WO2016203071A1 - Hidrogeles bioactivos y su aplicación en regeneración osea y cartilaginosa - Google Patents

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WO2016203071A1
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bmp
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hydrogels
bone
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PCT/ES2016/000069
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ana Civantos Fernandez
Viviana RAMOS LINO
Alejandro SÁNCHEZ BARREIRO
Rita LÓPEZ CEBRAL
José Luis LOPEZ LACOMBA
Begoña Seijo Rey
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Universidade de Santiago de Compostela
Universidad Complutense de Madrid
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Universidade de Santiago de Compostela
Universidad Complutense de Madrid
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/52—Hydrogels or hydrocolloids

Definitions

  • the present invention falls within the biomedical and pharmaceutical sector, more specifically, in the regeneration of tissues and, in particular, of cartilaginous and bone tissue (tendons, cartilage and ligaments).
  • a biomaterial is defined as a pharmacologically inert substance, of natural or synthetic origin, designed to be implanted or incorporated into the living system to treat, augment or replace any tissue, organ or body function.
  • these bioactive or second generation materials interact in the organism, allowing their replacement by host tissue, such as tricyclic phosphate ceramics ( ⁇ -TCP of the English Tricafcmm phospate Beta) or biovidrios and thus avoiding a second implant removal intervention (Heneh, LL, Polak, JM (2000). Science, 295: 1014-1017).
  • host tissue such as tricyclic phosphate ceramics ( ⁇ -TCP of the English Tricafcmm phospate Beta) or biovidrios and thus avoiding a second implant removal intervention (Heneh, LL, Polak, JM (2000). Science, 295: 1014-1017).
  • the most commonly used calcium phosphate in the manufacture of implants is hydroxyapatite, as it is the compound most similar to the mineral component of bones and has good properties as a biomaterial, such as biocompatibility, bioactivity. osteoconductivity and direct union to the bone. However, its mechanical properties are inferior to those of bioinert ceramics and it has
  • third generation materials have been developed, whose main objective is to specifically stimulate the cellular response at the molecular level through the use of active substances. They are materials that adapt to the physiological environment, allowing cell proliferation and the development of new tissue, and even produce the activation of genes that stimulate its regeneration, for example, ⁇ -TCP ceramics activated with rhBMP-2 (Abarrategi, A., Civantos, A., Ramos. V., Sanz Casado, JV, Lépez-Lacomba, JL (2008) Bhmacmmolecutes, 9: 711-718.).
  • the different biomaterials can be classified according to their composition (metallic, ceramic, polymeric or composite materials), their origin (natural or synthetic) and even biodegradable or non-biodegradable.
  • the metallic materials of titanium, cobalt, aluminum and their corresponding alloys are compatible with biological tissues providing Good mechanical properties (wear resistance for example) being used since its inception in the repair of hard support fabrics.
  • Polymeric materials are by far the most varied and versatile group within biomaterials, and can be classified according to their origin into: natural (alginates, dextrans, agarose, cellulose, starch, collagens, chitosans, etc.) or synthetics (polystyrene. poly-a-hydroacids, polyesters, polylactones, etc.) (Nair, LS fret, Laurencin, CT (2007) Progress in Po ⁇ ymer Science, 32: 762-798).
  • Hydrogels are three-dimensional polymer networks capable of embedding large amounts of water or aqueous fluids.
  • hydrogels There are several possible classifications for hydrogels, but the main one is based on the type of interactions that give rise to the pdimeric network that forms the skeleton of the hydrogei.
  • crosslinking or crosslinking the hydrogels are divided into chemical hydrogels and physical hydrogels. In the former, the junctions are made through covalent bonds, while in the latter, the bonding mechanisms correspond to physical interactions: ionic interactions, hydrogen bonds, van der Waals forces ... etc. .
  • Chemical hydrogels have been extensively studied in the past for biomedical applications, mainly due to the in vivo instability of physical hydrogels.
  • biomaterials which can be biodegradable or not, natural or synthetic, must always be biocompatible and non-toxic, in such a way that they allow and favor the development of de novo tissue. If they are biodegradable, the degradation rate must be controlled so that it also adjusts to the repair rate, replacement of the biomaterial by the tissue itself and its degradation products must be harmless.
  • Another desirable feature of biomaterials is that they are suitable for the release of bioactive agents; In addition, it must allow cells already stimulated with said bioactive agents to colonize them, acting at the same time as release systems and as supports for regeneration.
  • Bone regeneration systems known so far and those that already exist in the market are medical devices that incorporate bioactive agents whose main drawback is that there is a rapid onyx release (burst effect), a very short-term biological effect and that biodegradation of the support used (collagen) is also very fast, since it is an existing protein in the human body and for which there are specific enzymes. All this means that the dose to be placed on the support for an effective therapeutic action is excessive, which makes the product extremely expensive and can lead to unwanted effects.
  • This high cost also contributes to the fact that the support, the collagen, is excessively expensive by having to remove from the natural molecule, extracted from other species, those non-homologous sequences with the human sequence that can give rise to immunogenic reactions.
  • Bioactive hydrogels and their application in bone and cartilage regeneration relate to bioactive hydrogels made with ingredients of natural origin that are crosslinked by electrostatic type interactions and that incorporate bone morphogenic proteins (BMP); These bioactive hydrogels are used to produce medical devices for bone and cartilage regeneration with very good results due to the long life of the BMP support within the animal organism, which favors the formation of new bone, cartilage or tendon.
  • BMP bone morphogenic proteins
  • the extracellular bone matrix constitutes an important reserve of growth factors (GF), among which are bone morphogenetic proteins (BMP) of the English Bath Mwphogenetic Pmteins, which are involved in the formation of different tissues (bone tissue). , neural and cardiac) during embryogenesis and even act in life adult in fracture repair processes. These proteins act as agents (oral, they need to remain in the bone defect for a certain time to produce cell differentiation and consequent tissue regeneration. Therefore, they are proteins that require a carrier matrix that allows their prolonged release at the site of action and protect the degradation process factor.
  • BMP bone morphogenetic proteins
  • bioactive hydrogel comprising:
  • an anionic polymer preferably gelarto gum and / or gum arabic which can be incorporated into the bioactive hydrogel in concentrations of 3 to 1 mg / ml (final concentration in the hydrogel) is selected.
  • Caffeioriic crosslinking agents of choice may be spermidine and / or spermine, which are preferably used at a final concentration between 0.1 and 1.5 mg / ml.
  • chondroitin sulfate, hyaluronic acid and / or dermatan sulfate are incorporated as glycosaminoglycans at a final concentration of between 0.5 and 5 mg / ml.
  • the bioactive hydrogel one is a BMP and the other is preferably albumin that can be incorporated at a final concentration of between 2 and 10 mg / ml.
  • BMP2 is preferably selected in its homodimeric form (BMP2-BMP2), that is, formed by two equal subunits linked together, but it is known that in nature there may be BMP-2 with other proteins, that is in its heterodirnérica form like the one formed by two different monomers ( ⁇ MPMIV ⁇ P4, BMP22iMP5, BMP2-BMP6, BMP2-BMP7, BMP2-BMP9, BMP2-BMP12, etc.).
  • the BMP-2 chosen was used at a final concentration in the hydrogel of between 0.1 and 0.5 mg / ml.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for making the bioactive hydrogels of the invention. This method comprises the following steps:
  • step b) add a BMP solution to the aqueous solution of step a), c) mix with an aqueous solution of a catholic crosslinker,
  • step d) pour the mixture from step c) onto an aqueous solution of an anionic polymer with a glycosaminogiican, mixing the components at 55-65 ° C and applying stirring for 2-10 seconds, then allowing the hydrogel to form at room temperature .
  • the protein of step a) is preferably albumin that can be incorporated at a final concentration of between 5 and 10 mg / ml.
  • BMP2 is preferably selected in its homodimeric form (BMP2-BMP2), that is, formed by two equal subunits joined together.
  • the heating crosslinking agents of choice may be spermidine and / or spermine, which are preferably added at a final concentration between 0.1 and 1.5 mg / ml.
  • gellan gum and / or gum arabic which can be incorporated into the bioactive hydrogel in a final concentration of 3 to 1 mg / ml is preferably selected.
  • chondroitin sulfate, hyaluronic acid and / or dermatan sulfate are incorporated as glycosaminogiican at a final concentration of between 0.5 and 5 mg / ml.
  • the temperature of choice for mixing the components is 60 ° C and, preferably, stirring is applied for 5 seconds.
  • the BMP can be dissolved in dilute acetic acid by subsequently filtering it in sterility by means of 0.22 ⁇ filters.
  • the aqueous solutions are preferably made in HEPES buffer.
  • a preferred method of making the bioactive hydrogels of the invention comprises the following steps:
  • step d) pour the mixture from step c) onto an aqueous solution of gelane and chondroitin sulfate, mixing the components at 60 ° C and stirring for 5 seconds, then allowing the hydrogel to form at room temperature.
  • BMPs are very sensitive, so they can lose their biological activity when they undergo certain processes or environmental conditions. Most of the biomaterials activated with proteins during the manufacturing process become inactive and lose their biological function. In the case of invenwi hydrogels, these factors were included and the presence of active protein in them could be evaluated. To determine the presence of active protein incorporated in the hydrogels, the hydrogels were subjected to edorimitophic alkaline phosphatase activity (ALP, early marker of the differentiation ⁇ a). This activity can be detected finely in osteoblastic cells. The C2C12 multipotent cell line was used, a premtoblast cell line that in the presence of BMP2 is able to differentiate it towards different bone phenotypes.
  • ALP early marker of the differentiation ⁇ a
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition and / or a medical device comprising a bioactive hydrogel of the invention and a pharmaceutically acceptable excipient. Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition and / or a medical device for use in bone or cartilaginous regeneration.
  • the invention also relates to a method of treating bone and / or cartilaginous alterations through the use of the bioactive hydrogels of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a bioactive hydrogel of the invention in the preparation of a pharmaceutical composition or a medical device.
  • bioactive hydrogel of the invention in the preparation of polymeric implants for bone and cartilage regeneration.
  • the bioactive hydrogels of the present invention are physical hydrogels that have proven to be more stable, both in vitro and in vivo, than to conventional physical hydrogels.
