WO2016200113A2 - 녹차 추출물에 의해 불화된 바이러스를 포함하는 백신 및 그의 제조방법 - Google Patents

녹차 추출물에 의해 불화된 바이러스를 포함하는 백신 및 그의 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention was made by the task number HI13C0826 under the support of the Ministry of Health and Welfare, the research and management institution of the task is Korea Health Industry Development Institute, the research project name is "infectious disease crisis technology development”, the research title is "immune vaccine-based technology development Center ”, the lead organization is Yonsei University Industry-Academic Cooperation Foundation, research period is 2013.06.24. -2018.06.23. to be.
  • the present invention relates to a vaccine comprising the virus inactivated by green tea extract and a method for producing the same.
  • Attenuated vaccines are vaccines that contain pathogenic but proliferative viruses and have the advantage of being able to cause cellular immune responses as well as humoral immune responses in administered individuals.
  • the attenuated vaccine contains proliferative viruses, pathogenicity may be restored by back mutation during circulation infection in the population, and it is difficult to maintain the infectivity of the microorganisms during storage and transport.
  • inactivated vaccines killed vaccines
  • the most commonly used inactivating agent for the production of inactivating vaccines is formaldehyde.
  • Formaldehyde is so toxic that 37% of formaldehyde 30 ml can kill an adult.
  • Formaldehyde is absorbed through inhalation, through the skin or eyes and can cause symptoms such as headaches, shortness of breath, and damage the respiratory system. Therefore, there is a possibility of hypersensitivity reactions and side effects due to residual formaldehyde when inoculated into the body inactivated vaccine using formaldehyde.
  • Green tea is produced from a plant called Camellia sinensis and is commonly used as a beverage or applied to diet foods or cosmetics (Cabrera, C. et al., Beneficial effects of green tea review.Journal of the American College of Nutrition 25, 79-99).
  • Green tea extract consists of several kinds of catechins, specifically, (-)-epigallocatechin (EGC: (-)-epigallocatechin), (-)-epicatechin gallate (ECG: (-)-epicatechin gallate) , (-)-Epigallocatechin gallate (EGCG: (-)-epigallocatechin gallate) and (-)-epicatechin (EC: (-)-epicatechin).
  • ECG epigallocatechin gallate
  • EGCG epigallocatechin gallate
  • a small molecule inhibitors virion attachment to heparan sulfate- or sialic acid-containing glycans.Journal of virology 88, 7806-7817), particularly in the influenza virus, inhibits the activity of neuraminidase and releases it after infection, proliferation and release in cells. It has been reported to exhibit viral effects (Song, JM et al., 2005. Antiviral effect of catechins in green tea on influenza virus. Antiviral research 68, 66-74). However, none of the green tea extracts have been used to inactivate viruses to produce vaccines.
  • the present inventors made diligent research efforts to solve the problems of chemical (eg, formaldehyde) based inactivation methods used in the preparation of inactivated virus vaccines. As a result, when the green tea extract was treated with the virus, the virus was completely inactivated and at the same time, the immunogenicity was maintained, and there was no toxicity and the defense ability against the virus was completed.
  • chemical eg, formaldehyde
  • a vaccine composition comprising a virus inactivated by green tea extract.
  • Another object of the present invention is the step of (a) adding and mixing the green tea extract to the proliferative virus; And (b) incubating the mixture of the virus and green tea extracts to provide a method of producing an inactivated virus vaccine comprising a.
  • Another object of the present invention to provide a method for preventing a viral infectious disease comprising administering the vaccine composition to a subject.
  • the present inventors made diligent research efforts to solve the problems of chemical (eg, formaldehyde) based inactivation methods used in the preparation of inactivated virus vaccines. As a result, when the green tea extract was treated with the virus, the virus was completely inactivated and maintained immunogenicity, and there was no toxicity, and the defense against the virus was also excellent.
  • chemical eg, formaldehyde
  • the present invention comprises the steps of i) a vaccine composition comprising a virus inactivated by green tea extract, ii) adding and mixing green tea extract to a proliferative virus; And incubating the mixture of virus and green tea extracts, and iii) a method of preventing a viral infectious disease comprising administering the vaccine composition to a subject.
  • the invention provides a vaccine composition comprising a virus inactivated by green tea extract.
  • the term “green tea extract” refers to a variety of extraction solvents, such as (a) water, (b) anhydrous or hydrous lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms (methanol, ethanol, propanol, butanol, etc.), (c) said A mixed solvent of a lower alcohol and water, (d) acetone, (e) ethyl acetate, (f) chloroform, (g) 1,3-butylene glycol and (h) butyl acetate can be obtained as an extraction solvent.
  • the green tea extract of the present invention is obtained by using water as an extraction solvent.
  • the green tea extract of the present invention includes several kinds of catechins, specifically, (-)-epigallocatechin (EGC: (-)-epigallocatechin), (-)-epicatechin gallate (ECG: (-)-epicatechin gallate), (-)-epigallocatechin gallate (EGCG: (-)-epigallocatechin gallate) and (-)-epicatechin (EC: (-)-epicatechin) Most specifically, (-)-epigallocatechin gallate (EGCG) includes (-)-epigallocatechin gallate (EGCG).
  • the green tea extract of the present invention may be obtained using ethanol as an extraction solvent, and according to a specific embodiment of the present invention, 70% ethanol may be obtained as an extraction solvent.
  • 70% ethanol may be obtained as an extraction solvent.
  • the term "extract" has a meaning commonly used as a crude extract in the art as described above, but also broadly includes a fraction additionally extracting the extract. That is, the green tea extract of the present invention includes not only one obtained by using the aforementioned extraction solvent, but also one obtained by additionally applying a purification process thereto. For example, fractions obtained by passing the extract through an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatography (manufactured for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), etc. The fraction obtained through the purification method is also included in the extract of the present invention.
  • the extract of the present invention includes those prepared in powder form by an additional process such as vacuum distillation and freeze drying or spray drying.
  • the term "vaccine” is used in its broadest sense to mean a composition that positively affects the subject's immune response.
  • the vaccine composition provides a subject with an enhanced systemic or local immune response induced by a cellular immune response, such as a Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) or humoral immune response, such as an antibody.
  • CTL Cytotoxic T Lymphocyte
  • humoral immune response such as an antibody.
  • the virus of the present invention is an enveloped virus or a non-enveloped virus.
  • Envelope viruses of the present invention are Foxviridae (such as Vaccinia and smallpox), Iridoviridae, Herpesviridae (such as herpes simplex, varicella virus, cytomegalovirus and Epstein-Barr).
  • Flaviviridae such as yellow fever virus, tick-borne encephalitis virus and hepatitis C virus
  • Togaviridae such as rubella virus and Sindbis virus
  • Coronaviridae such as human) Coronavirus (SARS Severe Respiratory Syndrome Virus), Infectious Bronchitis Virus (IBV)]
  • Paramyzoviridae such as parainfluenza virus, mumps virus, measles virus and respiratory syncytial virus
  • lob Rabdoviridae such as vesicle stomatitis virus and rabies bars Irus
  • Filoviridae such as Marburg virus and Ebola virus
  • Orthomyxoviridae such as influenza A and B viruses
  • Bunyaviridae such as Bwamba virus, California
  • Encephalitis virus sandfly fever virus and valley fever virus
  • Arenaviridae such as LCM virus, Lassa virus, Junin virus
  • Hepadnaviridae such as Hepatit
  • Non-enveloped viruses of the present invention include, but are not limited to, noroviruses, rotaviruses, adenoviruses, polio viruses, and reoviruses.
  • the virus of the invention is an enveloped virus.
  • the virus of the invention is an influenza virus.
  • Influenza viruses of the present invention include influenza viruses that can infect mammals or birds, for example, but are not limited to birds, humans, dogs, horses, pigs, cats and the like.
  • Influenza viruses of the present invention include the influenza virus itself and various influenza virus-derived antigens known in the art.
  • the antigen refers to an antigen component capable of causing an immune function among the components of the virus, and according to a specific embodiment of the present invention, a neucleoprotein (NP), hemagglutinin (HA: Hemagglutinin), and neuraminidase Agent (NA: neuraminidase) or a fragment thereof.
  • the influenza virus of the present invention is influenza A virus, influenza B virus or influenza C virus.
  • the influenza virus of the present invention is a type A influenza virus, A / H1N1, A / H3N2, A / H5N2, A / H9N2 virus.
  • the A / H1N1 virus of the present invention is A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virus, A / Chile / 1/83 (H1N1) A / NWS / 33, or A / Korea / 01/2009 (H1N1) virus.
  • the A / H3N2 virus of the present invention is A / Sydney / 5/97 (H3N2), and A / H5N2 is A / Aquatic bird / Korea / w81 / 05 (H5N2) / H9N2 is A / chicken / Korea / 310/01 (H9N2).
  • the influenza virus can cause flu, cold, sore throat, bronchitis or pneumonia in humans, and in particular can cause bird flu, swine flu or chlorine flu.
  • the virus of the invention is a corona virus.
  • the corona virus of the present invention includes a corona virus that infects animals such as mammals, birds, and the like, and causes diseases of the respiratory or gastrointestinal tract, and infects a host to reduce weight, runny nose, fever, cough, headache, diarrhea, and the like. May cause symptoms.
  • the corona virus is acute respiratory syndrome virus (SARS-CoV), Middle East Respiratory Syndrome Virus (MERS-CoV) infectious bronchitis virus (IBV), swine infectious gastroenteritis virus (TGE), swine epidemic diarrhea virus (PED), bovine corona Viruses (BCoV), cat / dog corona virus (FCoV / CCoV), mouse hepatitis virus (MHV), and the like.
  • the corona virus of the present invention is infectious bronchitis virus (IBV) strain M14, which spread in the world after spreading around the world since 2003 in Asia and caused nearly 800 deaths (SARS-).
  • the virus of the invention is a human papilloma virus.
  • Human papillomavirus of the present invention is a kind of virus that causes warts in humans, and there are about 100 or more kinds of infections, which can cause warts on the skin surface and cause warts on the hands, feet, and genital mucosa, and in women, may cause cervical cancer.
  • the HPV virus may specifically be of type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, more specifically It may be of type 16.
  • the virus of the invention is a norovirus.
  • Norovirus of the present invention causes severe nausea and vomiting, diarrhea, abdominal pain, chills, fever of about 38 °C in humans, and includes a Norwalk virus.
  • the green tea extract of the present invention binds to nucleoprotin or hemagglutinin of the influenza virus of the present invention. According to certain embodiments of the invention, the green tea extract of the present invention binds to the globular domain or stalk region of hemagglutinin of the influenza virus of the present invention. According to another embodiment of the present invention, the green tea extract of the present invention binds to the globular domain and stalk region of hemagglutinin of the virus of the present invention.
  • the green tea extract of the present invention binds to the coronavirus and human papillomavirus, norovirus of the present invention.
  • the protein sizes of infectious bronchitis virus, human papilloma virus, and norovirus are all increased (FIGS. 1E, 13, and 14).
  • the vaccine composition of the present invention comprises a virus inactivated by a pharmaceutically effective amount of the green tea extract of the present invention, wherein the green tea extract binds to the protein of the virus.
  • the vaccine composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically effective amount as used herein means an amount sufficient to achieve a prophylactic, alleviating or therapeutic effect against a disease or pathological condition caused by a virus.
  • compositions of the present invention are those commonly used in the formulation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, silicic acid Calcium, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils, and the like. It is not.
  • the composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and the like in addition to the above components.
  • the vaccine composition of the present invention may comprise other components such as stabilizers, excipients, other pharmaceutically acceptable compounds or any other antigen or portion thereof.
  • Vaccines may exist in the form of lyophilized formulations or suspensions, all of which are common in the field of vaccine production.
  • the dosage form of the vaccine composition of the present invention may be in the form of enteric skin use units, inoculation for intraperitoneal, intramuscular or subcutaneous administration, aerosol spray, oral or intranasal use. Administration in drinking water or edible pellets is also possible.
  • Vaccine compositions of the present invention may express heterologous antigens and immunomodulatory molecules such as cytokines in the same recombinants and deliver them into a single vaccine, as a "cocktail" comprising two or more viral vectors carrying different foreign genes or immunopotentiators. May be administered.
  • adjuvant generally refers to any substance that increases a humoral or cellular immune response to an antigen (eg, alum, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, LPS, poly IC). , poly AU, etc.).
  • an antigen eg, alum, Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, LPS, poly IC). , poly AU, etc.
  • the present invention comprises the steps of (a) adding and mixing the green tea extract to the proliferative virus; And (b) incubating the mixture of the virus and green tea extracts.
  • the inactivated virus vaccine of the present invention is a vaccine comprising a virus inactivated by the green tea extract, the green tea extract binds to the protein of the virus.
  • the inactivated virus of the present invention is an influenza virus of type A influenza virus, type B influenza virus or type C influenza virus.
