WO2016195462A1 - 전기활성화 전도성 폴리머를 사용한 기능성 세포 시트 및 이의 제조방법 - Google Patents

전기활성화 전도성 폴리머를 사용한 기능성 세포 시트 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2016195462A1
WO2016195462A1 PCT/KR2016/006015 KR2016006015W WO2016195462A1 WO 2016195462 A1 WO2016195462 A1 WO 2016195462A1 KR 2016006015 W KR2016006015 W KR 2016006015W WO 2016195462 A1 WO2016195462 A1 WO 2016195462A1
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WO
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cell
cell sheet
bmp2
cells
polypyrrole
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PCT/KR2016/006015
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English (en)
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조영남
이형재
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국립암센터
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a functional cell sheet using an electroactivated conductive polymer and a method for manufacturing the same, and more particularly, to a functional cell sheet using an electroactivated conductive polymer and a method for manufacturing the same, a growth factor-fixed cell sheet is a single layer or a 3D-multilayer. It provides a tissue engineering cell sheet and a composition for inducing bone differentiation comprising the cell sheet.
  • Tissue engineering in which cells and growth factors are structured in 3D scaffolds provides an alternative approach. Tissues and organs consist of a complex 3D network comprising cells, extracellular matrix, and signal molecules. The interaction of cell-cell and cell-extracellular matrix in this network is important for regulating biochemistry and cellular responses. Tissue engineering aims to mimic these natural biological functions without disturbing them.
  • achieving this goal requires a biocompatible scaffold that acts as a structural template and promotes cell adhesion, cell proliferation and eventually tissue formation.
  • synthetic and natural biocompatible materials are applied to extracellular matrix (EMC) -like scaffolds, which act as matrices for controlling uniform cell seeding and attachment and release of various growth factors.
  • EMC extracellular matrix
  • recent cell sheet engineering has suggested a “scaffold-free” tissue engineering approach, which can be particularly advantageous when using temperature-responsive polymers. Compared to injecting isolated cells, this scaffold-free method improves cell adhesion and proliferation and thus improves integration with host tissues. At the same time, it retains the original functionality, structure, and integration of EMC.
  • Scaffold-free cell sheet technology has been applied for regeneration of damaged tissues and periods in various animal models, as well as in clinical trials including esophagus, cornea, and cardiomyopathy.
  • the use of cell sheets presents certain challenges. For example, to analyze the ex vivo / in vivo activity of cell sheets, it is necessary to induce biochemical and cellular responses by exogenous administration of growth factors. However, due to rapid proliferation from the target site following soluble delivery, the cells get insufficient levels of growth factors, which can interfere with the interaction and communication of the receptor with the ligand.
  • the present inventors completed the present invention by demonstrating the performance of the polypyrrole, a conductive polymer, as a high-efficiency cell capture / release platform, and developing a cell sheet to which growth factors were immobilized without using a scaffold.
  • Another object of the present invention is to provide a cell sheet for tissue engineering in which a growth factor is immobilized.
  • Another object of the present invention to provide a composition for inducing bone differentiation comprising a cell sheet in which the growth factor is fixed.
  • the present invention comprises the steps of culturing the target cells in the growth factor-fixed electroactive conductive polymer; And applying an electric field to separate the layer of growth factor-fixed cells from the electroactivated conductive polymer; It provides a method for producing a tissue sheet for tissue engineering comprising a.
  • the target cell may be a myoblast or mesenchymal stem cell.
  • the electrically activated conductive polymer is polypyrrole, a derivative thereof or an equivalent thereof, and the growth factor may be BMP2, TGF- ⁇ , a derivative thereof, or an equivalent thereof, to which biotin is attached. .
  • the polypyrrole is electrodeposited through biotin doping, and then the biotin-attached BMP2, TGF- ⁇ , derivatives thereof, or equivalents thereof are biotin-streptavidin crosslinking agents. It can be made using.
  • the present invention also provides a cell sheet for tissue engineering produced by the above-described manufacturing method.
  • the present invention also provides a cell sheet for tissue engineering, wherein the growth factor-fixed cell sheet is composed of a single layer or a 3D-multilayer.
  • the tissue engineering may be treatment of tissue, organ dysfunction or organ failure.
  • the treatment may be for cancer patients.
  • the cell sheet is used to treat any one bone disease selected from the group consisting of bone damage, bone loss and osteogenic mechanism, fibrotic osteoarthritis, aplastic bone disease and metabolic bone disease Or to treat any one cartilage disease selected from the group consisting of degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, fractures, muscle tissue damage, plantar fasciitis, humerus external surgery, calcification myositis, nonunion of the fracture and joint damage due to trauma. Can be.
  • the present invention also provides a composition for inducing bone differentiation or cartilage differentiation comprising the cell sheet for tissue engineering described above.
  • the cells of the cell sheet may be myoblasts or mesenchymal stem cells.
  • the inventors of the present invention have applied the unique electroactivation nature of polypyrrole to the development of novel scaffold-free cell sheet technology.
  • Figure 1 shows the manufacturing process for 3D cell sheet specifically bound to bone formation growth factor 2 (BMP2).
  • BMP2C12 cells were cultured on BMP2-fixed, biotin-doped polypyrrole surfaces.
  • Cell sheets are made of individual cells that are effectively bound to growth factors (specifically BMP2) via cell surface receptors, which can be released from polypyrrole nondestructively by applying an electric field ( ⁇ 0.8 V for 30 seconds).
  • the recovered cell sheets can be prepared overlapping as 3D-multilayers.
  • 2 (A) is a fluorescence microscopic image of polypyrrole (Ppy) alone (top), BMP2-fixed biotin-doped polypyrrole (medium) before electrical stimulation and BMP2-fixed biotin-doped polypyrrole (bottom) after electrical stimulation.
  • the potential ( ⁇ 0.8 V for 30 seconds) induced massive release of bound BMP2 and biotin from polypyrrole.
  • Surface-fixed BMP2 was visualized using fluorescein isothiocyanate (FITC) -binding anti-BMP2 antibodies.
  • 2 (B) is an ELISA result graphically showing the quantification of BMP2 immobilized on biotin-doped polypyrrole surfaces using various protein concentrations.
  • C is a fluorescence image of BMP2-binding C2C12 cells (upper row) and normal C2C12 cells (lower row). After electrical stimulation, the isolated BMP2-binding cells were incubated in a solution containing anti-BMP2 labeled FITC.
  • 3 (A) is a brightfield photograph of C2C12 cell sheet (s) isolated from biotin-doped polypyrrole in response to electrical stimulation ( ⁇ 0.8 V for 30 seconds). Inset images show the polypyrrole surface after separation of the cell sheet. 3D cell sheets were prepared by repeatedly layering the separated cell sheets in 35-mm cell culture dishes. 3 (B) shows the efficiency of cell separation from BMP2-fixed biotin-doped polypyrrole in response to an electric field (+ 0.4V to -0.8V for 30 seconds).
  • Figure 3 (C) is a 5mM ferricyan compound probe solution used as a marker, showing the effect of electrical stimulation on the cyclic voltammogram curve (cyclic voltammogram curve).
  • Figure 4 (A) shows the results of fluorescence-based live / dead viability assay of monolayer, BMP2-fixed C2C12 cell sheet (1-CS w / BMP2 i ) after 1 day of culture (left) or 7 days of culture (right).
  • 4 (B) is a graph comparing cell viability of BMP2-fixed cell sheets of monolayer (1-CS w / BMP2 i ) and 3-layer (3-CS w / BMP2 i ) after 1 day or 7 days of culture. .
  • FIGS. 5 (A) and 5 (B) are C2C12 cell sheets as controls
  • FIGS. 5 (C) and 5 (D) are C2C12 cell sheets with 100 ng of BMP2 in the culture medium
  • FIGS. 5 (E) and 5 (F) is a phase difference and fluorescence image of C2C12 to which BMP2 is fixed. After 7 days of culture, the cell sheets were separated by electrical stimulation. Fluorescence images were obtained by labeled nuclei using Hoechst dye.
  • 5 (G) is a confocal laser scanning microscope image of a two-layer cell sheet. The first recovered cell sheet was stained with streptavidin Cy3 after cell biotinylation and the second recovered cell sheet was stained with Hoechst dye.
  • Figure 6 is a control group (i) monolayer C2C12 cell sheet, (ii) monolayer C2C12 cell sheet (1-CS w / o BMP2 a ) without BMP2 added to culture medium, (iii) 100 ng in culture medium Monolayer C2C12 cell sheets (1-CS w / BMP2 a ) added with BMP2, and (iv) monolayer, trilayer and 5-layer C2C12 cell sheets (1-, 3- and 5-CS w / BMP2 fixed with BMP2) i ) ALP (Alkaline phosphatase) activity of the graph is shown.
  • ALP Alkaline phosphatase
  • FIG. 6 (B) shows the results of alizarin red staining of monolayer cell sheets in normal DMEM or osteogenic DMEM for 7 days.
  • BMP2-fixed cell sheets (CS w / BMP2 i ) were more strongly stained red in both normal cell and osteogenic medium than BMP2-added cell sheets (CS w / BMP2 a ).
  • FIG. 6 (C) is a quantification of mineralized areas stained in red using Image J software, where the stained areas represent osteoblast mineralization.
  • Figure 7 is a photograph comparing the bone differentiation of human mesenchymal stem cells after incubation in culture medium and bone differentiation induced culture medium using alizarin red staining.
  • Figure 8 is a photograph comparing the degree of cartilage differentiation of human mesenchymal stem cells after the culture in cartilage differentiation-induced culture medium and normal culture medium using an alcian blue staining.
  • FIG. 10 is a schematic representation of a 3D cell sheet.
  • scaffold-free cell sheet technology has been applied for the regeneration of damaged tissues and periods in various animal models as well as clinical trials including esophagus, cornea, and cardiomyopathy.
  • the use of cell sheets presents certain challenges. For example, to analyze the ex vivo / in vivo activity of cell sheets, it is necessary to induce biochemical and cellular responses by exogenous administration of growth factors.
  • the rapid diffusion from the target site following soluble delivery results in cells getting insufficient levels of growth factors, which can interfere with the interaction and communication of the receptor with the ligand.
  • the performance of the polypyrrole, a conductive polymer, as a high efficiency cell capture / release platform was demonstrated, and a solution for the above-mentioned problems was sought by providing a cell sheet having a growth factor immobilized without using a scaffold.
  • the cell sheet provided herein provides that (i) the natural and reversible redox reaction of the surface of the biotin-doped polypyrrole enables controlled binding and release of biomolecules, and (ii) the receptor and BMP2 Successful binding significantly improves bone differentiation of C2C12 cells, and (iii) the absence of scaffolds promotes high cell density resulting in improved integration with surrounding tissues, imitation of tissue function, and more complete regeneration of tissues do.