  • the preparation of the bioactive hydrogels of the invention by means of the ionic geliücadoi ⁇ i technique, whose basis is the electrostatic interactions between compound of opposite charge, also takes place in a short time. In this way, it is not necessary to use chemical reagents or radiation sources, such as UV radiation.
  • FIG. 1 BMP-2 activity test in vitro. A) Determination of the amount of total proteins (PT), expressed in micrograms and determined by the Bradfbrd method at an absorbency of 59 nm; B) Alkaline phosphatase activity (ALP), by determining the absorbency at 4Q5nm, of the C2C12 cell culture seeded with hydrogel release media with protein (H-BMP2) and without protein (H-C).
  • Figure 2. Hematoxylin-eosin stain staining performed on samples obtained after 3 weeks of implantation of ios hydrogels without rhBMP-2 (10x). The good integration of the hydrogels in the host tissue is appreciated, with no signs of encapsulation.
  • Figure 3. Hematoxylin-eosin staining performed on samples obtained after 3 weeks of implantation of the hydrogels without rhBMP-2 (40x). The appearance of cells is observed colonizing the hydrogel.
  • FIG. 4 Hematoxylin-eosin staining performed on samples obtained after 3 weeks of implantation of the hydrogels without rhBMP-2 (40x). The appearance of blood vessels in the vicinity of the hydrogel is observed.
  • FIG. 1 Hematoxylin-eosin staining performed on samples obtained after 3 weeks of implantation of the hydrogels loaded with rhBMP-2 (10x). The good integration of hydrogels in the host tissue is observed, with no signs of encapsulation.
  • FIG. Hematoxylin-eosin staining performed on samples obtained after 3 weeks of implantation of the hydrogels.
  • A hydrogels without rhBMP-2 (40x)
  • B hydrogels loaded with rhBMP-2 (10x).
  • C and D extensions.
  • Figure 7. Hematoxylin-eosin staining performed on samples obtained after 3 weeks of implantation of the hydrogels loaded with BMP (10x).
  • Figure 8 Hematoxylin-eosin staining performed on samples obtained after 9 weeks of implantation of ios hydrogels loaded with BMP (20x).
  • FIG. 9 Hematoxylin-eosin staining performed on samples obtained after 9 weeks of implantation of the hydrogels loaded with BMP (100x). In the image you can see an osteone, osteocytes (black arrow) and osteoblasts (white arrow).
  • FIG. 10 This figure shows images of computerized microtomography ( ⁇ -CT) corresponding to experimental subjects sacrificed at 5 weeks; the images were taken in the second, third, fourth and fifth week post-surgery (indicated by numbers in the upper part of the figure).
  • ⁇ -CT computerized microtomography
  • Ll the active samples with BMP-2 protein, both collagen (M + BMP-2) and hydrogel (H + BMP-2), were inserted. Senna is observed! of great intensity in the soft tissue area that evolves during the 5 weeks of study in both samples. It should be noted the great difference between the samples with BMP-2 in the last week.
  • FIG. 11 H / E images of the samples corresponding to the commercial control of Mucograft collagen (A: control without protein, B; with BMP-2) after 5 weeks post-surgery.
  • the sample area (5x) is framed, and an increase (20x) of the same is presented to the right.
  • the presence of osteocytes (Os) is detected in the active sample surrounded by adipose tissue (TA) characteristic of bone marrow (BM), surrounded by muscle fibers (FM).
  • TA adipose tissue
  • BM bone marrow
  • FM muscle fibers
  • FC collagen fibers
  • FC collagen fibers
  • FM muscle fibers
  • TA adipose tissue
  • H / E images of fas samples corresponding to the hydrogel of the invention (A: control without protein, B: with BMP-2) after 5 weeks post-surgery.
  • the sample area (5x) is framed, and there is an increase (20x) of it to the right.
  • the presence of osteocytes is detected in the active sample embedded in bone matrix (BM, intense red color, organized and high density) surrounded by muscle fibers (FM).
  • BM bone matrix
  • FM muscle fibers
  • hydrogel fragments (H, and black arrows) surrounded by connective tissue, collagen fibers ⁇ FC) and muscle fibers (FM) are easily located.
  • FIG 13 Computed microtomography ( ⁇ -CT) images corresponding to experimental subjects sacrificed at 9 weeks. To simplify the image, it is shown only from week 5 to week 9.
  • the controls were implanted, where serial bone tissue is not seen in any of the cuts.
  • the active samples were inserted with BMP-2 (Mucograft ⁇ at the top and hydrogel at the bottom of the figure).
  • H + BMP-2 the active hydrogels
  • This signal is almost negligible in the case of Mucograft® with protein (M + BMP-2), during the 9 weeks of study.
  • FIG 14. TM images of the samples corresponding to the commercial control Mucograft® (A: control without protein, B: with BMP-2) after 9 weeks post-surgery. The sample area (5x) is framed, and an increase is presented to the right (10x). The presence of adipose tissue surrounded by the characteristic bone marrow implanted sample is detected. There is no evidence of ectopic bone tissue, since no osteocytes or bone matrix are found as if it was observed at 5 weeks of study. In the case of the control without BMP-2, the shortage of collagen fibers (FC) stands out in comparison with the images obtained at 5 weeks. These facts are indicative of their early degradation in vivo. Figure 15.
  • TM images of the samples corresponding to the hydrogel of the invention (A: control without protein, B: with BMP-2) after 9 weeks post-surgery.
  • the sample area (5x) is framed, and an increase in the same to the right (10x).
  • the presence of smaller hydrogel fragments is detected, more integrated in the tissue than at 5 weeks.
  • collagen (FC) and muscle (FM) fibers are also observed in contact with the sample.
  • BMP-2 protein bone tissue is distinguished, where osteocytes are seen.
  • the appearance of abundant fundamental blood vessels to enrich and maintain the new tissue stands out in a circle.
  • FIG. 16 Analysis of cell cite-toxicity of ios hkirogeles.
  • A the W3T3 cells are shown, after 5 days of incubation with the hydrogel prepared according to example 4 and in B the images corresponding to the same cell line after 45 days of incubation on the hydrogel prepared according to example 2.
  • Example 1 Preparation of cough hydroaeles with chondroitin sulfate.
  • the BMP-2 protein was included in the hydrogels during the preparation thereof as described in example 1. More specifically, 200 ⁇ of a solution of BMP-2 in 50 mM AcOH (2.5 mg / ml) was added to the Solution C, allowing both substances to interact for 45 minutes, hydrogels loaded with BMP-2 were also kept at 4 ° C for up to 15 minutes before implantation.
  • the W3T3 fibroblast cell line was used to analyze the biocompatibility of the hydrogels studied.
  • the hydrogels were prepared under aseptic conditions.
  • the fibroblasts were grown in Dulbecco's Modifted Eagle's Medium, supplemented with 10% inactivated fetal bovine serum, 1% L-glutamine and 1% penicillin-streptomycin, at 37 ° C and in a humidified atmosphere containing 5% CO2 . Subsequently, these cells were trypsinized and seeded on the surface of the hydrogels or, in another modality of the experiment, incorporated into the hydrogels during their preparation, by prior addition to the albumin solution (4 * 10 5 cells / mL) .
  • Example 1 Four disc-shaped samples (0.75 cm in diameter and 5 mm thick) were prepared from the hydrogels described in Examples 1-7. In vitro cultures were made by seeding the C2C12 cell line (CLR mouse prizeblastic 1721 ATCC) being the one that showed the greatest cytocompatibility and cell proliferation, the hydrogel prepared according to example 1. From these results the composition of example 1 was selected to make the same hydrogels with BMP-2 following example 8.
  • C2C12 cell line CLR mouse prizeblastic 1721 ATCC
  • Example 4 disk-shaped samples ⁇ 0.75 cm in diameter and 5 mm thick) were prepared from the hydrogels prepared according to Example 1 and Example 8. These samples were placed in sterile 24-well culture plates in quadruplicate, to which 0.6 ml of DMEM (Eagle Culture Medium Modified by Dulbecco) was added. The plate was taken to a 37 ° C temperature oven and, after 5, 8, 24 and 96 hours of incubation, DMEM media that were in contact with the hydrogels were removed and used for Bradford assays (to determine the proteins total) and alkaline phosphatase. As a control, the same steps were followed with hydrogel samples not loaded with protein, such as the hydrogels described in example 1. The remaining hydrogels described in examples 2-7, also as controls, showed a hydrogel-like behavior described in Example 1. This hydrogel was, therefore, the one selected since it presented greater cytocompatibility, greater cell proliferation and is the one shown in Figure 1.
  • DMEM Eagle Culture Medium Modified by Dulbecco
  • the C2C12 cell line from the American Type Culture Collection (CRL-1772, Manassas, Virginia) was used. The experiments were carried out in 48-well plates in which a volume of 0.026 ml of cell suspension with a density of 10,000 cels / cm 2 was included . Next, 0.1 ml of the previously collected samples, tai and as described at the beginning of this example, and 0.3 ml of preheated culture medium were added.
  • the culture medium was removed from the wells and washed with PBS (200 ⁇ ), then adding 100 ⁇ / well of lysis buffer (50 mM Tris pH 6.8; 0.1% Triton X-100; 2 mM MgCb). 10 ⁇ of the samples were used to perform alkaline phosphatase (ALP) activity assays in 96-well plates, using p-nitrophenyl phosphate in 2-amino-2-methyl-M-propanol buffer as a substrate in a total volume of 100 ⁇ . After 10 minutes at 37 ° C, the reaction was stopped with 100 ⁇ of 0.5 NaOH and the absorbance at 450 nm was measured with a Microplate Reader (Bioteck FL-600).
  • ALP alkaline phosphatase
  • ALP early marker of ossification, of cell differentiation towards bone lineage
  • Each gel prepared according to example 1 or example 8 was divided into 4 equal portions, each of which was implanted in the muscle tissue of Wistar rats (animal model seleceiihado for study).
  • the surgery developed consisted of the insertion of the samples of hydrogels, loaded or not with BMP-2, (or of the corresponding controls) in muscle tissue.
  • BMP-2 or of the corresponding controls
  • the area to be operated was disinfected, which corresponded to the hindquarters of adult Wistar rats.
  • a superficial incision was made following the spine, 3cm from the root of the tail.
