WO2016189257A1 - Procédé d'observation d'un échantillon - Google Patents

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WO2016189257A1
WO2016189257A1 PCT/FR2016/051250 FR2016051250W WO2016189257A1 WO 2016189257 A1 WO2016189257 A1 WO 2016189257A1 FR 2016051250 W FR2016051250 W FR 2016051250W WO 2016189257 A1 WO2016189257 A1 WO 2016189257A1
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Cédric ALLIER
Thomas Bordy
Olivier CIONI
Lionel Herve
Sophie MOREL
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Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives
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Definitions

  • the technical field of the invention is related to the observation of a sample, in particular a biological sample, by imaging without a lens, by implementing a holographic reconstruction algorithm with improved performances.
  • This image is formed of interference figures between the light wave emitted by the source and transmitted by the sample, and diffraction waves, resulting from the diffraction by the sample of the light wave emitted by the source.
  • These interference patterns are sometimes called diffraction patterns, or designated by the term "diffraction pattern".
  • WO2008090330 discloses a device for the observation of biological samples, in this case cells, by imaging without a lens.
  • the device makes it possible to associate, with each cell, an interference pattern whose morphology makes it possible to identify the type of cell.
  • Imaging without a lens appears as a simple and inexpensive alternative to a conventional microscope.
  • its field of observation is much larger than can be that of a microscope. It is understandable that the application prospects related to this technology are important. This document also mentions the possibility of illuminating the sample using light sources of different wavelengths.
  • the image formed on the matrix photodetector comprising interference patterns
  • a digital propagation algorithm is well known in the field of holographic reconstruction. For this, the distance between the sample and the photodetector being known, we apply a propagation algorithm, taking into account this distance, as well as the wavelength. It is then possible to reconstruct an image of an optical property of the sample.
  • a digital reconstruction algorithm is for example described in US2012 / 0218379.
  • a first image, of a first wavelength is retraced, according to said first wavelength, in a plane according to which the object, said plane of the object, extends, so as to obtain, in this object plane, a first complex field.
  • the phase of this first complex field, in the object plane is multiplied by a ratio between the first wavelength and a second wavelength.
  • This complex field is then propagated, according to said second wavelength, from the object plane to the detector plane, whereupon its module is replaced by the module of the image acquired at said second wavelength. It is then backpropagated in the plane of the object, for a second iteration. The iterative process continues until one reaches a convergence criterion.
  • WO2014035238 some inventors are the authors of the publication mentioned above, includes the same teachings.
  • the publication Bao P, Optics Communications 285, 5029-5036, 2012 discloses an iterative algorithm for reconstructing a three-dimensional surface of a transparent object from an image acquired by an image sensor in a lensless configuration.
  • This algorithm aims to illuminate an object using two wavelengths.
  • the image acquired by the image sensor, at each wavelength, is propagated in a plane of the object.
  • a phase difference at each of these wavelengths is then estimated in the object plane.
  • the three-dimensional surface is reconstructed from the phase difference thus estimated.
  • WO2015 / 015023 discloses an iterative holographic reconstruction algorithm based on a color image sensor in a lensless configuration.
  • the sample is illuminated by a polychromatic light source.
  • the acquired image is decomposed into different spectral components.
  • Each component is backpropagated in a plane according to which the sample extends, the propagation of the components being carried out at different distances from each other.
  • This document then describes a mixture of the spectra of each hologram in the Fourier domain, making it possible to generate a single image, the latter being used in a next iteration loop.
  • the inventors propose an alternative method to those proposed in the previous publications, allowing a reliable estimation of the optical properties of a sample.
  • a first object of the invention is a method for observing a sample, comprising the following steps:
  • the method being characterized in that it also comprises the following steps: iii) determining, from each image acquired according to each spectral band, an initial complex amplitude of the light wave transmitted, according to said spectral band, in said detection plane,
  • step iv) combining a plurality of complex amplitudes determined in step iv), at different spectral bands, to calculate a weighting function in the plane of the sample,
  • step vi updating each complex amplitude of the transmitted light wave, according to each spectral band, in the detection plane, using said determined weighting function, in said spectral band, during step vi )
  • each iteration comprises a propagation, called backpropagation, of the plane of the detector towards the plane of the sample, of a plurality of complex amplitudes, in different spectral bands.
  • These different complex amplitudes are combined, in the plane of the sample, to form a weighting function.
  • This combination, in the plane of the sample, of a plurality of complex amplitudes, corresponding to different spectral ranges, has the effect of smoothing the noise affecting each of them, this noise being the consequence of backpropagation.
  • the weighting function is then propagated from the plane of the sample to the detection plane, where it is used to form a new estimate of the complex amplitude of the light wave to which the sample is exposed, and this in each spectral band considered.
  • the weighting function in said sample plane can be calculated by calculating a weighted sum of different complex amplitudes, or their logarithms, in the sample plane. of the transmitted light wave, said complex amplitudes being respectively associated with different spectral bands.
  • the weighting function in said sample plane can also be determined by calculating a weighted sum of the module and / or the argument different complex amplitudes, in the plane of the sample, of the transmitted light wave, said complex amplitudes being respectively associated with different spectral bands.
  • transmitted light wave is meant the light wave to which the photodetector is exposed.
  • the method may include any of the following features, taken alone or in technically feasible combinations:
  • the modulus of the complex amplitude of the wave transmitted in a spectral band is determined by normalizing the intensity of the image measured by the photodetector 16, in said spectral band, by an intensity of reference measured by said photodetector in the absence of sample.
  • step iv) the determination of the complex amplitude in a plane of the sample, in a spectral band, is obtained by applying a propagation operator, along an axis of propagation, to said complex amplitude, defined in FIG. the same spectral band, in the detection plane.
  • said weighting function, in the detection plane is obtained by applying a propagation operator, along the axis of propagation, to the weighting function, determined, in the plane of the sample. during step v).
  • step vii) the modulus of the complex amplitude of the transmitted light wave, in a spectral band, in the detection plane, is calculated as a function of the modulus of said initial complex amplitude, in said spectral band.
  • step vii) the argument of the complex amplitude of the light wave transmitted, according to a spectral band, in the detection plane, is calculated according to the argument of the weighting function determined, in said detection plane and at said spectral band, during step vi).
  • said weighting function may be common to all of the spectral bands.
  • this step v) may comprise the determination of a plurality of weighting functions, each weighting function being associated with a spectral band.
  • the method may comprise, after step viii), step ix): forming an image representative of the module or the argument of the complex amplitude of the wave, transmitted by the sample, in the plane of the sample or in the detection plane, according to at least one spectral band ( ⁇ ,).
  • Another object of the invention is a device for observing a sample comprising: a light source capable of illuminating said sample,
  • the sample being disposed between the light source and the photodetector
  • the photodetector being able to form a plurality of images, in a detection plane, of a light wave transmitted by the sample under the effect of illumination by said light source, each image being obtained according to a spectral band different from each other,
  • a processor able to process said plurality of images by executing instructions, programmed in a memory, implementing a method as previously described.
  • FIG. 1 represents a first example of a device for implementing the invention, the sample analyzed being an anatomopathology slide.
  • FIG. 2 represents a first example of a device for implementing the invention, the analyzed sample being a body fluid comprising particles.
  • FIG. 3 shows the detection plane, on which an image is formed, as well as the plane of the sample. This figure also illustrates the links between the main quantities implemented in the various embodiments presented.
  • FIG. 4 represents a logic diagram describing the sequence of the main steps of an iterative reconstruction process.
  • FIG. 5 represents a second example of a device for the implementation of the invention, the sample analyzed being an anatomopathology slide.
  • FIGS. 6A, 6B and 6C represent reconstructed images, in a plane of the sample, in a first spectral band, according to an iterative reconstruction algorithm, these images being respectively obtained following a number of iterations respectively equal to 1, 3 and 10.
  • FIGS. 7A, 7B and 7C represent reconstructed images, in a plane of the sample, in a second spectral band, according to an iterative reconstruction algorithm, these images being respectively obtained following a number of iterations 1, 3 and 10 respectively.
  • FIGS. 8A, 8B and 8C represent reconstructed images, in one plane of the sample, in a third spectral band, according to an iterative reconstruction algorithm, these images being respectively obtained following a number of iterations respectively equal to 1, 3 and 10.
  • FIGS. 9A, 9B and 9C represent composite images, obtained by combining the reconstructed images in FIG. first, second and third spectral bands, these images corresponding respectively to 1, 3 and 10 iterations. These images are color images, represented here in black
  • FIG. 1 represents an exemplary device that is the subject of the invention.
  • a light source 11 is able to produce a light wave 12, referred to as the incident light wave, in the direction of a sample 10, along an axis of propagation Z.
  • Sample 10 may be a biological sample that it is desired to characterize. It may, for example, be a tissue slide, or anatomopathology slide, comprising a thin layer of tissue deposited on a transparent slide 15. By thin thickness, it is meant a thickness preferably of less than 100 ⁇ , and preferably less than 10 ⁇ , typically a few micrometers. Such a sample is shown in FIG. 1. It is observed that the sample extends along a plane P 3 ⁇ 4 called the plane of the sample, perpendicular to the axis of propagation Z.
  • Sample 10 may also comprise a medium 14, solid or liquid, comprising particles 1, 2, 3, 4, 5 to be characterized, such a case being shown in FIG. 2.
  • a medium 14 solid or liquid, comprising particles 1, 2, 3, 4, 5 to be characterized, such a case being shown in FIG. 2.
