WO2017003153A1 - Method for producing natural killer cells from cord blood monocytes or cells derived therefrom - Google Patents

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WO2017003153A1
WO2017003153A1 PCT/KR2016/006899 KR2016006899W WO2017003153A1 WO 2017003153 A1 WO2017003153 A1 WO 2017003153A1 KR 2016006899 W KR2016006899 W KR 2016006899W WO 2017003153 A1 WO2017003153 A1 WO 2017003153A1
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natural killer
cord blood
cell
hut78
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PCT/KR2016/006899
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정혜진
민보경
최하나
황유경
김은지
김효진
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주식회사 녹십자랩셀
재단법인 목암생명과학연구소
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
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    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens

Definitions

  • Figure 4a is a graph showing the proliferation rate of natural killer cells according to the number of re-stimulation when incubating the enriched natural killer cells with HuT78 support cells as seed cells.
  • the re-stimulation may be repeated one or more times at intervals of 5 to 12 days starting on day 0 of the culture, preferably may be repeated one or more times at intervals of 7 days, but is not limited thereto.
  • cells may be obtained 5 days after the last stimulus, preferably 14 days, but this is also not limiting.
  • Tube 5 anti-human CD3-FITC, anti-human NKp44-PE (BD Pharmingen, 558563), anti-human CD56-PE-Cy5
  • Natural killer cells cultured with various supporting cells were reacted with various tumor cell lines to measure direct cell killing ability.
  • Inhibitory KIR analysis showed that the ratio of CD158a (-) CD158b (-) CD158e (-) cells (KIR (-) cells) of natural killer cells obtained from cells derived from cord blood mononuclear cells was higher than that of PBMC (Fig. 8b).

Abstract

The method for proliferating and producing natural killer cells, according to the present invention, can mass-produce natural killer cells, which have a high killing activity and can be clinically applied, from a small amount of cord blood monocytes or cells derived therefrom, by co-culturing the cord blood monocytes or cells derived therefrom with CD4(+) T cells and proliferating the same, and thus the method can be utilized in the commercialization of cord blood-derived cell therapeutic agents.

Description

제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포로부터 자연살해세포를 제조하는 방법Method for producing natural killer cells from umbilical cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom
본 발명은 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포로부터 자연살해세포를 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포를 CD4(+) T 세포와 공배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 제조방법, 상기 방법에 의해 수득된 자연살해세포 및 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing natural killer cells from umbilical cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom, and more particularly, to co-culture umbilical cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom with CD4 (+) T cells. It includes a method for producing natural killer cells, natural killer cells obtained by the method and the natural killer cells as an active ingredient, to a composition for preventing or treating cancer or infectious diseases.
암은 대표적인 사망 요인 중의 하나이다. 외과적 수술, 화학요법, 방사선 요법 등의 치료법이 발달하여 과거에 비해 초기 암환자의 대부분을 치료할 수 있게 되었음에도 불구하고 말기암 환자의 치료율은 여전히 낮은 편이다. 따라서, 암의 전이, 재발 방지 및 말기암 환자들의 생존기간을 연장시키는 치료법으로서 환자의 면역기능을 이용한 면역 치료법이 관심을 받고 있다. 특히, 항원에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptors, CARs)를 발현하는 유전자 변형 T 세포를 이용한 면역 치료법이 암 치료에 효과적인 것으로 알려져 있다. 하지만, 타인의 T 세포를 사용하였을 경우 주조직적합성복합체(major histocompatability complex, HMC)의 제한을 받아 심각한 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD)을 유발할 수 있다. 따라서 암 치료제의 상업화를 위해서는 동종으로 사용 가능하며 대량 생산이 가능한 자연살해세포(natural killer cell, NK cell)의 사용이 유용하다.Cancer is one of the leading causes of death. Although treatments such as surgery, chemotherapy and radiation therapy have been developed to treat most of the early cancer patients compared to the past, the treatment rate of terminal cancer patients is still low. Therefore, as a treatment for cancer metastasis, prevention of recurrence, and prolonging the survival of terminal cancer patients, immunotherapy using the immune function of the patient is of interest. In particular, immunotherapy using genetically modified T cells expressing chimeric antigen receptors (CARs) that specifically bind to antigens is known to be effective in treating cancer. However, the use of other T cells can lead to severe graft-versus-host disease (GVHD), which is limited by major histocompatability complex (HMC). Therefore, the use of natural killer cells (NK cells) that can be used homogeneously and mass-produced for the commercialization of cancer treatment agents is useful.
자연살해세포는 선천성 면역반응에 중요한 역할을 하는 림프구계 세포로서, NKG2D 및 NCR(NKp30, NKp44, NKp46)과 같은 활성 수용체와 KIR(killer cell immunoglobulin-like receptor) 및 CD94/NKG2A와 같은 억제 수용체와의 신호전달 균형을 통해 활성 또는 억제된다(Vivier E. et al., Science 306; 1517-1519, 2004). 상기 자연살해세포는 바이러스나 암세포를 인지하여 선택적으로 제거하며, 수지상 세포(dendritic cell, DC)의 활성 또는 종양 특이적인 세포독성 T 림프구(cytotoxic t lymphocyte, CTL)를 유도하여 종양 세포를 제거한다. 그러나 체내에 존재하는 자연살해세포의 수는 그다지 많지 않고, 치료적 효과를 보이기 위해 필요한 유효 자연살해세포의 수는 매우 많아야 하므로, 효과적인 자연살해세포의 증식방법이 요구된다. Natural killer cells are lymphocytic cells that play an important role in the innate immune response. Active killer cells such as NKG2D and NCR (NKp30, NKp44, NKp46) and inhibitory receptors such as killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) and CD94 / NKG2A Activated or inhibited through signaling balance of (Vivier E. et al., Science 306; 1517-1519, 2004). The natural killer cells recognize and selectively remove viruses or cancer cells, and induce the activity of dendritic cells (DC) or tumor-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs) to remove tumor cells. However, the number of natural killer cells present in the body is not very large, and the number of effective natural killer cells required for showing a therapeutic effect should be very large, so an effective method for propagating natural killer cells is required.
최근에는 말초혈 림프구(peripheral blood lymphocyte, PBMC), 제대혈(cord blood, CB) 또는 사람유도 만능줄기세포(human-induced pluripotent stem cell)를 원료로 이용한 자연살해세포의 증식 및 제조가 시도되고 있다.Recently, proliferation and production of natural killer cells using peripheral blood lymphocytes (PBMC), cord blood (CB) or human-induced pluripotent stem cells as raw materials have been attempted.
이중, 제대혈 유래 자연살해세포의 확장 배양은 단핵세포(MNC)를 원료세포로 사용하여 증식하는 방법 및 조혈전구세포(hematopoietic progenitor cell, CD34+ 세포)를 원료세포로 하여 증식하는 방법이 있다. 단핵세포를 원료세포로 사용하는 방식은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-15(IL-15), FLT-3L 등을 단독 혹은 혼합 사용하여 자연살해세포를 증식을 돕지만, 증식률 및 순도가 낮은 문제가 있다(Biossel L. et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation, 14, 1031-1038, 2008). 또한, 조혈전구세포를 원료로 사용하는 방식은 증식률이 좋고 순도가 높지만, 배양기간이 길고 다양한 사이토카인과 성장인자를 혼합하여 사용해야 하므로 비용 측면에서 상업화에 어려움이 있다(Fias A.M. et al., Experimental Hematology 36(1):61-68, 2008). Among these, expansion cultures of cord blood-derived natural killer cells include a method of proliferating using mononuclear cells (MNC) as a feedstock cell and a method of proliferating using hematopoietic progenitor cells (CD34 + cells) as feedstock cells. Mononuclear cells are used as source cells to help proliferate natural killer cells by using interleukin-2 (IL-2), interleukin-15 (IL-15), and FLT-3L alone or in combination, but proliferation rate and purity Is a low problem (Biossel L. et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation, 14, 1031-1038, 2008). In addition, the method of using hematopoietic progenitor cells as a raw material has a high proliferation rate and high purity, but it is difficult to commercialize in terms of cost because the culture period is long and a variety of cytokines and growth factors must be used in combination (Fias AM et al., Experimental) Hematology 36 (1): 61-68, 2008).
이에 본 발명자들은 제대혈로부터 자연살해세포를 대량으로 제조할 수 있는 방법에 관해 연구하던 중, 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포를 CD4(+) T 세포와 공배양함으로써 고순도, 고성능의 자연살해세포를 대량으로 증식 및 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.Therefore, while the present inventors are studying a method for producing a large number of natural killer cells from cord blood, high-purity, high-performance natural killer cells by co-culture of cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom with CD4 (+) T cells. It was confirmed that can be grown and prepared in large quantities to complete the present invention.
따라서, 본 발명의 목적은 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포로부터 효율적이고 안정적으로 자연살해세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for producing natural killer cells efficiently and stably from cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 수득된 자연살해세포를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide natural killer cells obtained by the above method.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating cancer or infectious disease, comprising the natural killer cells as an active ingredient.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 자연살해세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer or infectious disease, comprising administering the natural killer cells to a subject.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포를 CD4(+) T 세포와 공배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing natural killer cells, comprising the step of co-culturing cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom with CD4 (+) T cells.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득된 자연살해세포를 제공한다. In order to achieve the above another object, the present invention provides a natural killer cells obtained by the above method.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는, 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above another object, the present invention provides a composition for preventing or treating cancer or infectious disease, comprising the natural killer cells as an active ingredient.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 자연살해세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.In order to achieve the above another object, the present invention provides a method for preventing or treating cancer or infectious disease comprising the step of administering the natural killer cells to a subject.
본 발명에 따른 CD4(+) T 세포를 이용한 자연살해세포의 제조방법은 소량의 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포를 CD4(+) T 세포와 공배양하여 살해능이 높고 임상 적용이 가능한 자연살해세포를 대량 생산할 수 있는바, 제대혈 유래 세포치료제의 상용화에 유용하게 활용될 수 있다.In the method for producing natural killer cells using CD4 (+) T cells according to the present invention, a small amount of cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom are co-cultured with CD4 (+) T cells for high killing ability and are capable of clinical application. Since the cells can be mass-produced, they can be usefully used for the commercialization of cord blood-derived cell therapeutics.
도 1a는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.1A is a graph showing the proliferation rate of natural killer cells obtained after incubating CD56 (+) cells with two support cells for 14 days as seed cells.
도 1b는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.1B is a graph showing the proliferation rate of natural killer cells obtained after incubating 14 days with concentrated natural killer cells as two seed cells together with two support cells.
도 1c는 시드세포로서 CD3(-) 세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.1C is a graph showing the proliferation rate of natural killer cells obtained after incubating CD3 (−) cells with two support cells for 14 days as seed cells.
도 1d는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.1D is a graph showing the proliferation rate of natural killer cells obtained after 21 days of incubation of CD56 (+) cells with two support cells as seed cells.
도 1e는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.1E is a graph showing the proliferation rate of natural killer cells obtained after 21 days of incubation of concentrated natural killer cells with two support cells as seed cells.
도 1f는 시드세포로서 CD3(-) 세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.Figure 1f is a graph showing the proliferation rate of natural killer cells obtained after incubating CD3 (-) cells with two support cells for 21 days as seed cells.
도 2a는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 HuT78 지지세포와 함께 배양할 때, 시드세포와 지지세포의 비율에 따른 자연살해세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.Figure 2a is a graph showing the proliferation rate of natural killer cells according to the ratio of seed cells and support cells when incubating the enriched natural killer cells with HuT78 support cells as seed cells.
도 2b는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 HuT78 지지세포와 함께 배양할 때, 지지세포의 재자극 시기에 따른 자연살해세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.Figure 2b is a graph showing the proliferation rate of natural killer cells according to the restimulation time of the support cells when incubated with HuT78 support cells enriched natural killer cells as seed cells.
도 3a는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 HuT78 지지세포와 함께 배양할 때, 소태아혈청(FBS) 또는 사람 혈장을 사용할 경우의 자연살해세포 증식율을 나타낸 그래프이다.Figure 3a is a graph showing the natural killer cell proliferation rate when using fetal bovine serum (FBS) or human plasma when incubating the enriched natural killer cells with HuT78 support cells as seed cells.
도 3b는 시드세포로서 CD3(-) 세포를 HuT78 지지세포와 함께 배양할 때, FBS 또는 사람 혈장을 사용할 경우의 자연살해세포 증식율을 나타낸 그래프이다.Figure 3b is a graph showing the natural killer cell proliferation rate when using FBS or human plasma when incubating CD3 (-) cells with HuT78 support cells as seed cells.
도 4a는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 HuT78 지지세포와 함께 배양할 때, 재자극 횟수에 따른 자연살해세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.Figure 4a is a graph showing the proliferation rate of natural killer cells according to the number of re-stimulation when incubating the enriched natural killer cells with HuT78 support cells as seed cells.
도 4b는 시드세포로서 CD3(-) 세포를 HuT78 지지세포와 함께 배양할 때, 재자극 횟수에 따른 자연살해세포의 증식률을 나타낸 그래프이다.Figure 4b is a graph showing the proliferation rate of natural killer cells according to the number of re-stimulation when incubating CD3 (-) cells with HuT78 support cells as seed cells.
도 5a는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 확인 및 순도를 나타낸 그래프이다.5a is a graph showing the identification and purity of natural killer cells obtained after incubating CD56 (+) cells with two support cells for 14 days as seed cells.
도 5b는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 확인 및 순도를 나타낸 그래프이다.Figure 5b is a graph showing the identification and purity of the natural killer cells obtained after culturing the concentrated natural killer cells with two supporting cells for 14 days as seed cells.
도 5c는 시드세포로서 CD3(-) 세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 확인 및 순도를 나타낸 그래프이다.5c is a graph showing the identification and purity of natural killer cells obtained after incubating CD3 (−) cells with two support cells for 14 days as seed cells.