  • the skin was separated from the muscle tissue and, in that area, another incision was made, creating a muscular pocket where the samples were inserted (due to their size a quarter were implanted). After suturing the different layers of tissue, the wound was closed and the animals were applied heat, with a source of red light, until observing the recovery of anesthesia.
  • the animals were sacrificed by injection of Doletal (Thiopental) into the marginal tail vein and biopsies of the implantation area were obtained. These biopsy samples were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) and subsequently subjected to a paraffin histology treatment. This treatment required a decalcrification for 2 days in 5% nitric acid, followed by a dehyddratadén immersing the biopsy samples in a sequence of alcohols of increasing concentration, a miscibility step in xylol and, finally, its embedding in paraffin until get the block
  • PFA paraformaldehyde
  • Example 12 Imolafitadiin of hydrogels without BMP-2 in healthy muscle. Evaluation at 3 weeks post-cfeaola.
  • FIG 2 a histological section with H / E staining corresponding to the biopsy of the tissue is presented after three weeks of implantation of the hydrogel, performed as described in exercise 8.
  • Optimal integration of the hydrogel in the muscle tissue is observed . No signs of inflammatory or infectious reactions were found in the operated area.
  • a deeper analysis of the samples allows us to observe the absence of encapsulation phenomena of the hydrogel (reacej ⁇ ri a body erarlo), where the host tissue recognizes and lysia said implanted biomatelfal of the surrounding tissues by regulating or delaying its integration into the tissue.
  • the hydrogels showed good biocompatibility in the tissue since no fibrommeca capsule was observed around, and the cellular colonization of the hydrogels could also be observed (Figure 3) and the appearance of blood vessels in its vicinity ( Figure 4), probably to improve the supply of oxygen and nutrients to them.
  • the biocompatible nature of the hydrogels used in the invention was corroborated.
  • Etemolo 13 Implantation of htdroqeles lacking with rhBMP-2 in healthy muscle.
  • Bone production was studied after implantation of hydrogel formulations loaded with the bioactive factor rhBMP-2 whose preparation is described in example 8.
  • Example 14 Comparison of the performance of hydrogels with commercial product. Study at 5 and 9 post surgery seminars.
  • the hydrogels allow the release of the BMP-2 protein actively, achieving differentiation of muscle tissue to bone tissue.
  • the ectopic bone formation capacity of a commercial formulation strongly depends on the release of active factors.
  • the models currently marketed for the release of rhBMP-2 (infuse®) require a conveyor that controls the release of the same and allows prolonging the local effect of said factor for a longer time.
  • the only suitable and FDA approved carrier is collagen.
  • Commercial products use collagen matrices and / or sponges, which are impregnated with an active factor solution and implanted in order to regenerate bone tissue. For this reason, it was decided to use Mucograft®, a 3D collagen matrix, as a commercial control against the hydrogels of the invention, both with and without protein load.
  • the Mucograft® material was activated with the same amount of protein as the hydrogels. It was loaded with 2.5 mg / ml rhBMP-2 in 50 mM AcOH. The sample was allowed to dry and kept at 4 ° C until 15 minutes before implantation.
  • ⁇ -CT computerized microtomography
  • the acquisition protocol was of high quality (HR) at a resolution of 0.125 mm pixel size, 45 kV / 0.8 mA.
  • HR high quality
  • Figure 15 the behavior of the hydrogels of the invention is shown. Without protein (Figure 15-A), some smaller hydrogel fragments were recognized, in direct contact with collagen fibers and muscle fibers. However, in the presence of BMP-2 ( Figure 15-B) it was released from hydrogel coughs and managed to differentiate muscle cells towards Bone lineage, reaching bone matrix, abundant collagen fibers and even the presence of osteocytes. In addition, I highlight the large number of blood vessels that appeared in the sample, which are necessary to keep the new tissue formed alive.

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Abstract

La presente invención se refiere a hidrogeles bioactivos elaborados con ingredientes de origen natural, que están entrecruzados por interacciones de tipo electrostático y que incorporan proteínas morfogénicas óseas (BMP), y al método de elaboración de dichos hidrogeles. La invención también incluye la aplicación de estos hidrogeles bioactivos para elaborar productos sanitarios, composiciones farmacéuticos y/o implantes poliméricos para regeneración ósea y cartilaginosa.

Description

Título
Hidrogeles bioactivos y su aplicación en regeneración Ósea y cartilaginosa
Sector de la técnica
La presente invención se encuadra en el sector biomédico y farmacéutico, más concretamente, en la regeneración de tejidos y, en particular, del tejido cartilaginoso y óseo (tendones, cartílago y ligamentos).
Estado de la técnica
En ta actualidad, la lesiones óseas y cartilaginosas siguen siendo un reto en el campo biomédico. El tratamiento estándar para la regeneración de lesiones Óseas se caracteriza por ser osteoinductor, osteogénico y osteoconductor y consiste en el injerto de hueso auülogo, del propio paciente. Aunque la posibilidad de rechazo es mínima, este método presenta ciertas limitaciones como la cantidad de tejido donante, o la morbilidad de la zona del mismo. Para solventar estos inconvenientes existen otras alternativas: los denominados aloinjertos, injertos óseos obtenidos de otro paciente, y los biomateriales. Un biomaterial se define como una sustancia farmacológicamente inerte, de origen natural o sintético, diseñada para ser implantada o incorporada dentro del sistema vivo para tratar, aumentar o reemplazar cualquier tejido, Órgano o función del cuerpo. El tipo de biomateriales empleados con fines regenérateos en el campo de la biomedicina ha experimentado una evolución notable a medida que ha aumentado el conocimiento sobre las interacciones de los mismos con el cuerpo humano. Asi, los primeros materiales que surgieron, de primera generación o "inertes", se emplean exclusivamente como método para restaurar las funciones perdidas, es decir, buscan reemplazar el tejido minimizando efectos nocivos en el hospedador como, por ejemplo, los implantes de titanio (Liu, X., Chu, P.K., Ding, C. (2004) Materials Science and Engineering Reports, 47: 49-121). Posteriormente, se produjo un cambio en el concepto de la función de un biomaterial en el proceso de la regeneración tisular, pasando de considerarlo sólo un mero soporte mecánico, a diseñar sistemas en los que el material presenta per se cierta actividad biológica.
Con mejores resultados, estos materiales bíoactivos o de segunda generación, interaccíonan en el organismo permitiendo su reemplazo por tejido del propio hospedador como, por ejemplo, las cerámicas de fosfato tricÉlcíco (β-TCP del ingles Tricafcmm phospate Beta) o los biovidrios y evitando asi una segunda intervención de retirada del implante (Heneh, L.L., Polak, J.M. (2000). Science, 295: 1014-1017). El fosfato de calcio más utilizado en la fabricación de implantes es la hidroxiapatita, por ser el compuesto más parecido ai componente mineral de los huesos y presentar buenas propiedades como biomateríal, tales como biocompatibilidad, bioactividad. osteoconductividad y unión directa al hueso. Sin embargo, sus propiedades mecánicas son inferiores a las de las cerámicas bioinertes y tiene una cinética de degradación muy lenta.
Más recientemente, se han desarrollado los materiales de tercera generación, cuyo principal objetivo es estimular de forma específica la respuesta celular a nivel molecular mediante el empleo de sustancias activas. Son materiales que se adaptan al medio fisiológico, permitiendo la proliferación celular y el desarrollo del nuevo tejido, e incluso producen ta activación de genes que estimulan la regeneración del mismo, por ejemplo, cerámicas de β-TCP activadas con rhBMP-2 (Abarrategi, A., Civantos, A., Ramos. V., Sanz Casado, J.V., Lépez-Lacomba, J.L (2008) Bhmacmmolecutes, 9: 711-718.).
En las ultimas décadas, se han desarrollado materiales poliméricos biodegradables dando lugar a un amplio abanico de polímeros naturales y sintéticos con aplicaciones biomédtcas (Nair, L.S., Laurencin, C.T. (2007) Pmgmss in Potymer Science, 32: 762-798).
Por lo tanto, ios diferentes biomateriales se pueden clasificar en fundón de su composición (materiales metálicos, cerámicos, poliméricos o compuestos), de su origen (naturales o sintéticos) e incluso en biodegradables o no biodegradables.
Los materiales metálicos de titanio, cobalto, aluminio y sus aleaciones correspondientes, son compatibles con los tejidos biológicos aportando buenas propiedades mecánicas (resistencia al desgaste por ejemplo) siendo empleados desde sus inicios en la reparación de tejidos duros de sostén.
Los inconvenientes que presentan se solventan en parte con los materiales cerámicos (alúmina, porcelanas, hidroxíapatita, etc.), con una baja reactividad química que les confiere un carácter inerte y que conlleva una adecuada biocompatibilidad. Este tipo de materiales promueven la proliferación celular (muchas veces de forma especifica), permitiendo la sintesis por parte de estas células de los componentes de la matriz extracelular.
Los materiales polim|ricos son, con mucho, el grupo más variado y versátil dentro de los biomateriales, pudiendo clasificarse en función de su origen en: naturales (alginatos, dextranos, agarosa. celulosa, almidón, colágenos, quitosanos, etc.) o sintéticos (poliestireno. poli-a-hidroácidos, poltésteres, polilactonas, etc.) (Nair, LS„, Laurencin, C.T. (2007) Progress in Poíymer Science, 32: 762-798).
Una de las corrientes dentro del campo de la ingeniería de tejidos se centra en imitar y simular las condiciones de reparación y regeneración de los tejidos que tienen lugar de forma natural en el organismo vivo. De ahí nace la necesidad de emplear polímeros naturales presentes en los tejidos para emplearlos como biomateriales.
