WO2016195074A1 - リードスルー治療薬 - Google Patents

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WO2016195074A1
WO2016195074A1 PCT/JP2016/066593 JP2016066593W WO2016195074A1 WO 2016195074 A1 WO2016195074 A1 WO 2016195074A1 JP 2016066593 W JP2016066593 W JP 2016066593W WO 2016195074 A1 WO2016195074 A1 WO 2016195074A1
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administered
read
clindamycin
therapeutic agent
activity
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良一 松田
政孝 塩塚
禎昭 野々村
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University of Tokyo NUC
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University of Tokyo NUC
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4025—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. cromakalim

Definitions

  • the present invention relates to a lead-through therapeutic agent.
  • This application claims priority based on provisional application No. 62 / 171,205 filed in the United States on June 4, 2015, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • a nonsense mutation-type inherited disease is a disease caused by inhibition of protein expression by an immature stop codon formed by a point mutation on a gene (nonsense mutation).
  • the read-through activity refers to an activity in which, when a specific compound is administered to a patient with a nonsense mutation type inherited disease, the compound acts on the ribosome, and the ribosome reads through the immature stop codon and translates.
  • wild-type normal protein is synthesized, and the symptoms of nonsense mutation-type inherited disease are alleviated.
  • Patent Document 1 describes that arbekacin, which is an aminoglycoside compound, has read-through activity.
  • aminoglycoside compounds need to be administered by intravenous injection.
  • a drug that can be administered orally is desirable in order to maintain compliance.
  • an object of the present invention is to provide a read-through therapeutic agent that can be administered orally.
  • the present invention is as follows. (1) A lead-through therapeutic agent containing a lincomycin-based compound as an active ingredient. (2) The lead-through therapeutic agent according to (1), which is an oral agent. (3) The read-through therapeutic agent according to (1) or (2), which is used for treatment of a nonsense mutation-type inherited disease. (4) The read-through therapeutic agent according to any one of (1) to (3), wherein the nonsense mutation-type inherited disease is muscular dystrophy or cystic fibrosis.
  • a lead-through therapeutic agent that can be administered orally can be provided.
  • Experimental Example 1 it is a graph which shows the measurement result of the read-through activity of each mouse.
  • Experimental Example 2 it is a graph which shows the measurement result of the read-through activity of each mouse
  • (A) to (d) are photographs showing the results of immunostaining in Experimental Example 3.
  • (A) to (d) are photographs showing the results of immunostaining in Experimental Example 3.
  • (A) to (c) are photographs showing the results of immunostaining in Experimental Example 5.
  • Experimental Example 6 it is a graph which shows the measurement result of the creatine kinase activity in the blood of each mouse
  • ⁇ ⁇ Functional protein deficiency due to nonsense mutation causes more than 2,400 lethal diseases (nonsense mutation type inherited disease) including muscular dystrophy.
  • Lead-through treatment is a treatment method that improves the symptoms by administering a drug to a patient, suppressing the inhibition of protein expression due to nonsense mutation, allowing translation to progress, and acquiring a congenitally lacking functional protein. It is.
  • This therapy is not based on gene therapy or nucleic acid medicine, but is based on the concept that comprehensive treatment of nonsense mutation cases is possible. For example, effective and rapid options for nonsense mutation cases accounting for 19% in Duchenne muscular dystrophy patients in Japan. it is conceivable that.
  • the present invention provides a lead-through therapeutic agent containing a lincomycin-based compound as an active ingredient.
  • the read-through therapeutic agent of this embodiment can exhibit read-through activity by oral administration. Therefore, the lead-through therapeutic agent of this embodiment can be used as an oral agent.
  • an intractable nonsense mutation-type inherited disease can be treated using a drug regardless of gene therapy, nucleic acid medicine, stem cell transplantation, and the like.
  • examples of lincomycin compounds include clindamycin, lincomycin, and the like.
  • clindamycin is a drug that has good oral absorbability and tissue permeability, has been used as an antibacterial agent for many years, and a lot of information has been accumulated on safety from the track record of clinical use.
  • the inventors have clarified that clindamycin is also effective as a lead-through therapeutic agent.
