WO2016207543A1 - Procédé de préparation de matériaux macroporeux monolithiques biocompatibles utilisables a titre de substitut osseux - Google Patents

Procédé de préparation de matériaux macroporeux monolithiques biocompatibles utilisables a titre de substitut osseux Download PDF

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hydroxyapatite
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silica
phase
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Rénal BACKOV
Jérémy SOULIE
Manuel MERCE
Stéphanie SARDA
Véronique SCHMITT
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Bordeaux
Institut National Polytechnique de Toulouse INPT
Universite de Toulouse
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Bordeaux
Universite Toulouse III Paul Sabatier
Institut National Polytechnique de Toulouse INPT
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    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of macroporous monolithic macroporous materials with low temperature controlled macroporosity, in particular allowing access to monoliths based on a silica / hydroxyapatite bioceramic material having an open and controlled macroporosity with a particle size.
  • homogeneous macropores monodispersity
  • an open porosity is a porosity which is accessed from outside the material and which participates in the transport of material.
  • These materials include a high specific surface area and a hierarchical structure.
  • the bone is a hybrid material consisting mainly of cells, type I collagen which constitutes a protein organic framework and a mineral phase consisting of apatitic calcium phosphate crystals (or apatites) of nanometric size.
  • This large-scale three-dimensional organic / mineral combination imparts both elasticity and hardness to the bone tissue allowing it to resist the forces applied to it.
  • the bone is hard, dense and very resistant.
  • implant materials are usually bio inert, that is, simply tolerated by the body, or biocompatible, that is, they integrate perfectly with the host organism. These synthetic materials must meet a very specific specification. The first mandatory criterion is that of biocompatibility and good tolerance by the body of the substitute and its degradation products. These materials must also have a macroporosity favorable to rehabilitation and osteoconduction.
  • the pore size of the bone substitute conditions its colonization by bone cells: the micropores (size less than 100 ⁇ ) are conducive to the diffusion of ions and feed liquids and macropores (sizes of the order of 100- 600 ⁇ ) are conducive to bone cell colonization and thus to osteoconduction.
  • Bone substitutes can also be biodegradable with slow and gradual resorption. Other properties may be desired such as bioactivity, bone induction, mechanical quality (mechanical resistance), etc.
  • bioactivity is defined as the property of allowing specific chemical reactions at the implant-tissue recipient interface. It depends directly on the chemical and physico-chemical properties of the material, and is opposed to bioinertia (biocompatible but inert materials). In the context of bone substitutes, the goal of bioactivity is bone neoformation to achieve a true chemical bond with the bone.
  • porous calcium phosphate-based bioceramics which have a chemical composition similar to the mineral phase of bone, and in particular the hydroxyapatite bioceramics (HAp) obtained by conventional methods.
  • sintering powders at high temperatures generally between 1100 and 1300 ° C (Veljovic et al., Ceramics International, 2011, 37 (2), 471-479) or by high temperature methods from Pickering emulsions.
  • porous HAp bioceramics consisting, in a first step, of preparing an oil-in-water emulsion having a pH value of between 6.1 and 7.7, using methyl myristate as the oily phase and nanoparticles HAp as particulate emulsifier, then in a second step, to sinter the emulsion thus obtained at a temperature of about 800 ° C to obtain a porous bioceramics based on hydroxyapatite.
  • the materials thus obtained do not, however, always have sufficient mechanical strength and do not have the physicochemical and biological properties of bioceramics obtained at low temperature. In particular, there is a decrease in bioabsorbability and bioactivity. In addition, the use of high sintering temperatures is not compatible with the functionalization of materials by biomolecules (protein, peptide, growth factor, etc.) whose role on adhesion and / or cell proliferation is known.
  • Macroporous composite materials prepared by solvent evaporation from Pickering emulsions can also be mentioned.
  • Yang H et al. (Macromolecular Materials and Engineering, 2014, 299, 1070-1080) describe a process for the preparation of such materials consisting firstly of preparing an oil-in-water emulsion in which the dispersed oily phase consists of dichloromethane, while the continuous phase is an aqueous solution of polylactic acid (PLLA) in water, said emulsion being stabilized by HAp particles functionalized with polylactic acid, said particles being adsorbed at the oil / water interface, then evaporating emulsion to obtain a macroporous material consisting of a composite matrix HAp / PLLA comprising interconnected macropores.
  • PLLA polylactic acid
  • the size of the macropores in these materials is of the order of one hundred microns. These materials also have a Young's modulus that can vary between 0.16 MPa for the lowest concentrations of HAp particles (5.1% by weight) to 8.40 MPa for the highest concentrations of HAp particles ( 21.7% by weight). However, this method does not give complete satisfaction as far as their mechanical strength is not sufficient.
  • the hydroxyapatite particles used are PLLA-modified particles, resulting in a hybrid organic / inorganic material with limited applications. In fact, the design of an osteoinductive biomaterial passes through a functionalization of the surface of the apatite crystals by adsorption or grafting of the biomolecule (protein, peptide, growth factor, etc.) onto the mineral material.
  • the colloidal solid particles may be inorganic or organic. According to this prior application, the colloidal solid particles are preferably mineral particles chosen from the group of oxides, hydroxides and sulphates of metals. In a very preferential way, they are silica particles.
  • the materials obtained according to this method can not, however, be used as a bone substitute insofar as they do not contain in their structure any biocompatible material close to the bone mineral.
  • porous monolithic material that meets all the specifications relating to the materials that can be used as bone substitutes, that is to say that have a macroporosity sufficient for colonization of macropores by bone tissue. and which is biocompatible, resorbable in a slow and continuous manner over time, as well as for a preparation process allowing simple and low temperature access to such a material.
  • the subject of the present invention is therefore a process for the preparation of a biocompatible inorganic porous material in the form of a cellular monolith composed of a silica matrix comprising interconnected macropores having an average dimension d A ranging from 100 ⁇ to 500 ⁇ and micropores of average size di from 0.7 to 2 nm, and wherein at least a portion of the surface of the macropores is coated with hydroxyapatite particles, said process comprising at least one step of mineralization of an emulsion oil-in-water formed from droplets of an oily phase dispersed in a continuous aqueous phase and in which colloidal solid particles are present at the interface formed between the continuous aqueous phase and the dispersed oily phase droplets, said process being characterized and in that :
  • volume fraction of the oily phase is greater than or equal to 64%
  • the colloidal solid particles are particles of hydroxyapatite
  • the quantity of hydroxyapatite particles varies from 0.05 to 50 mg of particles / ml of oily phase, and said mineralization step is carried out without stirring, at a pH of between 6 and 9, in the presence of at least one precursor of silica oxide in an amount greater than or equal to 10% by weight relative to the mass of the aqueous phase.
  • biocompatible used in the present description to qualify a material or a substance, such as for example an oil, means that said material or said substance does not interfere with or degrade the biological medium in which he / she is used.
  • the amount of colloidal solid particles of hydroxyapatite in the emulsion ranges from 1 mg of particles / ml of oil phase to 40 mg of particles / ml of oily phase, and more preferably from 5 mg / ml to 20 mg / ml of oily phase.
  • the process is carried out at a low temperature (that is to say at room temperature, generally between 20 and 25 ° C.) and, surprisingly, makes it possible to access silica monoliths comprising a macroporous network in which the pores are interconnected (open porosity) and have a calibrated and homogeneous size that can vary between 100 and 500 ⁇ and whose biocompatibility is sufficient to allow its use, especially as a bone substitute. It is indeed possible, thanks to the presence of the solid colloidal particles of hydroxyapatite at the interface of the oily phase and of the aqueous phase, to stabilize the emulsion and to allow homogeneous mineralization of the aqueous phase leading in a simple manner.
  • the hydroxyapatite particles retain their biocompatible character although they are used at a nanometric size, which is not the case for any type of material, for example carbon which becomes cytotoxic when it is used in the form of nano tubes.
  • the term "monolith” means a solid object having an average dimension of at least 1 mm.
  • said monoliths can have various sizes and shapes depending on the volume of bone tissue to be replaced. .