도 5d는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 확인 및 순도를 나타낸 그래프이다.Figure 5d is a graph showing the identification and purity of natural killer cells obtained after incubating CD56 (+) cells with two support cells for 21 days as seed cells.
도 5e는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 확인 및 순도를 나타낸 그래프이다.5E is a graph showing the identification and purity of natural killer cells obtained after 21 days of incubation of concentrated natural killer cells with two support cells as seed cells.
도 5f는 시드세포로서 CD3(-) 세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 확인 및 순도를 나타낸 그래프이다.Figure 5f is a graph showing the identification and purity of natural killer cells obtained after incubating 21 days with CD3 (-) cells as two seed cells with seed cells.
도 6a는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 활성수용체의 발현율을 나타낸 그래프이다.Figure 6a is a graph showing the expression rate of the active receptor of natural killer cells obtained after incubating CD56 (+) cells with two support cells for 14 days as seed cells.
도 6b는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 활성수용체의 발현율을 나타낸 그래프이다.Figure 6b is a graph showing the expression rate of the active receptors of natural killer cells obtained after incubating the concentrated natural killer cells with two support cells for 14 days as seed cells.
도 6c는 시드세포로서 CD3(-) 세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 활성수용체의 발현율을 나타낸 그래프이다.Figure 6c is a graph showing the expression rate of the active receptor of natural killer cells obtained after incubating CD3 (-) cells with two support cells for 14 days as seed cells.
도 6d는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 활성수용체의 발현율을 나타낸 그래프이다.Figure 6d is a graph showing the expression rate of the active receptor of natural killer cells obtained after incubating 21 days CD56 (+) cells with two support cells as seed cells.
도 6e는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 활성수용체의 발현율을 나타낸 그래프이다.6E is a graph showing the expression rate of the active receptors of natural killer cells obtained after 21 days of incubation of concentrated natural killer cells with two support cells as seed cells.
도 6f는 시드세포로서 CD3(-) 세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 활성수용체의 발현율을 나타낸 그래프이다.Figure 6f is a graph showing the expression rate of the active receptors of natural killer cells obtained after 21 days incubation of CD3 (-) cells with two support cells as seed cells.
도 7a는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 K562 세포주에 대한 세포살상능을 나타낸 그래프이다.Figure 7a is a graph showing the cell killing capacity for the K562 cell line of natural killer cells obtained after incubating CD56 (+) cells with two support cells for 14 days as seed cells.
도 7b는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 Huh7 세포주에 대한 세포살상능을 나타낸 그래프이다.Figure 7b is a graph showing the cell killing ability against Huh7 cell line of natural killer cells obtained after incubating CD56 (+) cells with two support cells for 14 days as seed cells.
도 7c는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 HuT78 세포주에 대한 세포살상능을 나타낸 그래프이다.Figure 7c is a graph showing the cell killing capacity of the HuT78 cell line of natural killer cells obtained after incubating CD56 (+) cells with two support cells for 14 days as seed cells.
도 7d는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 K562 세포주에 대한 세포살상능을 나타낸 그래프이다.Figure 7d is a graph showing the cell killing capacity for the K562 cell line of natural killer cells obtained after culturing the concentrated natural killer cells with two support cells for 14 days as seed cells.
도 7e는 시드세포로서 농축 자연살해세포를 두 지지세포와 함께 14일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 Huh7 세포주에 대한 세포살상능을 나타낸 그래프이다.Figure 7e is a graph showing the cell killing ability of Huh7 cell line of natural killer cells obtained after culturing concentrated natural killer cells with two supporting cells for 14 days as seed cells.
도 7f는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 K562 세포주에 대한 세포살상능을 나타낸 그래프이다.Figure 7f is a graph showing the cell killing capacity for the K562 cell line of natural killer cells obtained after incubating CD56 (+) cells with two support cells for 21 days as seed cells.
도 7g는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 Huh7 세포주에 대한 세포살상능을 나타낸 그래프이다.Figure 7g is a graph showing the cell killing capacity of the Huh7 cell line of natural killer cells obtained after incubating CD56 (+) cells with two support cells for 21 days as seed cells.
도 7h는 시드세포로서 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 HuT78 세포주에 대한 세포살상능을 나타낸 그래프이다.Figure 7h is a graph showing the cell killing capacity of the HuT78 cell line of natural killer cells obtained after incubating CD56 (+) cells with two support cells for 21 days as seed cells.
도 7i는 시드세포로서 CD3(-) 세포를 두 지지세포와 함께 21일간 배양한 후 수득한 자연살해세포의 K562 세포주에 대한 세포살상능을 나타낸 그래프이다.Figure 7i is a graph showing the cell killing capacity for the K562 cell line of natural killer cells obtained after 21 days incubation of CD3 (-) cells with two support cells as seed cells.
도 8a는 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포를 HuT78 지지세포와 함께 배양한 후 수득한 자연살해세포와 PBMC 유래의 세포를 HuT78 지지세포와 함께 배양한 후 수득한 자연살해세포를 활성수용체 측면에서 비교한 그래프이다.FIG. 8a shows natural killer cells obtained after culturing cells derived from cord blood mononuclear cells with HuT78 support cells and natural killer cells obtained after culturing PBMC-derived cells with HuT78 support cells in terms of active receptors. It is a graph.
도 8b는 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포를 HuT78 지지세포와 함께 배양한 후 수득한 자연살해세포와 PBMC 유래의 세포를 HuT78 지지세포와 함께 배양한 후 수득한 자연살해세포를 KIR 표현형 측면에서 비교한 그래프이다.FIG. 8B shows that natural killer cells obtained after culturing cells derived from cord blood mononuclear cells with HuT78 support cells and natural killer cells obtained after culturing PBMC-derived cells with HuT78 support cells in terms of KIR phenotype. It is a graph.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본원에서 사용된 용어 "자연살해세포(natural killer cell; NK 세포)"는 혈액과 비장과 같은 림프조직에서 발견되는 선천면역세포 중 하나로서, 암 세포에 대해 선택적인 세포독성을 보이는 세포를 지칭한다. 상기 NK 세포는 다른 면역세포와 달리 상기 세포 표면에 존재하는 다양한 면역수용체를 통해 암세포와 정상세포를 구분함으로써 암세포를 즉각적으로 감지하여 바로 제거한다. As used herein, the term “natural killer cell (NK cell)” is one of the innate immune cells found in lymphoid tissues such as blood and spleen, and refers to a cell that shows selective cytotoxicity against cancer cells. . Unlike other immune cells, the NK cells detect cancer cells immediately by distinguishing cancer cells from normal cells through various immunoreceptors present on the cell surface.
본 발명은 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포를 CD4(+) T 세포와 공배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 제조방법을 제공한다.The present invention provides a method for producing natural killer cells, comprising co-culturing cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom with CD4 (+) T cells.
본원에서 사용된 용어 "제대혈 단핵세포"는 제대혈로부터 수득되는 단핵세포로서, 특히, 본 발명에서 제조하고자 하는 자연살해세포를 함유하는 단핵세포를 지칭한다. 상기 제대혈 단핵세포(MNC)는 자연살해세포를 제조하기 위한 원료인 시드세포(seed cell)로서 기능한다. 상기 제대혈 단핵세포는 제대혈로부터 통상적인 원심분리(예컨대, 피콜 밀도 구배 원심분리)에 의해 수득될 수 있다. As used herein, the term "umbilical cord blood mononuclear cells" refers to mononuclear cells obtained from umbilical cord blood, in particular mononuclear cells containing natural killer cells to be prepared in the present invention. The cord blood mononuclear cells (MNC) function as seed cells, which are raw materials for producing natural killer cells. The cord blood mononuclear cells can be obtained from cord blood by conventional centrifugation (eg, Ficoll density gradient centrifugation).
또한, 본원에서 사용된 용어 "이(제대혈 단핵세포)로부터 유래된 세포"는 제대혈 단핵세포로부터 수득되는 세포의 유형으로서, 특히, 본 발명에서 제조하고자 하는 자연살해세포를 함유하는 세포를 지칭한다. 상기 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포는 자연살해세포를 제조하기 위한 원료인 시드세포(seed cell)로서 기능한다. In addition, as used herein, the term “cell derived from cord blood mononuclear cells” refers to a type of cell obtained from cord blood mononuclear cells, particularly a cell containing natural killer cells to be prepared in the present invention. Cells derived from the cord blood mononuclear cells function as seed cells, which are raw materials for producing natural killer cells.
상기 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포는 제대혈 단핵세포로부터 분리된 CD3(-) 세포, 제대혈 단핵세포로부터 분리된 CD56(+) 세포 및 제대혈 단핵세포로부터 분리된 자연살해세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 제대혈 단핵세포로부터 분리된 CD56(+) 세포 또는 제대혈 단핵세포로부터 분리된 자연살해세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The cells derived from the cord blood mononuclear cells may be selected from the group consisting of CD3 (-) cells isolated from cord blood mononuclear cells, CD56 (+) cells isolated from cord blood mononuclear cells and natural killer cells isolated from cord blood mononuclear cells. Preferably, the cell may be, but is not limited to, CD56 (+) cells isolated from cord blood mononuclear cells or natural killer cells isolated from cord blood mononuclear cells.
본 발명의 방법에 사용되는 CD4(+) T 세포는 자연살해세포를 활성화시키고 선택적으로 대량 증식시키는 지지세포로서 사용된다. CD4 (+) T cells used in the method of the present invention are used as supporting cells that activate and selectively proliferate natural killer cells.
본원에서 사용된 용어 "지지세포(feeder cell, 또는 배양보조세포)"는, 분열증식하지는 못하지만 대사활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 세포의 증식을 돕는 세포를 의미한다. As used herein, the term "feeder cell (or feeder cell)" refers to a cell that does not proliferate but has metabolic activity and thus produces various metabolites to help proliferate a target cell.
상기 CD4(+) T 세포는 HuT78 세포, H9 세포, Loucy 세포, Molt3 세포, Molt-13 세포, PEER 세포, RPMI8402 세포 및 TALL-01 세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 CD4(+) T 세포는 CD4(+)를 발현하는 T 림포마일 수 있으며, 상기 CD4(+)를 발현하는 T 림포마는 바람직하게는 HuT78 세포일 수 있다. 상기 HuT78 세포는 자연살해세포를 선택적으로 증식시켜 자연살해세포의 증식률 및 세포 살상능을 증가시킬 수 있다. The CD4 (+) T cells may be selected from the group consisting of HuT78 cells, H9 cells, Loucy cells, Molt3 cells, Molt-13 cells, PEER cells, RPMI8402 cells and TALL-01 cells. In addition, the CD4 (+) T cells may be T lymphomas expressing CD4 (+), and the T lymphomas expressing CD4 (+) may preferably be HuT78 cells. The HuT78 cells can selectively propagate natural killer cells to increase the proliferation rate and cell killing ability of natural killer cells.
상기 CD4(+) T 세포는 분열증식이 억제된 불활성화 세포이거나 안정성 확보를 위해 분열증식이 억제된 불활성화 세포일 수 있다. 세포를 불활성화시키는 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용하여도 무방하며, 예를 들어 감마선(gamma-ray)을 조사하는 방법이 사용될 수 있다. 활성화 CD4(+) T 세포를 사용할 경우, 대부분의 종양세포들이 활성화된 자연살해세포에 의해 배양 중에 사멸될 수 있기 때문에 불활성화한 CD4(+) T 세포에 한정하는 것은 아니다.The CD4 (+) T cells may be inactivated cells with dividing proliferation inhibited or inactivated cells with dividing proliferation inhibited to ensure stability. As a method of inactivating the cells, conventional methods known in the art may be used. For example, a method of irradiating gamma-rays may be used. When using activated CD4 (+) T cells, most tumor cells are not limited to inactivated CD4 (+) T cells because they can be killed in culture by activated natural killer cells.
본 발명에 따른 자연살해세포의 제조는 전술한 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포를 동물세포 배양용 배지에서 CD4(+) T 세포와 공배양함으로써 수행된다. The production of natural killer cells according to the present invention is carried out by co-culturing the cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom with CD4 (+) T cells in an animal cell culture medium.
상기 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포와 CD4(+) T 세포는 1:1 내지 1:20의 비율의 세포수로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1:5의 비율의 세포수로 혼합될 수 있다. The cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom and CD4 (+) T cells may be mixed in a cell number ratio of 1: 1 to 1:20, preferably in a cell number ratio of 1: 5. Can be.
또한, 상기 배양은 5 내지 60일간, 바람직하게는 14 내지 21일간 수행될 수 있다. In addition, the culture may be performed for 5 to 60 days, preferably 14 to 21 days.
또한, 상기 동물세포 배양용 배지의 예로는 AIM-V media, RIMI1640, CellGro SCGM, X-VIVO20, IMDM 및 DMEM을 들 수 있다. 상기 배양용 배지는 T 세포에 저친화성(low affinity)을 가지며 T 세포를 자극하는 항체, 인터루킨 단백질 및 혈장 또는 혈청을 함유할 수 있다. In addition, examples of the animal cell culture medium include AIM-V media, RIMI1640, CellGro SCGM, X-VIVO20, IMDM and DMEM. The culture medium may contain antibodies, interleukin proteins, and plasma or serum that have low affinity for T cells and stimulate T cells.
상기 T 세포에 저친화성을 가지며 T 세포를 자극하는 항체란 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)와 회합하여 항원인식복합체를 형성하는 분자군인 CD3 항원에 특이적으로 반응하는 단백질로서, OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 OKT3일 수 있다. An antibody that has low affinity for T cells and stimulates T cells is a protein that specifically reacts with the CD3 antigen, a group of molecules that associate with T cell receptors (TCRs) to form antigen recognition complexes, and includes OKT3 and UCHT1. And it may be selected from the group consisting of HIT3a, preferably may be OKT3.
