WO2016208823A1 - 아미노글리코시드계 항생제 및 프로바이오틱스를 포함하는 아프타 구내염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

아미노글리코시드계 항생제 및 프로바이오틱스를 포함하는 아프타 구내염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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aphthous stomatitis
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최영님
박희경
김윤지
최윤식
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present application relates to the treatment or prevention of recurrent aphthous stomatitis with antibiotics and probiotics.
  • Aphthous stomatitis also known as ulcerated stomatitis, is an oral mucosal ulcer that causes extreme pain compared to other traumatic ulcers of similar size and requires frequent relapses and a long healing period (Scully C, et. al. Br Dent J. 2005; 199: 259-264).
  • Afta stomatitis usually lasts about 7 days to about 10 days, but may last for weeks, with 10-20% of the population known to have oral ulcers over their lifetime (Aas JA, et al., J Clin Microbiol. 2005 43: 5721-5732).
  • Glucocorticoids such as triamcinolone acetonide and dexamethasone are also topically applied ('Oral and Maxillofacial Pathology' by B.W. Neville et al. 1995; pp. 236-239).
  • glucocorticoids require prescription for use due to serious side effects.
  • 5% of amlexanox oral paste (Aphthasol TM from Block Drug Company) is used as a prescription to treat aphtha ulcers, but its efficacy is still limited.
  • U.S. Patent No. 6148718 relates to dosage forms for use in the treatment of acute oral mucosal infections and discloses formulations that allow antibiotics such as penicillin, beta-lactam system to be effectively used for oral use.
  • Korean Laid-Open Patent Publication No. 2005-007585 relates to compositions and methods for the prevention and treatment of aphtha ulcers and herpes simplex lesions, and discloses compositions comprising polyvalent metals other than zinc contained in a mucoadhesive paste.
  • the present application is to selectively regulate the target bacterial composition of aphthous stomatitis, to provide a new concept of prophylactic or therapeutic agent capable of fundamental treatment.
  • the present application provides a pharmaceutical composition for preventing or treating aphthous stomatitis, which comprises one or more of Streptococcus salivarius and Veillonella dispar as probiotics.
  • the composition according to the present invention inhibits the growth of Acinetobacter johnsonii while increasing or affecting the growth of the Streptococcus salivarius and Veillonella dispar . And aminoglycoside-based antibiotics that are free.
  • the aminoglycoside antibiotics that may be included in the compositions herein include one or more of kanamycin, amikacin, tophramycin, dibecacin, gentamicin, sisomycin, netylmycin, neomycin, or streptomycin.
  • kanamycin amikacin
  • tophramycin dibecacin
  • gentamicin gentamicin
  • sisomycin netylmycin
  • neomycin or streptomycin.
  • streptomycin this is not limiting.
  • the aminoglycoside antibiotic is at least one of gentamicin or topramycin.
  • the growth of the Streptococcus salivarius and Veillonella dispar is increased while inhibiting the growth of Acinetobacter johnsonii .
  • Concentrations are included at about 0.5-1 ⁇ g / ml.
  • composition according to the present application is a formulation suitable for topical application, and may further comprise a bioadhesive or mucosal adhesion carrier.
  • the present disclosure provides a composition for diagnosing recurrent aphthous stomatitis comprising a substance for detecting Acinetobacter johnsonii , Streptococcus salivarius , and Veillonella dispar .
  • the present application provides Acinetobacter johnsonii , Streptococcus salivarius , and Veillonella dispar in a sample of oral mucosa derived from a subject to provide information for diagnosing aphthal stomatitis. Determining the amount of c); Determining a disbiosis index based on the determined amount; And if the disbiosis index is high compared to the normal control, it comprises the step of discriminating it as aphtha stomatitis, provides a method for determining aphtha stomatitis in vitro.
  • oral mucosa sample is a sample derived from a subject treated with aphthous stomatitis, the disbiosis index determined in the sample is no difference compared to the disbiosis index determined in the pre-oral mucosal sample of the patient Determining this as a recurrent apta stomatitis risk group.
  • the present invention includes administering, as a probiotic, one or more of Streptococcus salivarius and Veillonella dispar or a pharmaceutical composition comprising the same to a person in need of treatment for aphthal stomatitis
  • a method for treating aphthal stomatitis is provided.
  • the present disclosure provides a method for diagnosing aphthous stomatitis, wherein the method comprises: Acinetobacter johnsonii , Streptococcus salivarius , and Veillonella dispar in an oral mucosal sample from a test subject. Determining the amount of c); Determining a disbiosis index based on the determined amount; And if the disbiosis index is high compared to the normal control, determining this as aphtha stomatitis.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating aphthitis infections including aminoglycoside antibiotics and / or probiotics according to the present invention does not act nonspecifically throughout oral bacteria, such as conventional antispecific antibacterial goggle agents, but is a target microorganism. It is a therapeutic agent that selectively regulates the composition of a new concept of prevention / treatment.
  • Figures 1a to 1c is a comparison of the control group and ulcerative aphthous stomatitis (RAS AL ) and the mucosa and saliva microbiota in the control group
  • Figure 1a is a species distribution measured by the Chao 1 and Shannon diversity index
  • Figure 1b is a box & whisket plot
  • Figure 1b is a PCoA plot generated using a weighted Unifrac metric shows 51.6% of the variation of the two components
  • Figure 1c is a mucosa obtained using a weight metric
  • Figure 1d is a graph showing the Unifrac distance within and between groups of the community
  • Figure 1d is a pie graph showing the five dominant (phylum) and the top 15 dominant genus (Genus), * indicates a significant difference.
  • FIGS 2A and 2B show the dysbiosis index of recurrent aphthous stomatitis (RAS), which is the relative amount of A. johnsonii divided by the relative abundance of S. salivarius plus V. dispar in the mucosa.
  • RAS recurrent aphthous stomatitis
  • 2A shows the indices of 19 control samples and 20 RAS AL samples
  • FIG. 2B shows the index change after treatment using four RAS PS samples
  • the red dotted line indicates the logistic regression analysis. This value predicts the existence of RAS.
  • 3A and 3B show cytotoxicity of RAS-associated bacteria on human oral epithelial cells.
  • HOK-16B cells were identified as A. johnsonii, S. salivarius, and V. dispar.
  • the results of comparing the degree of proliferation compared to the degree of life and control were evaluated. *: P ⁇ 0.05 compared to control, ⁇ : P ⁇ 0.05 compared to A. johnsonii of the same MOI.
  • Figures 4a to 4d are experiments measuring the minimum inhibitory concentration of gentamycin for three bacteria associated with RAS, A. johnsonii (Fig. 4a), and V. dispar (Fig. 4b) and S. salivarius (Fig. 4c, 4d)
  • Each strain was diluted to 5x10 6 / ml in a medium containing 0.5 ⁇ 128 ⁇ g / ml gentamycin and incubated for 24 hours, the absorbance was measured at 600 nm.
  • the minimum inhibitory concentration was defined as the concentration that inhibits the growth of more than 90% of the absorbance of the bacteria cultured in the medium containing no antibiotics.
  • Figure 5a shows the addition of each strain of A. johnsonii, S. salivarius, and V. dispar to HOK-16B cells, immortalized oral epithelial cells, at 1000-fold multiples of the number of HOK-16B cells, followed by 24 hours of incubation with Annexin-V and PI staining. Is the result of Cell viability was reduced from 89% to 35% by A. johnsonii , showing very high cytotoxicity, whereas salivarius and V. dispar showed very low cytotoxicity.
  • FIG. 5B shows that when A. johnsonii is added to HOK-16B cells at 500 times the number of HOK-16B cells and cultured for 24 hours, and when 1 ⁇ g / ml concentration of gentamicin is added thereto, 1 ⁇ g / ml concentration of gentamicin and V Comparison of cytotoxicity with the addition of 100 times of dispar showed that all of the cytotoxicity of A. johnsonii was eliminated by gentamicin and that the viability of HOK-16B cells was further increased by the addition of V. dispar . .
  • FIG. 6 shows infection of oral epithelial cells with A. johnsonii, S. salivarius, and V. dispar strains associated with aphthous stomatitis at a ratio of 1: 500 relative to the number of epithelial cells.
  • the Aj bacterium which increases the risk of aphthous stomatitis, increases the secretion of inflammatory cytokines, which is a characteristic of aphthous stomatitis.
  • Ss and Vd bacteria which mediate severe pain, but lower the risk of aphthous stomatitis, can reduce inflammation and reduce pain by lowering the release of inflammatory cytokines.
  • This application is based on the identification of changes in the microflora of aphthous stomatitis. Specifically, we found that an increase in A. johnsonii , a decrease in S. salivarius and V. dispar was associated with acute stomatitis risk and recurrence in patients.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating recurrent aphthous stomatitis, which comprises, as a probiotic, one or more microorganisms of Streptococcus salivarius and Veillonella dispar and optionally antibiotics. .