Los hidrogeles son redes poliméricas tridimensionales capaces de embeber grandes cantidades de agua o fluidos acuosos. Existen varias posibles clasificaciones para los hidrogeles, pero la principal se basa en el tipo de interacciones que dan lugar a la red pdimérica que forma el esqueleto del hidrogei. Asi, atendiendo al tipo de entrecruzamiento o reticulación, ios hidrogeles se dividen en hidrogeles químicos e hidrogeles físicos. En los primeros, las uniones se realizan a través de enlaces covalentes, mientras que en ios segundos, las mecanismos de formación de enlace se corresponden con interacciones de tipo físico: interacciones iónicas, puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals ...etc. Los hidrogeles químicos han sido ampliamente estudiados en el pasado para aplicaciones biomédicas, principalmente debido a la inestabilidad in vivo de ios hidrogeles físicos. Sin embargo, está ampliamente descrito que muchos de los reticulantes químicos son tóxicos y que los métodos de elaboración de estos hidrogeles son agresivos, siendo probable, como consecuencia, la alteración de posibles moléculas delicadas incorporadas en los mismos. Al mismo tiempo esto ha dificultado su aprobación para usos biomédicos por parte de las agencias regulatorias. Probablemente por este motivo hay tan pocas formulaciones hídrogel comercializadas, con respecto al importante esfuerzo investigador realizado.
De forma paralela, los bíomateriates, que pueden ser biodegradables o no, naturales o sintéticos, siempre deben ser biocompatibles y no tóxicos, de tal forma que permitan y favorezcan el desarrollo de tejido de novo. Si son biodegradables, ha de poderse controlar la velocidad de degradación de forma que se ajuste asimismo a la velocidad de reparación, de sustitución del biomaterial por el propio tejido y sus productos de degradación han de ser inocuos. Otra característica deseable de los biomateriales es que sean adecuados para la liberación de agentes bioactivos; además, debe permitir que las células ya estimuladas con dichos agentes bioactivos los colonicen, actuando a la vez como sistemas de liberación y como soportes para la regeneración. Puede encontrarse una revisión de ios diferentes tipos de biomateriales en: Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. (2012) Trends m Biotechnology, 10 (30): 548-54.
Los sistemas de regeneración Ósea conocidos hasta el momento y los que ya existen en el mercado son productos sanitarios que incorporan agentes bioactivos cuyo principal inconveniente es que existe una rápida liberación íniciai (burst effect), un efecto biológico a muy corto plazo y que la biodegradación del soporte usado (colágeno) también resulta muy rápida, ai tratarse de una proteína ya existente en el cuerpo humano y para la que existen enzimas específicos. Todo ello hace que la dosis que ha de colocarse en el soporte para una acción terapéutica eficaz sea excesiva, lo cual encarece extraordinariamente el producto y puede conducir a efectos indeseados. A ese elevado coste también contribuye el hecho de que el soporte, el colágeno, resulta excesivamente caro al tener que eliminar de la molécula natural, extraída de otras especies, aquellas secuencias no homologas con ta secuencia humana que puedan dar lugar a reacciones inmunogénicas. Aparte del elevado coste, las características de estos sistemas de regeneración no permiten obtener un efecto biológico a largo plazo conducente a la inducción a tiempos largos de la formación de osteonas (unidades micromecánicas de hueso compacto, constituidas por osteocitos y matriz Ósea, necesarias en osteogénesís), a menos que se emplee una elevada dosificación de agentes bioactivos lo que, además de encarecer el producto, puede conducir a efectos secundarios como, por ejemplo, ta acción en lugares no deseados del agente bioactivo incorporado.
En cambio, en la regeneración de tejidos blandos como ligamentos, tendones y/o cartílagos, no existen productos comerciales que lleven incorporados factores activos (Endobuíton CL® o Ácido hialurónico).
Por ello todo lo expuesto hasta aqui, existe una incesante demanda de otros transportadores que, siendo biocompatibles con el organismo, permitan la liberación del factor bioactivo durante más tiempo y de forma controlada, para reducir los efectos secundarios asociados a su aplicación y para conseguir, no silo una eficaz reparación de lesiones Óseas, sino que la maleabilidad del mismo permita liberar factores bioactivos de forma efectiva para su aplicación en la regeneración de otros tejidos como cartílago y tendones.
Descripción detallada de la invención
Hidrogeles bioactivos y su aplicación en regeneración ósea y cartilaginosa. La presente invención se refiere a hidrogeles bioactivos elaborados con ingredientes de origen natural que están entrecruzados por interacciones de tipo electrostático y que incorporan proteínas morfogéntcas óseas (BMP); estos hidrogeles bioactivos se utilizan para elaborar productos sanitarios para regeneración ósea y cartilaginosa con muy buenos resultados debido a la prolongada vida del soporte de la BMP dentro del organismo animal, lo que favorece la formación de nuevo hueso, cartílago o tendón.
La matriz ósea extracelular constituye una importante reserva de factores de crecimiento (GF, del inglés Gmwth Factors), entre los que se encuentran las proteínas morfogenéticas óseas (BMP, del inglés Bañe Mwphogenetic Pmteins) que intervienen en la formación de diferentes tejidos (tejido óseo, neural y cardiaco) durante la embríogénesis e, incluso, actúan en la vida adulta en los procesos de reparación de fracturas. Dichas proteínas actúan como agentes (ocales, necesitan permanecer en el defecto óseo durante un tiempo determinado para producir la diferenciación celular y la consiguiente regeneración tisular. Por ello, son proteínas que requieren de una matriz portadora que permita su liberación de forma prolongada en el sitio de acción y proteja ai factor de procesos degradativos.
En el 2004, ta FDA (Food and Drug Administration, de EEUU) aprobé ei uso biomédico como productos sanitarios de la rhBMP-2 y la rhBMP-7 para determinadas situaciones clínicas como, por ejemplo, el tratamiento de grandes defectos áseos, no uniones y fusión espinal anterior, lumbar y cervical. Existen diferentes productos disponibles en ei mercado, como Infuse® (rhBMP-2, Medtronic, Minneapolis, USA), Inducto* (rhBMP-2, Wyeth Europa Ldt, London, UK), Osigraph® (rhBMP-7, Wyeth Europa Ldt, Londres, UK) y OP-1 Putty® (rhBMP-7, Stryker Biotech. MA, USA), que emplean como transportador esponjas de colágeno.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un hidrogel bioactivo que comprende:
a) ai menos un polímero aniónico,
b) al menos un agente reticulante catiónico,
c) al menos un glicosaminoglicano, y
d) al menos dos proteínas, donde a) y b) son de origen natural y están entrecruzados por interacciones de tipo electrostático y una de las proteínas es un agente bioactivo del grupo de las proteínas morfogénicas óseas.
Como polímero aniónico se selecciona preferentemente la goma gelarto y/o la goma arábiga que pueden incorporarse ai hidrogel bioactivo en concentraciones de 3 a 1 mg/ml (concentración final en el hidrogel). Los agentes reticulantes cafioriicos de elección pueden ser la espermidina y/o la espermina, que se utilizan preferentemente a una concentración final entre 0,1 y 1,5 mg/ml. Preferentemente, se incorpora condroitín sulfato, ácido hialuróníco y/o dermatán sulfato, como glicosaminoglicanos a una concentración final de entre 0,5 y 5 mg/ml. De las dos proteínas que incorpora el hidrogel bioactivo, una es una BMP y ia otra es, preferentemente, albúmina que puede incorporarse a una concentración final de entre 2 y 10 mg/ml.
Entre las BMP, se selecciona preferentemente la BMP2 en su forma homodimérica (BMP2-BMP2), es decir, formada por dos subunidades iguales unidas entre si, pero se conoce que en la naturaleza puede existir ia BMP-2 con otras proteínas, es decir en su forma heterodirnérica como la formada por dos monémeros diferentes (ÍMPMIVÍP4, BMP22iMP5, BMP2-BMP6, BMP2- BMP7, BMP2-BMP9, BMP2-BMP12, etc.). La BMP- 2 escogida se empleó a una concentración final en él hidrogel de entre 0, 1 y 0,5 mg/ml.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para elaborar los hidrogeles bioactivos de la invención. Este método comprende los siguientes pasos:
a) preparar una disolución acuosa de proteína,
b) añadir una disoluélin de BMP a la disolución acuosa del paso a), c) mezclar con una disolución acuosa de un reticulante catióhico,
d) verter la mezcla del paso c) sobre una solución acuosa de un polímero aniónico con un glicosaminogiicano, mezclando ios componentes a 55-65°C y aplicando agitación durante 2-10 segundos, para después dejar que el hidrogel se forme a temperatura ambiente.
La proteína del paso a) es, preferentemente, albúmina que puede incorporarse a una concentración final de entre 5 y 10 mg/ml. Entre las BMP, se selecciona preferentemente la BMP2 en su forma homodimérica (BMP2- BMP2), es decir, formada por dos subunidades iguales unidas entre si. Los agentes reticulantes caliénteos de elección pueden ser la espermidína y/o la espermina, que se añaden preferentemente a una concentración final entre 0,1 y 1,5 mg/ml. Como polímero ariiÓnico se selecciona preferentemente la goma gelano y/o la goma arábiga que puede incorporarse al hidrogel bioactivo en concentración final de 3 a 1 mg/ml. Preferentemente, se incorpora como glicosaminogiicano condroitin sulfato, ácido hialurónioco y/o dermatán sulfato a una concentración final de entre 0,5 y 5 mg/ml. La temperatura de elección para realizar la mezcla de ios componentes es de 60°C y, preferente, se aplica agitación durante 5 segundos. La BMP se puede disolver en ácido acético diluido filtrándola posteriormente en esterilidad mediante filtros de 0,22 μιη, Para tos demás componentes de los hidrogeles bioactrvos las disoluciones acuosas se realizan, preferentemente, en tampon HEPES.
Por lo tanto, un método preferido para elaborar ios hidrogeles bioactivos de la invención comprende ios siguientes pasos:
a) preparar una disoluéip* acuosa de alamina,
b) añadir una disolución de BMP a la disolución acuosa de albúmina, c) mezclar con una solue¡Éri acuosa de espermtdina,
d) verter la mezcla del paso c) sobre una solución acuosa de gome gelano y condroitín sulfato, meziianclo los componentes a 60°C y aplicando agitación durante 5 segundos, para después dejar que el hidrogel se forme a temperatura ambiente.
