ensuite retenus en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg à 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 100 μί d'un tampon d'élution, TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA ImM) est ajouté sur la résine. Les tubes sont ensuite agités (1 800 rpm) à 75°C pendant 10 minutes à l'aide d'un thermomixer (thermomixer TS100 - MD33, Hangzhou Miu instruments co. Ltd) .. Les tubes sont centrifugés à 5 000 g pendant 5 secondes afin de prélever le surnageant. 5 μί de cet éluat sont utilisés pour titrer l'élution d'ADN par qPCR (Quanta Perfecta tough mix) avec les amorces et sondes spécifiques (tableau 10) pour les échantillons d'ADN génomique à 150 pb. Pour les échantillons de 20 pb, les extraits sont analysés sur gel agarose couplé à de la densitomètrie.  The ability of the process to extract DNA fragments of different sizes was tested. A solution containing either genomic DNA or plasmid DNA (2,000 bp) or 150 bp DNA amplicons, or 20 bp DNA fragments, is placed in the presence of 100 μί of a linear polylysine solution (PLL) at 10 mg / mL. The placing in contact of the PLL and the nucleic acids is achieved by the homogenization of the solution (three successive manual reversals of the microtube). The polyplexes are then retained batchwise on a cation exchange resin (80 mg to 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After centrifugation, the supernatant is removed. A volume of 100 μl of an elution buffer, TE (10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA) is added to the resin. The tubes are then shaken (1800 rpm) at 75 ° C. for 10 minutes using a thermomixer (TS100-MD33 thermomixer, Hangzhou Miu instruments Co. Ltd.). The tubes are centrifuged at 5,000 g for 5 minutes. seconds to collect the supernatant. 5 μl of this eluate are used to titrate qPCR elution (Quanta Perfecta tough mix) with specific primers and probes (Table 10) for 150 bp genomic DNA samples. For the 20 bp samples, the extracts are analyzed on agarose gel coupled to densitometry.
Fragments Séquences des amorces et des sondes Fragments Sequences of primers and probes
Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3'  FL 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3 '
ADN génomique (Legionella  Genomic DNA (Legionella
RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' pneumophila)  RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3 'pneumophila)
SI 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3' IF 5 '-FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3'
F2 5' -TACCG AG CTCG CG G CCG C AAG C -3' F2 5 '-TACCG AG CTCG CG G CCG C AAG C -3'
ADN plasmidique  Plasmid DNA
R2 5' -TCC AAG CG AG C A AA AG C AG GT- 3 '  R2 5 '-TCC AAG CG AG AA AG C AG GT-3'
synthétique synthetic
S2 5'-HEX-GGA GTT CAG CAG ATT TGG AG-BHQ1-3' S2 5'-HEX-GGA GTT CAG AGC ATT TGG AG-BHQ1-3 '
Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3' FL 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3 '
Amplicon d'ADN synthétique RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3'  Synthetic DNA Amplicon RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3 '
S2 5'-HEX-GGA GTT CAG CAG ATT TGG AG-BHQ1-3' Tableau 10 : Séquences des amorces et des sondes S2 5'-HEX-GGA GTT CAG AGC ATT TGG AG-BHQ1-3 ' Table 10: Sequences of primers and probes
12.2 Résultats 12.2 Results
Les résultats, illustrés dans la figure 4, montrent que le procédé permet l'extraction et la purification de l'ADN de taille allant de l'ADN génomique à des fragments d'ADN de 20 pb. (* : SD) The results, illustrated in Figure 4, show that the method allows the extraction and purification of DNA size ranging from genomic DNA to 20 bp DNA fragments. (*: SD)
EXEMPLE 13 : CAPACITE D'EXTRACTION DE L'ADN ET DE L'ARN EXAMPLE 13: CAPACITY FOR EXTRACTING DNA AND RNA
13.1 Matériels et méthodes 13.1 Materials and methods
La capacité du procédé à extraire de l'ADN et de l'ARN a été testée. Une solution contenant un mélange d'ADN et d'ARN, respectivement 1.105 UG (unités génome) de Legionella pneumophila et 1.106 UG de phage model MS2 est mise en présence de 100 μί d'une solution de polylysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL. La mise en contact de la PLL et des acides nucléiques est réalisée par l'homogénéisation de la solution (trois retournements manuels successifs du microtube). Les polyplexes sont ensuite retenus en batch sur une résine échangeuse de cations (80 mg à 10 mEq/g) par dix retournements successifs du tube. Après centrifugation, le surnageant est éliminé. Un volume de 100 μί d'un tampon d'élution, TE (Tris HCI 10 mM pH 8,5, EDTA ImM) est ajouté sur la résine. Les tubes sont ensuite agités (1 800 rpm) à 75°C pendant 10 minutes à l'aide d'un thermomixer. The ability of the process to extract DNA and RNA was tested. A solution containing a mixture of DNA and RNA, respectively 1.10 5 UG (genome units) of Legionella pneumophila and 1.10 6 UG phage model MS2 is brought into the presence of 100 μί of a solution of linear polylysine (PLL) to 10 mg / mL. The placing in contact of the PLL and the nucleic acids is achieved by the homogenization of the solution (three successive manual reversals of the microtube). The polyplexes are then retained batchwise on a cation exchange resin (80 mg to 10 mEq / g) by ten successive reversals of the tube. After centrifugation, the supernatant is removed. A volume of 100 μl of an elution buffer, TE (10 mM Tris HCl pH 8.5, ImM EDTA) is added to the resin. The tubes are then shaken (1800 rpm) at 75 ° C for 10 minutes using a thermomixer.