  • It may for example be biological particles in a culture medium, or in a body fluid.
  • biological particle is meant a cell, a bacterium or other microorganism, a fungus, a spore, etc.
  • the term particles may also refer to microbeads, for example metal microbeads, glass microbeads or organic microbeads, commonly used for work in biological protocols. It may also be insoluble droplets bathed in a liquid medium, for example lipid droplets in an oil-in-water emulsion.
  • a particle refers to both endogenous particles, initially present in the sample examined, and exogenous particles, added to this sample prior to analysis.
  • a particle has a size advantageously less than 1 mm, or even less than 500 ⁇ , and preferably a size between 0.5 ⁇ and 500 ⁇ .
  • the distance ⁇ between the light source and the sample is preferably greater than 1 cm. It is preferably between 2 and 30 cm.
  • the light source, seen by the sample is considered as point. This means that its diameter (or diagonal) is preferably less than one-tenth, better one-hundredth of the distance between the sample and the light source.
  • the light arrives at the sample in the form of plane waves, or can be considered as such.
  • the light source 11 is capable of producing a plurality of incident light waves
  • the light source comprises three sources of light-emitting diode (LED) lights, 11, 11 and 11 emitting respectively in the light-emitting diodes.
  • the light source 11 comprises a multiple LED diode brand Creat (trademark) and reference XLamp (registered trademark) MC-E.
  • This diode comprises four individually addressable elementary light-emitting diodes, of which only three are used in the context of this invention, the fourth being a white LED.
  • Elementary light sources can be temporally coherent sources, such as laser diodes. Other configurations of light sources 11 are possible and described later.
  • the light source 11 is preferably punctual. It may in particular comprise a diaphragm 18, or spatial filter.
  • the opening of the diaphragm is typically between 5 ⁇ and 1mm, preferably between 50 ⁇ and 500 ⁇ , for example 150 ⁇ .
  • the diaphragm may be replaced by an optical fiber, a first end of which is placed facing an elementary light source 11, 11 or 11, and a second end of which is placed facing the sample.
  • the light source 11 preferably comprises a diffuser 17 disposed between each elemental light source 11i, II2 and II3 and the diaphragm 18.
  • the inventors have found that the use of such a diffuser makes it possible to overcome the constraints of centering of each elemental source with respect to the opening of the diaphragm.
  • the use of such a diffuser makes it possible to use an elementary light source 11 , with 1 ⁇ i ⁇ 3, slightly off-center with respect to the opening of the diaphragm 18.
  • the diaphragm is supplied by Thorlabs under the reference P150S.
  • each elementary light source 11 is of small spectral width, for example less than 100 nm, or even 20 nm.
  • the term spectral width refers to the width at half height of the emission band of the light source considered.
  • the diffuser used is a 40 ° diffuser (Reference Light Shaping Diffuser 40 °, manufactured by Luminit).
  • the function of such a diffuser is to distribute the light beam produced by a source of elemental light 11 ,, according to a cone of angle a, a being equal to 40 ° in this case.
  • the diffusion angle ⁇ varies between 10 ° and 60 °.
  • the sample 10 is disposed between the light source 11 and a matrix photodetector 16. The latter preferably extends parallel to, or substantially parallel to, the transparent plate 15 supporting the sample.
  • substantially parallel means that the two elements may not be strictly parallel, an angular tolerance of a few degrees, less than 10 ° being allowed.
  • the photodetector 16 is an imager capable of forming an image according to a detection plane P.
  • it is a matrix photodetector comprising a matrix of pixels, of the CCD type or a CMOS.
  • CMOSs are the preferred photodetectors because the size of the pixels is smaller, which makes it possible to acquire images whose spatial resolution is more favorable.
  • the detector is a CMOS sensor marketed by Omnivision under the reference OV5647. This is a CMOS RGB sensor, comprising 2592 x 1944 pixels, with an inter-pixel pitch of 1.4 ⁇ .
  • the effective area of the photodetector is 3.6 x 2.7 mm 2 .
  • the detection plane P preferably extends perpendicularly to the propagation axis Z of the incident light wave 12.
  • the photodetector comprises a matrix of pixels, above which is disposed a transparent protection window.
  • the distance between the pixel matrix and the protection window is generally between a few tens of ⁇ at 150 or 200 ⁇ .
  • Photodetectors whose inter pixel pitch is less than 3 ⁇ are preferred, in order to improve the spatial resolution of the image.
  • the photodetector may include a mirror image return system to a pixel array, in which case the detection plane corresponds to the plane along which the image return system extends.
  • the detection plane P corresponds to the plane in which an image is formed.
  • the distance d between the sample 10 and the pixel matrix of the photodetector 16 is, in this example, equal to 300 ⁇ . In general, and whatever the embodiment, the distance d between the sample and the pixels of the photodetector is preferably between 50 ⁇ and 2 cm, preferably between 100 ⁇ and 2 mm. Note the absence of magnification optics between the photodetector 16 and the sample 10. This does not prevent the possible presence of microlenses focusing at each pixel of the photodetector 16, the latter having no function of magnification of the image.
  • FIG. 3 represents a sample 10, comprising diffracting objects 32 arranged around non-diffracting or little diffracting zones 31, described hereinafter as poor zones.
  • the sample may be solid, for example in the case of a tissue deposited on an anatomopathology slide. It can also be liquid, for example in the case of a body fluid or a cell culture medium.
  • the photodetector 16 is capable of producing an image I of a light wave 22, transmitted by the sample 10 when the latter is illuminated by an incident wave 12, in the i th spectral band ⁇ 1.
  • the spectral band of the transmitted light wave 22 comprises all or part of the spectral band of the incident wave 12.
  • the light wave 22 transmitted by the sample in the spectral band ⁇ , results from the interaction of the sample 10 with the incident light wave 12i, produced by the elementary light source 11,.
  • the sample 10 can generate a diffracted wave, capable of producing, at the level of the detection plane P, interference, in particular with a part of the incident light wave 12 , transmitted by the sample.
  • These interferences give rise, on the image acquired by the photodetector, to a plurality of elementary diffraction patterns, each elementary diffraction figure 36 comprising a central zone and several concentric diffraction rings.
  • Each elementary diffraction pattern 36 is due to a diffractive object 32 in the sample.
  • the sample can absorb a portion of the incident light wave 12.
  • the light wave 22 in a spectral band ⁇ , transmitted by the sample, and to which the matrix photodetector 16 is exposed, can comprise:
  • each elementary diffraction figure may be associated with a diffractive element 32 of the sample.
  • a diffractive element may be a cell, or a particle or any other diffractive object 32 present in the sample 10.
  • a processor 20 for example a microprocessor, is able to process each image generated by the matrix photodetector 16.
  • the processor is a microprocessor connected to a programmable memory 23 in which is stored a sequence of instructions for performing the operations of image processing and calculations described in this description. It can also be connected to a display screen 24.
  • each elementary light source 11 the light source 11 is successively activated, each light source producing an incident light wave (12i, .. 12 N), a spectral band ( ⁇ I , ... N ), along an axis of propagation Z, towards the sample 10.
  • the matrix photodetector collects an image I, corresponding to a spectral band ⁇ ,, the index i, relative to the spectral band, being between 1 and N, where N is the number of spectral bands considered.
  • the light source 11 comprises three elementary light sources 11, 11 2 and 11 3 .
  • the photodetector collects three images li, l 2 , b, respectively corresponding to the spectral bands ⁇ , ⁇ 2 and ⁇ 3.
  • r a radial coordinate, that is to say a coordinate in a plane perpendicular to the axis of propagation Z.
  • the complex amplitude a (r) comprises a module and an argument, so that:
  • Mf (r) denotes the modulus of the complex amplitude of the light wave detected by the photodetector, in the ith spectral band ⁇ ,, at a radial coordinate r in the detection plane;
  • ⁇ pf (r) denotes the phase of the complex amplitude of the light wave detected by the photodetector, in the ith spectral band ⁇ , and at said radial coordinate r in the detection plane.
  • e 7 ⁇ is considered to be equal to an arbitrary initial value, for example equal to 1.
  • the complex amplitude af (r) can be expressed in a standardized way, according to the expression:
  • jmean designates the mean intensity of the light wave 12, emitted by the light source 11 in the ith spectral band ⁇ ,; this average intensity can be determined experimentally, by arranging the photodetector 16 facing the light source 11, without a sample interposed between one and the other, and by calculating the average of the pixels of the image acquired by the photodetector 16.
  • Af (r) denotes the normalized complex amplitude of the light wave 22, detected by the matrix photodetector 16 in the ith spectral band ⁇ 1.
  • Normalization can also be achieved by dividing the complex amplitude a (r) by I ean (r), this term representing the light intensity, at the radial coordinate r, measured in the absence of sample.
  • the normalized complex amplitude Af (r) has a module and an argument, so that:
  • mf (r) denotes the modulus of the normalized complex amplitude Af (r);
  • ⁇ pf (r) denotes the phase of the normalized complex amplitude, which is also the phase of the complex amplitude ff (r).
  • the first step 100 makes it possible to assign to each complex amplitude a (r) or to each normalized complex amplitude Af (r) an initial value from the image I, detected by the photodetector in the ith spectral band ⁇ ,, in such a way that :
  • the index p corresponds to the rank of the iteration of the iterative process described later. Since step 100 is an initialization step, the value 1 is assigned to this index.
  • a complex image, or complex field, of the light wave 22 at the plane of the detector is obtained, this image bringing together the complex amplitudes af (r) or the complex amplitudes Normalized Af (r).
