WO2016207466A1 - Método in vitro y kit para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes antipsicóticos por parte de pacientes que han sufrido un primer episodio psicótico - Google Patents

Método in vitro y kit para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con agentes antipsicóticos por parte de pacientes que han sufrido un primer episodio psicótico Download PDF

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Mónica MARTÍNEZ CENGOTITABENGOA
Ana María GONZÁLEZ-PINTO
Susana ALBERICH MESA
Juan Carlos LEZA CERRO
Karina MACDOWELL MATA
María José PARELLADA REDONDO
Roberto RODRÍGUEZ JIMÉNEZ
Miguel BERNARDO ARROYO
Pilar Alejandra SÁIZ MARTÍNEZ
Juan Antonio MICÓ SEGURA
Antonio LOBO SATUÉ
Carlos Matute Almau
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Euskal Herriko Unibertsitatea
Universidad Complutense de Madrid
Universidad de Zaragoza
Universitat de Barcelona UB
Universidad de Oviedo
Universidad de Cadiz
Hospital Clinic de Barcelona
Administracion General de la Comunidad Autonoma de Euskadi
Centro de Investigacion Biomedica en Red CIBER
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention is within the field of medicine and molecular biology, and refers to an in vitro method of prognosis or prediction of the response to a treatment with antipsychotic drugs, by subjects who have suffered a first psychotic episode, and in particular the use of the expression value of the ratio formed by the active and truncated forms of the receptor (TrKB) of the neuronal growth factor BDNF, called TrKB-FL and TrkB-T, respectively.
  • a first episode of psychosis occurs in approximately 3% of the population and involves a serious mental illness in which the patient usually suffers hallucinations and delusions that are usually accompanied by other symptoms (symptoms maniacs, depressive symptoms, cognitive dysfunctions, behavioral alterations, etc.) and may even represent the onset of a serious and chronic mental illness such as schizophrenia or bipolar disorder.
  • the SPF in certain cases, improves completely with treatment, especially with the use of antipsychotic medications, although this is not always the case. In fact, compared to the general healthy population, patients with a first episode of psychosis have a very high mortality rate.
  • the most used diagnostic criteria in an FEP are the criteria of the DSM (acronym for Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders) of the American Psychiatric Association (APA) and the World Health Organization (WHO), whose latest version is the DSM-V.
  • DSM digital versatile System
  • APA American Psychiatric Association
  • WHO World Health Organization
  • biological markers with prognostic value for said pathology are not included.
  • NIMH National Institute of Mental Health
  • the prognosis of patients who have suffered an SPF can be divided into 3 categories: 25% of patients show a complete response to treatment that leads to a complete recovery after FEP, 50% of patients are recurrent suffering exacerbations and remissions , and the last 25% of patients show an unfavorable evolution with response and an incomplete recovery after suffering the SPF.
  • lack of response or a partial response to treatment remains common, and such lack of response is associated with a longer duration of hospitalization, in addition to obtaining poor long-term results.
  • an SPF can lead, in many cases, to a serious and chronic pathology such as schizophrenia, psychosis, bipolar disorder, etc., it is very important to carry out an early approach to the disease to fight for the best possible prognosis.
  • neurotrophins such as neurotrophins , specifically the neurotrophins Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) and Nerve Growth Factor (NGF), which play an important role in neurodevelopment and adult brain plasticity, in the survival and differentiation of neurons, in neuronal functioning and in repair mechanisms .
  • Said neurotrophins exert their actions through the activation of their tyrosine kinase-like receptors, TrKB in the case of BDNF and TrKA, in the case of NGF.
  • TrKB tyrosine kinase-like receptors
  • TrKA tyrosine kinase-like receptors
  • biomarkers useful in predicting or predicting the response of patients who have suffered an SPF to treatment with antipsychotic drugs do not exist in the state of the art. Consequently, there is in the state of the art a clear and urgent need to look for biomarkers, with high specificity and sensitivity, that makes them extrapolated to clinical practice, and that are useful for predicting the response to antipsychotic treatment in patients after suffering an SPF. DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the present invention relates to an in vitro method for the prognosis or prediction of the response to treatment with at least one antipsychotic agent, by patients who have suffered an SPF, where the prognosis is made according to the expression value resulting from the rate.
  • TrKB-FL / TrKB ⁇ T in an isolated biological sample of said patients at the time of disease debut.
  • this is characterized in that when the expression value resulting from the ratio is> 0.70, said value is indicative that the patient will have a good prognosis of response to treatment with at least an antipsychotic drug, that is, will be a patient responding to antipsychotic treatment.
  • BDNF receptor forms preferably in a sample of biological fluid, preferably in a sample of blood, plasma or serum, more preferably in a sample of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), provides us with a tool to predict whether a patient who has just suffered his FEP will respond well or not to antipsychotic treatment.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the technical problem solved by the present invention refers to an in vitro method for the prognosis or prediction of the response to treatment with at least one antipsychotic agent, by patients who have suffered an SPF, from a sample Biological obtained from these patients at the time of the debut of the disease, which is simple (based on the analysis of two specific proteins and / or the genes that encode them), little invasive for the patient and also presents a sensitivity ( 79.1%) and specificity (61.1%) very high, thus allowing its use in daily clinical practice.
  • the prediction of the response to treatment by patients who have suffered an SPF is useful in several main ways: (1). Prediction of non-responders to treatment with at least one antipsychotic agent (poor prognosis): in this way the patient could be directed to alternative treatments without the need to apply, as a first treatment, antipsychotic therapy. (2).
  • this tool is very useful to start treatment very early since in the particular case of patients who have suffered an SPF it has been shown that treatment In the early stages of the disease they can be very effective in preventing its progression towards chronic pathologies such as schizophrenia or psychosis, in addition to allowing the patient to lead a normal life, defined as a good general functioning of the patient in his daily life.
  • the first aspect of the present invention relates to an in vitro method, from here we will call it, the first method of the invention, for the prognosis or prediction of the response to treatment with at least one antipsychotic agent by part of patients who have suffered a first psychotic episode, where the prognosis is made based on the expression value of the TrkB-FL / TrkB-T ratio, in an isolated sample of said patients at the time of disease debut, where a value The expression value of the ratio ⁇ 0.70 is indicative of a patient responding to the treatment and an expression value of the ratio ⁇ 0.70 is indicative of a patient not responding to the treatment.
  • the present invention also relates, therefore, to the use in vitro of the expression value of the TrKB-FL / TrKB-T ratio as a prognostic or predictive biomarker of the response to treatment with at least one antipsychotic agent, by patients who have suffered a first psychotic episode, where when the expression value resulting from said ratio is ⁇ 0.70, this value is indicative that the patient will have a good prognosis of response to treatment with at least one antipsychotic drug, that is It will be a patient responding to antipsychotic treatment.
  • this value is indicative that the patient will have a poor prognosis of response to treatment with at least one antipsychotic drug, that is, it will be a patient not responding to the treatment antipsychotic
  • TrKB refers to a protein that in Human is encoded by the NTRK2 gene located on chromosome 9 (87.28-87.64 Mb). TrKB acts as a high affinity catalytic receptor for BDNF and NT-3 and -4 neurotrophic factors. Its denomination is usually abbreviated with the following modes: NTRK2; GP145-TrkB; TRKB; trk-B.
  • the Said receiver has two TrKB-FL and TrKB-T isoforms.
  • the TrKB-FL isoform is the complete active form of the TrKB receptor. This complete form transduces the BDNF signal through Ras-ERK, PI3K, and PLCy.
  • the TrKB-T isoform is the truncated form of the TrKB receptor that lacks kinase activity and opposes the function of the TrKB-FL form. This truncated form has the same extracellular and transmembrane domains as the complete form but differs in the terminal sequence.
  • the TrkB accession number in the UniProtKB / Swiss-Prot database is Q16620, where the protein sequences for the active isoform and for the truncated isoform appear.
  • the access number for the genomic sequence of NTRK2 in the NCBI database is NG_012201.2.
  • any technique known to the person skilled in the art can be used.
  • any of the proteins of the present invention are the product of the expression of a nucleotide sequence.
  • This nucleotide sequence can be, for example but not limited to, any RNA such as, but not limited to, messenger RNA (mRNA), or any of its fragments.
  • the nucleotide sequence can also be complementary DNA (cDNA) or any of its fragments.
  • the cDNA is a complementary DNA to an mRNA or is also the nucleotide sequence that comprises the exons of the genomic nucleotide sequence but not the introns, that is, the cDNA is the coding sequence.
  • the transcription of the genomic nucleotide sequence of the gene that codes for the protein and its cDNA encodes for the same mRNA and, therefore, for the same protein.
  • RNA or any DNA or any of its fragments
  • the TrKB-FL and TrKB-T proteins or any fragment thereof is detected and / or quantified by electrophoresis, immunoassay, chromatography. and / or microarray technology, also evaluating its presence or absence.
  • Electrophoresis is an analytical separation technique based on the movement or migration of dissolved macro-molecules in a medium (electrophoresis buffer), using a matrix or a solid support as a result of the action of an electric field.
  • the behavior of the molecule depends on its electrophoretic mobility and this mobility depends on the charge, size and shape.
  • Electrophoresis is selected from the list comprising, but not limited to, capillary electrophoresis, paper electrophoresis, agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing or two-dimensional electrophoresis.
  • An immunoassay is a biochemical test that measures the concentration of a substance in a biological liquid using the reaction of an antibody or antibodies with any of its antigens.
  • the assay takes advantage of the specificity of an antibody with its antigen.
  • the amount of antibody or antigen can be detected by methods known in the state of the art. One of the most common methods is based on the antigen or antibody mapping.
  • the marking can be carried out, but not limited to, an enzyme, radioisotopes (radioimmunoassay), magnetic tags (magnetic immunoassay) or fluorescence, and also other techniques including agglutination, nephelometry, turbidimetry or Western Blot.
  • Heterogeneous immunoassays can be competitive or non-competitive.
  • the immunoassay can be competitive: the response will be inversely proportional to the concentration of antigen in the sample, or it may be non-competitive (also known as "sandwich assay"): the results are directly proportional to the concentration of the antigen.
  • An immunoassay technique that can be used in the present invention is the ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) assay.
  • chromatographic techniques the molecules can be separated, but not limited, by their charge, size, molecular mass, by their polarity or by their redox potential.
  • the chromatography technique is selected, but not limited to, liquid chromatography (partition chromatography, adsorption chromatography, exclusion chromatography or ion exchange chromatography), gas chromatography or supercritical fluid chromatography.
  • the microarray technology of the present invention is based, for example, on the fixation on a solid support of a molecule that recognizes the protein of the present invention.
  • the antibody-based microarray is the most common protein microarray. In this case, the antibodies are fixed on the solid support (the term chip can also be used to refer to microarray). These antibodies are used to capture molecules that allow the detection of proteins from, but not limited to, biological samples, cell lysates, blood, plasma, serum, PBMCs or urine.