  • the influenza virus of the present invention is a type A influenza virus, A / H1N1, A / H3N2, A / H5N2, A / H9N2 virus.
  • the A / H1N1 virus of the present invention is A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virus, A / Chile / 1/83 (H1N1) A / NWS / 33, or A / Korea / 01/2009 (H1N1) virus.
  • the A / H3N2 virus of the present invention is A / Sydney / 5/97 (H3N2), and A / H5N2 is A / Aquatic bird / Korea / w81 / 05 (H5N2) / H9N2 is A / chicken / Korea / 310/01 (H5N2).
  • the influenza virus and green tea extracts of the present invention are mixed at a ratio of 5x10 10 -5x10 3 PFU: 0.1-100 mg.
  • treatment of 0.1-1 mg / ml of green tea extract to 5 ⁇ 10 8 -5 ⁇ 10 7 PFU / ml of influenza virus reduced virus proliferation activity and hemagglutination activity, and 1 ⁇ 10 8-
  • 1 mg / ml of green tea extract was mixed in the same amount of 5x10 7 PFU / ml influenza virus, virus proliferation activity was completely inhibited, and 1 mg / ml of green tea extract was mixed in 5x10 7 PFU / ml influenza virus.
  • both viral proliferation activity and hemagglutination activity are completely inhibited (FIG. 2B).
  • said inactivated virus of the invention is a corona virus.
  • the corona virus includes a corona virus that can infect humans and birds, and includes infectious bronchitis virus, SARS virus, and MERS virus.
  • the corona virus is infectious bronchitis virus strain M14.
  • the corona virus and green tea extract of the present invention are mixed at a ratio of 10 10 -10 3 EID 50 : 0.1-100 mg.
  • 0.1-1 mg / ml green tea extract to 10 6.5 -5x10 5.5 EID 50 / ml of influenza virus, viral activity disappeared from the ureters collected after inoculation of the chicks. It can be confirmed that (Fig. 10).
  • said inactivated virus of the invention is a human papilloma virus.
  • Human papillomavirus is a kind of virus that induces warts in humans. There are about 100 or more kinds of infections.
  • the human papillomavirus is infected with the surface of the skin, causing warts on the hands, feet, and genital mucosa, and in women, cervical cancer.
  • the HPV virus may specifically be of type 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, more specifically It may be of type 16.
  • the inactivated virus of the invention is a norovirus.
  • the norovirus causes severe nausea and vomiting, diarrhea, abdominal pain, chills, fever of about 38 ° C. in humans, and includes a Norwalk virus.
  • the human papilloma virus and norovirus of the present invention can be seen that the viral protein is inactivated by binding to the green tea extract (Fig. 13, Fig. 14).
  • the method of the present invention is carried out incubation at a temperature of 15 °C or more after the step of mixing the virus and green tea extract.
  • the method of the present invention after the step of mixing the virus and green tea extract 15-50 °C, 20-50 °C, 25-50 °C, 30-50 °C, 33-50 °C, 35 -50 °C, 15-45 °C, 20-45 °C, 25-45 °C, 30-45 °C, 33-45 °C, 35-45 °C, 15-40 °C, 20-40 °C, 25-40 °C, 30 Incubate at -40 ° C, 33-40 ° C, 35-40 ° C, 15-38 ° C, 20-38 ° C, 25-38 ° C, 30-38 ° C, 33-38 ° C, 35-38 ° C or 35 ° C It is not limited to this.
  • the incubation of the present invention even if the temperature is lower than 20 °C lower the activity of the virus compared to the group not treated with green tea extract, so when carried out at a temperature of at least 15-20 °C range of room temperature as in the embodiment of the present invention
  • the proliferation of viruses can be suppressed to achieve the purpose of virus inactivation, and that the purpose of inactivation of the virus can be achieved even if carried out at a higher temperature.
  • the influenza virus was treated with green tea extracts and incubated at 20-35 ° C., resulting in decreased virus growth and hemagglutination activity, and at 35 ° C., proliferation activity and hemaggle of influenza virus. All of the rutination activity was completely suppressed, it can be seen that the activity of the corona virus also disappeared (Fig. 2a, Fig. 10).
  • the incubation of the present invention is carried out for 1 hour or more.
  • the incubation of the invention is 1-96 hours, 1-72 hours, 1-48 hours, 1-36 hours, 1-30 hours, 1-24 hours, 3-96 hours, 3 -72 hours, 3-48 hours, 3-36 hours, 3-30 hours, 3-24 hours, 6-96 hours, 6-72 hours, 6-48 hours, 6-36 hours, 6-30 hours, 6 If carried out for at least 24 hours, and at least 1 hour or more is carried out to suppress the growth of the virus as in the embodiment of the present invention can achieve the purpose of virus inactivation, even if carried out for a longer time the purpose of inactivating the virus Achievement is obvious to those skilled in the art.
  • the virus was treated with green tea extract and incubated at 35 ° C., and as a result of incubation, virus proliferation activity and hemagglutination activity began to decrease, and the green tea extract was treated with 1 mg / ml.
  • the virus proliferation activity and hemagglutination activity were completely inhibited only after 6 hours of incubation (FIG. 2C).
  • the invention may further comprise the step of adding an excipient (c) after the incubation step (b).
  • excipient means a lubricant, wetting agent, sweetener, flavoring agent, emulsifying agent, suspending agent, preservative, and adjuvant, in addition to the pharmaceutically acceptable carrier described above. Includes all excipients commonly used in the art.
  • the invention may further comprise the step of (d) filtration, sterilization, and dilution after adding the excipient of (c).
  • the filtration, sterilization, and dilution step may be incorporated into a filtration step to remove foreign substances contained in the composition comprising the virus inactivated by the green tea extract of the present invention, and in addition to the inactivated virus and excipients in the vaccine container.
  • Sterilizing microorganisms including viruses, bacteria, and fungi
  • diluting compositions comprising inactivated viruses to a pharmaceutically effective concentration, which are commonly used in the fields of vaccine manufacture of the present invention. All filtration, sterilization, and dilution methods can be used without limitation.
  • the present invention provides a method for preventing a viral infectious disease comprising administering the vaccine composition to a subject.
  • the viral infectious disease of the present invention is caused by an influenza virus, corona virus, human papilloma virus, or norovirus.
  • the method for preventing a viral infectious disease of the present invention relates to a method of using the above-described vaccine composition, descriptions of overlapping contents will be omitted in order to avoid excessive complexity of the description herein.
  • the present invention comprises the steps of i) a vaccine composition comprising a virus inactivated by green tea extract, ii) adding and mixing the green tea extract to a proliferative virus; And incubating the mixture of virus and green tea extracts, and iii) a method of preventing a viral infectious disease comprising administering the vaccine composition to a subject.
  • the green tea extract when the green tea extract is treated with a virus, it has an effect of inactivating the virus and maintaining excellent immunogenicity. Therefore, it is possible to prepare an inactivated vaccine by mixing the green tea extract and the proliferative virus according to the present invention, and when the vaccine composition prepared by the method of the present invention is administered to a subject, an immune response against the virus is induced. This can effectively prevent infectious diseases caused by the virus.
  • the green tea extract of the present invention is non-toxic and can be produced in a safe virus vaccine, unlike the chemical-based manufacturing process, the dialysis process is unnecessary, there is an advantage in the economic efficiency in the manufacturing process.
  • Figure 1a shows the result of analysis through SDS-PAGE after the reaction of the nucleoprotin of the A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virus with green tea extract.
  • Figure 1b-1d shows the result of analysis through SDS-PAGE after reacting the LysRS (Lysyl-tRNA synthetase) -HA fusion protein of the A / Korea / 01/2009 (H1N1) virus with green tea extract.
  • LysRS Lysyl-tRNA synthetase
  • Figure 1e shows the results of analysis by SDS-PAGE after reacting the hemagglutinin protein of A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virus with EGCG.
  • Figure 1f shows the result of analyzing the hemagglutinin protein reacted with EGCG through LCMS / MS.
  • Figure 2a shows the virus proliferation activity and hemagglutination activity when the virus (5x10 7 PFU / ml) was mixed in the same amount with green tea extract (1 mg / ml) and incubated according to the temperature.
  • Figure 2b shows the virus proliferation activity and hemagglutination activity when incubated by mixing the same concentration of various concentrations of virus (5x10 7 , 1x10 8 and 5x10 8 PFU / ml) and green tea extract (1 mg / ml).
  • Figure 2c shows the virus proliferation activity and hemagglutination activity when the virus (5x10 7 PFU / ml) and incubated by mixing the same amount with various concentrations of green tea extract (0.1, 0.5 and 1 mg / ml).
  • the dotted line indicates the detection limit, the detection limit of the virus proliferation activity experiment was 5 PFU / ml, and the detection limit of the hemagglutination activity experiment was 2 HAU / ml.
  • Figure 3a shows the results of plaque analysis conducted to confirm that the virus is completely inactivated.
  • Figure 3b shows the results confirming that GT-V has lost the ability to infect chicks.
  • FIG. 4A shows the toxicity test results of GT-V.
  • Figure 4b shows the results of the toxicity test of green tea extract.
  • Figure 5a shows the hemagglutination inhibition test (HI test) results of GT-V.
  • 5B shows the result of virus neutralization test (VNT) of GT-V.
  • the dotted line indicates the detection limit, the detection limit of the HI assay is 8 (HI titer), and the detection limit of the neutralization assay is 20 (NT titer).
  • Figure 6 shows the results of the defense analysis of GT-V through challenge vaccination.
  • Figure 7 shows the result of confirming the infection virus proliferation in the lung of mice immunized with GT-V.
  • the dashed line represents the detection limit of 50 PFU / ml.
  • Figure 9 shows the results of the analysis by infecting bronchitis virus (IBV) strain M41 with green tea extract SDS-PAGE and Western blot.
  • IBV bronchitis virus
  • FIG. 11 shows the results of the analysis of IgG antibodies in the serum of mice immunized with GT-IBV.
  • Figure 12a is a result of confirming the neutralizing antibody of mouse serum collected at 2 weeks after GT-IBV inoculation by DIB (Dot-immunoblot assay).
  • Figure 12b is the result of confirming the neutralizing antibodies of mouse serum collected at 6 weeks after GT-IBV inoculation by DIB.
  • Figure 13 shows the result of analysis through SDS-PAGE after the reaction of hRBD-L1 fusion protein of human papillomavirus with green tea extract.
  • Figure 14 shows the result of analysis through SDS-PAGE after the reaction of hRBD-NoV VP1 fusion protein of norovirus with green tea extract.
  • MDCK Madck-Darby Canine Kidney
  • Vero cells were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC), and the cells were treated with 10% FBS (fetal bovine serum, HyClone, USA) MEM (minimal essential medium, HyClone, USA) medium. Incubated under 5% CO 2 , 37 ° C.
  • FBS fetal bovine serum, HyClone, USA
  • MEM minimal essential medium, HyClone, USA
  • a / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virus was inoculated into 11-day-old SPF (specific pathogen free) embryos and grown in a 37 ° C incubator for 2 days, followed by collecting allantoic fluid to remove impurities. It was stored in a freezing facility at minus 80 °C.
  • IBV strain M41 Infectious bronchitis virus (IBV) strain M41 was inoculated in 11-day-old SPF (specific pathogen free) embryos and grown in a 37 ° C incubator for 2 days, followed by collection of allantoic fluid to remove impurities. It was stored in a freezing facility at minus 80 °C.
  • SPF specific pathogen free
  • HPV Human papillomavirus
  • HPV 16L1 L1 protein
  • VLP type 16 virus-like particle
  • Norovirus used VP1 (NoV VP1), a structural protein of the Hu / GII.4 / Hiroshima / 55/2005 / JPN strain.
  • Green tea extract was purified using a 0.2 ⁇ m syringe filter after dissolving powdered green tea (green tea 100%, AMOREPACIFIC, South Korea) in tertiary distilled water.
  • EGCG (EGCG 98%, Changsha Sunfull Bio-tech, China) was dissolved in tertiary distilled water and purified using a 0.2 ⁇ m syringe filter.
  • nucleoprotin (NP) of A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virus was reacted with green tea extract and analyzed through SDS-PAGE. It was.
  • nucleic acid sequence encoding the nucleoprotin was inserted into the pGE-LysRS (3) vector and expressed in E. coli , followed by separation and purification using nickel chromatography.
  • 1 ⁇ g / 10 ⁇ l of purified nucleoprotin was reacted with 10, 100 and 1000 ⁇ g / 10 ⁇ l of green tea extract for 6 hours at room temperature.
  • electrophoresis was performed by loading nucleoprotin treated with green tea extract on a 10% PAGE gel (gel) and staining the gel with Coomassie-blue to confirm stained protein bands.