  • the simplification of this manufacturing method enables scaffold-free cell sheets to be integrated with in vitro tissue / period models and can be used for in vivo cell based treatment.
  • the present invention comprises the steps of culturing the target cell in a growth factor-fixed electroactive conductive polymer; And applying an electric field to separate the layer of growth factor-fixed cells from the electroactivated conductive polymer; It provides a method for producing a tissue sheet for tissue engineering comprising a.
  • the target cell may be a myoblast or mesenchymal stem cells
  • the cells are, for example, human, monkey, mouse, rat, dog, cow, horse, pig, sheep, It may be derived from mammals such as goats, cats, rabbits, hamsters, morphotes, or the like, but may be used without limitation as long as the cells are derived from mammals, and preferably derived from humans.
  • Myoblasts are muscle cells that are in an undifferentiated state and can be differentiated into bone cells by osteoblast growth factors such as BMP2.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • chondrocytes are cells that can differentiate into chondrocytes, bone cells, adipocytes, muscle cells, etc., and to cartilage, bone, muscle, ligament, and adipose tissue under specific culture conditions in vitro. Induction of differentiation is possible. Since mesenchymal stem cells are easily extracted from bone marrow, many studies have been conducted on the possibility of using them as cell therapeutics for various refractory diseases. Cartilage lacks regeneration and is very difficult to treat once damaged. Because degenerative arthritis is caused by degenerative changes in the joint, it cannot be completely stopped, and currently relies on drug therapy or physical therapy. However, no reliable drug has been developed to treat arthritis, and prolonged use of steroids and lubricants results in promoting cartilage degeneration.
  • cartilage regeneration using cell therapy can be applied to diseases such as the digestive system and urinary system, as well as musculoskeletal disorders. That is, by locally regenerating cartilage tissue, it can be applied to the treatment of diseases such as reflux esophagitis and urethral reflux.
  • the number of cells seeded into the electroactive conductive polymer may be in any range as long as the cell density is capable of forming a cell sheet.
  • the cell density is too low, the cell is badly shaped, the incubation time until the cell reaches the confluent state is long, and the time for the cell to mature and stain is also long, and too dense.
  • the cell proliferation is suppressed similarly, and the culture time until reaching a confluent state tends to be long, and the cell may die due to overcrowding.
  • the cell density to be seeded is 5 x 10 3 to 5 x 10 5 , preferably 1 x 10 4 to 1 x 10 5 , most preferably about 5 x 10 4 on 10 mm wide and 10 mm long. Preferably from 1 x 10 5 individuals.
  • the "electro-activated conductive polymer” refers to an organic compound having excellent electronic, electrical and optical properties, and also having processability and physical strength, which are advantages of the inherent polymer. Electro-activated conductive polymers can be used as biomaterials, nerve probes, tissue engineering scaffolds, and drug carriers because they can deliver electrical signals accurately and partially by controlling the degree and duration of electrical stimuli. I am getting it.
  • the electroactive conductive polymer used in the present invention is not particularly limited as long as it can be used as a biomaterial for medical applications, for example, polypyrrole, polythiophene, PEDOT (poly (3,4,4) -ethylenedioxythiophene)), polyaniline, derivatives thereof, or equivalents thereof, and preferably polypyrrole, derivatives thereof, or equivalents thereof.
  • the growth factor can be used without limitation various growth factors according to the differentiation purpose.
  • BMP2 bone morphogenetic protein 2
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • the C2C12 cell sheet specifically binds to BMP2, and that individual cells in the cell sheet may be labeled with BMP2 to stimulate bone formation in C2C12 myoblasts (FIG. 2). In addition, they were labeled with BMP2 or TGF- ⁇ to stimulate bone formation or chondrogenesis in mesenchymal stem cells (FIGS. 7 and 8).
  • the step of applying an electric field to separate the layer of growth factor-fixed cells from the electroactivated conductive polymer may be achieved by applying an electric field such that the cell layer can be non-destructively separated from the polypyrrole.
  • an electric field such that the cell layer can be non-destructively separated from the polypyrrole.
  • a method for preparing a tissue sheet for tissue engineering is as follows.
  • Conductive polymers such as polypyrrole (Ppy) are electrodeposited via biotin doping, and then the chemical bonding of the biotin attached BMP2 is accomplished using a biotin-streptavidin crosslinker. C2C12 cells are then cultured on the BMP2-fixed polypyrrole surface to induce interactions between cell surface receptors and binding BMP2 ligands. After this process, the BMP2-fixed cell layer can be easily separated from the polypyrrole surface by applying a dislocation (FIG. 1). This novel method results in a high affinity, ligand-bound cell sheet, which exhibits signal activity that occurs through uniform range and maximum receptor accessibility with membrane-bound proteins.
  • Ppy polypyrrole
  • the preparation method may be performed by varying the type of cell and the type of growth factor. Using this strategy to produce cell surfaces with preferred ligands forms structures that mimic living tissue, and thus the methods of the present invention have potential applicability in regenerative medicine and tissue engineering.
  • the present invention also provides a cell sheet for tissue engineering produced by the above-described manufacturing method.
  • the present invention also provides a cell sheet for tissue engineering, wherein the growth factor-fixed cell sheet is composed of a single layer or a 3D-multilayer.
  • the cell sheet manufactured by the manufacturing method may be a single layer or may form a multilayer by layering.
  • ClC12 cells of the prepared monolayer or multilayer cell sheets remained healthy (FIGS. 4A and 4B).
  • the cells were round in shape and showed a osteogenic phenotype after only 4 days, similar to the cell pattern from the culture medium to which the equivalent amount of BMP2 was added (FIGS. 5A-5F). ).
  • the monolayer or 3D multilayer cell sheet of the present invention may be applied to regenerative medicine or tissue engineering, and specifically, may be usefully used for the treatment of tissue, organ dysfunction or organ failure, but the cell sheet may be effectively applied. If so, there is no particular limitation on the use. Treatment of such tissue, organ dysfunction or organ failure includes the treatment of cancer patients, preferably osteosarcoma patients.
  • the cell sheet of the present invention can be used to prevent or treat bone diseases or cartilage diseases.
  • Bone disease can be any one selected from the group consisting of bone damage, bone loss and osteogenic mechanisms, fibrous osteoarthritis, aplastic bone disease and metabolic bone disease, but is not limited thereto.
  • cartilage disease refers to a disease caused by cartilage, cartilage tissue, and / or joint tissues (such as synovial membrane, articular follicle, subchondral bone, etc.) injured by mechanical stimulation or an inflammatory response, and includes cartilage damage diseases.
  • Such cartilage diseases include, but are not limited to, degenerative arthritis, rheumatoid arthritis, fractures, muscle tissue damage, plantar fasciitis, humerus external surgery, calcifying myositis, fracture nonunion or trauma.
  • the cell sheet of the present invention is capable of preventing the above diseases in humans and mammals other than humans (e.g., monkeys, mice, rats, dogs, cows, horses, pigs, sheep, goats, cats, rabbits, hamsters, mormots, etc.)
  • the range of disease sites that can be used and applicable for treatment is appropriately selected depending on the target disease, animal species to be administered, age, sex, weight, symptoms and the like.
  • the cell sheet for transplantation of the present invention may be transplanted by dividing once or several times.
  • the number of times of application of the transplant may be determined according to the medical practitioner and the guideline according to the disease.
  • the interval is not particularly limited, but a period of several days to several weeks may be provided.
  • the present invention also provides a composition for inducing bone differentiation comprising the cell sheet described above.
  • the cells of the cell sheet may be myoblasts or mesenchymal stem cells.
  • ALP activity in monolayer BMP2-fixed cell sheets (1-CS w / BMP2i) is four-fold improved when compared to C2C12 cells apparently cultured in medium without BMP2 (CS w / o BMP2a)
  • ALP activity was significantly higher in the multilayer than in the monolayer (FIG. 6A).
  • Alizarin Red staining results also confirmed that BMP2-fixed cellsheets favorably induce osteogenic differentiation and increased accumulation of mineralized calcium phosphate (FIGS. 6B and 6C).
  • Polypyrrole, sodium dodecylbenzene sulfonate (NaDSB), biotin, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS) are available from Sigma-Aldrich. Recombinant human BMP2 was obtained from Peprotech.
  • BMP2-fixed polypyrrole platforms were electrochemically prepared using potentiostat / galvanostat (BioLogic SP-50). ITO, platinum rings and Ag / AgCl standards were used as working electrode, counter electrode and standard electrode, respectively.
  • To prepare a biotin-doped polypyrrole platform with a 1 cm 2 surface area polypyrrole was prepared by adding 1 mM biotin and applying chronoamperology (CA) at 0.8 V for 60 seconds to 0.1 M pyrrole and 0.01 M NaDBS solution. Polymerized at The biotin-doped polypyrrole platform was then washed three times with ultrapure water.
  • CA chronoamperology
  • BMP2-fixed polypyrrole platforms 50, 100, 200 and 300 ng were electrically stimulated by applying CA at -0.8 V for 30 seconds to induce BMP2 release from the surface.
  • the amount of released BMP2 in the supernatant was analyzed and quantified using the Quantikine BMP-2 ELISA kit (R & D Systems).
  • 30 ⁇ l of FITC-binding anti BMP-2 antibody 5 ⁇ g / mL in PBS, Abcam
  • 50 ⁇ l of 1 wt% bovine serum albumin dissolved in PBS was added to prevent nonspecific binding. All prepared samples were observed with Zeiss Axio Observer Z1.
  • C2C12 myoblasts were obtained from the American Type culture Collection (ATCC) CRL-1772, 37 , 5% CO in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 100 units / mL antibiotic / antifungal. Incubated under 2 conditions.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • BMP2 For immunofluorescence observation of BMP2 in C2C12 cells, 1 ⁇ 10 5 cells / mL were seeded on BMP2-fixed polypyrrole platform and incubated overnight at 37, 5% CO 2 conditions. Cells were then easily released from the surface by exposure to an electric field for 30 seconds before being resuspended on the coverslip. After 3 hours, FITC-binding anti-BMP2 antibody was added to the culture medium and incubated for an additional 4 hours. Labeled cells were observed using Zeiss Axio Observer Z1.
  • C2C12 cells were seeded at a cell concentration of 5 ⁇ 10 4 on a BMP2-fixed, biotin-doped polypyrrole (BMP2-polypyrrole) platform (10 mm width, 10 mm length) and tight cell-cell connectivity. For 5 days in culture medium. The polypyrrole platform was then electrically stimulated using CA at -0.8 V for 30 seconds. Cell sheets were easily separated from the polypyrrole platform by gentle stirring and pipette control. The cell sheet was transferred to a new culture dish and the cell sheets of the second and third layers were sequentially attached to the first layer cell sheet using the method described above.