Las BMP son muy sensibles, por lo que pueden perder su actividad biológica cuando se someten a determinados procesos o condiciones ambientales. La mayoría de ios biomateriales activados con proteínas durante el proceso de fabricación se inactiva y pierden su función biológica. En el caso de los hidrogeles de la invenwi, se consiguió incluir dichos factores y se pudo evaluar la presencia de proteína activa en los mismos. Para determinar la presencia de proteína activa incorporada en los hidrogeles se sometió a los hidrogeles a ensayos edorimitftcos de actividad fosfatasa alcalina (ALP, marcador temprano de la diferenciación Ó$ea). Dicha actividad puede detectarse fínicamente en células osteoblásticas. Se utilizó la linea celular multipotente C2C12, linea celular premtoblastíca que en presencia de BMP2 es capaz de diferenciarle hacia diferentes fenotipos óseos. Se realizó la siembra de esta linea celuiar¡en los hidrogeles de la invención y se observé si la BMP2 cargada en los mismos se liberaba de forma activa y era capaz de promover la eféctijva diferenciación de estas células hacia el linaje osteoblástico. La detección de actividad fosfatasa alcalina en muestras de células C2C12 cultivadas con medios procedentes de ensayos de liberación de BMP-2 cargada en ios hidrogeles estudiados demostré la liberación de la proteina manteniendo su bioactividad. La presente Invención también se refiere a una composición farmacéutica y/o a un producto sanitario que comprenden un hidrogel bioactivo de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de ia invención se refiere a una composición farmacéutica y/o a un producto sanitario para su uso en regeneración Ósea o cartilaginosa.
La invención también se refiere a un método para tratar las alteraciones Óseas y/cartilaginosas mediante el uso de los hídrogeles bioactivos de la invención.
Otro aspecto de ia invención se refiere ai uso de un hidrogel bioactivo de la invención en ia elaboración de una composición farmacéutica o de un producto sanitario.
Asf mismo se refiere al uso de un hidrogel bioactivo de la invención en la elaboración de implantes poliméricos para regeneración ósea y cartilaginosa.
Los hídrogeles bioactivos de ia presente invención son hídrogeles físicos que han demostrado ser mis estables, tanto m vitro como in vivo, que a los hídrogeles físicos convencionales. La preparación de los hídrogeles bioactivos de la invención mediante ia técnica de ia geliücadoiíi iónica, cuyo fundamento son las interacciones electrostáticas entre compuesto de carga opuesta, tiene lugar además en un tiempo corto. De esta manera, no es preciso el uso de reactivos químicos ni de fuentes de radiación, como la radiación UV.
Las pruebas in vivo realizadas con los hídrogeles bioactivos de la invención han demostrado, en primer lugar, su biocompatibilidad; en segundo lugar, ta larga duración de estos hídrogeles como soportes de las BMP, lo que permite la liberación del factor bioactivo durante mis tiempo que otros soportes conocidos, permitiendo que el tejido generado se mantenga con mayor estabilidad en el tiempo y no sea reabsorbido, lo que facilitaría el éxito de procesos regenerativos que necesiten de un mayor tiempo para completarse, en tercer lugar, el control que han ejercido los hídrogeles bioactivos sobre la liberación de la BMP, en el lugar donde se requiere la regeneración; y, en cuarto lugar, las adecuadas propiedades mecánicas de los hídrogeles bioactivos de la invención para actuar como soportes de) crecimiento y desarrollo celular in vivo. Con todo ello, se consigue la eficaz reparación de lesiones óseas, asi como de otros tejidos como son los tendones y ligamentos.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Test de actividad BMP-2 in vitro. A) Determinación de la cantidad de proteínas totales (PT), expresadas en microgramos y determinadas por el método de Bradfbrd a una absorbencia de 59®nm; B) Actividad fosfatase alcalina (ALP), mediante la determinación de la absorbencia a 4Q5nm, del cultivo celular C2C12 sembrado con medios de liberación de los hidrogeles con proteina (H-BMP2) y sin proteína (H-C). Figura 2. Tinción de hematoxilina-eosina realizada en muestras obtenidas tras 3 semanas de implantación de ios hidrogeles sin rhBMP-2 (10x). Se aprecia la buena integración de los hidrogeles en el tejido hospedador, sin signos de encapsulación. Figura 3. Tinción de hematoxilina-eosina realizada en muestras obtenidas tras 3 semanas de implantación de los hidrogeles sin rhBMP-2 (40x). Se observa la aparición de células colonizando el hidrogel.
Figura 4. Tinción de hematoxilina-eosina realizada en muestras obtenidas tras 3 semanas de implantación de los hidrogeles sin rhBMP-2 (40x). Se observa la aparición de vasos sanguíneos en las proximidades del hidrogel.
Figura S. Tinción de hematoxilina-eosina realizada en muestras obtenidas tras 3 semanas de implantación de los hidrogeles cargados con rhBMP-2 (10x). Se observa la buena integración de los hidrogeles en el tejido hospedador, sin signos de encapsulación.
Figura 6. Tinción de hematoxilina-eosina realizada en muestras obtenidas tras 3 semanas de implantación de los hidrogeles. A: hidrogeles sin rhBMP-2 (40x) B: hidrogeles cargados con rhBMP-2 (10x). C y D: ampliaciones. Figura 7. Tinción de hematoxilina-eosina realizada en muestras obtenidas tras 3 semanas de implantación de los hidrogeles cargados con BMP (10x).
Figura 8. Tinción de hematoxilina-eosina realizada en muestras obtenidas tras 9 semanas de implantación de ios hidrogeles cargados con BMP (20x). A) Hueso trabecular; B) Periostium; C) Médula ósea.
Figura 9. Tinción de hematoxilina-eosina realizada en muestras obtenidas tras 9 semanas de implantación de los hidrogeles cargados con BMP (100x). En ia imagen se pueden apreciar una osteona, osteocitos (flecha negra) y osteoblastos (flecha blanca).
Figura 10. En esta figura se muestran imágenes de microtomografía computerizada (μ-CT) correspondientes a los sujetos experiménteles sacrificados a las 5 semanas; las imágenes se tomaron en la segunda, tercera, cuarta y quinte semana post-cirugía (se indican con números en la parte superior de la figura). En el lado derecho (LD), se implantaron los controles de colágeno (M-C) y de hidrogel (H-C) donde no se aprecia señal de tejido oseo. En cambio, en el lado izquierdo (Ll), se insertaron las muestras activas con protefna BMP-2, tanto de colágeno (M+BMP-2) como de hidrogel (H+BMP-2). Se observa sena! de gran intensidad en la zona del tejido blando que evoluciona durante las 5 semanas de estudio en ambas muestras. Cabe destacar la gran diferencia entre las muestras con BMP-2 en la última semana. Se distingue una señal de gran tamaño, volumen e intensidad correspondiente al nuevo tejido óseo, producido por el hidrogel con BMP-2 en la última semana en comparación con el control Mucograft con proteina BMP-2.
Figura 11. Imágenes de H/E de las muestras correspondientes al control comercial de colágeno Mucograft (A: control sin proteina, B; con BMP-2) tras 5 semanas post-cirugía. Se encuadra la zona de la muestra (5x), y se presente un aumento (20x) de la misma a ia derecha. Se detecta la presencia de osteocitos (Os) en la muestra activa rodeada de tejido adiposo (TA) característico de medula ósea (BM), rodeado de fibras musculares (FM). En la muestra sin BMP-2, se aprecia abundantes fibras de colágeno (FC) con cierta orientación y rodeadas de fibras musculares (FM) y menor cantidad de tejido adiposo (TA). Figura 12. Imágenes de H/E de fas muestras correspondientes al hidrogel de la invención (A: control sin proteína, B: con BMP-2) tras 5 semanas postcirugía. Se encuadra ia zona de ta muestra (5x), y se presenta un aumento (20x) de ia misma a la derecha. Se detecta ia presencia de osteocitos en ia muestra activa embebidos en matriz ósea (BM, de color rojo intenso, organizada y de gran densidad) rodeado de fibras musculares (FM). En ia muestra sin BMP-2, se localiza fácilmente fragmentos de hidrogel (H, y flechas negras) rodeados por tejido conectivo, fibras de colágeno <FC) y fibras musculares (FM).
Figura 13. imágenes de microtomografía computarizada (μ-CT) correspondientes a los sujetos experimentales sacrificados a las 9 semanas. Para simplificar la imagen, se muestra sólo a partir de ia semana 5 hasta la semana 9. En el lado derecho (LD), se implantaron los controles, donde no se aprecia serial de tejido Óseo en ninguno de ios cortes. En cambio, en el lado izquierdo (Ll), se insertaron las muestras activas con BMP-2 (Mucograft© en la parte superior e hidrogel en la parte inferior de la figura). Se confirma, asi, la presencia de nuevo tejido Óseo por más tiempo en el caso de ios hidrogeles activos (H+BMP-2) donde se distingue de forma nítida ia existencia de una señal correspondiente al nuevo hueso en el lado izquierdo hasta la semana 9 de estudio. Dicha señal es prácticamente inapreciable en el caso de Mucograft® con proteína (M+BMP-2), durante las 9 semanas de estudio.
Figura 14. Imágenes de TM de las muestras correspondientes al control comercial Mucograft® (A: control sin proteína, B: con BMP-2) tras 9 semanas post-cirugía. Se encuadra la zona de la muestra (5x), y se presenta un aumento de la misma a ia derecha (10x). Se detecta ia presencia de tejido adiposo rodeado por la muestra implantada característico de médula ósea. Ya no se aprecian indicios de tejido óseo ectópico, puesto que no se localizan osteocitos ni matriz ósea como si se observó a las 5 semanas de estudio. En el caso del control sin BMP-2, destaca la escasez de fibras de colágeno (FC) en comparación con las imágenes obtenidas a las 5 semanas. Estos hechos son indicativos de su pronta degradación in vivo. Figura 15. Imágenes de TM de las muestras correspondientes al hidrogel de ia invención (A: control sin protefna, B: con BMP-2) tras 9 semanas postcirugía. Se encuadra ia zona de la muestra (5x), y se presenta un aumento de la misma a la derecha (10x). Se detecta la presencia de menores fragmentos de hidrogel, más integrados en el tejido que a las 5 semanas. En el hidrogel control sin BMP-2, se observan, además, fibras de colágeno (FC) y musculares (FM) en contacto con la muestra. Con proteína BMP-2, se distingue tejido óseo, donde se aprecian ios osteocitos. Además, se destaca con un círculo la aparición de abundantes vasos sanguíneos fundamentales para enriquecer y mantener el nuevo tejido.