  • This first step is repeated for each spectral band ( ⁇ ... ⁇ ⁇ ) detected by the photodetector.
  • the normalized complex amplitude A ° ip (r ' ) of the wave 22, to which the detector is exposed is estimated in the plane of the sample P 0 .
  • This estimate is made by backpropagating the normalized complex amplitude Af p (r), determined in the detection plane P, from the detection plane P to the plane of the sample P 0 .
  • the index p designates the rank of the iteration.
  • the complex amplitude resulting from the previous iteration is used, as will be detailed later.
  • the normalized complex amplitude A z ip j) of the light wave 22 can be obtained at a coordinate point (r, z) from Af p d (r), depending on the operation :
  • ⁇ ⁇ denotes the propagation operator in the spectral band ⁇ ,.
  • the propagation operator can in particular be based on the Fresnel diffraction model.
  • the propagation operator is the Fresnel-Helmholtz function, such that:
  • ⁇ denotes the central wavelength of the spectral band considered.
  • a ° p (r) is thus obtained by backpropagation of Af p (r) according to the distance d separating the detection plane P from the plane of the sample Po.
  • This second step is repeated for each spectral band ( ⁇ I ... AN) emitted by the light source 11 or, more generally, for each spectral band ( ⁇ I ... AN) respectively associated with each image (II .. IN) detected by the photodetector 16. It is possible, at this stage, to establish an image of the modulus or phase of the amplitude A ° p (r) complex of each light wave 22 ,, in the plane of the sample Po, the complex amplitude being normalized or not, by calculating the value of A ° p (r) at the various coordinates r in the plane of the sample.
  • Each image of the complex amplitude module A ° p (r) is representative of the intensity of the light wave at the sample level, while each image of the argument of the complex amplitude A ° p (r) is representative of the phase of the intensity of the light wave at the sample level.
  • the information contained in the three images makes it possible to obtain a color image of the sample.
  • a weighting function denoted F p (r)
  • F p (r) a weighting function constituted of the complex amplitude of the light wave transmitted by the sample in the different bands.
  • spectral ⁇ considered.
  • the weighting function F p ° (r) in the plane of the sample may be common to each spectral band. It is obtained by combining the standardized complex amplitudes A ° p (r) of the light wave transmitted by the sample, in the plane P 0 of the sample and in the different spectral bands ⁇ .
  • the weighting function is obtained by a weighted sum of each complex amplitude determined during step 200, in the plane Po of the sample, according to the expression:
  • ki denotes a weighting factor, positive, associated with the ith spectral band ⁇ ,.
  • the weighting factors may be equal to each other, for example equal to 1/3. Other ways to determine the weighting function in the sample plan are detailed below.
  • the step 400 aims to propagate, from the plane of the sample Po to the plane of the detector P, the weighting function F p (r) determined, in the previous step, in the plane of the sample Po.
  • the wavelength dependent propagation operator as many weighting functions are determined in the detection plane as are considered spectral bands.
  • ⁇ denotes the central wavelength of the spectral band considered. 5 'th step: updating the complex amplitude in the detector plane
  • the update formula is:
  • mf (r) denotes the modulus of the initial standardized complex amplitude determined, from the image I ,, during the first step 100. This term has a function of attachment to the measured data;
  • ⁇ p p denotes an estimate of the phase of the complex amplitude of the wave 22, in the ith spectral band ⁇ ,;
  • Afp rr designates the complex amplitude of the light wave 22i transmitted by the sample, in the plane of the photodetector 16, this complex amplitude constituting the basis of the next iteration.
  • the steps 200 to 500 are performed iteratively, or according to a number of iterations ma x predetermined, ie until a convergence criterion has been reached, which can be, for example, example, expressed as a difference between the estimation of two same quantities between two successive iterations. When this difference is smaller than a given threshold ⁇ , the convergence criterion is reached. For example, the process is stopped when one of these conditions is reached:
  • the complex amplitude f (r) or the normalized complex amplitude Af (r) determined during this step do not include any information as to the phase of the phase. light wave they represent. This lack information is reflected, during the backpropagation of the plane of the detector P to the plane of the sample P 0 , the subject of step 200, by the formation of artifacts designated by the term "twin image".
  • step 100 get an initial estimate the complex amplitude of the wave 22, transmitted by the sample, in the plane of the detector, and this in several spectral bands (step 100);
  • the update formula of step 500 shows that, at each iteration, the modulus mf (r) (respectively Ai (r)) of the normalized complex amplitude A p (r) (respectively of the complex amplitude af p (r)), in the detection plane, corresponds to the one determined, during step 100, by each image I, formed by the photodetector 16 in the spectral band ⁇ ,.
  • the modulus, in the detection plane, of the complex amplitude af (r) or of the normalized complex amplitude A p (r) does not change and corresponds to that derived from the intensity measured by the photodetector.
  • each iteration includes:
  • a first way of constituting the weighting function is to perform a fair weighting between the different spectral bands ⁇ , considered.
  • Each weighting factor k t is positive and can have the same value, for example 1/3.
  • the modules of the complex amplitudes of first light waves 22, whose spectral bands ⁇ , are close to the range spectral ⁇ have a higher value than the modules of the complex amplitudes of second light waves whose spectral bands are farther from the wavelength ⁇ .
  • the weighting factor ki is lower than the weighting factors k 2 and k 3 respectively associated with spectral bands ⁇ 2 (green) and ⁇ 3 (red).
  • the module and the argument of each complex amplitude are weighted by independent weighting factors, so that
  • ki and k'i being weighting factors respectively associated with the modulus and the argument of the complex amplitude of the light wave 22 ,, in the plane of the sample, in the spectral band ⁇ ,.
  • a weighting function F p (r) is not determined, but a plurality of weighting functions F p j), each function being associated with a spectral band ⁇ , .
  • Each F ° weighting function p (r) associated with an i th wavelength is obtained by combining a number of complex amplitudes A ° p (r), respectively associated with different spectral bands.
  • the weighting function takes the form of a vector F p (r), of dimension N, where N is the number of spectral bands considered, of which each term F? p (r) is a weighting function associated with a spectral band ⁇ ,.
  • This weighting function can be obtained by the following matrix product:
  • K is a weighting matrix
  • each term ky of the weighting matrix representing the weight associated with the complex amplitude ⁇ ° ⁇ ( ⁇ ) associated with the spectral band ⁇ for calculating the weighting function associated with the band spectral ⁇ ,.
  • the matrix K is a square matrix of dimension N x N, N being the number of spectral bands considered.
  • the weighting function is preferably standardized, so that each term
  • F j 0 p is expressed as: the term ⁇ ⁇ being a standardization term.
  • the weighting function takes the form of a vector Fp r), of dimension 2N, where N is the number of spectral bands considered, each term representing either the module or the argument of a weighting function F ° p r) associated with a spectral band ⁇ ,.
  • This weighting function can be obtained by the following matrix product:
  • K is a weighting matrix, of dimension 2N x2N, each term kg of the weighting matrix representing the weight associated with either the argument or the phase of the complex amplitude Aj p (r) associated with the band spectral ⁇ .
  • each coordinate of the vector A p represents either the module or the argument of a complex amplitude, Aj p (r) in a spectral band j.
  • the weighting function is preferably normalized, so that each term F ° p is expressed as:
  • the coefficients of a weighting matrix can be determined beforehand, either arbitrarily or based on experimental tests.
  • the coefficient ky of the weighting matrix can then be determined as a function of this linear regression coefficient oty, possibly affected by a term taking into account the dispersion around the linear regression model.
  • the diagonal of the weighting matrix may consist of coefficients k u equal to 1.
  • the light source 11, able to emit a light wave 12 in different spectral bands comprises three elementary light sources 11, 11 2 , 11 3 , taking the form of diodes electroluminescent, emitting respectively in a first spectral band ⁇ , a second spectral band ⁇ 2 and a third spectral band ⁇ 3, the spectral bands being different from each other, and preferably not overlapping.
  • the light source 11 may also comprise a white light source 11 w placed upstream of a filtering device 19, for example a filter wheel, capable of interposing a bandwidth filter ⁇ between the white light source. and the sample, as shown in FIG. 5, such that the image I formed by the photodetector 16 is representative of said bandwidth ⁇ 1.
  • filters having different passbands from each other, are then successively interposed between the light source 11 w and the sample 10.
  • the filtering device 19 may also be a tri-band filter, defining a plurality of spectral bands.
  • a filter suitable for the application is the Tri-Band filter 458, 530 & 628 nm - Edmund Optics, defining spectral bands respectively centered on the wavelengths 457 nm, 530 nm and 628 nm. This allows illumination of the sample simultaneously using 3 wavelengths.
  • the photodetector 16 may, as previously described, be an RGB matrix photodetector, which makes it possible to acquire successively or simultaneously different images ⁇ .. ⁇ , ... ⁇ different spectral bands ⁇ .. ⁇ ... ⁇ .
  • the light source may be a white light source 11 w , in which case the different images may be acquired simultaneously. It can also be a monochromatic photodetector 16, in which case the light source 11 is able to generate, successively, a light wave in different spectral bands ⁇ .. ⁇ ... ⁇ .
  • the light source comprises either several elementary light sources Ili, II2, II 3 , or a filtering device 19, as previously described.
  • the sample is successively exposed to incident light waves 12 ⁇ ..12, ... 12 ⁇ , N being the number of spectral bands considered.