  • nonsense mutation hereditary diseases include, for example, cystic fibrosis, retinitis pigmentosa, epidermolysis bullosa, xeroderma pigmentosum, lysosomes, multiple sclerosis, infant neuronal ceroid lipofuscin deposition Disease, Alzheimer's disease, Tay-Sachs disease, neural tissue degeneration, Parkinson's disease, rheumatoid arthritis, graft versus host disease, arthritis, hemophilia, von Willebrand disease, telangiectasia ataxia, thalassemia, kidney stone, Bone dysplasia, cirrhosis, neurofibromatosis, bullous disease, lysosomal storage disease, Harrah's disease, familial cholesterolemia, cerebellar ataxia, tuberous sclerosis, familial erythrocytosis, immunodeficiency
  • the lead-through therapeutic agent of this embodiment greatly contributes as a direct reduction to human welfare, and can provide great hope to patients suffering from intractable diseases. Furthermore, by specifying drug candidates from existing drugs, it is possible to omit non-clinical / phase I clinical trials, and it can be put to practical use quickly. For this reason, contributing to the early treatment of progressive serious diseases and increasing the opportunity to provide useful pharmaceuticals will greatly contribute to society. In addition to shortening the development period, it is also possible to reduce development risks and development costs.
  • the lead-through therapeutic agent of this embodiment may be a pharmaceutical composition containing a lincomycin-based compound and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition may be formulated into an orally used dosage form or a parenterally used dosage form, but it is formulated into an orally used dosage form from the viewpoint of maintaining compliance. It is preferable that
  • Examples of the dosage form used orally include tablets, capsules, elixirs, microcapsules and the like.
  • Examples of dosage forms used parenterally include injections.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose
  • corn starch Swelling agents such as gelatin, alginic acid, etc .
  • lubricants such as magnesium stearate
  • sweeteners such as sucrose, lactose, saccharin
  • flavoring agents such as peppermint, red mono oil, cherry
  • fats and oils water for injection, vegetable oil (eg, sesame oil, coconut oil, soybean oil), liquid carriers such as buffer (for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer); solubilizer (for example, ethanol, propylene glycol, polyethylene glycol, benzyl benzoate, benzyl alcohol);
  • Nonionic surfactant eg, Polysorbate 80 TM, HCO-50
  • a soothing agent e.g., benzalkonium chloride, procaine hydrochloride
  • stabilizers e.g., benzalkonium chloride, pro
  • water for injection examples include physiological saline; isotonic solutions containing glucose, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride and the like.
  • Administration of the pharmaceutical composition to a patient can be performed by methods known to those skilled in the art, such as oral administration, intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection.
  • the dose of the lincomycin-based compound varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, etc., but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • 100 to 500 mg (titer) is generally administered every 6 hours.
  • 600 to 2400 mg (titer) is generally administered 2 to 4 times a day.
  • the present invention provides a method for reducing the dose of an amide glycoside compound comprising the step of administering an amide glycoside compound and a lincomycin compound in combination.
  • the reduction method of the present embodiment by using a lincomycin-based compound in combination, the dose of the amide glycoside compound can be reduced while exhibiting the same degree of lead-through therapeutic effect. As a result, effects such as reduction of side effects caused by administration of the amide glycoside compound can be obtained.
  • the present invention provides a method for reducing the dose of a lincomycin compound, comprising the step of administering a combination of an amide glycoside compound and a lincomycin compound.
  • the reduction method of the present embodiment by using an amide glycoside compound in combination, the dose of the lincomycin compound can be reduced while exhibiting the same degree of lead-through treatment effect. As a result, effects such as reduction of side effects caused by administration of the lincomycin-based compound can be obtained.
  • the present invention provides a kit for treating a nonsense mutant genetic disease, comprising an injection containing an amide glycoside compound as an active ingredient and an oral preparation containing a lincomycin compound as an active ingredient. provide.
  • the present invention provides a method for treating a nonsense mutant genetic disease, comprising the steps of administering an amide glycoside compound to a patient and administering a lincomycin compound to the patient.