  • Afta stomatitis in which the composition of the present invention is effective, is an oral mucosal ulcer, also known as ulcerated stomatitis, which is severe in comparison with other traumatic ulcers of similar size and requires frequent relapses and a long healing period (Scully). C, et al. Br Dent J. 2005; 199: 259-264). Afta stomatitis is characterized by a very strong recurrence. Ulcers associated with aphthous stomatitis are shallow painful ulcers in the oral cavity (oral mucosa surface), usually accompanied by numbness or burning sensation (prodromal period) followed by ulcerated red spots or swelling (tissue swelling). Ulcers are often covered with grey-white exudate and surrounded by erythematous margin (inflammatory). It can range in size from mild (severe afta) to 1/4 inch or more (severe afta).
  • lesion or “ulcer” herein includes lesions or ulcers of the lips, tongue, gums, and other internal tissues of the oral cavity, wherein the lesions or ulcers are mucous membranes, submucosa, epithelium, dermis and / or subcutaneous tissue It may be of.
  • Treatment includes amelioration of symptoms, healing of a disease or condition.
  • Prevention includes the prevention (prevention) of ulceration at the site showing the symptoms of pre-ulceration, wherein the pre-ulceration symptoms include pain, burning, pain, inflammation, redness before an oral ulcer is formed. It includes spots, erythematous swelling, and the like.
  • probiotic bacteria or microorganisms refers to living microbial strains that are beneficial to the host that consumes them.
  • Probiotic bacteria included in the compositions according to the present invention include Streptococcus salivarius and Veillonella dispar .
  • Probiotics included in the composition according to the present invention may be included in an amount suitable for reversing dysbiosis, a medical symptom due to an imbalance of microorganisms occurring in aphthous stomatitis, to prevent or treat stomatitis,
  • the strains described in the examples herein can be used.
  • probiotics may be included in 10 2 to 10 13 colon forming units (CFU) per ml composition.
  • composition according to the present application may further comprise an antibiotic.
  • antibiotics mean antibiotics that increase the growth of Streptococcus salivarius and do not affect the growth of Veillonella dispar , while inhibiting the growth of Acinetobacter johnsonii .
  • Selectbiotics are very effective in the prevention and treatment of stomatitis by using antibiotics that selectively inhibit bacteria that increase the risk of stomatitis, while using resident bacteria that protects the oral mucosa as probiotics.
  • A.johnsonii has been shown to induce high death of oral epithelial cells, and therefore A. johnsonii kills and, when supplied with Streptococcus salivarius and Velonella dispar probiotics, is very useful for the treatment of stomatitis. Can be effective.
  • aminoglycoside antibiotics are particularly suitable for these conditions.
  • Aminoglycoside antibiotics refer to antibiotics for Gram-negative bacteria that include amino-modified glycosides or aminosugars in their molecular structure and inhibit protein synthesis. Examples include antibiotics such as kanamycin, amikacin, toppramycin, dibecacin, gentamycin, sisomycin, netylmycin, neomycin, streptomycin.
  • aminoglycoside antibiotics may be used alone or in combination.
  • gentamycin and / or tophramycin are used.
  • gentamicin is used.
  • gentamycin is used at a concentration of 0.5-1 ⁇ g / ml, at which A. johnsonii dies , increases the growth of Streptococcus salivarius, and affects the growth of Baylonella dispar. Does not have
  • the present application has been found to be associated with changes in the microflora of aphthous stomatitis, and in this respect, the present application also relates to Acinetobacter johnsonii , Streptococcus salivarius and Veillonella dispar .
  • the present invention relates to a composition or kit for diagnosing recurrent aphthous stomatitis, comprising a detection substance.
  • the detecting substance included in the kit or the composition according to the present invention is for detecting the microorganism in a sample derived from a subject suspected of stomatitis, for example, oral mucosa.
  • Such microorganisms can be carried out biochemically or by methods comprising electrophoresis, for example after sequencing or amplification of conserved regions specific to each microorganism such as 16sRNA, or by treating the genome with restriction enzymes. have.
  • the nucleic acid sequence must show at least 97% identity compared to a known 16sRNA sequence, and the comparison is, for example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool is an algorithm for comparing primary biological sequence).
  • GAP http://ftp.sunet.se/pub/molbio/docs/afrc-molbio-man/html-format/ch5-5.2.html#Heading13
  • BESTFIT http: //www.chem.umass can be analyzed using a program such as .edu / ⁇ cmartin / Courses / BioStruct / Proj / Flanagan / bestfit.html.
  • polynucleotide probes specific for 16sRNA genes of each bacterium may be synthesized and then attached to gold nanoparticles to be detected by electrochemical detection (ECD) .Afonso et al., Biosensors and Bioelectronics 2013, Vol 40 : pp 121-126).
  • ECD electrochemical detection
  • compositions according to the invention can be administered parenterally in a variety of ways, particularly preferably administered topically to the mucosal surface.
  • the dosage depends on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the time of day, and may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • composition according to the present application is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically or therapeutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level refers to the severity of the patient's disease, Activity, sensitivity to drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may be a gel, ointment, cream, paste, lotion, liquid (e.g., mouthwash and wash), drug bandage, spray, or any suitable for the treatment of oral or skin ulcers / lesions. It may be formulated in a form suitable for various topical administrations.
  • composition according to the invention can be formulated in solid, liquid or paste form.
  • composition according to the present application may further comprise a suitable solid or liquid carrier dermatologically or pharmaceutically acceptable.
  • Solid carriers include carboxymethylcellulose or derivatives thereof, Carbopol (R) polymers, polyacrylic acid polymers, gelatin, or mixtures thereof.
  • Suitable liquid carriers include substances in which the antibiotics or probiotics according to the invention can be dissolved or dispersed to an effective level.
  • the liquid composition may be applied through an absorbent pad used for dipping of bandages and other dressings, or may be sprayed onto the affected area using a pumped or aerosol sprayer and may be used as an oral cleanser.
  • the composition according to the present invention comprises a bioadhesive or mucoadhesive paste or carrier.
  • CARBOPOL® polymers, Carbopol-poloxamer gels, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethyl cellulose, guar gum, polyvinyl pyrrolidone, chitosan, polyacrylic acid, hydroxypropyl cellulose, sodium starch glycolate, Alginates include, but are not limited to.
  • formulations comprising bioadhesive agents and / or mucoadhesive carriers are prepared to enable long-term contact, for example from about 1 hour to about 8 hours, at pre-ulcer and / or post-ulcer tissue sites. .
  • Antibiotics and probiotics included in the compositions according to the present disclosure may be included in one formulation as a complex, or each may be formed in separate formulations and administered together or continuously.
  • the present disclosure relates to a method capable of diagnosing aphthous stomatitis by changing the microflora.
  • determining the amount (abundance) of Aj, Ss, Vd in the oral mucosa sample from the subject Determining a disbiosis index based on the determined amount; And when the disbiosis index is high compared to the normal control, it discloses a method for determining aphtha stomatitis comprising the step of identifying it as aphtha stomatitis.
  • the disbiosis index in the method according to the invention is defined as the relative amount of A. johnsonii divided by the relative amount of S. salivarius plus V. dispar in the mucosa.
  • the relative amounts of the three bacteria can be measured by quantitative PCR, for example, real-time PCR using primers specific for each bacterial 16sRNA gene.
  • Bacterial specific 16sRNA can be obtained from the RA database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), etc., and the difference is obtained after aligning using a sequence comparison program such as BLAST. It will be easy to prepare a primer for detecting.
  • Polynucleotide sequence comparisons can also be performed, for example, by GAP (http://ftp.sunet.se/pub/molbio/docs/afrc-molbio-man/html-format/ch5-5.2.html#Heading13) or BESTFIT (http: /www.chem.umass.edu/ ⁇ cmartin/Courses/BioStruct/Proj/Flanagan/bestfit.html).
  • polynucleotide probes specific for 16sRNA genes of each bacterium may be synthesized and then attached to gold nanoparticles to be detected by electrochemical detection (ECD) .Afonso et al., Biosensors and Bioelectronics 2013, Vol 40 : pp 121-126).
  • ECD electrochemical detection
  • the method according to the invention can be used to predict relapse of aphthous stomatitis.
  • the method according to the present application uses a mucus or saliva sample derived from a patient treated with aphtha stomatitis, in which the disbiosis index determined in the sample has no difference compared to the patient's pretreatment sample. Further comprising the step of identifying stomatitis risk group. If stomatitis recurrences are predicted, relapses can be prevented by returning the microflora to a normal state through the administration of probiotics according to the present application.
  • the mucosal microflora of the RAS patient lesion was compared with that of the corresponding site of the normal control group, and compared to that of the RAS AL with the site of healing after treatment. Only 4 patients returned for further sampling one week after the lesion had completely healed. Two out of four (RAS2 and RAS3) used 0.1% dexamethasone gargles during the intersessional period.