  • solid support refers to a wide variety of materials, for example, but not limited to, ion exchange or adsorption resin, glass, plastic, latex, nylon, gel, cellulose esters , paramagnetic spheres or the combination of some of them.
  • antibody refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, that is, molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts) with a protein
  • immunoglobulins There are five isotypes or major classes of immunoglobulins: IgM, IgD, IgG, IgA and IgE.
  • IgM immunoglobulin molecules
  • IgD immunoglobulin molecules
  • IgG immunoglobulin glycoprotein
  • Antibodies known in the state of the art capable of detecting TrKB-FL and / or TrKB-T proteins are selected from any of the following: Anti-TrkB antibodies of references ab18987 and ab33665, reference Anti-TrkB antibody [EPR1294] ab134155, of Abcam Inc (Cambridge, MA); TrkB antibody # 4606 from Cell Signaling (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, USA); TrkB (C-13) sc-1 19 antibody, TrkB (F-1) sc-377218 antibody and TrkB (794) sc-12 antibody from Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California, USA); anti-TrkB antibody (Ab-705) from Sigma (Spain).
  • variant refers to proteins substantially homologous to the TrKB-FL and TrKB-T proteins.
  • a variant includes additions, deletions or substitutions of amino acids, always with the proviso that said variants are functionally equivalent to the original protein.
  • variant also includes proteins resulting from posttranslational modifications such as, but not limited to, glycosylation, phosphorylation or methylation.
  • fragment refers to a portion of the TrKB-FL and TrKB-T proteins or one of its variants.
  • the term "prognosis” or “prediction” is understood as the expected evolution of a disease and refers to the assessment of the probability according to which a subject suffers from a disease as well as the assessment of its disease. onset, stage of development, evolution, or its regression, and / or the prognosis of the course of the disease in the future. As those skilled in the art will understand, such assessment, although preferred, may not be correct for 100% of the subjects to be diagnosed. The term, however, requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as having the disease or having a predisposition to it.
  • a part is statistically significant, it can be determined by the person skilled in the art using several well-known statistical evaluation tools, for example, determination of confidence intervals, determination of p-values, Student's t-test, Mann-Whitney test , or Fisher discriminant functions, measures not Mann Whitney parametrics, Spearman correlation, logistic regression, linear regression, area under the ROC curve (AUC), etc.
  • Preferred confidence intervals are at least 50%>, at least 60%>, at least 70%>, at least 80%>, at least 90%, at least 95%, at least 97 %, at least 98% or at least 99%.
  • P values are preferably 0, 1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001. etc.
  • 'Prediction of the response' means, in the context of the present invention, the determination of the probability that the patient responds favorably or unfavorably to a particular therapy or treatment.
  • 'prediction' refers to an individual evaluation of any parameter that may be useful in determining the evolution of a patient.
  • the prediction of the clinical response to treatment although it is preferred, does not need to be correct for 100% of the subjects to be diagnosed or evaluated. The term, however, requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as having an increased probability of having a positive response.
  • Preferred confidence intervals are at least 50%>, at least 60%>, at least 70%>, at least 80%>, at least 90%, at least 95%, at least 97 %, at least 98% or at least 99%.
  • P values are preferably 0, 1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
  • the present invention makes it possible to predict the response to the treatment differentially by at least 60%, more preferably at least 70%, much more preferably at least 80%, or even more preferably at least 90 % of the subjects of a certain group or population analyzed.
  • the prediction of the clinical response can be made using any assessment criteria used in psychiatry and known by the person skilled in the art.
  • the term "good prognosis” or “responding patients” refers to those patients who after suffering an SPF and starting treatment with at least one antipsychotic drug, recover from the disease, having a satisfactory functional life.
  • the term “poor prognosis” or “non-responders” refers to those patients who after suffering an SPF starting an antipsychotic treatment will not make them recover from the disease and its functioning in daily life will to look deteriorated
  • the term "specificity" refers to the ability of a diagnostic and / or prognostic method or test to correctly classify a healthy individual (eg negative diagnosis of carcinoma, when the patient is not affected by carcinoma) , that is, the probability that a negative result will be obtained for a healthy subject; a specificity of 100% means that there are no false positives.
  • the specificity shown by the method described in the present invention is 79.1%.
  • a specificity of 79.1% means that the value of the TrkB-FL / TrkB-T ratio obtained correctly predicts 79.1% of subjects with poor functionality.
  • the term "sensitivity" refers to the ability of a diagnostic and / or prognostic method or test to correctly classify a sick individual (eg positive diagnosis of carcinoma, when the patient is affected by carcinoma), that is, the probability that a positive result will be obtained for a sick subject; 100% sensitivity means that there are no false negatives.
  • the sensitivity shown by the method described in the present invention is 61.1%.
  • a sensitivity of 61.1% means that the method correctly predicts 61.1% of subjects with good functionality.
  • the term "positive predictive value” or “PPV” refers to the probability that a patient is ill if the prognosis or prediction method is positive (eg being affected by carcinoma when the diagnosis / prognosis of the test is positive), that is, the proportion of patients with a positive result in the method of diagnosis and / or prognosis that eventually turned out to be sick.
  • the PPV is 85.3% which means that 85.3% of the subjects that by the method of Invention they are predicted as responding patients, they will be responding patients and present good functionality.
  • the term "negative predictive value” or “NPV” refers to the probability that a patient is healthy if the prognostic or prediction method is negative (eg not being affected by carcinoma when the diagnosis / prognosis of the test is negative), that is, the proportion of patients with a negative result in the diagnostic method and / or prognosis that finally turned out to be healthy.
  • the NPV is 57.9% which means that 57.9% of the subjects who by the method of the invention are predicted as non-responders and who would present poor functionality if they were treated with antipsychotic drugs, they will finally be non-responders who will have a malfunction.
  • antipsychotic agent or “antipsychotic compound” or “antipsychotic drug” refers to those substances capable of treating the patient's psychotic symptoms such as delusions and / or hallucinations.
  • antipsychotic refers to a wide family of drugs traditionally classified into two groups, depending on their safety profile and their efficacy on the depressive symptoms of schizophrenia.
  • the main groups of antipsychotics are typical antipsychotics (AT) and atypical antipsychotics (AA).
  • TAs are the oldest antipsychotic drugs, with a fundamentally antidopaminergic action and characterized by their effectiveness in the control of positive psychotic symptoms (delusions, hallucinations), but which are ineffective on negative symptoms (depression, social isolation).
  • AT drugs that can be used in the treatment of an SPF are selected from any of the following: chlorpromazine, fluphenazine, levomepromazine, perphenazine, trifluoperazine, haloperidol, zuclopenthixol, pimozide, suppressed, thiapride, or combinations thereof.
  • Atypical antipsychotic drugs are characterized by simultaneously blocking dopaminergic and serotonergic receptors and being effective in both positive and negative symptoms.
  • the AA drugs that can be used in the treatment of an SPF are selected from any of the following: clozapine, risperidone, olanzapine, quetiapine, ziprasidone, aripiprazole, paliperidone, asenapine, sertindole, amisulpride, or combinations thereof.
  • the term "isolated biological sample” includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to a person skilled in the art.
  • the isolated biological sample is a biological fluid.
  • the biological fluid is blood or plasma or blood serum.
  • the biological fluid is blood and preferably, peripheral blood mononuclear cells (PB Cs).
  • PB Cs peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • kit or device comprising the elements necessary to detect and / or quantify the expression levels of the TrKB-FL and TrKB-T isoforms. , or a variant thereof or a fragment thereof, in a biological sample isolated from a subject.
  • the elements necessary for the detection and / or quantification of the TrKB-FL and TrKB-T isoforms, or a variant thereof or a fragment thereof are preferably selected from: oligonucleotides, probes and / or antibodies
  • this comprises antibodies capable of detecting the expression of the TrKB-FL and TrKB-T isoforms or of a fragment thereof or any of its variants.
  • Said kit may contain all those reagents necessary to analyze the amount of TrKB-FL and TrKB-T protein by any of the methods described hereinbefore, such as, but not limited to, specific antibodies of said proteins, secondary antibodies. or positive and / or negative controls.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc. In the case of detection by RTqPCR, it may contain, but not limited to, primers, probes and all those reagents necessary to determine the expression of TrKB-FL and TrKB-T proteins.
  • the kit can also include, without any limitation, the use of buffers, polymerases, cofactors to obtain optimum activity from these, agents to prevent contamination, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for its start-up and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • FIG. 1 Analysis of the expression of TrKB-FL (A) and TrkB-T (B) isoforms in PBMCs isolated from patients at the time of disease debut and 6 months later, and in healthy control subjects .
  • C Graph showing the value of the TrKB-FL / TrKB-T ratio in healthy control subjects and in subjects who have suffered an SPF, at the time of the debut of their disease and after 6 months of follow-up.
  • the densitometric data of the respective bands of interest have been normalized using the expression obtained for ⁇ -actin. The data represent the mean ⁇ standard deviation. T test for paired samples. * p ⁇ 0.05 vs. Control; #p ⁇ 0.05, ## p ⁇ 0.01 vs FEP debut.
  • the invention will now be illustrated by exposing the results obtained by the inventors. These show the specificity, sensitivity and efficacy of the biomarker prediction of response to an antipsychotic treatment in patients who have suffered an SPF, described in the present invention.
  • Table 1 shows the clinical characteristics of patients and healthy control subjects.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • TrKB-FL and TrKB-T were quantified using the Western-Blot (WB) technique, from the cytosolic extracts obtained from the PBMCs by a modified procedure based on the method of Scheiber and cois.
  • PBMCs were homogenized in 150 buffer (10 mmol / L N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid [pH 7.9]; 1 mmol / L EDTA, 1 phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.1 mg / mL aprotinin, 1 mg / mL leupeptin, 1 mg / mL Na-ptosyl-L-lysine-chloromethyl ketone, 5 mmol / L NaF, 1 mmol / L NaV04, 0.5 mol / L sucrose, and 10 mmol / L Na2Mo04) at pH 7.4.
  • 150 buffer 10 mmol / L N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid [pH 7.9]; 1 mmol / L EDTA, 1 phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.1 mg
  • Nonidet P-40 (Roche, Mannheim, Germany) was added until reaching a concentration of 1%.
  • the tubes were vortexed for 30 seconds and the nuclei were collected by centrifugation at 8000g x 5 min. The supernatant was considered to constitute the cytosolic fraction.
  • the pellets were resuspended in 50 of the buffer, supplemented with 20% glycerol, 15 mmol / L MgCL2 and 0.4 mol / L NaCI and stirred slightly for 30 min at 4 ° C.
  • Nuclear protein extracts were obtained by centrifugation at 13,000 gx 5 min, and aliquots of the supernatant were stored at -80 ° C. All stages of fractionation were carried out at 4 ° C.
  • GPDH glyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase
  • SP1 Specific Protein 1
  • ⁇ -actin in cytosol: 99 ⁇ 1; 19 ⁇ 5; and 98 ⁇ 1% of total optical density signal [OD], respectively; and in cores: 0; 81 ⁇ 7; and 99 ⁇ 1% of total optical density signal, respectively.