  • BMP2-polypyrrole biotin-doped polypyrrole
  • Cell sheets recovered from the polypyrrole platform were suspended in 12-well culture plates and maintained in complete culture medium. To monitor the survival rate over time of the cell sheet, calcein AM and ethidium homodimer-1 were added to the culture medium and incubated for 20 minutes. Labeled cell sheets were observed using Zeiss Axio Observer Z1. The recovered cell sheets were also suspended in 24-well culture plates and incubated in complete culture medium. After preparing monolayer or trilayer cell sheets, complete culture medium was added to each well and incubated in a 5% CO 2 , 37 incubator. After 24 or 48 hours suspension, the viability of the cell sheets was assessed using Cell Counting Kit-8 (Dojindo).
  • C2C12 cell sheets were recovered by electrical stimulation at ⁇ 0.8 V for 30 seconds and placed in 12-well culture plates. After biotinylating the cell surface with Sulfo-NHS-Biotin (0.5 mg / mL, 15 min), one cell sheet was stained with Hoechst 33341 (0.5 ⁇ l / mL, 1 h) and another cell sheet was Labeled with streptavidin-Cy3 (SA-Cy3, 0.5 ⁇ l / mL, 30 min). After spreading the cell sheet stained with Hoechst 33341 on the cover slip, the cell sheet stained with SA-Cy3 was placed on the cell sheet of the first layer. Multilayer cell sheets were observed in Zeiss LSM 710 ConfoCor 3 fluorescence microscope in 3D.
  • ALP activity was measured with an ALP assay kit (BioVision, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • 5 ⁇ 10 4 C2C12 cells were prepared on three different platforms: i) biotin-doped polypyrrole, ii) biotin-doped polypyrrole with 100 ng / mL BMP2 added to the culture medium, or iii) 100 ng BMP2. -Seeded and cultured on fixed polypyrrole platform. After incubation for 5 days, cell sheets of all groups were recovered by electrical stimulation and made of monolayer, trilayer, and 5-layer sheets. Cell sheets were transplanted into 6-well culture plates and then incubated for an additional 7 days.
  • the cell sheets were then lysed using ALP assay buffer for 1 hour and all cell lysates were centrifuged at 13500 rpm for 4-10 minutes. After centrifugation, the supernatants were placed in 96-well plates, p -nitrophenyl phosphate was added to each well and incubated for 37 to 30 minutes. All samples were measured with a microplate reader (Power Wave HT, BioTek) at a wavelength of 405 nm.
  • Alizarin red staining was performed according to standard protocols on the prepared cell sheets. 5 ⁇ 10 4 density C2C12 cells were cultured on biotin-doped polypyrrole or BMP-2 loading polypyrrole platforms to form tight cell-cell connections. All cells were recovered from the polypyrrole surface by electrical stimulation at ⁇ 0.8 V for 30 seconds and transplanted into 6-well culture plates. After 24 hours, the culture medium was replaced with DMEM containing 10% FBS or DMEM containing 2 mM L-glutamine, 50 ⁇ M ascorbic acid, 20 mM ⁇ -glycerol phosphate and 10% FBS. Cell sheets were then incubated for an additional 7 days in a 5% CO 2 , 37 incubator.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a manufacturing process of a 3D cell sheet.
  • polypyrrole was electrochemically polymerized on the ITO surface using biotin as a co-dopant of the polypyrrole film.
  • Biotin can be used as a bridge to target biomolecules.
  • electric-field-assisted cell sheets can be prepared, wherein a mouse skeletal muscle-derived C2C12 cell line was used as a working model.
  • individual cells in the 3D structure can be efficiently bound through growth factors, particularly BMP2 and cell surface receptors.
  • BMP2 plays an important role in inducing osteoblast differentiation of C2C12 myoblasts by blocking the myogenic differentiation pathway.
  • the introduction of BMP2 in the vicinity of the cell surface increases the recognition of cell membrane receptors as well as communication with cell membrane receptors, which leads to the formation of stable complexes between growth factors and receptors with continuous receptor activation.
  • This strategy takes into account the manipulation of individual target cells with the required functional entities and subsequent regulation of cell activity.
  • the advantages of the polypyrrole-based scaffold-free cell sheet produced in the present invention are as follows: (i) The natural and reversible redox reaction of the biotin-doped polypyrrole surface allows for controlled binding and release of biomolecules. . (ii) Successful binding of receptors and BMP2 outside the cell membrane of cells significantly improves bone differentiation of C2C12 cells and is so by efficient and site specific delivery of functional proteins.
  • the feasibility of the method of the present invention was investigated by examining the fixing efficiency of BMP2 with biotin attached to the functionalized polypyrrole surface.
  • C2C12 cells are cultured in medium containing BMP2.
  • soluble delivery of proteins often limits their availability to cell surface receptors.
  • cell sheets with BMP2 ligands labeled on each cell were constructed.
  • the binding efficiency of BMP2 to biotin-doped polypyrrole was investigated using a fluorescence microscope; Fluorescence images were used to examine the distribution of surface-fixed proteins with FITC-binding anti-BMP2 used as detection probes.
  • the green fluorescent region visible on the polypyrrole surface indicates the presence of BMP2 due to the selective binding of biotin-streptavidin binding.
  • the fluorescence signal disappears from the electrically stimulated polypyrrole surface, which can be explained primarily by the massive release of biotin and binding BMP2 from polypyrrole.
  • BMP2 loading efficiency was investigated using various concentrations. As shown in FIG. 2B, when 50-300 ng / cm 2 of BMP2 is applied to the biotin doped polypyrrole surface, the amount of fixed BMP2 is 39-147 ng / cm 2 (by ELISA quantification), which is surface-fixed BMP2.
  • the structure of the BMP2-binding C2C12 cell sheet was demonstrated.
  • C2C12 cells (5 ⁇ 10 4 ) were inoculated on the BMP2-fixed biotin dope polypyrrole surface for 5 days to enable intimate contact between the cells.
  • Cells aggregated into sheets can be nondestructively separated from the polypyrrole surface by applying an electric field (FIG. 3A).
  • the weak translocation precisely regulates the cell-surface contact acquired due to the spontaneous release of the biotin component and adherent cells.
  • the recovered cell sheet can easily be made into 3D cell multilayers.
  • C2C12 cell sheets grown on BMP2-fixed, biotin-doped polypyrrole surfaces exhibit electroactive ferricyan compound species through the polypyrrole surface due to the apparently reduced electron transfer capacity, especially intimate cell-surface junctions.
  • Electrical stimulation of -0.8 V is sufficient to separate the cell sheet from the polypyrrole surface, which eliminates the movement of the electrolyte and eventually restores the current strength to its original state.
  • the positive potential did not affect the peak intensity, indicating that the C2C12 cell sheet remained firmly attached to the polypyrrole surface regardless of the electrical stimulation applied.
  • BMP2-fixed C2C12 cell sheet After continuous electrical stimulation, the recovered second cell layer overlaps with the first cell layer, thereby mimicking 3D tissue formation.
  • the cell sheet produced has an approximate thickness of 35 micrometers.
  • BMP2-fixed C2C12 cell sheet After electrical stimulation, BMP2-fixed cell sheets (CS w / BMP2i) were transferred to the petri dishes to assess alkaline phosphate (ALP) activity in C2C12 cells (FIG. 6A).
  • ALP activity in monolayer BMP2-fixed cell sheets (1-CS w / BMP2i) was obviously four-fold improved compared to C2C12 cells cultured in medium without BMP2 (CS w / o BMP2a).
  • ALP activity was significantly higher in multiples than monolayers, indicating that 3D tissue produced by laminating each cell sheet upon transplantation is therapeutically much more effective.
  • elevated ALP activity in CS w / BMP2i may be due to membrane binding growth factor, which causes receptor-ligand complexes to form.
  • Growth factor-tethered cell sheets showed effective cell activity significantly associated with specific amounts of BMP2 present in individual cells, which is different from traditional soluble delivery methods. Indeed, direct binding of biomolecules to individual cells results in uniform distribution and long contact duration by limiting diffusion from the site of integration, thereby effectively triggering differentiation.
  • Osteoblast differentiation of C2C12 cells in 3D cell structure was investigated using Alizarin red staining assay (FIGS. 6B-6C).
  • CS w / BMP2i showed CS w / BMP2a stronger red staining in both normal cell and osteogenic medium.
  • the results of alizarin red staining indicate that BMP2-binding cell sheets favorably influence the induction of osteogenic differentiation and increase the accumulation of mineralized calcium phosphate.
  • CS w / BMP2i induced a four-fold increased mineral deposition compared to CS w / BMP2a, in particular bone formation medium.
  • 'pyrrole solution' 0.01 M PSS solution containing 0.1 M pyrrole and 1 mM biotin
  • sulfo-NHS-biotin 0.01 M PSS solution containing 0.1 M pyrrole and 1 mM biotin
  • TGF- ⁇ cartilage differentiation factor
  • BMP A cell sheet of human mesenchymal stem cells was prepared using -2 (bone cell differentiation factor) as follows.
  • TGF- ⁇ and BMP-2 After washing twice with 3 distilled water, apply TGF- ⁇ and BMP-2 at the concentration of 10 ng / mL to the polypyrrole film surface and incubate at 4 °C for 1 hour.
  • human mesenchymal stem cells were suspended on the polypyrrole film surface at a cell density of 1 ⁇ 10 5 for 4 hours at 37 ° C., 5% CO 2 incubator. Incubate to fix the cells on the surface.
  • the cell sheet was detached from the surface of the polypyrrole film by using electrical stimulation, and then stained with alizarin red s and alcian blue, respectively, and the growth factor was simply added to the culture medium and fixed to the surface of the polypyrrole to differentiate the cultured cells. Compared.
  • control group cultured by immobilizing TGF- ⁇ on the polypyrrole film surface showed higher chondrocyte differentiation rate compared to the control cultured by adding TGF- ⁇ to a normal culture medium.
  • Induction culture media showed a similar pattern.
  • FIG. 9 is a graph comparing the degree of differentiation by quantitatively analyzing the stained portions in FIGS. 7 and 8, through which a limited space such as a polypyrrole film is used rather than simply cultured by adding a growth factor or differentiation factor protein to the culture medium. When fixed to the culture was confirmed that the efficacy can be improved.
  • the present invention it is possible to provide a structure that mimics a living tissue by making a cell surface having a preferred ligand, and thus, the cell sheet of the present invention and its manufacturing method can be applied to regenerative medicine and tissue engineering.

Abstract

본 발명은 전기활성화 전도성 폴리머를 사용한 기능성 세포 시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전기활성화 전도성 폴리머를 사용한 기능성 세포 시트 및 이의 제조방법, 성장인자-고정 세포 시트가 단층 또는 3D-다층으로 이루어진 조직 공학용 세포 시트 및 상기 세포 시트를 포함하는 골분화 유도용 조성물을 제공한다.