  • An image I, (l ⁇ i ⁇ N), representative of the light wave 22, transmitted by the sample is then acquired at each exposure.
  • Tests were performed according to the configuration shown in Figure 1 and described above.
  • the sample is an anatomopathology slide, with a section of colon stained by Hematoxylin Eosine Safran.
  • the light source is disposed at a distance ⁇ equal to 5 cm from the sample, this distance separating the diaphragm 18 from the sample 10.
  • FIGS. 6A, 6B and 6C represent an image of the module
  • FIGS. 7A, 7B and 7C represent an image of the module
  • FIGS. 8A, 8B and 8C represent an image of the module
  • Figs. 9A, 9B and 9C show respectively the combination of the images 6A-7A-8A, 6B-7B-8B; 6C-7C-8C.
  • These figures make it possible to have a color representation of the sample, while simultaneously taking into account the three spectral bands ⁇ , ⁇ 2 and ⁇ 3.
  • an increase in contrast is observed as a function of the number of iterations.
  • the method is therefore suitable for the observation of samples in a wide field and at high rates. It makes it possible to obtain images according to one or more spectral bands, making it compatible with the dyeing methods commonly practiced in the field of anatomocytopathology.

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Abstract

Procédé d'observation d'un échantillon (10) comportant une étape d'illumination de l'échantillon par une source de lumière et l'enregistrement d'une pluralité d'images, par un photodetecteur(16), les images représentant la lumière transmise par l'échantillon dans différentes bandes spectrales. A partir de chaque image, on détermine une amplitude complexe représentative de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon dans une bande spectrale déterminée. Le procédé, itératif, comprend alors : • - la rétropropagation de chaque amplitude complexe dans un plan de l'échantillon, • - le calcul d'une fonction de pondération à partir d'une somme pondérée des amplitudes complexes rétropropagées, • - la propagation de ladite fonction de pondération dans le plan du photodétecteur, • - la mise à jour de chaque amplitude complexe, dans le plan de l'échantillon, en fonction de la fonction de pondération ainsi propagée.

Description

Procédé d'observation d'un échantillon Description
DOMAINE TECHNIQUE
Le domaine technique de l'invention est lié à l'observation d'un échantillon, en particulier un échantillon biologique, par imagerie sans lentille, en mettant en œuvre un algorithme de reconstruction holographique aux performances améliorées.
ART ANTERIEUR
L'observation d'échantillons, et en particulier des échantillons biologiques, par imagerie sans lentille connaît un développement important depuis ces dix dernières années. Cette technique permet d'observer un échantillon en le disposant entre une source de lumière et un photodétecteur matriciel, sans disposer de lentille de grossissement optique entre l'échantillon et le photodétecteur. Ainsi, le photodétecteur collecte une image de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon.
Cette image est formée de figures d'interférence entre l'onde lumineuse émise par la source et transmise par l'échantillon, et des ondes de diffraction, résultant de la diffraction par l'échantillon de l'onde lumineuse émise par la source. Ces figures d'interférences sont parfois dénommées figures de diffraction, ou désignées par le terme anglais « diffraction pattern ».
Le document WO2008090330 décrit un dispositif permettant l'observation d'échantillons biologiques, en l'occurrence des cellules, par imagerie sans lentille. Le dispositif permet d'associer, à chaque cellule, une figure d'interférence dont la morphologie permet d'identifier le type de cellule. L'imagerie sans lentille apparaît alors comme une alternative simple, et peu onéreuse, à un microscope classique. De plus, son champ d'observation est nettement plus important que ne peut l'être celui d'un microscope. On comprend alors que les perspectives d'application liées à cette technologie sont importantes. Ce document mentionne également la possibilité d'illuminer l'échantillon à l'aide de sources de lumière de différentes longueurs d'onde.
Le document US2012/0218379, postérieur au document précédent, reprend l'essentiel des enseignements de WO2008090330, tout en mentionnant la possibilité d'utiliser un photodétecteur matriciel couleur, mais l'information couleur est ensuite traitée pour former une image monochrome.
D'une façon générale, l'image formée sur le photodétecteur matriciel, comportant des figures d'interférence, peut être traitée par un algorithme de propagation numérique, de manière à estimer des propriétés optiques de l'échantillon. De tels algorithmes sont bien connus dans le domaine de la reconstruction holographique. Pour cela, la distance entre l'échantillon et le photodétecteur étant connue, on applique un algorithme de propagation, prenant en compte cette distance, ainsi que la longueur d'onde. On peut alors reconstituer une image d'une propriété optique de l'échantillon. Un algorithme de reconstruction numérique est par exemple décrit dans US2012/0218379.
Il est également connu que de tels algorithmes peuvent générer une image affectée d'un bruit de fond important, qualifié par le terme anglais « Twin Image », signifiant « image jumelle ». Un tel bruit est dû au fait que l'image de départ, formée par le photodétecteur, ne contient qu'une information partielle quant à l'onde lumineuse collectée par le photodétecteur. En effet, une image ne donne qu'une information relative à la partie réelle de l'onde lumineuse, obtenue par l'intensité mesurée. Mais une telle image ne comporte pas d'information relative à la partie imaginaire de l'onde lumineuse à laquelle est exposé le détecteur, en particulier sa phase. L'algorithme de reconstruction utilise donc une information incomplète, ce qui se traduit par l'apparition d'un bruit sur l'image reconstruite.
Un tel bruit de fond peut compliquer l'interprétation des images reconstruites par propagation numérique ; il est important d'en diminuer l'influence par des algorithmes appropriés.
Pour ce faire, la publication « Lensless phase contrast microscopy based on multiwavelenght Fresnel diffraction », Optics Letters Vol. 39, N°2, 15 janvier 2014, décrit un algorithme permettant d'améliorer la qualité des images reconstruites. Cette publication décrit un dispositif d'imagerie sans lentille basé sur l'utilisation de trois sources de lumière de longueurs d'onde différentes (respectivement 685 nm, 785 nm, 940 nm). L'échantillon est illuminé successivement par ces trois sources de lumière. Le photodétecteur acquiert alors autant d'images que de sources de lumière, ces images étant formées dans un plan, dit plan du détecteur, selon lequel s'étend le capteur. A chaque image correspond une longueur d'onde.
Une première image, d'une première longueur d'onde, est rétropropagée, selon ladite première longueur d'onde, dans un plan selon lequel s'étend l'objet, dit plan de l'objet, de façon à obtenir, dans ce plan objet, un premier champ complexe. La phase de ce premier champ complexe, dans le plan objet, est multipliée par un ratio entre la première longueur d'onde et une deuxième longueur d'onde. Ce champ complexe est alors propagé, selon ladite deuxième longueur d'onde, du plan objet vers le plan du détecteur, suite à quoi son module est remplacé par le module de l'image acquise à ladite deuxième longueur d'onde. Il est alors rétropropagé dans le plan de l'objet, pour une deuxième itération. Le procédé itératif se poursuit jusqu'à une l'atteinte d'un critère de convergence. Le document WO2014035238, dont certains inventeurs sont les auteurs de la publication évoquée ci-dessus, comporte les mêmes enseignements.
La publication Bao P,« Optical surface profile measurement using phase retrieval by tuning the illumination wavelenght », Optics Communications 285, 5029-5036, 2012 décrit un algorithme itératif permettant une reconstruction d'une surface tridimensionnelle d'un objet transparent à partir d'une image acquise par un capteur d'image dans une configuration sans lentille. Cet algorithme vise à illuminer un objet à l'aide de deux longueurs d'onde. L'image acquise par le capteur d'image, à chaque longueur d'onde, est propagée dans un plan de l'objet. On estime ensuite une différence de phases, à chacune de ces longueurs d'onde, dans le plan objet. La surface tridimensionnelle est reconstruite à partir de la différence de phase ainsi estimée.
Le document WO2015/015023 décrit un algorithme itératif de reconstruction holographique basé sur un capteur d'image couleur dans une configuration sans lentille. Selon cet algorithme, l'échantillon est illuminé par une source de lumière polychromatique. L'image acquise est décomposée en différentes composantes spectrales. Chaque composante est rétropropagée dans un plan selon lequel s'étend l'échantillon, la propagation des composantes étant réalisée selon différentes distances les unes des autres. Ce document décrit ensuite un mélange des spectres de chaque hologramme dans le domaine de Fourier, permettant de générer une image unique, cette dernière étant utilisée dans une boucle d'itération suivante.
Les inventeurs proposent une méthode alternative à celles proposées dans les publications précédentes, permettant une estimation fiable des propriétés optiques d'un échantillon.
EXPOSE DE L'INVENTION
Un premier objet de l'invention est un procédé d'observation d'un échantillon, comportant les étapes suivantes :
i) illumination dudit échantillon à l'aide d'une source de lumière, apte à produire une onde lumineuse se propageant selon un axe de propagation.
ii) acquisition, à l'aide d'un photodétecteur, d'une pluralité d'images de l'échantillon, formées dans un plan de détection, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le photodétecteur, chaque image étant représentative d'une onde lumineuse, transmise par l'échantillon, sous l'effet de ladite illumination, chaque image étant acquise selon une bande spectrale différente l'une de l'autre,
le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes : iii) détermination, à partir de chaque image acquise selon chaque bande spectrale, d'une amplitude complexe initiale de l'onde lumineuse transmise, selon ladite bande spectrale, dans ledit plan de détection,
iv) rétropropagation de chaque amplitude complexe établie dans le plan de détection, selon une bande spectrale, pour déterminer une amplitude complexe de l'onde transmise, selon chaque bande spectrale, dans un plan selon lequel s'étend l'échantillon,
v) combinaison d'une pluralité d'amplitudes complexes déterminées lors de l'étape iv), à différentes bandes spectrales, pour calculer une fonction de pondération dans le plan de l'échantillon,
vi) projection de ladite fonction de pondération dans le plan de détection, de façon à obtenir, pour chaque bande spectrale, une fonction de pondération dans ledit plan de détection,
vii) mise à jour de chaque amplitude complexe de l'onde lumineuse transmise, selon chaque bande spectrale, dans le plan de détection, à l'aide de ladite fonction de pondération déterminée, dans ladite bande spectrale, au cours de l'étape vi),
viii) répétition des étapes iv à vii jusqu'à l'atteinte d'un critère d'arrêt.