  • RAS2 and RAS3 used 0.1% dexamethasone gargles during the intersessional period.
  • a 20 mm x 20 mm sterile polyvinylidene difluoride membrane (Korea Inc, Seoul, Korea) was placed in the widest ulcer lesion for 30 seconds.
  • samples were taken from the lip or buccal mucosa. A minimum of 2 ml of unstimulated whole saliva sample was collected to spit out.
  • Acinetobacter johnsonii KCTC 12405 (Korean Collection for Type Culture, Daejeon, Korea) was cultured in BHI medium under aerobic 30 ° C.
  • Veillonella dispar KCOM 1864 (Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea) was incubated in ATCC medium 188 medium under anaerobic 37 ° C.
  • Streptococcus salivarius KCTC 5512 (KCTC) and Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 (American Type Culture Collection, USA) were incubated in ATCC medium 188 and BHI medium containing 5 ⁇ g / ml hemin and 10 ⁇ g / ml vitamin K under anaerobic 37 ° C.
  • HOK-16B (Park NH et al., Oncogene 1995, 10 (11): 2145-2153) were cultured in keratin growth medium (Clonetics, USA) containing growth factors. HOK-16B cells were seeded in triplicate at concentrations of 4 ⁇ 10 4 cells / well in each well of a 48 well plate and incubated for 24 hours and infected with bacteria with multiplicity of infection (MOI) 100, 500, and 1000. After 24 hours of saturation humidity at 95% air and 5% CO 2 , the cell viability and cell number of each well were apoptified using trypanblue exclusion kit (Life technologies, USA) according to the manufacturer's method. Whether or not was measured. In addition, cells were stained using an Annexin V FITC and PI kit (Life technologies, USA) for flow cytometry, and flow cytometry (BD Bioscience, USA) was performed.
  • MOI multiplicity of infection
  • Epithelial cells were infected with each strain of A. johnsonii, S. salivarius, and V. dispar with MOI 500 as described above.
  • Inflammatory cytokines TNF-alpha, IL-1beta and IL-8 secreted into cultures 4, 16 and 24 hours after infection were measured according to the manufacturer's method using an ELISA kit (R & D systems, USA).
  • intergroup UniFrac distance was higher than the intragroup distance of the control group, indicating that there was a significant difference in the overall bacterial profile between the control and RAS AL samples (FIG. 1C). There was no significant difference between intra and intergroups at UniFrac distance in the salivary community reflecting the lesion site as well as the non-lesion site of the patient.
  • Relative amounts in Table 2 are expressed in median% and range, with arrows indicating an increase or decrease in RAS or recurrent aphthous ulcers AL compared to the control.
  • the disbiosis index was accurately predicted in 82% of the total cases analyzed for the absence and presence of RAS (95% of control and 70% of RAS, FIG. 2A).
  • RAS AL microflora Another important issue was to determine whether the characteristics of the RAS AL microflora were intrinsic to RAS or whether the disease resulted from ulcers / inflammatory. In four patients who donated samples after treatment, three had a decreased biopsies index after treatment (FIG. 2B). In RAS16, the disbiosis index did not change, presumably because A. johnsonii was not detected in the RAS AL sample, and the amount of S. salivarius plus V. dispar increased from 2.5% to 11.7% after treatment.
  • FIGS. 3A and 3B The results are described in FIGS. 3A and 3B.
  • A. johnsonii showed greater cytotoxicity against HOK-16B cells compared to S. salivarius and V. dispar , comparable to cytotoxicity by P. gingivalis .
  • A. johnsonii inhibited the proliferation of HOK-16B cells even at MOI 100.
  • A. johnsonii did not grow at 37 ° C., which excludes cytotoxicity due to bacterial growth.
  • each strain of A. johnsonii, S. salivarius, and V. dispar was added to HOK-16B cells, oral epithelial cells, at 1000-fold multiples of HOK-16B cells , and cultured for 24 hours, followed by Annexin-V and PI staining.
  • FIG. 5A cell viability was reduced from 89% to 35% by A. johnsonii , showing very high cytotoxicity, whereas salivarius and V. dispar showed very low cytotoxicity.
  • Each strain of A. johnsonii, S. salivarius, and V. dispar was diluted to 5 ⁇ 10 6 / ml in a medium containing 0.5-128 ⁇ g / ml gentamicin and incubated for 24 hours, and then absorbance was measured at 600 nm.
  • the minimum inhibitory concentration was defined as the concentration that inhibits the growth of more than 90% of the absorbance of the bacteria cultured in the medium containing no antibiotics.
  • FIGS. 4A-4D The results are described in FIGS. 4A-4D.
  • the minimum inhibitory concentration for A. johnsonii is 0.5 ⁇ g / ml
  • salivarius are 4-32 ⁇ g / ml, as shown in FIGS. 4B, 4C, and 4D.
  • both strains (1) and (2) showed higher growth than bacteria grown in the medium without antibiotics at concentrations below the minimum inhibitory concentration.
  • 0.5-1 ⁇ g / ml gentamycin is a concentration that inhibits the growth of A. johnsonii while increasing the growth of S. salivarius and having minimal effect on the growth of V. dispar .
  • Example 5 S. salivarius Wow V. dispar Inhibition of cytokine secretion by bacteria

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Abstract

본원은 프로바이오틱스로서 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 중 하나 이상의 미생물 및/또는 아미노글리코시드계의 항생제를 포함하는 아프타구내염 치료 또는 예방용 약학 조성물을 개시한다. 본원은 또한 아시네토박터 존슨이(Acinetobacter johnsonii), 스트렙토코커스 살리바리우스 및 베일로넬라 디스파르 검출용 물질을 포함하는 재발성 아프타 구내염 진단용 조성물을 개시하며, 아시네토박터 존슨이, 스트렙토코커스 살리바리우스 및 베일로넬라 디스파르의 양을 이용한 아프타구내염의 재발여부를 판별하는 방법을 개시한다.

Description

아미노글리코시드계 항생제 및 프로바이오틱스를 포함하는 아프타 구내염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본원은 항생제 및 프로바이오틱스를 이용한 재발성 아프타 구내염의 치료 또는 예방과 관련된 것이다.
궤양성 구내염(ulcerated stomatitis)이라고도 알려진 아프타 구내염(aphthous stomatitis)은 구강 점막 내 궤양으로 유사한 크기의 다른 외상성 궤양과 비교하여 극심한 통증을 동반하며 빈번한 재발과 긴 치유기간이 필요한 질환이다 (Scully C, et al. Br Dent J. 2005;199: 259-264). 아프타 구내염은 통상 약 7일 내지 약 10일간 지속되나, 수주 동안 계속될 수도 있으며, 인구의 10-20%가 일생 동안 구강 궤양에 걸리는 것으로 알려져 있다 (Aas JA, et al., J Clin Microbiol. 2005;43: 5721-5732).
하지만 병을 일으키는 원인에 대하여는 명확하게 밝혀진 바가 없어, 병인 기전에 따른 정확한 표적에 기반을 둔, 근원적으로 치료 약물이 없는 것이 실정이다. 따라서 치료는 대증치료에 집중되어 있으며, 환자의 임의 완화 치료로 인한 부작용으로 인한 문제도 심각하다.
보편적으로 사용되는 치료법은 통증을 일시적으로 경감시키는 국소 소독제, 항생제, 및 수면제(예컨대, 2% 점성 리도카인 또는 10-20% 벤조카인 겔)를 사용하는 것이다. 또한, 트리암시놀론 아세토나이드(triamcinolone acetonide) 및 덱사메타손(dexamethasone)과 같은 글루코코르티코이드를 국소적으로 도포하기도 한다('Oral and Maxillofacial Pathology' by B.W. Neville et al. 1995; pp. 236-239). 하지만 글루코코르티코이드는 심각한 부작용으로 인해 사용 시 처방을 요한다. 아울러 암렉사녹스(amlexanox) 경구 페이스트 5%(Block Drug Company 제조의 Aphthasol™)가 아프타 궤양을 치료하는 처방약으로 사용되지만 그 효능은 여전히 상당히 제한적이다.
미국 특허 제6148718호는 구강점막 급성 감염의 치료에 사용되는 투약제형에 관한 것으로 페니실린, 베타락탐계 등의 항생제를 구강 사용에 효과적으로 사용될 수 있도록 하는 제형을 개시한다.
한국공개특허공보 2005-007585는 아프타 궤양 및 단순 헤르페스 병변의 예방 및 치료조성물 및 방법에 관한 것으로, 유착성 페이스트(mucoadhesive paste) 중에 포함된 아연을 제외한 다가 금속을 포함하는 조성물을 개시한다.
따라서 병인 기전에 따른 정확한 타겟을 가지는 이를 근원적으로 치료할 수 있는 약물의 개발이 필요하다.