상기 인터루킨(interleukin, IL) 단백질이란 림프구나 단구 및 대식세포 등 면역담당세포가 생산하는 단백질성 생물 활성물질로서, 사이토카인(cytokine) 내 하나의 분자종을 의미한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 인터루킨 단백질은 IL-2, IL-15, IL-12, IL-18 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인터루킨 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 IL-2 또는 IL-2와 IL-15의 혼합일 수 있다. The interleukin (IL) protein is a proteinaceous biologically active substance produced by immunoreactive cells such as lymphocytes, monocytes, and macrophages, and means one molecular species in cytokines. The interleukin protein that may be used in the present invention may be one or more interleukin proteins selected from the group consisting of IL-2, IL-15, IL-12, IL-18 and IL-21, preferably IL-2 or IL May be a mixture of -2 and IL-15.
상기 혈장 또는 혈청은 림프구의 증식을 지지하는 역할을 하며, 그 예로는 사람 혈장(human plasma), 소태아혈청(fetal bovine serum), 송아지혈청(bovine calf serum), 말혈청(horse serum), 혈소판 용해물(platelet lysate) 등을 들 수 있다.The plasma or serum serves to support the proliferation of lymphocytes, and examples thereof include human plasma, fetal bovine serum, bovine calf serum, horse serum, and platelets. Platelet lysate, and the like.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 동물세포 배양용 배지는 T 세포에 저친화성을 가지며 T 세포를 자극하는 항체로서 OKT3, 인터루킨 단백질로서 IL-2와 IL-15, 및 혈장 또는 혈청으로서 소태아혈청(FBS)을 포함할 수 있다. 상기 OKT3는 배지 중에 0.1~100 ng/mL, 바람직하게는 10 ng/mL의 농도로 포함될 수 있고, 상기 IL-2는 배지 중에 10~2000 U/mL, 바람직하게는 1000 U/mL의 농도로 포함될 수 있으며, IL-15는 배지 중에 1~100 ng/mL, 바람직하게는 10 ng/mL의 농도로 포함될 수 있고, 상기 FBS는 배지 중에 1~30%(volume/volume), 바람직하게는 10%(volume/volume)의 농도로 포함될 수 있다. In a preferred embodiment of the present invention, the medium for animal cell culture has low affinity for T cells and OKT3 as an antibody stimulating T cells, IL-2 and IL-15 as interleukin proteins, and fetal bovine serum as plasma or serum ( FBS). The OKT3 may be included in the medium at a concentration of 0.1-100 ng / mL, preferably 10 ng / mL, and the IL-2 is in the medium at a concentration of 10-2000 U / mL, preferably 1000 U / mL. IL-15 may be included in the medium at a concentration of 1-100 ng / mL, preferably 10 ng / mL, and the FBS is 1-30% (volume / volume), preferably 10 It may be included at a concentration of% (volume / volume).
본 발명에 따른 자연살해세포의 제조방법은 상기 배양 동안 배지에 CD4(+) T 세포를 더 첨가하여 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포를 재자극할 수 있다.The method for producing natural killer cells according to the present invention may further re-stimulate cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom by further adding CD4 (+) T cells to the medium during the culture.
본원에서 사용된 용어 "재자극"은 일정 배양 시간이 경과한 후, 배지에 CD4(+) T 세포 및 선택적으로 T 세포에 저친화성을 가지며 T 세포를 자극하는 항체를 다시 첨가하여 자연살해세포 증식을 재유도하는 것을 의미한다.As used herein, the term "re-stimulation" refers to the propagation of natural killer cells after the incubation time has elapsed by the addition of a low affinity to CD4 (+) T cells and optionally T cells and stimulating T cells in the medium. It means to reinduce it.
상기 재자극에 사용되는 CD4(+) T 세포는 배양 초기에 첨가된 CD4(+) T 세포와 동일하거나 상이할 수 있으나, 동일한 것이 바람직하다. 상기 재자극에 사용되는 CD4(+) T 세포는 CD4(+)를 발현하는 T 림포마, 바람직하게는 HuT78일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 분열증식이 억제된 불활성화된 세포 또는 불활성화시키지 않은 세포가 이용될 수 있다. 또한, 상기 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포와 CD4(+) T 세포는 1:1 내지 1:20의 비율의 세포수로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1:5의 비율의 세포수로 혼합되어 자연살해세포를 재자극할 수 있다. 상기 재자극은 배양 0일째 시작하여 5 내지 12일 간격으로 1회 이상 반복될 수 있으며, 바람직하게는 7일 간격으로 1회 이상 반복될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 세포는 마지막 자극 후 5일째 수득될 수 있으며, 바람직하게는 14일째 수득될 수 있으나, 이 또한 제한되는 것은 아니다.The CD4 (+) T cells used for the restimulation may be the same as or different from the CD4 (+) T cells added at the beginning of the culture, but the same is preferable. The CD4 (+) T cells used for the restimulation may be T lymphomas, preferably HuT78, which express CD4 (+), but are not limited thereto. Not cells may be used. In addition, the cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom and CD4 (+) T cells can be mixed in a cell number of the ratio of 1: 1 to 1:20, preferably in a cell number of the ratio of 1: 5 Can be mixed to re-stimulate natural killer cells. The re-stimulation may be repeated one or more times at intervals of 5 to 12 days starting on day 0 of the culture, preferably may be repeated one or more times at intervals of 7 days, but is not limited thereto. In addition, cells may be obtained 5 days after the last stimulus, preferably 14 days, but this is also not limiting.
상기 재자극은 T 세포에 저친화성을 가지며 T 세포를 자극하는 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 수행될 수 있다. 상기 T 세포에 저친화성을 가지며 T 세포를 자극하는 항체는 OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 OKT3일 수 있다. 또한, 상기 인터루킨 단백질은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인터루킨 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 IL-2 또는 IL-2와 IL-15의 혼합일 수 있다.The restimulation may be performed in a medium containing an antibody and interleukin proteins that have low affinity for T cells and stimulate T cells. The antibody having low affinity for the T cells and stimulating the T cells may be selected from the group consisting of OKT3, UCHT1, and HIT3a, preferably OKT3. In addition, the interleukin protein may be one or more interleukin proteins selected from the group consisting of IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, and IL-21, preferably IL-2 or IL-2 and May be a mixture of IL-15.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 수득된 자연살해세포를 제공한다.The present invention also provides natural killer cells obtained by the above method.
상기 자연살해세포는 종래의 제대혈 MNC 및 PBMC를 지지세포로 사용하여 배양한 경우보다 CD16, NKG2D, NKp30, NKp44 및 NKp46과 같은 활성화 수용체의 발현이 높아 종양 세포주에 대한 살해능이 증가하므로, 탁월한 항암 효과를 기대할 수 있다. The natural killer cells have higher expression of activating receptors such as CD16, NKG2D, NKp30, NKp44, and NKp46 than those of cultured cells using conventional cord blood MNC and PBMC as support cells, thereby increasing the killing ability against tumor cell lines. You can expect.
따라서, 상기 자연살해세포는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서 이용될 수 있다. 상기 암 또는 감염성 질환의 예로는 백혈병, 간암, 폐암, 위암, 흑색종암, 난소암, 유방암, 뇌종양, 신장암, 에이즈 및 만성 C형 간염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Therefore, the natural killer cells can be used as a composition for preventing or treating cancer or infectious diseases. Examples of the cancer or infectious disease may include, but are not limited to, leukemia, liver cancer, lung cancer, gastric cancer, melanoma cancer, ovarian cancer, breast cancer, brain tumor, kidney cancer, AIDS and chronic hepatitis C.
나아가, 본 발명은 상기 자연살해세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.Furthermore, the present invention provides a method for preventing or treating cancer or infectious disease, comprising administering the natural killer cells to a subject.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 본 발명에 따른 자연살해세포의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택가능하다. 또한, 상기 자연살해세포는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여될 수 있다.The subject may be a mammal, specifically a human. Routes and dosages of natural killer cells according to the present invention can be administered to the subject in a variety of ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence of side effects, the optimal method of administration and dosage is selected in the appropriate range by those skilled in the art It is possible. In addition, the natural killer cells may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances whose therapeutic effects are known for the disease to be treated.
이하, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.　하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로써, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples. The following examples are intended to illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited by the following examples.
실시예Example 1:  One: 자연살해세포의Natural killer 제조를 위한 시드세포  Seed Cells for Manufacturing 및 지지세포And supporting cells 의 준비Preparation
<1-1> 자연살해세포의 제조를 위한 시드세포(seed cell)의 준비<1-1> Preparation of seed cells for the production of natural killer cells
본 발명에서 사용된 제대혈은 연구용 제대혈로, 서울특별시 제대혈 은행으로부터 제공받았다.Umbilical cord blood used in the present invention was provided from the Umbilical Cord Blood Bank of Seoul, Seoul.
자연살해세포의 제조를 위한 시드세포로서, 제대혈 단핵세포로부터 분리한 CD3(-) 세포, CD56(+) 세포 및 농축된(enriched) 자연살해세포를 각각 준비하였다. As seed cells for the preparation of natural killer cells, CD3 (−) cells, CD56 (+) cells and enriched natural killer cells isolated from cord blood mononuclear cells were prepared, respectively.
먼저, 연구용 제대혈 백(bag)으로부터 피콜(Ficoll-Paque Plus, GE Healthcare, 17-1440-03)을 사용하여 피콜 밀도 구배 원심분리(ficoll density gradient centrifugation) 방법을 통해 제대혈 단핵세포(mononuclear cell, MNC)를 분리한 후 ADAM 세포 계수기 시스템(ADAM cell counter system, 나노엔텍)을 사용하여 세포수를 측정하였다. First, umbilical cord blood mononuclear cells (MNC) using Ficoll density gradient centrifugation method using Ficoll-Paque Plus, GE Healthcare, 17-1440-03, from a umbilical cord blood bag ) Was isolated and the cell number was measured using an ADAM cell counter system (ADAM cell counter system, NanoEntech).
이후, 상기 제대혈 단핵세포로부터 CD3(-) 세포, CD56(+) 세포 및 농축된 자연살해세포를 수득하기 위해 상기 제대혈 단핵세포를 각각 6x106(cell), 5x107(cell) 및 5x107(cell)씩 새로운 50 mL 튜브로 옮긴 후 1,200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 하였다. Then, the cord blood mononuclear cells were 6x10 6 (cell), 5x10 7 (cell) and 5x10 7 (cell) to obtain CD3 (-) cells, CD56 (+) cells and concentrated natural killer cells from the cord blood mononuclear cells. ) Was transferred to a new 50 mL tube and centrifuged at 1,200 rpm and 4 ° C for 10 minutes.
CD3(-) 세포를 얻기 위하여, 6x106(cell)의 단핵세포 펠렛에 48 μL의 MACS 런닝 버퍼(running buffer, 0.5 부피% FBS, 2mM EDTA를 포함한 PBS)와 12 μL의 CD3 자기비드(Miltenyi biotec, 130-050-101)를 넣고 4℃에서 20분간 반응시켰다. 1 ~ 2 mL의 MACS 런닝 버퍼를 넣어 세척한 뒤 1350 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고 다시 0.5 mL의 MACS 런닝 버퍼에 현탁하였다. VarioMACS 분리기(Miltenyi Biotec)에 CS 컬럼(Miltenyi Biotec, 130-041-305)을 장착하여 세포를 분리하고, 최종 15 mL이 될 때까지 MACS 런닝 버퍼로 컬럼을 세척하여 세포를 회수하였다. ADAM 세포 계수기 시스템을 사용하여 세포수를 측정한 후 1,350 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고 1x106 세포/mL의 농도가 되도록 세포 펠렛을 10 부피% 소태아혈청(FBS, Gibco, 16000-044)이 포함된 CellGro 배지에 현탁하였다. To obtain CD3 (−) cells, 48 μL of MACS running buffer (0.5 volume% FBS, PBS with 2 mM EDTA) and 12 μL of CD3 magnetic beads (Miltenyi biotec) were placed in 6 × 10 6 (monocyte) mononuclear cell pellets. , 130-050-101) was added and reacted at 4 ° C. for 20 minutes. After washing with 1 ~ 2 mL of MACS running buffer and centrifuged for 10 minutes at 1350 rpm, 4 ℃ and suspended again in 0.5 mL of MACS running buffer. Cells were separated by mounting a CS column (Miltenyi Biotec, 130-041-305) in a VarioMACS separator (Miltenyi Biotec), and the cells were recovered by washing the column with MACS running buffer until the final 15 mL. After measuring the number of cells using the ADAM cell counter system, centrifuge for 10 minutes at 1,350 rpm, 4 ° C, and prepare the cell pellet in 10% by volume fetal bovine serum (FBS, Gibco, 16000-044) to a concentration of 1x10 6 cells / mL. ) Was suspended in CellGro medium.
CD56(+) 세포를 얻기 위하여, 5x107(cell)의 단핵세포 펠렛에 400 μL의 MACS 런닝 버퍼와 100 μL의 CD56 자기비드(Mitenyi Biotec, 130-050-401)를 넣고 4℃에서 15분간 반응시켰다. 10~20 mL의 MACS 런닝 버퍼를 넣어 세척한 뒤 1350 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고 펠렛을 다시 0.5 mL의 MACS 런닝 버퍼에 현탁하였다. MACS MultiStand(Miltenyi Biotec, 130-042-303)에 MS 컬럼(Miltenyi Biotec, 130-042-201)을 장착한 후 현탁액을 흘려주었다. 0.5 mL의 MACS 런닝버퍼로 3회 세척한 후 1 mL의 MACS 런닝버퍼로 세포를 회수하여 ADAM 세포 계수기 시스템을 사용하여 세포수를 측정하였다. 그 후, 1,350 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고 1x106 세포/mL의 농도가 되도록 세포 펠렛을 10 부피% 소태아혈청이 포함된 CellGro 배지에 현탁하였다.To obtain CD56 (+) cells, 400 μL of MACS running buffer and 100 μL of CD56 magnetic beads (Mitenyi Biotec, 130-050-401) were added to 5 × 10 7 (monocyte) mononuclear cell pellet and reacted at 4 ° C. for 15 minutes. I was. After washing with 10-20 mL of MACS running buffer, centrifuged for 10 minutes at 1350 rpm, 4 ℃ and the pellet was again suspended in 0.5 mL of MACS running buffer. MS column (Miltenyi Biotec, 130-042-201) was mounted on MACS MultiStand (Miltenyi Biotec, 130-042-303) and the suspension was flowed. After washing three times with 0.5 mL of the MACS running buffer, the cells were collected with 1 mL of the MACS running buffer, and the cell number was measured using an ADAM cell counter system. Thereafter, the cells were centrifuged at 1,350 rpm and 4 ° C. for 10 minutes and the cell pellet was suspended in CellGro medium containing 10% by volume fetal bovine serum to a concentration of 1 × 10 6 cells / mL.