  • the micropores are present in the thickness of the walls of the macropores, thus rendering them microporous.
  • the method comprises, in this order, the following steps:
  • step iv) adding, to said aqueous dispersion obtained above in step i), the oily phase, with mechanical stirring, until an oil-in-water emulsion is obtained,
  • step iv) adding, to said emulsion obtained above in step iv), the aqueous solution of at least one hydrolysed silica precursor obtained above in step iii) to obtain an oil-in-oil emulsion water stabilized with hydroxyapatite particles and wherein the aqueous phase comprises said hydrolyzed silica precursor;
  • step v) resting the emulsion resulting from step v) until a solid material is obtained
  • step vi) the elimination of the oily phase present in the solid material obtained above in step vi) to obtain the expected material in the form of a macroporous silica monolith in which the surface of the macropores is coated with particles of hydroxyapatite.
  • step iii) causes the hydrolysis of the silica oxide precursor
  • step v) leads to the formation of the oil-in-water emulsion in which the solid particles colloidal hydroxyapatite adsorb at the water / oil interface
  • step vi) leads to the mineralization of the emulsion, and thus to the production of a macroporous solid material, by condensation of the precursors of hydrolysed silica.
  • the oily phase of the emulsion is preferably constituted by one or more oils that are liquid at room temperature, and may in particular be chosen from fatty acid esters, vegetable oils, essential oils or any oil that can be dissolved with volatile organic solvents such as tetrahydrofuran (THF), acetone or ethanol.
  • the liquid oils are selected from biocompatible oils.
  • fatty acid esters which may be mentioned in particular the esters of fatty acids C 8 / Ci 0 such as glycerine oil (or tricaprylin), capric acid triglycerides and caprylic acid, triglycerides of capric acid, caprylic acid and linoleic acid, propylene glycol dicaprilate / dicaprate esters, butylene glycol dicaprilate / dicaprate esters, diacetylated monoglycerides, decyloleate, etc.
  • glycerine oil or tricaprylin
  • capric acid triglycerides and caprylic acid triglycerides of capric acid, caprylic acid and linoleic acid
  • propylene glycol dicaprilate / dicaprate esters butylene glycol dicaprilate / dicaprate esters
  • diacetylated monoglycerides decyloleate, etc.
  • short-chain triglycerides are particularly preferred to avoid any crystallization of the oil at ambient temperature, such as the product sold under the trade name Stelliesters MCT 55/45 by the company Stéarine Dubois.
  • the amount of oily phase present in the emulsion can be adjusted as a function of the diameter of the macropores that it is desired to obtain for the silica monolith, it being understood that the higher the volume fraction oil / water, the greater the diameter of the oil droplets within the emulsion will be low and the diameter of the macropores will be low also.
  • the volume fraction of the oily phase of the emulsion varies from 64 to 90%, and even more preferably from 70% to 82%. These amounts of oily phase make it possible to obtain a macroporous silica monolith in which the pores are interconnected.
  • the solid particles of hydroxyapatite generally have a size of less than a few micrometers.
  • the hydroxyapatite particles generally have a mean size of between 5 and 5000 nm inclusive, and preferably between 5 and 500 nm inclusive. They may be of spherical shape or not, for example in the form of needles.
  • the hydroxyapatite particles are spherical in shape.
  • the solid colloidal particles of hydroxyapatite are chosen from the nanoparticles sold under the names Hydroxyapatite by Sigma Aldrich (CAS No. 12167-74-7), Hydroxyapatite Nanopowder by MK nano.
  • the particles sold by MK Nano are needle-shaped particles having a width of about 20 nm and a length of about 60 nm.
  • the colloidal solid particles of hydroxyapatite can also be obtained by a conventional method of double decomposition synthesis consisting of mixing a solution of calcium nitrate and a solution of diammonium phosphate at basic pH according to the following chemical reaction:
  • a white precipitate forms immediately after mixing the two solutions and sediment.
  • the reaction medium is left to mature for about 24 hours, then the precipitate is filtered, washed and water and freeze-dried.
  • the solid colloidal hydroxyapatite particles used according to the process are hydroxyapatite particles synthesized by double decomposition by mixing a solution of calcium nitrate and a phosphate solution. of diammonium at basic pH.
  • the amount of hydroxyapatite particles (with a fixed amount of oil) present within the emulsion can be adjusted according to the diameter of the macropores that is desired for the silica monolith, it being understood that the greater the quantity of particles will be. The higher the diameter of the oil droplets within the emulsion, the lower the diameter of the macropores will be.
  • the amount of colloidal solid particles of hydroxyapatite present in the continuous aqueous phase varies according to the average volume size desired of the droplets of the oily phase in the emulsion and consequently of the desired size for the macropores of the material.
  • the precursor (s) of silica are preferably selected from tetramethoxyorthosilane (TMOS), tetraethoxyorthosilane (TEOS), dimethyldiethoxysilane (DMDES) and mixtures of DMDES with TEOS or TMOS.
  • TMOS tetramethoxyorthosilane
  • TEOS tetraethoxyorthosilane
  • DMDES dimethyldiethoxysilane
  • the silica precursor is TEOS.
  • concentration of precursor (s) of silica oxide in the aqueous phase of the emulsion preferably varies from 10 to 40% by weight relative to the weight of the aqueous phase.
  • step iii) varies from 3 to about 5 hours.
  • the mechanical stirring carried out in step iv) can in particular be carried out in a device intended to emulsify such as, for example, in devices sold under the trade names Ultra-Turrax® or Rayneri.
  • Step vi) (mineralization step) is advantageously carried out at a temperature close to room temperature.
  • the duration of this step can vary from a few hours (2 to 3 hours) to a few weeks (2 to 3 weeks) depending on the pH of the reaction medium.
  • the washing of the material during stage vii) makes it possible to eliminate the organic residues originating from the oily phase and found essentially in the macropores.
  • This washing can be carried out using a volatile organic solvent such as acetone, tetrahydrofuran (THF) or mixtures thereof.
  • the material obtained is preferably dried at a temperature between 15 and 40 ° C for 10 to 20 days.
  • the drying of the material may for example be carried out in a desiccator at a temperature of about 25 ° C. for 10 days.
  • silica monolith obtained by the implementation of the process as defined according to the first subject of the invention is new in itself and constitutes the second object of the invention.
  • the invention therefore also relates to the biocompatible inorganic porous material obtained by the implementation of the method according to the present invention, said material being characterized in that it is in the form of a cellular monolith consisting of a matrix of silica comprising interconnected macropores having a mean dimension d A ranging from 100 ⁇ to 500 ⁇ and micropores of average size di from 0.7 to 2 nm, and wherein at least a portion of the surface of the macropores is covered by particles hy droxy apatite.
  • the walls of the macropores generally have a thickness ranging from 0.1 to 10 ⁇ approximately, and preferably from 0.5 to 1 ⁇ approximately.
  • the micropores are present in the thickness of the walls of the macropores, thus rendering them microporous.
  • the specific surface area of the material according to the invention generally varies from 100 to 400 m 2 / g approximately, preferably from 150 to 300 m 2 / g approximately.
  • the very nature of the material (silica), and the presence of the hydroxyapatite particles on the surface of the macropores of the material according to the invention makes it possible to promote the colonization of the macropores by the bone tissues, which makes its use as a particularly advantageous bone substitute.
  • the third object of the invention is the material as obtained by the method as defined according to the first subject of the invention or as defined in the second subject of the invention, for use as a bone substitute, that is to say as a bone filling material.
  • the present invention is illustrated by the following exemplary embodiments, to which it is however not limited.
  • Tetraethoxyorthosilane 98% Aldrich company
  • caprylic acid ester and caprylic triglycerides sold under the trade name Stelliesters MCT 55/45 ° by Stéarinerie Dubois;
  • each of the emulsions prepared had a total volume of 20 ml, the aqueous phase of the emulsion consisting of an aqueous solution of 0.5M NaCl.
  • the macroporosity was characterized qualitatively by SEM technique using the TM-1000 microscope from Hitachi.