Ainsi chaque itération comprend une propagation, dite rétropropagation, du plan du détecteur vers le plan de l'échantillon, d'une pluralité d'amplitudes complexes, dans différentes bandes spectrales. Ces différentes amplitudes complexes sont combinées, dans le plan de l'échantillon, pour former une fonction de pondération. Cette combinaison, dans le plan de l'échantillon, d'une pluralité d'amplitudes complexes, correspondant à différentes plages spectrales, a pour effet de lisser le bruit affectant chacune d'entre elles, ce bruit étant la conséquence de la rétropropagation.
La fonction de pondération est ensuite propagée du plan de l'échantillon vers le plan de détection, où elle est utilisée pour former une nouvelle estimation de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse à laquelle est exposé l'échantillon, et cela dans chaque bande spectrale considérée.
De façon alternative aux méthodes exposées dans l'art antérieur, la fonction de pondération, dans ledit plan de l'échantillon, peut être calculée en calculant une somme pondérée de différentes amplitudes complexes, ou de leurs logarithmes, dans le plan de l'échantillon, de l'onde lumineuse transmise, lesdites amplitudes complexes étant respectivement associées à différentes bandes spectrales. La fonction de pondération, dans ledit plan de l'échantillon, peut également être déterminée en calculant une somme pondérée du module et/ou de l'argument de différentes amplitudes complexes, dans le plan de l'échantillon, de l'onde lumineuse transmise, lesdites amplitudes complexes étant respectivement associées à différentes bandes spectrales.
Par onde lumineuse transmise, on entend l'onde lumineuse à laquelle est exposé le photodétecteur.
Le procédé peut comprendre l'une quelconque des caractéristiques suivantes, prises isolément ou selon les combinaisons techniquement réalisables :
lors de l'étape iii), le module de l'amplitude complexe de l'onde transmise dans une bande spectrale est déterminé en normalisant l'intensité de l'image mesurée par le photodétecteur 16, dans ladite bande spectrale, par une intensité de référence mesurée par ledit photodétecteur en l'absence d'échantillon.
Lors de l'étape iv), la détermination de l'amplitude complexe dans un plan de l'échantillon, dans une bande spectrale, est obtenue en appliquant un opérateur de propagation, selon un axe de propagation, à ladite amplitude complexe, définie dans la même bande spectrale, dans le plan de détection.
Lors de l'étape vi), ladite fonction de pondération, dans le plan de détection, est obtenue en appliquant un opérateur de propagation, selon l'axe de propagation, à la fonction de pondération, déterminée, dans le plan de l'échantillon, au cours de l'étape v).
Lors de l'étape vii), le module de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse transmise, selon une bande spectrale, dans le plan de détection, est calculé en fonction du module de ladite amplitude complexe initiale, dans ladite bande spectrale.
Lors de l'étape vii), l'argument de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse transmise, selon une bande spectrale, dans le plan de détection, est calculé en fonction de l'argument de la fonction de pondération déterminée, dans ledit plan de détection et à ladite bande spectrale, au cours de l'étape vi).
Lors de l'étape v), ladite fonction de pondération peut être commune à l'ensemble des bandes spectrales. Alternativement, cette étape v) peut comprendre la détermination d'une pluralité de fonctions de pondérations, chaque fonction de pondération étant associée à une bande spectrale.
Le procédé peut comporter, suite à l'étape viii), l'étape ix) : formation d'une image représentative du module ou de l'argument de l'amplitude complexe de l'onde, transmise par l'échantillon, dans le plan de l'échantillon ou dans le plan de détection, selon au moins une bande spectrale (λ,).
Un autre objet de l'invention est un dispositif d'observation d'un échantillon comportant : une source de lumière, apte à illuminer ledit échantillon,
un photodétecteur, l'échantillon étant disposé entre la source de lumière et le photodétecteur,
le photodétecteur étant apte à former une pluralité d'images, dans un plan de détection, d'une onde lumineuse transmise par l'échantillon sous l'effet de l'illumination par ladite source de lumière, chaque image étant obtenue selon une bande spectrale différente l'une de l'autre,
un processeur, apte à traiter ladite pluralité d'images en exécutant des instructions, programmées dans une mémoire, mettant en œuvre un procédé tel que précédemment décrit.
FIGURES
La figure 1 représente un premier exemple de dispositif pour la mise en œuvre de l'invention, l'échantillon analysé étant une lame d'anatomopathologie.
La figure 2 représente un premier exemple de dispositif pour la mise en œuvre de l'invention, l'échantillon analysé étant un liquide corporel comportant des particules.
La figure 3 représente le plan de détection, sur lequel une image est formée, ainsi que le plan de l'échantillon. Cette figure illustre également les liens entre les principales grandeurs mises en œuvre dans les différents modes de réalisation exposés.
La figure 4 représente un logigramme décrivant l'enchaînement des principales étapes d'un procédé itératif de reconstruction.
La figure 5 représente un deuxième exemple de dispositif pour la mise en œuvre de l'invention, l'échantillon analysé étant une lame d'anatomopathologie.
Les figures 6A, 6B et 6C représentent des images reconstruites, dans un plan de l'échantillon, dans une première bande spectrale, selon un algorithme de reconstruction itératif, ces images étant respectivement obtenues suite à un nombre d'itérations respectivement égal à 1, 3 et 10. Les figures 7 A, 7B et 7C représentent des images reconstruites, dans un plan de l'échantillon, dans une deuxième bande spectrale, selon un algorithme de reconstruction itératif, ces images étant respectivement obtenues suite à un nombre d'itérations respectivement égal à 1, 3 et 10. Les figures 8A, 8B et 8C représentent des images reconstruites, dans un plan de l'échantillon, dans une troisième bande spectrale, selon un algorithme de reconstruction itératif, ces images étant respectivement obtenues suite à un nombre d'itérations respectivement égal à 1, 3 et 10. Les figures 9A, 9B et 9C représentent des images composites, obtenues par combinaison des images reconstruites dans la première, la deuxième et la troisième bande spectrales, ces images correspondant respectivement à 1, 3 et 10 itérations. Ces images sont des images en couleur, représentées ici en noir et blanc.
EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS
La figure 1 représente un exemple de dispositif objet de l'invention. Une source de lumière 11 est apte à produire une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, en direction d'un échantillon 10, selon un axe de propagation Z.
L'échantillon 10 peut être un échantillon biologique que l'on souhaite caractériser. Il peut par exemple s'agir d'une lame de tissu, ou lame d'anatomopathologie, comportant une fine épaisseur de tissu déposée sur une lame transparente 15. Par fine épaisseur, on entend une épaisseur de préférence inférieure à 100 μιη, et de préférence inférieure à 10 μιη, typiquement quelques micromètres. Un tel échantillon est représenté sur la figure 1. On observe que l'échantillon s'étend selon un plan P¾ dit plan de l'échantillon, perpendiculaire à l'axe de propagation Z.
L'échantillon 10 peut également comporter un milieu 14, solide ou liquide, comportant des particules 1, 2, 3, 4, 5 à caractériser, un tel cas de figure étant représenté sur la figure 2. Il peut par exemple s'agir de particules biologiques dans un milieu de culture, ou dans un liquide corporel. Par particule biologique, on entend une cellule, une bactérie ou autre microorganisme, un champignon, une spore... Le terme particules peut également désigner des microbilles, par exemple des microbilles métalliques, des microbilles de verre ou des microbilles organiques, couramment mises en œuvre dans des protocoles biologiques. Il peut également s'agir de gouttelettes insolubles baignant dans un milieu liquide, par exemple des gouttelettes lipidiques dans une émulsion de type huile dans eau. Ainsi, le terme particule désigne à la fois des particules endogènes, initialement présentes dans l'échantillon examiné, et des particules exogènes, ajoutées à cet échantillon avant l'analyse. D'une façon générale, une particule a une taille avantageusement inférieure à 1 mm, voire inférieure à 500 μιη, et de préférence une taille comprise entre 0.5 μιη et 500 μιη.