Description

전기활성화 전도성 폴리머를 사용한 기능성 세포 시트 및 이의 제조방법
본 발명은 전기활성화 전도성 폴리머를 사용한 기능성 세포 시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전기활성화 전도성 폴리머를 사용한 기능성 세포 시트 및 이의 제조방법, 성장인자-고정 세포 시트가 단층 또는 3D-다층으로 이루어진 조직 공학용 세포 시트 및 상기 세포 시트를 포함하는 골분화 유도용 조성물을 제공한다.
최근 수십 년간, 조직, 장기 기능장애 또는 장기 부전의 치료를 위한 효과적인 방법을 개발하는데 상당한 노력을 기울여 왔다. 전통적인 임상 접근법은 타겟 부위에 자가 세포를 이식하거나 직접 주입하는 세포-기반 치료를 포함한다. 그러나, 분리된 세포를 타겟 조직에 정착 및 적응시키는 것과 관련된 어려움이 이러한 방법을 실용화하는 것을 방해해왔다. 세포와 성장인자가 3D 스캐폴드로 구조화된 조직 공학은 다른 방안을 제공한다. 조직 및 장기는 세포, 세포외 기질, 및 신호 분자를 포함하는 복합 3D 네트워크로 이루어진다. 이러한 네트워크에서 세포-세포 및 세포-세포외 기질의 상호작용은 생화학 및 세포 반응을 조절하기 위해 중요하다. 조직 공학은 그들을 방해하지 않고 이러한 자연적 생물학적 기능을 모방하는 것을 목표로 한다.
그러나 이러한 목표를 달성하는 것은 구조적 템플레이트로 작용하고 세포 부착, 세포 증식 및 결국에는 조직 형성을 촉진하는 생체적합한 스캐폴드를 필요로 한다. 일반적으로, 합성 및 자연 생체적합물질은 세포외기질(EMC)-유사 스캐폴드로 적용되며, 이는 균일한 세포 파종(seeding)과 부착, 및 다양한 성장인자의 방출을 조절하기 위한 매트릭스로 작용한다. 그러나, 최근 세포 시트 공학은 “스캐폴드가 없는” 조직 공학 접근법을 제안하고 있으며, 이는 온도-반응 폴리머를 사용할 때 특히 유리할 수 있다. 분리된 세포를 주입하는 것과 비교하여, 이러한 스캐폴드가 없는 방법은 세포 부착 및 증식을 개선하고 따라서 숙주조직과의 통합을 개선시킨다. 동시에 EMC의 본래의 기능, 구조 및 통합성을 유지한다. 스캐폴드가 없는 세포 시트 기술은 식도, 각막, 및 심근증을 포함하는 임상 실험 뿐만 아니라 다양한 동물 모델에서 손상된 조직과 기간의 재생을 위해 적용되어 왔다. 이러한 이점에도 불구하고, 세포 시트의 사용은 특정 과제가 존재한다. 예를 들어, 세포 시트의 생체 외/생체 내 활성을 분석하기 위해, 이는 성장인자의 외인성 투여에 의한 생화학 및 세포 반응을 유도하는 것이 필요하다. 그러나, 가용성 전달(soluble delivery) 다음의 타겟 위치로부터 빠른 확산으로 인해 세포는 성장 인자를 불충분한 수준으로 얻고, 이는 수용체와 리간드의 상호작용 및 커뮤니케이션을 방해할 수 있다.
이에, 본 발명자들은 전도성 폴리머인, 폴리피롤의 고효율 세포 포착/방출 플랫폼으로서의 성능을 입증하고 스캐폴드를 사용하지 않고 성장인자가 고정된 세포시트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 조직 공학용 세포 시트 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 성장인자가 고정된 조직 공학용 세포 시트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 성장인자가 고정된 세포 시트를 포함하는 골분화 유도용 조성물을 제공하는데 있다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 타겟 세포를 성장인자-고정 전기활성화 전도성 폴리머에 배양하는 단계; 및 전기장을 적용하여 성장인자-고정 세포의 층을 전기활성화 전도성 폴리머로부터 분리하는 단계; 를 포함하는 조직 공학용 세포 시트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 타겟 세포는 근아세포 또는 간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 전기활성화 전도성 폴리머는 폴리피롤, 이의 유도체 또는 이의 등가물이고, 상기 성장인자는 비오틴이 부착된 BMP2, TGF-β, 이들의 유도체 또는 이들의 등가물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 폴리피롤은 비오틴 도핑을 통해 전착되고, 이후 비오틴이 부착된 BMP2, TGF-β, 이들의 유도체 또는 이들의 등가물의 화학적 결합이 비오틴-스트렙타비딘 가교제를 이용하여 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 제조방법에 의해 제조되는 조직 공학용 세포 시트를 제공한다.
본 발명은 또한, 성장인자-고정 세포 시트가 단층 또는 3D-다층(multilayer)으로 이루어진 조직 공학용 세포 시트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조직 공학은 조직, 장기 기능장애 또는 장기 부전의 치료일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 치료는 암환자를 위한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 세포 시트는 골손상, 골손실 및 골형성 기작병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 골 질환을 치료하거나, 또는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 및 외상에 의한 관절손상으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 연골 질환을 치료하기 위해 이식될 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 조직 공학용 세포 시트를 포함하는 골분화 또는 연골분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 세포 시트의 세포는 근아세포 또는 간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명의 발명자들은 폴리피롤의 고유한 전기활성화 본성을 신규한 스캐폴드가 없는 세포 시트 기술을 개발하는데 적용하였다. 본 발명에서는 바람직한 리간드를 갖는 세포 표면을 제작함으로써 생체 조직을 모방한 구조물을 제공하는 것이 가능하므로, 본 발명의 세포 시트 및 이의 제조 방법은 재생 의료와 조직 공학에 적용될 수 있다.
도 1은 골형성성장인자 2(BMP2)와 특이적으로 결합된 3D 세포 시트에 대한 제조 공정을 나타낸다. C2C12 세포는 BMP2-고정, 비오틴-도핑 폴리피롤 표면에서 배양되었다. 세포 시트는 세포 표면 수용체를 통해 효과적으로 성장인자(구체적으로 BMP2)가 결합된 개별적인 세포로 제조되고, 이들은 전기장(30초 동안 -0.8V)을 적용함으로써 비파괴적으로 폴리피롤로부터 방출될 수 있다. 회수된 세포 시트는 3D-다층으로서 겹쳐서 제조될 수 있다.
도 2(A)는 폴리피롤(Ppy) 단독 (위), 전기 자극 전 BMP2-고정 비오틴-도핑 폴리피롤 (중간) 및 전기 자극 후 BMP2-고정 비오틴-도핑 폴리피롤 (아래)의 형광 현미경 이미지이다. 전위(30초 동안 -0.8V)는 폴리피롤로부터 결합된 BMP2와 비오틴의 방대한 방출을 유도했다. 표면-고정 BMP2는 플루오레세인 이소티오시안염 (FITC)-결합 항-BMP2 항체를 사용하여 시각화 하였다. 도 2(B)는 다양한 단백질 농도를 사용하여 비오틴-도핑 폴리피롤 표면에 고정된 BMP2의 정량화를 그래프로 나타낸 ELISA 결과이다. 도 2(C)는 BMP2-결합 C2C12 세포(윗줄)와 보통의 C2C12 세포(아래줄)의 형광 이미지이다. 전기 자극 후, 분리된 BMP2-결합 세포는 항-BMP2 표지 FITC를 함유하는 용액에서 배양되었다.
도 3(A)는 전기 자극(30초 동안 -0.8V)에 반응하여 비오틴-도핑 폴리피롤로부터 분리된 C2C12 세포 시트(들)의 명시야 사진이다. 인세트(inset) 이미지는 세포 시트의 분리 후 폴리피롤 표면을 나타낸다. 3D 세포 시트는 35-mm 세포 배양 디쉬에서 분리된 세포 시트를 반복적으로 레이어링(layering)함으로써 제조되었다. 도 3(B)는 전기장(30초 동안 +0.4V 내지 -0.8V)에 대한 반응으로 BMP2-고정 비오틴-도핑 폴리피롤로부터의 세포 분리 효율을 나타낸 것이다. 도 3(C)는 표지자로 사용된 5mM 페리시안 화합물 프로브 용액으로, 사이클릭 볼타모그램 커브(cyclic voltammogram curve)에서 전기 자극의 효과를 나타낸 것이다.
도 4(A)는 배양 1일 후(왼쪽) 또는 배양 7일 후(오른쪽) 단층, BMP2-고정 C2C12 세포 시트(1-CS w/BMP2i)의 fluorescence-based live/dead viability assay 결과를 나타낸 것이다. 도 4(B)는 배양 1일 또는 7일 후, 단층(1-CS w/BMP2i)과 3층(3-CS w/BMP2i)의 BMP2-고정 세포 시트의 세포 생존율을 비교한 그래프이다.
도 5(A) 및 5(B)는 대조군으로서 C2C12 세포 시트, 도 5(C) 및 5(D)는 배양 배지에 100 ng의 BMP2를 갖는 C2C12 세포 시트, 그리고 도 5(E) 및 도 5(F)는 BMP2가 고정된 C2C12의 위상차 및 형광 이미지이다. 배양 7일 후, 세포 시트는 전기 자극으로 분리되었다. 형광 이미지는 Hoechst dye를 사용하여 표지된 핵에 의해 수득되었다. 도 5(G)는 2층 세포 시트의 공초점 레이저주사현미경 이미지이다. 첫 번째 회수된 세포 시트는 세포 비오티닐화 후 스트렙타비딘 Cy3로 염색되었고 두 번째 회수된 세포 시트는 Hoechst dye로 염색되었다.
도 6(A)는 대조군으로 (i) 단층 C2C12 세포 시트, (ii) 배양 배지에 BMP2가 첨가되지 않은 단층 C2C12 세포 시트(1-CS w/o BMP2a), (iii) 배양 배지에 100 ng의 BMP2가 첨가된 단층 C2C12 세포 시트(1-CS w/ BMP2a), 및 (iv) BMP2로 고정된 단층, 3층 및 5층 C2C12 세포 시트(1-, 3- 및 5- CS w/ BMP2i)의 ALP(Alkaline phosphatase) 활성을 그래프로 나타낸 것이다. 도 6(B)는 7일 동안 보통 DMEM 또는 골형성 DMEM에서 단층 세포 시트의 알리자린 레드 염색 결과를 나타낸 것이다. BMP2-고정 세포 시트(CS w/ BMP2i)는 BMP2-첨가 세포 시트(CS w/ BMP2a) 보다 보통의 세포 배지와 골형성 배지 모두에서 붉은 색으로 더 강하게 염색되었다. 도 6(C)는 Image J software를 사용하여 붉은색으로 염색된 광물화된 영역(mineralized area)을 정량화한 것으로, 염색된 영역은 골아세포 광물화를 나타낸다.