  • the cytosolic extracts were mixed with the same volume of the Laemmli buffer (Bio-Rad, USA) (SDS 10%, distilled H20, 50% glycerol, 1 M Tris HCI, pH 6.8, dithiothreitol and bromophenol blue), with ⁇ -mercaptoethanol (50 ⁇ Laemmli). 12 ⁇ g of said mixture was loaded on an electrophoresis gel. Protein samples were separated and transferred to a nitrocellulose membrane (Amersham, Iberian, Spain). After neutralization, the membranes were incubated with specific antibodies to detect the presence of the markers of the invention:
  • TrKB rabbit polyclonal antibodies at a dilution of 1: 1000 in TBS-Tween (sc-12; Santa Cruz Biotechnology, USA), for TrKB-FL,
  • TrKB-T Rabbit TrKB polyclonal antibodies at a dilution of 1: 1000 in TBS-Tween (sc-1 19; Santa Cruz Biotechnology, USA) for TrKB-T,
  • the membranes were incubated with their respective secondary antibodies conjugated with peroxidase. (dilution 1: 2000 in TBS-Tween).
  • the immunoreactivity of the bands was detected and visualized by the Oddyssey Fe system (Liquor, Germany) and quantified by densitometry (NIH ImageJ® software). All densitometric results were expressed as percentage of expression of each of the markers analyzed with respect to the control group.
  • GAF scale Global Assessment Functioning
  • DSM-lll-R American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-lll-R), text revision.
  • DSM-IV American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders DSM-IV. Washington, DC: American Psychiatric Association; 1994
  • DSM-IV-TR American Psychiatric Association, Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-IV-TR), text revision, 4th edition, Washington, DC: American Psychiatric Association; 2000.
  • a high score on the scale denotes better functionality. For the purposes of the present invention, good functionality is considered when the score on the GAF scale is ⁇ 60 points, while the patient will have impaired functioning when the score on that scale is ⁇ 60 points.
  • a "step-by-step backward" model was used, including all possible confounding variables (sex, age, marital status, studies, socioeconomic status, race, tobacco, alcohol, cannabis, BMI, antipsychotics) . Only those variables that were significant or those that produced a significant change in the coefficient of the independent variable, were included in the regression model (BMI, tobacco and antipsychotics). Finally, the interaction terms were evaluated.
  • PANSS Scale of positive and negative symptoms. * Affective psychosis: bipolar disorder, psychotic depression or schizoaffective disorder. ** Non-affective psychosis: schizophrenia, schizophreniform disorder and psychotic disorder not previously specified. Bold data indicate that the data has reached statistical significance (p value ⁇ 0.05).
  • the patients object of the present study once diagnosed, were given antipsychotic treatment.
  • the drugs used in said treatment were selected from any of the following: risperidone, clozapine, paliperidone, aripiprazole, ziprasidone, olanzapine or quetiapine.
  • the expression of said receptors in the PBMCs cells is modified to along the time in patients who had suffered an SPF, so that the expression levels of the TrKB-FL isoform increase significantly during the follow-up period of the patients (6 months) after the debut of the disease (Fig. 1A), while the levels of the expression of the TrKB-T isoform decrease significantly in this same period (Fig. 1 B) and in comparison with the levels that show the group of healthy control subjects of said isoform (Fig. 1 B).
  • the expression value of the TrKB-FL / TrKB-T ratio increases significantly throughout the follow-up compared to the expression of said ratio in healthy control subjects and with respect to the expression thereof in patients at the time. of the disease debut (Fig. 1 C).
  • the regression model for the association between the TrKB-FL / TrKB-T index at baseline (disease debut) and patient functionality at 6 months of debut (GAF) was adjusted taking into account the variables: index of body mass (BMI), tobacco consumption and consumption of antipsychotics.
  • BMI index of body mass
  • Table 2 shows the sizes of the effect of taking antipsychotics for different levels of the expression value of the TrKB-FL / TrKB-T ratio on functionality (GAF) at 6 months after the disease's debut.
  • GAF functionality
  • TrKB-FL / TrKB-T 1.96
  • the patients taking antipsychotics were the ones with the best functionality after 6 months of debut (effect size: 43.54; 95% CI: 12.189, 74.887) (Table 2).
  • Table 2 Sizes of the effect of taking antipsychotics on the functionality 6 months after the disease's debut (and its 95% CI) for the selected values of the TrKB-FL / TrKB-T ratio *
  • the size of the effect is interpreted as the difference between the GAF means between the patients taking antipsychotics.
  • the expression levels of the TrKB-FL / TrKB-T ratio at the time of disease debut are related to the functionality of the patient in a different way depending on whether the patient consumes or not antipsychotics.
  • both the expression levels of the TrKB-FUTrKB-T ratio, as well as the consumption of antipsychotics do not show an effect on the functionality of said patients (GAF) in an independent way, since neither shows statistical significance when included in the equation of regression the term of the interaction.
  • the potential of the expression value of the TrKB-FL / TrKB-T ratio as a biomarker for the prognosis of response to treatment with agents was analyzed antipsychotics in patients who have suffered an SPF.
  • sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) were studied, considering as a cut-off point the value of ⁇ 0.70 for the TrKB-FL / TrKB-T index level and a value ⁇ 60 as a cut-off point for the GAF scale. 0.70 was considered as the cut-off point for the index since it is the point at which sensitivity and specificity values are maximized.
  • the proposed model shows a sensitivity of 79.1%, a specificity of 61.1%, a PPV of 85.3% and a NPV of 57.9%.
  • the method offers a false positive ratio of 38.9% and a false negative ratio of 20.9%.
  • the data of sensitivity refers to the fact that 79.1% of patients with good functionality after 6 months taking antipsychotics after having suffered FEP, had a high value of the expression of the TrKB-FL / TrKB-T at the time of disease debut.
  • TrKB-FL / TrKB-T an expression value of the TrKB-FL / TrKB-T ⁇ 0.70 ratio, at the time of disease debut.
  • the specificity data refers to the fact that 61.1% of the patients who presented a low value of the expression of the TrKB-FL / TrKB-T ratio ( ⁇ 0.70) at the time of the debut of the disease when the disease started and after 6 months of taking antipsychotic medication, presented poor functionality ( ⁇ 60).
  • This analysis consolidates the use of the expression value of the TrKB-FL / TrKB-T ratio as a marker for the prediction of the response to an antipsychotic treatment in patients who have suffered an SPF, allowing those responding patients to be easily discriminated against non-responders. responders, to antipsychotic therapy.
  • Sensitivity according to the model, 79.1% of patients with good functionality after 6 months taking antipsychotics after having suffered FEP, had a high level of the TrKB-FL / TrKB-T ratio ( ⁇ 0.70) at the time of Start the disease.
  • TrKB-FL / TrKB-T ratio The proportion of patients with low levels of the TrKB-FL / TrKB-T ratio ( ⁇ 0.70) when the disease started had poor functionality ( ⁇ 60) after 6 months after taking antipsychotic medication.
  • PPV a patient with a value of the TrKB-FL / TrKB-T ⁇ 0.70 ratio at the time of debuting the disease and starting with an antipsychotic treatment has a 85.3% chance of having good functionality (GAF ⁇ 60) a 6 months later
  • NPV a patient who has a low level of the TrKB-FL / TrKB-T ratio ( ⁇ 0.70) at the time of PEP, has a probability of presenting general poor functionality ( ⁇ 60) after 6 months of taking antipsychotic medication.
  • the expression value of the TrKB-FL / TrKB-T ratio serves as a prognostic marker of response to antipsychotic treatment in subjects who have suffered an SPF, showing high sensitivity (79.1%) and specificity (61.1%). Therefore, expression levels of the TrKB-FL / TrKB-T ratio ⁇ 0.70 in subjects who suffer an SPF at the time of their debut in the disease, show a better response to antipsychotic treatment than those patients who at the time of their debut in the disease have a level of expression of the TrKB-FL / TrKB-T ratio ⁇ 0.70.

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Abstract

La presente invención se refiere aun método in vitrode pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con fármacos antipsicóticos, por parte de sujetos que han sufrido un primer episodio psicótico (FEP), y en concreto, al empleo del valor de expresión, en una muestra biológica aislada de dichos sujetos, del ratio formado por dos de las isoformas -isoforma activa e isoforma truncada-, del receptor (TrKB) del factor de crecimiento neuronal BDNF, denominadas TrKB-FL y TrkB-T, respectivamente. La presente invención describe además kits y usos de los mismos para llevar a cabo el método de la invención.

Description

MÉTODO IN VITRO Y KIT PARA EL PRONÓSTICO O PREDICCIÓN DE LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO CON AGENTES ANTIPSICÓTICOS POR PARTE DE PACIENTES QUE HAN SUFRIDO UN PRIMER EPISODIO PSICÓTICO. DESCRIPCIÓN
La presente invención se encuentra dentro del campo de la medicina y la biología molecular, y se refiere a un método in vitro de pronóstico o predicción de la respuesta a un tratamiento con fármacos antipsicóticos, por parte de sujetos que han sufrido un primer episodio psicótico, y en concreto al empleo del valor de expresión del ratio formado por las formas activa y truncada del receptor (TrKB) del factor de crecimiento neuronal BDNF, denominadas TrKB-FL y TrkB-T, respectivamente.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Un primer episodio de psicosis (FEP, siglas del inglés First-Episode Psycosis) ocurre en aproximadamente el 3% de la población y supone una enfermedad mental grave en la que el paciente suele sufrir alucinaciones y delirios que normalmente se acompañan de otros síntomas (síntomas maníacos, síntomas depresivos, disfunciones cognitivas, alteraciones de comportamiento, etc.) e incluso puede llegar a representar el inicio de una enfermedad mental grave y crónica como puede ser la esquizofrenia o el trastorno bipolar. El FEP, en determinados casos, mejora completamente con el tratamiento, especialmente con el uso de medicamentos antipsicóticos, aunque no siempre sucede así. De hecho, en comparación con la población general sana, los pacientes con un primer episodio de psicosis tienen una tasa muy alta de mortalidad.
El estudio de las fases tempranas de un FEP tiene el objetivo de captar los cambios fisiopatológicos presentes en el paciente cuando la sintomatología aparece por primera vez, permitiendo así estudiar esta compleja enfermedad antes de que la misma progrese evitando potenciales factores de confusión, tales como el tratamiento prolongado con antipsicóticos o la aparición de patologías concomitantes. Además, es de particular importancia cuando se produce un FEP, en primer lugar llevar a cabo el diagnóstico correcto del paciente y por otro lado, aplicarle un tratamiento específico y adecuado, ya que la aplicación de un tratamiento inadecuado puede conducir a alteraciones neuroanatómicas y cognitivas, así como a un peor resultado funcional del paciente.