Les tubes sont centrifugés à 5 000 g pendant 5 secondes afin de prélever le surnageant. 5 μί de cet éluat sont utilisés pour titrer l'élution d'ADN par qPCR (Quanta Perfecta tough mix) avec les amorces RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3' et la sonde 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3'. 5 μΐ de cet éluat sont utilisés pour titrer l'élution d'ARN par qRT- PCR (qScript One step qRT-PCR, Quanta SYBR Green) avec les amorces Fl 5'-TCG ATG GTC CAT ACC TTA GAT GC-3'/Rl 5'-ACC CCG TTA GCG AAG TTG CT-3'.  The tubes are centrifuged at 5,000 g for 5 seconds to collect the supernatant. 5 μl of this eluate are used to titrate the elution of DNA by qPCR (Quanta Perfecta tough mix) with primers RI 5'-CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG-3 '/ FL 5'-CCG ATG CCA CAT CAT TAG C-3 'and the 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1-3 'probe. 5 μl of this eluate are used to titrate the elution of RNA by qRT-PCR (qScript One step qRT-PCR, Quanta SYBR Green) with the primers Fl 5'-TCG ATG GTC CAT ACC TTA GAT GC-3 '/ RL 5'-CCG ACCTA TTA GCG AAG TTG CT-3 '.
13.1. Résultats 13.1. Results
Les résultats présentés dans la figure 5 montrent que le procédé permet à la fois l'extraction et la purification de l'ADN mais aussi de l'ARN . The results presented in Figure 5 show that the process allows both extraction and purification of DNA but also of RNA.
EXEMPLE 14 : EXTRACTION A PARTIR DE DIFFERENTS TYPES D'ECHANTILLONS OU MATRICES EXAMPLE 14: EXTRACTION FROM DIFFERENT TYPES OF SAMPLES OR MATRICES
14.1. Matériels et méthodes : 14.1. Materials and methods :
14.1.1. Matrices alimentaires  14.1.1. Food matrices
L'efficacité du procédé sur des matrices alimentaires telle que des boissons, alcoolisées ou non, a été testée. Les différentes matrices alimentaires ont été dopées avec une suspension de 1000 Unités Génome de Legionella pneumophila. Après une concentration du volume d'échantillon (filtration ou centrifugation, cf tableau), une lyse thermique a été réalisée. Le lysat est mis en présence de 100 μί d'une solution de polylysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL. La suite du procédé est identique au protocole de l'exemple 13.  The efficiency of the process on food matrices such as beverages, alcoholic or not, has been tested. The different food matrices were doped with a suspension of 1000 Genome Units of Legionella pneumophila. After concentration of the sample volume (filtration or centrifugation, see table), thermal lysis was performed. The lysate is brought into contact with 100 μl of a linear polylysine solution (PLL) at 10 mg / ml. The rest of the process is identical to the protocol of Example 13.