  • the samples were coated with gold or carbon by plasma deposition prior to their characterization.
  • the Fourier Transform Infrared (IFTR) analyzes were carried out in the wavelength range from 400 cm -1 to 4000 cm -1 , using a Thermo Nicolet 5700 spectrometer on pellets consisting of 1 mg of product to be analyzed, dispersed in 300 mg of KBr. The number of scans was set at 64 per spectrum with a resolution of 4 cm -1 .
  • a macroporous silica monolith according to the invention was prepared from an oil-in-water emulsion stabilized with hydroxyapatite particles.
  • the aqueous solution of silica precursor was prepared by mixing 1 mass equivalent of TEOS for 2 mass equivalents of a solution of 10 " HCl containing 0.5 M NaCl which was left stirring at asbestos temperature for 5 hours.
  • the dispersion of hydroxyapatite particles was prepared by dispersing 1 g of particles in 10 ml of water at 0.5 M NaCl.
  • the oil-in-water emulsion was prepared by dispersing 8 ml of Stelliesters 55/45 ° (ie 7.6 grams of oil), in 2 ml of the hydroxyapatite particle dispersion obtained above at step 2), ie 26.3 mg of hydroxyapatite per gram of oil.
  • the emulsion was prepared under stirring with Ultra Turrax® (sold by Janke-Kunkel IKA Labortechnik) at 24,000 rpm for 1 minute.
  • the volume fraction in oil ( ⁇ ) of the emulsion was 65% (volume of oil / total volume of the emulsion) at the end of step 4).
  • the solidification of the emulsions was at rest for 10 days to allow the polycondensation of the silica precursor (TEOS) within the continuous phase of the emulsion in the form of a silica monolith.
  • TEOS silica precursor
  • the monoliths were prepared using the following quantities:
  • the monolith thus obtained (M 65 ) was examined by scanning electron microscopy (SEM) using a microscope sold under the reference TM-1000 by the company Hitachi.
  • FIG. 1 is the SEM photograph of the monolith M 65 thus obtained.
  • the monolith M 65 is in the form of a macroporous material whose pores are interconnected and have a diameter greater than 100 ⁇ , compatible with the intended application and whose surface is lined with hydroxyapatite particles.
  • macroporous silica monoliths according to the invention were prepared from oil-in-water emulsions stabilized with hydroxyapatite particles.
  • the hydroxyapatite particles were first synthesized according to the following protocol: The synthesis was carried out by adding dropwise 433.3 ml of an aqueous solution of 1.5 M diammonium phosphate in 1100 ml of an aqueous solution of 1 M calcium nitrate. The addition of the phosphate solution of Diammonium was made by maintaining the pH of the reaction medium at 10 by adding ammonia and maintaining the reaction temperature at 100 ° C. After formation of the precipitate, the solution was filtered through Buchner, the precipitate was washed hot with decarbonated water. The recovered gel was then lyophilized and the obtained powder stored in the freezer.
  • Agglomerated hydroxyapatite particles elongated in the direction of the Ca / P length length 1.66 ⁇ 0.01, with an average length of 250 nm and a width of less than 100 nm were thus obtained.
  • the agglomerates were sieved at 125 ⁇ .
  • the X-ray diffraction pattern of these particles is given in the appended FIG.
  • the intensity is a function of the angle 2 ⁇ .
  • the curve corresponds to the experimental points recorded for the hydroxyapatite particles synthesized in this example and the vertical lines correspond to the peaks indexed on the theoretical values of hydroxyapatite.
  • This diagram shows that the synthesized particles are indeed hydroxyapatite particles and no impurity has been detected.
  • the IFTR spectrum of the synthesized particles is given by the appended FIG. 3, in which the absorbance is a function of the wave number in cm -1 .
  • results presented in this figure show the IR bands characteristic of hydroxyapatite, including strips of vibration to 1000-1100 cm “1 and 600 cm” 1, characteristic of orthophosphate groups, and 3560 cm “1 and 630 cm” attributable to OH groups.
  • the hydroxyapatite particles thus synthesized were then used for the stabilization of the oil-in-water emulsions prepared in this example.
  • silica monoliths were prepared according to the general procedure given above in Example 1, only the volume fraction of oil of the starting emulsion was modified, as follows:
  • the volume fraction of oil of the starting emulsion is 80% (hence the notation M80 / 20), this material corresponds to the protocol given in Example 1.
  • the volume fraction of oil of the starting emulsion is 85% (increase of the size of the interconnections).
  • the monoliths M80 / 20 and M85 / 10 as prepared above in Example 2 were reduced to powder (called respectively P-M80 / 20 and P-1). M85 / 10).
  • the powders were sterilized for 25 minutes under UV radiation.
  • the quantity of each of the powders necessary for the recovery of 25%, 50% and 100% of the surface of the wells was determined by weighing in order to ensure good reproducibility of the results.
  • the cytotoxicity tests were carried out on powders P-M80 / 20 and P-M85 / 10 in the presence of human osteoblasts:
  • the cells tested are cells derived from human femoral bone implants grown in Iscove's Modified Dulbecco's (IMDM) medium supplemented with 10% fetal calf serum and containing BMP2 protein (osteoinductive growth factor) at approximately 10 ng / mL.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's
  • BMP2 protein osteoinductive growth factor
  • the cells are seeded in the culture medium at a rate of 50,000 cells / well in order to allow their adhesion and start the proliferation phase.
  • the culture medium is then replaced by the experimental medium.
  • the tests in the presence of the powders are stopped on D1, D3 and D7. Each test is repeated 3 times. Wells seeded with cells but in the absence of powders serve as a positive control.
  • a 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) colorimetric test is carried out using a UV spectrophotometer (570 nm) to measure cell viability (only living cells are detected).
  • a proliferation test was carried out not on the P-M80 / 20 and M-P85 / 10 powders but on the M80 / 20 materials preserved in the form of monoliths, previously sterilized with ethylene oxide. These monoliths were placed in culture wells whose bottom had been previously covered with 1% agarose in order to prevent cell adhesion on the bottom. The osteoblasts were then inoculated at 40,000 cells / well in a volume of 50 L of culture medium to allow their complete penetration into the porous monolith. After incubation for 3 hours, 1.5 ml of culture medium is then carefully added.
  • results of MTT assays are expressed as a percentage of cell survival. This percentage is obtained from the average value from the three experiments for each monolith powder tested. 100% is determined in the absence of powder.
  • the results show little alteration of cell survival for the 2 materials tested.
  • the powder P-M80 / 20 shows very little alteration of the cell survival especially at short times (J1) and the powder P-M85 / 10 has a better survival on day 7.
  • Figure 9 is an SEM photograph of a monolith M80 / 20 at the end of the proliferation test and show bone cells adhered to the wall of macropores.

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Abstract

La présente invention est relative à un procédé de préparation de matériaux macroporeux monolithiques biocompatibles à macroporosité contrôlée à basse température permettant en particulier d'accéder à des monolithes à base d'un matériau biocéramique silice/hydroxyapatite ayant une macroporosité ouverte et contrôlée avec une taille de macropores homogène (monodispersité) allant de la dizaine de microns à quelques centaines de microns, ainsi qu'à l'utilisation de ces matériaux, notamment pour le comblement osseux.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE MATERIAUX MACROPOREUX MONOLITHIQUES BIOCOMPATIBLES UTILISABLES A TITRE DE
SUBSTITUT OSSEUX
La présente invention est relative à un procédé de préparation de matériaux macroporeux monolithiques biocompatibles à macroporosité contrôlée à basse température permettant en particulier d'accéder à des monolithes à base d'un matériau biocéramique silice/hydroxyapatite ayant une macroporosité ouverte et contrôlée avec une taille de macropores homogène (monodispersité) allant de la dizaine de microns à quelques centaines de microns, ainsi qu'à l'utilisation de ces matériaux, notamment pour le comblement osseux, comme support solide pour la réalisation de réactions chimiques catalysées en phase hétérogène, ou bien encore comme matériau fonctionnel pour des applications dans le domaine de l'environnement (piégeage de métaux lourds par exemple).