Los criterios diagnósticos más empleados en un FEP son los criterios del DSM (siglas del inglés Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders) de la Asociación Americana de Psiquiatría (APA) y de la Organización Mundial de la Salud (OMS), cuya última versión es la DSM-V. En dicha versión de las guías diagnósticas utilizadas actualmente no se incluyen marcadores biológicos con valor pronóstico para dicha patología. Recientemente, el National Institute of Mental Health (NIMH) estadounidense, ha recalcado la necesidad de buscar raíces neurobiológicas en las enfermedades psiquiátricas, pidiendo a la comunidad científica un esfuerzo para intentar comprender los fundamentos fisiopatológicos de esta enfermedad (Reardon S. Nature. 2014;507:288). El pronóstico de los pacientes que han sufrido un FEP se puede dividir en 3 categorías: 25% de los pacientes muestra una respuesta completa al tratamiento que lleva a una recuperación completa tras el FEP, el 50% de los pacientes es recurrente sufriendo exacerbaciones y remisiones, y el último 25% de los pacientes muestran una evolución desfavorable con respuesta y una recuperación incompleta tras sufrir el FEP. Así, la falta de respuesta o una respuesta parcial al tratamiento sigue siendo común, y dicha falta de respuesta se asocia con una mayor duración de la hospitalización, además de la obtención de pobres resultados a largo plazo. En este sentido, dado que un FEP puede derivar, en muchos casos en una patología grave y crónica tal como esquizofrenia, psicosis, trastorno bipolar, etc., es de gran relevancia realizar un abordaje temprano de la enfermedad para luchar por el mejor pronóstico posible para el paciente. La importancia de una rápida intervención está ampliamente aceptada pero no siempre la misma intervención es igualmente efectiva para todos los pacientes con un FEP. Por dicho motivo, es necesario focalizar en los distintos endofenotipos de la enfermedad en esta etapa temprana a fin de diseñar el abordaje terapéutico más apropiado, ya que el éxito del tratamiento de un FEP es uno de los principales factores que afecta el pronóstico a largo plazo. Este hecho pone de relieve la necesidad de encontrar biomarcadores capaces de pronosticar o predecir, en fases muy tempranas de la enfermedad, específicamente en el momento en el que se produce el primer brote psicótico, con una alta especificidad y sensibilidad, la respuesta al tratamiento en dichos sujetos, para en consecuencia, diseñar y aplicar el tratamiento más adecuado para cada caso particular.
En este sentido, en los últimos años el foco se ha centrado principalmente en la detección de biomarcadores relacionados con el componente inflamatorio de dichos procesos, aunque también con componentes de estrés oxidativo y marcadores genéticos, entre otros (Fond G, et al. Schizophr Bull. 2015;41 (3):559-73). El daño causado por los procesos inflamatorios y oxidativos durante el proceso de un FEP tiende a ser contrarrestado o compensado por varios sistemas protectores o de reparación (Meyer U. Brain Behav Immun. 201 1 ;25(8):1507-18; Gomes JR, et al. J Neurosci Off J Soc Neurosci. 2012;32(13):4610-22; Miller BJ, et al. Biol Psychiatry. 201 1 ;70(7):663-71), como por ejemplo, las neurotrofinas, específicamente las neurotrofinas Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) y Nerve Growth Factor (NGF), que juegan un papel relevante en el neurodesarrollo y plasticidad cerebral adulta, en la supervivencia y diferenciación de neuronas, en el funcionamiento neuronal y en los mecanismos de reparación. Dichas neurotrofinas ejercen sus acciones a través de la activación de sus receptores de tipo tirosin-quinasa, TrKB en el caso del BDNF y TrKA, en el caso del NGF. Diversos estudios preclínicos y clínicos desarrollados en los últimos 10 años han encontrado cambios en los niveles plasmáticos de neurotrofinas, así como un descenso de su expresión en determinadas áreas cerebrales en pacientes con esquizofrenia (Wong J, et al. Schizophr Bull. 2013;39(1): 130-40; Mondelli V, et al. J Clin Psychiatry. 2011 ;72(12): 1677-84; Weickert CS, et al. Mol Psychiatry. 2005; 10(7):637-50). Dichos estudios han puesto de manifiesto que los niveles de BDNF generalmente se encuentran disminuidos en pacientes con un primer episodio de psicosis (Toll A, Mané A. World J Psychiatry. 2015; 5(1): 154-9). Por otro lado, también se ha descrito que el desequilibrio entre las isoformas activa (TrKB-FL) y truncada (TrKB-T) del receptor de BDNF, se asocia tanto con muerte neuronal (Vidaurre OG, et al. Cell Death Dis. 2012; 3:e256) como con esquizofrenia (Wong J, et al. Schizophr Bull. 2013;39(1): 130-40). Así, a pesar de que se han propuesto un gran número de biomarcadores para el diagnóstico y/o pronóstico del FEP, ninguno de ellos se aplica en la actualidad en la rutina clínica diaria.
Por lo tanto, no existe en el estado de la técnica biomarcadores útiles para pronosticar o predecir la respuesta de pacientes que han sufrido un FEP a un tratamiento con fármacos antipsicóticos. En consecuencia, existe en el estado de la técnica una clara y urgente necesidad de buscar biomarcadores, con una alta especificidad y sensibilidad, que los haga extrapolables a la práctica clínica, y que sean útiles para predecir la respuesta al tratamiento antipsicótico en pacientes tras sufrir un FEP. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con al menos un agente antipsicótico, por parte de pacientes que han sufrido un FEP, donde el pronóstico se realiza atendiendo al valor de expresión resultante del ratío TrKB-FL/TrKB~T, en una muestra biológica aislada de dichos pacientes en el momento del debut de la enfermedad. En una realización preferida del método in vitro de la invención, este se caracteriza por que cuando el valor de expresión resultante del ratio es > 0.70, dicho valor es indicativo de que el paciente va a presentar un buen pronóstico de respuesta ai tratamiento con al menos un fármaco antipsicótico, es decir, va a ser un paciente respondedor al tratamiento antipsicótico. En cambio, cuando el valor resultante del ratio es < 0.70, dicho valor es indicativo de que el paciente va a presentar un mal pronóstico de respuesta al tratamiento con al menos un fármaco antipsicótico, es decir, va a ser un paciente no- respondedor ai tratamiento antipsicótico. Por lo tanto, una baja expresión de la forma truncada (TrKB-T) del receptor TrkB, respecto de la forma activa (TrKB-FL) del mismo, se relaciona con una buena respuesta al tratamiento. Consecuentemente, evaluar la expresión de las formas del receptor de BDNF, y obtener su ratio de expresión, en una muestra de fluido biológico, preferentemente en una muestra de sangre, plasma o suero, más preferentemente en una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), nos proporciona una herramienta para predecir si un paciente que acaba de sufrir su FEP responderá bien o no al tratamiento antipsicótico. La determinación del valor de dicho ratio en el momento del debut de la enfermedad resulta de gran importancia debido a que nos permite establecer un tratamiento adecuado que pueda mejorar la evolución a largo plazo de dichos pacientes.
Por lo tanto, en la presente invención se describe el uso de la proporción relativa de las dos isoformas del receptor TrKB, TrKB-FL (isoforma activa) respecto a TrKB-T (isoforma truncada), medido en el momento del debut de ¡a enfermedad, como biomarcador para el pronóstico o predicción de la respuesta al tratamiento con al menos un agente antipsicótico por parte de pacientes que han sufrido un FEP, ya que dicho valor de expresión del ratio se relaciona significativamente con pacientes respondedores al tratamiento antipsicótico, obteniéndose en dichos pacientes muy buenos resultados funcionales en su recuperación seis meses después de haber sufrido el primer episodio psicótico. Es más, como se muestran en los ejemplos que acompañan a la presente invención, los niveles de expresión del ratio aquí descrito, durante los seis primeros meses de seguimiento tras el debut de la enfermedad, llega a ser estadística y significativamente más alto incluso que el nivel de expresión de dicho ratio en sujetos control que no padecen la enfermedad. Así, el problema técnico resuelto por la presente invención se refiere a un método in vitro para el pronóstico o predicción de ¡a respuesta al tratamiento con al menos un agente antipsicótico, por parte de pacientes que han sufrido un FEP, a partir de una muestra biológica obtenida de dichos pacientes en el momento del debut de la enfermedad, que es sencillo (se basa en el análisis de dos proteínas concretas y/o de los genes que las codifican), poco invasivo para el paciente y que además presenta una sensibilidad (79.1 %) y especificidad (61.1 %) muy altas, permitiendo por tanto su uso en la práctica clínica diaria.
En este sentido, la predicción de la respuesta al tratamiento por parte de pacientes que han sufrido un FEP es útil en varios sentidos principales: (1). Predicción de pacientes no-respondedores al tratamiento con ai menos un agente antipsicótico (mal pronóstico): de esta forma se podría dirigir al paciente hacia tratamientos alternativos sin necesidad de aplicarle, como primer tratamiento, la terapia antipsícótíca. (2). Predicción de pacientes respondedores al tratamiento con ai menos un agente antipsicótico (buen pronóstico): esta herramienta es muy útil para empezar el tratamiento de forma muy temprana ya que en el caso particular de los pacientes que han sufrido un FEP se ha demostrado que el tratamiento en fases precoces de la enfermedad pueden ser muy efectivo para evitar el avance de la misma hacia patologías crónicas tales como esquizofrenia o psicosis, además de permitir al paciente llevar una vida normal, definida como un buen funcionamiento general del paciente en su vida diaria.
Así, el primer aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro, a partir de aquí lo denominaremos, primer método de la invención, para el pronóstico o predicción de la respuesta a tratamiento con al menos un agente antipsicótico por parte de pacientes que han sufrido un primer episodio psicótico, donde el pronóstico se realiza atendiendo al valor de expresión del ratio TrkB-FL/TrkB-T, en una muestra aislada de dichos pacientes en el momento del debut de la enfermedad, donde un valor de expresión del ratio ≥ 0.70 es indicativo de un paciente respondedor al tratamiento y un valor de expresión del ratio < 0.70 es indicativo de un paciente no- respondedor al tratamiento. Alternativamente, la presente invención también se refiere, por tanto al uso in vitro del valor de la expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T como biomarcador pronóstico o de predicción de la respuesta a tratamiento con al menos un agente antipsicótico, por parte de pacientes que han sufrido un primer episodio psicótico, donde cuando el valor de expresión resultante de dicho ratio es≥ 0.70, dicho valor es indicativo de que el paciente va a presentar un buen pronóstico de respuesta al tratamiento con al menos un fármaco antipsicótico, es decir va a ser un paciente respondedor al tratamiento antipsicótico. En cambio, cuando el valor resultante del ratio es < 0.70, dicho valor es indicativo de que el paciente va a presentar un mal pronóstico de respuesta al tratamiento con al menos un fármaco antipsicótico, es decir va a ser un paciente no-respondedor al tratamiento antipsicótico.