La distance Δ entre la source de lumière et l'échantillon est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. De préférence, la source de lumière, vue par l'échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre l'échantillon et la source de lumière. Ainsi, de préférence, la lumière parvient à l'échantillon sous la forme d'ondes planes, ou pouvant être considérées comme telles. La source de lumière 11 est apte à produire une pluralité d'ondes lumineuses incidentes
12i 12n, chaque ieme onde lumineuse 12, s' étendant selon une ieme bande spectrale λ,. Les bandes spectrales 12i...l2n sont différentes les unes des autres, et, de préférence, ne se recouvrent pas. Dans l'exemple de dispositif représenté sur les figures 1 et 2, la source de lumière comporte trois sources de lumières élémentaires de type diodes électroluminescentes (LED, acronyme du terme anglais Light Emitting Diode), lli, II2 et II3 émettant respectivement dans les bandes spectrales λι = 450nm - 465 nm ; λ2 = 520nm - 535 nm ; λ3 = 620nm - 630 nm. De préférence, il n'y a pas de recouvrement entre les différentes bandes spectrales ; un recouvrement négligeable, par exemple concernant moins de 25%, mieux moins de 10% de l'intensité lumineuse émise, est toutefois envisageable. Dans ces exemple, la source de lumière 11 comporte une diode LED multiple de marque Crée (marque déposée) et de référence XLamp (marque déposée) MC-E. Cette diode comporte quatre diodes électroluminescentes élémentaires adressables individuellement, dont trois seulement sont mises en œuvre dans le cadre de cette invention, la quatrième étant une LED blanche. Les sources de lumière élémentaires peuvent être des sources temporellement cohérentes, comme des diodes Laser. D'autres configurations de sources lumineuses 11 sont possibles et décrites par la suite.
La source de lumière 11 est de préférence ponctuelle. Elle peut notamment comprendre un diaphragme 18, ou filtre spatial. L'ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 μιη et 1mm, de préférence entre 50 μιη et 500 μιη, par exemple 150 μιη. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à une source de lumière élémentaire lli, II2 ou II3, et dont une deuxième extrémité est placée face à l'échantillon.
La source de lumière 11 comporte de préférence un diffuseur 17, disposé entre chaque source de lumière élémentaire lli, II2 et II3 et le diaphragme 18. Les inventeurs ont constaté que l'usage d'un tel diffuseur permet de s'affranchir de contraintes de centrage de chaque source élémentaire par rapport à l'ouverture du diaphragme. Autrement dit, l'utilisation d'un tel diffuseur permet d'utiliser une source de lumière élémentaire 11,, avec 1 < i < 3, légèrement décentrée par rapport à l'ouverture du diaphragme 18. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P150S.
De préférence, chaque source de lumière élémentaire 11, est de faible largeur spectrale, par exemple inférieure à 100 nm, voire 20 nm. Le terme largeur spectrale désigne la largeur à mi- hauteur de la bande d'émission de la source de lumière considérée. Dans cet exemple, le diffuseur mis en œuvre est un diffuseur 40° (Référence Light Shaping Diffuser 40°, fabriqué par Luminit). La fonction d'un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11,, selon un cône d'angle a, a étant égal à 40° dans le cas présent. De préférence, l'angle de diffusion a varie entre 10° et 60°. L'échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et un photodétecteur matriciel 16. Ce dernier s'étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement à la lame transparente 15 supportant l'échantillon.
Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 10° étant admise.
Le photodétecteur 16 est un imageur, apte à former une image selon un plan de détection P. Dans l'exemple représenté, il s'agit d'un photodétecteur matriciel comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Les CMOS sont les photodétecteurs préférés, car la taille des pixels est plus faible, ce qui permet d'acquérir des images dont la résolution spatiale est plus favorable. Dans cet exemple, le détecteur est un capteur CMOS commercialisé par Omnivision sous la référence OV5647. Il s'agit d'un capteur CMOS RGB, comprenant 2592 x 1944 pixels, avec un pas inter-pixels est de 1.4 μιη. La surface utile du photodétecteur est de 3.6 x 2.7 mm2. Le plan de détection P s'étend de préférence perpendiculairement à l'axe de propagation Z de l'onde lumineuse incidente 12. De préférence, le photodétecteur comprend une matrice de pixels, au-dessus de laquelle est disposée une fenêtre de protection transparente. La distance entre la matrice de pixels et la fenêtre de protection est généralement comprise entre quelques dizaines de μιη à 150 ou 200 μιη. Les photodétecteurs dont le pas inter pixel est inférieur à 3 μιιι sont préférés, afin d'améliorer la résolution spatiale de l'image. Le photodétecteur peut comprendre un système de renvoi d'image de type miroir vers une matrice de pixels, auquel cas le plan de détection correspond au plan selon lequel s'étend le système de renvoi d'image. D'une façon générale, le plan de détection P correspond au plan dans lequel une image est formée.
La distance d entre l'échantillon 10 et la matrice de pixels du photodétecteur 16 est, dans cet exemple, égale à 300 μιη. D'une manière générale, et cela quel que soit le mode de réalisation, la distance d entre l'échantillon et les pixels du photodétecteur est préférentiellement comprise entre 50 μιη et 2 cm, de préférence comprise entre 100 μιη et 2 mm. On remarque l'absence d'optique de grossissement entre le photodétecteur 16 et l'échantillon 10. Cela n'empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du photodétecteur 16, ces dernières n'ayant pas de fonction de grandissement de l'image. La figure 3 représente un échantillon 10, comportant des objets diffractants 32 disposés autour de zones non diffractantes ou peu diffractantes 31, qualifiées par la suite de zones pauvres. L'échantillon peut être solide, par exemple dans le cas d'un tissu déposé sur une lame d'anatomopathologie. Il peut également être liquide, par exemple dans le cas d'un liquide corporel ou d'un milieu de culture cellulaire. Le photodétecteur 16 est apte à réaliser une image I, d'une onde lumineuse 22, transmise par l'échantillon 10 lorsque ce dernier est éclairé par une onde incidente 12,, dans la ieme bande spectrale λ,. La bande spectrale de l'onde lumineuse transmise 22, comporte tout ou partie de la bande spectrale de l'onde incidente 12,. L'onde lumineuse 22,, transmise par l'échantillon dans la bande spectrale λ,, résulte de l'interaction de l'échantillon 10 avec l'onde lumineuse incidente 12i, produite par la source de lumière élémentaire 11,.
Sous l'effet de l'onde lumineuse incidente 12,, l'échantillon 10 peut engendrer une onde diffractée, susceptible de produire, au niveau du plan de détection P, des interférences, en particulier avec une partie de l'onde lumineuse incidente 12, transmise par l'échantillon. Ces interférences donnent lieu, sur l'image acquise par le photodétecteur, à une pluralité de figures de diffraction élémentaires, chaque figure de diffraction élémentaire 36 comportant une zone centrale et plusieurs anneaux de diffraction concentriques. Chaque figure de diffraction élémentaire 36 est due à un objet diffractant 32 dans l'échantillon.
Par ailleurs, l'échantillon peut absorber une partie de l'onde lumineuse incidente 12,. Ainsi, l'onde lumineuse 22,, dans une bande spectrale λ,, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le photodétecteur matriciel 16, peut comprendre :
une composante résultant de la diffraction, précédemment décrite, cette composante de diffraction pouvant notamment se traduire par la présence de figures de diffraction élémentaires sur le photodétecteur 16, chaque figure de diffraction élémentaire pouvant être associée à un élément diffractant 32 de l'échantillon. Un tel élément diffractant peut être une cellule, ou une particule ou tout autre objet diffractant 32 présent dans l'échantillon 10.
une composante résultant de l'absorption de l'onde lumineuse incidente 12, dans l'échantillon. Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image générée par le photodétecteur matriciel 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 23 dans laquelle est stockée une séquence d'instructions pour effectuer les opérations de traitement d'images et de calculs décrites dans cette description. Il peut également être relié à un écran d'affichage 24.
On décrit ci-après les étapes d'un procédé itératif d'obtention d'une image de l'échantillon 10, en lien avec les figures 3 et 4. lere étape : initialisation
Lors d'une première étape 100 d'acquisition d'images, chaque source de lumière élémentaire 11, de la source de lumière 11 est successivement activée, chaque source de lumière produisant une onde lumineuse incidente (12i, .. 12N), dans une bande spectrale (ÀI,...ÀN), selon un axe de propagation Z, en direction de l'échantillon 10.
A chaque acquisition, le photodétecteur matriciel recueille une image I, correspondant à une bande spectrale λ,, l'indice i, relatif à la bande spectrale, étant compris entre 1 et N, N étant le nombre de bandes spectrales considérées. Dans l'exemple représenté sur les figures 1 et 2, la source de lumière 11 comporte trois sources de lumière élémentaires lli, 112 et 113. Le photodétecteur recueille trois images li, l2, b, correspondant respectivement aux bandes spectrales λι, λ2 et λ3.
L'échantillon est placé à une coordonnée axiale z = 0, selon l'axe de propagation Z. On désigne par r une coordonnée radiale, c'est-à-dire une coordonnée dans un plan perpendiculaire à l'axe de propagation Z. Le plan z = d correspond au plan de détection, tandis que le plan z = 0 correspond à un plan passant par l'échantillon, dit plan de l'échantillon et noté Po.
Si 7 =d (r)= if (r) désigne la valeur de l'intensité collectée, dans la bande spectrale λ,, par le pixel du détecteur de coordonnée radiale r dans le plan de détection, il est possible d'établir, à l'aide de l'image I, une amplitude com (r) de l'onde 22, au niveau dudit pixel de coordonnée r, dont le module peu l'expression :
Figure imgf000013_0001
L'exposant d exprime le fait que l'amplitude complexe est déterminée selon le plan P de l'échantillon, d'équation z = d. L'amplitude complexe a (r) comporte un module et un argument, de telle sorte que :
af {r) = Mf
Figure imgf000013_0002
où :
Mf (r) désigne le module de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse détectée par le photodétecteur, dans la ieme bande spectrale λ,, à une coordonnée radiale r dans le plan de détection ;
- <pf (r) désigne la phase de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse détectée par le photodétecteur, dans la ieme bande spectrale λ, et à ladite coordonnée radiale r dans plan de détection.