  • the present invention provides a method for treating a nonsense mutant genetic disease, comprising the step of administering an effective amount of a lincomycin-based compound to a patient in need of treatment.
  • the present invention provides a lincomycin-based compound for the treatment of a nonsense mutant genetic disease.
  • the present invention provides the use of a lincomycin-based compound for the manufacture of a therapeutic agent for a nonsense mutant genetic disease.
  • the lincomycin-based compound is preferably administered orally.
  • the nonsense mutation-type inherited disease may be muscular dystrophy or cystic fibrosis.
  • Example 1 Use a transgenic mouse for detection of read-through activity (Readthrough Evaluation and Assessment by Dual-reporter, International Publication No. 2008/004610, hereinafter referred to as “READ mouse”).
  • R. E. A. D. The mouse comprises a construct (27mer including a 12mer peripheral sequence before and after the immature stop codon of exon 23 of mdx mouse) in which a ⁇ -galactosidase gene and a luciferase gene are linked and an immature stop codon (TGA) is inserted into the joint.
  • TGA immature stop codon
  • An expression vector (pCAGGS) having a cytomegalovirus enhancer / chicken ⁇ -actin hybrid promoter is incorporated into the germline.
  • R. E. A. D. Mice normally express only ⁇ -galactosidase, and luciferase when read through the premature stop codon.
  • R. E. A. D. Expression of ⁇ -galactosidase has been confirmed in all muscle tissues including mouse myocardium and diaphragm.
  • R.D. E. A. D. Arbekacin 1 mg / day, lincomycin 3 mg / day, lincomycin 10 mg / day, and clindamycin 6 mg / day were subcutaneously administered to mice for 7 days. Subsequently, the read-through activity in each mouse was measured. The read-through activity was measured by quantifying the luciferase activity and ⁇ -galactosidase activity in the thigh / crus skeletal muscle tissue extract at the end of drug administration with a luminometer.
  • FIG. 1 is a graph showing the measurement results of the read-through activity of each mouse. As a result, it was clarified that by administering lincomycin or clindamycin subcutaneously, the same level of read-through activity as that obtained by subcutaneous administration of arbekacin known to have read-through activity was exhibited. .
  • FIG. 2 is a graph showing the measurement results of the read-through activity of each mouse.
  • mdx mice which are model mice of Duchenne muscular dystrophy, and the expression of dystrophin protein was examined. Note that mdx mice have a nonsense mutation in the dystrophin gene and lack the dystrophin protein.
  • Mdx mice were administered clindamycin 6 mg / day for 4 consecutive days. Clindamycin was administered subcutaneously or orally. Subsequently, the lower leg muscle tissue of each mouse was collected to prepare a sliced section, and the expression of dystrophin protein was examined by immunostaining. For comparison, B10 mice, which are normal mice, and mdx mice that were not administered with clindamycin were also subjected to the same immunostaining by collecting crus muscle tissue and preparing sliced sections.
  • FIG. 3 (a) to 3 (d) are photographs showing the results of immunostaining.
  • FIG. 3 (a) shows the results of B10 mice
  • FIG. 3 (b) shows the results of mdx mice not administered with clindamycin
  • FIG. 3 (c) shows mdx administered with clindamycin by subcutaneous administration.
  • mouth is shown
  • FIG.3 (d) shows the result of the mdx mouse
  • dystrophin protein was not detected in the tissue of mdx mice not administered with clindamycin (FIG. 3 (b)).
  • B10 mice FIGG. 3A
  • mdx mice administered with clindamycin by subcutaneous administration FIG. 3C
  • mdx mice administered with clindamycin by oral administration FIG. 3D
  • the expression of full-length dystrophin protein was detected.
  • dystrophin protein can be expressed in tissues of mdx mice having a nonsense mutation in the dystrophin gene by subcutaneous administration or oral administration of clindamycin.
  • Creatine kinase is a clinical marker for muscular dystrophy. Creatine kinase is an enzyme contained in muscle fibers and leaks into the blood when the muscle is destroyed. For this reason, it shows that muscle collapse progresses, so that the creatine kinase activity in blood is high.