도 7은 골 분화 유도 배양배지와 보통의 배양배지에서 배양을 시킨 후에 인간 간엽줄기세포의 골 분화 정도를 알리자린 레드 염색을 이용하여 비교한 사진이다.
도 8은 연골분화 유도 배양배지와 보통의 배양배지에서 배양을 시킨 후에 인간 간엽줄기세포의 연골분화 정도를 알시안 블루 염색을 이용하여 비교한 사진이다.
도 9는 도 7 및 8에서 염색이 된 부분을 정량적으로 분석하여 분화 정도를 비교한 그래프이다.
도 10은 3D 세포 시트의 개략도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상술한 바와 같이, 스캐폴드가 없는 세포 시트 기술은 식도, 각막, 및 심근증을 포함하는 임상 실험 뿐만 아니라 다양한 동물 모델에서 손상된 조직과 기간의 재생을 위해 적용되어 왔다. 이러한 이점에도 불구하고, 세포 시트의 사용은 특정 과제가 존재한다. 예를 들어, 세포 시트의 생체 외/생체 내 활성을 분석하기 위해, 이는 성장인자의 외인성 투여에 의한 생화학 및 세포 반응을 유도하는 것이 필요하다. 그러나, 가용성 전달(soluble delivery) 다음의 타겟 위치로부터 빠른 확산으로 인해 세포는 성장 인자를 불충분한 수준으로 얻고, 이는 수용체와 리간드의 상호작용 및 커뮤니케이션을 방해할 수 있다는 문제가 있다.
이에 본 발명에서는 전도성 폴리머인, 폴리피롤의 고효율 세포 포착/방출 플랫폼으로서의 성능을 입증하고 스캐폴드를 사용하지 않고 성장인자가 고정된 세포시트를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명에서 제공되는 세포 시트는 (i) 비오틴-도핑 폴리피롤 표면의 자연적이고 가역성인 산화 환원 반응이 생체분자의 조절된 결합 및 방출을 가능하게 하고, (ii) 세포 멤브레인의 세포 밖에서 수용체와 BMP2의 성공적인 결합이 C2C12 세포의 골분화를 현저하게 개선시키며, (iii) 스캐폴드가 없기 때문에 주변 환경 조직과 개선된 통합, 조직 기능의 모방, 및 조직의 더욱 완전한 재생을 함께 야기하는 높은 세포 밀도를 촉진한다. 이러한 제조방법의 단순화는 생체 외 조직/기간 모델과 통합되는 스캐폴드가 없는 세포 시트를 가능하게 하고 생체 내 세포 기반 치료에 사용될 수 있게 한다.
본 발명은 타겟 세포를 성장인자-고정 전기활성화 전도성 폴리머에 배양하는 단계; 및 전기장을 적용하여 성장인자-고정 세포의 층을 전기활성화 전도성 폴리머로부터 분리하는 단계; 를 포함하는 조직 공학용 세포 시트의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 타겟 세포는 근아세포(myoblast) 또는 간엽줄기세포일 수 있으며, 상기 세포들은는 예를 들어, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트 등의 포유 동물 유래일 수 있으나, 포유 동물 유래의 세포이면 제한 없이 사용할 수 있고, 바람직하게는 인간 유래일 수 있다.
근아세포 (myoblast)는 분화되지 않은 상태에 있는 근육 세포이며, BMP2와 같은 골형성성장인자에 의해 골세포로 분화할 수 있다.
간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSC)는 연골세포, 골세포, 지방세포 및 근육세포 등으로 분화할 수 있는 세포로서, 시험관 내에서 특정 배양조건하에 연골, 뼈, 근육, 인대 및 지방조직 등으로의 분화 유도가 가능하다. 중간엽 줄기세포는 골수에서 추출이 용이하여 여러 가지 난치성 질환에 대한 세포 치료제로의 이용 가능성에 대하여 많은 연구가 진행되고 있다. 연골은 재생력이 부족하여 한번 손상된 후에는 이를 치료하는 것이 매우 어렵다. 퇴행성 관절염은 관절의 퇴행성 변화에 의해서 발생하므로 이를 완전히 정지시킬 수는 없으며, 현재는 약물요법이나 물리 치료 등에 의존하고 있다. 그러나 관절염을 치료하는 확실한 약물이 개발되지 않은 상태이며, 스테로이드제제 및 윤활제의 장기간 사용은 연골의 변성을 촉진시키는 결과를 초래한다. 최근에 자가 연골 세포 이식술이 개발되었으나, 연골조직의 제한, 연골세포의 시험관 배양 중 탈분화, 고 연령에 따른 세포증식의 한계 등이 문제점으로 남아 있다. 따라서, 재생력이 풍부한 중간엽 줄기세포의 이용은 생물학적 복원이 파괴된 연골을 재생하는데 효과적인 세포 치료제로서 응용될 수 있다. 세포치료제를 이용한 연골 재생은 근골격계 질환뿐만 아니라, 소화기계 및 비뇨기계 등의 질환에 응용될 수 있다. 즉, 국소적으로 연골 조직을 재생시켜 줌으로써 역류성 식도염 및 요도 역류 등의 질병 치료에 응용 가능하다.
전기활성화 전도성 폴리머에 파종(seed)되는 세포의 수는 세포 시트를 형성시킬 수 있는 세포 밀도이면 어떠한 범위라도 상관없다. 그러나, 세포 밀도가 지나치게 낮은 경우에는, 세포의 형태가 나쁘고, 세포가 컨플루언트한 상태에 이를 때까지의 배양 시간이 길고, 또한 세포가 성숙하여 착색되기까지 걸리는 시간도 길어지며, 또 지나치게 조밀한 경우에도 동일하게 세포 증식을 억제하고, 컨플루언트한 상태에 이를 때까지의 배양 시간이 길어지는 경향이 있는 것 외에, 과밀하기 때문에 세포가 죽어 버리는 경우도 있다. 따라서 파종되는 세포 밀도는, 10 mm 폭, 10 mm 길이 상에 5 x 103 내지 5 x 105개, 바람직하게는 1 x 104 내지 1 x 105개, 가장 바람직하게는 약 5 x 104 내지 1 x 105 개인 것이 좋다.
본 발명에서 "전기활성화 전도성 폴리머"는 우수한 전자적, 전기적, 광학적 특성을 지닌 동시에 고유의 고분자가 갖는 이점인 가공성과 물리적 강도도 지니고 있는 유기화합물을 말한다. 전기활성화 전도성 폴리머는 전기적 자극의 정도와 지속시간을 조절하여 전기적 신호를 정확하고 부분적으로 전달할 수 있기 때문에 바이오센서, 신경 프로브(probe), 조직공학용 스캐폴드(scaffold), 약물전달체 등의 재료로 주목 받고 있다. 본 발명에서 사용되는 전기활성화 전도성 폴리머는 의공학적 응용을 위한 생체재료로 사용될 수 있는 것이라면 특별히 제한하지 않으나, 예를 들어, 폴리피롤(polypyrrole), 폴리티오핀(polythiophene), PEDOT(poly(3,4-ethylenedioxythiophene)), 폴리아닐린 (polyaniline), 이들의 유도체 또는 이들의 등가물일 수 있고, 바람직하게는 폴리피롤, 이의 유도체 또는 이의 등가물일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 성장인자는 분화 목적에 따라 다양한 성장인자를 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 골분화 유도를 위해 성장인자로 BMP2(bone morphogenetic protein 2)를 사용하였으나, BMP2의 유도체 또는 등가물, BMP2 이외에도 골분화를 유도할 수 있는 성장인자라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에서는 연골분화 유도를 위해 성장인자로 TGF-β(transforming growth factor-β)를 사용하였으나, TGF-β의 유도체 또는 등가물, TGF-β 이외에도 연골분화를 유도할 수 있는 성장인자라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 일실시예에서는 C2C12 세포 시트가 BMP2에 특이적으로 결합하며, 세포 시트 내 개별적인 세포는 C2C12 근아세포에서 골형성을 자극하기 위해 BMP2로 표지될 수 있음을 확인하였다(도 2). 또한, 간엽줄기세포에서 골형성 또는 연골형성을 자극하기 위해 BMP2 또는 TGF-β로 표지되었다(도 7 및 8).
본 발명의 제조방법에 있어서, 전기장을 적용하여 성장인자-고정 세포의 층을 전기활성화 전도성 폴리머로부터 분리하는 단계는 세포층이 폴리피롤로부터 비파괴적으로 분리될 수 있는 정도의 전기장을 적용함으로써 이루어질 수 있다. 음전위가 적용되었을 때 세포의 선택절인 분리가 일어나며, -2.0V 내지 -0.4V, 바람직하게는 -1.5V 내지 -0.8V로 30초 내지 3분 정도 적용하는 것이 높은 효율로 세포층을 분리할 수 있다(도 3).
본 발명의 구체적인 일실시예에 따른면, 조직 공학용 세포 시트의 제조방법은 다음과 같다.
전도성 폴리머, 예를 들어, 폴리피롤(Ppy)은 비오틴 도핑을 통해 전착되며, 이후 비오틴이 부착된 BMP2의 화학적 결합이 비오틴-스트렙타비딘 가교제를 이용하여 이루어진다. 그 다음, 세포 표면 수용체와 결합 BMP2 리간드 사이의 상호작용을 유도하기 위해 C2C12 세포를 BMP2-고정 폴리피롤 표면에서 배양한다. 이러한 과정 이후, BMP2-고정 세포층은 전위를 적용함으로써 쉽게 폴리피롤 표면으로부터 분리될 수 있다(도 1). 이러한 신규 방법은 높은 친화도, 리간드-결합 세포 시트를 야기하고, 이는 멤브레인-결합 단백질을 갖는 균일한 범위와 최대 수용체 접근성을 통해 발생하는 신호 활성을 나타낸다.
상기의 제조방법은 세포의 종류와 성장인자의 종류를 달리하여 수행될 수 있다. 이러한 전략을 사용하여 바람직한 리간드를 갖는 세포 표면을 제조하는 것은 생체 조직을 모방하는 구조물을 형성하며, 따라서 본 발명의 방법은 재생 의료 및 조직 공학에 잠재적인 적용 가능성을 갖는다.
본 발명은 또한, 전술한 제조방법에 의해 제조되는 조직 공학용 세포 시트를 제공한다.
본 발명은 또한, 성장인자-고정 세포 시트가 단층 또는 3D-다층(multilayer)으로 이루어진 조직 공학용 세포 시트를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 제조방법에 의해 제조된 세포 시트는 단층이나, 레이어링하여 다층(multilayer)을 형성할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 배양 1일 및 7일 후에도, 제조된 단층 또는 다층 세포 시트의 ClC12 세포는 건강한 상태를 유지하였다(도 4A 및 4B). 또한, BMP2-표지된 C2C12 단층 세포 시트에서, 세포는 둥근 모양이었고, 단 4일 후 골형성 표현형을 나타냈으며, 등가량의 BMP2가 첨가된 배양 배지로부터의 세포 패턴과 유사했다(도 5A 내지 5F). 이중층의 C2C12 세포 시트는 연속적 전기 자극 후, 회수된 제2 세포층이 제1 세포층과 겹쳐지고 이로써 3D 조직 형성을 모방한다(도 5G).