농축된 자연살해세포를 얻기 위하여, 5x107(cell)의 단핵세포 펠렛에 200 μL의 MACS 런닝 버퍼와 50 μL의 자연살해세포 바이오틴 항체(NK cell Biotin-Antibody Cocktail: Miltenyi Biotec, 130-092-657)를 넣고 4℃에서 5분간 반응시켰다. 이후, 150 μL의 MACS 런닝 버퍼와 100 μL의 자연살해세포 자기비드(NK cell MicroBead Cocktail: Miltenyi Biotec, 130-092-657)를 넣고 4℃에서 10분간 추가로 반응시켰다. VarioMACS 분리기에 LS 컬럼(Miltenyi Biotec, 130-041-306)을 장착하여 세포를 분리하고, 최종 15 mL이 될 때까지 MACS 런닝 버퍼로 컬럼을 세척하여 세포를 회수하였다. ADAM 세포 계수기 시스템을 사용하여 세포수를 측정한 후 1,350 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하고, 1x106 세포/mL의 농도가 되도록 세포 펠렛을 10 부피% 소태아혈청이 포함된 CellGro 배지에 현탁하였다. To obtain concentrated natural killer cells, 200 μL MACS running buffer and 50 μL NK cell Biotin-Antibody Cocktail: Miltenyi Biotec, 130-092-657 in 5 × 10 7 (cell) mononuclear cell pellets ) Was added and reacted at 4 ° C. for 5 minutes. Then, 150 μL of MACS running buffer and 100 μL of natural killer cell magnetic beads (NK cell MicroBead Cocktail: Miltenyi Biotec, 130-092-657) were added and further reacted at 4 ° C. for 10 minutes. Cells were separated by mounting an LS column (Miltenyi Biotec, 130-041-306) in a VarioMACS separator and cells were recovered by washing the column with MACS running buffer until the final 15 mL. After measuring the cell number using the ADAM cell counter system, centrifuge at 1,350 rpm, 4 ° C for 10 minutes, and suspend the cell pellet in CellGro medium containing 10% by volume fetal bovine serum to a concentration of 1x10 6 cells / mL. It was.
<1-2> 자연살해세포의 제조를 위한 지지세포(feeder cell)의 준비<1-2> Preparation of feeder cells for the production of natural killer cells
자연살해세포의 제조를 위한 지지세포로서, PBMC 및 HuT78 세포를 준비하였다.As support cells for the production of natural killer cells, PBMC and HuT78 cells were prepared.
건강한 공여자로부터 채취한 말초혈 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 50 mL 튜브로 옮기고, 1%의 FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 20 mL의 PBS(phosphate buffered saline)로 현탁하여 1,200 rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리하였다. PBMC 펠렛을 10 mL MACS 런닝 버퍼에 현탁하고, ADAM 세포 계수기 시스템을 사용하여 세포 수를 측정하였다. PBMC 지지세포 1x107(cell)을 새로운 50 mL 튜브로 옮긴 후 1,200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 하였다. 이후, 펠렛을 10 부피% 소태아혈청이 포함된 CellGro 배지 2 mL에 현탁한 뒤, 감마선 조사기에서 2000 cGy로 조사하여 PBMC를 준비하였다.Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from healthy donors were transferred to 50 mL tubes, suspended in 20 mL of PBS (phosphate buffered saline) containing 1% of fetal bovine serum (FBS) at 1,200 rpm. , Centrifuged at 4 ° C. for 10 minutes. PBMC pellets were suspended in 10 mL MACS running buffer and cell number was measured using an ADAM cell counter system. PBMC support cells 1x10 7 (cell) was transferred to a new 50 mL tube and centrifuged at 1,200 rpm and 4 ° C for 10 minutes. Thereafter, the pellet was suspended in 2 mL of CellGro medium containing 10% by volume fetal bovine serum, and then irradiated with 2000 cGy in a gamma irradiator to prepare PBMC.
림포마세포주 HuT78(ATCC, CRM-TIB-161)을 배양 플라스크에서 회수하여 1,200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리한 후, 펠렛을 10 부피% 소태아혈청이 포함된 CellGro 배지 2 mL에 현탁하고 감마선 조사기에서 20,000 cGy로 조사하여 불활성화시켜 HuT78 세포를 준비하였다.Lymphoma cell line HuT78 (ATCC, CRM-TIB-161) was recovered from the culture flask, centrifuged at 1,200 rpm, 4 ° C for 10 minutes, and the pellet was suspended in 2 mL of CellGro medium containing 10% by volume fetal bovine serum. HuT78 cells were prepared by inactivation by gamma irradiation at 20,000 cGy.
실시예Example 2: 다양한 시드세포  2: various seed cells 및 지지세포And supporting cells 를 이용한 Using 자연살해세포의Natural killer 제조 Produce
하기 표 1에 기재된 시드세포 및 지지세포를 이용하여 자연살해세포를 제조하였다.Natural killer cells were prepared using the seed cells and supporting cells described in Table 1 below.
시드세포Seed cell 지지세포Support cell 지지세포 자극 시기Support cell stimulation period 배양기간 Incubation period
조건 1Condition 1 CD56(+)CD56 (+) PBMC, HuT78PBMC, HuT78 D0D0 14일14 days
조건 2Condition 2 농축 자연살해세포Enriched natural killer cells PBMC, HuT78PBMC, HuT78 D0D0 14일14 days
조건 3Condition 3 CD3(-)CD3 (-) PBMC, HuT78PBMC, HuT78 D0D0 14일14 days
조건 4Condition 4 CD56(+)CD56 (+) PBMC, HuT78PBMC, HuT78 D0, D7D0, D7 21일 21st
조건 5Condition 5 농축 자연살해세포Enriched natural killer cells PBMC, HuT78PBMC, HuT78 D0, D7D0, D7 21일21st
조건 6Condition 6 CD3(-)CD3 (-) PBMC, HuT78PBMC, HuT78 D0, D7D0, D7 21일21st
조건 7Condition 7 CD56(+)CD56 (+) HuT78HuT78 D0, D10D0, D10 21일21st
조건 8Condition 8 농축 자연살해세포Enriched natural killer cells PBMC, HuT78PBMC, HuT78 D0, D7, D14D0, D7, D14 26일26 days
조건 9Condition 9 CD3(-)CD3 (-) PBMC, HuT78PBMC, HuT78 D0, D7, D14D0, D7, D14 26일26 days
<2-1> 14일 배양조건<2-1> 14 days culture condition
자연살해세포 배양시 1,000 IU/mL의 IL-2(Norvartis, CA2671BX) 또는 IL-2와 10 ng/mL의 IL-15(R&D System, 248-IL-025), 및 10 ng/mL의 OKT3(eBioscience, 16-0037-82)를 배양 용기에 넣은 다음, 배양 0일째 시드세포와 지지세포를 1:5의 비율로 0.25~1 mL을 넣었다. 여기에 10 부피% FBS 또는 1 부피% 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지 0.25~1 mL을 넣어 37℃ 인큐베이터에서 3~5일간 정치 배양하였다(조건 1, 2 및 3).1,000 IU / mL IL-2 (Norvartis, CA2671BX) or 10-2 ng / mL IL-15 (R & D System, 248-IL-025), and 10 ng / mL OKT3 in natural killer cell cultures. eBioscience, 16-0037-82) was placed in a culture vessel, and then 0.25-1 mL of seed and support cells were added at a ratio of 1: 5 on day 0 of culture. To this, 0.25-1 mL of CellGro medium containing 10% by volume FBS or 1% by volume human plasma was added and cultured in a 37 ° C. incubator for 3 to 5 days (conditions 1, 2 and 3).
상기 표 1의 조건 1, 2 및 3 모두, 배양 3~5일째에 세포 수를 측정하여 약 2~5x105 세포/mL이 되도록 1,000 IU/mL의 IL-2 단독 또는 상기 IL-2와 10 ng/mL의 IL-15의 혼합물, 및 10 부피% FBS가 포함된 CellGro 배지로 희석한 후, 적절한 배양 용기에 넣어 다시 정치 배양하였다. 이후, 2~3일 간격으로 세포 수를 측정하고 5~10x105 세포/mL이 되도록 1,000 IU/mL의 IL-2 또는 상기 IL-2와 10 ng/mL의 IL-15의 혼합물, 및 10 부피% FBS 또는 1 부피% 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석한 후, 14일까지 부유 배양하여 증식된 자연살해세포를 수득하였다.In conditions 1, 2 and 3 of Table 1, 1,000 IU / mL of IL-2 alone or 10 ng of IL-2 was measured so that the number of cells was measured on the 3rd to 5th day of culture to be about 2 to 5x10 5 cells / mL. Diluted with a mixture of / mL of IL-15, and CellGro medium containing 10% by volume FBS, and then placed in an appropriate culture vessel and again incubated. Thereafter, measure the number of cells at intervals of 2 to 3 days and mix 1,000 IU / mL of IL-2 or a mixture of IL-2 and 10 ng / mL of IL-15 to give 5-10 × 10 5 cells / mL, and 10 volumes. After dilution with CellGro medium containing% FBS or 1% by volume human plasma, the cells were suspended in culture for up to 14 days to obtain proliferated natural killer cells.
상기 표 1의 조건 1에 의해 배양된 자연살해세포의 증식률을 비교한 결과, 총 세포수(total nucleated cells, TNC) 기준 증식률은 지지세포의 종류에 따라 PBMC 63.0배 및 HuT78 296.6배로서 HuT78이 월등히 높은 증식률을 보여주었다. 총 세포 중 자연살해세포 증식률은 지지세포의 종류에 따라 PBMC 25.9배, HuT78 321.7배였으며 HuT78 지지세포로 증식시킨 경우, PBMC 지지세포로 증식시킨 경우에 비해 12배 이상 높은 증식률을 보였다(표 2, 도 1a).As a result of comparing the proliferation rate of natural killer cells cultured under the condition 1 of Table 1, the total proliferation rate based on total nucleated cells (TNC) was 63.0 times PBMC and 296.6 times HuT78, depending on the type of supporting cells. It showed a high proliferation rate. The percentage of natural killer cell proliferation among total cells was 25.9 times PBMC and 321.7 times HuT78, depending on the type of support cells. The growth rate of HuT78 support cells was 12 times higher than that of PBMC support cells (Table 2, 1a).
또한, 상기 표 1의 조건 2에 의해 배양된 자연살해세포의 증식률을 비교한 결과, 총 세포 수를 기준으로 지지세포의 종류에 따라 PBMC 58.4배 및 HuT78 145.7배로서 HuT78이 월등히 높은 증식률을 보여주었다. 총 세포 중 자연살해세포 증식률은 지지세포의 종류에 따라 PBMC 55.7배, HuT78 197.5배였으며 HuT78 지지세포로 증식시킨 경우, PBMC 지지세포로 증식시킨 경우에 비해 3배 이상 높은 증식률을 보였다(표 3, 도 1b).In addition, as a result of comparing the proliferation rate of natural killer cells cultured under the condition 2 of Table 1, HuT78 showed a significantly higher proliferation rate as PBMC 58.4 times and HuT78 145.7 times according to the type of supporting cells based on the total number of cells. . The percentage of natural killer cell proliferation among the total cells was 55.7 times PBMC and 197.5 times HuT78, depending on the type of support cell. The growth rate of HuT78 support cells was 3 times higher than that of PBMC support cells (Table 3, 1b).
아울러, 상기 표 1의 조건 3에 의해 배양된 자연살해세포의 증식률을 비교한 결과, 총 세포수 기준 증식률은 지지세포의 종류에 따라 PBMC 34.2배 및 HuT78 115.1배로서 HuT78이 월등히 높은 증식률을 보여주었다. 총 세포 중 자연살해세포 증식률은 지지세포의 종류에 따라 PBMC 91.5배, HuT78 334.7배였으며 HuT78 지지세포로 증식시킨 경우 PBMC에 비해 3배 이상 높은 증식률을 보였다(표 4, 도 1c).In addition, as a result of comparing the proliferation rate of the natural killer cells cultured under the condition 3 of Table 1, the proliferation rate based on the total cell number was 34.2 times PBMC and 115.1 times HuT78 according to the type of supporting cells, showing that HuT78 showed a significantly higher proliferation rate. . Natural killer cell proliferation rate of total cells was 91.5 times PBMC and 334.7 times HuT78, depending on the type of support cells. When proliferated with HuT78 support cells, the proliferation rate was 3 times higher than that of PBMC (Table 4, FIG. 1C).