Les matériaux se présentant sous la forme de monolithes macroporeux à porosité ouverte, en fonction de leur nature chimique, constituent des matériaux de choix pour de nombreuses applications telles que la chimie séparative comme par exemple la chromatographie, la filtration, l'adsorption, la catalyse en phase hétérogène, la fabrication d'électrodes et le stockage de l'énergie en raison de leur grande surface spécifique, de leur grand volume de pores et de leurs excellentes propriétés mécaniques.
Au sens de la présente invention, une porosité ouverte est une porosité à laquelle on accède depuis l'extérieur du matériau et qui participe au transport de matière. Ces matériaux comprennent une surface spécifique élevée et une structure hiérarchisée.
L'os est un matériau hybride constitué principalement par des cellules, du collagène de type I qui constitue une trame organique protéique et une phase minérale constituée de cristaux de phosphates de calcium de structure apatitique (ou apatites) de taille nanométrique. Cette association organique/minéral à grande échelle en trois dimensions confère à la fois de l'élasticité et de la dureté au tissu osseux lui permettant de résister aux forces qui lui sont appliquées. L'os est donc dur, dense et très résistant.
En pratique, peut être considéré comme substitut osseux, tout biomatériau d'origine humaine, animale, végétale ou synthétique, destiné à l'implantation chez l'homme, dans la perspective d'une reconstitution du stock osseux, par le renforcement d'une structure osseuse ou le comblement d'une perte de substance osseuse d'origine traumatique ou orthopédique. La présente invention s'intéresse en particulier aux matériaux d'origine synthétique. Plusieurs classes de matériaux synthétiques (désignés par "matériaux d'implants") sont proposés dans l'art antérieur. Les matériaux d'implants sont généralement bio inertes, c'est-à-dire simplement tolérés par l'organisme, ou biocompatibles, c'est-à-dire qu'ils s'intègrent parfaitement à l'organisme hôte. Ces matériaux synthétiques doivent répondre à un cahier des charges bien spécifique. Le premier critère obligatoire est celui de la biocompatibilité et de la bonne tolérance par l'organisme du substitut et de ses produits de dégradation. Ces matériaux doivent également présenter une macroporosité favorable à la réhabilitation et à l'ostéoconduction. En particulier, la taille des pores du substitut osseux conditionne sa colonisation par des cellules osseuses : les micropores (taille inférieure à 100 μηι) sont propices à la diffusion des ions et des liquides nourriciers et les macropores (tailles de l'ordre de 100-600 μηι) sont propices à la colonisation cellulaire osseuse et donc à l'ostéoconduction. Les substituts osseux peuvent également être biodégradables avec une résorption lente et progressive. D'autres propriétés peuvent être souhaitées telles que bioactivité, induction osseuse, qualité mécanique (résistance mécanique), etc .. En particulier, la bioactivité est définie comme la propriété de permettre des réactions chimiques spécifiques, à l'interface implant - tissu receveur. Elle dépend directement des propriétés chimiques et physico-chimiques du matériau, et s'oppose à la bioinertie (matériaux biocompatibles mais inertes). Dans le cadre des substituts osseux, le but de la bioactivité est la néoformation osseuse pour aboutir à une véritable liaison chimique avec l'os.
Les différents substituts osseux d'origine synthétique actuellement disponibles sur le marché satisfont plus ou moins complètement aux critères souhaités.
Parmi ces substituts osseux, on peut en particulier mentionner les biocéramiques poreuses à base de phosphate de calcium qui ont une composition chimique similaire à la phase minérale de l'os, et en particulier les biocéramiques d'hydroxyapatite (HAp) obtenues par des procédés classiques de frittage de poudres à hautes températures, généralement entre 1100 et 1300°C (Dj. Veljovic et al, Ceramics International, 2011, 37(2), 471-479) ou par des procédés haute température à partir d'émulsions de Pickering. Notamment, Fujii S. et al. (Journal of Colloid and Interface Science, 2007, 315(1), 287-296) ont décrit un procédé de préparation de biocéramiques poreuses d'HAp consistant, dans une première étape à préparer une émulsion huile-dans-eau ayant un pH compris entre 6,1 et 7,7, en utilisant le myristate de méthyle comme phase huileuse et des nanoparticules d'HAp comme émulsifiant particulaire, puis dans une deuxième étape, à effectuer le frittage de l'émulsion ainsi obtenue à une température de l'ordre de 800°C pour obtenir une biocéramique poreuse à base d'hydroxyapatite. Les matériaux ainsi obtenus ne présentent cependant pas toujours une résistance mécanique suffisante et n'ont pas les propriétés physico-chimiques et biologiques de biocéramiques obtenues à basse température. On observe en particulier une diminution de la biorésorbabilité et la bioactivité. De plus, l'utilisation de hautes températures de frittage n'est pas compatible avec la fonctionnalisation des matériaux par des biomolécules (protéine, peptide, facteur de croissance...) dont le rôle sur l'adhésion et/ou la prolifération cellulaire est connu.
On peut également mentionner les matériaux composites macroporeux préparés par évaporation de solvant à partir d'émulsions de Pickering. Par exemple, Yang H et al. (Macromolecular Materials and Engineering, 2014, 299, 1070-1080) décrivent un procédé de préparation de tels matériaux consistant tout d'abord à préparer une émulsion huile dans eau dans laquelle la phase huileuse dispersée est constituée de dichlorométhane, tandis que la phase continue est une solution aqueuse d'acide polylactique (PLLA) dans l'eau, ladite émulsion étant stabilisée par des particules d'HAp fonctionnalisées par de l'acide polylactique, lesdites particules étant adsorbées à l'interface huile/eau, puis à évaporer l'émulsion pour obtenir un matériau macroporeux constitué d'une matrice composite HAp/PLLA comportant des macropores interconnectés. La taille des macropores dans ces matériaux est de l'ordre de la centaine de microns. Ces matériaux présentent par ailleurs un module de Young pouvant varier entre 0,16 MPa pour les plus faibles concentrations en particules d'HAp (5,1 % en masse) à 8,40 MPa pour les plus hautes concentrations en particules d'HAp (21,7 % en masse). Cependant, ce procédé ne donne pas non plus entière satisfaction dans la mesure où leur résistance mécanique n'est pas suffisante. De plus, les particules d'hydroxyapatite utilisées sont des particules modifiées par du PLLA, ce qui conduit à un matériau hybride organique/inorganique aux applications limitées. En effet la conception d'un biomatériau ostéoinducteur passe par une fonctionnalisation de la surface des cristaux d'apatites par adsorption ou greffage de la biomolécule (protéine, peptide, facteur de croissance...) sur le matériau minéral.
Dans un domaine technique totalement différent, qui est celui de la chimie séparative et de la filtration, ou de la réalisation de réactions chimiques catalysées en phase hétérogène, il a par ailleurs déjà été proposé, notamment dans la demande de brevet FR 2 965 807, un procédé de préparation de matériaux monolithiques inorganiques macroporeux permettant d'accéder à des monolithes de silice ayant une macroporosité ouverte et contrôlée avec une taille de macropores allant du micron à quelques centaines de microns. Ces matériaux sont préparés selon un procédé comprenant au moins une étape de minéralisation d'une émulsion huile- dans-eau formée de gouttelettes d'une phase huileuse dispersées dans une phase aqueuse continue et dans laquelle des particules solides colloïdales sont présentes à l'interface formée entre la phase aqueuse continue et les gouttelettes de phase huileuse dispersées. Les particules solides colloïdales peuvent être minérales ou organiques. Selon cette demande antérieure, les particules solides colloïdales sont de préférence des particules minérales choisies dans le groupe des oxydes, hydroxydes et sulfates de métaux. A titre tout à fait préférentiel, ce sont des particules de silice. Les matériaux obtenus selon ce procédé ne peuvent cependant pas être utilisés à titre de substitut osseux dans la mesure où ils ne renferment dans leur structure aucun matériau biocompatible proche du minéral osseux.