따라서, 본 발명의 단층 또는 3D 다층의 세포 시트는 재생 의료 또는 조직 공학에 적용될 수 있으며, 구체적으로, 조직, 장기 기능장애 또는 장기 부전의 치료에 유용하게 사용할 수 있으나, 세포 시트가 효과적으로 적용될 수 있는 것이라면 용도에 특별한 제한은 없다. 상기 조직, 장기 기능장애 또는 장기 부전의 치료는 암환자, 바람직하게는 골육종(osteosarcoma) 환자의 치료를 포함한다.
본 발명의 세포 시트는 골 질환 또는 연골질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다. "골 질환"은 골손상, 골손실 및 골형성 기작병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, "연골 질환"은 연골, 연골 조직 및/또는 관절조직(활막, 관절포, 연골하골 등)이 기계적 자극이나 염증 반응에 의해 상해됨으로써 발생하는 질환을 말하며, 연골손상 질환을 포함한다. 이러한 연골질환에는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 또는 외상에 의한 관절손상이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 세포 시트는, 인간, 인간 이외의 포유 동물 (예：원숭이, 마우스, 래트, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트 등) 에 있어서의 상기 질환을 치료하기 위해서 사용할 수 있고 적용 가능한 질환 부위의 범위는, 대상 질환, 투여 대상의 동물종, 연령, 성별, 체중, 증상 등에 의존하여 적절히 선택된다.
본 발명의 이식용 세포 시트는, 1 회 또는 수 회로 나누어 이식해도 된다. 이식의 적용 횟수는 질환에 따라 의료 종사자, 가이드라인에 따라 결정될 수 있다, 예를 들어 복수 회 이식을 실시하는 경우, 인터벌은 특별히 한정되지 않지만, 수일 내지 수 주일의 기간을 두어도 된다.
본 발명은 또한, 전술한 세포 시트를 포함하는 골분화 유도용 조성물을 제공한다.
상기 세포 시트의 세포는 근아세포 또는 간엽줄기세포일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는, 단층 BMP2-고정 세포 시트(1-CS w/BMP2i)에서 ALP 활성이 명백하게 BMP2가 없는 배지(CS w/o BMP2a)에서 배양된 C2C12 세포와 비교했을 때 4배 개선되며 ALP 활성은 단층보다 다층에서 현저하게 높다는 것을 확인하였다(도 6A). 또한, 알리자린 레드 염색 결과를 통해 BMP2-고정 세포시트가 골형성 분화의 유도에 유리하게 영향을 미치며 광화(mineralized) 칼슘 포스페이트의 축적을 증가시킨다는 것을 확인하였다(도 6B 및 6C).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 1]
근아세포를 이용한 세포 시트 및 이의 제조
1. 실험
1-1. 재료의 준비
폴리피롤, 소듐 도데실벤젠 설포네이트(NaDSB), 비오틴, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)는 Sigma-Aldrich에서 구입하였고, 재조합 인간 BMP2는 Peprotech로부터 입수하였다.
1-2. BMP2-고정 폴리피롤(Ppy) 플랫폼의 제조
BMP2-고정 폴리피롤 플랫폼은 potentiostat/galvanostat (BioLogic SP-50)을 사용하여 전기화학적으로 제조되었다. ITO, 백금 고리 및 Ag/AgCl 표준은 각각 작업 전극, 상대 전극 및 표준 전극으로 사용하였다. 1 cm2 표면 영역을 갖는 비오틴-도핑 폴리피롤 플랫폼을 제조하기 위해, 폴리피롤은 1mM의 비오틴을 첨가하고 60초 동안 0.8V에서 크로노암페로메트리(CA)를 적용함으로써 0.1M 피롤과 0.01 M NaDBS 용액에서 중합되었다. 이후, 비오틴-도핑 폴리피롤 플랫폼은 3번 초정제수로 세척되었다. 에어-드라잉 이후, 10 ng/mL의 스트렙타비딘(SA)을 30분 동안 폴리피롤 플랫폼 상의 비오틴과 결합시키고 초정제수로 세척하였다. 다양한 농도(50, 100, 200, 및 300 ng)의 BMP2가 제조업자의 프로토콜에 따라 Sulfo-NHS-비오틴 (Thermo Scientific) 용액을 사용하여 비오티닐화 (biotinylated)되었고 이후 SA-종결 폴리피롤 표면에 첨가하였다.
1-3. 폴리피롤 플랫폼상의 BMP2 로딩 효율
0, 100, 200 및 300 ng의 BMP2-고정 폴리피롤 플랫폼 (50, 100, 200 및 300 ng)은 표면으로부터 BMP2 방출을 유도하기 위해 30초 동안 -0.8 V로 CA를 적용하여 전기적으로 자극하였다. 상층액의 방출된 BMP2의 양이 분석되었고 Quantikine BMP-2 ELISA kit (R&D Systems)를 이용하여 정량화 되었다. 폴리피롤 표면에 부착된 BMP2의 시각화를 위해, 30 ㎕의 FITC-결합 항 BMP-2 항체 (5 ㎍/mL in PBS, Abcam)를 BMP2-로딩 폴리피롤 표면에 첨가하였고 4에서 6시간 동안 배양하였다. PBS로 세척 후, PBS에 용해된 50 ㎕의 1 wt% 소혈청 알부민을 비특이적 결합을 방지하기 위해 첨가하였다. 모든 제조된 샘플은 Zeiss Axio Observer Z1로 관찰되었다.
1-4. 세포 배양
C2C12 근아세포는 American Type culture Collection (ATCC) CRL-1772로부터 입수하였고, 10% 우태아 혈청(FBS) 및 100 units/mL 항생제/항진균제를 함유하는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 37, 5% CO2 조건 하에 배양하였다. 세포 배양 시약은 Thermo Scientific and Life Technologies로부터 구매하였다.
1-5. 세포 표면에 결합된 BMP2의 면역형광 관찰
C2C12 세포에서 BMP2의 면역형광 관찰을 위해, 1 × 105 cells/mL를 BMP2-고정 폴리피롤 플랫폼 상에 파종하고, 37, 5% CO2 조건에서 밤새 배양했다. 이후 세포는 커버슬립에 재현탁되기 전에 30초 동안 전기장에 노출하여 표면으로부터 용이하게 방출시켰다. 3시간 후, FITC-결합 항-BMP2 항체를 배양 배지에 첨가하고 추가적 4시간 동안 배양하였다. 표지된 세포는 Zeiss Axio Observer Z1를 이용하여 관찰되었다.
1-6. 세포 시트 다층 레이어링(multi-layering)
세포 시트 다층 레이어링을 위해, C2C12 세포는 BMP2-고정, 비오틴-도핑 폴리피롤 (BMP2-폴리피롤) 플랫폼 (10 mm width, 10 mm length) 상에 5 × 104의 세포 농도로 파종되었고 긴밀한 세포-세포 연결을 위해 배양 배지에서 5일 동안 배양하였다. 이후, 폴리피롤 플랫폼은 30초 동안 -0.8V로 CA를 사용하여 전기적으로 자극되었다. 세포 시트는 부드럽게 교반 및 피펫 제어로 폴리피롤 플랫폼으로부터 쉽게 분리되었다. 세포 시트를 새로운 배양 디쉬에 옮기고, 전술한 방법을 이용하여 제2층 및 제3층의 세포 시트를 순차적으로 제1층 세포시트에 부착하였다.
1-7. 세포 시트 생존율
폴리피롤 플랫폼으로부터 회수된 세포 시트를 12-웰 배양 플레이트에 현탁시키고 완전 배양 배지에 유지하였다. 세포 시트의 시간에 따른 생존율을 모니터링하기 위해, 칼세인 AM과 에티듐 호모다이머-1을 배양 배지에 첨가하고 20분 동안 배양하였다. 표지된 세포 시트는 Zeiss Axio Observer Z1를 이용하여 관찰되었다. 또한, 회수된 세포 시트를 24-웰 배양 플레이트에 현탁하였고 완전 배양 배지에서 배양하였다. 단층 또는 3층 세포 시트를 제조한 후, 완전 배양 배지를 각 웰에 첨가하고 5% CO2, 37 배양기에서 배양하였다. 24시간 또는 48시간 현탁 후, 세포 시트의 생존율은 Cell Counting Kit-8 (Dojindo)를 이용하여 평가되었다.
1-8. 세포 시트의 형태 관찰
형태 관찰을 위해, 5 × 104 세포를 3가지 종류의 플랫폼, i) 비오틴-도핑 폴리피롤, ii) 배양 배지에 100 ng/mL의 BMP2가 첨가된 비오틴-도핑 폴리피롤, 또는 iii) 100 ng의 BMP2-고정 폴리피롤에서 배양하였다. 배양 7일 후, 세포 시트를 분리하기 위해 폴리피롤 표면에 전기 자극을 가했다. Hoechst 33341 (Life Technologies)을 세포 시트가 포함된 배양 배지에 첨가하고 30분 동안 배양하였다. 표지된 세포 시트를 Zeiss Axio Observer Z1을 이용하여 관찰하였다.
1-9. 다층 세포 시트의 3D 관찰
다층 세포 시트의 관찰을 위해, C2C12 세포 시트를 30초 동안 -0.8 V로 전기 자극하여 회수하였고 12-웰 배양 플레이트에 두었다. 세포 표면을 Sulfo-NHS-Biotin (0.5 mg/mL, 15 min)으로 비오티닐화한 후, 하나의 세포 시트를 Hoechst 33341 (0.5 ㎕/mL, 1 h)로 염색하고 또 다른 하나의 세포 시트를 스트렙타비딘-Cy3 (SA-Cy3, 0.5 ㎕/mL, 30 min)로 표지하였다. 커버 슬립에 Hoechst 33341로 염색된 세포 시트를 펼친 후, SA-Cy3로 염색된 세포 시트를 제1층의 세포 시트 위에 두었다. 다층 세포 시트를 3D로 Zeiss LSM 710 ConfoCor 3 형광현미경에서 관찰하였다.