  • LysRS Lysyl-tRNA synthetase
  • the nucleic acid sequence encoding the LysRS-HA fusion protein was inserted into the pGE-LysRS (3) vector, expressed in E. coli , and isolated and purified using nickel chromatography.
  • the LysRS-HA fusion protein is composed of the HA globula domain (Globular domain, LysRS-HA GD) and HA stalk region (Stalk region, LysRS-HA Stalk), which are the head of hemagglutinin, and the entire HA. (LysRS-HA Full) It can have three different structures.
  • LysRS-HA Full, LysRS-HA GD, and LysRS-HA Stalk fusion proteins were treated with TEV protease (TEV protease, Invitrogen, USA) to cut LysRS, and then LysRS-HA Full, LysRS-HA GD, and LysRS- 1 ⁇ g / 10 ⁇ l of HA Stalk fusion protein was reacted with 10, 100 and 1000 ⁇ g / 10 ⁇ l of green tea extract for 6 hours at room temperature. Subsequently, electrophoresis was performed by loading onto a 10% PAGE gel, and staining the gel with Coomassie-blue confirmed the stained protein bands.
  • TEV protease TEV protease
  • Hemagglutinin (HA: hemagglutinin) of the A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virus was reacted with EGCG and analyzed via SDS-PAGE.
  • Hemagglutinin was expressed in human cells. 2 ⁇ g / 10 ⁇ l of hemagglutinin was reacted with 100 ⁇ g / 10 ⁇ l of EGCG for 2 hours at room temperature. Then, electrophoresis was performed by loading hemagglutinin treated with EGCG on a 10% PAGE gel, and staining the gel with Coomassie-blue confirmed the stained protein bands.
  • the EGCG according to the present invention binds to the hemagglutinin protein of the influenza virus (FIG. 1E).
  • LCMS / MS liquid chromatography mass spectrometry
  • virus 5x10 7 PFU / ml
  • green tea extract (1 mg / ml) in the same amount
  • the water bath at 20, 25, 30 and 35 ° C., respectively. Reaction was carried out for 24 hours.
  • the mixed solution was inoculated into 12-well plates in which MDCK cells were cultured, and virus titers were confirmed by plaque assay.
  • the virus proliferation activity was reduced by about 3 log 10 PFU / ml with increasing temperature, it was confirmed that all of the virus growth is inhibited at 35 °C.
  • Hemagglutination activity decreased with temperature, and it was confirmed that all hemagglutination activity was suppressed in the case of 35 ° C (FIG. 2A).
  • the virus was effectively mixed in the same amount by mixing the various titers of virus (5x10 7 , 1x10 8 and 5x10 8 PFU / ml) and green tea extract (1 mg / ml) in the same amount.
  • the reaction was carried out in a constant temperature bath at 35 ° C. for 24 hours.
  • the mixed solution was inoculated into 12-well plates in which MDCK cells were cultured to confirm virus titer through plaque analysis.
  • the virus proliferation activity increased as the titer of the inoculated virus increased, and the virus proliferation activity was inhibited at the titers of 1x10 8 PFU / ml and 5x10 7 PFU / ml. It was confirmed that the hemagglutination activity decreased according to the concentration and all hemagglutination activity was inhibited at the titer of 5 ⁇ 10 7 PFU / ml (FIG. 2B).
  • virus 5x10 7 PFU / ml and various concentrations of green tea extract (0.1, 0.5 and 1 mg / ml) was mixed in the same amount, the virus growth over time while reacting at 35 °C for 24 hours Growth Kinetics were identified.
  • the mixed solution was inoculated into 12-well plates in which MDCK cells were cultured to confirm the titer through plaque analysis. As a result, it was confirmed that the virus proliferation activity decreased with concentration and time, and in the case of the green tea extract 1 mg / ml all virus proliferation activity was inhibited in 6 hours.
  • a / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virus 5x10 7 PFU / ml and 1 mg / ml of green tea extract were mixed in equal amounts and reacted at 35 ° C. for 24 hours to treat green tea extract.
  • Influenza inactivating vaccine (GT-V) was prepared. Plaque assays were performed by inoculating MDCK cells to confirm that the virus was completely inactivated. As a result, no plaque was produced, confirming that the activity of the virus disappeared (FIG. 3A). For more certain verification, the prepared GT-V stock solution was inoculated into 11-day-old fetuses and incubated at 37 ° C.
  • GT-V Green tea
  • GT 25.0 ⁇ g-V 1.25x10 6 PFU GT 50.0 ⁇ g-V 2.50 ⁇ 10 6 PFU
  • PBS PBS
  • mice per group were intraperitoneally inoculated (100 ⁇ l) with 0.05, 0.1, 1 mg and PBS of green tea extract, respectively.
  • the weight loss change and survival rate of the mice were confirmed for 14 days.
  • the concentration of the highest green tea extract was 0.05 mg, and it was confirmed that no toxicity was observed even when 1 mg, which was 20 times higher, was administered to the mice (FIG. 4B).
  • GT-V immunogenicity and protective capacity of GT-V
  • mice per group were treated with various concentrations of GT-V (GT 12.5 ⁇ g-V 6.25x10 5 PFU, GT 25.0 ⁇ g-V 1.25x10 6 PFU, GT 50.0 100 ⁇ l of an alum, 100 ⁇ l of ⁇ g-V 2.50 ⁇ 10 6 PFU), was intraperitoneally administered (100 ⁇ l / mice), followed by further inoculation at the same concentration two weeks later.
  • the change in the weight of the mice was observed daily for 2 weeks after the inoculation, and blood was collected after the first 2, 4 and 6 weeks of inoculation, and only serum was collected through centrifugation and used for immunogenicity analysis.
  • hemagglutination inhibition (HI) analysis was performed.
  • the serum was treated with receptor destroying enzyme and was inactivated by applying heat at 56 ° C. for 1 hour, and then serum was serially diluted 2-fold with PBS in 96-well plates by 25 ⁇ l.
  • 4 HAU / 25 ⁇ l of the same wild-type A / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virus were added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • 50 ⁇ l of 1% chicken erythrocytes cRBC, chicken RBC
  • HI titer was not found at the lowest inoculation concentration at 2 weeks, but the antibody titer was significantly increased after booster vaccination, and thus, it was confirmed that the HI titer was induced by parking and concentration.
  • HI antibody titer showed the highest value at 6 weeks, from which it was confirmed that the immune-induced response by GT-V of the present invention is maintained for a long time more than 6 weeks (Fig. 5a).
  • VNT virus neutralization test
  • the neutralizing antibody titer (NT titer) was hardly increased at 2 weeks after the initial inoculation, but was significantly increased after boosting, and it was confirmed that the immune response was maintained by increasing slightly at 6 weeks (FIG. 5B). ).
  • mice inoculated with GT-V with GT 12.5 ⁇ g-V 6.25 ⁇ 10 5 PFU, GT 25.0 ⁇ g-V 1.25 ⁇ 10 6 PFU, GT 50.0 ⁇ g-V 2.50 ⁇ 10 6 PFU were further inoculated in the same amount after 2 weeks.
  • a / Puerto Rico / 8/34 (H1N1) virus was challenged intranasally with 10 4 PFU / 50 ⁇ l, 10 times the concentration of 10% (10 MLD 50 ) of 50% mortality, and 2 after challenge. Changes in body weight and survival were observed during the week.
  • mice vaccinated with GT-V showed about 10% weight loss until 6 days after challenge but recovered afterwards, and control group without GT-V was rapidly reduced in weight after 6 weeks of challenge. All died on the primary. In the case of survival rate, regardless of the concentration of GT-V inoculated, all survived even in the group inoculated with GT-V at the lowest concentration, showing a 100% survival rate (FIG. 6).
  • mice were inoculated up to 2 times with GT-V as in the above example and after 4 weeks A / Puerto Rico / 8/34 ( H1N1) virus was challenged intranasally with 10 MLD 50 (10 4 PFU / 50 ⁇ l) and 2, 4 and 6 days later, mice were sacrificed to recover lungs. The collected lungs were put into 500 ml of PBS, ground, and centrifuged to separate only the supernatant. The isolated supernatants were inoculated into MDCK cells to confirm the titer of the virus present in the lungs of mice through plaque analysis.
  • the infectious virus identified in the lungs of mice vaccinated with GT-V was about 10 3 fold lower than in mice not vaccinated. This value appeared not only 6 days after inoculation but also 2 and 4 days, and did not completely inhibit the replication of the virus, but it was confirmed to have a sufficiently low inhibition value (FIG. 7).
  • GT-V of the present invention is not necessary for the dialysis process, it can be seen that the economic efficiency in the vaccine production.
  • infectious bronchitis virus (IBV) strain M41 was reacted with green tea extract and analyzed through SDS-PAGE. 100 ⁇ l of virus (10 6.5 EID 50 / ml) was reacted with 100 ⁇ l of green tea extract (10 mg / ml) for 2 hours at room temperature. Thereafter, 8% PAGE gel was loaded and subjected to electrophoresis. Thereafter, the gel was stained with Coomassie-blue to confirm the stained protein bands, and western blot was performed at the same time.
  • IBV infectious bronchitis virus
  • the protein band in the gel was transferred to a Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane through transfer and blocked with 5% skim milk to wash non-specific reactions and then washed with TBST.
  • Serum from mice inoculated with IBV was diluted 1: 1000 and used as a primary antibody on the membrane.
  • HRP conjugated anti-mouse IgG conjugated with HRP (Horseradish peroxidase) enzyme was diluted 1: 10000 and treated with a secondary antibody (secondary antibody) on the membrane.
  • WEST-ZOL plus Western Blot Detection System iNtRON, Korea
  • the green tea extract according to the present invention was confirmed to bind to the corona virus protein (Fig. 9).
  • Infectious bronchitis virus (IBV) strain M41 10 6.5 EID 50 / ml and 1 mg / ml of green tea extract were mixed in equal amounts and reacted for 24 hours at 35 ° C to treat green tea extract corona inactivated vaccine (GT -IBV) was prepared.
  • GT -IBV stock solution was inoculated into 11-day-old fetuses, incubated at 37 ° C for 2 days, and the urinary fluid was collected and virus residual analysis was performed by a dot-immunoblot assay (DIB) Was performed.
  • nitrocellulose paper nitrocellulose paper
  • BSA bovine serum albumin
  • the serum of mice inoculated with IBV was diluted 1: 1000 and reacted at 37 ° C for 30 minutes.
  • biotinylated anti-mouse IgG Biotinylated anti-mouse IgG
  • ABC kit Biotin and avidin-conjugated peroxidase complex
  • GT-IBV In order to confirm the immunogenicity of GT-IBV of the present invention, four mice per group were treated with various concentrations of GT-V (GT 12.5 ⁇ g-IBV 1.25x10 4.5 EID 50 , GT 25.0 ⁇ g-IBV 2.50x10 4.5 EID 50 , And 100 ⁇ l of GT 50.0 ⁇ g-V 5.0 ⁇ 10 4.5 EID 50 ) and 100 ⁇ l of alum, an immunopotentiator, were intraperitoneally administered. Two weeks later, the cells were boosted at the same concentration. Two and six weeks after the first inoculation, blood was collected and collected for serum immunoassay by centrifugation.
  • GT-V GT 12.5 ⁇ g-IBV 1.25x10 4.5 EID 50
  • GT 25.0 ⁇ g-IBV 2.50x10 4.5 EID 50 And 100 ⁇ l of GT 50.0 ⁇ g-V 5.0 ⁇ 10 4.5 EID 50
  • alum an immunopotentiator
  • mice serum inoculated with GT-V of the present invention was initially diluted 1: 200 and then subdivided twice in 100 ⁇ l / well into 96 wells and treated at room temperature for 1 hour.
  • HRP-conjugated anti-mouse IgG (Mab) was diluted 1: 1000 and treated at 100 ⁇ l / well for 1 hour at room temperature. After washing in the same manner, the TMB solution was treated with 100 ⁇ l / well at room temperature for 30 minutes. The reaction was stopped by treatment with 2N H 2 SO 4 and analyzed at 450 nm with a spectrophotometer.
  • VNT virus neutralization test
  • 100 ⁇ l of IBV strain M41 at 10 2 EID 50 / ml was applied to GT 12.5 ⁇ g-IBV 1.25x10 4.5 EID 50 , GT 25.0 ⁇ g-IBV 2.50x10 4.5 EID 50 , GT 50.0 ⁇ g-V 5.0x10 4.5 EID 50 A pulled from mice 2 weeks and 6 weeks inoculation serum (10 - 3, 10 - 4 , 10 -5 dilution) to the reaction at 37 °C for 100 ⁇ l and one hour, three to each mixture to 11 days of age each fetus based Inoculation was incubated at 37 ° C. for 3 days. Subsequently, the urea solution of the fetus was collected and subjected to a dot-immunoblot assay (DIB) in the same manner as the neutral
  • DIB dot-immunoblot assay
  • L1 protein HPV 16L1
  • HPV human papillomavirus
  • TEV protease TEV protease, Invitrogen, USA
  • the low concentration did not show a large change, but when reacted with the green tea extract 1000 ⁇ g / 10 ⁇ l, it was confirmed that the band size was increased by the molecular weight of the L1 protein due to the binding of the protein and the green tea extract. Therefore, it was confirmed that the green tea extract according to the present invention is bound to the HPV protein which is a non-influenza virus (FIG. 13).