Il existe donc un besoin pour un matériau monolithique poreux répondant à l'ensemble du cahier des charges relatifs aux matériaux utilisables à titre de substituts osseux, c'est-à-dire qui présentent une macroporosité suffisante à la colonisation des macropores par le tissu osseux, et qui soit biocompatible, résorbable de façon lente et continue dans le temps, ainsi que pour un procédé de préparation permettant d'accéder de façon simple et à basses températures à un tel matériau.
La présente invention a donc pour premier objet un procédé de préparation d'un matériau poreux minéral biocompatible se présentant sous forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice comprenant des macropores interconnectés ayant une dimension moyenne dA allant de 100 μηι à 500 μηι et des micropores de dimension moyenne di de 0,7 à 2 nm, et dans lequel au moins une partie de la surface des macropores est recouverte de particules d'hydroxyapatite, ledit procédé comprenant au moins une étape de minéralisation d'une émulsion huile-dans-eau formée de gouttelettes d'une phase huileuse dispersées dans une phase aqueuse continue et dans laquelle des particules solides colloïdales sont présentes à l'interface formée entre la phase aqueuse continue et les gouttelettes de phase huileuse dispersées, ledit procédé étant caractérisé et en ce que :
- la fraction volumique de la phase huileuse est supérieure ou égale à 64 %,
- les particules solides colloïdales sont des particules d'hydroxyapatite,
- la quantité de particules d'hydroxyapatite varie de 0,05 à 50 mg de particules/mL de phase huileuse, et - ladite étape de minéralisation est réalisée sans agitation, à un pH compris entre 6 et 9, en présence d'au moins un précurseur d'oxyde de silice en une quantité supérieure ou égale à 10% en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse.
Selon l'invention, le terme « biocompatible » utilisé dans la présente description pour qualifier un matériau ou une substance, telle que par exemple une huile, signifie que ledit matériau ou ladite substance n'interfère pas et ne dégrade pas le milieu biologique dans lequel il/elle est utilisé(e).
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la quantité de particules solides colloïdales d'hydroxyapatite au sein de l'émulsion varie de 1 mg de particules/mL de phase huileuse à 40 mg de particules/mL de phase huileuse, et encore plus préférentiellement de 5 mg/mL à 20 mg/mL de phase huileuse.
La mise en œuvre de ce procédé se fait à basse température (c'est-à-dire à température ambiante, en général entre 20 et 25 °C) et permet, de façon surprenante, d'accéder à des monolithes de silice comportant un réseau macroporeux dans lequel les pores sont interconnectés (porosité ouverte) et ont une taille calibrée et homogène pouvant varier entre 100 et 500 μηι et dont la biocompatibilité est suffisante pour permettre son utilisation, notamment à titre de substitut osseux. Il est en effet possible, grâce à la présence des particules solides colloïdales d'hydroxyapatite à l'interface de la phase huileuse et de la phase aqueuse, de stabiliser l'émulsion et de permettre une minéralisation homogène de la phase aqueuse conduisant de façon simple et reproductible à un monolithe de silice à macroporosité ouverte dans lequel la taille des macropores découle directement la quantité de particules adsorbées à l'interface huile/eau (procédé de coalescence limitée) et dans lequel au moins une partie de la surface des macropores est tapissée par des particules d'hydroxyapatite dont la présence favorise la colonisation par les cellules du tissu osseux. De plus, la présence des particules solides colloïdales d'hydroxyapatite dans les proportions indiquées ci-dessus, favorise la croissance hétérogène de la silice à l'interface formée entre la phase aqueuse continue et les gouttelettes de phase huileuse lors de l'étape de minéralisation conduisant à un matériau cohésif autour des gouttes d'huile alors que la liaison P-O-Si se fait en principe plus difficilement que la liaison Si-O-Si. Enfin les particules d'hydroxyapatite conserve leur caractère biocompatible bien qu'elles soient utilisées à une taille nanométrique ce qui n'est pas le cas pour tout type de matériau, comme par exemple le carbone qui devient cytotoxique lorsqu'il est utilisé sous forme de nano tubes. Au sens de la présente invention, on entend par monolithe, un objet solide ayant une dimension moyenne d'au moins 1 mm. Bien entendu dans le cadre de l'utilisation du matériau obtenu selon le procédé de l'invention, c'est-à dire à titre de substitut osseux, lesdits monolithes peuvent avoir des tailles et formes variées en fonction du volume de tissu osseux à remplacer.
Selon l'invention, les micropores sont présents dans l'épaisseur des parois des macropores, les rendant alors microporeuses.
Selon une forme de réalisation particulière et préférée du procédé conforme à l'invention, le procédé comprend, dans cet ordre, les étapes suivantes :
i) la dispersion de particules solides colloïdales d'hydroxyapatite dans une phase aqueuse ayant un pH allant de 6 à 9 environ pour obtenir une dispersion aqueuse de particules d'hydroxyapatite ;
ii) la préparation d'une solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice, le pH de ladite solution étant de 2 à 5 environ ;
iii) le maintien de la solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice sous agitation pendant une durée allant de 5 minutes à 10 heures environ pour obtenir une solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice hydrolysé ;
iv) l'ajout, à ladite dispersion aqueuse obtenue ci-dessus à l'étape i), de la phase huileuse, sous agitation mécanique jusqu'à obtention d'une émulsion huile- dans-eau,
v) l'ajout, à ladite émulsion obtenue ci-dessus à l'étape iv), de la solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice hydrolysé obtenue ci-dessus à l'étape iii) pour obtenir une émulsion huile-dans-eau stabilisée par des particules d'hydroxyapatite et dans laquelle la phase aqueuse comprend ledit précurseur de silice hydrolysé ;
vi) la mise au repos de Pémulsion résultant de l'étape v) jusqu'à obtention d'un matériau solide, puis
vii) l'élimination de la phase huileuse présente dans le matériau solide obtenu ci-dessus à l'étape vi) pour obtenir le matériau attendu sous la forme d'un monolithe de silice macroporeux dans lequel la surface des macropores est tapissée de particules d'hydroxyapatite.
Selon cette forme de réalisation particulière du procédé de l'invention, l'étape iii) provoque l'hydrolyse du précurseur d'oxyde de silice, l'étape v) conduit à la formation de F émulsion huile-dans-eau dans laquelle les particules solides colloïdales d'hydroxyapatite s'adsorbent à l'interface eau/huile, tandis que l'étape vi) conduit à la minéralisation de l'émulsion, et donc à l'obtention d'un matériau solide macroporeux, par condensation des précurseurs d'oxyde de silice hydrolysés.
La phase huileuse de l'émulsion est de préférence constituée par une ou plusieurs huiles liquides à température ambiante, pouvant notamment être choisies parmi les esters d'acides gras, les huiles végétales, les huiles essentielles ou toute huile que l'on peut dissoudre avec des solvants organiques volatils tels que le tetrahydrofurane (THF), l'acétone ou l'éthanol. De préférence pour des applications biomédicales, les huiles liquides sont choisies parmi les huiles biocompatibles.
A titre d'exemple d'esters d'acides gras, on peut en particulier citer les esters d'acides gras en C8/Ci0 tels que l'huile de glycérine (ou tricapryline), les triglycérides d'acide caprique et d'acide caprylique, les triglycérides d'acide caprique, d'acide caprylique et d'acide linoléique, les esters de propylène glycol dicaprilate/dicaprate, les esters de butylène glycol dicaprilate/dicaprate, les monoglycérides diacétylés, le décyloléate, etc ..
Parmi les esters d'acides gras, on préfère tout particulièrement les triglycérides à chaîne courte pour éviter toute cristallisation de l'huile à température ambiante, tels que le produit vendu sous la dénomination commerciale Stelliesters MCT 55/45 par la société Stéarine Dubois.
La quantité de phase huileuse présente au sein de l'émulsion peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir pour le monolithe de silice, étant entendu que plus la fraction volumique huile/eau sera élevée, plus le diamètre des gouttelettes d'huile au sein de l'émulsion sera faible et plus le diamètre des macropores sera faible également.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la fraction volumique de la phase huileuse de l'émulsion varie de 64 à 90 %, et encore plus préférentiellement de 70 % à 82 %. Ces quantités de phase huileuse permettent d'obtenir un monolithe de silice macroporeux dans lequel les pores sont interconnectés.