본원은 아프타 구내염의 타겟 세균 조성을 선택적으로 조절해주어, 근본적 치료가 가능한 새로운 개념의 예방 또는 치료제를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 프로바이오틱스로서 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 중 하나 이상을 포함하는 아프타 구내염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 아시네토박터(Acinetobacter johnsonii)의 증식은 억제하면서 상기 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar)의 증식은 증가시키거나 또는 증식에는 영향이 없는 아미노글리코시드계 항생제를 추가로 포함한다.
일 구현예에서 본원에 조성물에 포함될 수 있는 아미노글리코시드계 항생제는 카나마이신, 아미카신, 토프라마이신, 디베카신, 젠타마이신, 시소마이신, 네틸마이신, 네오마이신, 또는 스트렙토마이신 중 하나 이상이나, 이로 제한하는 것은 아니다.
일 구현예에서는 특히 아미노글리코시드계 항생제는 젠타마이신 또는 토프라마이신 중 하나 이상이다.
일 구현예에서 아시네토박터(Acinetobacter johnsonii)의 증식은 억제하면서 상기 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar)의 증식은 증가시키거나 또는 증식에는 영향이 없는 젠타마이신의 농도는 약 0.5 ~ 1μg/ml로 포함된다.
일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 국소 도포에 적합한 제형으로, 생체 유착성 또는 점막 유착성 담체를 추가로 포함할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 아시네토박터(Acinetobacter johnsonii), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 검출용 물질을 포함하는 재발성 아프타 구내염 진단용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 아프타 구내염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검사 대상자 유래의 구강 점막 시료에서 아시네토박터(Acinetobacter johnsonii), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 의 양을 결정하는 단계; 상기 결정된 양에 근거하여 디스바이오시스 인덱스를 결정하는 단계; 및 상기 디스바이오시스 인덱스가 정상 대조군과 비교하여 높은 경우, 이를 아프타 구내염으로 판별하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 아프타 구내염 판별 방법을 제공한다.
본원에 따른 방법에서 구강 점막 시료는 아프타 구내염으로 치료받은 대상자 유래의 시료로, 상기 시료에서 결정된 디스바이오시스 인덱스가 상기 환자의 치료전 구강 점막 시료에서 결정된 디스바이오시스 인덱스와 비교하여 차이가 없는 경우 이를 재발성 아프타 구내염 위험군으로 판별하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서 본원은 프로바이오틱스로서 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 중 하나 이상 또는 상기를 포함하는 약학 조성물을 아프타 구내염 치료가 필요한 사람에게 투여하는 단계를 포함하는 아프타 구내염 치료 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 아프타 구내염 진단 방법을 제공하며, 상기 방법은 검사 대상자 유래의 구강 점막 시료에서 아시네토박터(Acinetobacter johnsonii), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 의 양을 결정하는 단계; 상기 결정된 양에 근거하여 디스바이오시스 인덱스를 결정하는 단계; 및 상기 디스바이오시스 인덱스가 정상 대조군과 비교하여 높은 경우, 이를 아프타 구내염으로 판별하는 단계를 포함한다.
본원에 따른 아미노글리코시드계 항생제 및/또는 프로바이오틱스를 포함하는 아프타구내염 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 기존의 비특이적으로 작용하는 항균 가글제와 같이 구강세균 전반에 비특이적으로 작용하는 것이 아니라, 표적이 되는 미생물의 조성을 선택적으로 조절해주는 치료제로 새로운 개념의 예방/치료제로 그 치료효과가 크다.
도 1a 내지 도 1c는 대조군과 궤양이 있는 아프타 구내염(RASAL)과 대조군에서 점막 및 타액의 미생물총(microbiota)을 비교한 결과로, 도 1a는 Chao 1 및 Shannon 다양성 인덱스에 의해 측정된 종 분포를 box & whisket 플롯으로 나타낸 것이고, 도 1b는 가중치 Unifrac 메트릭을 이용하여 생성된 PCoA 플롯으로 두 가지의 성분이 변화(varience)의 51.6%를 나타내고 있으며, 도 1c는 가중치 메트릭을 이용하여 수득한 점막 컴뮤너티의 그룹내 및 그룹간 Unifrac 거리를 나타낸 그래프이고, 도 1d는 5개의 우점 문(phylum)과 상위 15개의 우점 속(Genus)을 나타내는 파이 그래프로, *는 유의적 차이를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 RAS(recurrent aphthous stomatitis)의 디스바이오시스(dysbiosis) 인덱스를 나타내는 것으로, 점막에서 A. johnsonii 의 상대적인 양을 S. salivarius 플러스 V. dispar의 상대적 양(abundance)으로 나눈 값으로 정의되며, 도 2a는 19개 대조군 시료 및 20개의 RASAL 시료의 인덱스를 나타내고, 도 2b는 치료 후 인덱스 변화를 4개의 RASPS 시료를 이용하여 분석한 결과로, 적색의 점선은 로지스틱 회귀분석에 의거한 RAS의 존재를 예측하는 값이다.
도 3a 및 b는 RAS와 연관된 박테리아가 인간 구강 상피 세포에 미치는 세포독성을 분석한 결과로 HOK-16B 세포를 A. johnsonii, S. salivarius, 및 V. dispar 각 균주를 MOI 100, 500, 및 1000로 24시간 동안 처리한 후 트리판블루 배제 염색을 수행하여, 각각 생활도 및 대조군과 비교한 증식정도를 비교한 결과이다. *: P < 0.05 compared to control, †: P < 0.05 compared to A. johnsonii of the same MOI.
도 4a 내지 4d는 RAS와 연관된 세 가지 세균에 대한 젠타마이신의 최소억제농도를 측정한 실험으로 A. johnsonii (도 4a), 및 V. dispar (도 4b) 및 S. salivarius (도 4c, 4d) 각 균주를 0.5 ~ 128μg/ml 젠타마이신이 포함된 배지에 5x106/ml로 희석해 24시간 배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정 하였다. 최소억제농도는 항생제가 포함되지 않은 배지에서 배양한 세균의 흡광도 대비 90%이상의 성장을 억제하는 농도로 정의하였다.
도 5a는 불멸화된 구강상피세포인 HOK-16B 세포에 A. johnsonii, S. salivarius, 및 V. dispar 각 균주를 HOK-16B 세포 수 대비 1000배수로 첨가해 24시간 배양한 후 Annexin-V와 PI 염색을 수행한 결과이다. A. johnsonii에 의해 세포 생존율이 89%에서 35%로 감소해 매우 높은 세포독성을 보인데 반해 salivarius와 V. dispar 는 매우 낮은 세포독성을 보였다.
도 5b는 HOK-16B 세포에 A. johnsonii를 HOK-16B 세포 수 대비 500배수로 첨가해 24시간 배양했을 때와 여기에 1μg/ml 농도의 젠타마이신을 추가한 경우 1μg/ml 농도의 젠타마이신과 V. dispar 100배수를 첨가했을 때 세포독성을 비교한 결과로 젠타마이신에 의해 A. johnsonii의 세포독성이 모두 사라졌고 V. dispar 첨가에 의해 HOK-16B 세포의 생활도(viability)가 더 증가된 것을 나타낸다.
도 6은 구강상피세포에 아프타성구내염과 관련이 있는 A. johnsonii, S. salivarius, 및 V. dispar 각 균주를 상피세포 수 대비 1:500의 비율로 감염시킨 후, 4시간, 16시간 및 24시간 후에 배양액에 분비된 염증성 싸이토카인인 TNF-알파, IL-1베타 및 IL-8을 ELISA로 측정한 결과로, 아프타구내염의 위험을 높이는 Aj 세균은 염증성 싸이토카인의 분비를 증가시켜 아프타성구내염의 특징인 심한 통증을 매개하나, 아프타성구내염의 위험을 낮추는 Ss와 Vd 세균은 염증성 싸이토카인의 분비를 낮추어 염증을 줄이고, 통증도 줄일 수 있음을 나타낸다.
본원은 아프타구내염의 미생물총의 변화 규명에 근거한 것이다. 구체적으로 본원에서는 환자에서 A. johnsonii 의 증가, S. salivarius 및 V. dispar의 감소가 아프타 구내염 위험 및 재발과 연관되어 있음을 발견하였다.
따라서 한 양태에서 본원은 프로바이오틱스로서 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 중 하나 이상의 미생물과 선택적으로 항생제를 포함하는 재발성 아프타 구내염 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본원의 조성물이 효과가 있는 아프타 구내염은 궤양성 구내염(ulcerated stomatitis)이라고도 알려진 구강 점막 내 궤양으로 유사한 크기의 다른 외상성 궤양과 비교하여 극심한 통증을 동반하며 빈번한 재발과 긴 치유기간이 필요한 질환이다(Scully C, et al. Br Dent J. 2005;199: 259-264). 아프타 구내염은 재발성이 매우 강한 것이 특징이다. 아프타 구내염에 동반되는 궤양은 구강(구강 점막 표면)의 얕은 통증성 궤양으로 통상 저림 또는 작열감(전구기; prodromal period)에 이어 궤양화된 붉은 반점 또는 종창(조직의 팽창)이 동반된다. 궤양은 흔히 회백색 삼출물(exudate)로 피복되며, 연변 홍반(erythematous margin)(염증성)으로 둘러싸인다. 이는 극미한 크기(경증 아프타)에서부터 1/4 인치 이상의 크기(중증 아프타)를 갖는다.