  • Mdx mice were administered clindamycin 6 mg / day for 4 consecutive days. Clindamycin was administered subcutaneously or orally. For comparison, a group in which normal saline was administered to B10 mice and mdx mice, which were normal mice, and a group in which arbekacin 1 mg / day was subcutaneously administered to mdx mice every day for 4 weeks were prepared.
  • FIG. 4 is a graph showing measurement results of creatine kinase activity.
  • Arbekacin 1 mg / day was subcutaneously administered to mdx mice every day for 3 weeks. Moreover, arbekacin 0.5 mg / day was subcutaneously administered to mdx mice every day for 3 weeks, and clindamycin 3 mg / day was orally administered. Subsequently, the lower leg muscle tissue of each mouse was collected in the same manner as in Experimental Example 3, thin slices were prepared, and the expression of dystrophin protein was examined by immunostaining. As a control, muscular tissue was collected from mdx mice subcutaneously administered daily for 3 weeks, and the crus muscle tissue was collected and sliced, and the same immunostaining was performed.
  • FIG. 5 (a) to (c) are photographs showing the results of immunostaining.
  • Fig. 5 (a) shows the results of control mdx mice
  • Fig. 5 (b) shows the results of mdx mice administered with arbekacin
  • Fig. 5 (c) shows mdx administered with arbekacin and clindamycin in combination. Mouse results are shown.
  • dystrophin protein was not detected in the tissue of mdx mice administered with physiological saline (FIG. 5 (a)).
  • mdx mice administered subcutaneously with arbekacin 1 mg / day FIG. 5B
  • mdx mice administered subcutaneously with arbekacin 0.5 mg / day FIG. 3 (c)
  • the expression of dystrophin protein was detected to the same extent from the tissue of)).
  • a lead-through therapeutic agent that can be administered orally can be provided.
  • the lead-through therapeutic agent it is possible to treat an intractable nonsense mutated hereditary disease using a drug regardless of gene therapy, nucleic acid medicine, stem cell transplantation and the like.

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Abstract

リンコマイシン系化合物を有効成分として含有するリードスルー治療薬。

Description

リードスルー治療薬