Los términos "Primer Brote Psicótico" o "Primer Episodio Psicótico" o "FEP" o "PEP" utilizados indistintamente a lo largo del presente documento, en muchas ocasiones en el estado de la técnica se utilizan erróneamente como sinónimo de esquizofrenia. Para delimitar dichos términos cabría señalar que la esquizofrenia se caracteriza por "la presencia de ideas delirantes, alucinaciones, lenguaje desorganizado, conducta catatónica y/o desorganizada y síntomas negativos tales como el aplanamiento afectivo, alogia o abulia y al menos, dos de estos síntomas pueden haber estado presentes durante 6 meses (salvo que el paciente se haya tratado previamente) y se asocian a una disfunción laboral y social (Ballesteros, J. Brotes psicóticos. Sección de Psiquiatría Fundación Santa Fe de Bogotá. 2013. pp. 1330-1332). El matiz que pone de manifiesto la diferencia con el brote psicótico se advierte en el hecho de que la esquizofrenia es una forma de psicosis de larga duración, mientras que el brote psicótico sería una manifestación abrupta de lo que se podría considerar la sintomatología positiva de la esquizofrenia durante un breve período de tiempo.
El término "TrKB" (conocido también, entre otros sinónimos como receptor tropomiosin quinasa B, o receptor tirosin quinasa B o receptor de los factores de crecimiento BDNF y NT3 o receptor neurotrófico tirosin quinasa tipo 2) se refiere a una proteína que en humanos es codificada por el gen NTRK2 localizado en el cromosoma 9 (87.28-87.64 Mb). TrKB actúa como receptor catalítico de alta afinidad de los factores neurotróficos BDNF y NT-3 y -4. Su denominación suele abreviarse con los siguientes modos: NTRK2; GP145-TrkB; TRKB; trk-B. Dicho receptor presenta dos isoformas TrKB-FL y TrKB-T. La isoforma TrKB-FL es la forma activa completa del receptor TrKB. Dicha forma completa transduce la señal de BDNF a través de Ras-ERK, PI3K, and PLCy. La isoforma TrKB-T es la forma truncada del receptor TrKB que carece de actividad kinasa y se opone a la función de la forma TrKB-FL. Esta forma truncada posee los mismos dominios extracelular y transmembrana que la forma completa pero difiere en la secuencia terminal. El número de acceso del TrkB en la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot es Q16620, donde aparecen las secuencias proteicas para la isoforma activa y para la isoforma truncada. El número de acceso para la secuencia genómica de NTRK2 en la base de datos NCBI es NG_012201.2. Para detectar y/o cuantificar los biomarcadores proteicos descritos en la invención es suficiente con detectar uno o más fragmentos de dichas proteínas ya que dichos fragmentos son un constituyente de la secuencia aminoacídica y de la estructura de las proteínas. Es decir, el método de la presente invención contempla la posibilidad de asociar la detección de un fragmento que inequívocamente pertenezca a dicha proteína a la presencia de la proteína en cuestión. Para la detección, y/o cuantificación de dicho fragmento de la proteína o de la proteína completa se puede usar cualquier técnica conocida por el experto en la materia.
Cualquiera de las proteínas de la presente invención son el producto de la expresión de una secuencia nucleotídica. Esta secuencia nucleotídica puede ser, por ejemplo pero sin limitarse, cualquier ARN como por ejemplo, pero sin limitarse, ARN mensajero (ARNm), o cualquiera de sus fragmentos. La secuencia nucleotídica puede ser también ADN complementario (ADNc) o cualquier de sus fragmentos. El ADNc es un ADN complementario a un ARMm o es también la secuencia nucleotídica que comprende los exones de la secuencia nucleotídica genómica pero no los intrones, es decir, el ADNc es la secuencia codificante. La transcripción de la secuencia nucleotídica genómica del gen que codifica para la proteína y su ADNc codifican para el mismo ARNm y, por tanto, para la misma proteína. En la presente invención también es posible detectar cualquier ARN o cualquier ADN, o cualquiera de sus fragmentos, en lugar de la detección de la proteína, o simultáneamente. Así, en otra realización preferida del método in vitro descrito en la presente invención este se caracteriza por que las proteínas TrKB-FL y TrKB-T o cualquier fragmento de las mismas, es detectado y/o cuantificado por medio de electroforesis, immunoensayo, cromatografía y/o tecnología de microarray, evaluando además su presencia o ausencia.
La electroforesis es una técnica analítica de separación basada en el movimiento o la migración de macro-moléculas disueltas en un medio (buffer de electroforesis), mediante una matriz o un sólido apoyo como resultado de la acción de un campo eléctrico. El comportamiento de la molécula depende de su movilidad electroforética y esta movilidad depende de la carga, tamaño y forma. Existen numerosas variaciones de esta técnica basadas en el equipamiento usado, soportes y condiciones para llevar a cabo la separación de las proteínas. La electroforesis se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, electroforesis capilar, electroforesis en papel, electroforesis en gel de agarosa, electroforesis en gel de poliacrilamida, isoelectroenfoque o electroforesis bidimensional.
Un inmunoensayo es una prueba bioquímica que mide la concentración de una sustancia en un líquido biológico usando la reacción de un anticuerpo o anticuerpos con alguno de sus antígenos. El ensayo aprovecha la especificidad de un anticuerpo con su antígeno. La cantidad de anticuerpo o antígeno puede detectarse por medio de métodos conocidos en el estado de la técnica. Uno de los métodos más comunes es el que se basa en el mareaje del antígeno o de los anticuerpos. El mareaje puede llevarse a cabo, pero sin limitarse, una enzima, radioisótopos (radioinmunoensayo), etiquetas magnéticas (inmunoensayo magnético) o fluorescencia, y también otras técnicas incluidas aglutinación, nefelometría, turbidimetría o Western Blot. Los inmunoensayos heterogéneos pueden ser competitivos o no competitivos. El inmunoensayo puede ser competitivo: la respuesta será inversamente proporcional a la concentración de antígeno en la muestra, o puede ser no competitivo (conocido también como "sandwich assay"): los resultados son directamente proporcionales a la concentración del antígeno. Una técnica de inmunoensayo que puede ser utilizada en la presente invención es el ensayo ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Por medio de las técnicas cromatográficas, las moléculas pueden ser separadas, pero sin limitarse, por su carga, tamaño, masa molecular, mediante su polaridad o mediante su potencial redox. La técnica de cromatografía se selecciona, pero sin limitarse, cromatografía de líquidos (cromatografía de partición, cromatografía de adsorción, cromatografía de exclusión o cromatografía de intercambio iónico), cromatografía de gases o cromatografía de fluidos supercríticos.
La tecnología de microarray de la presente invención está basada, por ejemplo, sobre la fijación en un soporte sólido de una molécula que reconoce la proteína de la presente invención. El microarray basado en anticuerpos es el microarray de proteínas más común. En este caso, los anticuerpos se fijan en el soporte sólido (también se puede emplear el término chip para referirse a microarray). Estos anticuerpos son utilizados para capturar moléculas que permiten la detección de proteínas procedentes, pero sin limitarse, de muestras biológicas, de lisados celulares, de sangre, plasma, suero, PBMCs o de orina. El término "soporte sólido" tal como se emplea en la presente invención se refiere a una gran variedad de materiales, por ejemplo, pero sin limitarse, intercambio de iones o resina adsorción, vidrio, plástico, látex, nylon, gel, ésteres de celulosa, esferas paramagnéticas o la combinación de algunos de ellos.
El término "anticuerpo", tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con una proteína. Hay cinco isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. A efectos de la presente invención se puede utilizar cualquier anticuerpo capaz de detectar la expresión de las proteínas TrKB-FL y/ o TrKB-T. Anticuerpos conocidos en el estado de la técnica capaces de detectar las proteínas TrKB-FL y/ o TrKB-T se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: anticuerpos Anti-TrkB de referencias ab18987 y ab33665, anticuerpo Anti-TrkB [EPR1294] de referencia ab134155, de Abcam Inc (Cambridge, MA); anticuerpo TrkB #4606 de Cell Signalling (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA, USA); anticuerpo TrkB(C-13) sc-1 19, anticuerpo TrkB (F-1) sc-377218 y anticuerpo TrkB (794) sc-12 de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, California, USA); anticuerpo anti-TrkB (Ab-705) de Sigma (España). En una realización preferida del primer método de la invención, es posible también, además de la detección de un fragmento de las proteínas usadas como biomarcadores, la detección y cuantificación de una variante funcionalmente equivalente de los mismos.
En el sentido utilizado en esta descripción, el término "variante" se refiere a proteínas sustancialmente homologas a las proteínas TrKB-FL y TrKB-T. En general, una variante incluye adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, siempre con la condición de que dichas variantes son funcionalmente equivalentes a la proteína original. El término "variante" incluye también a las proteínas resultantes de modificaciones postranslacionales como, por ejemplo, pero sin limitarse, glicosilación, fosforilación o metilación.
La expresión "funcionalmente equivalente", tal como aquí se utiliza, significa que la proteína o el fragmento de la proteína en cuestión mantiene esencialmente las propiedades inmunológicas descritas en este documento. Dichas propiedades inmunológicas se pueden determinar mediante métodos convencionales tales como los descritos en los ejemplos que acompañan a esta descripción. El término "fragmento", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una porción de las proteínas TrKB-FL y TrKB-T o de una sus variantes.
A efectos de la presente invención, el término "pronóstico" o "predicción", se entiende como la evolución esperada de una enfermedad y se refiere a la valoración de la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad así como a la valoración de su inicio, estado de desarrollo, evolución, o de su regresión, y/o el pronóstico del curso de la enfermedad en el futuro. Como entenderán los expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC), etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos del 50%>, al menos del 60%>, al menos del 70%>, al menos del 80%>, al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Los valores de p son, preferiblemente, 0, 1 , 0,05, 0,01 , 0,005 o 0,0001. etc.
Por 'predicción de la respuesta' se entiende, en el contexto de la presente invención, la determinación de la probabilidad de que el paciente responda de forma favorable o desfavorable a una terapia o a un tratamiento determinado. Especialmente, el término 'predicción', como se usa aquí, se refiere a una evaluación individual de cualquier parámetro que pueda ser útil en determinar la evolución de un paciente. Como entenderán los expertos en la materia, la predicción de la respuesta clínica al tratamiento, aunque se prefiere que sea, no necesita ser correcta para el 100% de los sujetos a ser diagnosticados o evaluados. El término, sin embargo, requiere que se pueda identificar una parte estadísticamente significativa de los sujetos como que tienen una probabilidad aumentada de tener una respuesta positiva. El experto en la materia puede determinar fácilmente si un sujeto es estadísticamente significativo usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de los valores de p, prueba t de Student, prueba de Mann Whitney, o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC (AUC), etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos del 50%>, al menos del 60%>, al menos del 70%>, al menos del 80%>, al menos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%.. Los valores de p son, preferiblemente, 0, 1 , 0,05, 0,01 , 0,005 o 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite predecir la respuesta al tratamiento de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 80%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada. La predicción de la respuesta clínica se puede hacer utilizando cualquier criterio de valoración usado en psiquiatría y conocido por el experto en la materia. A efectos de la presente invención el término "buen pronóstico" o "pacientes respondedores" se refiere a aquéllos pacientes que tras sufrir un FEP y comenzar un tratamiento con al menos un fármaco antipsicótico, se recuperan de la enfermedad, teniendo una vida funcional satisfactoria. Por otro lado, el término "mal pronóstico" o "pacientes no-respondedores" se refiere a aquéllos pacientes que tras sufrir un FEP el comenzar un tratamiento antipsicótico no va a hacer que se recuperen de la enfermedad y su funcionamiento en la vida diaria va a verse deteriorado.