Pour être colloïdales, les particules solides d'hydroxyapatite présentent généralement une taille inférieure à quelques micromètres. Ainsi les particules d'hydroxyapatite présentent généralement une taille moyenne comprise entre 5 et 5000 nm inclusivement, et de préférence entre 5 et 500 nm inclusivement. Elles peuvent être de forme sphérique ou non, par exemple sous la forme d'aiguilles. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les particules d'hydroxyapatite sont de forme sphérique. Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, les particules solides colloïdales d'hydroxyapatite sont choisies parmi les nanoparticules vendues sous les dénominations Hydroxyapatite par la société Sigma Aldrich (CAS N° 12167- 74-7), Hydroxyapatite Nanopowder par la société MK Nano. Les particules vendues par la société MK Nano sont des particules en forme d'aiguilles dont la largeur est d'environ 20 nm et de longueur environ 60 nm.
Les particules solides colloïdales d'hydroxyapatite peuvent également être obtenues par une méthode classique de synthèse par double décomposition consistant à mélanger une solution de nitrate de calcium et une solution de phosphate de diammonium à pH basique selon la réaction chimique suivante :
10 Ca(N03)2 + 6 (NH4)2HP04 + 8 NH OH→ Cai0(PO4)6(OH)2 + 20 NH4N03 + 6 H20
Selon cette réaction, un précipité blanc se forme immédiatement après mélange des deux solutions et sédimente. Le milieu réactionnel est laissé à mâturer pendant environ 24 heures, puis le précipité est filtré, lavé et l'eau et lyophilisé.
Selon une forme de réalisation particulièrement préférée de l'invention, les particules solides colloïdales d'hydroxyapatite utilisées selon le procédé sont des particules d'hydroxyapatite synthétisées par double décomposition par mélange d'une solution de nitrate de calcium et d'une solution de phosphate de diammonium à pH basique. La quantité de particules d'hydroxyapatite (à quantité d'huile fixée) présente au sein de Pémulsion peut être ajustée en fonction du diamètre des macropores que l'on souhaite obtenir pour le monolithe de silice, étant entendu que plus la quantité de particules sera élevée, plus le diamètre des gouttelettes d'huile au sein de Pémulsion sera faible et plus le diamètre des macropores sera faible également.
Avantageusement, la quantité de particules solides colloïdales d'hydroxyapatite présentes dans la phase aqueuse continue varie en fonction de la taille moyenne en volume souhaitée des gouttelettes de la phase huileuse dans l'émulsion et par voie de conséquence, de la taille souhaitée pour les macropores du matériau.
Le ou les précurseur(s) d'oxyde de silice sont de préférence choisis parmi le tetraméthoxyorthosilane (TMOS), le tetraéthoxyorthosilane (TEOS), le diméthyldiéthoxysilane (DMDES) et les mélanges du DMDES avec le TEOS ou le TMOS.
Selon une forme de réalisation préférée de l'invention, le précurseur de silice est le TEOS. La concentration en précurseur(s) d'oxyde de silice au sein de la phase aqueuse de Pémulsion varie de préférence de 10 à 40 % environ en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse.
Egalement selon une forme de réalisation préférée de l'invention, la durée de l'étape iii) varie de 3 à 5 heures environ.
L'agitation mécanique réalisée lors l'étape iv) peut notamment être réalisée dans un dispositif destiné à émulsionner tel que par exemple dans des dispositifs vendus sous les dénominations commerciales Ultra- Turrax® ou Rayneri.
L'étape vi) (étape de minéralisation) est effectuée avantageusement à une température proche de la température ambiante. La durée de cette étape peut varier de quelques heures (2 à 3 heures) à quelques semaines (2 à 3 semaines) en fonction du pH du milieu réactionnel.
Le lavage du matériau lors de l'étape vii) permet d'éliminer les résidus organiques provenant de la phase huileuse et se trouvant essentiellement dans les macropores. Ce lavage peut être réalisé à l'aide d'un solvant organique volatil tel que l'acétone, le tetrahydrofurane (THF) ou leurs mélanges.
A l'issue de l'étape vii), le matériau obtenu est de préférence séché à une température comprise entre 15 et 40°C, pendant 10 à 20 jours. Le séchage du matériau peut par exemple être effectué dans un dessiccateur à une température de 25°C environ pendant 10 jours.
Le monolithe de silice obtenu par la mise en œuvre du procédé tel que défini selon le premier objet de l'invention, est nouveau en soi et constitue à ce titre le deuxième objet de l'invention.
L'invention a donc également pour objet le matériau poreux minéral biocompatible obtenu par la mise en œuvre du procédé conforme à la présente invention, ledit matériau étant caractérisé en qu'il se présente sous forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice comprenant des macropores interconnectés ayant une dimension moyenne dA allant de 100 μηι à 500 μηι et des micropores de dimension moyenne di de 0,7 à 2 nm, et dans lequel au moins une partie de la surface des macropores est recouverte par des particules d ' hy droxy apatite .
Dans ce matériau, les parois des macropores ont généralement une épaisseur allant de 0,1 à 10 μηι environ, et de préférence de 0,5 à 1 μηι environ. Selon l'invention, les micropores sont présents dans l'épaisseur des parois des macropores, les rendant alors microporeuses.
La surface spécifique du matériau conforme à l'invention varie généralement de 100 à 400 m2/g environ, préférentiellement de 150 à 300 m2/g environ.
Comme indiqué précédemment, la nature même du matériau (silice), et la présence des particules d'hydroxyapatite à la surface des macropores du matériau conforme à l'invention permet de favoriser la colonisation des macropores par les tissus osseux, ce qui rend son utilisation à titre de substitut osseux particulièrement avantageuse.
Par conséquent, le troisième objet de l'invention est le matériau tel qu'obtenu par le procédé tel que défini selon le premier objet de l'invention ou tel que défini dans le second objet de l'invention, pour une utilisation à titre de substitut osseux, c'est-à-dire comme matériau de comblement osseux.
La présente invention est illustrée par les exemples de réalisation suivants, auxquels elle n'est cependant pas limitée.
EXEMPLES
Les matières premières utilisées dans les exemples qui suivent sont listées ci-après :
- Tetraéthoxyorthosilane à 98 % (TEOS) : société Aldrich ;
- Huile biocompatible : ester d'acide caprylique et de triglycérides capryliques, vendue sous la dénomination commerciale Stelliesters MCT 55/45° par la société Stéarinerie Dubois ;
- Particules sphériques d'hydroxyapatite de diamètre 50 à 200 nm vendues sous la dénomination commerciale Hydroxyapatite par la société Sigma Aldrich ;
- Tetrahydrofurane ;
- NaCl ; Acide chlorhydrique ; ammoniaque (Sigma Aldrich)
- phosphate de diammonium (Sigma Aldrich) ;
- nitrate de calcium (Sigma Aldrich)
- Eau déminéralisée.
Ces matières premières ont été utilisées telles que reçues des fabricants, sans purification supplémentaire. Dans les exemples qui suivent, chacune des émulsions préparées avait un volume total de 20 mL, la phase aqueuse de l'émulsion étant constituée par une solution aqueuse de NaCl à 0,5M.
La macroporosité a été caractérisée de manière qualitative par une technique MEB à l'aide du microscope TM-1000 de la société Hitachi. Les échantillons ont été revêtus d'or ou de carbone par dépôt plasma avant leur caractérisation.
Les analyses de diffraction des rayons X ont été réalisées sur des particules d'hydroxyapatite à l'aide d'un diffractomètre à compteur courbe vendu sous la référence INEL CPS 120 utilisant le rayonnement Kal émis par une anticathode au cobalt (λ=1,78892Α).
Les analyses Infrarouge à transformée de Fourier (IFTR) ont été réalisées dans l'intervalle de longueur d'onde allant de 400 cm"1 à 4000 cm"1, à l'aide d'un spectromètre Thermo Nicolet 5700 sur des pastilles constituées de 1 mg de produit à analysé, dispersé dans 300 mg de KBr. Le nombre de scans a été réglé à 64 par spectre avec une résolution de 4 cm"1.