Figura 16. Análisis de cite-toxicidad celular de ios hkirogeles. En A se muestra las células W3T3, tras 5 días de incubación con el hidrogel preparado según el ejemplo 4 y en B las imágenes que corresponden a la misma linea celular tras 45 dias de incubación sobre el hidrogel preparado según el ejemplo 2.
Modo de realización de ia invención
Ejemplo 1. Preparación de tos hidroaeles con condroitin sulfato.
Figure imgf000014_0001
Para la preparación de ios hidrogeies se mezclaron 0.93 mi de la solución C con 0.43 mi de la solución D, tras lo cual se añadid el conjunto sobre una mezcla de 0.71 mi de solución A y 0.43 mi de solución B, previamente situada en un baño termostatizado a 60±1eC bajo agitación magnética. Después dé 5 segundos se interrumpió la agitación y se retiró la fuente de calor. La gelificación se produjo de manera espontanea, con ia disminución de la temperatura del sistema. El hidrogel se mantuvo a 4° C hasta 15 minutos antes de su implantación, durante ios que se dejó a temperatura ambiente.
Eiemoio 2. Preparación de tos hidroaeles con ácido hiaiurónico.
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000015_0001
Para la preparación de los hidrogeles se mezclaron 0.93 mi de la solución C con 0.43 mi de la solución D. tras lo cual se añadió el conjunto sobre una mezcla de 0.71 mi de solución A y 0.43 mi de solución B, previamente situada en un bafto termostatizado a 60±1°C bajo agitación magnética. Después de 5 segundos se interrumpid la agitación y se retiró la fuente de calor. La gelificación se produjo de manera espontánea, con la disminuciin de la temperatura del sistema. Ejemplo 3. Preparación de los hidrooeles con espetmina. En primer lugar se pjepararon las siguientes soluciones:
Figure imgf000015_0002
Para la preparación de ios hidrogeles se mezclaron 0.93 mi de la solución C con 0.21 mi de la solución D y 0.21 de la solución E, tras lo cual se afrailó el conjunto sobre una mezcla de 0.71 mi de soludóN A y 0.43 mi de solución B, previamente situada en un baño termostatizado a 60±1°C bajo agitación magnética. Después de 5 segundos se interrumpió la agitación y se retiró ia fuente de calor. La gelificación se produjo de manera espontánea, con ia disminución de ia temperatura dei sistema.
Eiemolo 4. Preparación de tos hidrogeles con Condrotin sulfato v una concentráciori de esoerrilina mavor.
Figure imgf000015_0003
Figure imgf000016_0001
Para ta preparación de ios hidrogeles se mezclaron 0.93 mi de la solución C con 0.43 mi de la solución D, tras lo cual se altadlo el conjunto sobre una mezcla de 0.71 mi de solución A y 0.43 mi de solución B, previamente situada en un baño termostatizado a 60±1°C bajo agitación magnética. Después de 5 segundos se interrumpió la agitación y se retiré la fuente de calor. La gelificación se produjo de manera espontánea, con la disminución de la temperatura del sistema. Ejemplo 5. Preparación de los hidrogeles con Ortofbsfcserina v goma arábiga
Figure imgf000016_0002
Para la preparación de ios hidrogeles se mezclaron 0.16 mi de la solución F, con 0.30 mi de la solución E, tras lo cual se afiadió el conjunto sobre una mezcla de 1 mi de solución A, 0.43 de la solución B, 0.90 de la solución C y 0.7 de la solución D, previamente situada en un baño termostatizado a 60±1°C bajo agitación magnética. Después dé 5 segundos se interrumpió la agitación y se retiró la fuente de calor. La geliftcadén se produjo de manera espontánea, con la disminución de la temperatura del sistema.
Ejemplo 6. Preparación de los hidrogeles con dermatán sulfato.
Figure imgf000016_0003
Figure imgf000017_0002
Para la preparación de los hidrogeles se mezclaron 0.93 mi de la solución C con 0.43 mi de ia solución D, trae lo cual se añadió el conjunto sobre una mezcla de 0.71 mi de solución A y 0.43 mi de solución B, previamente situada en un bario termostatízado a 60±1°C bajo agitación magnética. Después de 5 segundos se interrumpió la agitación y se reiró la fuente de calor. La gelificación se produjo de manera espontánea, con la disminución de ia temperatura del sistema.
Eiemoto 7, Preparación de los hidrooeles con condroitin sulfato v dermatán Sulfato,
Figure imgf000017_0003
Para la preparación de los hidrogeles se mezclaron 0.93 mi de ia solución D con 0.43 mi de la solución E, tras lo cual sé aÉadiÓ el conjunto sobre una mezcla de 0.71 mi de solución A. 0.43 mi de solución B y 0.43 mi de solución C, previamente situada en un barra termostatízado a 60±1SC bajo agitación magnética. Después de 5 segundos se interrumpió la agitación y se retiró la fuente de calor. La gelificación se produjo de manera espontánea, con ta disminución de ia temperatura del sistema.
Figure imgf000017_0001
La proteína BMP-2 se incluyó en los hidrogeles durante la preparación de los mismos según se describe en el ejemplo 1. Más concretamente, se añadieron 200 μΙ de una solución de BMP-2 en AcOH 50 mM (2.5 mg/ml) a la solución C, dejándose interaccionar ambas sustancias durante 45 minutos, tos hidrogeles cargados con BMP-2 también se mantuvieron a 4° C hasta 15 minutos antes de su implantación.
Ejemplo 9. Análisis de citotoxicidad celular
La línea celular de fibroblastos W3T3 fue utilizada para analizar la biocompatibilídad de los hidrogeles estudiados. Para la realización de estos experimentos los hidrogeles fueron preparados en condiciones asépticas. Los fibroblastos fueron cultivados en Dulbecco's Modifted Eagle's Médium, suplementado con un 10% suero fetal bovino inactivado, un1% de L- glutamína y un 1% de penicilina-estreptomicina, a 37°C y en una atmosfera humidificada conteniendo un 5% de CO2. Posteriormente estas células fueron tripsinizadas y sembradas sobre la superficie de los hidrogeles o, en otra modalidad del experimento, incorporadas a los hidrogeles durante la preparación de los mismos, mediante su adición previa a la solución de albúmina (4 * 105 celulas/mL). Tras 2, 5 y 45 dias, se aplicó una doble tinción. Dicha tinción está basada en la adición de 800 μΙ de una solución 0.012 mM de diacetato de fluoresceina en tarnpóh fosfato salino (PBS, pH 7.4), dejándose actuar esta durante 15 minutos, y en la posterior incorporación de 800 μΙ de una solución de OAPI (4',6-diamino-2-fenilindol) 0.0014 mM en PBS (pH 7.4), dejándose actuar ésta durante 5 minutos. Mediante esta tinción los núcleos de todas las células se tifien de azul, mientras que solamente ios citoplasmas de las células vivas se tifien de verde. Finalmente, se lavaron las formulaciones con PBS (pH 7.4) generosamente, para eliminar todos los posibles residuos de ios reactivos de tinción, y se observaron los geles con ayuda de un microscopio confocal (Microscopio Confoca! Spectral Leica TCS-SP5; LEICA Microsystems Heidelberg GmbH, Am Friedenspíatz, Mannheim, Alemania).
Tal y como se observa en la Figura 16, este análisis demostró que, a todos ios tiempos estudiados, habia células vivas en ios hidrogeles, situadas a diferentes profundidades en el mismo. Además, imágenes de confocal de los canales verde y azul, fusionados en una única imagen con doble color, permitió confirmar la ausencia de células muertas en los mismos. Ejemplo 10. Test de actividad de BMP-2 in vito.
Se prepararon 4 muestras con forma de disco (de 0,75 cm de diámetro y 5 mm de grosor) a partir de ios hidrogeles descritos en ios ejemplos 1- 7. Se realizaron cultivos in vitro sembrando la linea celular C2C12 (premioblastica de ratón CLR 1721 ATCC) siendo el que presentí mayor crtocompatibilidad y proliferación celular, el hidrogel preparado según ei ejemplo 1. De estos resultados se seleccionó la composición del ejemplo 1 para realizar los mismos hidrogeles con BMP-2 siguiendo el ejemplo 8.
Se prepararon 4 muestras con forma de disco {de 0,75 cm de diámetro y 5 mm de grosor) de los hidrogeles preparados según el ejemplo 1 y el ejemplo 8. tas muestras se colocaron en placas de cultivo estériles de 24 pocilios por cuadruplicado, a los que se les añadid 0,6 mi de DMEM (Medio de Cultivo Eagle Modificado por Dulbecco). Se llevó la placa a estufa de temperatura 37°C y, tras 5, 8, 24 y 96 horas de incubación, los medios DMEM que estuvieron en contacto con los hidrogeles se retiraron y se emplearon para los ensayos de Bradford (para determinar las proteínas totales) y fosfatase alcalina. Como control, se siguieron los mismos pasos con muestras de hidrogel sin cargar con protelna, como los hidrogeles descritos en el ejemplo 1. El resto de hidrogeles descritos en los ejemplos 2-7, también como controles, mostraron un comportamiento semejante al hidrogel descrito en el ejemplo 1. Este hidrogel fue, por tanto, el seleccionado ya que presentó mayor citocompatibilidad, mayor proliferación celular y es el que se muestra en la figura 1.
Para los ensayos se utilizó la línea celular C2C12 procedente de la American Type Culture Collection (CRL-1772, Manassas, Virginia). Los experimentos se realizaron en placas de 48 pocilios en los que se incluyó un volumen de 0,026 mi de suspensión celular con una densidad de 10000 cels/cm2. A continuación, se añadieron 0,1 mi de las muestras previamente recogidas, tai y como se describe al principio de este ejemplo, y 0,3 mi de medio de cultivo precalentado.
Se retiró el medio de cultivo de los pocilios y se lavaron con PBS (200 μΙ) añadiendo, a continuación, 100 μΙ/ pocilio de tampón de lisís (50 mM Tris pH 6,8; 0,1% Tritón X-100; 2 mM MgCb). Se utilizaron 10 μΙ de las muestras para realizar ensayos de actividad fosfatase alcalina (ALP) en placas de 96 pocilios, utilizando p-nitrofenil fosfato en tampén 2-amino-2-metiM -propanol como sustrato en un volumen total de 100 μΙ. Después de 10 minutos a 37°C, se paró la reacción con 100 μΙ de 0,5 NaOH y se midió la absorbancia a 450 nm con un Microplate Reader (Bioteck FL-600).