A efectos de la presente invención, el término "especificidad" se refiere a la capacidad de un método o prueba diagnóstica y/o pronostica de clasificar correctamente a un individuo sano (p.e. diagnóstico negativo de carcinoma, cuando el paciente no está afectado de carcinoma), es decir, la probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo; una especificidad del 100% significa que no hay falsos positivos. La especificidad que muestra el método descrito en la presente invención es del 79.1 %. Así, una especificidad del 79.1 % significa que el valor del ratio TrkB- FL/TrkB-T obtenido pronostica correctamente al 79.1 % de los sujetos con mala funcionalidad.
A efectos de la presente invención, el término "sensibilidad" se refiere a la capacidad de un método o prueba diagnóstica y/o pronostica de clasificar correctamente a un individuo enfermo (p.e. diagnóstico positivo de carcinoma, cuando el paciente está afectado de carcinoma), es decir, la probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga un resultado positivo; una sensibilidad del 100% significa que no hay falsos negativos. La sensibilidad que muestra el método descrito en la presente invención es del 61.1 %. Así, una sensibilidad del 61.1 % significa que el método pronostica correctamente al 61.1 % de los sujetos con buena funcionalidad.
A efectos de la presente invención, el término "valor predictivo positivo" o "VPP" se refiere a la probabilidad de que un paciente esté enfermo si el método de pronóstico o predicción resulta positivo (p.e. estar afectado de carcinoma cuando el diagnóstico/pronóstico de la prueba es positivo), es decir, la proporción de pacientes con un resultado positivo en el método de diagnóstico y/o pronóstico que finalmente resultaron estar enfermos. En el caso particular del método de la invención, el VPP es del 85.3% lo que significa que el 85.3% de los sujetos que mediante el método de la invención se pronostican como pacientes respondedores, serán pacientes respondedores y presentarán una buena funcionalidad.
A efectos de la presente invención, el término "valor predictivo negativo" o "VPN" se refiere a la probabilidad de que un paciente esté sano si el método de pronóstico o predicción resulta negativo (p.e. no estar afectado de carcinoma cuando el diagnóstico/pronóstico de la prueba es negativo), es decir, la proporción de pacientes con un resultado negativo en el método de diagnóstico y/o pronóstico que finalmente resultaron estar sanos. En el caso particular del método de la invención, el VPN es del 57.9% lo que significa que el 57.9% de los sujetos que mediante el método de la invención se pronostican como no respondedores y que presentarían mala funcionalidad si fuesen tratados con fármacos antipsicóticos, serán finalmente pacientes no respondedores que tendrán mal funcionamiento. A efectos de la presente invención el término "agente antipsicótico" o "compuesto antipsicótico" o "fármaco antipsicótico" se refiere a aquellas sustancias capaces de tratar los síntomas psicóticos del paciente tales como delirios y/o alucinaciones. El término antipsicótico hace referencia a una amplia familia de fármacos clasificados tradicionalmente en dos grupos, en función de su perfil de seguridad y su eficacia sobre los síntomas depresivos de la esquizofrenia. Así los grupos principales de antipsicóticos son los antipsicóticos típicos (AT) y los antipsicóticos atípicos (AA). Los AT son los fármacos antipsicóticos más antiguos, con acción fundamentalmente antidopaminérgica y caracterizados por su eficacia en el control de síntomas psicóticos positivos (delirios, alucinaciones), pero que son poco eficaces sobre los síntomas negativos (depresión, aislamiento social). Su uso se asocia frecuentemente con síntomas extrapiramidales (SEP) e hiperprolactinemia. A efectos de la presente invención, los fármacos AT que pueden utilizarse en el tratamiento de un FEP se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: clorpromazina, flufenazina, levomepromazina, perfenazina, trifluoperazina, haloperidol, zuclopentixol, pimozida, supirida, tiaprida, o combinaciones de los mismos. Los fármacos antipsicóticos atípicos se caracterizan por bloquear simultáneamente los receptores dopaminérgicos y serotoninérgicos y ser eficaces tanto en los síntomas positivos como en los negativos. Globalmente, los AA se asocian con menos síntomas extrapiramidales (efecto secundario) que los AT; sin embargo, no están exentos de problemas ya que el uso de AA se ha asociado con una mayor incidencia de reacciones adversas metabólicas (hiperglucemia, aumento de peso, ... ) que en ocasiones limitan su uso. A efectos de la presente invención, los fármacos AA que pueden utilizarse en el tratamiento de un FEP se seleccionan de entre cualquiera de los siguientes: clozapina, risperidona, olanzapina, quetiapina, ziprasidona, aripiprazol, paliperidona, asenapina, sertindol, amisulprida, o combinaciones de los mismos. Por otro lado, también es posible combinar en un mismo tratamiento antipsicótico cualquiera de los fármacos AT o combinaciones de los mismos con cualquiera de los fármacos AA o combinaciones de los mismos. A efectos de la presente invención, el término "muestra biológica aislada" incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada es un fluido biológico. Más preferiblemente, el fluido biológico es sangre o plasma o suero sanguíneo. Más preferiblemente aún, el fluido biológico es sangre y preferentemente, células mononucleares de sangre periférica (PB Cs). Las "células mononucleares de sangre periférica" o "PBMC" incluyen linfocitos, monocitos y macrófagos. Los métodos para asilar estas PBMC de una muestra de sangre se conocen bien en la técnica. El término "individuo" o "sujeto", tal y como se utilizan en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. Dichos términos no pretenden ser limitativos en ningún aspecto, pudiendo ser éstos de cualquier edad, sexo y condición física. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit o dispositivo, de aquí en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para detectar y/o cuantificar los niveles de expresión de las isoformas TrKB-FL y TrKB- T, o de una variante de las mismas o de un fragmento de las mismas, en una muestra biológica aislada de un sujeto. En una realización preferida los elementos necesarios para la detección y/o cuantificación de las isoformas TrKB-FL y TrKB-T, o de una variante de las mismas o de un fragmento de las mismas se seleccionan preferentemente de entre: oligonucleótidos, sondas y/o anticuerpos.
En una realización más preferida del kit de la invención, este comprende anticuerpos capaces de detectar la expresión de las isoformas TrKB-FL y TrKB-T o de un fragmento de las mismas o de cualquiera de sus variantes.
Dicho kit puede contener todos aquellos reactivos necesarios para analizar la cantidad de proteína TrKB-FL y TrKB-T por medio de cualquiera de los métodos descritos anteriormente en este documento como, por ejemplo, pero sin limitarse, anticuerpos específicos de dichas proteínas, anticuerpos secundarios o controles positivos y/o negativos. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. En el caso de la detección por RTqPCR puede contener, pero sin limitarse, cebadores, sondas y todos aquellos reactivos necesarios para determinar la expresión de las proteínas TrKB-FL y TrKB-T. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, el uso de tampones, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1. Análisis de la expresión de las isoformas de los receptores TrKB-FL (A) y TrkB- T (B) en las células PBMCs aisladas de pacientes en el momento del debut de la enfermedad y 6 meses después, y en sujetos control sanos. (C) Gráfica donde se muestra el valor del ratio TrKB-FL/TrKB-T en sujetos control sanos y en sujetos que han sufrido un FEP, en el momento del debut de su enfermedad y tras 6 meses de seguimiento de los mismos. Los datos densitométricos de las respectivas bandas de interés han sido normalizados utilizando la expresión obtenida para la β-actina. Los datos representan la media ± desviación estándar. Prueba t para muestras pareadas. *p<0.05 vs. Control; #p<0.05, ##p<0.01 vs debut del FEP.
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante la exposición de los resultados obtenidos por los inventores. Estos ponen de manifiesto la especificidad, sensibilidad y eficacia del biomarcador de predicción de respuesta a un tratamiento antipsicótico en pacientes que han sufrido un FEP, descrito en la presente invención.
Pacientes
En el estudio se han incluido muestras de sangre de 94 pacientes obtenidas durante su primer año tras debutar con un primer episodio psicótico y como controles sanos se han incluido 80 muestras de sangre de sujetos control, sanos pareados por sexo, raza y edad.
Los criterios de inclusión en el estudio para los sujetos que habían sufrido un FEP fueron:
a) Síntomas psicóticos positivos de menos de 12 meses de duración,
b) Edad de 9 a 35 años en el momento de debutar con la enfermedad,
c) Hablar español correctamente,
d) Firmar el consentimiento informado del estudio. Y los criterios de exclusión:
a) Retraso mental según criterios DSM-IV,
b) Historia de traumatismo craneoencefálico con pérdida de conciencia, c) Enfermedad sistémica con repercusión mental. Para evaluar la sintomatología psicótica utilizamos la escala PANSS (Escala de síndrome positivo y negativo, en sus siglas en inglés, Positive And Negative Symptoms Scale) (Kay SR, et al. Schizophr Bull. 1987; 13(2):261-76)
Por otro lado, los criterios de inclusión en el estudio para los sujetos control fueron: a) Ausencia actual o previa de patología psiquiátrica según criterios DSM-IV, b) Hablar español correctamente,
c) Firmar el consentimiento informado del estudio.
Y los criterios de exclusión fueron los mismos que los anteriormente mencionados para los pacientes y además:
d) Historia de cuadros psicóticos en familiares de primer grado.
Ni los pacientes ni los sujetos sanos tenían cuadros febriles o alérgicos, infecciones u otra condición médica importante, y no habían recibido medicación inmunosupresora o vacunas en los 6 meses previos o medicación antiinflamatoria en los dos días previos a la extracción de las muestras de sangre. En la Tabla 1 se muestran las características clínicas de los pacientes y de los sujetos control sanos.