<2-2> 21일 배양의 재자극 조건<2-2> Restimulation conditions of 21 days culture
자연살해세포 배양시 1,000 IU/mL의 IL-2 또는 상기 IL-2와 10 ng/mL의 IL-15의 혼합물, 및 10 ng/mL의 OKT3를 배양 용기에 넣은 다음, 배양 0일째 다양한 시드세포와 지지세포를 1:5의 비율로 하고, 10 부피% FBS 또는 1 부피% 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지를 넣어 37℃ 인큐베이터에서 정치 배양하였다. 배양 3~5일째에 세포 수를 측정하여 약 2~10x105 세포/mL이 되도록 1,000 IU/mL의 IL-2 또는 상기 IL-2와 10 ng/mL의 IL-15의 혼합물, 및 10 부피% FBS가 포함된 CellGro 배지로 희석한 후, 적절한 배양 용기에 넣어 다시 정치 배양하였다.In culture of natural killer cells, 1,000 IU / mL of IL-2 or a mixture of IL-2 and 10 ng / mL of IL-15, and 10 ng / mL of OKT3 were placed in a culture vessel, followed by various seed cells on day 0 of culture. And the supporting cells in a ratio of 1: 5, and added CellGro medium containing 10% by volume FBS or 1% by volume of human plasma and cultured in a 37 ℃ incubator. Measure the number of cells on the 3rd to 5th day of culture to obtain about 2-10 x 10 5 cells / mL of 1,000 IU / mL of IL-2 or a mixture of IL-2 and 10 ng / mL of IL-15, and 10% by volume After diluting with CellGro medium containing FBS, it was placed in an appropriate culture vessel and cultured again.
지지세포의 재자극은, 배양 0일째 사용한 지지세포를 동일하게 사용하였고 배양 7일째에 시드세포와 지지세포의 비율은 주로 1:5로 하였다(조건 4, 5 및 6). 다만, 배양 7일째에 재자극 비율 실험에서는 시드세포와 지지세포의 비율을 1:1, 1:3 또는 1:5로 하였다(도 2a). 재자극 시기 실험에서는 배양 7 또는 10일째에 재자극하였다(도 2b). 재자극은 배양 중인 자연살해세포수를 측정하고 세포 수를 기준으로 2~5x105 세포/mL이 되도록 10 부피% FBS 또는 1 부피% 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석한 뒤, 다양한 지지세포를 해당 배수에 맞게 준비하였다. 1,000 IU/mL의 IL-2 또는 상기 IL-2와 10 ng/mL의 IL-15의 혼합물, 및 10 ng/mL의 OKT3를 배양 용기에 추가하고 10 부피% FBS 또는 1 부피% 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지를 넣은 후 3일간 정치 배양하였다. 이후, 2~3일 간격으로 세포 수를 측정하여 5~10x105 세포/mL이 되도록 1,000 IU/mL의 IL-2 또는 상기 IL-2와 10 ng/mL의 IL-15의 혼합물, 및 10 부피% FBS 또는 1 부피% 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하며 20~22일까지 부유 배양하여 증식된 자연살해세포를 수득하였다.Restimulation of the support cells was performed using the same support cells used on day 0 of culture, and the ratio of seed cells and support cells was 1: 5 on day 7 of culture (conditions 4, 5 and 6). However, in the re-stimulation ratio experiment on the 7th day of culture, the ratio of seed cells and supporting cells was 1: 1, 1: 3, or 1: 5 (FIG. 2A). Restimulation timing experiments were restimulated on day 7 or 10 of the culture (FIG. 2B). Restimulation was performed by measuring the number of natural killer cells in culture and diluting them with CellGro medium containing 10% by volume FBS or 1% by volume of human plasma to 2-5x10 5 cells / mL based on the number of cells. It was prepared for the corresponding drainage. Add 1,000 IU / mL of IL-2 or a mixture of IL-2 and 10 ng / mL of IL-15, and 10 ng / mL of OKT3 to the culture vessel and contain 10 volume% FBS or 1 volume% human plasma After putting the CellGro medium was incubated for 3 days. Thereafter, the number of cells measured at intervals of 2 to 3 days was measured to be 1,000 IU / mL of IL-2 or a mixture of IL-2 and 10 ng / mL of IL-15 such that 5-10 × 10 5 cells / mL was obtained, and 10 volumes. Diluted with CellGro medium containing% FBS or 1% by volume human plasma was suspended in culture for 20-22 days to obtain proliferated natural killer cells.
상기 표 1의 조건 4에 의해 배양된 자연살해세포의 증식률을 비교한 결과, 총 세포수 기준 증식률은 지지세포의 종류에 따라 PBMC 1,102.2배 및 HuT78 1,416.7배로서 HuT78이 월등히 높은 증식률을 보여주었다. 총 세포수 중 자연살해세포 증식률은 지지세포의 종류에 따라 PBMC 72.3배, HuT78 1,586.1배였으며 HuT78 지지세포로 증식시킨 경우가 PBMC 지지세포로 증식시킨 경우에 비해 약 21배 이상 높은 증식률을 보였다(표 5, 도 1d).As a result of comparing the proliferation rate of the natural killer cells cultured by the condition 4 of Table 1, the proliferation rate based on the total cell number was PBMC 1,102.2 times and HuT78 1,416.7 times according to the type of supporting cells, showing that HuT78 showed a significantly higher proliferation rate. Natural killer cell proliferation rate of total cell number was PBMC 72.3 times and HuT78 1,586.1 times according to the type of supporting cells, and the growth rate of HuT78 supporting cells was 21 times higher than that of PBMC supporting cells. 5, FIG. 1D).
또한, 상기 표 1의 조건 5에 의해 배양된 자연살해세포의 증식률을 비교한 결과, 총 세포수를 기준으로 지지세포의 종류에 따라 PBMC 357.5배 및 HuT78 1,105.0배로서 HuT78이 월등히 높은 증식률을 보여주었다. 총 세포수 중 자연살해세포 증식률은 지지세포의 종류에 따라 PBMC 541.2배, HuT78 1,547.3배였으며 HuT78 지지세포로 증식시킨 경우가 PBMC 지지세포로 증식시킨 경우에 비해 약 2.8배 이상 높은 증식률을 보였다(표 6, 도 1e).In addition, as a result of comparing the proliferation rate of natural killer cells cultured under the condition 5 of Table 1, HuT78 showed an extremely high proliferation rate as PBMC 357.5 times and HuT78 1,105.0 times according to the type of support cells based on the total cell number . The percentage of natural killer cell proliferation among the total cell number was PBMC 541.2 times and HuT78 1,547.3 times depending on the type of supporting cells, and the growth rate of HuT78 support cells was about 2.8 times higher than that of PBMC support cells. 6, FIG. 1E).
상기 표 1의 조건 6에 의해 배양된 자연살해세포의 증식률을 비교한 결과, 총 세포수 기준 증식률은 지지세포의 종류에 따라 PBMC 1,797.2배 및 HuT78 3,991.7배로서 HuT78이 월등히 높은 증식률을 보여주었다. 총 세포수 중 자연살해세포 증식률은 지지세포의 종류에 따라 PBMC 4,949.4배, HuT78 94,265.7배였으며 HuT78 지지세포로 증식시킨 경우가 PBMC 지지세포로 증식시킨 경우에 비해 약 19배 이상 높은 증식률을 보였다(표 7, 도 1f).As a result of comparing the proliferation rate of the natural killer cells cultured by the condition 6 of Table 1, the proliferation rate based on the total cell number was 1,797.2 times and HuT78 3,991.7 times PBMC according to the type of supporting cells, showing that HuT78 showed a significantly higher proliferation rate. The total proliferation rate of natural killer cells was 4,949.4 times PBMC and 94,265.7 times HuT78, depending on the type of supporting cells. The growth rate of HuT78 support cells was about 19 times higher than that of PBMC support cells. 7, FIG. 1F).
상기 결과는 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포를 14일 또는 21일 배양하여 자연살해세포를 증식시킬 때, HuT78와 공배양하는 방법이 PBMC와 공배양하는 방법에 비해 증식률 측면에서 우수한 지지세포로서 사용될 수 있음을 보여준다.The results show that when proliferating natural killer cells by culturing cells derived from cord blood mononuclear cells for 14 days or 21 days, co-culture with HuT78 can be used as an excellent support cell in terms of proliferation rate compared to the method of co-culture with PBMC. Shows that there is.
<2-3> 26일 배양의 재자극 조건<2-3> Restimulation conditions of 26-day culture
자연살해세포 배양시 1,000 IU/mL의 IL-2 또는 상기 IL-2와 10 ng/mL의 IL-15의 혼합물, 및 10 ng/mL의 OKT3를 배양 용기에 넣은 다음, 배양 0일째 다양한 시드세포와 지지세포를 1:5의 비율로 하고, 10 부피% FBS 또는 1 부피% 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지를 넣어 37℃ 인큐베이터에서 정치 배양하였다. 배양 3~5일째에 세포 수를 측정하여 약 2~10x105 세포/mL이 되도록 1,000 IU/mL의 IL-2 또는 상기 IL-2와 10 ng/mL의 IL-15의 혼합물, 및 10 부피% FBS가 포함된 CellGro 배지로 희석한 후, 적절한 배양 용기에 넣어 다시 정치 배양하였다.In culture of natural killer cells, 1,000 IU / mL of IL-2 or a mixture of IL-2 and 10 ng / mL of IL-15, and 10 ng / mL of OKT3 were placed in a culture vessel, followed by various seed cells on day 0 of culture. And the supporting cells in a ratio of 1: 5, and added CellGro medium containing 10% by volume FBS or 1% by volume of human plasma and cultured in a 37 ℃ incubator. Measure the number of cells on the 3rd to 5th day of culture to obtain about 2-10 x 10 5 cells / mL of 1,000 IU / mL of IL-2 or a mixture of IL-2 and 10 ng / mL of IL-15, and 10% by volume After diluting with CellGro medium containing FBS, it was placed in an appropriate culture vessel and cultured again.
지지세포의 재자극은, 배양 0일째 사용한 지지세포를 동일하게 사용하였고 배양 7일째 및 14일째에 시드세포와 지지세포의 비율은 주로 1:5로 하였다(조건 4, 5 및 6). 재자극은 배양 중인 자연살해세포수를 측정하고 세포 수를 기준으로 2~5x105 세포/mL이 되도록 10 부피% FBS 또는 1 부피% 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석한 뒤, 다양한 지지세포를 해당 배수에 맞게 준비하였다. 1,000 IU/mL의 IL-2 또는 상기 IL-2와 10 ng/mL의 IL-15의 혼합물, 및 10 ng/mL의 OKT3를 배양 용기에 추가하고 10 부피% FBS 또는 1 부피% 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지를 넣은 후 3~5일간 정치 배양하였다. 이후, 2~3일 간격으로 세포 수를 측정하여 5~10x105 세포/mL이 되도록 1,000 IU/mL의 IL-2 또는 상기 IL-2와 10 ng/mL의 IL-15의 혼합물, 및 10 부피% FBS 또는 1 부피% 사람 혈장이 포함된 CellGro 배지로 희석하며 20~22일까지 부유 배양하여 증식된 자연살해세포를 수득하였다.Restimulation of the support cells was performed using the same support cells used on day 0 of the culture, and the ratio of seed cells and support cells was mainly 1: 5 on the 7th and 14th days of culture (conditions 4, 5 and 6). Restimulation was performed by measuring the number of natural killer cells in culture and diluting them with CellGro medium containing 10% by volume FBS or 1% by volume of human plasma to 2-5x10 5 cells / mL based on the number of cells. It was prepared for the corresponding drainage. Add 1,000 IU / mL of IL-2 or a mixture of IL-2 and 10 ng / mL of IL-15, and 10 ng / mL of OKT3 to the culture vessel and contain 10 volume% FBS or 1 volume% human plasma After putting the CellGro medium was incubated for 3 to 5 days. Thereafter, the number of cells measured at intervals of 2 to 3 days was measured to be 1,000 IU / mL of IL-2 or a mixture of IL-2 and 10 ng / mL of IL-15 such that 5-10 × 10 5 cells / mL was obtained, and 10 volumes. Diluted with CellGro medium containing% FBS or 1% by volume human plasma was suspended in culture for 20-22 days to obtain proliferated natural killer cells.
상기 표 1의 조건 8 및 9에 의해 배양된 자연살해세포의 증식률을 HuT78 지지세포로 증식시켜 확인한 결과, 7일과 14일에 재자극을 줄수록 높은 증식률을 나타내었다(표 8, 9 및 도 4a 및 4b).As a result of proliferation of natural killer cells cultured under the conditions 8 and 9 of Table 1 by HuT78 support cells, the higher the re-stimulation at 7 days and 14 days, the higher the growth rate was (Tables 8, 9 and 4a). And 4b).
상기 결과는 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포를 14일, 21일 또는 25일간 배양하여 자연살해세포를 증식시킬 때, Hu78 세포의 재자극 시기, 비율, 횟수 등에 따라 배양 성적의 차이가 있으나, HuT78 세포가 우수한 지지세포로 사용될 수 있고, FBS 및 사람 혈장이 자연살해세포 배양에 사용될 수 있음을 보여준다.The above results indicate that when the cells derived from cord blood mononuclear cells are grown for 14 days, 21 days, or 25 days, natural killer cells are propagated, there are differences in culture results depending on the restimulation time, rate, and frequency of Hu78 cells. Can be used as an excellent support cell, showing that FBS and human plasma can be used for natural killer cell culture.
실시예Example 3: 인-비트로(in vitro) 세포 표현형 분석 3: In vitro Cell Phenotype Assay
상기 실시예 1에 따른 배양방법으로 배양된 자연살해세포의 배양 전과 후의 세포를 수거하여 1,200 rpm으로 5분간 원심분리하고, 배양액을 흡입하여 제거하였다. 이후, 펠렛을 1 mL의 FACS 버퍼(2.5 부피% FBS를 포함한 PBS)로 희석하여 세포수를 측정하고, 5x106 세포/mL이 되도록 FACS 버퍼로 희석하였다. 5 mL FACS 튜브(Falcon, 352052)에 희석한 세포 용액을 100 μL씩 넣고, 다음과 같은 항체로 표현형을 분석하였다.Cells before and after culturing the natural killer cells cultured by the culture method according to Example 1 were collected, centrifuged at 1,200 rpm for 5 minutes, and the culture solution was aspirated and removed. The pellet was then diluted with 1 mL FACS buffer (PBS with 2.5 vol% FBS) to determine cell number and diluted with FACS buffer to 5 × 10 6 cells / mL. 100 μL of the diluted cell solution was added to a 5 mL FACS tube (Falcon, 352052), and the phenotype was analyzed with the following antibody.