5 μί de l'éluat sont utilisés pour titrer l'élution d'ADN par qPCR (Quanta Perfecta tough mix) avec les amorces RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3' et la sonde 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3'. En plus du contrôle de la perte de signal correspondant au dopage initial, un ADN synthétique « témoin d'inhibition » est ajouté dans chaque réaction de qPCR afin de contrôler la levée de l'inhibition. Il est amplifié avec le même couple d'amorces que la cible Fl et RI et est détecté par une sonde spécifique (5'-HEX-GGA GTT CAG CAG ATT TGG AG-BHQ1-3'). 5 μl of the eluate are used to titrate the elution of DNA by qPCR (Quanta Perfecta tough mix) with primers RI 5'-CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG-3 '/ FL 5'-CCG ATG CCA CAT CAT TAG C-3 'and the 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3 'probe. In addition to controlling the signal loss corresponding to the initial doping, a synthetic "inhibition control" DNA is added in each qPCR reaction to control the rise of the inhibition. It is amplified with the same pair of primers as the Fl and RI target and is detected by a specific probe (5'-HEX-GGA GTT AGC CAG ATT TGG AG-BHQ1-3 ').
14.1.2. Matrices médicales 14.1.2. Medical matrices
L'efficacité du procédé sur des matrices du domaine médical, ou matrices médicales, telles que le sang, le plasma, les fèces ou les urines, ont été testées. Les différentes matrices médicales ont été dopées avec une suspension de Legionella pneumophila. Une lyse thermique a été réalisée, puis le lysat est mis en présence de 100 μί d'une solution de polylysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL. La suite du procédé est identique au procédé décrit dans l'exemple 1, seul deux lavages (2 x 500 μί de tampon TE) de la résine après élimination du surnageant ont été rajoutés. The efficiency of the method on matrices of the medical field, or medical matrices, such as blood, plasma, feces or urine, have been tested. The different medical matrices were doped with a suspension of Legionella pneumophila. Thermal lysis was performed, then the lysate was brought into contact with 100 μl of a linear polylysine solution (PLL) at 10 mg / ml. The rest of the process is identical to the method described in Example 1, only two washes (2 x 500 μί of TE buffer) of the resin after removal of the supernatant were added.
5 μί de l'éluat sont utilisés pour titrer l'élution d'ADN par qPCR (Quanta Perfecta tough mix) avec les amorces RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3' et la sonde 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3'. De même que précédemment, le contrôle interne d'inhibition permet de contrôler la levée de l'inhibition . L'acide nucléique est amplifié avec le même couple d'amorces que la cible Fl et RI et est détecté par une sonde spécifique (5 '- H EX-GGA GTT CAG CAG ATT TGG AG-BHQ1-3') . 5 μl of the eluate are used to titrate DNA elution by qPCR (Quanta Perfecta tough mix) with primers RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG-3 '/ FL 5'-CCG ATG CCA CAT CAT TAG C-3' and probe 5 '-FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG- BHQ1- 3 '. As before, the internal inhibition control makes it possible to control the lifting of the inhibition. The nucleic acid is amplified with the same pair of primers as the target F1 and R1 and is detected by a specific probe (5 '- H EX-GGA GTT CAG AGC ATT TGG AG-BHQ1-3').
14.2 Résultats 14.2 Results
Les résu ltats, ta nt su r les matrices alimentaires que médicales, sont présentés dans les figures 6A et 6B. Ils montrent que le procédé de pu rification décrit présente u ne forte capacité d'élimination des in hibiteu rs de la réaction de PCR. De plus, un signal a été détecté dans toutes les matrices, le procédé selon l'invention est donc applicable efficacement à toutes les matrices testées. EXEM PLE 15: EFFET DE LA FORCE ET DE LA DU REE DE L'AGITATION SUR LES DIFFERENTES ETAPES DU PROTOCOLE  The results, on both food and medical matrices, are shown in Figures 6A and 6B. They show that the described purification process has a high capacity for eliminating inhibitors from the PCR reaction. In addition, a signal has been detected in all the matrices, the method according to the invention is therefore effectively applicable to all the matrices tested. EXEM PLE 15: EFFECT OF THE FORCE AND THE REE OF AGITATION ON THE DIFFERENT STAGES OF THE PROTOCOL
15.1 Matériels et méthodes 15.1 Materials and methods