본원에서 "병변" 또는 "궤양"이란 용어는 입술, 혀, 잇몸, 및 구강의 기타 내부 조직의 병변 또는 궤양을 포함하며, 상기 병변 또는 궤양은 점막, 점막하부, 상피, 진피 및/또는 피하 조직의 것일 수 있다.
본원에서 "치료"는, 증후의 개선, 질병 또는 증상의 치유를 포함한다.
본원에서 "예방"은 사전-궤양화 증상을 나타내는 부위에서의 궤양화 예방(방지)을 포함하는 것으로, 사전-궤양화 증상은 구강내 궤양이 형성되기 전의 자통감, 작열감, 통증, 염증, 붉은 반점, 홍반성 종창 등을 포함하는 것이다.
본원에서 “프로바이오틱 박테리아 또는 미생물”또는 “프로바이오틱스”는 이를 섭취하는 숙주에게 유익한 살아있는 미생물 균주를 일컫는 것이다.
본원에 따른 조성물에 포함되는 프로바이오틱 박테리아는 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar)를 포함한다.
본원에 따른 조성물에 포함되는 프로바이오틱스는 아프타 구내염에서 발생한 미생물의 불균형에 의한 의학적 증상인 디스바이오시스(dysbiosis)를 되돌려, 구내염을 예방 또는 치료하기에 적합한 양으로 포함될 수 있으며, 시중에서 구입할 수 있으며, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 균주가 사용될 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 프로바이오틱스는 조성물 ml 당 102 내지 1013 CFU(colony forming units)로 포함 될 수 있다.
본원에 따른 조성물은 항생제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 항생제는 특히 아시네토박터(Acinetobacter johnsonii)의 증식은 억제하면서 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius)의 증식을 증가시키고 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar)의 증식에는 영향을 미치지 않는 항생제를 의미한다.
이러한 항생제와 프로바이토틱스가 함께 사용되는 치료제를 셀렉트바이오틱스로 명명하였다. 이러한 셀렉트바이오틱스는 구강점막을 보호하는 상주균을 프로바이오틱스로 사용함과 동시에 구내염의 위험을 높이는 세균을 선택적으로 억제하는 항생제를 병용하여 구내염의 예방 및 치료에 매우 효과적이다.
본원에 따르면 A.johnsonii가 구강상피세포의 높은 사멸을 유도하는 것으로 나타났으며, 따라서 A. johnsonii은 사멸시키며, 스트렙토코커스 살리바리우스 및 베일로넬라 디스파르를 프로바이오틱스로 공급할 경우, 구내염의 치료에 매우 효과적일 수 있다.
본원에서는 특히 아미노글리코시드계 항생제가 상기 조건에 적합함을 발견하였다. 아미노글리코시드계 항생제는 분자 구조에 아미노-변형된 글리코시드 또는 아미노슈가를 포함하는 그람음성 박테리아에 대한 항생제를 일컫는 것으로, 단백질 합성을 억제한다. 예를 들면 카나마이신, 아미카신, 토프라마이신, 디베카신, 젠타마이신, 시소마이신, 네틸마이신, 네오마이신, 스트렙토마이신과 같은 항생제를 포함한다. 본원에 따른 일 구현예에서는 아미노글리코시드계 항생제가 단독 또는 조합으로 사용될 수 있다. 본원에 따른 다른 구현예에서는 젠타마이신 및/또는 토프라마이신이 사용된다.
본원에 따른 일 구현예에서는 젠타마이신이 사용된다.
본원에 따른 다른 구현예에서 젠타마이신은 0.5 ~ 1μg/ml의 농도로 사용되며, 상기 농도에서 A. johnsonii은 사멸시키며, 스트렙토코커스 살리바리우스의 증식은 증가시키고, 베일로넬라 디스파르의 증식에는 영향을 미치지 않는다.
본원은 아프타 구내염의 미생물총의 변화와 연관되어 있음을 발견한 것으로, 이런 측면에서 본원은 또한 아시네토박터(Acinetobacter johnsonii), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 검출용 물질을 포함하는 재발성 아프타 구내염 진단용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
본원에 따른 키트 또는 조성물에 포함된 검출용 물질은 구내염이 의심되는 대상자 유래의 시료 예를 들면 구강 점막에서 상기 미생물을 검출하기 위한 것이다. 상기와 같은 미생물은 생화학적으로 또는 예를 들면 각 미생물에 특이적인 보존된 영역 예를 들면 16sRNA의 서열분석 또는 증폭, 또는 유전체를 제한효소로 처리한 후 전기영동을 포함하는 방법에 의해 수행될 수 있다. 일반적으로 동일한 종에 속하는 박테리아로 판단되기 위해서는 공지된 16sRNA 서열과 비교하여 핵산서열이 적어도 97%의 동일성을 나타내야 하며, 비교는 예를 들면 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool is an algorithm for comparing primary biological sequence information) GAP (http://ftp.sunet.se/pub/molbio/docs/afrc-molbio-man/html-format/ch5-5.2.html#Heading13) 또는 BESTFIT (http://www.chem.umass.edu/~cmartin/Courses/BioStruct/Proj/Flanagan/bestfit.html)과 같은 프로그램을 이용하여 분석될 수 있다. 또는 각 세균의 16sRNA 유전자에 특이적인 폴리뉴클레오타이드 프로브를 합성한 후 여기에 금나노 입자를 붙여 전기화학 검출법(electrochemical detection, ECD)으로 검출할 수도 있으며, Afonso et al., Biosensors and Bioelectronics 2013,Vol 40: pp 121-126)에 기재된 바를 참고할 수 있다.
본원에 따른 조성물은 다양한 방법으로 비경구투여 될 수 있으며, 특히 점막 표면에 국소 투여되는 것이 바람직하다.
투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본원에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적 또는 치료적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본원에 따른 약학적 조성물로서 겔, 연고, 크림, 페이스트, 로션, 액상(예컨대, 구강 세정액 및 세척액), 약물 도포 붕대(medicated bandage), 스프레이, 또는 구강 또는 피부 궤양/병변의 치료에 적절한 임의의 다양한 국소 투여에 적합한 형태로 제형화될 수 있다.
본원에 따른 조성물은 고형, 액상 또는 페이스트 형태로 제형화 될 수 있다.
이러한 측면에서 본원에 따른 조성물은 피부과학적으로(dermatologically) 또는 약학적으로 허용 가능한 적절한 고체 또는 액상 담체를 추가로 포함할 수 있다.
고형 담체는 카르복시메틸셀룰로오스 또는 그의 유도체, Carbopol(R) 폴리머, 폴리아크릴산 폴리머, 젤라틴, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 적절한 액상 담체는 본원에 따른 항생제 또는 프로바이오틱스가 유효한 수준으로 용해 또는 분산될 수 있는 물질을 포함한다. 액상 조성물은 붕대 및 기타 드레싱의 침지에 사용되는 흡수성 패드(absorbent pad)를 통해 도포되거나, 펌프형 또는 에어로졸 분무기(aerosol sprayer)를 이용해 환부에 분무될 수 있으며, 구강 세정제로서 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 생체 유착성 또는 점막 유착성 페이스트 또는 담체를 포함한다. 예를 들면 CARBOPOL® 폴리머, Carbopol-폴록사머 겔, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 소디움 카르복시메틸 셀룰로스, 구아검, 폴리비닐 피롤리돈, 키토산, 폴리아크릴산, 하이드록시프로필 셀룰롯, 소디움 스타치 클리콜레이트, 알기네이트를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 일반적으로, 생체 유착성 제제 및/또는 점막 유착성 담체를 포함하는 제형은 사전-궤양 및/또는 사후-궤양 조직 부위에서 장기간 예를 들면 약 1시간 내지 약 8시간의 접촉이 가능할 수 있도록 제조된다.
본원에 따른 조성물에 포함되는 항생제 및 프로바이오틱스는 복합체로서 하나의 제형에 포함되거나 또는 각각 별개의 제형으로 형성되어 함께 또는 연속적으로 투여될 수 있다.
더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화 할 수 있다.