  • VP1 NoV VP1
  • Norovirus a structural protein of Norovirus (Norovirus, NoV, Hu / GII.4 / Hiroshima / 55/2005 / JPN)
  • hRBD a structural protein of Norovirus
  • the hRBD-NoV VP1 fusion protein of norovirus cut the hRBD by treatment with TEV protease (TEV protease, Invitrogen, USA).
  • the low concentration did not show a large change, but when reacted with the green tea extract 1000 ⁇ g / 10 ⁇ l, it was confirmed that the band size was increased by the molecular weight of the VP1 protein due to the binding of the protein and the green tea extract. Therefore, it was confirmed that the green tea extract according to the present invention binds to the non-influenza virus norovirus protein (FIG. 14).

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Abstract

본 발명은 녹차 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 백신 조성물, 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 녹차 추출물을 바이러스에 처리하는 경우 바이러스를 불활화 시킴과 동시에 면역원성을 우수하게 유지하는 효과가 있으므로, 본 발명에 따른 녹차 추출물과 증식력이 있는 바이러스를 혼합하여 불활화 백신의 제조가 가능하고, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 백신 조성물을 대상체에 투여할 경우 해당 바이러스에 대한 면역반응이 유발되어 해당 바이러스에 의한 전염성 질환을 효과적으로 예방할 수 있다. 또한, 본 발명의 녹차 추출물은 독성이 없어 안전한 바이러스 백신의 제조가 가능하고, 화학물질 기반 제조과정과는 달리 투석과정이 불필요하여 제조 공정에 있어 경제성이 우수하다는 이점이 있다.

Description

녹차 추출물에 의해 불화된 바이러스를 포함하는 백신 및 그의 제조방법
본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 HI13C0826에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진흥원, 연구사업명은 “ 감염병위기대응기술개발”, 연구과제명은 “면역백신기반기술개발센터”, 주관기관은 연세대학교 산학협력단, 연구기간은 2013.06.24. - 2018.06.23. 이다.
본 특허출원은 2015년 6월 11일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0082653호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 녹차 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 백신 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
약독화 백신(attenuated vaccine; live vaccine)은 병원성은 약하지만 증식력이 있는 바이러스를 포함하는 백신으로, 투여한 개체에서 체액성 면역반응뿐만 아니라 세포성 면역반응을 일으킬 수 있다는 장점이 있다. 그러나, 약독화 백신은 증식력이 있는 바이러스를 포함하기 때문에 집단 내 순환감염되면서 역돌연변이(back mutation)에 의해 병원성이 회복될 가능성이 있고, 보관 및 이동 중에 미생물의 감염성을 유지하기가 어려운 단점이 있다. 반면, 불활화 백신(inactivated vaccine; killed vaccine)은 죽은 바이러스이기 때문에 병원성의 회복이 나타날 수 없으며, 살아있는 미생물의 혼입이 일어나지 않으므로 약독화 백신보다 안전성이 높고(Bardiya, N. 등, 2005. Influenza vaccines: recent advances in production technologies. Applied microbiology and biotechnology 67, 299-305) 증식력이 있는 바이러스에 열, 자외선, 포르말린(포름알데하이드), BEI(Bianry Ethyleneimine) 및 베타-프로피오락톤 등을 처리하여 생산하므로(Goldstein MA 등, Effect of formalin, beta-propiolactone, merthiolate, and ultraviolet light upon influenza virus infectivity chicken cell agglutination, hemagglutination, and antigenicity. Appl Microbiol. 1970 Feb;19(2):290-4) 개발기간이 비교적 짧고 대량 생산시 효율이 높기 때문에 매우 경제적이어서 최근까지도 지속적인 개발이 이루어지고 있다.
불활화 백신의 생산을 위해 가장 일반적으로 사용되는 불활화제제는 포름알데하이드이다. 포름알데하이드는 독성이 매우 강하여 37%의 포름알데하이드 30 ml는 성인을 죽음에 이르게 할 수 있을 정도이다. 포름알데하이드는 들숨이나 피부 또는 눈을 통해 흡수되며, 두통, 호흡곤란 등의 증상을 유발하고 호흡기에 손상을 줄 수 있다. 따라서, 포름알데하이드를 이용한 불활화 백신을 우리 몸에 접종할 경우 잔류 포름알데하이드에 의한 과민반응 및 부작용의 가능성이 있다.
또한, 포름알데하이드는 바이러스를 쉽게 불활화할 수 있고 바이러스의 단백질이 고정되어 투여된 개체 내에서 면역반응도 비교적 잘 일어나지만, 폴리오바이러스(poliovirus)의 경우는 포름알데하이드를 처리하는 과정에서 부분적으로 항원(antigen) 구조에 변형이 나타나는 것으로 알려져 있어(Ferguson,M. 등, 1993. Antigenic structure of poliovirus in inactivated vaccines. The Journal of general virology 74(Pt 4), 685-690002E) 효과적인 면역반응이 일어나지 않을 가능성이 있다. 호흡기 세포융합 바이러스(RSV: respiratory syncytial virus) 또는 홍역(measles) 바이러스에 감염된 개체들 중에는 백신을 접종받지 않은 개체보다 포름알데하이드로 불활화한 백신을 접종받은 개체들의 증상이 매우 심하게 나타나는 사례가 종종 있다. 이는 백신의 접종으로 인해 바이러스에 대한 민감도가 증가된 것인데 이것은 백신접종 후 체내에 잔류하는 포름알데하이드와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. Moghaddam,A. 등에 따르면, 포르말린-불활화 RSV를 접종한 마우스에서 TH2 반응이 증가하고, IL-4 및 IL-5가 강하게 유도된다는 결과가 나타난다고 한다(2006. A potential molecular mechanism for hypersensitivity caused by formalin-inactivated vaccines. Nature medicine 12, 905-907, Openshaw,P.J. 등, 2001.Immunopathogenesis of vaccine-enhanced RSV disease. Vaccine 20 Suppl 1, S27-31). 또한, 포름알데하이드-불활화 백신의 생산시, 포름알데하이드는 불활화 과정 이후에 투석을 통해 제거되어야만 하므로(Furuya, Y. 등, 2010. Effect of inactivation method on the cross-protective immunity induced by whole 'killed' influenza A viruses and commercial vaccine preparations. Journal of General Virology 91, 1450-1460. Andrew, S. M. 등, 2001. Dialysis and concentration of protein solutions. Current protocols in immunology / edited by John E. Coligan. [et al.], Appendix 3H) 바이러스 정제, 불활화 외에 투석으로 인한 추가 생산비용이 많이 발생하는 문제도 발생한다. 이에 따라, 포름알데하이드를 대체할 수 있는 새로운 불활화제제 개발의 필요성이 제기되었다.
본 발명자들은 바이러스를 불활화 시키기 위해 녹차 추출물을 선택하였다. 녹차는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)라는 식물에서 생산되며, 흔히 음료로 음용되거나 다이어트 식품 또는 화장품에 응용된다(Cabrera,C. 등, Beneficial effects of green tea review. Journal of the American College of Nutrition 25, 79-99). 녹차의 추출물은 여러 종류의 카테킨으로 구성되어있는데, 구체적으로 (-)-에피갈로카테킨(EGC: (-)-epigallocatechin), (-)-에피카테킨 갈레이트(ECG: (-)-epicatechin gallate), (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG: (-)-epigallocatechin gallate) 및 (-)-에피카테킨(EC: (-)-epicatechin)으로 이루어져있다. 이중 주요한 카테킨인 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG)는 몇 종류의 바이러스에 대하여 세포내 침입을 저해하고, 바이러스의 세포 부착을 저해하는 것으로 알려져 있으며(Colpitts,C.C. 등, 2014. A small molecule inhibits virion attachment to heparan sulfate- or sialic acid-containing glycans. Journal of virology 88, 7806-7817), 특히 인플루엔자 바이러스에서 뉴라미니데이즈의 활성을 저해시키고 세포에서 감염, 증식된 후 방출하는 과정(release step)에서 항바이러스 효과를 나타내는 것으로 보고되어 있다(Song, J.M. 등, 2005. Antiviral effect of catechins in green tea on influenza virus. Antiviral research 68, 66-74). 그러나 아직까지 녹차 추출물을 바이러스 불활화에 사용하여 백신을 제조하기에 이른 경우는 전무하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 불활화 바이러스 백신 제조에 있어 기존에 사용되는 화학물질(예컨대, 포름알데하이드) 기반 불활화 방법의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이러스에 녹차 추출물을 처리하는 경우 상기 바이러스가 완벽하게 불활화됨과 동시에 면역원성을 유지하고, 독성이 없으며 바이러스에 대한 방어 능력 역시 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 녹차 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 증식력이 있는 바이러스에 녹차 추출물을 첨가하고 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 바이러스 및 녹차 추출물의 혼합물을 인큐베이션하는 단계:를 포함하는 불활화 바이러스 백신의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 백신 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 전염성 질환의 예방방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 불활화 바이러스 백신 제조에 있어 기존에 사용되는 화학물질(예컨대, 포름알데하이드) 기반 불활화 방법의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이러스에 녹차 추출물을 처리하는 경우 상기 바이러스가 완벽하게 불활화됨과 동시에 면역원성을 유지하고, 독성이 없으며 바이러스에 대한 방어 능력 역시 우수함을 확인하였다.
따라서 본 발명은 i) 녹차 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 백신 조성물, ii) 증식력이 있는 바이러스에 녹차 추출물을 첨가하고 혼합하는 단계; 및 상기 바이러스 및 녹차 추출물의 혼합물을 인큐베이션하는 단계:를 포함하는 불활화 바이러스 백신의 제조방법, 및 iii) 상기 백신 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 전염성 질환의 예방방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 녹차 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 명세서의 용어, "녹차 추출물"은 다양한 추출 용매, 예를 들어 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 부틸 아세테이트를 추출 용매로 하여 얻을 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 녹차 추출물은 물을 추출용매로 하여 얻어진 것이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 녹차 추출물은 여러 종류의 카테킨을 포함하며, 구체적으로 (-)-에피갈로카테킨(EGC: (-)-epigallocatechin), (-)-에피카테킨 갈레이트(ECG: (-)-epicatechin gallate), (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG: (-)-epigallocatechin gallate) 및 (-)-에피카테킨(EC: (-)-epicatechin)을 포함하며, 가장 구체적으로는 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG: (-)-epigallocatechin gallate)를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면 본 발명의 녹차 추출물은 에탄올을 추출 용매로 하여 얻어질 수 있고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면 70% 에탄올을 추출 용매로 하여 얻을 수 있다. 한편, 본 발명의 추출물은 상기 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
본 명세서의 용어 “추출물”은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉 본 발명의 녹차 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다. 또한 본 발명의 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조된 것을 포함한다.