1-10. 알칼리 포스파타아제 활성(ALP) 어세이
ALP 활성을 제조업자의 지시에 따라, ALP assay kit (BioVision, USA)로 측정하였다. 요약하면, 5 × 104의 C2C12 세포를 3가지 종류의 플랫폼, i) 비오틴-도핑 폴리피롤, ii) 배양 배지에 100 ng/mL의 BMP2가 첨가된 비오틴-도핑 폴리피롤, 또는 iii) 100 ng의 BMP2-고정 폴리피롤 플랫폼에 파종하고 배양하였다. 5일 동안 배양한 후, 모든 그룹의 세포 시트는 전기 자극에 의해 회수되었고 단층, 3층, 및 5층 시트로 제조되었다. 세포 시트를 6-웰 배양 플레이트에 이식한 다음 추가 7일 동안 배양하였다. 이후, 세포 시트를 ALP 어세이 버퍼를 사용하여 1시간 동안 용해하고 모든 세포 용해물을 4에서 10분 동안 13500 rpm으로 원심분리 하였다. 원심분리 후, 상층액을 96-웰 플레이트에 두고, p-니트로페닐 포스페이트를 각 웰에 첨가하고, 37에서 30분 동안 배양하였다. 모든 샘플을 405 nm의 파장에서 마이크로플레이트 리더 (Power Wave HT, BioTek)로 측정하였다.
1-11. 알리자린 레드 염색
알리자린 레드 염색을 제조된 세포 시트에서 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 5 × 104 밀도의 C2C12 세포를 비오틴-도핑 폴리피롤 또는 BMP-2 로딩 폴리피롤 플랫폼에 배양하여 긴밀한 세포-세포 연결을 형성하였다. 모든 세포는 30초 동안 -0.8V로 전기 자극하여 폴리피롤 표면으로부터 회수하였고 6-웰 배양 플레이트에 이식하였다. 24시간 후, 배양 배지를 10% FBS를 함유하는 DMEM 또는 2 mM L-글루타민, 50 μM 아스코르브산, 20 mM β-글리세롤 포스페이트 및 10% FBS를 함유하는 DMEM로 교체하였다. 이후 5% CO2, 37 배양기에서 세포 시트를 추가로 7일 동안 배양하였다. 그 다음, 세포 시트를 탈이온수로 2회 세척하였고 40 mM의 알리자린 레드(Sigma-Aldrich, pH 4.2 adjusted with 1% 의 수산화암모늄으로 조정) 용액을 사용하여 실온에서 20분 동안 염색하였다. 마지막으로, 세포를 탈이온수로 세척하고 현미경에서 관찰하였다. 칼슘이 침전된 영역은 Image J software (NIH, USA)를 이용하여 현미경 이미지로부터 측정되었다.
2. 결과
2-1. C2C12 세포 시트는 BMP 2에 특이적으로 결합한다.
도 1은 3D 세포 시트의 제조 과정을 나타낸 개략도이다. 먼저, 폴리피롤을 폴리피롤 필름의 공동-도판트(co-dopant)로 비오틴을 사용하여 ITO 표면에서 전기화학적으로 중합하였다. 비오틴은 타겟 생체분자와 연결하는 브릿지로 사용될 수 있다. 이러한 방법으로, 전기장 어시스트 세포 시트(electric-field-assisted cell sheets)를 제조할 수 있고, 여기서 마우스 골격근-유래 C2C12 세포주를 작업모델로 사용하였다. 중요하게, 3D 구조물 내 개별적인 세포들은 성장인자, 특히 BMP2와 세포 표면 수용체를 통해 효율적으로 결합될 수 있다. BMP2는 근원성 분화 경로를 차단함으로써 C2C12 근아세포의 골아세포 분화 유도에 중요한 역할을 한다. 세포 표면의 부근에서 BMP2의 도입은 세포 멤브레인 수용체와의 커뮤니케이션 뿐만 아니라 세포 멤브레인 수용체의 인식을 증가시키며, 이는 지속적인 수용체 활성화로 성장인자와 수용체 사이에 안정한 복합체를 형성하게 한다. 이러한 전략은 요구되는 기능성 개체를 갖는 개별적인 타겟 세포의 조작과 이후 세포 활성의 조절을 감안한 것이다. 본 발명에서 제조된 폴리피롤-기반 스캐폴드가 없는 세포 시트의 이점은 다음과 같다: (i) 비오틴-도핑 폴리피롤 표면의 자연적이고 가역성인 산화 환원 반응이 생체분자의 조절된 결합 및 방출을 가능하게 한다. (ii) 세포 멤브레인의 세포 밖에서 수용체와 BMP2의 성공적인 결합은 C2C12 세포의 골분화를 현저하게 개선시키고, 기능성 단백질의 효율적이고 부위 특이적 전달에 의해 그와 같이 된다. (iii) 스캐폴드가 없는 기술은 주변 환경 조직과 개선된 통합, 조직 기능의 모방, 및 조직의 더욱 완전한 재생을 함께 야기하는 높은 세포 밀도를 촉진한다. 이러한 제조방법의 단순화는 생체 외 조직/기간 모델과 통합되는 스캐폴드가 없는 세포 시트를 가능하게 하고 생체 내 세포 기반 치료에 사용될 수 있게 한다.
2-2. 폴리피롤 플랫폼에 BMP2의 로딩 효율
기능화된 폴리피롤 표면에 비오틴이 부착된 BMP2의 고정 효율을 조사함으로써 본 발명의 방법의 실현 가능성을 조사하였다. 일반적으로 C2C12 세포는 BMP2를 함유하는 배지에서 배양된다. 이러한 상황에서, 단백질의 가용성 전달은 종종 이들의 이용가능성을 세포 표면 수용체로 제한한다. 이러한 문제를 극복하기 위해 각각의 세포에 표지된 BMP2 리간드를 갖는 세포 시트를 구성하였다. 처음으로, BMP2의 비오틴-도핑 폴리피롤로의 결합 효율성을 형광현미경을 사용하여 조사하였다; 형광 이미지는 검출 프로브로 사용된 FITC-결합 항-BMP2를 갖는 표면-고정 단백질의 분포를 조사하기 위해 사용되었다. 폴리피롤 표면에 보이는 녹색 형광 영역은 비오틴-스트렙타비딘 결합의 선택적인 결합으로 인한 BMP2의 존재를 나타낸다. 그러나, 적용된 전기장의 반응으로, 형광 신호는 전기적 자극된 폴리피롤 표면으로부터 사라지고, 이는 일차적으로 폴리피롤로부터 비오틴과 결합 BMP2의 방대한 방출로 설명될 수 있다. BMP2 로딩 효율을 다양한 농도를 사용하여 조사하였다. 도 2B에 나타난 바와 같이, 50-300 ng/cm2의 BMP2가 비오틴 도핑 폴리피롤 표면에 적용될 때, 고정된 BMP2의 양은 (ELISA 정량화에 의해) 39-147ng/cm2이고, 이는 표면-고정된 BMP2의 수준이 세포 표면 수용체에 대한 이의 유용성 개선시키기에 충분하다는 것을 나타낸다. 또한, C2C12 세포의 표면에 BMP2의 존재를 입증하였다(도 2C). 전기장을 적용하여, 성장 인자에 특이적으로 결합ㄷ된 세포를 멤브레인 수용체에 방출하였다. BMP2-결합 C2C12 세포는 이후 FITC로 표지된 항-BMP2를 함유하는 용액에서 배양되었다. 마지막으로 BMP2는 보통의 C2C12 세포가 아닌, BMP2-결합 C2C12 세포의 세포 멤브레인에 따라 관찰되었다(도 2C). 본 연구에서, 세포 시트 내 개별적인 세포는 C2C12 근육생성 세포에서 골형성을 자극하기 위해 BMP2로 표지될 수 있다. 폴리피롤 표면 내 비오틴은 새로운 생물학적 모이어티(moieties)의 결합을 위한 더 큰 유연성을 제공하며, 이는 세포 표면 공학을 위한 다용도의 분자적으로 잘 정의된 방법론이 될 수 있고, 다양한 세포적 적용에 거부반응을 일으키지 않는다.
2-3. 비오틴-도핑 폴리피롤 플랫폼을 이용한 BMP2 -고정 C2C12 세포시트의 제조
도 3에 나타난 바와 같이, BMP2-결합 C2C12 세포 시트의 구조를 입증하였다. 첫 번째로, C2C12 세포(5x104)가 BMP2-고정 비오틴 도핑 폴리피롤 표면에 5일 동안 접종되어 세포 사이의 친밀한 접촉을 가능하게 하였다. 시트로 결집된 세포는 전기장을 적용함으로써 폴리피롤 표면으로부터 비파괴적으로 분리될 수 있다(도 3A). 사실상, 약한 전위는 비오틴 성분 및 부착 세포의 자발적인 방출로 인해 독득한 세포-표면 접촉을 정교하게 조절한다. 회수된 세포 시트는 쉽게 3D 세포 다층으로 제조될 수 있다. 조작 세포 시트 기술에 대한 전위의 효과를 -0.8V 내지 +0.4V 범위의 전기장을 30초 동안 폴리피롤 표면에 적용하여 조사하였다)도 3B). 이전의 연구와 마찬가지로, 단층 세포 시트는 음전기 자극 후 PBS-충전 피펫으로 부드러운 교반에 의해 손쉽게 표면으로부터 분리되었다. 그러나 폴리피롤 표면의 양전기 자극은 반응이 없었고, 자극되지 않은 대조군과 유사한 결과를 나타냈다. 도 3C에 나타난 바와 같이 폴리피롤 표면의 전기화학적 행동을 사이클릭 볼타메트리(CV)를 사용하여 평가하였다. 산화 환원 반응 피크 전류는 비오틴 도핑 폴리피롤 표면에서 개선되었다. 그러나, BMP2-고정하, 비오틴-도핑 폴리피롤 표면에서 자란 C2C12 세포 시트는 명백하게 감소된 전자 이동 능력, 특히 친밀한 세포-표면 정션으로 인해 폴리피롤 표면을 통한 전기활성 페리시안 화합물 종을 나타낸다. -0.8V의 전기적 자극은 폴리피롤 표면으로부터 세포 시트를 분리하기에 충분하며, 이는 전해액의 이동을 없도록 하여 결국 본래 상태로 전류 강도를 회복시킬 수 있다. 그러나, 양전위는 피크 강도에 영향을 주지 않았고, 이는 적용된 전기적 자극과 관계없이 C2C12 세포 시트가 확고하게 폴리피롤 표면에 부착되도록 유지한다는 것을 나타낸다. 전기적 자극은 산화/환원 반응을 통한 폴리피롤 백본의 형태 변화를 유도한다; 구체적으로, 폴리피롤 폴리머는 현저하게 양전위로 증가하며, 자유부피를 생성하고 고분자 백본 내부의 다양한 성분의 포착(entrapment)을 가능하게 한다. 대조적으로, 음전위에서, 폴리피롤은 구조적 수축을 겪고, 폴리머 내에 결합된 분자를 방출한다. 사실상, 이러한 결과는 오직 음전위가 적용되었을 때 세포의 선택적인 분리가 일어난다는 것을 입증한다.