튜브 1: 항-인간(anti-human) CD3-FITC(BD Pharmingen, 555332), 항-인간 CD16-PE(BD Pharmingen, 555407), 항-인간 CD56-PE-Cy5(BD Pharmingen, 555517)Tube 1: anti-human CD3-FITC (BD Pharmingen, 555332), anti-human CD16-PE (BD Pharmingen, 555407), anti-human CD56-PE-Cy5 (BD Pharmingen, 555517)
튜브 2: 항-인간 CD14-FITC(BD Pharmingen, 555397), 항-인간 CD19-PE(BD Pharmingen, 555413), 항-인간 CD3-PE-Cy5(BD Pharmingen, 555341)Tube 2: anti-human CD14-FITC (BD Pharmingen, 555397), anti-human CD19-PE (BD Pharmingen, 555413), anti-human CD3-PE-Cy5 (BD Pharmingen, 555341)
튜브 3: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 NKG2D-PE(R&D system, FAB139P), 항-인간 CD56-PE-Cy5 Tube 3: anti-human CD3-FITC, anti-human NKG2D-PE (R & D system, FAB139P), anti-human CD56-PE-Cy5
튜브 4: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 NKp30-PE(BD Pharmingen, 558407), 항-인간 CD56-PE-Cy5Tube 4: anti-human CD3-FITC, anti-human NKp30-PE (BD Pharmingen, 558407), anti-human CD56-PE-Cy5
튜브 5: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 NKp44-PE(BD Pharmingen, 558563), 항-인간CD56-PE-Cy5Tube 5: anti-human CD3-FITC, anti-human NKp44-PE (BD Pharmingen, 558563), anti-human CD56-PE-Cy5
튜브 6: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 NKp46-PE(BD Pharmingen, 557991), 항-인간 CD56-PE-Cy5Tube 6: anti-human CD3-FITC, anti-human NKp46-PE (BD Pharmingen, 557991), anti-human CD56-PE-Cy5
튜브 7: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 CD69-PE(R&D systems, FAB23591P), 항-인간 CD56-PE-Cy5Tube 7: anti-human CD3-FITC, anti-human CD69-PE (R & D systems, FAB23591P), anti-human CD56-PE-Cy5
튜브 8: 항-인간 CD3-FITC, 항-인간 NKG2A-PE(R&D systems, FAB1059P), 항-인간 CD56-PE-Cy5Tube 8: anti-human CD3-FITC, anti-human NKG2A-PE (R & D systems, FAB1059P), anti-human CD56-PE-Cy5
튜브 9: 항-인간 CD3-FITC, PE 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Pharmingen, 555749), 항-인간 CD56-PE-Cy5Tube 9: anti-human CD3-FITC, PE mouse IgG1 k isotope control (BD Pharmingen, 555749), anti-human CD56-PE-Cy5
튜브 10: FITC 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Pharmingen, 555748), PE 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Pharmingen, 555749), PE-Cy5 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Pharmingen, 555750)Tube 10: FITC mouse IgG1 k isotope control (BD Pharmingen, 555748), PE mouse IgG1 k isotope control (BD Pharmingen, 555749), PE-Cy5 mouse IgG1 k isotope control (BD Pharmingen, 555750)
상기 튜브들을 30분간 냉장 온도에서 염색한 후, 염색이 끝난 세포에 2 mL FACS 버퍼를 넣고, 1,500 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 2 mL FACS 버퍼를 넣고 1,500 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 다시 상층액을 제거하고, 300 μL FACS 버퍼를 넣어 현탁한 후 FACS LSRII Fortessa(Becton Dickinson)를 이용하여 표현형을 분석하여, 세포를 확인하고, 순도를 조사하였다. 확인은 자연살해세포의 대표적인 표현형인 CD3(-)CD56(+) 세포로 표시하였고 순도 측정은 CD3(+)는 T 세포, CD14(+)는 단세포(monocyte), CD19(+)는 B 세포로 측정하였다. After staining the tubes at refrigeration temperature for 30 minutes, 2 mL FACS buffer was added to the stained cells, and centrifuged for 5 minutes at 1,500 rpm. The supernatant was removed, and again, 2 mL FACS buffer was added and centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes. The supernatant was again removed, suspended in 300 μL FACS buffer, and then phenotype was analyzed using FACS LSRII Fortessa (Becton Dickinson) to identify cells and to investigate purity. Confirmation was expressed as CD3 (-) CD56 (+) cells, which are representative phenotypes of natural killer cells, and purity was measured as T cells, CD14 (+) as monocytes, and CD19 (+) as B cells. Measured.
<3-1> 세포 확인 및 순도<3-1> Cell Identification and Purity
제대혈 단핵세포로부터 분리된 CD56(+) 세포를 두 지지세포와 함께 각각 14일간 배양한(상기 표 1의 조건 1) 후 자연살해세포의 확인 및 순도를 분석한 결과, 자연살해세포의 함량이 PBMC 50.8% 및 HuT78 93.0%로서, HuT78 지지세포로 배양하였을 때 다른 지지세포와 달리, 매우 높은 자연살해세포 함량을 보여주었다. 또한, 이때 단세포 및 B 세포의 함량도 모두 1% 이하로, HuT78 지지세포로 배양한 자연살해세포가 고순도 자연살해세포임을 보여주었다(표 2, 도 5a). CD56 (+) cells isolated from umbilical cord blood mononuclear cells were cultured with two supporting cells for 14 days (condition 1 in Table 1), and then analyzed and confirmed the purity of natural killer cells. 50.8% and HuT78 93.0% showed very high natural killer cell content when cultured with HuT78 support cells, unlike other support cells. In addition, the content of single cells and B cells were also less than 1%, showing that natural killer cells cultured with HuT78 support cells were high-purity natural killer cells (Table 2, Figure 5a).
또한, 제대혈 단핵세포로부터 유래된 농축된 자연살해세포를 두 지지세포와 함께 각각 14일간 배양한(표 1의 조건 2) 후 자연살해세포의 확인 및 순도를 분석한 결과, 자연살해세포의 함량이 PBMC 73% 및 HuT78 93.7%로서, HuT78 지지세포로 배양하였을 때 다른 지지세포에 비해 더욱 높은 자연살해세포 함량을 보여주었다. 또한, 이때 단세포 및 B세포의 함량도 모두 1% 이하로, HuT78 지지세포로 배양한 자연살해세포가 고순도 자연살해세포임을 나타내주었다(표 3, 도 5b).In addition, after culturing concentrated natural killer cells derived from cord blood mononuclear cells with two supporting cells for 14 days (condition 2 in Table 1), the results of analysis and identification of natural killer cells showed that the content of natural killer cells was increased. PBMC 73% and HuT78 93.7% showed higher natural killer cell content than other support cells when cultured with HuT78 support cells. In addition, the content of both single cells and B cells was also 1% or less, indicating that natural killer cells cultured with HuT78 support cells were high-purity natural killer cells (Table 3, FIG. 5B).
제대혈 단핵세포로부터 분리된 CD3(-) 세포를 두 지지세포와 함께 각각 14일간 배양한(표 1의 조건 3) 후 자연살해세포의 확인 및 순도를 분석한 결과, 자연살해세포의 함량이 PBMC 82.5% 및 HuT78 89.0%로서, HuT78 지지세포로 배양하였을 때가 다른 지지세포에 비해 좀더 높은 자연살해세포 함량을 보여주었다. 또한, 이때 단세포 및 B 세포의 함량도 모두 1% 이하로, HuT78 지지세포로 배양한 자연살해세포가 고순도 자연살해세포임을 나타내주었다(표 4, 도 5c).CD3 (-) cells isolated from umbilical cord blood mononuclear cells were cultured with two supporting cells for 14 days (condition 3 in Table 1), and then analyzed for the identification and purity of natural killer cells. % And HuT78 89.0%, when cultured with HuT78 support cells showed higher natural killer cell content than other support cells. In addition, the content of single cells and B cells was also 1% or less, indicating that natural killer cells cultured with HuT78 support cells were high-purity natural killer cells (Table 4, FIG. 5C).
제대혈 단핵세포로부터 분리된 CD56(+)를 두 지지세포와 함께 각각 21일간 배양한(표 1의 조건 4) 후 자연살해세포의 확인 및 순도를 분석한 결과, 자연살해세포의 함량이 PBMC 7.1% 및 HuT78 88.5%로서, HuT78 지지세포로 배양하였을 때 PBMC 지지세포에 비해 월등히 높은 자연살해세포 함량을 보여주었다(표 5, 도 5d).After culturing CD56 (+) isolated from umbilical cord blood mononuclear cells with two supporting cells for 21 days (condition 4 in Table 1), the analysis and identification of natural killer cells showed that the content of natural killer cells was 7.1% of PBMC. And HuT78 88.5%, when cultured with HuT78 support cells showed significantly higher natural killer cell content than PBMC support cells (Table 5, Figure 5d).
또한, 제대혈 단핵세포로부터 유래된 농축된 자연살해세포를 두 지지세포와 함께 각각 21일간 배양한(표 1의 조건 5) 후 자연살해세포의 확인 및 순도를 분석한 결과, 자연살해세포의 확인 및 순도를 분석한 결과, 자연살해세포의 함량이 PBMC 89.2% 및 HuT78 94.1%로서, HuT78 지지세포로 배양하였을 때 PBMC 지지세포에 비해 월등히 높은 자연살해세포 함량을 보여주었다(표 6, 도 5e).In addition, the concentrated natural killer cells derived from umbilical cord blood mononuclear cells were cultured together with the two support cells for 21 days (condition 5 in Table 1), and then the natural killer cells were identified and analyzed. As a result of the purity analysis, the contents of natural killer cells were 89.2% of PBMC and 94.1% of HuT78, which showed much higher natural killer cell contents than PBMC support cells when cultured with HuT78 support cells (Table 6, FIG. 5E).
그러나, 제대혈 단핵세포로부터 분리된 CD3(-) 세포를 두 지지세포와 함께 각각 21일간 배양한(표 1의 조건 6) 후 자연살해세포의 확인 및 순도를 분석한 결과, 자연살해세포의 함량이 PBMC 97.5% 및 HuT78 99.8%로서, 지지세포에 따른 큰 차이를 확인하지 못하였다(표 7, 도 5f).However, CD3 (-) cells isolated from umbilical cord blood mononuclear cells were cultured together with two supporting cells for 21 days (condition 6 in Table 1), and then analyzed and confirmed the purity of natural killer cells. PBMC 97.5% and HuT78 99.8%, did not identify a large difference according to the support cells (Table 7, 5f).
상기 결과는 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포를 14일 또는 21일간 배양하여 자연살해세포를 증식시킬 때, HuT78이 제대혈 MNC 및 PBMC보다 자연살해세포의 함량 및 순도 측면에서 우수한 지지세포로 사용될 수 있음을 보여준다.The results indicate that when the cells derived from cord blood mononuclear cells are cultured for 14 days or 21 days to propagate natural killer cells, HuT78 can be used as a support cell superior in the content and purity of natural killer cells than cord blood MNC and PBMC. Shows.
<3-2> 세포 발현 마커<3-2> Cell Expression Markers
세포의 종류 확인 및 순도 이외에 지지세포에 따라 차이가 나타나는 대표적인 자연살해세포의 수용체(receptor) 발현을 분석하였다. In addition to cell type identification and purity, we analyzed receptor expression of representative natural killer cells that showed differences depending on supporting cells.
제대혈로부터 분리된 CD56(+) 세포, 농축된 자연살해세포 및 CD3(-) 세포를 두 지지세포와 함께 각각 14일간 배양한(표 1의 조건 1, 2 및 3) 후 자연살해세포의 세포 표현형을 분석한 결과, CD16, NKG2D, NKp30, NKp44 및 NKp46에 대해 표현형의 차이가 관찰되었으며, 특히 HuT78을 지지세포로 사용하여 배양할 때 상기 표현형의 발현이 가장 높은 것을 확인하였다(도 6a, 6b 및 6c). Cell phenotype of natural killer cells after CD56 (+) cells isolated from umbilical cord blood, concentrated natural killer cells and CD3 (-) cells were cultured with two supporting cells for 14 days ( conditions 1, 2 and 3 in Table 1), respectively. As a result of the analysis, a difference in phenotype was observed for CD16, NKG2D, NKp30, NKp44 and NKp46. In particular, it was confirmed that the expression of the phenotype was highest when cultured using HuT78 as a support cell (FIGS. 6A, 6B and 6c).
제대혈로부터 분리된 CD56(+) 세포, 농축된 자연살해세포 및 CD3(-) 세포를 다양한 지지세포와 함께 각각 21일간 배양한(표 1의 조건 4, 5 및 6) 후 자연살해세포의 세포 표현형을 분석한 결과, CD16, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46에 대해 표현형의 차이가 관찰되었다. PBMC 대비 HuT78을 지지세포로 사용하여 배양한 경우 해당 표현형의 발현이 높은 것을 확인하였다(도 6d, 6e 및 6f). 특히 CD16과 NKG2D는 PBMC 지지세포 대비 HuT78 지지세포로 배양한 경우 발현도가 상당히 높았다. Cellular phenotype of natural killer cells after CD56 (+) cells isolated from umbilical cord blood, concentrated natural killer cells and CD3 (-) cells were incubated with various supporting cells for 21 days (conditions 4, 5 and 6 in Table 1). As a result of the analysis, a difference in phenotype was observed for CD16, NKG2D, NKp30, NKp44, and NKp46. When cultured using HuT78 as a support cell compared to PBMC, it was confirmed that the expression of the phenotype is high (FIGS. 6D, 6E and 6F). In particular, CD16 and NKG2D expression levels were significantly higher when cultured with HuT78 support cells than PBMC support cells.