본 명세서의 용어, "백신"은 대상(subject)의 면역 반응에 긍정적으로 영향을 주는 조성물을 의미하는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 백신 조성물은 대상에게 세포성 면역 반응, 예를 들어 CTL(Cytotoxic T Lymphocyte) 또는 체액성 면역 반응, 예를 들어 항체에 의해 유발되는 향상된 전신적 또는 국소적 면역 반응을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 외피 바이러스(enveloped virus) 또는 비-외피 바이러스(non-enveloped virus)이다. 본 발명의 외피 바이러스는 폭스 비리다애(Poxviridae, 예컨대 백시니아(Vaccinia) 및 천연두), 이리도비리다애(Iridoviridae), 헤르페스비리다애(Herpesviridae, 예컨대 단순포진, 바리셀라 바이러스, 사이토메갈로바이러스 및 엡스타인-바 바이러스), 플라비비리다애(Flaviviridae, 예컨대 황열 바이러스, 틱-본 뇌염 바이러스 및 C형 간염 바이러스), 토가바리다애(Togaviridae, 예컨대 풍진 바이러스 및 신드비스 바이러스), 코로나비리다애[Coronaviridae, 예컨대 인간 코로나바이러스(SARS 중증급성호흡기증후군 바이러스), 닭 전염성 기관지염 바이러스(Infectious Bronchitis Virus, IBV)], 파라믹소비리다애(Paramyxoviridae, 예컨대 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스 및 호흡기 세포융합 바이러스), 랍도비리다애(Rabdoviridae, 예컨대 소포 구내염 바이러스 및 광견병 바이러스), 필로비리다애(Filoviridae, 예컨대 마버그 바이러스 및 에볼라 바이러스), 오르토믹소비리다애(Orthomyxoviridae, 예컨대 인플루엔자 A 및 B 바이러스), 버니아비리다애(Bunyaviridae, 예컨대 브왐바(Bwamba) 바이러스, 캘리포니아 뇌염 바이러스, 샌드플라이 열 바이러스 및 계곡열 바이러스), 아레나비리다애(Arenaviridae, 예컨대 LCM 바이러스, 라사 바이러스, 주닌 바이러스), 헤파드나비리다애(Hepadnaviridae, 예컨대 B형 간염 바이러스), 및 레트로비리다애(Retroviridae, 예컨대 HTLV 및 HIV)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 비-외피 바이러스는 노로 바이러스, 로타 바이러스, 아데노 바이러스, 폴리오 바이러스, 및 레오 바이러스(Reovirus)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 외피 바이러스이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 포유동물 또는 조류에 감염할 수 있는 인플루엔자 바이러스를 포함하며, 예를 들어 조류, 사람, 개, 말, 돼지, 고양이 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 자체 및 종래 공지된 다양한 인플루엔자 바이러스-유래 항원을 포함한다. 상기 항원은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분을 말하며, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 뉴클레오프로틴(NP: neucleoprotein), 헤마글루티닌(HA: Hemagglutinin), 뉴라미니다제(NA: neuraminidase) 또는 이들의 단편이다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스 또는 C형 인플루엔자 바이러스이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스로 A/H1N1, A/H3N2, A/H5N2, A/H9N2 바이러스이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 A/H1N1 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스, A/Chile/1/83(H1N1) A/NWS/33, 또는 A/Korea/01/2009(H1N1) 바이러스이다. 본 발명의 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 A/H3N2 바이러스는 A/Sydney/5/97(H3N2)이고, A/H5N2는 A/Aquatic bird/Korea/w81/05(H5N2)이며, A/H9N2는 A/chicken/Korea/310/01(H9N2) 이다. 상기 인플루엔자 바이러스는 사람에서 독감, 감기, 인후염, 기관지염 또는 폐렴을 일으킬 수 있으며, 특히 조류독감, 돼지독감 또는 염소독감을 야기시킬 수 있다.
본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 코로나 바이러스이다. 본 발명의 코로나 바이러스는 사람을 비롯한 포유류, 조류 등의 동물에 감염하여 호흡기 또는 위장관에 질병을 일으키는 코로나 바이러스를 포함하며, 숙주에 감염하여 체중감소, 콧물, 발열, 기침, 두통, 설사 등의 임상증상을 일으킬 수 있다. 상기 코로나 바이러스는 중중급성호흡기증후군 바이러스(SARS-CoV), 중동호흡기증후군 바이러스(MERS-CoV)전염성 기관지염 바이러스(IBV), 돼지의 전염성 위장염 바이러스(TGE), 돼지 유행성 설사 바이러스(PED), 소 코로나바이러스(BCoV), 고양이/개 코로나 바이러스(FCoV/CCoV), 마우스 간염 바이러스(MHV) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 코로나 바이러스는 전염성 기관지염 바이러스(IBV) strain M14로, 2003년 아시아에서 발생한 뒤 전 세계로 확산되며 800명 가까운 사망자를 낸 중증급성호흡기증후군 바이러스(SARS-CoV) 및 주로 사우디와 아랍에미리트, 요르단, 카타르 등 중동 지역에서 감염자가 발생하다가 2015년 5월부터 우리나라 전역에서 100명이 넘는 감염자가 발생했던 중동호흡기증후군 바이러스(MERS-CoV)와 같은 속에 속하여 유전적으로 유사하다 (Travis R. Ruch 등, 2012. The Coronavirus E Protein: Assembly and Beyond. Viruses 4(3), 363-382/ Xing-Yi Ge 등, 2013. Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature 503, 535-538).
본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 인유두종 바이러스이다. 본 발명의 인유두종바이러스는 사람에서 사마귀을 유발하는 바이러스의 일종으로, 약 100여종 이상이 있으며, 피부 표면에 감염되어 손과 발 및 생식기 점막에 사마귀를 발생시키며 여성의 경우 자궁경부암을 일으킬 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 인유두종 바이러스는 구체적으로는 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66번 유형일 수 있고, 보다 구체적으로는 16번 유형일 수 있다.
본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이러스는 노로바이러스이다. 본 발명의 노로바이러스는 사람에서 심한 구역질과 구토, 설사, 복통, 오한, 38℃ 정도의 발열 등을 유발하며, 노르워크(Norwalk) 바이러스를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 녹차 추출물은 본 발명의 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오프로틴 또는 헤마글루티닌에 결합한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 녹차 추출물은 본 발명의 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 글로뷸라 도메인(globular domain) 또는 스토크 영역(stalk region)에 결합한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 녹차 추출물은 본 발명의 바이러스의 헤마글루티닌의 글로뷸라 도메인(globular domain) 및 스토크 영역(stalk region)에 결합한다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 녹차 추출물을 처리한 경우 인플루엔자 바이러스의 단백질(예컨대, 뉴클레오프로틴, 헤마글루티닌 전체 단백질, 헤마글루티닌의 글로뷸라 도메인 및 스토크 영역) 사이즈가 모두 증가함을 알 수 있다(도 1a-1d).
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 녹차 추출물은 본 발명의 코로나바이러스와 인유두종 바이러스, 노로바이러스에 결합한다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 녹차 추출물을 처리한 경우 전염성 기관지염 바이러스, 인유두종 바이러스, 노로바이러스의 단백질 사이즈가 모두 증가함을 알 수 있다(도 1e, 도 13, 도 14).
본 발명의 백신 조성물은 약제학적 유효량의 본 발명의 녹차 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하고, 상기 녹차 추출물은 바이러스의 단백질에 결합한다. 본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서의 용어 "약제학적 유효량"은 바이러스에 의해 유발되는 질병 또는 병리학적 증상에 대한 예방, 경감 또는 치료적 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. 본 발명인 백신 조성물은 기타 구성성분, 예컨대 안정화제, 부형제, 기타 약학적 허용 화합물 또는 임의의 기타 항원 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 백신은 냉동 건조된 제제 또는 현탁액의 형태로서 존재할 수 있으며, 이들은 모두 백신 생성 분야에 일반적인 것들이다.
본 발명인 백신 조성물의 투여 형태는 장용피 사용 단위체의 형태, 복강내, 근육내 또는 피하 투여용 접종, 에어로졸 분무, 경구 또는 비강내 용도일 수 있다. 음용수 또는 식용 펠렛으로 투여하는 것도 가능하다. 본 발명의 백신 조성물은 이종 항원 및 시토킨과 같은 면역 조절 분자를 동일한 재조합체내에서 발현시켜 단일 백신으로 전달할 수도 있으며, 상이한 외래 유전자 또는 면역증강제를 보유하는 2 이상의 바이러스벡터를 포함하는 "칵테일"로서 투여할 수 있다. 본 명세서의 용어, "면역증강제(adjuvant)"는 일반적으로 항원에 대한 체액 또는 세포 면역 반응을 증가시키는 임의의 물질(예컨대, alum, 프로인트 완전 어주번트, 프로인트 불완전 어주번트, LPS, poly IC, poly AU 등)을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 증식력이 있는 바이러스에 녹차 추출물을 첨가하고 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 바이러스 및 녹차 추출물의 혼합물을 인큐베이션하는 단계:를 포함하는 불활화 바이러스 백신의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 불활화 바이러스 백신은 녹차 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 백신으로, 녹차 추출물은 바이러스의 단백질에 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 불활화된 바이러스는 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스, B형 인플루엔자 바이러스 또는 C형 인플루엔자 바이러스이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 A형 인플루엔자 바이러스로 A/H1N1, A/H3N2, A/H5N2, A/H9N2 바이러스이다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 A/H1N1 바이러스는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스, A/Chile/1/83(H1N1) A/NWS/33, 또는 A/Korea/01/2009(H1N1) 바이러스이다. 본 발명의 다른 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 A/H3N2 바이러스는 A/Sydney/5/97(H3N2)이고, A/H5N2는 A/Aquatic bird/Korea/w81/05(H5N2)이며, A/H9N2는 A/chicken/Korea/310/01(H5N2) 이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 인플루엔자 바이러스 및 녹차 추출물은 5x1010-5x103 PFU:0.1-100 mg의 비율로 혼합한다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 5x108-5x107 PFU/ml의 인플루엔자 바이러스에 0.1-1 mg/ml의 녹차 추출물을 처리하는 경우 바이러스 증식 활성 및 헤마글루티네이션 활성이 감소하였으며, 1x108-5x107 PFU/ml의 인플루엔자 바이러스에 1 mg/ml의 녹차 추출물을 동량 혼합한 경우는 바이러스 증식 활성이 완전히 억제되었고, 5x107 PFU/ml의 인플루엔자 바이러스에 1 mg/ml의 녹차 추출물을 동량 혼합한 경우는 바이러스 증식 활성 및 헤마글루티네이션 활성 모두가 완전히 억제됨을 확인할 수 있다(도 2b).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 불활화된 바이러스는 코로나 바이러스이다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 상기 코로나 바이러스는 사람과 조류에 감염할 수 있는 코로나 바이러스를 포함하며, 전염성 기관지염 바이러스, SARS 바이러스, 및 MERS 바이러스를 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 코로나 바이러스는 전염성 기관지염 바이러스 strain M14 이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 코로나 바이러스 및 녹차 추출물은 1010-103 EID50:0.1-100 mg의 비율로 혼합한다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 106.5-5x105.5 EID50/ml의 인플루엔자 바이러스에 0.1-1 mg/ml의 녹차 추출물을 처리하는 경우 계태아의 접종한 후 채취한 요막액에서 바이러스 활성이 소멸하였음을 확인할 수 있다(도 10).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 불활화된 바이러스는 인유두종 바이러스이다. 상기 인유두종바이러스는 사람에서 사마귀을 유발하는 바이러스의 일종으로, 약 100여종 이상이 있으며, 피부 표면에 감염되어 손과 발 및 생식기 점막에 사마귀를 발생시키며 여성의 경우 자궁경부암을 일으킬 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 상기 인유두종 바이러스는 구체적으로는 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66번 유형일 수 있고, 보다 구체적으로는 16번 유형일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 불활화된 바이러스는 노로바이러스이다. 상기 노로바이러스는 사람에서 심한 구역질과 구토, 설사, 복통, 오한, 38℃ 정도의 발열 등을 유발하며, 노르워크(Norwalk) 바이러스를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 인유두종 바이러스 및 노로바이러스는 바이러스 단백질이 녹차 추출물과 결합하여 불활화되는 것을 알 수 있다(도 13, 도 14).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 바이러스 및 녹차 추출물을 혼합하는 단계 이후 15℃ 이상의 온도에서 인큐베이션을 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 바이러스 및 녹차 추출물을 혼합하는 단계 이후 15-50℃, 20-50℃, 25-50℃, 30-50℃, 33-50℃, 35-50℃, 15-45℃, 20-45℃, 25-45℃, 30-45℃, 33-45℃, 35-45℃, 15-40℃, 20-40℃, 25-40℃, 30-40℃, 33-40℃, 35-40℃, 15-38℃, 20-38℃, 25-38℃, 30-38℃, 33-38℃, 35-38℃ 또는 35℃에서 인큐베이션을 실시하는 것이나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 인큐베이션은 온도가 20℃ 이하로 낮은 경우에도 녹차 추출물을 처리하지 않은 군에 비하여 바이러스의 활성이 낮아졌으므로 실온범위인 최소 15-20℃ 이상의 온도에서 실시하면 본 발명의 실시예에서와 같이 바이러스의 증식이 억제되어 바이러스 불활화의 목적을 달성할 수 있고 그 이상의 온도에서 실시하여도 바이러스를 불활화하는 목적을 달성할 수 있음은 당업자에게 자명한 사실이다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 인플루엔자 바이러스에 녹차 추출물을 처리하여 20-35℃에서 인큐베이션을 실시한 결과 바이러스 증식 활성 및 헤마글루티네이션 활성이 감소하였으며, 35℃에서는 인플루엔자 바이러스의 증식 활성 및 헤마글루티네이션 활성 모두가 완전히 억제되었고, 코로나 바이러스의 활성도 소멸되었음을 확인할 수 있다(도 2a, 도 10).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 인큐베이션은 1시간 이상 실시한다. 본 발명의 어떠한 구현예에 따르면, 본 발명의 인큐베이션은 1-96시간, 1-72시간, 1-48시간, 1-36시간, 1-30시간, 1-24시간, 3-96시간, 3-72시간, 3-48시간, 3-36시간, 3-30시간, 3-24시간, 6-96시간, 6-72시간, 6-48시간, 6-36시간, 6-30시간, 6-24시간 실시하며, 최소 1시간 이상 실시하면 본 발명의 실시예에서와 같이 바이러스의 증식이 억제되어 바이러스 불활화의 목적을 달성할 수 있고 그 이상의 시간 동안 실시하여도 바이러스를 불활화하는 목적을 달성할 수 있음은 당업자에게 자명한 사실이다. 하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 바이러스에 녹차 추출물을 처리하여 35℃에서 인큐베이션을 실시한 결과 인큐베이션 시작과 함께 바이러스 증식 활성 및 헤마글루티네이션 활성이 감소하기 시작하였으며, 녹차 추출물 1 mg/ml을 처리한 경우에는 6시간의 인큐베이션만에 바이러스 증식 활성 및 헤마글루티네이션 활성 모두가 완전히 억제됨을 확인할 수 있다(도 2c).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 (b)의 인큐베이션 단계 이후에 (c) 부형제를 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에서 용어 “부형제”는 상기한 약제학적으로 허용되는 담체 외, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 및 면역보강제 등을 포함하는 의미로, 본 발명의 백신 제조와 관련된 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 부형제를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 (c)의 부형제를 첨가하는 단계 이후, (d) 여과, 멸균, 및 희석하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 여과, 멸균, 및 희석 단계는 본 발명의 녹차 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 조성물에 포함된 이물질을 제거하는 여과 단계와, 불활화된 바이러스 및 부형제 이외에 백신 보관용기에 혼입될 수 있는 미생물(바이러스, 세균, 및 곰팡이를 포함한다)을 멸균하는 단계 및 불활화된 바이러스를 포함하는 조성물을 약제학적 유효농도에 맞추어 희석하는 단계로서, 본 발명의 백신 제조와 관련된 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 여과, 멸균, 및 희석 방법을 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 백신 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 전염성 질환의 예방방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 상기 바이러스성 전염성 질환은 인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스, 인유두종 바이러스, 또는 노로바이러스의 감염에 의한 것이다.