Or, le photodétecteur matriciel ne fournit aucune information relative à la phase de l'onde lumineuse. Aussi, lors de l'étape 100, on considère que e7^^ est égal à une valeur initiale arbitraire, par exemple égale à 1.
L'amplitude complexe af (r) peut être exprimée de façon normalisée, selon l'expression :
Af (r) =
1 1 jmean
où :
jmean désigne l'intensité moyenne l'onde lumineuse 12, émise par la source de lumière 11 dans la ieme bande spectrale λ, ; cette intensité moyenne peut être déterminée expérimentalement, en disposant le photodétecteur 16 face à la source de lumière 11, sans échantillon interposé entre l'un et l'autre, et en calculant la moyenne des pixels de l'image acquise par le photodétecteur 16.
Af (r) désigne l'amplitude complexe normalisée de l'onde lumineuse 22, détectée par le photodétecteur matriciel 16 dans la ième bande spectrale λ,.
La normalisation peut également être réalisée en divisant l'amplitude complexe a (r) par I™ean(r), ce terme représentant l'intensité lumineuse, à la coordonnée radiale r, mesurée en l'absence d'échantillon.
L'amplitude complexe normalisée Af (r) comporte un module et un argument, de telle sorte que :
Figure imgf000014_0001
où :
mf (r) désigne le module de l'amplitude complexe normalisée Af (r) ;
<pf (r) désigne la phase de l'amplitude complexe normalisée, qui est également la phase de l'amplitude complexe œf (r). La première étape 100 permet d'attribuer à chaque amplitude complexe a (r) ou à chaque amplitude complexe normalisée Af (r) une valeur initiale à partir de l'image I, détectée par le photodétecteur dans la ieme bande spectrale λ,, de telle sorte que :
ou
Figure imgf000015_0001
L'indice p correspond au rang de l'itération du procédé itératif décrit par la suite. L'étape 100 étant une étape d'initialisation, on attribue la valeur 1 à cet indice.
En adressant tout ou partie des pixels r du photodétecteur 16, on obtient une image complexe, ou champ complexe, de l'onde lumineuse 22, au niveau du plan du détecteur, cette image rassemblant les amplitudes complexes af (r) ou les amplitudes complexes normalisées Af (r).
Dans la suite de la description, on ne considère que l'amplitude complexe normalisée Af (r), sachant que le raisonnement s'applique également à l'amplitude complexe a (r).
Cette première étape est répétée pour chaque bande spectrale (λι...λΝ) détectée par le photodétecteur.
2'eme étape : rétropropagation dans le plan Pp de l'échantillon
Durant une deuxième étape 200, on estime l'amplitude complexe normalisée A°i p (r') de l'onde 22, à laquelle est exposé le détecteur, dans le plan de l'échantillon P0. Cette estimation est réalisée par rétropropagation de l'amplitude complexe normalisée Afp(r), déterminée dans le plan de détection P, du plan de détection P vers le plan de l'échantillon P0.
L'indice p désigne le rang de l'itération. Lors de la première itération (p = 1), on utilise l'amplitude complexe normalisée initiale
Figure imgf000015_0002
(r) = Af (r) obtenue suite à la première étape 100. Lors des itérations suivantes (p > 1), on utilise l'amplitude complexe résultant de l'itération précédente, comme cela sera détaillé par la suite. Selon les principes bien connus de la reconstruction holographique numérique, en effectuant un produit de convolution entre l'amplitude complexe de l'onde lumineuse 22,, relative à la bande spectrale λ,, déterminée dans le plan de détection z = d, et un opérateur de propagation h(r,z), il est possible de reconstruire une amplitude complexe de cette même onde lumineuse en tout point de coordonnées (r,z) de l'espace, et en particulier dans le plan Po de l'échantillon. Autrement dit, l'amplitude complexe normalisée Az i p j) de l'onde lumineuse 22, peut s'obtenir, à un point de coordonnées (r,z), à partir de Afp d(r), selon l'opération :
A ,p (r) = A ;d(r) * h i (r, z - d),
Où ή ί désigne l'opérateur de propagation dans la bande spectrale λ,.
Lorsque la reconstruction s'effectue selon le sens la propagation de la lumière, par exemple de l'échantillon vers le photodétecteur, on parle de propagation. Lorsque la reconstruction s'effectue selon le sens inverse de la propagation de la lumière, par exemple du photodétecteur vers l'échantillon, on parle de rétropropagation.
L'opérateur de propagation peut notamment reposer sur le modèle de diffraction de Fresnel. Dans cet exemple, l'opérateur de propagation est la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que :
1 f*2
h(r, z) = — eJ exp(jn—).
où λ désigne la longueur d'onde.
Ainsi,
■¾ » = A{v(r) = Af;"(r) . hM(r, -d)
où
r' désigne les coordonnées radiales dans le plan du photodétecteur (z = d), r désigne les coordonnées radiales dans le plan de reconstruction (z = 0),
λ, désigne la longueur d'onde centrale de la bande spectrale considérée.
A°p (r) est donc obtenu par rétropropagation de Afp (r) selon la distance d séparant le plan de détection P du plan de l'échantillon Po.
Cette deuxième étape est répétée pour chaque bande spectrale (ÀI...ÀN) émise par la source de lumière 11 ou, de façon plus générale, pour chaque bande spectrale (ÀI...ÀN) respectivement associée à chaque image (II... IN) détectée par le photodétecteur 16. II est possible, à ce stade, d'éta blir une image du module ou de la phase de l'amplitude A°p (r) complexe de chaque onde lumineuse 22,, dans le plan de l'échantillon Po, l'amplitude complexe étant normalisée ou non, en calculant la valeur de A°p (r) aux différentes coordonnées r dans le plan de l'échantillon.
Chaque image du module de l'amplitude complexe A°p(r) est représentative de l'intensité de l'onde lumineuse au niveau de l'échantillon, tandis que chaque image de l'argument de l'amplitude complexe A°p(r) est repréntative de la phase de l'intensité de l'onde lumineuse au niveau de l'échantillon.
Lorsque, comme dans le cas présent, on met en œuvre trois bandes spectrales centrées respectivement sur des longueurs d'onde dans le bleu, le vert et le rouge, l'information contenue dans les trois images permet d'obtenir une image en couleur de l'échantillon.
On note que l'amplitude complexe normalisée A°p (r) est équivalente à une fonction de transmission de l'onde incidente 12, par l'échantillon 10 à la coordonnée radiale r.
3ième étape : détermination de la fonction de pondération
Au cours de l'étape 300, on constitue, dans le plan de l'échantillon, une fonction de pondération, notée Fp (r), de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon dans les différentes bandes spectrales λ, considérées.
Selon cet exemple, la fonction de pondération Fp°(r), dans le plan de l'échantillon, peut être commune à chaque bande spectrale. Elle est obtenue en combinant les amplitudes complexes normalisées A°p(r) de l'onde lumineuse transmise par l'échantillon, dans le plan P0 de l'échantillon et dans les différentes bandes spectrales λ.
Selon un exemple, la fonction de pondération est obtenue par une somme pondérée de chaque amplitude complexe déterminée lors de l'étape 200, dans le plan Po de l'échantillon, selon l'expression :
Fp° (r) = -L M°p(r)
i
où ki désigne un facteur de pondération, positif, associé à la ième bande spectrale λ,.
Les facteurs de pondération peuvent être égaux les uns aux autres, par exemple égaux à 1/3. D'autres façons de déterminer la fonction de pondération, dans le plan de l'échantillon, sont détaillées par la suite.
4'eme étape : propagation de la fonction de pondération dans le plan du détecteur
L'étape 400 vise à propager, du plan de l'échantillon Po vers le plan du détecteur P, la fonction de pondération Fp (r) déterminée, lors de l'étape précédente, dans le plan de l'échantillon Po.
L'opérateur de propagation étant dépendant de la longueur d'onde, cette propagation est effectuée pour chaque bande spectrale λ, considérée.
Ainsi, pour chaque bande spectrale λ,, F^p(r) = Fp (r) * h i (r, z = d). Lorsque l'opérateur de propagation est un opérateur de Fresnel-Helmholtz tel que précédemment défini,
Figure imgf000018_0001
L'opérateur de propagation dépendant de la longueur d'onde, on détermine autant de fonctions de pondération, dans le plan de détection, que de bandes spectrales considérées.
r' désigne les coordonnées radiales dans le plan de l'échantillon (z = 0),
r désigne les coordonnées radiales dans le plan de reconstruction, c'est-à-dire le plan du détecteur (z = d),
λ, désigne la longueur d'onde centrale de la bande spectrale considérée. 5'eme étape : mise à jour de l'amplitude complexe dans le plan du détecteur
Dans l'étape 500, on utilise la valeur de la fonction de pondération, dans le plan de détection z = d, pour mettre à jour l'estimation de l'amplitude complexe normalisée
Figure imgf000018_0002
de l'onde lumineuse 22,, à laquelle est exposé le photodétecteur 16, dans la bande spectrale λ,.
La formule de mise à jour est :
Figure imgf000018_0003
où :
|F^p (r) | désigne le module de F^p (r) ;
mf (r) désigne le module de l'amplitude complexe initiale normalisée
Figure imgf000018_0004
déterminé, à partir de l'image I,, lors de la première étape 100. Ce terme a une fonction d'attache aux données mesurées ;
<p p désigne une estimation de la phase de l'amplitude complexe de l'onde 22, dans la ieme bande spectrale λ, ;
Afp Çr) désigne l'amplitude complexe de l'onde lumineuse 22i transmise par l'échantillon, dans le plan du photodétecteur 16, cette amplitude complexe constituant la base de l'itération suiva nte.