상기 결과는 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포와 상기 세포의 배양기간에 따라 세포 표현형의 발현 차이가 나타나긴 하지만, HuT78 지지세포를 이용하여 배양함으로써 CD16, NKG2D, NCR 등 자연살해세포의 활성 마커들의 발현을 증가시킬 수 있으며, 이에 따라 높은 효능을 갖는 자연살해세포를 수득할 수 있음을 보여준다. Although the results showed a difference in expression of cell phenotype depending on the cells derived from cord blood mononuclear cells and the culture period of the cells, expression of activity markers of natural killer cells such as CD16, NKG2D and NCR by culturing using HuT78 support cells. It can be increased, thereby showing that natural killer cells with high efficacy can be obtained.
또한, 제대혈 단핵세포로부터 분리된 CD56(+) 세포, 농축된 자연살해세포 또는 CD3(-) 세포를 HuT78 지지세포와 함께 14일 또는 21일간 배양한 자연살해세포의 세포 표현형을 PBMC 유래 자연살해세포의 표현형과 비교해 보았을 때, NKp44, CD69의 발현도가 높았고 NKG2A의 발현도는 낮았다(도 8a). 이는, 같은 지지세포를 이용한 경우라도, PBMC보다 제대혈 단핵세포 유래의 세포로부터 수득한 자연살해세포의 일부 억제형 마커의 발현이 낮고 일부 활성화 마커의 발현이 높음을 보여준다.In addition, PBMC-derived natural killer cells were obtained from the cell phenotype of natural killer cells cultured for 14 days or 21 days with CD56 (+) cells, enriched natural killer cells or CD3 (-) cells with HuT78 support cells. Compared with the phenotype of, the expression levels of NKp44 and CD69 were high and the expression levels of NKG2A were low (FIG. 8A). This shows that even when the same supporting cells are used, the expression of some inhibitory markers of natural killer cells obtained from cells derived from cord blood mononuclear cells is lower than that of PBMC and the expression of some activation markers is higher.
실시예Example 4: 다양한 종양 세포주에  4: to various tumor cell lines 대한 인About -비트로(in vitro) In vitro 세포살상능Cell killing ability
타겟 종양 세포주(K562(ATCC), HuT78(ATCC), Huh7(한국세포주은행) 등) 1x106개의 세포를 15 mL 튜브에 넣어 원심 분리한 후, 세포 펠렛을 1 mL의 RPMI1640-10% FBS 배지로 현탁하였다. 이후, 1 mM의 Calcein-AM(Molecular probe, C34852) 30 μL을 넣은 다음 은박지로 빛을 차단하여 37℃ 인큐베이터에서 한 시간 동안 염색하였다. Calcein-AM 염색이 끝난 종양 세포주를 10~15 mL의 RPMI1640-10% FBS 배지를 넣어 세척하고 원심 분리한 뒤 펠렛을 10 mL의 RPMI 배지로 현탁하여 1x105 세포/mL의 농도로 조절하였다. 1 x 10 6 cells of the target tumor cell line (K562 (ATCC), HuT78 (ATCC), Huh7 (Korea Cell Line Bank), etc.) were placed in a 15 mL tube and centrifuged, and then the cell pellet was placed in 1 mL of RPMI1640-10% FBS medium. Suspended. Thereafter, 30 μL of 1 mM Calcein-AM (Molecular probe, C34852) was added thereto, and then, light was blocked with silver foil and stained for 1 hour in a 37 ° C. incubator. Calcein-AM stained tumor cell lines were washed with 10-15 mL of RPMI1640-10% FBS medium, centrifuged, and the pellets were suspended in 10 mL of RPMI medium to adjust the concentration to 1 × 10 5 cells / mL.
자연살해세포 3x106개를 15 mL 튜브에 담아 원심분리하고, 펠렛을 타겟 종양 세포주에 대비하여 원하는 비율로 RPMI1640-10% FBS 배지에 현탁하였다. 준비된 타겟 종양 세포주와 자연살해 세포주를 둥근 바닥 96-웰 플레이트(well plate)에 100 μL씩 섞어서 분주하고, 각 웰을 3개씩(triplicate) 준비하여 평균값을 얻었다. 스판(spontaneous release) 웰(well)에는 염색된 종양 세포주를 100 μL씩 넣고 RPMI1640-10% FBS 배지를 100 μL씩 넣어주었다. 맥스(maximum release) 웰(well)에는 염색된 종양 세포주를 100 μL씩 넣고 2% Triton-X 100 용액을 100 μL씩 넣어 주었다. RPMI1640-10% FBS 배지 및 2% Triton-X 100 용액에 존재하는 자가 형광값을 보정하기 위해 RPMI1640-10% FBS 배지 200 μL를 넣어 배지값을 준비하고, RPMI 1640-10% FBS 배지 100 μL에 2% Triton-X 100 용액 100 μL를 넣어 두 용액의 혼합액의 값을 준비하였다. 배지값에서 혼합액의 값을 뺀 차(A)를 맥스값에 더하여 자가 형광값을 보정하였다. 3 × 10 6 natural killer cells were placed in a 15 mL tube and centrifuged, and the pellet was suspended in RPMI1640-10% FBS medium at a desired ratio against the target tumor cell line. The prepared target tumor cell line and the natural killer cell line were mixed by mixing 100 μL in a round-bottom 96-well plate, and three wells were prepared to obtain an average value. Span (spontaneous release) wells (well) were stained with 100 μL of stained tumor cell line and 100 μL of RPMI 1640-10% FBS medium. In a maximum release well, 100 μL of the stained tumor cell line was added and 100 μL of 2% Triton-X 100 solution was added. To calibrate the autofluorescence values present in RPMI1640-10% FBS medium and 2% Triton-X 100 solution, 200 μL of RPMI1640-10% FBS medium was prepared, and the medium value was prepared in 100 μL of RPMI 1640-10% FBS medium. 100 μL of a 2% Triton-X 100 solution was added to prepare a mixed solution of the two solutions. The autofluorescence value was corrected by adding the difference (A) obtained by subtracting the value of the mixed solution from the medium value to the max value.
빛을 차단하여 37℃ 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시킨 후, 플레이트를 2,000 rpm에서 3분간 원심 분리하였다. 상층액을 96-웰 블랙 플레이트에 100 μL씩 넣고 형광 플레이트 리더기(Perkin Elmer, VICTOR X3)를 이용하여 형광값(OD480/535 nm)을 측정하여, 자연살해세포의 종양 세포살상능을 하기 식을 이용하여 계산하였다.After blocking the light and reacting for 4 hours in a 37 ℃ incubator, the plate was centrifuged for 3 minutes at 2,000 rpm. 100 μL of the supernatant was added to a 96-well black plate, and the fluorescence value (OD 480/535 nm) was measured using a fluorescence plate reader (Perkin Elmer, VICTOR X3). Calculated using.
세포살상능(%) = (샘플 웰 평균 형광값 - 스판 웰 평균 형광값)/{(맥스 웰 평균 형광값 + A) - 스판 웰 평균 형광값} x 100Apoptosis (%) = (Sample mean fluorescence value-Spanwell mean fluorescence value) / {(Maxwell mean fluorescence value + A)-Spanwell mean fluorescence value} x 100
다양한 지지세포로 배양된 자연살해세포들을 다양한 종양세포주와 반응시켜 직접적인 세포살해능을 측정하였다.Natural killer cells cultured with various supporting cells were reacted with various tumor cell lines to measure direct cell killing ability.
제대혈 단핵세포로부터 분리된 CD56(+)를 두 지지세포와 함께 14일간 각각 배양한(표 1의 조건 1) 후 자연살해세포의 세포살상능을 혈액암 세포주 K562, 간암 세포주 Huh7 및 림포마 세포주 HuT78을 대상으로 평가하였다. 그 결과, 모든 종양 타깃에 대해 HuT78 지지세포로 배양한 자연살해세포가 PBMC 지지세포로 배양한 경우보다 높은 세포살상능을 나타내었다(도 7a, 7b 및 7c). After culturing CD56 (+) isolated from umbilical cord blood mononuclear cells with two supporting cells for 14 days (condition 1 in Table 1), the cell killing ability of natural killer cells was measured by blood cancer cell line K562, liver cancer cell line Huh7 and lymphoma cell line HuT78. Was evaluated. As a result, natural killer cells cultured with HuT78 support cells showed higher cell killing ability than all the tumor targets when cultured with PBMC support cells (FIGS. 7A, 7B and 7C).
제대혈 단핵세포로부터 분리된 농축된 제대혈 자연살해세포를 두 지지세포와 함께 각각 14일간 배양한(표 1의 조건 2) 후 자연살해세포의 세포살상능을 혈액암 세포주 K562 및 간암 세포주 Huh7을 대상으로 평가하였다. 그 결과, HuT78 지지세포로 배양한 자연살해세포가 PBMC 지지세포로 배양한 경우보다 높은 세포살상능을 나타내었다(도 7d 및 7e). The concentrated umbilical cord blood killer cells isolated from umbilical cord blood mononuclear cells were cultured with two supporting cells for 14 days (condition 2 in Table 1), and then the cell killing ability of the natural killer cells was analyzed in the blood cancer cell line K562 and the liver cancer cell line Huh7. Evaluated. As a result, natural killer cells cultured with HuT78 support cells showed higher cell killing capacity than those cultured with PBMC support cells (FIGS. 7D and 7E).
제대혈 단핵세포로부터 분리된 CD56(+) 세포를 두 가지 지지세포와 함께 각각 21일간 배양한(표 1의 조건 4) 후 자연살해세포의 세포살상능을 혈액암 세포주 K562 및 간암 세포주 Huh7 및 림포마 세포주 HuT78를 대상으로 평가하였다. 그 결과, 두 종양 타깃에 대해 HuT78 지지세포로 배양한 경우 더욱 높은 세포살상능을 나타내었다(도 7f, 7g 및 7h).CD56 (+) cells isolated from umbilical cord blood mononuclear cells were incubated with two supporting cells for 21 days (condition 4 in Table 1), and then the cell killing ability of natural killer cells was measured by blood cancer cell line K562 and liver cancer cell line Huh7 and lymphoma. Cell line HuT78 was evaluated. As a result, when cultured with HuT78 support cells for the two tumor targets showed a higher cell killing ability (Figs. 7f, 7g and 7h).
제대혈 단핵세포로부터 분리된 CD3(-) 세포를 두 지지세포와 함께 각각 21일간 배양한(표 1의 조건 6) 후 자연살해세포의 세포살상능을 혈액암 세포주 K562를 대상으로 평가하였다. 그 결과, HuT78 지지세포로 배양한 자연살해세포가 PBMC 지지세포로 배양한 경우보다 높은 세포살상능을 나타내었다(도 7i).CD3 (-) cells isolated from umbilical cord blood mononuclear cells were cultured with two supporting cells for 21 days (condition 6 in Table 1), and then the cell killing ability of natural killer cells was evaluated in blood cancer cell line K562. As a result, natural killer cells cultured with HuT78 support cells showed higher cell killing capacity than those cultured with PBMC support cells (FIG. 7I).
상기 결과는 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포와 HuT78 지지세포를 공배양하여 증식된 자연살해세포의 종양타깃에 대한 세포살상능이, 상기 세포의 배양기간이나 시드세포에 따라 차이가 있긴 하지만, 타 지지세포를 이용하여 증식된 것에 비해 우수함을 보여준다.The results showed that the cell killing capacity of tumor cells of natural killer cells proliferated by co-culture of cells derived from cord blood mononuclear cells and HuT78 support cells, depending on the culture period or seed cells of other cells, It shows superiority compared to the multiplied using.
실시예Example 5: 인-비트로(in-vitro)  5: in-vitro KIRKIR 표현형 분석 Phenotype analysis
실시예 1에 따른 배양방법으로 배양된 자연살해세포의 배양 전과 후의 세포를 수거하여 1200 rpm으로 5분간 원심분리한 후 펠렛을 1 mL의 FACS 버퍼(2.5 부피% FBS를 포함한 PBS)로 희석하여 세포 수를 측정하고, 5x106 세포/mL이 되도록 FACS 버퍼로 희석하였다. 5 mL FACS 튜브(Falcon, 352052)에 희석한 세포 용액을 100 μL씩 넣고, 다음과 같은 항체로 표현형을 분석하였다.The cells before and after cultivation of natural killer cells cultured by the culture method according to Example 1 were collected and centrifuged at 1200 rpm for 5 minutes, and the pellet was diluted with 1 mL of FACS buffer (PBS containing 2.5 vol% FBS). The number was measured and diluted with FACS buffer to 5 × 10 6 cells / mL. 100 μL of the diluted cell solution was added to a 5 mL FACS tube (Falcon, 352052), and the phenotype was analyzed with the following antibody.