2-4. BMP2-고정 C2C12 세포 시트의 특성
배양 1일 및 7일 후단층 또는 다층 세포 시트의 생존도를 조사하였고, C2C12 세포는 7일 후에도 건강한 상태를 유지했다(4A 및 4B). 또한, 세포 단층의 형태를 위상차 및 형광 현미경을 이용하여 조사했다(도 5A 내지 도5F). BMP2-표지된 C2C12 세포 시트에서, 세포는 둥근 모양이었고, 단 4일 후 골형성 표현형을 나타냈으며, 등가량의 BMP2가 첨가된 배양 배지로부터의 세포 패턴과 유사했다. 대조적으로, BMP2 없이 통상적인 배양 접시에서 배양된 세포는 보통의 방추형 형태를 나타낸다. 공초점 레이저 현미경을 사용하여 C2C12 세포로 이루어진 이중층을 관찰하였다. 연속적 전기 자극 후, 회수된 두 번째 세포층은 첫 번째 세포층과 겹쳐지고, 이로써 3D 조직 형성을 모방한다. 제조된 세포 시트는 35마이크로미터의 근사치 두께를 갖는다. 골아 세포 발현에 대한 BMP2-고정 C2C12 세포 시트의 효과를 조사하였다. 전기 자극 후, BMP2-고정 세포 시트(CS w/BMP2i)는 배양접시로 옮겨 C2C12 세포에서 알칼린 포스페이트(ALP) 활성을 평가하였다(도 6A). 단층 BMP2-고정 세포 시트(1-CS w/BMP2i)에서 ALP 활성은 명백하게 BMP2가 없는 배지(CS w/o BMP2a)에서 배양된 C2C12 세포와 비교했을 때 4배 개선되었다. 추가로, ALP 활성은 단층보다 다층에서 현저하게 높았고, 이는 이식 시, 각각의 세포 시트를 적층함으로써 제조된 3D 조직이 치료학적으로 훨씬 효과적이라는 것을 나타낸다. BMP2-추가 배지에서 배양된 세포 시트와 비교하여, CS w/BMP2i에서 상승된 ALP 활성은 멤브레인 결합 성장 인자 때문일 수 있고, 이는 수용체-리간드 복합체가 형성되게 한다. 성장 인자-결합(tethered) 세포 시트는 개별적인 세포에 존재하는 BMP2의 특정 양과 유의적으로 연관된 효과적인 세포 활성을 보였고, 이는 전통적인 가용성 전달 방법과는 다르다. 사실상, 생체분자가 개별적 세포에 직접 결합하는 것은 통합 부위로부터 확산을 제한함으로써 균일한 분포와 장기간 접촉 지속 기간을 나타내고, 이로써 분화가 효과적으로 촉발된다. 3D 세포 구조 내 C2C12 세포의 골아세포 분화를 알리자린 적색 염색 분석을 사용하여 조사하였다(도6B 내지 6C). 놀랍게도 CS w/BMP2i는 보통의 세포 배지와 골형성 배지 모두에서 CS w/BMP2a 더욱 강한 적색 염색을 나타냈다. 알리자린 적색 염색의 결과는 BMP2-결합 세포 시트가 골형성 분화의 유도에 유리하게 영향을 미치며 광화(mineralized) 칼슘 포스페이트의 축적을 증가시킨다는 것을 나타낸다. CS w/BMP2i는 CS w/BMP2a, 특히 골형성 배지와 비교하여 4배 증가된 미네랄 침착을 유도했다.
3. 결론
본 발명자들은 인공적 스캐폴드를 사용하지 않고 BMP2-고정 C2C12 세포 시트를 개발하였다. 전기활성, 이들 세포 시트의 비오틴-도핑 폴리피롤 표면은 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통한 생물학적으로 적절한 수준의 BMP2를 결합할 수 있다. 폴리피롤 표면에서 고정 BMP2를 정량화하기 위한 ELISA를 이용한 후, 우리는 세포-세포 정션을 강화하고 BMP2 리간드와 함께 세포 표면 수용체를 변경하기 위해 폴리피롤 상에서 C2C12 세포를 배양하였다. 음전위의 전기적 자극 후, BMP2-결합 세포 시트는 비파괴적으로 분리되고, 골분화 능력을 평가하기 위해 배양 접시에 옮겨졌다. 우리의 결과는 이러한 접근이 세포 배양, 조직 공학 또는 이 모두를 필요로 하는 응용에 있어서 생물활성 분자를 세포 표면에 부착하기 위한 가치 있고 유연한 도구가 될 수 있음을 나타낸다.
[ 실시예 2]
간엽줄기세포를 이용한 세포 시트 및 이의 제조
1. 실험
0.1 M의 피롤과 1 mM의 비오틴을 함유하는 0.01M의 PSS 용액(이하 '피롤 용액' 이라함), sulfo-NHS-biotin, 세포 성장(분화) 인자로 TGF-β(연골분화인자), BMP-2(골 세포분화 인자)를 사용하여 인간 간엽줄기세포(ATCC, PCS-500-011)의 세포 시트를 다음과 같이 제조하였다.
① 2 x 1.5 cm 크기의 ITO 글라스(glass)를 피롤 용액에 딥핑(deeping)하여 CA 0.8 V, 1분간 전기적으로 중합하여 폴리피롤 필름(Ppy film)을 만든다. 이 때 폴리피롤 표면의 크기를 1 cm2 가 되게 한다.
② 3차 증류수로 2번 세척한 후에 30 mM EDC / 6 mM NHS 용액을 도포하여 폴리피롤 표면의 비오틴을 활성화한다(배양 시간 : 30분, RT).
③ 3차 증류수로 2번 세척한 후에 10 ng/mL 농도의 스트렙타비딘 용액을 도포하여 폴리피롤 표면을 스트렙타비딘으로 표지한다(배양 시간: 30분, RT).
④ 3차 증류수로 2번 세척한다.
⑤ 1 mM sulfo-NHS-biotin 용액을 폴리피롤 필름 표면에 도포하고 30분간 실온(RT) 에서 배양한다.
⑥ 3차 증류수로 2번 세척 후에 10 ng/mL 농도의 TGF-β 와 BMP-2를 폴리피롤 필름 표면에 도포하여 4 ℃ 에서 1시간 동안 배양한다.
⑦ 세포 배양 배지로 폴리포롤 표면을 세척한 다음, 인간 간엽줄기세포(Human mesenchymal stem cell)를 1 x 105의 세포 밀도로 폴리피롤 필름 표면에 서스펜션하여 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 4시간 동안 배양하여 세포가 표면에 고정되도록 한다.
⑧ 세포가 표면에 퍼진 것을 확인한 후에 ITO 글라스를 6-웰 플레이트 웰에 옮긴 후에 보통의 배지(normal media)와 분화 배지(differentiation media)를 각각 넣어준 후 14일간 배양한다. 배지는 3일마다 갈아준다. 10 ng/mL의 농도로 BMP-2와 TGF-β를 첨가한 성장인자 첨가 배지도 3일마다 교체해 준다.
⑨ 14일 후에 각각의 세포들을 CA -1.5V, 3분의 조건으로 전기 자극하여 세포 시트를 보통의 배양 플레이트로 이식(implantation)한다.
⑩ 24시간 후에 세포들을 각각 알리자린 레드 s와 알시안 블루(alcian blue)로 염색하여 분화된 정도를 비교한다.
2. 결과
세포 시트를 전기적 자극을 이용하여 폴리피롤 필름 표면에서 떼어낸 후에, 각각 알리자린 레드 s와 알시안 블루로 염색하여 성장인자를 단순히 배양배지에 첨가한 실험군과 폴리피롤 표면에 고정시켜 배양한 세포들의 분화 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 단순히 BMP-2를 보통의 배양배지에 첨가하여 배양한 대조군에 비해 BMP-2를 폴리피롤 필름 표면에 고정하여 배양한 대조군에서 보다 더 많은 칼슘의 침착이 일어났다. 마찬가지로, 골 분화 유도 배양배지에서도 이와 비슷한 양상을 나타냈다.
또한, 도 8에 나타난 바와 같이 TGF-β를 보통의 배양배지에 첨가하여 배양한 대조군에 비해 TGF-β를 폴리피롤 필름 표면에 고정하여 배양한 대조군에서 보다 높은 연골세포 분화율을 나타냈고, 연골분화 유도 배양배지에서도 이와 비슷한 양상을 나타냈다.
도 9는 도 7과 8에서 염색이 된 부분을 정량적으로 분석하여 분화 정도를 비교한 그래프로, 이를 통해, 배양배지에 성장인자 혹은 분화 인자 단백질을 단순히 첨가하여 배양하기 보다는 폴리피롤 필름과 같은 제한된 공간에 고정하여 배양했을 때 그 효능을 높일 수 있다는 것을 확인하였다.
본 발명에서는 바람직한 리간드를 갖는 세포 표면을 제작함으로써 생체 조직을 모방한 구조물을 제공하는 것이 가능하므로, 본 발명의 세포 시트 및 이의 제조 방법은 재생 의료와 조직 공학에 적용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 다음의 단계를 포함하는 조직 공학용 세포 시트의 제조방법:
    타겟 세포를 성장인자-고정 전기활성화 전도성 폴리머에 배양하는 단계; 및
    전기장을 적용하여 성장인자-고정 세포의 층을 전기활성화 전도성 폴리머로부터 분리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 타겟 세포는 근아세포 또는 간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포 시트의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 전기활성화 전도성 폴리머는 폴리피롤, 이의 유도체 또는 이의 등가물이고, 상기 성장인자는 비오틴이 부착된 BMP2(bone morphogenetic protein 2), TGF-β(Transforming growth factor-β), 이들의 유도체 또는 이들의 등가물인 것을 특징으로 하는 조직 공학용 세포 시트의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리피롤은 비오틴 도핑을 통해 전착되고, 이후 비오틴이 부착된 BMP2, TGF-β, 이의 유도체 또는 이의 등가물의 화학적 결합이 비오틴-스트렙타비딘 가교제를 이용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 조직 공학용 세포 시트의 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의해 제조되는 조직 공학용 세포 시트.
  6. 성장인자-고정 세포 시트가 단층 또는 3D-다층(multilayer)으로 이루어진 조직 공학용 세포 시트.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 조직 공학은 조직, 장기 기능장애 또는 장기 부전의 치료인 것을 특징으로 하는 조직 공학용 세포 시트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 치료는 암환자를 위한 것임을 특징으로 하는 조직 공학용 세포 시트.
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 세포 시트는 골손상, 골손실 및 골형성 기작병, 섬유성 골염, 무형성 골질환 및 대사성 골질환으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 골 질환을 치료하거나, 또는 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 근육조직의 손상, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 및 외상에 의한 관절손상으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 연골 질환을 위해 이식되는 것을 특징으로 하는 조직 공학용 세포 시트.
  10. 제5항 또는 제6항에 따른 세포 시트를 포함하는 골분화 또는 연골분화 유도용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포 시트의 세포는 근아세포 또는 간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는 골분화 유도용 조성물.
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