　本発明は、リードスルー治療薬に関する。本願は、２０１５年６月４日に、米国に出願された仮出願第６２／１７１，２０５号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ナンセンス変異型遺伝性疾患とは、遺伝子上の点変異（ナンセンス変異）により形成される未熟終止コドンによるタンパク質の発現の阻害に起因する疾患である。リードスルー活性とは、ナンセンス変異型遺伝性疾患の患者に特定の化合物を投与した場合に、前記化合物がリボソームに作用し、リボソームが未熟終止コドンを読み越えて翻訳を行う活性をいう。リードスルーの結果、野生型正常タンパク質が合成され、ナンセンス変異型遺伝性疾患の症状が緩和される。
　例えば、特許文献１には、アミノグリコシド系化合物であるアルベカシンがリードスルー活性を有することが記載されている。
国際公開第２０１１／０９６４８４号
　しかしながら、アミノグリコシド系化合物は、静脈内注射により投与する必要がある。臨床での長期投与を考慮すると、コンプライアンスを保つために経口投与可能な薬剤であることが望ましい。そこで、本発明は、経口投与可能なリードスルー治療薬を提供することを目的とする。
　本発明は以下の通りである。
（１）リンコマイシン系化合物を有効成分として含有するリードスルー治療薬。
（２）経口剤である、（１）に記載のリードスルー治療薬。
（３）ナンセンス変異型遺伝性疾患治療用である、（１）又は（２）に記載のリードスルー治療薬。
（４）ナンセンス変異型遺伝性疾患が筋ジストロフィー又は嚢胞性線維症である、（１）～（３）のいずれかに記載のリードスルー治療薬。
　本発明により、経口投与可能なリードスルー治療薬を提供することができる。
実験例１において、各マウスのリードスルー活性の測定結果を示すグラフである。 実験例２において、各マウスのリードスルー活性の測定結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｄ）は、実験例３における免疫染色の結果を示す写真である。 実験例４において、各マウスの血液中のクレアチンキナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｃ）は、実験例５における免疫染色の結果を示す写真である。 実験例６において、各マウスの血液中のクレアチンキナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
　ナンセンス変異による機能性タンパク質の欠損は、筋ジストロフィーをはじめ２，４００種を超える致死性疾患（ナンセンス変異型遺伝性疾患）を引き起こす。患者に薬物を投与して、ナンセンス変異によるタンパク質の発現の阻害を抑制して翻訳を進行させ、先天的に欠如した機能性タンパク質を後天的に発現させて症状を改善する治療方法がリードスルー治療である。本療法は遺伝子治療や核酸医薬ではなく、ナンセンス変異症例の包括的治療が可能な概念に基づくものであり、例えば、本邦のデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者において１９％を占めるナンセンス変異症例の有効かつ迅速な選択肢と考えられる。
　１実施形態において、本発明は、リンコマイシン系化合物を有効成分として含有するリードスルー治療薬を提供する。実施例において後述するように、本実施形態のリードスルー治療薬は、経口投与によりリードスルー活性を発揮することができる。したがって、本実施形態のリードスルー治療薬は、経口剤として用いることができる。本実施形態のリードスルー治療薬によれば、難治性のナンセンス変異型遺伝性疾患を、遺伝子治療、核酸医薬、幹細胞移植等によらず、薬物を用いて治療することができる。
　本実施形態のリードスルー治療薬において、リンコマイシン系化合物としては、クリンダマイシン、リンコマイシン等が挙げられる。中でも、クリンダマイシンは、経口吸収性や組織浸透性が良く、抗菌剤として長年に渡り使用され、安全性についても臨床使用の実績から多くの情報が集積されている薬剤である。実施例において後述するように、発明者らは、クリンダマイシンがリードスルー治療薬としても有効であることを明らかにした。
　本実施形態のリードスルー治療薬は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療に好適に用いることができる。ナンセンス変異型遺伝性疾患としては、筋ジストロフィー以外にも、例えば、嚢胞性線維症、網膜色素変性症、表皮水疱症、色素性乾皮症、ライソゾーム症、多発性硬化症、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症、アルツハイマー病、テイ－サックス病、神経組織変性、パーキンソン病、慢性関節リウマチ、対宿主性移植片病、関節炎、血友病、フォンヴィレブラント病、毛細管拡張性運動失調、サラセミア、腎結石、骨形成不全、肝硬変、神経繊維腫症、水疱性疾患、ライソゾーム性蓄積症、ハーラー疾患、家族性コレステロール血症、小脳運動失調、結節性硬化症、家族性赤血球増加症、免疫不全、腎臓病、肺疾患、家族性高コレステロール血症、色素性網膜症、アミロイドーシス、アテローム性動脈硬化症、巨人症、小人症、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、老化、肥満、糖尿病、ニーマン－ピック病、マルファン症候群、癌、等が挙げられる。本実施形態のリードスルー治療薬は、これらの遺伝性疾患に包括的に適用可能である。
　本実施形態のリードスルー治療薬は、人類福祉への直接的還元として大きく寄与し、難病に苦しむ患者に大きな希望を提供できる。更に、既存薬から薬物候補を特定したことにより、非臨床・第Ｉ相臨床試験を省くことが可能となり、迅速に実用化することができる。このため、進行性の重篤な疾患の早期治療に寄与し、有用な医薬品を提供する機会を増加させることで社会への貢献は甚大となる。開発期間の短縮だけでなく、開発リスクの低減や開発コストの軽減を図ることもできる。