튜브 1: 항-인간(anti-human) CD158b-FITC(BD Pharmingen, 559784), 항-인간 CD158e-PE(Beckman Coulter, IM3292), 항-인간 CD158a-APC(Beckman Coulter, A22332), 항-인간 CD56-APC-Cy7(BD Pharmingen, 555517), 7-AAC(Beckman Coulter, A07704), 항-인간 CD3-PE-Cy56(BD Pharmingen, 555341) Tube 1: anti-human CD158b-FITC (BD Pharmingen, 559784), anti-human CD158e-PE (Beckman Coulter, IM3292), anti-human CD158a-APC (Beckman Coulter, A22332), anti-human CD56-APC-Cy7 (BD Pharmingen, 555517), 7-AAC (Beckman Coulter, A07704), anti-human CD3-PE-Cy56 (BD Pharmingen, 555341)
튜브 2: FITC 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Pharmingen, 555748), PE 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Pharmingen, 555749), APC 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Pharmingen, 555751), 항-인간 CD56-APC-Cy7(BD Pharmingen, 555517), 7-AAC(Beckman Coulter, A07704), 항-인간 CD3-PE-Cy5(BD Pharmingen, 555341)Tube 2: FITC mouse IgG1 k isotope control (BD Pharmingen, 555748), PE mouse IgG1 k isotope control (BD Pharmingen, 555749), APC mouse IgG1 k isotope control (BD Pharmingen, 555751), anti-human CD56-APC-Cy7 (BD Pharmingen, 555517), 7-AAC (Beckman Coulter, A07704), anti-human CD3-PE-Cy5 (BD Pharmingen, 555341)
튜브 3: FITC 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Pharmingen, 555748), PE 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Pharmingen, 555749), APC 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Pharmingen, 555751), APC-Cy7 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Phamingen, 557873), PE-Cy5 마우스 IgG1 k 아이소토프 컨트롤(BD Pharmingen, 555750).Tube 3: FITC mouse IgG1 k isotope control (BD Pharmingen, 555748), PE mouse IgG1 k isotope control (BD Pharmingen, 555749), APC mouse IgG1 k isotope control (BD Pharmingen, 555751), APC-Cy7 mouse IgG1 k isotope control (BD Phamingen, 557873), PE-Cy5 mouse IgG1 k isotope control (BD Pharmingen, 555750).
상기 튜브들을 30분간 냉장 온도에서 염색한 후, 염색이 끝난 세포에 2 mL FACS 버퍼를 넣고, 1,500 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 다시 2 mL FACS 버퍼를 넣고 1,500 rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 다시 상층액을 제거하고, 300μL FACS 버퍼를 넣어 현탁한 후 FACS LSRII Fortessa(Becton Dickinson)를 이용하여 표현형을 분석하였다. 세포의 억제적 KIR인 CD158a(KIR2DL1), CD158b(KIR2DL2/DL3), CD158e(KIR3DL1)의 발현도를 단독 혹은 혼합적 측면에서 분석하였다. After staining the tubes at refrigeration temperature for 30 minutes, 2 mL FACS buffer was added to the stained cells, and centrifuged for 5 minutes at 1,500 rpm. The supernatant was removed, and again, 2 mL FACS buffer was added and centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes. The supernatant was again removed, suspended in 300 μL FACS buffer and phenotype analyzed using FACS LSRII Fortessa (Becton Dickinson). The expression levels of CD158a (KIR2DL1), CD158b (KIR2DL2 / DL3), and CD158e (KIR3DL1), which are inhibitory KIR of cells, were analyzed either alone or in combination.
PBMC로부터 유래된 CD3(-) 세포를 HuT78 지지세포와 함께 14일간 배양하여 수득한 자연살해세포와 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포를 HuT78 지지세포와 함께 14일 혹은 21일간 배양하여 수득한 자연살해세포의 억제적 KIR을 분석한 결과, PBMC보다 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포로부터 수득한 자연살해세포의 CD158a(-)CD158b(-)CD158e(-)세포(KIR(-)세포) 비율이 높았다(도 8b). Natural killer cells obtained by culturing CD3 (-) cells derived from PBMC with HuT78 support cells for 14 days and natural killer cells obtained by culturing cells derived from cord blood mononuclear cells with HuT78 support cells for 14 days or 21 days Inhibitory KIR analysis showed that the ratio of CD158a (-) CD158b (-) CD158e (-) cells (KIR (-) cells) of natural killer cells obtained from cells derived from cord blood mononuclear cells was higher than that of PBMC (Fig. 8b).
상기 표 1의 조건 1 내지 9에서 배양한 자연살해세포의 특성을 표로 요약하였다.The characteristics of natural killer cells cultured in the conditions 1 to 9 of Table 1 are summarized in a table.
표 1의 조건 1로 배양한 자연살해세포의 특성Characteristics of Natural Killer Cells Cultured in Condition 1 of Table 1
지지세포Support cell 확장배수(TNC)Extended drainage (TNC) 확장배수(NK)Expansion factor (NK) CD3-CD56+의 %% Of CD3-CD56 + K562에 대한 세포독성(E:T비율=1:1)Cytotoxicity against K562 (E: T ratio = 1: 1)
PBMCPBMC 63.063.0 25.925.9 50.850.8 50.150.1
HuT78HuT78 296.6296.6 321.7321.7 93.093.0 73.273.2
표 1의 조건 2로 배양한 자연살해세포의 특성Characteristics of Natural Killer Cells Cultured in Condition 2 of Table 1
지지세포Support cell 확장배수(TNC)Extended drainage (TNC) 확장배수(NK)Expansion factor (NK) CD3-CD56+의 %% Of CD3-CD56 + K562에 대한 세포독성(E:T비율=1:1)Cytotoxicity against K562 (E: T ratio = 1: 1)
PBMCPBMC 58.458.4 55.755.7 73.073.0 13.813.8
HuT78HuT78 145.7145.7 197.5197.5 93.793.7 54.254.2
표 1의 조건 3으로 배양한 자연살해세포의 특성Characteristics of Natural Killer Cells Cultured in Condition 3 of Table 1
지지세포Support cell 확장배수(TNC)Extended drainage (TNC) 확장배수(NK)Expansion factor (NK) CD3-CD56+의 %% Of CD3-CD56 + K562에 대한 세포독성(E:T비율=1:1)Cytotoxicity against K562 (E: T ratio = 1: 1)
PBMCPBMC 34.234.2 91.591.5 82.582.5 51.951.9
HuT78HuT78 115.1115.1 334.7334.7 89.089.0 49.749.7
표 1의 조건 4로 배양한 자연살해세포의 특성Characteristics of Natural Killer Cells Cultured in Condition 4 of Table 1
지지세포Support cell 확장배수(TNC)Extended drainage (TNC) 확장배수(NK)Expansion factor (NK) CD3-CD56+의 %% Of CD3-CD56 + K562에 대한 세포독성(E:T비율=1:1)Cytotoxicity against K562 (E: T ratio = 1: 1)
PBMCPBMC 1102.21102.2 72.372.3 7.17.1 13.813.8
HuT78HuT78 1416.71416.7 1586.11586.1 88.588.5 54.254.2
표 1의 조건 5로 배양한 자연살해세포의 특성Characteristics of Natural Killer Cells Cultured in Condition 5 of Table 1
지지세포Support cell 확장배수(TNC)Extended drainage (TNC) 확장배수(NK)Expansion factor (NK) CD3-CD56+의 %% Of CD3-CD56 + K562에 대한 세포독성(E:T비율=1:1)Cytotoxicity against K562 (E: T ratio = 1: 1)
PBMCPBMC 357.5357.5 541.2541.2 89.289.2 56.656.6
HuT78HuT78 1105.01105.0 1547.31547.3 94.194.1 60.960.9
표 1의 조건 6으로 배양한 자연살해세포의 특성Characteristics of Natural Killer Cells Cultured in Condition 6 of Table 1
지지세포Support cell 확장배수(TNC)Extended drainage (TNC) 확장배수(NK)Expansion factor (NK) CD3-CD56+의 %% Of CD3-CD56 + K562에 대한 세포독성(E:T비율=1:1)Cytotoxicity against K562 (E: T ratio = 1: 1)
PBMCPBMC 1797.21797.2 4949.44949.4 97.597.5 44.744.7
HuT78HuT78 3991.73991.7 94265.794265.7 99.899.8 58.858.8
표 1의 조건 8로 배양한 자연살해세포의 특성Characteristics of Natural Killer Cells Cultured in Condition 8 of Table 1
자극시기Stimulation 확장배수(NK)Expansion factor (NK)
D0D0 772.9772.9
D0, D7D0, D7 1848.21848.2
D0, D7, D14D0, D7, D14 10055.010055.0
표 1의 조건 9로 배양한 자연살해세포의 특성Characteristics of Natural Killer Cells Cultured in Condition 9 of Table 1
자극시기Stimulation 확장배수(NK)Expansion factor (NK)
D0D0 6730.76730.7
D0, D7D0, D7 13916.513916.5
D0, D7, D14D0, D7, D14 57421.157421.1

Claims (24)

  1. 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포를 CD4(+) T 세포와 공배양하는 단계를 포함하는, 자연살해세포의 제조방법.Comprising the step of co-culturing the cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom with CD4 (+) T cells, a method for producing natural killer cells.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CD4(+) T 세포가 CD4(+)를 발현하는 T 림포마인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 1, wherein the CD4 (+) T cells are T lymphomas that express CD4 (+).
  3. 제2항에 있어서, 상기 CD4(+)를 발현하는 T 림포마가 HuT78인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 2, wherein the T lymphoma expressing CD4 (+) is HuT78.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CD4(+) T 세포가 분열증식이 억제된 불활성화 세포 혹은 불활성화되지 않은 세포인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method for producing natural killer cells according to claim 1, wherein the CD4 (+) T cells are inactivated cells or uninactivated cells whose division is suppressed.
  5. 제1항에 있어서, 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포가 CD3(-) 세포, CD56(+) 세포 및 농축된 자연살해세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 1, wherein the cells derived from cord blood mononuclear cells are selected from the group consisting of CD3 (-) cells, CD56 (+) cells, and concentrated natural killer cells.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포가 CD56(+) 세포 또는 농축된 자연살해세포인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 1, wherein the cells derived from cord blood mononuclear cells are CD56 (+) cells or concentrated natural killer cells.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포와 지지 세포가 1:1 내지 1:20의 비율의 세포수로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 1, wherein the cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom and the support cells are mixed in a ratio of cells in a ratio of 1: 1 to 1:20.
  8. 제1항에 있어서, 상기 배양이 5 내지 60일간 수행되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 1, wherein the culture is performed for 5 to 60 days.
  9. 제1항에 있어서, 상기 배양이 T 세포에 저친화성(low affinity)을 가지며 T 세포를 자극하는 항체, 인터루킨 단백질 및 혈장 또는 혈청이 함유된 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.According to claim 1, The culture is characterized in that the natural killer cells, characterized in that the culture is carried out in a medium containing a low affinity (Tf cells) and the antibody, interleukin protein and plasma or serum that stimulates T cells Way.
  10. 제9항에 있어서, 상기 T 세포에 저친화성을 가지며 T 세포를 자극하는 항체가 OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 9, wherein the antibody having low affinity for T cells and stimulating T cells is selected from the group consisting of OKT3, UCHT1 and HIT3a.
  11. 제9항에 있어서, 상기 인터루킨 단백질이 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 9, wherein the interleukin protein is selected from the group consisting of IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, and IL-21.
  12. 제9항에 있어서, 상기 혈장 또는 혈청이 사람 혈장(human plasma), 소태아혈청(fetal bovine serum), 송아지혈청(bovine calf serum), 말혈청(horse serum) 및 혈소판 용해물(platelet lysate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 9, wherein the plasma or serum is human plasma, fetal bovine serum, bovine calf serum, horse serum and platelet lysate. Method for producing natural killer cells, characterized in that selected from the group consisting of.
  13. 제1항에 있어서, 상기 배양 동안 지지 세포로서 CD4(+) T 세포를 더 첨가하여 제대혈 단핵세포 또는 제대혈 단핵세포로부터 유래된 세포를 재자극하는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method for producing natural killer cells according to claim 1, wherein CD4 (+) T cells are further added as support cells during the culturing to re-stimulate cells derived from cord blood mononuclear cells or cord blood mononuclear cells.
  14. 제13항에 있어서, 상기 CD4(+) T 세포가 CD4(+)를 발현하는 T 림포마인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 13, wherein the CD4 (+) T cells are T lymphomas that express CD4 (+).
  15. 제14항에 있어서, 상기 CD4(+)를 발현하는 T 림포마가 HuT78인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method for producing natural killer cells according to claim 14, wherein the T lymphoma expressing CD4 (+) is HuT78.
  16. 제13항에 있어서, 상기 CD4(+) T 세포가 분열증식이 억제된 불활성화 세포인 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method for producing natural killer cells according to claim 13, wherein the CD4 (+) T cells are inactivated cells whose division is suppressed.
  17. 제13항에 있어서, 상기 제대혈 단핵세포 또는 이로부터 유래된 세포와 지지 세포가 1:1 내지 1:20의 비율의 세포수로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method for preparing natural killer cells according to claim 13, wherein the cord blood mononuclear cells or cells derived therefrom and the support cells are mixed in a ratio of cells in a ratio of 1: 1 to 1:20.
  18. 제13항에 있어서, 상기 재자극이 5 내지 12일 간격으로 1회 이상 반복되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 13, wherein the re-stimulation is repeated one or more times at intervals of 5 to 12 days.
  19. 제13항에 있어서, 상기 재자극이 T 세포에 저친화성을 가지며 T 세포를 자극하는 항체 및 인터루킨 단백질이 함유된 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 13, wherein the restimulation is performed in a medium containing an antibody and interleukin protein that have low affinity for T cells and stimulate T cells.
  20. 제19항에 있어서, 상기 T 세포에 저친화성을 가지며 T 세포를 자극하는 항체가 OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 19, wherein the antibody having low affinity for T cells and stimulating T cells is selected from the group consisting of OKT3, UCHT1, and HIT3a.
  21. 제19항에 있어서, 상기 인터루킨 단백질이 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 제조방법.The method of claim 19, wherein the interleukin protein is selected from the group consisting of IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, and IL-21.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 자연살해세포.A natural killer cell prepared by the method of any one of claims 1 to 21.
  23. 제22항의 자연살해세포를 유효성분으로 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.A composition for preventing or treating cancer or infectious disease comprising the natural killer cell of claim 22 as an active ingredient.
  24. 제22항의 자연살해세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법.A method for preventing or treating cancer or infectious disease, comprising administering the natural killer cells of claim 22 to a subject.
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