Exemple 1
Préparation d'un matériau macroporeux selon le procédé conforme à l'invention
Dans cet exemple, on a préparé un monolithe de silice macroporeux conforme à l'invention à partir d'une émulsion huile-dans-eau stabilisée par des particules d'hydroxyapatite.
Le protocole général suivant a été utilisé :
1) la solution aqueuse de précurseur de silice a été préparée en mélangeant 1 équivalent massique de TEOS pour 2 équivalents massiques d'une solution d'HCl à 10" M contenant 0,5 M de NaCl qui a été laissée sous agitation à température amiante pendant 5 heures.
2) la dispersion de particules d'hydroxyapatite a été préparée en dispersant 1 g de particules dans 10 mL d'eau à 0,5 M en NaCl.
3) l'émulsion huile-dans-eau a été préparée en dispersant 8 ml de Stelliesters 55/45° (soit 7,6 grammes d'huile), dans 2 mL de la dispersion de particules d'hydroxyapatite obtenue ci-dessus à l'étape 2), soit 26,3 mg d'hydroxyapatite par gramme d'huile. L'émulsion a été préparée sous agitation à l'Ultra Turrax ® (vendu par la société Janke-Kunkel IKA Labortechnik) à 24 000 tours/min pendant 1 minute. 4) Ajout de la solution aqueuse de précurseur de silice préparée à l'étape 1) dans l'émulsion huile-dans-eau préparée à l'étape 3). La fraction volumique en huile (Φ) de l'émulsion était de 65 % (volume d'huile/volume totale de l'émulsion) à l'issue de l'étape 4).
5) la solidification des émulsions s'est faite au repos pendant 10 jours pour permettre la polycondensation du précurseur de silice (TEOS) au sein de la phase continue de l'émulsion sous la forme d'un monolithe de silice.
6) les monolithes de silice ainsi obtenus ont été lavés pendant 3 fois en 24 H dans des bains contenant un mélange acétone/THF (50/50 : v/v) afin d'éliminer l'huile résiduelle présente au sein des macropores et séchés dans un dessiccateur à température ambiante pendant 15 jours.
Dans cet exemple, les monolithes ont été préparés en utilisant les quantités suivantes :
- Solution aqueuse de précurseur de silice à 33 % en masse de TEOS : 2 mL ; pH = 3
- Ajout de 2 mL de cette solution de TEOS préhydrolysé à l'émulsion.
Le monolithe ainsi obtenu (M65) a été examiné en microscopie électronique à balayage (MEB) à l'aide d'un microscope vendu sous la référence TM-1000 par la société Hitachi.
La figure 1 annexée est la photographie MEB du monolithe M65 ainsi obtenu.
Cette figure montre que le monolithe M65 se présente sous la forme d'un matériau macroporeux dont les pores sont interconnectés et ont un diamètre supérieur à 100 μηι, compatible avec l'application envisagée et dont la surface est tapissée de particules d'hydroxyapatite.
Exemple 2
Préparation de matériaux macroporeux selon le procédé conforme à l'invention
Dans cet exemple, on a préparé des monolithes de silice macroporeux conformes à l'invention à partir d'émulsions huile-dans-eau stabilisées par des particules d'hydroxyapatite.
Dans cet exemple on a tout d'abord procédé à la synthèse des particules d'hydroxyapatite selon le protocole suivant : La synthèse a été réalisée en ajoutant au goutte à goutte 433,3 mL d'une solution aqueuse de phosphate de diammonium 1.5 M dans 1100 mL d'une solution aqueuse de nitrate de calcium 1 M. L'ajout de la solution de phosphate de diammonium a été réalisé en maintenant le pH du milieu réactionnel à 10 par ajout d'ammoniaque et en maintenant la température de réaction à 100°C. Après formation du précipité, la solution a été filtrée sur Buchner, le précipité a été lavé à chaud avec de l'eau décarbonatée. Le gel récupéré a ensuite été lyophilisé et la poudre obtenue stockée au congélateur.
On a ainsi obtenu des particules d'hydroxyapatite agglomérées allongées dans le sens de la longueur de rapport Ca/P = 1,66 ± 0,01, de longueur moyenne de 250 nm et de largeur inférieure à 100 nm. Les agglomérats ont été tamisés à 125 μηι.
Le diagramme de diffraction des rayons X de ces particules est donné à la figure 2 annexée. Sur cette figure l'intensité est fonction de l'angle 2Θ. La courbe correspond aux points expérimentaux relevés pour les particules d'hydroxyapatite synthétisées dans cet exemple et les traits verticaux correspondent aux pics indexés sur les valeurs théoriques de l'hydroxyapatite.
Ce diagramme montre que les particules synthétisées sont bien des particules d'hydroxyapatite et qu'aucune impureté n'a été détectée.
Le spectre IFTR des particules synthétisé est donné par la figure 3 annexée, sur laquelle l'absorbance est fonction du nombre d'onde en cm"1.
Les résultats présentés sur cette figure montrent les bandes IR caractéristiques de l'hydroxyapatite, avec notamment des bandes de vibration vers 1000-1100 cm"1 et 600 cm"1, caractéristiques des groupements orthophosphate, et 3560 cm"1 et 630 cm" attribuables aux groupements OH.
Les particules d'hydroxyapatite ainsi synthétisées ont ensuite été utilisées pour la stabilisation des émulsions huile-dans-eau préparées dans cet exemple.
Les monolithes de silice ont été préparés selon le protocole général donné ci- dessus à l'exemple 1, seule la fraction volumique en huile de Pémulsion de départ a été modifiée, de la manière suivante :
Monolithe M80/20
La fraction volumique en huile de Pémulsion de départ est de 80% (d'où la notation M80/20), ce matériau correspond au protocole donné dans l'exemple 1. Monolithe M85/10
La fraction volumique en huile de Pémulsion de départ est de 85% (augmentation de la taille des interconnexions).
Les photographies MEB des monolithes M80/20 et M85/10 ainsi obtenus sont données par les figures 4 et 5 annexées.
Exemple 3
Etude de la biocompatibilité des matériaux conformes à l'invention
1) Protocole des tests de cytotoxicité
Afin d'étudier la biocompatibilité des matériaux conformes à l'invention, les monolithes M80/20 et M85/10 tels que préparés ci-dessus à l'exemple 2 ont été réduits en poudre (dénommées respectivement P-M80/20 et P-M85/10). Les poudres ont été stérilisées pendant 25 minutes sous rayonnement UV. La quantité de chacune des poudres nécessaire au recouvrement de 25 %, 50 % et 100 % de la surface des puits a été déterminée par pesée afin d'assurer une bonne reproductibilité des résultats.
Les tests de cytotoxicité ont été effectués sur les poudres P-M80/20 et P-M85/10 en présence d'ostéoblastes humains :
- Type de cellules :
Les cellules testées sont des cellules issues d'implants d'os fémoral humain, cultivées dans un milieu Iscove's Modified Dulbecco (IMDM) supplémenté en sérum de veau fœtal 10% et contenant de la protéine BMP2 (facteur de croissance ostéo-inducteur) à raison de 10 ng/mL. Les cellules ont été placées dans une étuve à 37°C en présence de CO2, dans des boites de 24 puits.
- Préparation des puits :
La quantité de chaque poudre nécessaire à l'expérimentation (25 %, 50 % ou 100 % de recouvrement de la surface des puits) a été pesée. La quantité nécessaire au recouvrement de la moitié (1/2) d'un puits a été déterminée par pesée, elle est égale à 0.02 g pour la poudre notée P-M85/10 et à 0,04 g pour la poudre P-M80/20. Les quantités pour couvrir ¼ ou la totalité de la surface d'un puits ont été déterminées au pro rata de la surface. Les puits ont été complétés par la solution cellulaire. Des plaques de 24 puits ont été utilisées, chaque puits ayant un volume de 1 mL. - Tests de cytotoxicité :
Deux jours avant l'ajout des poudres aux puits, les cellules sont ensemencées dans le milieu de culture à raison de 50 000 cellules / puits afin de permettre leur adhésion et démarrer la phase de prolifération.