　本実施形態のリードスルー治療薬は、リンコマイシン系化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、経口的に使用される剤型又は非経口的に使用される剤型に製剤化されていてもよいが、コンプライアンスを保ちやすい観点から、経口的に使用される剤型に製剤化されることが好ましい。
　経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては例えば注射剤等が挙げられる。
　薬学的に許容される担体としては、一般的に製剤に用いられるものを使用することができ、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等の結合剤；結晶性セルロース等の賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤；ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油、チェリーなどの香味剤；油脂、注射用水、植物油（例えば、ゴマ油、ヤシ油、大豆油）、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）等の液状担体；溶解補助剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール）；非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０）；無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）；安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール）；保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール）；酸化防止剤等が挙げられる。
　上記の注射用水としては、例えば、生理食塩水；ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等を含む等張液が挙げられる。
　医薬組成物の患者への投与は、経口投与、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の当業者に公知の方法により行いうる。リンコマイシン系化合物の投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。例えば、経口投与の場合、１００～５００ｍｇ（力価）を６時間毎に投与することが一般的である。また、点滴静注の場合、６００～２４００ｍｇ（力価）を１日２～４回投与することが一般的である。
（その他の実施形態）
　アルベカシン等の既存のアミドグリコシド系化合物を有効成分とするリードスルー治療薬と、本発明のリードスルー治療薬とを併用することにより、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療効果を維持したまま、薬物の投与量を減少させることもできる。
　すなわち、１実施形態において、本発明は、アミドグリコシド系化合物とリンコマイシン系化合物を併用して投与する工程を備える、アミドグリコシド系化合物の投与量の低減方法を提供する。本実施形態の低減方法においては、リンコマイシン系化合物を併用することにより、同程度のリードスルー治療効果を発揮しながら、アミドグリコシド系化合物の投与量を低減することができる。この結果、アミドグリコシド系化合物の投与による副作用を軽減することができる等の効果が得られる。
　１実施形態において、本発明は、アミドグリコシド系化合物とリンコマイシン系化合物を併用して投与する工程を備える、リンコマイシン系化合物の投与量の低減方法を提供する。本実施形態の低減方法においては、アミドグリコシド系化合物を併用することにより、同程度のリードスルー治療効果を発揮しながら、リンコマイシン系化合物の投与量を低減することができる。この結果、リンコマイシン系化合物の投与による副作用を軽減することができる等の効果が得られる。
　１実施形態において、本発明は、アミドグリコシド系化合物を有効成分として含有する注射剤と、リンコマイシン系化合物を有効成分として含有する経口剤とを含む、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療用キットを提供する。
　１実施形態において、本発明は、患者にアミドグリコシド系化合物を投与する工程と、前記患者にリンコマイシン系化合物を投与する工程と、を備える、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療方法を提供する。
　１実施形態において、本発明は、リンコマイシン系化合物の有効量を、治療を必要とする患者に投与する工程を備える、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療方法を提供する。
　１実施形態において、本発明は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療のためのリンコマイシン系化合物を提供する。