다른 측면에서 본원은 미생물총의 변화에 의해 아프타 구내염을 진단할 수 있는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서는 아프타 구내염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검사대상자 유래의 구강 점막 시료 에서 Aj, Ss, Vd의 양(abundance)을 결정하는 단계; 상기 결정된 양에 근거하여 디스바이오시스 인덱스를 결정하는 단계; 및 상기 디스바이오시스 인덱스가 정상 대조군과 비교하여 높은 경우, 이를 아프타 구내염으로 판별하는 단계를 포함하는 아프타 구내염 판별 방법을 개시한다.
본원에 따른 방법에 디스바이오시스 인덱스는 점막에서 A. johnsonii 의 상대적 양을 S. salivarius plus V. dispar 의 상대적 양으로 나눈 값으로 정의된다.
본원에 따른 방법에서 세 가지 세균의 상대적인 양은 각 세균의 16sRNA 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 정량적 PCR 예를 들면 실시간 증폭 PCR(real-time PCR)로 측정할 수 있다. 세균에 특이적인 16sRNA는 RA database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) 등에서 수득할 수 있으며, 이를 BLAST와 같은 서열비교 분석 프로그램을 이용하여 정렬한 후, 차이가 나는 부분을 검출하는 프라이머를 용이하게 제작할 수 있을 것이다. 폴리뉴클레오타이드 서열 비교는 또한 예를 들면 GAP (http://ftp.sunet.se/pub/molbio/docs/afrc-molbio-man/html-format/ch5-5.2.html#Heading13) 또는 BESTFIT (http://www.chem.umass.edu/~cmartin/Courses/BioStruct/Proj/Flanagan/bestfit.html)과 같은 프로그램을 이용하여 분석될 수 있다.
또는 각 세균의 16sRNA 유전자에 특이적인 폴리뉴클레오타이드 프로브를 합성한 후 여기에 금나노 입자를 붙여 전기화학 검출법(electrochemical detection, ECD)으로 검출할 수도 있으며, Afonso et al., Biosensors and Bioelectronics 2013,Vol 40: pp 121-126)에 기재된 바를 참고할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 아프타 구내염의 재발 예측에 사용될 수 있다. 이런 측면에서 본원에 따른 방법은 점액 또는 타액 시료로서 아프타 구내염으로 치료받은 환자 유래의 것을 사용하여 상기 시료에서 결정된 디스바이오시스 인덱스가 상기 환자의 치료전 시료와 비교하여 차이가 없는 경우 이를 재발성 아프타 구내염 위험군으로 판별하는 단계를 추가로 포함한다. 구내염 재발이 예측되는 경우, 본원에 따른 프로바이오틱스의 복용을 통해 미생물총을 정상 상태로 돌려놓음으로서 재발을 방지할 수 있을 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험방법 및 재료
집단 연구 및 시료 수집
본 연구는 헬싱키 선언 및 STROBE 가이드라인에 맞추어 진행되었다. 프로토콜(CRI 12018)은 서울대학교 치과병원 연구윤리 위원회에 의해 승인되었다. 2013년 2월부터 2014년 1월까지 서울대학교 치과병원의 구강내과 외래를 방문한 경미한 RAS 활성 병변(RASAL)이 발생한 20명의 환자와 구강 점막 질환이 없는 20명의 대조군 환자가 연구에 등록하였다. 모든 연구는 고지된 승인하에 수행되었다. 연구수행 직전 달에 항생제 또는 스테로이드를 사용한 환자 및 구강건조증(비자극 전체 타액 유속 <0.1ml/min)을 갖는 대상체는 제외하였다. 또한 다른 구강 점막 질환(칸디다 균 수 > 1,000 colony forming unit/ml, 혈액결핍 관련 질환)을 갖는 환자도 제외하였다. RAS 환자 병변 점막 미생물총을 정상 대조군의 상응하는 부위의 미생물총과 비교하였으며, 치료 후 치유가 진행되는 부위가 있는 RASAL의 미생물총과도 비교하였다. 단지 4명의 환자만이 병변이 완전히 치유 된 후 일주일째 추가의 시료채취를 위해 다시 내원하였다. 4명 중 두 명(RAS2 및 RAS3)은 사잇기간에 0.1% 덱사메타손 가글을 사용하였다. 또한 RASAL의 타액의 미생물총도 비교를 하였으며, 이는 대조군과 비교하여 환자의 건강한 부위 및 질환이 발생한 부위의 미생물 차이를 반영한다. 모든 대상체는 시료채취 전 두시간 동안 섭취 및 항균 구강세정제 사용을 피하도록 하였다. 점막 시료 채취를 위해, 20 mm x 20 mm 크기의 멸균된 폴리비닐리덴 디플루오리드 막(Korea Inc, Seoul, Korea)을 가장 넓은 궤양병변 부위에 30초 통안 정치하였다. 건강 대조군의 경우, 입술 또는 볼 점막으로부터 시료를 채취하였다. 최소 2ml의 비자극된 전타액 시료를 뱉도록 하여 수집하였다.
DNA 추출, 16S rRNA 유전자 증폭 및 파이로서열분석
타액을 원심분리하여 막 및 펠렛으로부터 PowerSoil DNA Isolation Kit(MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 유전체 DNA를 분리하였다. 40개의 점막(n=20, n=20, and n=4 for Controls, RASAL, 및 RASPS)과 20개 타액(n=10 및 n=10 대조군 및 RASAL)에 대하여 파이로서열분석을 수행하였다. 최종 연구 사이즈는 각 그룹에서 10개의 시료를 분석한 후에 결정되었다. 16S rRNA 유전자의 증폭 및 서열분석은 454 GS FLX Titanum Sequencing System (Roche, USA)을 사용하여 ChunLab Inc. (Seoul, Korea)에 의뢰하여 수행되었다.
파이로서열분석 데이터 분석
위에 기재한 바와 같이 분석한 서열에서 PCR 프라이머 서열을 제거한 후, 300bp 보다 짧거나 또는 두 개 이상의 불명확한 염기를 포함하는 서열을 제거하였다. 각 서열판독 결과의 계통분류는 EzTaxon database-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net) [Chun J, et al. Int J Syst Evol Microbiol. 2007;57: 2259-2261]에 대하여 수행되었다. 종의 풍부성 및 다양성은 the Ribosomal RNA database project's pyrosequencing pipeline (http://pyro.cme.msu.edu)을 이용하여 수행되었다. 판독서열을 동일한 파일로타입에 할당하기 위한 컷오프 값은 ≥ 97% 동일성으로 하였다. 무작위 샘플링을 통하여 시료간 판독 카운트에 있어 변이를 조정하였다. 커뮤너티 간의 전체적인 계통거리는 the weighted Fast UniFrac [Hamady M, et al. ISME J. 2010;4: 17-27.]를 이용하여 계산하였고, principal coordinate analysis (PCoA)를 이용하여 가시화하였다. 나아가 The Human Microbiome Project (HMP) Consortium [Human Microbiome Project Consortium. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 2012;486: 207-214.] 에 의해 발표된 볼 점막 및 타액의 파이로서열분석 결과를 본 연구의 대조군 대상체의 것과 비교하였다.
박테리아, 상피 세포 배양 및 염색
Acinetobacter johnsonii KCTC 12405 (Korean Collection for Type Culture, Daejeon, Korea) 는 호기성의 30℃ 조건에서 BHI 배지에서 배양하였다. Veillonella dispar KCOM 1864 (Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea) 는 혐기성의 37℃ 조건에서 ATCC medium 188 배지에서 배양하였다. Streptococcus salivarius KCTC 5512 (KCTC) 및 Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 (American Type Culture Collection,, USA) 혐기 37℃ 조건에서 5μg/ml hemin 및 10μg/ml vitamin K을 포함하는 ATCC medium 188 및 BHI 배지에서 배양하였다. 불멸화 인간 구강 케라티노사이트 HOK-16B (Park NH et al., Oncogene 1995, 10(11):2145-2153)는 성장인자를 포함하는 각질 성장 배지 (Clonetics, USA)에서 배양되었다. HOK-16B 세포는 48웰 플레이트의 각 웰에 4x104cells/well의 농도로 3중으로 씨딩된 후 24시간 동안 배양하였고, MOI (multiplicity of infection) 100, 500, 및 1000로 박테리아로 감염되었다. 이어 포화습도 95% 공기 및 5% CO2, 조건에서 24시간 동안 배양한 후 각 웰의 세포 생존도 및 세포 수를 트리판블루 배제 키트(Life technologies, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 세포사멸 여부를 측정하였다. 또한 세포는 유세포분석용 Annexin V FITC and PI 키트(Life technologies, USA)를 사용하여 염색한 후 유세포분석(BD Bioscience, USA)를 수행하였다.
싸이토카인 분비 분석
위에 기재된 바와 같이 상피세포를 MOI 500으로 각각 A. johnsonii, S. salivarius, 및 V. dispar 각 균주로 감염하였다. 감염 후에 각각 4시간, 16시간 및 24시간 후에 배양액에 분비된 염증성 싸이토카인인 TNF-알파, IL-1베타 및 IL-8을 ELISA 키트 (R&D systems, USA)를 사용하여 제조자의 방법대로 측정하였다.