본 발명의 바이러스성 전염성 질환의 예방방법은 상술한 백신 조성물을 이용하는 방법에 관한 것이므로, 중복되는 내용의 기재는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략하도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 i) 녹차 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 백신 조성물, ii) 증식력이 있는 바이러스에 녹차 추출물을 첨가하고 혼합하는 단계; 및 상기 바이러스 및 녹차 추출물의 혼합물을 인큐베이션하는 단계:를 포함하는 불활화 바이러스 백신의 제조방법, 및 iii) 상기 백신 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 전염성 질환의 예방방법에 관한 것이다.
(b) 본 발명에 따르면, 녹차 추출물을 바이러스에 처리하는 경우 바이러스를 불활화 시킴과 동시에 면역원성을 우수하게 유지하는 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 녹차 추출물과 증식력이 있는 바이러스를 혼합하여 불활화 백신의 제조가 가능하며, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 백신 조성물을 대상체에 투여할 경우 해당 바이러스에 대한 면역반응이 유발되어 해당 바이러스에 의한 전염성 질환을 효과적으로 예방할 수 있다.
(c) 또한, 본 발명의 녹차 추출물은 독성이 없어 안전한 바이러스 백신의 제조가 가능하고, 화학물질 기반 제조과정과는 달리 투석과정이 불필요하여 제조 공정에 있어 경제성이 우수하다는 이점이 있다.
도 1a는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스의 뉴클레오프로틴을 녹차 추출물과 반응시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석한 결과를 나타낸다. 도 1b-1d는 A/Korea/01/2009(H1N1) 바이러스의 LysRS(Lysyl-tRNA synthetase)-HA 융합(fusion) 단백질을 녹차 추출물과 반응시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석한 결과를 나타낸다.
도 1e는 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스의 헤마글루티닌 단백질을 EGCG와 반응시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석한 결과를 나타낸다. 도 1f는 EGCG와 반응시킨 헤마글루티닌 단백질을 LCMS/MS를 통해 분석한 결과를 나타낸다.
도 2a는 바이러스(5x107 PFU/ml)를 녹차 추출물(1 mg/ml)과 동량으로 혼합하여 온도에 따라 인큐베이션 시킨 경우의 바이러스 증식 활성 및 헤마글루티네이션 활성을 나타낸다. 도 2b는 다양한 농도의 바이러스(5x107, 1x108 및 5x108 PFU/ml)와 녹차 추출물(1 mg/ml)을 동량으로 혼합하여 인큐베이션 시킨 경우의 바이러스 증식 활성 및 헤마글루티네이션 활성을 나타낸다. 도 2c는 바이러스(5x107 PFU/ml)를 다양한 농도의 녹차 추출물(0.1, 0.5 및 1 mg/ml)과 동량으로 혼합하여 인큐베이션 시킨 경우의 바이러스 증식 활성 및 헤마글루티네이션 활성을 나타낸다. 점선은 검출 한계(detection limit)를 나타내며 바이러스 증식 활성 실험의 검출 한계는 5 PFU/ml, 헤마글루티네이션 활성 실험의 검출 한계는 2 HAU/ml이다.
도 3a는 바이러스가 완벽하게 불활화 되었는지 확인을 위해 실시한 플라크 분석 결과를 나타낸다. 도 3b는 GT-V이 계태아를 감염시킬 수 있는 능력을 상실하였음을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4a는 GT-V의 독성 시험 결과를 나타낸다. 도 4b는 녹차 추출물의 독성 시험 결과를 나타낸다.
도 5a는 GT-V의 혈구응집능 억제시험(HI test) 결과를 나타낸다. 도 5b는 GT-V의 바이러스 중화시험(VNT) 결과를 나타낸다. 점선은 검출 한계를 나타내며 HI 분석의 검출 한계는 8 (HI titer), 중화능 분석의 검출 한계는 20 (NT titer)이다.
도 6은 공격접종을 통한 GT-V의 방어능력 분석 결과를 나타낸다.
도 7은 GT-V로 면역시킨 마우스의 폐에서의 감염 바이러스 증식억제 확인 결과를 나타낸다. 점선은 검출 한계 50 PFU/ml을 나타낸다.
도 8은 GT-V의 투석 과정을 거친 것과 거치지 않은 것의 독성 실험 결과를 나타낸다.
도 9는 전염성 기관지염 바이러스(IBV) strain M41을 녹차추출물과 반응시킨 후 SDS-PAGE와 웨스턴 블랏을 통해 분석한 결과를 나타낸다.
도 10은 IBV가 GT에 의해서 불활화된 것을 DIB(Dot-immunoblot assay)로 확인한 결과이다.
도 11은 GT-IBV로 면역시킨 마우스의 혈청 내 IgG의 항체가 분석 결과를 나타낸다.
도 12a는 GT-IBV 접종 후 2주차에 채취한 마우스 혈청의 중화항체를 DIB (Dot-immunoblot assay)로 확인한 결과이다. 도 12b는 GT-IBV 접종 후 6주차에 채취한 마우스 혈청의 중화항체를 DIB로 확인한 결과이다.
도 13는 인유두종바이러스의 hRBD-L1 융합(fusion) 단백질을 녹차 추출물과 반응시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석한 결과를 나타낸다.
도 14은 노로바이러스의 hRBD-NoV VP1 융합(fusion) 단백질을 녹차 추출물과 반응시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료
세포주
MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 및 Vero 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하였고, 상기 세포는 10% FBS(fetal bovine serum, HyClone, 미국) MEM(minimal essential medium, HyClone, 미국) 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃ 조건 하에서 배양하였다.
바이러스 및 녹차 추출물
A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스는 11일 된 SPF(specific pathogen free) 계태아에 접종하여 37℃ 인큐베이터에서 2일 동안 키운 후, 요막액(allantoic fluid)을 채취하여 불순물을 제거하고 영하 80℃ 냉동시설에서 보관하였다.
전염성 기관지염 바이러스(Infectious bronchitis virus, IBV) strain M41 는 11일 된 SPF(specific pathogen free) 계태아에 접종하여 37℃ 인큐베이터에서 2일 동안 키운 후, 요막액(allantoic fluid)을 채취하여 불순물을 제거하고 영하 80℃ 냉동시설에서 보관하였다.
인유두종바이러스(Human papillomavirus, HPV)는 16형 바이러스유사입자(Virus-like particle, VLP)유래 외피단백질인 L1단백질 (HPV 16L1)을 사용하였다.
노로바이러스(Norovirus, NoV)는 Hu/GII.4/Hiroshima/55/2005/JPN strain의 구조단백질인 VP1 (NoV VP1)을 사용하였다.
녹차 추출물은 가루 녹차(녹차 100%, 아모레퍼시픽, 대한민국)를 3차 증류수에 녹인 후 0.2 μm 주사기 필터(syringe filter)를 이용하여 정제하였다.
EGCG(EGCG 98%, Changsha Sunfull Bio-tech, 중국)는 3차 증류수에 녹인 후 0.2 μm 주사기 필터(syringe filter)를 이용하여 정제하였다.
실험방법 및 결과
녹차 추출물을 처리한 인플루엔자 단백질의 분석
본 발명에 따른 녹차 추출물의 인플루엔자 단백질에 대한 영향을 알아보기 위하여 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스의 뉴클레오프로틴(NP: neucleoprotein)을 녹차 추출물과 반응시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석하였다.
먼저 뉴클레오프로틴을 코딩하는 핵산서열을 pGE-LysRS(3) 벡터에 삽입하여 E. coli에서 발현시킨 후, 니켈 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하였다. 다음으로 정제된 뉴클레오프로틴 1 μg/10 μl을 녹차 추출물 10, 100 및 1000 μg/10 μl과 실온에서 6시간 동안 반응시켰다. 이후, 10% PAGE 겔(gel)에 녹차 추출물을 처리한 뉴클레오프로틴을 로딩하여 전기영동을 실시하고, 쿠마시-블루(Coomassie-blue)로 상기 겔을 염색하여 염색된 단백질 밴드를 확인하였다.
그 결과, 낮은 농도에서는 큰 차이가 없었으나 녹차 추출물 1000 μg을 처리한 군에서 단백질과 녹차 추출물의 결합으로 인해 뉴클레오프로틴의 분자량이 증가하여 밴드 사이즈가 증가된 것을 확인할 수 있었다(도 1a).
다음으로, A/Korea/01/2009(H1N1) 바이러스의 LysRS(Lysyl-tRNA synthetase)-HA 융합(fusion) 단백질을 녹차 추출물과 반응시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석하였다.
LysRS-HA 융합 단백질을 코딩하는 핵산서열을 pGE-LysRS(3) 벡터에 삽입하여 E. coli에서 발현시킨 후, 니켈 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하였다. 상기 LysRS-HA 융합 단백질은 헤마글루티닌의 머리부분인 HA 글로뷸라 도메인(Globular domain, LysRS-HA GD)과 HA 스토크 영역(Stalk region, LysRS-HA Stalk), 및 이 두 가지가 합해진 HA 전체(LysRS-HA Full) 세 가지의 다른 구조를 가질 수 있다. 각각의 LysRS-HA Full, LysRS-HA GD, LysRS-HA Stalk 융합단백질은 TEV 프로테아제(TEV protease, Invitrogen, 미국)를 처리하여 LysRS를 잘라준 다음, LysRS-HA Full, LysRS-HA GD 및 LysRS-HA Stalk 융합 단백질 1 μg/10 μl을 녹차 추출물 10, 100 및 1000 μg/10 μl과 실온에서 6시간 동안 반응시켰다. 이후, 10% PAGE 겔에 로딩하여 전기영동을 실시하고, 쿠마시-블루(Coomassie-blue)로 상기 겔을 염색하여 염색된 단백질 밴드를 확인하였다.
그 결과, 낮은 농도에서는 큰 차이가 없었으나 녹차 추출물 1000 μg을 처리한 군에서, LysRS-HA 전체 단백질, HA 전체 단백질, HA 글로뷸라 및 HA 스토크 모두의 분자량이 증가하여 밴드 사이즈가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 녹차 추출물이 바이러스 전체 단백질에 결합함을 확인하였다(도 1b 내지 1d).
EGCG를 처리한 인플루엔자 단백질의 분석
A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스의 헤마글루티닌(HA:hemagglutinin)을 EGCG와 반응시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석하였다.
헤마글루티닌은 Human cell(어떤 human cell인지 기재바랍니다)에서 발현되었다. 헤마글루티닌 2 μg/10 μl을 EGCG 100 μg/10 μl과 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 10% PAGE 겔(gel)에 EGCG를 처리한 헤마글루티닌을 로딩하여 전기영동을 실시하고, 쿠마시-블루(Coomassie-blue)로 상기 겔을 염색하여 염색된 단백질 밴드를 확인하였다.
그 결과, EGCG와 반응하였을 때, 단백질의 분자량이 증가하여 밴드 사이즈가 증가된 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 EGCG가 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 단백질에 결합함을 확인하였다(도 1e).