El estudio fue aprobado por el Comité de Ética en la Investigación Clínica de los centros participantes. Todos los sujetos incluidos en el estudio firmaron un informe de consentimiento para participar en el mismo. En el caso de los sujetos menores de 18 años, se obtuvo el consentimiento de sus padres o representantes legales y los propios pacientes consintieron en participar. Muestras
Las muestras de sangre venosa obtenidas de los sujetos que participan en el estudio se extrajeron estando los sujetos en ayunas, en el momento del debut de la enfermedad y a los 6 meses tras sufrir el FEP. Dichas muestras de sangre fueron centrifugadas (641 g x 10 min a una temperatura de 4o C) y el plasma obtenido se almacenó a -80°C para su estudio posterior. El resto de la muestra se utilizó para aislar las células mononucleares de sangre periférica, conocidas como PBMCs, que una vez obtenidas se almacenaron a -80°C para su estudio posterior. Medida de la expresión de los receptores TrKB-FL y TrKB-T en PBMCs
La expresión de los marcadores descritos en la presente invención, TrKB-FL y TrKB-T se cuantificó utilizando la técnica de Western-Blot (WB), a partir de los extractos citosólicos obtenidos de las PBMCs mediante un procedimiento modificado basado en el método de Scheiber y cois. Brevemente, se homogeneizaron las PBMCs en 150 de tampón (10 mmol/L N-2-hidroiyetilpiperazine-N'-2-ácido etanesulfonico [pH 7.9]; 1 mmol/L EDTA, 1 fenilmetilsulfonil fluoride, 0.1 mg/mL aprotinina, 1 mg/mL leupeptina, 1 mg/mL Na-ptosil-L-lisina-clorometil cetona, 5 mmol/L NaF, 1 mmol/L NaV04, 0.5 mol/L sacarosa, and 10 mmol/L Na2Mo04) a pH 7.4. Tras 15 min, se añadió Nonidet P-40 (Roche, Mannheim, Germany) hasta alcanzar una concentración del 1 %. Los tubos fueron agitados en vortex durante 30 segundos y los núcleos se recogieron mediante centrifugación a 8000g x 5 min. Se consideró que el sobrenadante constituía la fracción citosólica. Los pellets fueron resuspendidos en 50 del tampón, suplementado con 20% de glicerol, 15 mmol/L MgCL2 y 0.4 mol/L NaCI y agitados ligeramente durante 30 min a 4°C. Los extractos de proteínas nucleares se obtuvieron por centrifugación a 13,000 g x 5 min, y las alícuotas del sobrenadante se almacenaron a -80°C. Todas las etapas del fraccionamiento se llevaron a cabo a 4°C. Como método de control para analizar la pureza de los extractos citosolicos y nucleares, se realizó un Western Blot utilizando gliceraldehide-3-fosfate deshidrogenasa (GAPDH), Proteína Específica 1 (SP1) o β-actina (en citosol: 99±1 ; 19±5; y 98±1 % de señal total densidad óptica [OD], respectivamente; y en núcleos: 0; 81 ±7; y 99±1 % de señal total densidad óptica, respectivamente.
Tras determinar y ajustar la concentración de proteína a 2μ9/μΙ, utilizando el método de Bradford, los extractos citosolicos fueron mezclados con igual volumen del tampón Laemmli (Bio-Rad, USA) (SDS 10%, H20 destilada, 50% glicerol, 1 M Tris HCI, pH 6.8, ditiotreitol y azul de bromofenol), con β-mercaptoethanol (50μΙΛηΙ Laemmli). Se cargaron 12^g de dicha mezcla en un gel de electroforesis. Las muestras proteicas se separaron y transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Amersham, Ibérica, España). Tras la neutralización, las membranas se incubaron con anticuerpos específicos para detectar la presencia de los marcadores de la invención:
• Anticuerpos policlonales TrKB de conejo a una dilución de 1 : 1000 en TBS- Tween (sc-12; Santa Cruz Biotechnology, USA), para TrKB-FL,
• Anticuerpos policlonales TrKB de conejo a una dilución de 1 : 1000 en TBS- Tween (sc-1 19; Santa Cruz Biotechnology, USA) para TrKB-T,
• Anticuerpos monoclonales β-actina de ratón a una dilución de 1 :15000 (Clone AC 15; Sigma, España), que se utilizó como control de carga.
Posteriormente, tras el lavado de los anticuerpos primarios, las membranas se incubaron con sus respectivos anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (dilución 1 :2000 en TBS-Tween). La inmunorreactividad de las bandas fue detectada y visualizada mediante el sistema Oddyssey Fe (Licor, Alemania) y se cuantificaron por densitometría (NIH ImageJ® software). Todos los resultados densitométricos fueron expresados como porcentaje de expresión de cada uno de los marcadores analizados respecto al grupo control.
Evaluación del funcionamiento general de los pacientes (GAF)
Con el fin de evaluar el funcionamiento general de los pacientes que habían sufrido un FEP utilizamos la escala GAF (en sus siglas en inglés Global Assessment Functioning), que proporciona una puntuación entre 0 y 100 y tiene en consideración diferentes aspectos de la vida diaria del paciente, tales como relaciones sociales, situación laboral, etc. Esta escala fue publicada en base a una revisión de la escala "Global Assessment Scale" (GAS) de Endicott (Endicott J, et al. Arch Gen Psychiatry. 1976;33(6):766-71). La escala GAF fue publicada en 1987 y se convirtió en la base de los diagnósticos del eje V en el DSM-lll-R (American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-lll-R), text revisión. 3rd edition. Washington, DC: American Psychiatric Association; 1987), DSM-IV (American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders DSM-IV. Washington, DC: American Psychiatric Association; 1994) y DSM-IV-TR (American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM- IV-TR), text revisión. 4rd edition. Washington, DC: American Psychiatric Association; 2000). Una puntuación alta en la escala denota mejor funcionalidad. A efectos de la presente invención, se considera una buena funcionalidad cuando la puntuación en la escala GAF es ≥60 puntos, mientras que el paciente tendrá un funcionamiento deteriorado cuando la puntuación en dicha escala sea <60 puntos.
Análisis estadístico Para evaluar la posible asociación entre el estado inflamatorio en el momento basal, es decir, tras sufrir los pacientes el FEP, y el valor de expresión del ratio TrKB- FL/TrKB-T, tanto en el debut de la enfermedad como 6 meses después dicho debut (seguimiento), se construyeron modelos de regresión lineal múltiple. Este mismo tipo de análisis fue utilizado para la evaluación de la influencia del estado inflamatorio y del valor de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T en el debut de la enfermedad sobre el funcionamiento global del paciente (GAF) y la situación clínica del mismo (PANSS) al final del periodo de seguimiento, transcurridos 6 meses tras el debut de la enfermedad. A fin de ajusfar dicho modelo, se utilizó un modelo "paso a paso hacia atrás" incluyendo todas las posibles variables de confusión (sexo, edad, estado civil, estudios, nivel socioeconómico, raza, tabaco, alcohol, cannabis, IMC, antipsicóticos). Sólo aquellas variables que resultaron significativas o aquellas que produjeron un cambio significativo en el coeficiente de la variable independiente, fueron incluidas en el modelo de regresión (IMC, tabaco y antipsicóticos). Finalmente, se evaluaron los términos de interacción.
Una vez obtenido el modelo final, se analizaron tanto el ajuste de los residuos como su normalidad. Se obtuvo el coeficiente β, el intervalo de confianza al 95% y el valor p para los test t (evaluando la significación estadística del coeficiente de regresión). En aquellos casos en que el término de interacción resultó significativo, se calculó para cada grupo el tamaño del efecto y su intervalo de confianza al 95%. Además, el tamaño del efecto del grupo principal de la variable dependiente fue estimado para diferentes valores de la variable independiente (percentiles 3, 25, 50, 75 y 97). Finalmente para evaluar el valor predictivo del modelo desarrollado, estimamos su sensibilidad, especificidad, y valores predictivos positivo y negativo. Los análisis estadísticos fueron desarrollados con el paquete estadístico Stata versión 12.1 (StataCorp LP, Texas, USA) y el nivel de significación se fijó en p<0.05. RESULTADOS
Tabla 1. Características básales de la muestra de sujetos incluidos en el estudio.
Pacientes Controles Muestra
(n=94) (n= 80) total (n=174) Estadístico N (%) N (%) N (%)
Mujer 29 (30.9%) 27 (33.8%) 56 (32.2%) X2=0.17,
Sexo df=1 ,
Hombre 65 (69.1 %) 53 (66.3%) 1 18 (67.8%)
p=0.683 t—1.96,
Edad (años) 23.78±5.81 25.69±7.07 24.66±6.47 df=172 p= 0.052 Pacientes Controles Muestra
(n=94) (n= 80) total (n=174) Estadístico N (%) N (%) N (%)
Bajo 28 (29.8%) 19 (23.8%) 47 (27.0%) X2= 1.66,
Nivel
Medio 38 (40.4%) 40 (50%) 78 (44.8%) df= 2, socioeconómico
Alto 28 (29.8%) 21 (26.3%) 49 (28.2%) p= 0.436
t= 3.38,
Indice de masa
25.02±3.97 23.08±3.07 24.12±3.70 df= 155, corporal (IMC)
p= 0.001
X2= 1.27,
Consumo de
23 (24.5%) 13 (17.3%) 36 (20.6%) df= 1 , cannabis
p= 0.260
Edad de inicio
24.45±5.80
(años)
Duración de
psicosis sin 91.26±97.05
tratar (días)
Psicosis
18 (19.1 %)
afectiva*
Psicosis
Diagnóstico
no
76 (80.9%)
afectiva*
*
PANSS positiva 10.21 ±4.99
PANSS
14.11 ±5.73
negativa
PANSS 50.44±16.89
MADRS 6.31 ±6.37
GAF 68.90±13.14
PANSS: Escala de síntomas positivos y negativos. *Psicosis afectiva: desorden bipolar, depression psicótica o desorden esquizoafectivo. ** Psicosis no afectiva: esquizofrenia, desorden esquizofreniforme y desorden psicótico no especificado previamente. Los datos en negrita indican que el dato ha alcanzado significación estadística (valor p < 0.05).
Los pacientes objeto del presente estudio, una vez diagnosticados se les administró el tratamiento antipsicótico. Los fármacos utilizados en dicho tratamiento se seleccionaron de entre cualquiera de los siguientes: risperidona, clozapina, paliperidona, aripiprazol, ziprasidona, olanzapina o quetiapina.
Tras analizar los niveles de expresión de los receptores TrKB-FL y TrKB-T en las PBMCs de los pacientes y de los sujetos control, y tal como se observa en la Figura 1 , la expresión de dichos receptores en las células PBMCs se modifica a lo largo del tiempo en pacientes que habían sufrido un FEP, de manera que los niveles de expresión de la isoforma TrKB-FL aumentan significativamente durante el periodo de seguimiento de los pacientes (6 meses) tras el debut de la enfermedad (Fig. 1A), mientras que los niveles de la expresión de la isoforma TrKB-T disminuyen significativamente en este mismo periodo (Fig. 1 B) y en comparación con los niveles que muestran el grupo de sujetos control sanos de dicha isoforma (Fig. 1 B). De modo similar, el valor de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T aumenta significativamente a lo largo del seguimiento en comparación con la expresión de dicho ratio en los sujetos control sanos y respecto a la expresión del mismo en los pacientes en el momento del debut de la enfermedad (Fig. 1 C).
El modelo de regresión para la asociación entre el índice TrKB-FL/TrKB-T en el momento basal (debut de la enfermedad) y la funcionalidad del paciente a los 6 meses del debut (GAF) fue ajustado teniendo en cuenta las variables: índice de masa corporal (IMC), consumo de tabaco y consumo de antipsicóticos. Dicho modelo pone de manifiesto la existencia de una interacción positiva y significativa entre el valor de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T y el tratamiento antipsicótico (β=41.46, p=0.004, IC 95%: 14.327, 68.590), lo que indica que el efecto del valor de expresión del ratio TrKB- FL/TrKB-T en el momento del debut de la enfermedad sobre la funcionalidad de dichos pacientes a los 6 meses de su debut es diferente dependiendo de si el paciente toma o no medicamentos antipsicóticos.