통계분석
데이터는 달리 언급하지 않는 한 mean ± 표준편차로 나타낸다. 두 개의 그룹 간의 UniFrac distance 및 상대적 abundance의 차이는 각각 Mann-Whitney U-test and t-test를 이용하여 분석하였다. RAS 리스크와 박테리아 종간의 연관성은 로지스틱 회귀 분석을 이용하여 수행되었다. 박테리아의 세포독성은 Bonferroni correction을 도입한 ANOVA post-hoc test로 분석되었다. 모든 통계분석은 SPSS Statistics19 software (SPSS Inc., USA)을 이용하여 수행되었다. 유의성은 P<0.05로 설정하였다.
실시예 1. 아프타구내염의 미생물 총 특징 규명
실험에 사용한 점막 및 타액시료가 유래된 RAS 환자의 인구학적 데이터는 표 1에 요약되어 있다.
[표 1]
Figure PCTKR2015012687-appb-I000001
연구에 참여한 RAS가 발병한 11명의 남성 및 9명의 여성의 나이는 19세부터 81세까지의 분포를 나타냈다. RAS 그룹에서, 3명의 환자가 흡연경력이 있었는데, 1명은 과거에 흡연자였으며, 한 명은 단지 RAS 증상을 경감시키기 위해 흡연을 하였으며, 한 명은 매일 담배를 피우는 것으로 나타났다. 점막의 시료 채취 부위는 혀 끝 (n=3), 볼 점막 (n=4), 및 입술 점막 (n=13)을 포함하였다. 13명의 환자는 한 개의 궤양이 발생되었으며, 7명의 환자는 혀끝, 입술 점막 및 물렁 입천장에 다수의 궤양이 발생되었다. 건강 대조군은 21세에서 71세의 9명의 남성 및 10명의 여성이었다. 한 명은 파이로서열분석의 실패로 제외하였다. 점막 시료채취 부위는 볼 점막 (n=7) 및 입술 점막 (n=12) 이었다. 단지 한 명의 대상체가 현재 흡연자였다.
64개의 시료로부터 43개의 점막 (n=19, n=20, 및 n=4 for Controls, RASAL, 및 RASPS) 및 17개의 타액 (n=8 및 n=9 for Controls 및 RASAL) 미생물총 커뮤너티 데이터 세트를 수득하였다. 60개 컴뮤너티로부터 총 58,491개의 필터된 판독결과(시료당 평균 9,434 판독)를 수득하였으며, 이는 각 시료당 99%를 넘는 Good’s coverage에 해당하는 것이다. 4개의 시료는 16sRNA가 증폭이 불충분하여 파이로서열분석을 수행하지 못하였다.
일부 질환에서는 미생물의 다양성이 변화하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 치주염에서는 플라크 박테리아의 다양성이 증가되는 것으로 나타났으며, 크론병에서는 장내 미생물총의 다양성이 감소되는 것으로 나타났다 [Griffen AL et al ISME J. 2012;6: 1176-1185; Hansen R, et al. Am J Gastroenterol. 2012;107: 1913-1922]. 따라서, 대조군 및 RASAL 그룹간의 알파 다양성을 비교하였다. 대조군과 비교하여, Chao 1 으로 분석된 RASAL 미생물총의 종 풍부성은 점막에서 감소한 것으로 나타났으나 (319 ± 18 vs. 279 ± 20) 타액에서는 증가하는 것으로 나타났다 (389 ± 23 vs. 437 ± 45). Shannon index를 통해 분석된 미생물총 컴뮤너티의 다양성은 유사한 양상을 나타냈다. RASAL 미생물총의 다양성은 대조군과 비교하여 점막에서는 다소 낮고 (3.61 ± 0.11 vs. 3.47 ± 0.11) 타액에서는 다소 높은 것으로 나타났다 (4.05 ± 0.09 vs. 4.22 ± 0.13). 그러나 이런 모든 차이는 통계적으로 유의하지 않은 것이다 (도 1a).
시료간의 변이를 결정하기 위한 UniFrac 기반의 PCoA 분석 결과 미생물총 프로파일은 생태적 니체에 의해 더 잘 구분되는 것으로 나타났는데, 즉 질환보다는 점막 vs. 타액에 의해 더 잘 구분되었다. 점막에서의 상이한 위치, 즉, 혀끝, 입술, 또는 볼 점막은 별개의 클러스터링을 나타내지 않았다. 타액 미생물 총의 경우, RASAL 클러스터는 대조군 시료와 비교하여 다소 시프트되었다. 흥미롭게도 RASAL 클러스터 점막 시료는 PCoA 플롯에서 넓게 분포되어 있는데, 이는 RAS 병변에서 박테리아 커뮤너티가 서로간에서 보다 이질적이라는 것을 의미한다 (도 1b). 실제, RASAL 에서 대조군과 비교하여 보다 높은 인트라그룹 UniFrac 거리는 RAS 병변에서 대상체 간 (inter-subject) 변이가 증가하였음을 확인하는 것이다. 나아가, 인터그룹 UniFrac 거리는 대조군의 인트라그룹 거리보다 높았는데, 이는 대조군 및 RASAL 시료사이의 전체 박테리아 프로파일이 유의한 차이가 있음을 의미하는 것이다 (도 1c). 환자의 비병변 부위는 물론 병변 부위를 반영하는 타액 컴뮤너티에서 UniFrac 거리에서 인트라 또는 인터그룹간의 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다.
다음 대조군 및 RASAL 그룹사이의 각 텍손의 상대적 양을 비교하였다. 점막 시료로부터 총 26개의 상이한 파일럼이 규명되었지만, Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, 및 Fusobacteria 이 주를 이루는 것으로 나타났다 (>99% in Controls 및 >97% in RASAL). 대조군 대상체에서 관찰된 주요 파일럼의 상대적 양은 RASAL 환자의 것과 차이가 없었다 (도 1d). 속(genus) 수준에서, 대조군에서 스트렙토코커스가 총 점막 미생물총의 거의 반을 점유하였으며, 다른 주요 속은 Haemophilus, Rothia, Neisseria, Actinomyces, 및 Veillonella인 것으로 나타났다. 대조군과 비교하여, RASAL 점막 커뮤너티에서 Veillonella는 감소하였으며, Acinetobacter는 증가한 것으로 나타났다 (표 2). 종의 수준에서 S. salivarius, Veillonellas (V. dispar and V. atypica), and Actinomyces odontolyticus를 포함하는 수 개의 스트렙토코커스의 양 (abundance)은 RASAL 점막에서 감소하는 것으로 나타났다. 대신에, Acinetobacter oryzae, A. johnsonii, Neisseria oralis, Blautia wexlerae, Ruminococcus gnavus, 및 Bacteroides fragilis의 양은 증가한 것으로 나타났다 (표 2).
[표 2]
Figure PCTKR2015012687-appb-I000002
표 2에서 상대적 양은 중위 (median) % 및 범위로 나타냈으며, 화살표는 대조군과 비교하여 RAS 또는 RAU(recurrent aphthous ulcers)AL 의 증가 또는 감소를 나타낸다.
Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobacteria, 및 TM7 이 타액 미생물총에 포함된 우점종인 것으로 나타났다 (>99% in controls 및 >97% in RASAL). 이들 중에서 특히 RASAL 그룹의 Bacteroidetes 및 Fusobacteria 의 양이 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였다(P=0.002 및 P=0.002, 각각). 도 1d에 나타난 상위 15개의 속에서, RASAL 타액 미생물총에서 스트렙토코커스가 유의적으로 감소하였으나 Porphyromonas 및 Capnocytophaga는 증가한 것으로 나타났다. 종의 수준에서, S. salivarius, S. parasanuinis, Rothia dentocariosa, N. sicca group, 및 A. viscosus 의 양은 RASAL 시료에서 감소하였다. 대신에 C. gingivalis, N. flava, Aggregatibacter segnis, 및 C. sputigena는 증가한 것으로 나타났다 (표 3).
[표 3]
Figure PCTKR2015012687-appb-I000003
표 3에서 상대적 양은 중위 % 및 범위로 표시되었다. 화살표는 대조군에서 화살표는 대조군과 비교하여 RASAL의 증가 또는 감소를 나타낸다.