Se determinó la ALP (marcador temprano de ta osificación, de la diferenciación celular hacia linaje óseo) en las células C2C12 premioblásticas de ratón. En primer lugar, se comprobó que las células sembradas con medio que estuvieron en contacto con hidrogeles no activos (sin protelna), no expresaban marcadores óseos como ALP (véase Figura 1, H-C ). En cambio, en las células que se sembraron con tos medios que estuvieron en contacto con los hidrogeles cargados con proteina (es decir, activos; H-BMP2 en la Figura 1), sí se detecté actividad ALP, mostrando absorbancia a 405nm. Este hecho demuestra que los hidrogeles son capaces de libelar la BMP-2 de forma activa al medio y ésta ser captada por las células adyacentes. Asi se consiguió demostrar que, ni el método de inclusión de la protelna ni el ambiente del hídrogel durante el proceso de liberación inactivaron a la protelna incluida en ios hidrogeles, siendo estos mismos trasportadores adecuados para liberarla.
Ejemplo 11. Procedimiento auirumico
Cada gel preparado según el ejemplo 1 o el ejemplo 8 se dividió en 4 porciones iguales, cada una de las cuales se implantó en el tejido muscular de ratas Wistar (modelo animal seleceiihado para el estudio).
La cirugía desarrollada consistió en la inserción de las muestras de hidrogeles, cargados o no con BMP-2, (o de los controles correspondientes) en tejido muscular. Para ello, y tras la anestesia via ifohalatoria (Isofluorano y 02), se desinfectó la zona a operar que correspondió a los cuartos traseros de ratas Wistar adultas. Se realizó una incisión superficial siguiendo la columna vertebral, a 3cm de la raíz de la cola. Se separó la piel del tejido muscular y, en dicha zona, se realizó otra incisión, creando un bolsillo muscular donde se insertaron las muestras (debido al tamaño de las mismas se implantaron una cuarta parte). Tras suturar las diferentes capas de tejido, se cerré la herida y a los animales se les aplicó calor, con una fuente de luz roja, hasta observar la recuperación de la anestesia. Los anímales se sacrificaron mediante inyección de Doletal (Tiopental) en vena marginal de la cola y se obtuvieron las biopsias de la zona de implantación. Estas muestras de biopsia se fijaron con paraformaldehido (PFA) al 4% y, posteriormente, se sometieron a un tratamiento de histología en parafina. Dicho tratamiento requirió de una descalcrficación durante 2 días en ácido nítrico al 5%, seguida de una deshídratadén sumergiendo las muestras de biopsia en una secuencia de alcoholes de concentración creciente, un paso de miscibilidad en xilol y, por Étimo, su embebimiento en parafina hasta conseguir la obtencl|h de ios bloques. Con un mterétomo (Leika RM 2155} se obtuvieron cortes de los bloques de apropiadamente 5 um de espesor y sobre éstos se realizaron las correspondientes tinlbnes hematoxilina-eosina (H/E), de uso frecuente en clínica, y Tricrorfiico de Masson (TM) específica de tejido oseo. tos tiempos empleados para los estudios que se detallan a continuación fueron 3, 5 y 9 semanas post-drugía. Se operaron un total de 18 ratas con un n =2 para cada condición y cada punto temporal de las muestras con y sin BMP-2.
Ejemplo 12. Imolafitadiin de los hidrogeles sin BMP-2 en músculo sano. Evaluación a las 3 semanas post-cfeaola.
Se evalÉÓ el comportamiento ¡h v#o de los hidrogeles bbactivos físicos preparados según se describe en el ejemplo 1 mediante gelifieacíin (ártica, y sin la incorporaron del factor bioactivo BMP-2.
En la Figura 2, se presenta un corte histológico con tinción H/E correspondiente a la biopsja del tejido tras tres semanas de la implantación del hidrogel, realizada segln se describe en el ejernplo 8. Se observa una integración Óptima del hidrogel en el tejido muscular. No se encontraron signos de reacciones infamatorias, o infecciosas en la zona operada. Un análisis más profundo de las muestras perm»t¾É observar la ausencia de fenómenos de encapsulación del hidrogel (reacejíri a cuerpo erarlo}, donde el tejido del hospedador reconoce y lisia dicho biomatelfal implantado de los tejidos circundantes dücuitando o retrasando su integradÉn en el tejido. En este caso, los hidrogeles mostraron buena biocompatibilidad en el tejido pues no se observó ninguna capsula fibrülca alrededor. Se pudo observar además, la colonización celular de los hidrogeles (Figura 3} y la aparición de vasos sanguíneos en sus inmediaciones (Figura 4), probablemente para mejorar el aporte de oxígeno y nutrientes a los mismos. Medíante este ejemplo se corroboró el carácter biocompatible de los hidrogeles utilizados en la invención. Etemolo 13. Implantación de los htdroqeles careados con rhBMP-2 en músculo sano.
Se estudié ia producción de hueso tras la implantación de las formulaciones de hidrogel cargadas con el factor bioactivo rhBMP-2 cuya preparación se describe en el ejemplo 8.
Las ratas se sacrificaron a las 3 y 9 semanas post-im plantación. Las muestras procedentes del estudio in vivo se trataron siguiendo el protocolo experimental descrito en el ejemplo 8 (tratamiento de histología en parafina y tinciones H/E y TM).
Los hidrogeles cargados con BMP-2, al igual que en el ejemplo 11, se integraron en el tejido hospedador. Tampoco se encontraron signos de reacciones inflamatorias, infecciosas o de encapsulación. Se obsen/S la presencia de numerosos vasos sanguíneos cerca del hidrogel cargado con BMP-2 (Figura 5), sin embargo, algunos de estos vasos tenían el aspecto de osteonas incipientes (comparación de ios dos tipos de vasos en la Figura 6). Finalmente, en la Figura 7 se observa la aparición de formaciones con aspecto de tejido adiposo, iste tipo de tejido es un componente abundante de la médula Ósea, por lo que su presencia puede interpretarse como médula ósea.
Las consideraciones expuestas en el párrafo anterior se confirmaron tras 9 semanas de implantación del hidrogel cargado con BMP-2. En el análisis de ios cortes histológicos correspondientes a este período se aprecio claramente la presencia de tejido oseo propiamente dicho, así como de medula Ósea (Figura 8), apareciendo incluso osteonas bien diferenciadas (Figura 9). Esto demuestra la capacidad de los hidrogeles para incorporar, inmovilizar y liberar la BMP-2 y protegerla del medaoambiente bilógico. Además, ia existencia de importantes diferencias entre la tercera y la novena semana de implantación indica que ios hidrogeles han ejercido un control sobre la liberación del factor de crecimiento. Quedan evidenciadas de igual manera tas adecuadas propiedades mecánicas de tos hidrogeles para actuar como soportes del crecimiento y desarrollo celular to vivo. Mediante el análisis de las figuras indicadas en los párrafos anteriores se hace patente también la biodegradación de los hidrogeles con el paso del tiempo, ya que los fragmentos de hidrogeles que se observaron en la muestra eran mucho menores que los trozos de hidrogel implantados. Asimismo, como en el caso de las figuras 2 y 8. se observé tejido formado entre los fragmentos de hidrogel presentes en la muestra, suplantando al propio hidrogel. Este dato es muy relevante de cara a ia aplicación de los sistemas en procesos regenérateos, donde tanto la rápida biodegradación del sistema como la ausencia de biodegradación son muy negativas. Esta cualidad está directamente relacionada con el ejemplo 8.
Ejemplo 14. Comparación de la actuación de los hidrogeles con producto comercial. Estudio a las 5 v 9 seminas post cirugía.
Como hemos demostrado en el ejemplo 12, los hidrogeles permiten la liberación de la proteina BMP-2 de forma activa, consiguiendo la diferenciación del tejido muscular hacia tejido Óseo. La capacidad de formación de hueso ectópico de una formulación comercial depende fuertemente de ia liberación de los factores activos. En particular, los modelos que se comercializan actualmente para ia liberación de rhBMP-2 (infuse®) requieren de un transportador que controle la liberación de la misma y permita prolongar el efecto local de dicho factor durante un tiempo mis prolongado. El único transportador adecuado y aprobado por la FDA es el colágeno. Los productos comerciales utilizan matrices y/o esponjas de colágeno, las cuales se impregnan de una solución del factor activo y se implantan con el fin de regenerar tejido óseo. Por este motivo, se decidió emplear Mucograft®, matriz de colágeno 3D, como control comercial frente a los hidrogeles de la invención, ambos con y sin carga proteica.
Se realizó el procedimiento quirúrgico descrito en el ejemplo 8, realizándose los estudios a las 5 y 9 semanas post-cirugía con posterior tratamiento histológico de las biopsias.
Para ello se activó el material Mucograft® con la misma cantidad de proteina que ios hidrogeles. Se cargó con 2.5 mg/ml de rhBMP-2 en AcOH 50 mM. La muestra se dejó secar y se mantuvo a 4° C hasta 15 minutos antes de su implantación. Adicionalmente al estudio histológico, se evaluó la presencia de tejido óseo de novo, producido por la liberación de la BMP-2 en el tejido muscular, mediante una técnica complementaria como es la microtomografla computerizada (μ-CT) Para la realización de esta técnica se empleó un Scaner PET/CT Albira ARS (GEM-IMGING; Oncovísion). El protocolo de adquisición fue de alta calidad (HR) a una resolución de 0,125 mm de tamaño de pixel, 45 kV/ 0,8 mA. El análisis de las imágenes se realizó con el programa Pmod 3.4, en ios tres planos del animal completo, mostrándose en esta memoria descriptiva solo el plano coronal.