더불어, 상기 EGCG와 반응시킨 헤마글루티닌 단백질을 LCMS/MS(Liquid chromatographymass spectrometry)로 분석하였다. 쿠마시-블루로 염색된 단백질 밴드를 인-겔 다이제스천(in-gel digestion)을 통해 분리하고, 알킬레이션(alkylation)과 탈색(destaining) 과정을 거친 다음, 트립신을 이용해 펩타이드 단편(peptide fragment)으로 제작하였다. 제작된 펩타이드 단편을 LCMS/MS [(Q-Exactive mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) coupled with an Easy-nLC system (Thermo Fisher Scientific, Odense, Denmark)]로 분석하였다.
그 결과, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질의 152번째 아미노산인 시스테인(Cysteine) 잔기에 EGCG가 디하이드로에피갈로카테킨(dehydroepigallocatechin, C15H11O6)의 형태로 변형되어 결합된 것을 확인할 수 있었다(도 1f).
녹차 추출물의 인플루엔자 바이러스 불활화 효과
녹차 추출물을 인플루엔자에 직접 처리하였을 때의 불활화 효과를 확인하기 위해 다양한 조건 하에서 바이러스의 증식활성, 혈구응집활성 및 성장동력 시험을 수행하였다.
먼저 온도에 따른 불활화 정도를 확인하기 위하여, 바이러스(5x107 PFU/ml)를 녹차 추출물(1 mg/ml)과 동량으로 혼합하여 각각 20, 25, 30 및 35℃의 항온수조(water bath)에서 24 시간 동안 반응시켰다. 혼합액은 MDCK 세포가 배양된 12-웰 플레이트에 접종하여 플라크 분석(plaque assay)을 통해 바이러스 역가를 확인하였다. 그 결과, 바이러스 증식활성은 온도가 증가함에 따라 약 3 log10 PFU/ml 감소하였고, 35 ℃의 경우 바이러스의 증식이 모두 억제된 것을 확인하였다. 혈구응집활성도 온도에 따라 감소하였고 35 ℃의 경우에는 혈구응집활성이 모두 억제된 것을 확인하였다(도 2a).
다음으로 바이러스 역가에 따른 불활화 정도를 확인하기 위하여 다양한 역가의 바이러스(5x107, 1x108 및 5x108 PFU/ml)와 녹차 추출물(1 mg/ml)을 동량으로 혼합하여 앞선 실험에서 바이러스가 효과적으로 억제되었던 35℃의 항온수조에서 24시간 동안 반응시켰다. 혼합액은 MDCK 세포가 배양된 12-웰 플레이트에 접종하여 플라크 분석을 통해 바이러스 역가를 확인하였다. 그 결과, 바이러스 증식활성은 접종한 바이러스의 역가가 높을수록 증가하였고 1x108 PFU/ml 와 5x107 PFU/ml 의 역가에서는 바이러스 증식 활성이 모두 억제된 것을 확인하였다. 혈구응집활성도 농도에 따라 감소하였고 5x107 PFU/ml의 역가에서는 혈구응집활성이 모두 억제된 것을 확인하였다(도 2b).
상기 실험 결과를 바탕으로, 바이러스 5x107 PFU/ml 와 다양한 농도의 녹차 추출물(0.1, 0.5 및 1 mg/ml)을 동량으로 혼합한 후, 35℃에서 24시간 동안 반응시키면서 시간에 따른 바이러스의 성장 동력(Growth Kinetics)을 확인하였다. 혼합액은 MDCK 세포가 배양된 12-웰 플레이트에 접종하여 플라크 분석을 통해 역가를 확인하였다. 그 결과, 농도 및 시간에 따라 바이러스 증식 활성이 감소하는 것을 확인하였고, 녹차 추출물 1 mg/ml의 경우 6시간 만에 바이러스 증식 활성이 모두 억제된 것을 확인하였다. 혈구응집활성의 경우에도 녹차 추출물의 농도가 증가하고, 처리시간이 길어짐에 따라 감소하였고 녹차 추출물 1 mg/ml의 경우 처리 24시간 후 혈구응집활성이 모두 억제된 것을 확인하였다(도 2c).
인플루엔자 바이러스 불활화 백신(GT-V) 제조
위 실험 결과를 바탕으로, A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스 5x107 PFU/ml와 1 mg/ml의 녹차 추출물을 동량으로 혼합하고 35℃에서 24시간 동안 반응시켜 녹차 추출물을 처리한 인플루엔자 불활화 백신(GT-V)을 제조하였다. 바이러스가 완벽하게 불활화 되었는지 확인하기 위해 MDCK 세포에 접종하여 플라크 분석을 실행하였다. 그 결과, 플라크가 전혀 생성되지 않아 바이러스의 활성이 소멸되었음을 확인하였다(도 3a). 보다 확실한 검증을 위하여, 준비한 GT-V 원액을 11일령 계태아에 접종하여 37℃에서 2일 동안 배양한 다음, 요막액을 수거하여 혈구응집능을 확인하였다. 실험 결과, 혈구응집능이 확인되지 않아 본 발명의 인플루엔자 불활화 백신(GT-V)은 계태아를 감염시킬 수 있는 능력을 완전히 상실하였음을 확인하였다(도 3b).
인플루엔자 바이러스 불활화 백신의 독성 확인
상기에서 제조한 GT-V의 독성을 확인하기 위하여, 마우스에 다양한 농도의 GT-V[GT(Green tea) 12.5 μg-V(virus) 6.25x105 PFU, GT 25.0 μg-V 1.25x106 PFU, GT 50.0 μg-V 2.50x106 PFU]와 PBS를 면역증강제인 alum(100 μl)과 함께 복강으로 투여(200 μl/mice)하고 14일 동안 몸무게 변화를 모니터링 하였다. 접종 후 2일까지 약간의 몸무게 감소를 보였지만 대조군과 비교하여 약 5% 정도로 큰 차이를 보이지 않았고, 꾸준히 몸무게를 회복하여 5일 째 이후로는 정상 몸무게로 돌아왔다. 따라서, 본 발명의 GT-V는 동물실험 결과 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 4a).
또한, 녹차 추출물만의 독성을 확인하기 위하여, 한 군 당 네 마리의 마우스에 녹차 추출물 0.05, 0.1, 1 mg 및 PBS을 각각 복강 접종(100 μl)하였다. 14일 동안 마우스의 몸무게 감소 변화 및 생존율을 확인하였다. 그 결과, 대조군인 PBS를 투여한 마우스 그룹과 비교하였을 때, 녹차 추출물 모든 농도의 마우스 그룹에서 유의성 있는 몸무게 감소를 확인하지 못하였고, 100%의 생존률을 보였다. GT-V 동물실험에서 가장 높은 녹차 추출물의 농도는 0.05 mg으로, 이보다 20배 더 높은 농도인 1 mg을 마우스에 투여했을 경우에도 독성을 보이지 않는 것을 확인하였다(도 4b).
GT-V의 면역원성 확인
GT-V 접종 및 혈액 채취
GT-V의 면역원성과 보호능력을 확인하기 위해, 한 군 당 다섯 마리의 마우스에 다양한 농도의 GT-V(GT 12.5 μg-V 6.25x105 PFU, GT 25.0 μg-V 1.25x106 PFU, GT 50.0 μg-V 2.50x106 PFU) 100 μl와 함께 면역증강제인 alum 100 μl를 복강으로 투여(100 μl/mice)하고, 2주 후 같은 농도로 추가접종 하였다. 접종 후 2주간 마우스의 몸무게 변화를 매일 관찰하였고, 첫 접종 2, 4 및 6주 후 혈액을 채취하여 원심분리를 통해 혈청만 수집하여 면역원성 분석을 위해 사용하였다.
모든 실험 과정은 연세 실험동물 연구센터 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC))의 가이드라인에 따라 수행하였다.
혈구응집억제 분석
GT-V의 헤마글루티네이션 저해 특성을 분석하기 위해, 혈구응집억제(HI: Hemagglutination inhibition) 분석을 수행하였다. 먼저 혈청에 수용체 파괴효소(receptor destroying enzyme)를 처리하고 56℃에서 1시간 동안 열을 가하여 비동화한 다음, 혈청을 25 μl씩 96-웰 플레이트에서 PBS와 함께 2배씩 단계적으로 희석하였다. 희석한 혈청에 동일한 야생형의 A/Puerto Rico/8/34(H1N1) 바이러스 4 HAU/25 μl를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 1%의 닭적혈구(cRBC, chicken RBC)를 50 μl 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시키고 혈구응집능을 억제하는 가장 높은 희석률을 계산하였다.
그 결과, HI 항체가(HI titer)는 2주 차에 가장 낮은 접종 농도에서는 나타나지 않았지만, 추가접종 후 항체가가 크게 증가하여 주차 별로, 농도별로 높게 유도되는 것을 확인할 수 있었다. HI 항체가는 6주 차에 가장 높은 수치를 나타냈고, 이로부터 본 발명의 GT-V에 의한 면역유도반응이 6주 이상 장기간 유지됨을 확인하였다(도 5a).
바이러스 중화능 분석
본 발명의 GT-V를 접종한 마우스 혈청의 바이러스 중화능을 확인하기 위해, 바이러스 중화시험(VNT: Virus Neutralization Test) 분석을 수행하였다. 먼저 상기 실시예에서 수거한 GT-V 접종한 마우스의 혈청을 56℃에서 1시간 동안 열을 가하여 비동화한 후, PBS와 함께 100 μl를 2배씩 단계적으로 희석하였다. 다음으로 희석한 혈청에 바이러스 100 PFU/100 μl를 넣어 37℃에서 1시간 동안 중화반응을 시켰다. 그 후 중화반응을 시킨 바이러스와 혈청을 MDCK 세포가 배양된 12-웰 플레이트에 접종하여 플라크 분석을 실시하고 대조군과 비교하여 50% 플라크 감소를 나타내는 희석률을 계산하였다.
그 결과, 중화항체가(NT titer)는 최초 접종 후 2주차에는 거의 증가하지 않았으나 추가접종 후 크게 증가된 것을 확인하였고, 6주에 조금 더 증가하여 면역 반응이 유지된 것을 확인할 수 있었다(도 5b).
공격접종을 통한 GT-V의 방어능력 분석
GT 12.5 μg-V 6.25x105 PFU, GT 25.0 μg-V 1.25x106 PFU, GT 50.0 μg-V 2.50x106 PFU로 GT-V를 접종한 마우스에, 2주 후 동량으로 추가 접종하였다. 추가 접종 후 4주차에 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)바이러스를 50% 치사율의 10배(10 MLD50)의 농도인 104 PFU/50 μl를 비강 내로 공격접종하고, 공격접종 후 2주 동안 체중 변화와 생존율을 확인하였다.
그 결과, GT-V를 접종한 마우스들은 공격접종 후 6일차까지 약 10%의 체중 감소를 보였지만 그 후에 회복하였고, GT-V를 접종하지 않은 대조군 그룹은 급격하게 체중이 감소하여 공격접종 후 6일차에 모두 죽었다. 생존율의 경우, 접종한 GT-V 농도에 관계없이 가장 낮은 농도로 GT-V를 접종한 군에서도 모두 살아남아 100%의 생존률을 보였다(도 6).
폐에서의 바이러스 증식억제 확인
GT-V가 치명적인 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 얼마나 방어능을 가지는지를 더 알아보기 위해, 상기 실시예에서와 같이 마우스에 GT-V를 2차까지 접종하고 4주 후 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)바이러스를 10 MLD50(104 PFU/50 μl) 로 비강 내 공격접종하고 2, 4 및 6일이 지났을 때, 마우스들을 희생시켜 폐를 회수하였다. 상기 회수한 폐를 PBS 500 ml에 넣고 분쇄한 후, 원심분리하여 상층액만 분리하였다. 분리한 상층액을 MDCK 세포에 접종하여 플라크 분석을 통해 마우스의 폐 내 존재하는 바이러스의 역가를 확인하였다.
그 결과, GT-V를 접종한 마우스의 폐에서 확인된 감염 바이러스는 백신이 접종되지 않은 마우스에서 보다 약 103배 낮은 값으로 나타났다. 이 값은 접종 후 6일뿐 아니라 2일 및 4일에도 나타났으며 바이러스의 복제를 완전히 억제하지는 못하였지만 충분히 낮은 억제값을 갖는 것을 확인하였다(도 7).
투석과정 필요여부에 대한 확인
본 발명에 따른 녹차 추출물로 바이러스를 불활화할 경우 포름알데하이드로 불활화한 경우와 마찬가지로 투석과정이 필요한지 여부를 알아보기 위하여, 녹차 추출물을 제거하는 투석 과정을 거친 GT-V와 그렇지 않은 GT-V의 독성을 상술한 GT-V의 독성 실험과 동일한 방법으로 수행하여 그 결과를 비교하였다. 투석은 녹차추출물과 바이러스의 반응액을 PBS 완충액(pH 7.4)으로 4℃에서 24시간 동안 실시하였다. 그 결과, 투석 과정을 거친 GT-V와 거치지 않은 GT-V를 접종한 마우스 군 간에 유의성있는 체중의 차이를 보이지 않았다(도 8).