Une solution d'ADN génomique de Legionella pneumophila titrée à 57 258 UG par échantillon, est mise en présence de 100 μ ί d'u ne solution de poly-lysine linéaire (PLL) à 10 mg/mL dans un microtube . La mise en contact de la PLL et de l'ADN génomique est réalisée soit pa r retournements man uels du microtube pendant 20s soit par vortex à 1500 rpm pendant 20s. Le polypiexe est ensuite retenu en batch sur u ne résine échangeuse de cations (80 mg de résine présentant u ne densité de charges de 10 m Eq/g) soit par retournements successifs du tu be pendant 20s ou 10 min soit pa r vortex à 1500 rpm pendant 20s ou 10 min utes. Après centrifugation, le su rnageant est éliminé . 200 μ ί d'une solution de TE sont ajoutés sur la résine . L'élution des acides nucléiques est effectuée soit par agitation au vortex pendant 20s à 75°C à 2500 rpm soit par agitation a u vortex pendant 10 minutes à 75°C à 2500 rpm .  A genomic DNA solution of Legionella pneumophila titrated at 57 258 UG per sample is placed in the presence of 100 μ ί of a linear poly-lysine solution (PLL) at 10 mg / ml in a microtube. The PLL and the genomic DNA are brought into contact either by manual overthrow of the microtube for 20 seconds or by vortexing at 1500 rpm for 20 seconds. The polypiexis is then retained batchwise on a cation exchange resin (80 mg of resin having a charge density of 10 m Eq / g) or by successive turns of the bebe during 20s or 10 min or by vortex 1500 rpm for 20s or 10 minutes. After centrifugation, the supernatant is removed. 200 μ ί of a TE solution are added to the resin. Elution of the nucleic acids is performed either by vortexing for 20s at 75 ° C at 2500 rpm or by vortexing for 10 minutes at 75 ° C at 2500 rpm.
Les tubes sont centrifugés à 10 000 g pendant 5 secondes pour pouvoir prélever le su rnageant. 2 μί du su rnageant sont utilisés pou r titrer l'élution par q PCR (Perfecta qPCR ToughMix Quanta) avec les amorces (RI 5'- CCA ATT GAG CGC CAC TCA TAG - 3' / Fl 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C - 3') et la sonde 5' -FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3' choisies d'après la norme NF T 90-431. The tubes are centrifuged at 10,000 g for 5 seconds to remove the supernatant. 2 μl of the supernatant are used to titrate elution by q PCR (Perfecta qPCR ToughMix Quanta) with primers (RI 5'- CCA ATT GAG CGC TCA TCA TAG - 3 '/ FL 5'- CCG ATG CCA CAT CAT TAG C -3') and probe 5 '-FAM-TGC CTT TAG CCA TTG CTT CCG-BHQ1- 3 'chosen according to NF T 90-431 standard.
15.2 Résultats 15.2 Results
Les résultats sont donnés dans le tableau 11 ci-dessous.  The results are given in Table 11 below.
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000033_0001
Tableau 11  Table 11
Le procédé selon l'invention est mis en œuvre dans les expériences 2, 4, 6, 8, 10 et 14, dans lesquelles l'étape b) de fixation est réalisée soit par des retournements du tube pendant 20 s soit par vortex pendant 20 s, alors que l'élution est mise en œuvre par l'application d'une force d'agitation au vortex pendant 10 mn. Les rendements de purification obtenus montrent l'efficacité d'un procédé selon l'invention .  The process according to the invention is carried out in the experiments 2, 4, 6, 8, 10 and 14, in which the fixing step b) is carried out either by reversals of the tube for 20 seconds or by vortexing for 20 seconds. s, while the elution is carried out by applying a vortex stirring force for 10 minutes. The purification yields obtained show the efficiency of a process according to the invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour purifier et concentrer au moins un fragment d'acides nucléiques d'une taille supérieure à 20 nucléotides, ou 20 bases, pour un fragment d'acides nucléiques simple brin, et supérieure à 20 paires de bases (pb) pour un fragment d'acides nucléiques double brin, susceptible d'être présent dans un échantillon, le procédé comprenant les étapes suivantes : A process for purifying and concentrating at least one nucleic acid fragment larger than 20 nucleotides, or 20 bases, for a single-stranded nucleic acid fragment, and greater than 20 base pairs (bp) for a double-stranded nucleic acid fragment, which may be present in a sample, the process comprising the following steps:
a) mise en contact d'au moins un desdits fragments avec une solution d'un polymère polycationique en vue de former un complexe entre ledit au moins un fragment d'acides nucléiques et le polymère polycationique, a) contacting at least one of said fragments with a solution of a polycationic polymer to form a complex between said at least one nucleic acid fragment and the polycationic polymer,
b) fixation du complexe obtenu à l'étape a) sur une résine échangeuse de cations et b) fixing the complex obtained in step a) on a cation exchange resin and
c) élution dudit au moins un fragment d'acides nucléiques de la résine échangeuse de cations par application d'une force d'agitation, c) eluting said at least one nucleic acid fragment of the cation exchange resin by applying a stirring force,