En primer lugar, se presentan los resultados obtenidos gracias al empleo de la μ-CT. Se trata de una técnica de imagen, no invasiva, de uso frecuente en el ámbito hospitalario para el diagnóstico clínico de procesos patológicos. Dicha técnica nos permitió evaluar el seguimiento de la formación de tejido Óseo durante las semanas de estudio correspondientes sin tener que sacrificar el animal. Tal y como se aprecia en la Figura 10, donde se muestra ei corte coronal de las ratas, de ia zona del implante a ambos lados de la columna. En el lado derecho (LD) de cada corte, hay control sin proteina tanto dei hidrogel (H-C) como de Mucograft (M-C), en ninguno de los dos casos se observó en ningún corte presencia de tejido óseo (señal circular). En cambio, en el lado izquierdo (Li), en el que los injertos si incluían BMP-2, aparece la señal correspondiente a nuevo hueso. Cabe destacar en el caso de Mucograft con BMP-2 (M+BMP-2) cómo la señal aumenta en las primeras semanas (segunda y tercera) y cómo disminuye hasta casi su completa desaparición en la quinta semana. Esta evolución se debe al tipo de liberación de BMP-2 que tiene lugar. En un primer momento se aprecia una serial de gran volumen e intensidad debido al efecto burst, o liberación explosiva, es decir a una liberación descontrolada y masiva, asociada a numerosos efectos secundarios. En cambio, con los hidrogeles cargados con BMP-2 (H+BMP-2), ia señal que se obtiene en tiempos cortos es inferior pero incrementa en volumen e intensidad con el paso de las semanas y dicha señal se vuelve constante en el tiempo, es decir, no disminuye ni de intensidad ni de tamaño. Este hecho es indicativo de una liberación más controlada, sin el denominado efecto burst y más estable.
Los resultados a través de las tinciones de histología corroboran de nuevo la adecuada bíocompatibilidad de los hidrogeles, con y sin proteina BMP-2, en el tejido del hospedador. Además, se observa, gracias a la liberación de la BMP-2, la presencia de tejido óseo de novo comprobado tanto por las imágenes de μ-CT analizadas gracias al programa Pmod 34 (Figura 10) como por la tinciones de H/E (Figura 11 y 12).
En primer lugar, se observa la tinción de H/E de las muestras del control de Mucograft® con y sin BMP-2 (Figura 11). Como se aprecia en dicha imagen, en presencia de BMP-2 se observa tejido Óseo neoformado, rodeando médula ósea rica en células adiposas. En la imagen aumentada, se distingue la presencia de células redondas (osteocitos, Os) características del hueso (Figura 11-B). En cambio, el control de Mucograft sin proteína revela, simplemente, la presencia abundante de fibras de colágeno, con cierta diferenciación, muy ligera, hacia tejido Óseo (Figura 11-A). Sin embargo, en las muestras de hidrogel con BMP-2 (Figura 12-B), se observa una masa osea de gran tamaño (BM) y de color rojo intenso, característica de tejido óseo ectópico de mayor organización y más compacto en comparación con Mucograft® activado con BMP-2. Se aprecia la presencia de osteocitos rodeados de matriz Ósea densa en contacto directo con fragmentos de hídrogel. El hidrogel control, (Figura 12-A) se muestra rodeado de tejido conectivo, fibras de colágeno y fibras musculares, remarcando de nuevo su total biocompatibilidad con el tejido del hospedador. No se observaron signos de encapsuladón del hidrogel. Se observan numerosos fragmentos de hidrogel y, en la imagen aumentada, se aprecia la existencia de vasos sanguíneos (marcados por flechas negras).
A continuación se describen los resultados de la segunda parte experimental correspondiente a las 9 semanas post-cirugía.
Los resultados obtenidos por μ-CT hasta la semana 9 se muestran en la Figura 13, donde queda patente el comportamiento diferente de ambos soportes en la formación de tejido Óseo ectópico. En primer lugar, cabe mencionar la señal tan ligera que se observa con Mucograft® y BMP-2 en el lado izquierdo (Ll). Aunque se muestran solo las imágenes desde la quinta semana (ya que las anteriores han sido similares a las obtenidas en el experimento de las 5 semanas), se observa cómo la señal apenas se distingue del tejido muscular y esta es casi inapreciable al final del ensayo. En cambio, destaca la señal de gran intensidad y volumen que se ha obtenido al emplear hidrogeles con BMP-2 (H+BMP-2; Ll). Dicha señal aumentó y se mantuvo estable incluso hasta final del estudio, demostrando la formación de un tejido Óseo con mayor organización y complejidad, permaneciendo más tiempo en el mismo estado de madurez. Las imágenes de histología correspondientes a las 9 semanas se muestran en las Figuras 14 y 15. Se presentan en este caso las imágenes de la tinción TM ya que ésta es mis especifica de tejido óseo {aunque también se ha realizado H/E).
En la Figura 14-A, se puede observar la ausencia de una masa de fibras de colágeno correspondientes al control de Mucograft® tai y como se observé a las 5 semanas poscirugía. El control comercial sin proteína prácticamente se degrado por enzimas propias del tejido, ya que apenas se distinguen ciertas fibras de color verde intenso entre las fibras musculares. En cambio, cuando el soporte de Mucograft® presentaba BMP-2, se aprecié la presencia de tejido adiposo característico de la medula ósea; sin embargo, no se detecté presencia de tejido oseo ectópico, ni células propias de hueso, ni una matriz extracelular densa o compacta. Apenas una capa fina de fibras colágenas envuelvta el tejido adiposo, pero sin una diferenciación apreciable hacia linaje oseo. Por otro lado, en la Figura 15, se muestra el comportamiento de los hidrogeles de la invención. Sin proteína (Figura 15-A), se reconocieron algunos fragmentos de hidrogel de menor tamaño, en contacto directo con fibras de colágeno y fibras musculares. Sin embargo, en presencia de BMP-2 (Figura 15-B) ésta se liberé de tos hidrogeles y consiguió diferenciar las células musculares hacia linaje Óseo, llegándose a detectar matriz osea, abundantes fibras de colágeno e, incluso, la presencia de osteocitos. Además, destaco la gran cantidad de vasos sanguíneos que aparecieron en la muestra, los cuales son necesarios para mantener vivo el nuevo tejido formado.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Hidrogel bioactivo que comprende:
a) ai menos un polímero amónico,
b) al menos un agente reticulante eatiónico,
c) ai menos un glicosaminoglicano, y
d) ai menos dos proteínas, donde a) y b) son de origen natural y están entrecruzados por interacciones de tipo electrostático y donde una de las proteínas es un agente bioactivo del grupo de las proteínas morfogénicas óseas (BMP).
2. Hidrogel bioactivo según la reivindicación 1 en el que el polímero aniónico es goma gelano y/o goma arábiga
3. Hidrogel bioactivo según la reivindicación 2 en el que el polímero aniónico está a una concentración final de 3 a 1 mg/ml.
4. Hidrogel bioactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en el que el agente reticulante catiohico es esperrnidina y/o espermina.
5. Hidrogel bioactivo según la reivindicación 4 en el que el reticulante catiohico esta a una concentración final de entre 0,1 y 1,5 mg/ml.
6. Hidrogel bioactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en el que el glicosaminoglicano es condroitín sulfato, ácido hialurónico, y/o dermátán sulfato.
7, Hidrogel bioactivo según la reivindicación 6 en el que el glicosaminoglicano está a una concentración final de entre 0,5 y 5 mg/ml.
8. Hidrogel bioactivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que una de las proteínas es la albúmina.
9. Hidrogel bioactivo según la reivindicación 8 en el que la albúmina está a una concentración final de entre 5 y 10 mg/ml.
10. Hidrogel bioactivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la BMP se selecciona del grupo formado por: BMP2 en su forma homodiméríca (BMP2-BMP2) o en su forma heterodimérica (BMP2-BMP4, BMP2-BMP5, BMP2-BMP6, BMP2-BMP7, BMP2-BMP9, BMP2-BMP12).
11. Hidrogel bioactivo según la reivindicación 10 en el que la BMP está a una concentración final entre 0,1 y 0,5 mg/ml.
12. Método para elaborar hidrogeles bioactivos según se definen en las reivindicaciones 1-11 que comprende los siguientes pasos:
a) preparar una disolución acuosa de una protefna distinta a una BMP, b) añadir una disolución de BMP a la disolución acuosa del paso a), c) mezclar con una disolución acuosa de un reticulante catiónico.
d) verter la mezcla del paso c) sobre una solución acuosa de un polímero antónico con un glicosaminoglicano,
e) mezclar los componentes a 55-65°C aplicando agitación durante 2-10 segundos,
f) dejar el hidrogel a temperatura ambiente.
13. Método según la reivindicación 12 en el que la proteína del paso a) es la albúmina.
14. Método según la reivindicación 13 en el que la albúmina se añade a una concentración final de entre 5 y 10 mg/ml.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12-14 en el que la BMP del paso b) se selecciona del grupo formado por: BMP2 en su forma homodiméríca (BMP2-BMP2) o en su forma heterodimérica (BMP2-BMP4, BMP2-BMP5, BMP2-BMP6, BMP2-BMP7, BMP2-BMP9. BMP2-BMP12).
16. Método según la reivindicación 15 en el que la BMP se añade a una concentración final entre 0,1 y 0,5 mg/ml.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12-16 en el que el reticulante catiónico del paso c) es espermídina y/o espermina.
18. Método según la reivindicación 17 en el que el reticulante catiónico se añade a una concentración final entre 0,1 y 1,5 mg/ml.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12-18 en el que el polímero aniónico que se añade es goma gelano y/o goma arábiga.
20. Método según la reivindicación 19 en el que ei polímero aniónico se añade a una concentración final de 3 a 1 mg/ml.
21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12-19 en el que el glicosaminoglicano que se añade es condroitfn sulfato, ácido híalurónico y/o dermatán sulfato.
22. Método segln la reivindicación 21 en el que ei glicosaminoglicano se añade a una concentración final de entre 0,5 y 5 mg/ml.
23. Composición farmacéutica que comprende un hkJrogel bioactivo según se definen en las reivindicaciones 1-11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
24. Producto sanitario que comprende un hidrogel bioactivo según se definen en las reivindicaciones 1-11.
25. Uso de un hidrogel bioactivo según se definen en las reivindicaciones 1- 11 en la elaboración de una composición farmacéutica o de un producto sanitario.
26. Uso de un hidrogel bioactivo según se definen en las reivindicaciones 1- 11 en la elaboración de implantes poliméricos para regeneración Ósea y cartilaginosa.
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