La Tabla 2 muestra los tamaños del efecto de tomar antipsicóticos para diferentes niveles del valor de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T sobre la funcionalidad (GAF) a los 6 meses del debut de la enfermedad. Para aquellos pacientes con niveles bajos de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T en el momento del debut de la enfermedad (TrKB- FL/TrKB-T^.18), destaca que los pacientes que tomaban antipsicóticos tenían peor funcionalidad que los pacientes que no los tomaban (tamaño del efecto: -30.26; IC 95%: -52.903, -30.259). Por el contrario, el efecto de tomar antipsicóticos es opuesto cuando los pacientes presentan en el momento del debut de la enfermedad unos niveles altos de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T (TrKB-FL/TrKB-T=1.96). En este caso, los pacientes que toman antipsicóticos fueron los que mejor funcionalidad presentan al cabo de 6 meses del debut (tamaño del efecto: 43.54; IC 95%: 12.189, 74.887) (Tabla 2). Tabla 2. Tamaños del efecto de tomar antipsicóticos sobre la funcionalidad a los 6 meses del debut de la enfermedad (y sus IC 95%) para los valores seleccionados del ratio TrKB-FL/TrKB-T*
Figure imgf000025_0001
*Ajustado por factores de confusión
1 EI tamaño del efecto se interpreta como la diferencia entre las medias de la GAF entre los pacientes que tomaban antipsicóticos.
Por lo tanto, teniendo en cuenta los resultados mostrados en la presente invención, los niveles de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T en el momento del debut de la enfermedad se relacionan con la funcionalidad del paciente de un modo diferente dependiendo de si el paciente consume o no antipsicóticos. Además, tanto los niveles de expresión del ratio TrKB-FUTrKB-T, como el consumo de antipsicóticos, no muestran efecto sobre la funcionalidad de dichos pacientes (GAF) de un modo independiente, ya que ninguno muestra significación estadística al incluir en la ecuación de regresión el término de la interacción.
Considerando la muestra de pacientes que consume medicación antipsicótica (n=75) y utilizando el modelo de regresión descrito, se analizó el potencial del valor de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T como biomarcador para el pronóstico de respuesta al tratamiento con agentes antipsicóticos en pacientes que han sufrido un FEP. Para ello se estudió la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN), considerado como punto de corte el valor de≥ 0.70 para el nivel del índice TrKB-FL/TrKB-T y un valor≥ 60 como punto de corte para la escala GAF. Se consideró 0.70 como punto de corte para el índice ya que es el punto para el cual se maximizan los valores de sensibilidad y especificidad. El punto de corte para la escala GAF se consideró tras revisar la bibliografía al respecto. Así el modelo propuesto muestra una sensibilidad del 79.1 %, una especificidad de un 61.1 %, un VPP de 85.3% y un VPN de 57.9%. El método ofrece una proporción de falsos positivos del 38.9% y una proporción de falsos negativos de 20.9%. Según estos resultados, el dato de sensibilidad, de acuerdo con el modelo de regresión utilizado, se refiere a que el 79.1 % de los pacientes con buena funcionalidad después de 6 meses tomando antipsicóticos tras haber sufrido el FEP, presentaba un alto valor de la expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T en el momento del debut de la enfermedad. Es decir, dichos pacientes presentaban un valor de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T≥0.70, en el momento del debut de la enfermedad. El dato de especificidad se refiere a que el 61.1 % de los pacientes que presentaban en el momento del debut de la enfermedad un valor bajo de la expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T (<0.70) cuando comenzó la enfermedad y tras 6 meses de tomar medicación antipsicótica, presentaban mala funcionalidad (<60). Este análisis consolida el uso del valor de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T como marcador para la predicción de la respuesta a un tratamiento antipsicótico en pacientes que han sufrido un FEP, permitiendo discriminar fácilmente a aquellos pacientes respondedores frente a los no-respondedores, a la terapia antipsicótica.
Sensibilidad: de acuerdo con el modelo, el 79.1 % de los pacientes con buena funcionalidad después de 6 meses tomando antipsicóticos tras haber sufrido el FEP, presentaba un alto nivel del ratio TrKB-FL/TrKB-T (≥0.70) en el momento de comenzar la enfermedad.
Especificidad: La proporción de pacientes con bajos niveles del ratio TrKB-FL/TrKB-T (<0.70) cuando comenzó la enfermedad tenían mala funcionalidad (<60) tras 6 meses después de tomar medicación antipsicótica. VPP: un paciente con un valor del ratio TrKB-FL/TrKB-T≥ 0.70 en el momento de debutar la enfermedad y que comience con un tratamiento antipsicótico tiene una probabilidad de un 85.3% de tener una buena funcionalidad (GAF≥60) un 6 meses después. VPN: un paciente que tenga un nivel bajo del ratio TrKB-FL/TrKB-T (<0.70) en el momento del PEP, tiene una probabilidad de presentar mala funcionalidad general (<60) al cabo de 6 meses de tomar medicación antipsicótica.
Todos estos resultados ponen de manifiesto que el 90% de los pacientes que presentaban buena funcionalidad a los 6 meses (GAF≥60) se correspondían con valores de la expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T ≥0.70, concretamente valores comprendidos entre 0.70-1.50, en el momento del debut de la enfermedad. Por el contrario, el 90% de los pacientes que presentaban un funcionamiento general deteriorado (GAF<60) al cabo de 6 meses tras debutar con la enfermedad, tenían niveles de la expresión del ratio TrKB-FUTrKB-T <0.70, concretamente valores del ratio comprendidos entre 0.25-0.70, en el momento del debut de la enfermedad.
Así, el valor de la expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T sirve como marcador pronóstico de respuesta a tratamiento antipsicótico en sujetos que han sufrido un FEP, mostrando una alta sensibilidad (79.1 %) y especificidad (61.1 %). Por lo tanto, niveles de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T ≥0.70 en sujetos que sufren un FEP en el momento de su debut en la enfermedad, muestran una mejor respuesta al tratamiento antipsicótico que aquellos pacientes que en el momento de su debut en la enfermedad presentan un nivel de expresión del ratio TrKB-FL/TrKB-T <0.70.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método in vitro para el pronóstico o predicción de la respuesta a tratamiento con al menos un agente antipsicótico por parte de pacientes que han sufrido un primer episodio psicótico (FEP), donde el pronóstico se realiza atendiendo al valor de expresión del ratio TrkB-FUTrkB-T, en una muestra aislada de dichos pacientes, donde un valor de expresión del ratio ≥ 0.70 es indicativo de un paciente respondedor al tratamiento y un valor de expresión del ratio < 0.70 es indicativo de un paciente no-respondedor al tratamiento.
2. Método in vitro según la reivindicación 1 , dónde la muestra aislada de los pacientes se selecciona de entre cualquiera de las siguientes: sangre, plasma o suero.
3. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde la muestra aislada es una muestra de sangre, preferentemente una muestra de células mononucleares de sangre periférica.
4. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde el valor de expresión del ratio se obtiene mediante la detección y cuantificación de los niveles de expresión de TrKB-FL y TrKB-T mediante cualquiera de las siguientes técnicas: electroforesis, immunoensayo, cromatografía y/o tecnología de microarray.
5. Método in vitro según la reivindicación 4 donde las técnicas se seleccionan entre: electroforesis y/o inmunoensayo.
6. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el agente antipsicótico se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: antipsicóticos típicos, preferentemente, clorpromazina, flufenazina, levomepromazina, perfenazina, trifluoperazina, haloperidol, zuclopentixol, pimozida, supirida, tiaprida, o combinaciones de los mismos y/o antipsicóticos atípicos, preferentemente, clozapina, risperidona, olanzapina, quetiapina, ziprasidona, aripiprazol, paliperidona, asenapina, sertindol, amisulprida, o combinaciones de los mismos.
7. Uso in vitro del valor de expresión del ratio TrkB-FL/TrkB-T como marcador pronóstico o predictivo de la respuesta al tratamiento con al menos un agente antipsicótico por parte de pacientes que han sufrido un FEP, en una muestra biológica aislada de dichos pacientes, donde un valor de expresión del ratio TrkB- FL/TrkB-T≥ 0.70 es indicativo de un paciente respondedor al tratamiento y un valor de expresión del ratio TrkB-FUTrkB-T < 0.70 es indicativo de un paciente no- respondedor al tratamiento.
8. Uso in vitro según la reivindicación 7 donde la muestra aislada de los pacientes se selecciona de entre cualquiera de las siguientes: sangre, plasma o suero.
9. Uso in vitro según la reivindicación 8 donde la muestra aislada es una muestra de sangre, preferentemente una muestra de células mononucleares de sangre periférica.
10. Uso in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 donde el valor de expresión del ratio se obtiene mediante la detección y cuantificación de los niveles de expresión de TrKB-FL y TrKB-T mediante cualquiera de las siguientes técnicas: electroforesis, immunoensayo, cromatografía y/o tecnología de microarray.
1 1. Uso in vitro según la reivindicación 10 donde las técnicas se seleccionan entre: electroforesis y/o inmunoensayo.
12. Uso in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12 donde el agente antipsicótico se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: antipsicóticos típicos, preferentemente, clorpromazina, flufenazina, levomepromazina, perfenazina, trifluoperazina, haloperidol, zuclopentixol, pimozida, supirida, tiaprida, o combinaciones de los mismos y/o antipsicóticos atípicos, preferentemente, clozapina, risperidona, olanzapina, quetiapina, ziprasidona, aripiprazol, paliperidona, asenapina, sertindol, amisulprida, o combinaciones de los mismos.
13. Kit que comprende oligonucleótidos, sondas y/o anticuerpos para la detección y/o cuantificación de la expresión de TrkB-FL y TrkB-T.
14. Kit según la reivindicación 13 que comprende anticuerpos.
15. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14 para pronosticar o predecir la respuesta al tratamiento con al menos un agente antipsicótico en una muestra biológica aislada de un individuo que ha sufrido un FEP.
16. Uso del kit según la reivindicación 15 donde la muestra aislada se selecciona de entre cualquiera de las siguientes: sangre, plasma o suero.
17. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16 donde la muestra aislada es sangre, preferentemente células mononucleares de sangre periférica.
18. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 donde el agente antipsicótico se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: antipsicóticos típicos, preferentemente, clorpromazina, flufenazina, levomepromazina, perfenazina, trifluoperazina, haloperidol, zuclopentixol, pimozida, supirida, tiaprida, o combinaciones de los mismos y/o antipsicóticos atípicos, preferentemente, clozapina, risperidona, olanzapina, quetiapina, ziprasidona, aripiprazol, paliperidona, asenapina, sertindol, amisulprida, o combinaciones de los mismos.
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