ledit procédé étant caractérisé en ce que les étapes a) à c) du procédé sont réalisées à un pH compris entre environ 6,0 et 10,0, avantageusement entre environ 7,5 et 9,5, et de manière particulièrement avantageuse entre environ 8 et 9, le pH de chacune de ces étapes pouvant être identique ou différent l'un de l'autre. said method being characterized in that steps a) to c) of the process are carried out at a pH of between about 6.0 and 10.0, preferably between about 7.5 and 9.5, and particularly preferably between about 8 and 9, the pH of each of these steps being identical or different from each other.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que la fixation lors de l'étape b) est réalisée par l'application d'une force d'agitation limitée, et de préférence par une agitation lente ou douce. 2. Method according to claim 1, characterized in that the fixation during step b) is performed by the application of a limited stirring force, and preferably by slow or gentle stirring.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit fragment d'acides nucléiques est un fragment d'ADN simple brin, un fragment d'ADN double brin, de l'ADN génomique ou de l'ARN . 3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that said nucleic acid fragment is a single-stranded DNA fragment, a double-stranded DNA fragment, genomic DNA or RNA.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la force d'agitation correspond à une agitation mécanique choisie parmi une agitation par agitateur orbital, par agitateur linéaire, par thermomixer, par ultrasons ou par micro-ondes. 4. Method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the stirring force corresponds to a mechanical stirring selected from an agitation by orbital shaker, by linear stirrer, by thermomixer, by ultrasound or by microwaves .
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'agitation mécanique est réalisée à une température comprise entre environ 30°C et 100°C, avantageusement à une température comprise entre environ 60°C et 80°C et de manière particulièrement avantageuse à une température d'environ 75°C. 5. Method according to claim 4, characterized in that the mechanical stirring is carried out at a temperature between about 30 ° C and 100 ° C, preferably at a temperature between about 60 ° C and 80 ° C and particularly at a temperature of about 75 ° C.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la résine échangeuse de cations présente une capacité d'échange d'ions au moins égale à 2 mEq/g, de préférence au moins égale à 10 mEq/g et en particulier comprise entre 10 et 30 mEq/g . 6. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the cation exchange resin has an ion exchange capacity of at least 2 mEq / g, preferably at least 10 mEq / g and in particular between 10 and 30 mEq / g.
7. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le polymère polycationîque est choisi dans le groupe comprenant la poly-L-lysine, des dendrimères greffés de lysine, le polyéthylènimine ou la polyamidoamine. 7. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the polycationic polymer is selected from the group comprising poly-L-lysine, grafted lysine dendrimers, polyethylenimine or polyamidoamine.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le polymère polycationîque est la poly-L-lysîne utilisée sous forme d'une solution à une quantité comprise entre 0, 1 et 10 mg, de préférence à une quantité d'environ l mg par échantillon . 8. Process according to claim 7, characterized in that the polycationic polymer is poly-L-lysine used in the form of a solution at a quantity of between 0.1 and 10 mg, preferably at a quantity of approximately mg per sample.
9. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une étape de récupération après l'étape d'élution dudit au moins un fragment d'acides nucléiques. 9. Method according to one of the preceding claims, characterized in that it further comprises a recovery step after the elution step of said at least one nucleic acid fragment.
10. Utilisation du procédé selon l'une des revendications précédentes pour la détection de bactéries, la détection de virus et la détection de parasites et de séquences nucléiques eucaryotes. 10. Use of the method according to one of the preceding claims for the detection of bacteria, the detection of viruses and the detection of eukaryotic parasites and nucleic sequences.
11 . Kit pour purifier et concentrer au moins un fragment d 'acides nucléiques à partir d'un échantillon susceptible d'en contenir en utilisant le procédé selon l'une des revendications 1 à 9, ledit kit comprenant un polymère polycationîque soluble en phase homogène, une résine échangeuse de cations et une solution tampon à un pH compris entre 6,0 et 10,0. 11. Kit for purifying and concentrating at least one nucleic acid fragment from a sample that may contain it using the method according to one of claims 1 to 9, said kit comprising a homogeneous phase soluble polycationic polymer, a cation exchange resin and a buffer solution at a pH of between 6.0 and 10.0.
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