따라서 본 발명의 GT-V는 투석 과정이 불필요한바, 백신 제조에 있어 경제성이 높음을 알 수 있었다.
녹차 추출물을 처리한 코로나바이러스의 분석
본 발명에 따른 녹차 추출물의 코로나바이러스에 대한 영향을 알아보기 위하여 전염성 기관지염 바이러스(Infectious bronchitis virus, IBV) strain M41을 녹차 추출물과 반응시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석하였다. 바이러스 (106.5 EID50/ml)의 100μl을 녹차 추출물(10mg/ml) 100 μl과 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 8% PAGE 겔(gel)에 로딩하고 전기영동을 실시하였다. 이후, 쿠마시-블루(Coomassie-blue)로 상기 겔을 염색하여 염색된 단백질 밴드를 확인하였고 동시에 웨스턴 블랏(western blot)을 실시하였다. 겔에 있는 단백질 밴드를 트랜스퍼(transfer) 과정을 거쳐 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 옮겨 주고 비특이반응을 감소시키기 위하여 멤브레인을 5% 탈지유(skim milk)로 블로킹(blocking)한 다음 TBST로 워싱하였다. IBV로 접종된 마우스의 혈청을 1:1000으로 희석하여 멤브레인에 일차항체(primary antibody)로 사용하였다. TBST로 멤브레인을 워싱한 후 HRP(Horseradish peroxidase) 효소가 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG(HRP-conjugated anti-mouse IgG)를 1:10000으로 희석하여 멤브레인에 이차항체(secondary antibody)로 처리하였다. TBST로 멤브레인을 워싱한 후, WEST-ZOL plus Western Blot Detection System(iNtRON, Korea)을 처리해준 뒤, 엑스레이 필름에 현상하였다.
그 결과, 녹차 추출물과 반응하였을 때, 단백질의 분자량이 증가하여 밴드 사이즈가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 녹차 추출물은 코로나 바이러스 단백질과 결합함을 확인하였다(도 9).
코로나바이러스 불활화 백신(GT-IBV) 제조
전염성 기관지염 바이러스(Infectious bronchitis virus, IBV) strain M41 106.5 EID50/ml와 1 mg/ml의 녹차 추출물을 동량으로 혼합하여 35℃에서 24시간 동안 반응시켜 녹차 추출물을 처리한 코로나 불활화 백신(GT-IBV)을 제조하였다. 바이러스가 완벽하게 불활화 되었는지 확인하기 위해 GT-IBV 원액을 11일령 계태아에 접종하여 37℃에서 2일 동안 배양한 다음, 요막액을 수거하여 바이러스 잔존량 분석을 DIB(Dot-immunoblot assay)로 수행하였다. 니트로셀룰로오스지(NC paper)에 상기 바이러스와 녹차 추출물의 혼합물을 200μl씩 분주하고 10-15분 진공처리한 후 워싱하였다. 3% BSA(bovine serum albumin)로 니트로셀룰로오스지를 37℃에서 2시간 동안 블로킹(Blocking)시킨 다음, IBV로 접종된 마우스의 혈청을 1:1000으로 희석하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. TBST로 3회 워싱한 후, 비오티닐화된 항-마우스 IgG(Biotinylated anti-mouse IgG)를 처리하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. TBST로 3회 워싱한 후, ABC kit (Biotin and avidin-conjugated peroxidase complex)를 처리하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. TBST로 3회 워싱한 후, 다이아미노벤지딘(Diaminobenzidine)를 처리하여 1분 동안 발색 후에 흐르는 물에 워싱 후 건조하여 염색여부를 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 GT-IBV를 접종한 계태아의 요막액은 IBV 항체로 염색이 되지 않아 IBV의 활성을 상실하였음을 확인하였다(도 10).
GT-IBV의 면역원성 확인
GT-IBV 접종 및 혈액 채취
본 발명의 GT-IBV의 면역원성을 확인하기 위하여, 한 군 당 네 마리의 마우스에 다양한 농도의 GT-V(GT 12.5 μg-IBV 1.25x104.5 EID50, GT 25.0 μg-IBV 2.50x104.5 EID50, 및 GT 50.0 μg-V 5.0x104.5 EID50) 100 μl와 면역증강제인 alum 100 μl를 복강으로 투여하였다. 2주 후, 같은 농도로 추가접종 하였다. 첫 접종 2주 및 6주 후 혈액을 채취하여 원심분리를 통해 혈청만 모아 면역원성 분석을 위해 사용하였다.
모든 실험 과정은 연세 실험동물 연구센터 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 가이드라인에 따라 수행되었다.
IgG 항체가 분석
본 발명의 GT-V로 접종한 마우스 혈청의 ELISA 분석을 수행하였다. 96 웰 플레이트에 106.5 EID50/ml의 야생형(WT) IBV 바이러스를 100 μl씩 분주하고 4℃ 에서 하루 동안 코팅하였다. 바이러스가 코팅된 플레이트를 Tris-HCl(pH 7.4)로 3회 워싱한 후, 1% BSA로 상온에서 1시간 동안 블로킹 하였다. 동일한 방법으로 워싱한 후, 본 발명의 GT-V로 접종한 마우스 혈청을 1:200으로 초기희석한 후 2배씩 계대 희석하여 100 μl/웰 씩 96웰에 분주하고 상온에서 1시간동안 처리하였다. 동일한 방법으로 워싱한 후, HRP-conjugated anti-mouse IgG(Mab)를 1:1000으로 희석하여 100 μl/웰 씩 상온에서 1시간동안 처리하였다. 동일한 방법으로 워싱한 후, TMB 용액을 100 μl/웰 씩 상온에서 30분 동안 처리하였다. 2N H2SO4를 처리하여 반응을 정지시키고 스펙트로포토미터로 450 nm에서 분석하였다.
그 결과, 1차 접종 후 2주차에는 IgG 항체가 거의 생성되지 않았지만, 2차 접종 후 6주차에는 항체가가 크게 증가하여 각각의 GT-IBV 접종 농도에서 항체가 충분히 생성된 것을 확인할 수 있었다(도 11).
바이러스 중화능 분석
본 발명의 GT-IBV를 접종한 마우스 혈청의 바이러스 중화능을 확인하기 위하여, 바이러스 중화시험(VNT) 분석을 수행하였다. 먼저 102 EID50/ml의 IBV strain M41 100 μl를 GT 12.5 μg-IBV 1.25x104.5 EID50, GT 25.0 μg-IBV 2.50x104.5 EID50, GT 50.0 μg-V 5.0x104.5 EID50 로 접종한 마우스에서 2주와 6주에 뽑은 혈청(10- 3 ,10- 4 ,10-5 dilution) 100 μl와 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음, 각 혼합물을 11일령 계태아에 3개씩 접종하여 3일 동안 37℃에서 배양시켰다. 그 후 계태아의 요막액을 채취하여 상기 중화능 분석 시험과 동일한 방법으로 DIB(Dot-immunoblot assay)를 진행하였다.
그 결과, 2주차에는 GT 12.5 μg-IBV 1.25x104.5 EID50 그룹에서 78%, GT 25.0 μg-IBV 2.50x104.5 EID50 그룹에서는 67%, GT 50.0 μg-V 5.0x104.5 EID50 그룹에서는 22%의 바이러스가 음성으로 나타남을 확인하였다(도 12a). 또한 6주차에는 GT 12.5 μg-IBV 1.25x104.5 EID50 그룹에서 33%, GT 25.0 μg-IBV 2.50x104.5 EID50 그룹에서는 44%, GT 50.0 μg-V 5.0x104.5 EID50 그룹에서는 33% 바이러스 음성을 확인하였다(도 12b). 따라서, 녹차 추출물을 처리한 코로나바이러스를 접종한 마우스의 혈청이 코로나바이러스를 중화할 수 있음을 확인하였다.
녹차 추출물을 처리한 비인플루엔자 단백질의 분석
녹차 추출물을 처리한 HPV 단백질의 분석
본 발명에 따른 녹차 추출물의 비인플루엔자 바이러스에 대한 영향을 알아보기 위하여 인유두종바이러스 (Human papillomavirus, HPV)의 16형 외피단백질인 L1단백질 (HPV 16L1)을 hRBD 벡터에 삽입하여 E. coli에서 발현시킨 후, 니켈 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후, 녹차 추출물과 반응시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석하였다. 인유두종바이러스의 hRBD-L1 융합(fusion) 단백질은 TEV 프로테아제(TEV protease, Invitrogen, 미국)를 처리하여 hRBD를 잘라주었다. L1 단백질 2 μg/10 μl를 본 발명에 따른 녹차 추출물 10, 100 및 1000 μg/10 μl과 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 10% PAGE 겔(gel)에 로딩하여 전기영동을 실시한 다음, 쿠마시-블루(Coomassie-blue)로 상기 겔을 염색하여 염색된 단백질 밴드를 확인하였다.
그 결과, 낮은 농도에서는 큰 변화가 보이지 않았지만 녹차 추출물 1000 μg/10 μl과 반응하였을 때, 단백질과 녹차 추출물의 결합으로 인해 L1 단백질의 분자량이 증가하여 밴드 사이즈가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 비인플루엔자 바이러스인 인유두종바이러스 단백질에 본 발명에 따른 녹차추출물이 결합함을 확인하였다(도 13).
녹차 추출물을 처리한 Norovirus 단백질의 분석
본 발명에 따른 녹차 추출물의 다른 비인플루엔자 바이러스에 대한 영향을 알아보기 위하여 노로바이러스(Norovirus, NoV, Hu/GII.4/Hiroshima/55/2005/JPN)의 구조단백질인 VP1 (NoV VP1)을 hRBD 벡터에 삽입하여 E. coli에서 발현시킨 후, 니켈 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제한 후, 녹차 추출물과 반응시킨 후 SDS-PAGE를 통해 분석하였다. 노로바이러스의 hRBD-NoV VP1 융합(fusion) 단백질은 TEV 프로테아제 (TEV protease, Invitrogen, 미국)를 처리하여 hRBD를 잘라주었다. VP1 단백질 2 μg/10 μl를 본 발명에 따른 녹차 추출물 10, 100 및 1000 μg/10 μl과 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 10% PAGE 겔(gel)에 로딩하여 전기영동을 실시한 다음, 쿠마시-블루로 상기 겔을 염색하여 염색된 단백질 밴드를 확인하였다.
그 결과, 낮은 농도에서는 큰 변화가 보이지 않았지만 녹차 추출물 1000 μg/10 μl과 반응하였을 때, 단백질과 녹차 추출물의 결합으로 인해 VP1 단백질의 분자량이 증가하여 밴드 사이즈가 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 비인플루엔자 바이러스인 노로바이러스 단백질에 본 발명에 따른 녹차추출물이 결합함을 확인하였다(도 14).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (18)

  1. 녹차 추출물에 의해 불활화된 바이러스를 포함하는 백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서 상기 녹차 추출물은 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG: (-)-epigallocatechin gallate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 A, B, 또는 C 바이러스 인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 인플루엔자 A 바이러스는 인플루엔자 A/H1N1, A/H3N2, A/H5N2, A/H9N2 바이러스인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 바이러스는 코로나 바이러스, 인유두종 바이러스, 또는 노로바이러스인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 코로나 바이러스는 전염성 기관지염 바이러스(Infectious bronchitis virus) strain M41 인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 녹차 추출물은 상기 바이러스의 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스이고, 상기 녹차 추출물은 인플루엔자 바이러스의 뉴클레오프로틴(neucleoprotein) 또는 헤마글루티닌(Hemagglutinin)에 결합하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 녹차 추출물은 상기 헤마글루티닌의 글로뷸라 도메인(globular domain) 또는 스토크 영역(stalk region)에 결합하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. (a) 증식력이 있는 바이러스에 녹차 추출물을 첨가하고 혼합하는 단계; 및
    (b) 상기 바이러스 및 녹차 추출물의 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 불활화 바이러스 백신의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서, (c) 부형제를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, (d) 여과, 멸균, 희석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 바이러스는 인플루엔자 바이러스이고, 바이러스 및 녹차 추출물을 5x1010 내지 5x103 PFU:0.1-100 mg의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 바이러스는 코로나 바이러스이고, 바이러스 및 녹차 추출물을 1010 내지 103 EID50:0.1-100 mg의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 인큐베이션은 15-50℃ 의 온도에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 인큐베이션은 1시간 이상 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스성 전염성 질환의 예방방법.
  18. 제 18 항에 있어서, 상기 바이러스성 전염성 질환은 인플루엔자 바이러스, 코로나 바이러스, 인유두종 바이러스, 또는 노로바이러스의 감염에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
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