　１実施形態において、本発明は、ナンセンス変異型遺伝性疾患の治療薬を製造するためのリンコマイシン系化合物の使用を提供する。
　これらの各実施形態において、リンコマイシン系化合物の投与は経口投与により行うことが好ましい。また、ナンセンス変異型遺伝性疾患は、筋ジストロフィー又は嚢胞性線維症であってもよい。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
　リードスルー活性検出用遺伝子導入マウス（Ｒｅａｄｔｈｒｏｕｇｈ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｂｙ　Ｄｕａｌ－ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｍｉｃｅ、国際公開第２００８／００４６１０号を参照。以下、「Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウス」という。）を用いて、リンコマイシン系化合物（リンコサミド系化合物）であるリンコマイシン及びクリンダマイシンのリードスルー活性を検討した。Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウスは、β－ガラクトシダーゼ遺伝子と、ルシフェラーゼ遺伝子とを連結し、その繋ぎ目に未熟終止コドン（ＴＧＡ）を挿入したコンストラクト（ｍｄｘマウスのエクソン２３の未熟終止コドン前後１２ｍｅｒ周辺配列を含む２７ｍｅｒ）を含む、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβーアクチンハイブリッドプロモーターを有する発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ）を生殖細胞系列に組み込んだものである。Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウスは、正常時にはβ－ガラクトシダーゼのみを発現し、未熟終止コドンをリードスルーするとルシフェラーゼを発現する。Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウスの心筋や横隔膜を含む筋組織全般でβ-ガラクトシダーゼの発現が確認されている。
　まず、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウスに、アルベカシン１ｍｇ／日、リンコマイシン３ｍｇ／日、リンコマイシン１０ｍｇ／日、クリンダマイシン６ｍｇ／日を、７日間連日皮下投与した。続いて、各マウスにおけるリードスルー活性を測定した。リードスルー活性は、薬物の投与終了時に大腿部/下腿部骨格筋組織抽出液のルシフェラーゼ活性とβ-ガラクトシダーゼ活性をルミノメータで定量することにより測定した。
　図１は、各マウスのリードスルー活性の測定結果を示すグラフである。その結果、リンコマイシン又はクリンダマイシンを皮下投与することにより、リードスルー活性を有することが知られているアルベカシンを皮下投与した場合と同程度のリードスルー活性が発揮されることが明らかとなった。
［実験例２］
　皮下投与又は経口投与により、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウスにクリンダマイシンを投与し、リードスルー活性を検討した。
　まず、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウスに、クリンダマイシン６ｍｇ／日を７日間連日投与した。投与は皮下投与又は経口投与（強制胃内投与）により行った。対照として、Ｒ．Ｅ．Ａ．Ｄ．マウスに生理食塩水を皮下投与した群を用いた。
　続いて、各マウスにおけるリードスルー活性を実験例１と同様にして測定した。図２は、各マウスのリードスルー活性の測定結果を示すグラフである。その結果、クリンダマイシンを投与することにより、対照と比較してリードスルー活性の上昇が観察された。また、リードスルー活性の上昇の程度は、皮下投与でも経口投与でも同程度であった。この結果は、クリンダマイシンが、皮下投与だけでなく経口投与によっても、リードスルー活性を発揮することができることを示す。
［実験例３］
　デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデルマウスであるｍｄｘマウスにクリンダマイシンを投与し、ジストロフィンタンパク質の発現を検討した。なお、ｍｄｘマウスはジストロフィン遺伝子にナンセンス変異を有しており、ジストロフィンタンパク質を欠損している。
　ｍｄｘマウスに、クリンダマイシン６ｍｇ／日を４週間連日投与した。クリンダマイシンの投与は、皮下投与又は経口投与により行った。続いて、各マウスの下腿筋組織を採取して薄切切片を作製し、免疫染色によりジストロフィンタンパク質の発現を検討した。また、比較のために、正常マウスであるＢ１０マウス、及びクリンダマイシンを投与していないｍｄｘマウスについても下腿筋組織を採取して薄切切片を作製し、同様の免疫染色を行った。
　図３（ａ）～（ｄ）は、免疫染色の結果を示す写真である。図３（ａ）はＢ１０マウスの結果を示し、図３（ｂ）はクリンダマイシンを投与していないｍｄｘマウスの結果を示し、図３（ｃ）は皮下投与によりクリンダマイシンを投与したｍｄｘマウスの結果を示し、図３（ｄ）は経口投与によりクリンダマイシンを投与したｍｄｘマウスの結果を示す。