상기와 같이 구강점막 세균 조성에 대한 파이로서열분석을 통하여 재발성 아프타 구내염 환자의 점막에서 건강한 사람과 비교해 보았을 때, 7개의 종은 증가, 24개의 종은 감소한다는 결과를 얻을 수 있었으며, 회귀분석을 통하여 Streptococcus salivarius (Ss), Veillonella dispar (Vd), Acinetobacter johnsonii (Aj)가 아프타성 구내염에 연관이 되어있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2. RAS의 디스바이오시스 인덱스 결정
다음으로 상기와 같은 박테리아 종의 양의 변화가 RAS 위험도와 관련되어 있는지를 살펴보았다. 포워드 방법을 사용하여 점막 미생물총의 로지스틱 회귀 분석 결과, S. salivarius 의 양(per % increase)은 RAS 리스크의 감소와 관련된 것으로 나타났다 (odds ratio [OR] 0.691, 95% confidence interval [95% CI] 0.526-0.909, P=0.008). 백워드 방법을 사용한 분석 결과 두 종이 연관된 것으로 나타났다. V. dispar 의 양은 RAS 리스크의 감소와 관련이 있는 것으로 나타났으며(OR 0.124, CI 95% 0.024-0.646, P=0.013), A. johnsonii 의 양은 RAS 리스크의 증가와 관련된 것으로 나타났다 (OR 7547, CI 95% 4.9-1.2E7, P=0.017). 유사하게, 타액에서 S. salivarius 의 양은 RAS의 감소와 관련이 되어 있는 것으로 나타났다 (OR 0.342, CI 95% 0.120-0.973, P=0.044). 점막에서 S. salivarius plus V. dispar 의 상대적 양으로 나눈 A. johnsonii 의 상대적 양을 디스바이오시스 (dysbiosis) 인덱스로 정의하였으며, 이는 RAS 리스크와 유의하게 관련되어 있는 것으로 나타났다 (OR 3.14E9. CI 95% 30.96-3.19E17, P=0.02). 나아가, 디스바이오시스 인덱스는 RAS의 부재 및 존재에 대하여 분석된 총 케이스의 82%에서 정확하게 예측하였다 (대조군의 95% 및 70% of RAS, 도 2a).
다른 중요한 이슈는 RASAL 미생물총의 특징이 RAS의 내재적 특징인지 또는 질환의 결과 즉 궤양/염증에 의한 것인지 여부를 결정하는 것이었다. 치료 후 시료를 기증한 4명의 환자에서, 세명은 치료 후에 디스바이오시스 인덱스가 감소하였다 (도 2b). RAS16에서, 디스바이오시스 인덱스는 변화하지 않았는데, 이는 A. johnsonii 가 RASAL 시료에서 검출되지 않았기 때문인 것으로 생각되며, S. salivarius plus V. dispar의 양은 치료후에 2.5% 에서 11.7% 로 증가하였다.
실시예 3. RAS 관련 박테리아의 구강상피 세포에 대한 세포독성
RAS의 원인 병리론에 있어서, 박테리아의 역할을 규명하기 위하여, 세 종류의 RAS 관련 박테리아 종의 세포독성을 구강 상피세포에 실험을 수행하였다. 치주 병원균인 P. gingivalis을 대조군으로 사용하였다. 불멸화된 구강상피세포인 HOK-16B에 A. johnsonii, S. salivarius, 및 V. dispar 각 균주를 MOI 100, 500, 및 1000로 24시간 동안 처리하였다. 6웰 플레이트에서 두 번의 독립적인 실험을 수행하였으며, 결과는 트리판블루 배제 염색으로 분석하여도 생활도 및 대조군과 대비한 증식정도를 측정하였다.
결과는 도 3a 및 3b에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이, A. johnsonii 는 S. salivarius 및 V. dispar와 비교하여 HOK-16B 세포에 대한 더 큰 세포독성을 나타냈으며, 이는 P. gingivalis에 의한 세포독성에 필적하는 수준이었다. 나아가, A. johnsonii 는 MOI 100에서 조차 HOK-16B 세포의 증식을 억제하였다. A. johnsonii 는 37℃에서 자라지 않았는데, 이는 박테리아 성장에 의한 세포독성을 배제하는 것이다.
또한 구강상피세포인 HOK-16B 세포에 A. johnsonii, S. salivarius, 및 V. dispar 각 균주를 HOK-16B 세포 수 대비 1000배수로 첨가해 24시간 배양한 후 Annexin-V와 PI 염색을 수행한 결과 도 5a에 나타난 바와 같이 A. johnsonii에 의해 세포 생존율이 89%에서 35%로 감소해 매우 높은 세포독성을 보인데 반해 salivarius와 V. dispar 는 매우 낮은 세포독성을 보였다.
아울러 HOK-16B 세포에 A. johnsonii를 HOK-16B 세포 수 대비 500배수로 첨가해 24시간 배양했을 때와 여기에 1μg/ml 농도의 젠타마이신을 추가한 경우 1 μg/ml 농도의 젠타마이신과 V. dispar 100배수를 첨가했을 때 세포독성을 비교 측정한 결과 도 5b에 나타난 바와 같이 젠타마이신에 의해 A. johnsonii의 세포독성이 모두 사라졌고 V. dispar 첨가에 의해 HOK-16B 세포의 생활도(viability)가 더 증가된 것으로 나타났다.
실시예 4. RAS와 연관된 세 가지 세균에 대한 젠타마이신의 최소억제농도 측정
A. johnsonii, S. salivarius, 및 V. dispar 각 균주를 0.5 ~ 128μg/ml 젠타마이신이 포함된 배지에 5x106/ml로 희석해 24시간 배양한 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 최소억제농도는 항생제가 포함되지 않은 배지에서 배양한 세균의 흡광도 대비 90%이상의 성장을 억제하는 농도로 정의하였다. 결과는 도 4a 내지 4d에 기재되어 있다. 도 4a에서 A. johnsonii에 대한 최소억제농도는 0.5μg/ml인데 반해 도 4b, 4c 및 4d에서 나타난 바와 같이 V. dispar와 S. salivarius에 대한 최소억제농도는 4~32μg/ml이다. 게다가 S. salivarius의 경우 두 가지 균주 (1)과 (2) 모두 최소 억제농도보다 낮은 농도에서는 항생제가 포함되지 않은 배지에서 배양한 세균보다 성장이 증가하였다. 따라서 상기 결과는 0.5 ~ 1μg/ml 젠타마이신은 A. johnsonii의 증식은 억제하면서 S. salivarius의 증식을 증가시키고 V. dispar의 증식에는 최소한의 영향을 미치는 농도임을 나타낸다.
실시예 5. S. salivarius 와 V. dispar 세균에 의한 싸이토카인 분비 억제
실험방법에 기재된 바와 같이 A. johnsonii, S. salivarius, 및 V. dispar 각 균주가 염증에 미치는 영향을 측정하였다. 결과는 도 6에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 아프타구내염의 위험을 높이는 Aj 세균은 염증성 싸이토카인의 분비를 증가시켜 아프타성구내염의 특징인 심한 통증을 매개하나, 아프타성구내염의 위험을 낮추는 Ss와 Vd 세균은 염증성 싸이토카인의 분비를 낮추어 염증을 줄이고, 통증도 줄일 수 있음을 나타낸다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (9)

  1. 프로바이오틱스로서 스트렙토코커스 살리바리우스 (Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르 (Veillonella dispar) 중 하나 이상을 포함하는 아프타 구내염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 조성물은 아시네토박터(Acinetobacter johnsonii)의 증식은 억제하면서 상기 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar)의 증식은 증가시키거나 또는 증식에는 영향이 없는 아미노글리코시드계 항생제를 추가로 포함하는 것인, 아프타 구내염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 아미노글리코시드계 항생제는 카나마이신, 아미카신, 토프라마이신, 디베카신, 젠타마이신, 시소마이신, 네틸마이신, 네오마이신, 또는 스트렙토마이신 중 하나 이상인, 아프타 구내염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 항생제는 젠타마이신 또는 토프라마이신 중 하나 이상인, 아프타 구내염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 젠타마이신의 농도는 0.5 ~ 1μg/ml인 아프타 구내염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 국소 도포에 적합한 생체 유착성 또는 점막 유착성 담체를 추가로 포함하는 것인, 아프타 구내염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 아시네토박터(Acinetobacter johnsonii), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 검출용 물질을 포함하는 재발성 아프타 구내염 진단용 조성물.
  8. 아프타 구내염 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
    검사 대상자 유래의 구강 점막 시료에서 아시네토박터(Acinetobacter johnsonii), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius) 및 베일로넬라 디스파르(Veillonella dispar) 의 양을 결정하는 단계;
    상기 결정된 양에 근거하여 디스바이오시스 인덱스를 결정하는 단계; 및
    상기 디스바이오시스 인덱스가 정상 대조군과 비교하여 높은 경우, 이를 아프타 구내염으로 판별하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 아프타 구내염 판별 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 구강 점막 시료는 아프타 구내염으로 치료받은 대상자 유래의 시료로, 상기 시료에서 결정된 디스바이오시스 인덱스가 상기 환자의 치료전 구강 점막 시료에서 결정된 디스바이오시스 인덱스와 비교하여 차이가 없는 경우 이를 재발성 아프타 구내염 위험군으로 판별하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 인비트로에서 아프타 구내염 판별 방법.
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