A T0 le milieu de culture est alors remplacé par le milieu expérimental. Les tests en présence des poudres sont arrêtés à Jl, J3 et J7. Chaque test est répété 3 fois. Des puits ensemencés avec cellules mais en l'absence des poudres servent de contrôle positifs.
Pour chaque temps expérimental (J0, Jl, J3, J7), un test colorimétrique au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tetrazolium (MTT) est réalisé à l'aide d'un spectrophotomètre UV (570 nm) afin de mesurer la viabilité des cellules (seules les cellules vivantes sont détectées).
2) Protocole des tests de prolifération :
Parallèlement un test de prolifération a été réalisé non pas sur les poudres P-M80/20 et M-P85/10 mais sur les matériaux M80/20 conservés sous forme de monolithes, préalablement stérilisés à l'oxyde d'éthylène. Ces monolithes ont été placés dans des puits de culture dont le fond avait été préalablement recouvert d'agarose 1% afin d'empêcher l'adhésion des cellules sur le fond. Les ostéoblastes ont alors été ensemencées à raison de 40 000 cellules / puits dans un volume de 50 L de milieu de culture afin de permettre leur pénétration complète dans le monolithe poreux. Après 3 heures d'incubation 1,5 mL de milieu de culture est alors ajouté avec précaution.
Des observations au microscope électronique à balayage (MEB) ont alors été effectuées à J2 afin de vérifier la présence de cellules en surface et donc leur adhésion sur les monolithes (en surface ou à l'intérieur des macropores).
3) Résultats obtenus
3.1) Résultats des tests de cytotoxicité
Les résultats des dosages MTT sont exprimés en fonction du pourcentage de survie des cellules. Ce pourcentage est obtenu à partir de la valeur moyenne issue des trois expériences pour chaque poudre de monolithe testée. Le 100% est déterminé en l'absence de poudre.
Les résultats obtenus au bout de 1, 3 et 7 jours de culture (Jl, J3 et J7) sont respectivement donnés par les figures 6, 7 et 8 annexées sur lesquelles le pourcentage de survie des cellules est donné pour chaque surface de recouvrement. Sur ces figures les barres de gauche correspondent à la poudre P-M85/10 et les barres de droite à la poudre P-M80/20.
Les résultats montrent peu d'altération de la survie cellulaire pour les 2 matériaux testés. La poudre P-M80/20 montre très peu d'altération de la survie cellulaire particulièrement à des temps courts (Jl) puis la poudre P-M85/10 présente une meilleure survie à J7.
3.2) Résultats des tests de prolifération
La figure 9 est une photographie MEB d'un monolithe M80/20 à l'issue du test de prolifération et montrent des cellules osseuses adhérées à la paroi des macropores. Ces résultats sont encourageants pour le développement de biocéramiques bioactives qui guideraient l'adhésion des cellules osseuses au travers de la macroporosité et aideraient la repousse osseuse.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'un matériau poreux minéral biocompatible se présentant sous forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice comprenant des macropores interconnectés ayant une dimension moyenne dA allant de 100 μηι à 500 μηι et des micropores de dimension moyenne di de 0,7 à 2 nm, et dans lequel au moins une partie de la surface des macropores est tapissée de particules d'hydroxyapatite, ledit procédé comprenant au moins une étape de minéralisation d'une émulsion huile-dans-eau formée de gouttelettes d'une phase huileuse dispersées dans une phase aqueuse continue et dans laquelle des particules solides colloïdales sont présentes à l'interface formée entre la phase aqueuse continue et les gouttelettes de phase huileuse dispersées, ledit procédé étant caractérisé et en ce que :
- la fraction volumique de la phase huileuse est supérieure ou égale à 64 %,
- les particules solides colloïdales sont des particules d'hydroxyapatite,
- la quantité de particules d'hydroxyapatite varie de 0,05 à 50 mg de particules/mL de phase huileuse,
- ladite étape de minéralisation est réalisée sans agitation, à un pH compris entre 6 et 9, en présence d'au moins un précurseur d'oxyde de silice en une quantité supérieure ou égale à 10 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la quantité de particules solides colloïdales d'hydroxyapatite au sein de l'émulsion varie de 1 mg de particules/mL de phase huileuse à 40 mg de particules/mL de phase huileuse.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend, dans cet ordre, les étapes suivantes :
i) la dispersion de particules solides colloïdales d'hydroxyapatite dans une phase aqueuse ayant un pH allant de 6 à 9 pour obtenir une dispersion aqueuse de particules d'hydroxyapatite,
ii) la préparation d'une solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice, le pH de ladite solution étant de 2 à 5,
iii) le maintien de la solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice sous agitation pendant une durée allant de 5 minutes à 10 heures pour obtenir une solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice hydrolysé, iv) l'ajout, à ladite dispersion aqueuse obtenue ci-dessus à l'étape i), de la phase huileuse, sous agitation mécanique jusqu'à obtention d'une émulsion huile- dans-eau,
v) l'ajout, à ladite émulsion obtenue ci-dessus à l'étape iv), de la solution aqueuse d'au moins un précurseur de silice hydrolysé obtenue ci-dessus à l'étape iii), pour obtenir une émulsion huile-dans-eau stabilisée par des particules d'hydroxyapatite et dans laquelle la phase aqueuse comprend ledit précurseur de silice hydrolysé,
vi) la mise au repos de l'émulsion résultant de l'étape v) jusqu'à obtention d'un matériau solide, puis
vii) l'élimination de la phase huileuse présente dans le matériau solide obtenu ci-dessus à l'étape vi) pour obtenir le matériau attendu sous la forme d'un monolithe de silice macroporeux dans lequel la surface des macropores est tapissée de particules d'hydroxyapatite.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la phase huileuse de l'émulsion est constituée par une ou plusieurs huiles choisies parmi les esters d'acides gras, les huiles végétales et les huiles essentielles.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la fraction volumique de la phase huileuse de l'émulsion varie de 64 à 90 %.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les particules d'hydroxyapatite présentent une taille moyenne comprise entre 5 et 5000 nm inclusivement.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les particules d'hydroxyapatite sont de forme sphérique ou en aiguille.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les précurseurs d'oxyde de silice sont choisis parmi le tetraméthoxyorthosilane, le tetraéthoxyorthosilane, le diméthyldiéthoxysilane et les mélanges du diméthyldiéthoxysilane avec le tetraéthoxyorthosilane ou le tetraméthoxyorthosilane.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration en précurseur(s) d'oxyde de silice au sein de la phase aqueuse de Pémulsion varie de 10 à 40 % en masse par rapport à la masse de la phase aqueuse.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que la durée de l'étape iii) varie de 3 à 5 heures.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 3 à 10, caractérisé en ce qu'à l'issue de l'étape vii), le matériau obtenu est séché à une température comprise entre 15 et 40°C, pendant 10 à 20 jours.
12. Matériau poreux minéral biocompatible obtenu par la mise en œuvre du procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, ledit matériau étant caractérisé en qu'il se présente sous forme d'un monolithe alvéolaire constitué d'une matrice de silice comprenant des macropores interconnectés ayant une dimension moyenne dA allant de 100 μηι à 500 μηι et des micropores de dimension moyenne di de 0,7 à 2 nm, et dans lequel au moins une partie de la surface des macropores est recouverte par des particules d'hydroxyapatite.
13. Matériau selon la revendication 12, caractérisé en ce que les parois des macropores ont une épaisseur allant de 0,1 à 10 μηι.
14. Matériau selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que la surface spécifique dudit matériau varie de 100 à 400 m2/g.
15. Matériau poreux minéral biocompatible tel qu'obtenu selon le procédé défini à l'une quelconque des revendications 1 à 11 ou tel que défini à l'une quelconque des revendications 12 à 14, pour une utilisation à titre de matériau de comblement osseux.
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