　その結果、クリンダマイシンを投与していないｍｄｘマウスの組織では、ジストロフィンタンパク質の発現が検出されなかった（図３（ｂ））。これに対し、Ｂ１０マウス（図３（ａ））、皮下投与によりクリンダマイシンを投与したｍｄｘマウス（図３（ｃ））、経口投与によりクリンダマイシンを投与したｍｄｘマウス（図３（ｄ））の組織からは、全長ジストロフィンタンパク質の発現が検出された。
　この結果は、クリンダマイシンの皮下投与又は経口投与により、ジストロフィン遺伝子にナンセンス変異を有するｍｄｘマウスの組織でジストロフィンタンパク質を発現させることができることを示す。
［実験例４］
　ｍｄｘマウスにクリンダマイシンを投与し、血液中のクレアチンキナーゼ活性を測定した。なお、クレアチンキナーゼは、筋ジストロフィーの臨床マーカーである。クレアチンキナーゼは筋線維中に含まれる酵素であり、筋が破壊されると血液中に漏出する。このため、血液中のクレアチンキナーゼ活性が高いほど筋崩壊が進んでいることを示す。
　ｍｄｘマウスに、クリンダマイシン６ｍｇ／日を４週間連日投与した。クリンダマイシンの投与は、皮下投与又は経口投与により行った。また、比較のために、正常マウスであるＢ１０マウス及びｍｄｘマウスに生理食塩水を投与した群、並びにｍｄｘマウスにアルベカシン１ｍｇ／日を４週間連日皮下投与した群を用意した。
　続いて、各マウスの血液を採取し、血液中のクレアチンキナーゼ活性を測定した。クレアチンキナーゼ活性の測定は、富士ドライケム生化学分析装置（富士フイルム社）を用いて行った。図４は、クレアチンキナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
　その結果、クリンダマイシンを皮下投与又は経口投与することにより、アルベカシンの皮下投与と同程度まで、血液中のクレアチンキナーゼ活性が低下したことが明らかとなった。
　この結果は、クリンダマイシンの皮下投与又は経口投与により、筋崩壊が抑制されたことを示す。すなわち、クリンダマイシンの皮下投与又は経口投与により、筋ジストロフィーの症状を低減することができることを示す。
［実験例５］
　ｍｄｘマウスに、アルベカシンとクリンダマイシンとを併用して投与し、その効果を検討した。
　ｍｄｘマウスにアルベカシン１ｍｇ／日を３週間連日皮下投与した。また、ｍｄｘマウスに３週間連日で、アルベカシン０．５ｍｇ／日を皮下投与し、クリンダマイシン３ｍｇ／日を経口投与した。続いて、実験例３と同様にして各マウスの下腿筋組織を採取して薄切切片を作製し、免疫染色によりジストロフィンタンパク質の発現を検討した。また、対照として、ｍｄｘマウスに生理食塩水を３週間連日皮下投与した群についても下腿筋組織を採取して薄切切片を作製し、同様の免疫染色を行った。
　図５（ａ）～（ｃ）は、免疫染色の結果を示す写真である。図５（ａ）は対照のｍｄｘマウスの結果を示し、図５（ｂ）はアルベカシンを投与したｍｄｘマウスの結果を示し、図５（ｃ）はアルベカシンとクリンダマイシンを併用して投与したｍｄｘマウスの結果を示す。
　その結果、生理食塩水を投与したｍｄｘマウスの組織では、ジストロフィンタンパク質の発現が検出されなかった（図５（ａ））。これに対し、アルベカシン１ｍｇ／日を皮下投与したｍｄｘマウス（図５（ｂ））、アルベカシン０．５ｍｇ／日を皮下投与し、クリンダマイシン３ｍｇ／日を経口投与したｍｄｘマウス（図３（ｃ））の組織からは、同程度にジストロフィンタンパク質の発現が検出された。
　この結果は、クリンダマイシンを併用して経口投与することにより、アルベカシンの投与量を０．５ｍｇ／日に減らしても、アルベカシンを１ｍｇ／日皮下投与した場合と同程度にジストロフィンタンパク質を発現させることができることを示す。
［実験例６］
　実験例５で用いたマウスの血液中のクレアチンキナーゼ活性を実験例４と同様にして測定した。また、比較のために、正常マウスであるＢ１０マウスの血液中のクレアチンキナーゼ活性も測定した。図６は、クレアチンキナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
　その結果、クリンダマイシンを併用して経口投与することにより、アルベカシンの投与量を０．５ｍｇ／日に減らしても、アルベカシンを１ｍｇ／日皮下投与した場合と同程度に、血液中のクレアチンキナーゼ活性が低下したことが明らかとなった。
　この結果は、アルベカシンとクリンダマイシンを併用することにより、薬物の投与量を低減することができることを更に支持するものである。
　本発明により、経口投与可能なリードスルー治療薬を提供することができる。リードスルー治療薬によれば、難治性のナンセンス変異型遺伝性疾患を、遺伝子治療、核酸医薬、幹細胞移植等によらず、薬物を用いて治療することができる。

Claims (4)

  1. 　リンコマイシン系化合物を有効成分として含有するリードスルー治療薬。
  2. 　経口剤である、請求項１に記載のリードスルー治療薬。
  3. 　ナンセンス変異型遺伝性疾患治療用である、請求項１又は２に記載のリードスルー治療薬。
  4. 　ナンセンス変異型遺伝性疾患が筋ジストロフィー又は嚢胞性線維症である、請求項１～３のいずれか一項に記載のリードスルー治療薬。
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