A la suite de cette éta pe, une nouvelle itération peut commencer, la donnée d'entrée de cette nouvelle itération p + 1 étant Af>p+ 1 r) = A p r), cette nouvelle itération débutant par la rétropropagation de chaque amplitude complexe normalisée Afp+1 r), pour les différentes bandes spectrales considérées, dans le plan Po de l'échantillon, selon l'étape 200. Les étapes 200 à 500 sont réalisées de manière itérative, soit selon un nom bre d'itérations max prédéterminé, soit jusqu'à l'atteinte d'un critère de convergence, ce dernier pouvant être, par exemple, exprimé sous la forme d'un écart entre l'estimation de deux mêmes grandeurs entre deux itérations successives. Lorsque cet écart est inférieur à un seuil ε donné, le critère de convergence est atteint. Par exemple, le processus est arrêté lorsque l'une de ces conditions est atteinte :
Figure imgf000019_0001
Arg (Alp {r) - A°p+1 {r)) < ε ;
Cette liste n'est pas limitative.
A l'issue du procédé, on dispose d'une estimation de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse 22i, transmise par l'échantillon, et à laquelle est exposé le photodétecteur, dans le plan du détecteur P, d'équation z = d et/ou dans le plan de l'échantillon Po, d'équation z = 0, et cela pour chaque bande spectrale considérée. En utilisant les différentes amplitudes complexes reconstruites Apr) dans le plan de l'échantillon, on obtient une représentation précise de ce dernier, dans chacune des bandes spectrales considérées, en particulier en formant des images à partir du module ou de la phase desdites amplitudes complexes.
Comme précédemment évoqué, lorsque les bandes spectrales sont distribuées dans le spectre visible, les images du module ou de la phase peuvent être combinées, par exemple superposées de façon à obtenir des représentations en couleur. II est rappelé que cet algorithme, bien que décrit en relation avec une amplitude complexe normalisée At , s'applique également à l'amplitude complexe non normalisée at .
Apport de la fonction de pondération
Un des points importants de cet algorithme itératif est la constitution de la fonction de pondération F°(r) dans le plan de l'échantillon. En effet, d'une façon générale, la détermination de l'amplitude complexe d'une onde lumineuse à partir d'une image acquise par un photodétecteur est insuffisante, car l'information quant à la phase de l'onde n'est pas enregistrée par le photodétecteur, ce dernier n'étant sensible qu'à l'intensité, correspondant au module de l'amplitude complexe de l'onde.
Ainsi, comme indiqué lors de la description de l'étape 100, l'amplitude complexe f(r) ou l'amplitude complexe normalisée Af(r) déterminées au cours de cette étape ne comportent pas d'information quant à la phase de l'onde lumineuse qu'elles représentent. Ce manque d'information se traduit, lors de la rétropropagation du plan du détecteur P vers le plan de l'échantillon P0, faisant l'objet de l'étape 200, par la formation d'artéfacts désignés par le terme « twin image ».
Les inventeurs ont constaté que ces artéfacts affectent principalement les zones pauvres 31 disposées au voisinage d'éléments diffractants 32, c'est-à-dire les zones situées entre deux éléments diffractants adjacents 32. En outre, ils ont constaté que ces artéfacts sont susceptibles de fluctuer en fonction de la longueur d'onde. Ainsi, en combinant les amplitudes complexes dans différentes longueurs d'onde, rétropropagées dans le plan de l'échantillon, les artéfacts, au niveau des zones pauvres 31, se moyennent statistiquement. Ce lissage statistique augmente alors le rapport signal sur bruit de l'image complexe rétropropagée dans le plan de l'échantillon. D'une façon générale, le procédé revient à :
obtenir une estimation initiale
Figure imgf000020_0001
de l'amplitude complexe de l'onde 22, transmise par l'échantillon, dans le plan du détecteur, et cela dans plusieurs bandes spectrales (étape 100) ;
- rétropropager chacune de ces amplitudes complexes dans le plan de l'échantillon, pour obtenir, à chaque bande spectrale, une amplitude complexe dans le plan de l'échantillon A°p (r) (étape 200)
constituer une fonction de pondération de chaque amplitude complexe Fp (r) dans le plan de l'échantillon (étape 300), de manière à réduire l'influence des interfacts de twin image ;
propager ladite fonction de pondération dans le plan du détecteur, pour au moins une bande spectrale, (étape 400) ;
mettre à jour l'estimation de l'amplitude complexe Afp (r) de l'onde 22, transmise par l'échantillon, dans le plan du détecteur, et cela dans plusieurs bandes spectrales, à l'aide de la fonction de pondération F^p (r) propagée dans le plan du détecteur (étape 500).
La formule de mise à jour de l'étape 500 montre qu'à chaque itération, le module mf (r) (respectivement Ai (r)) de l'amplitude complexe normalisée A p (r) (respectivement de l'amplitude complexe afp (r)), dans le plan de détection, correspond à celui déterminé, au cours de l'étape 100, par chaque image I, formée par le photodétecteur 16 dans la bande spectrale λ,. Autrement dit, au cours des différentes itérations, le module, dans le plan de détection, de l'amplitude complexe af (r) ou de l'amplitude complexe normalisée A p (r) n'évolue pas et correspond à celui dérivé de l'intensité mesurée par le photodétecteur. En revanche, l'algorithme tend à faire évoluer, à chaque mise à jour, l'argument des expressions complexe Afp (r) ou afp (r), et en particulier l'estimation de la phase <pfp (r), cette dernière étant considérée comme égale à la phase de la fonction de pondération F p(r) propagée dans le plan du détecteur, à chaque longueur d'onde λ,. Aussi, selon cet algorithme, chaque itération comprend :
une mise à jour de l'amplitude complexe A°p (r) de chaque onde lumineuse dans le plan de l'échantillon P0 (étape 200) ;
une mise à jour de l'argument de chaque amplitude complexe, Afp (r) et en particulier de sa phase, dans le plan de détection (étape 500).
Elaboration de la fonction de pondération.
Une première façon de constituer la fonction de pondération est d'effectuer une pondération équitable entre les différentes bandes spectrales λ, considérées.
Par exemple, la fonction de pondération peut prendre la forme Fp (r) = —∑i kiA° p(r) , ou k , désigne le facteur de pondération, ou poids, attribué à la ieme bande spectrale λ,, comme précédemment décrit en liaison avec l'étape 300. Chaque facteur de pondération kt est positif et peut avoir la même valeur, par exemple 1/3.
Selon une variante, et cela s'applique notamment dans le cas où l'échantillon analysé est coloré, selon une plage spectrale λ0, les modules des amplitudes complexes de premières ondes lumineuses 22, dont les bandes spectrales λ, sont proches de la plage spectrale λο ont une valeur plus élevée que les modules des amplitudes complexes de deuxièmes ondes lumineuses dont les bandes spectrales sont plus éloignées de la longueur d'onde λο. Dans un tel cas de figure, il est préférable de sous-pondérer les amplitudes complexes des premières ondes lumineuses, et de surpondérer les amplitudes complexes des deuxièmes ondes lumineuses.
Par exemple, si l'échantillon est coloré à l'aide d'un colorant bleu, qui correspond dans notre exemple à la première bande spectrale λι, le facteur de pondération ki est plus faible que les facteurs de pondération k2 et k3 respectivement associés aux bandes spectrales λ2 (verte) et λ3 (rouge).
Selon une autre variante, le module et l'argument de chaque amplitude complexe sont pondérés par des facteurs de pondérations indépendants, de telle sorte que
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000022_0001
ki et k'i étant des facteurs de pondération respectivement associés au module et à l'argument de l'amplitude complexe de l'onde lumineuse 22,, dans le plan de l'échantillon, dans la bande spectrale λ,.
Selon une autre variante, la combinaison des amplitudes complexes A°p(r) prend la forme d'une somme de logarithmes, selon l'expression : ln(Fp°(r)) = ——∑; /q ln[j4°„(r)l.
Selon une autre variante, on détermine, dans le plan de l'échantillon, non pas une fonction de pondération Fp (r), mais une pluralité de fonctions de pondération F p j), chaque fonction étant associée à une bande spectrale λ,.
Chaque fonction de pondération F°p (r), associée à une ieme longueur d'onde, est obtenue en combinant plusieurs amplitudes complexes A°p (r), respectivement associées à différentes bandes spectrales.
Selon un premier exemple, en considérant trois bandes spectrales :
Figure imgf000022_0004
Figure imgf000022_0002
Ainsi, selon ce mode de réalisation, la fonction de pondération prend la forme d'un vecteur Fp (r), de dimension N, N étant le nombre de bandes spectrales considérées, dont chaque terme F?p (r) est une fonction de pondération associée à une bande spectrale λ,. Cette fonction de pondération peut être obtenue par le produit matriciel suivant :
r) = K Â
Où K est une matrice de pondération, chaque terme ky de la matrice de pondération représentant le poids associé à l'amplitude complexe Α°ρ (τ) associée à la bande spectrale λ} pour le calcul de la fonction de pondération associée à la bande spectrale λ,.
La matrice K est une matrice carrée de dimension N x N, N étant le nombre de bandes spectrales considérées.
La fonction de pondération est de préférence normalisée, de telle sorte que chaque terme
Fj 0 p s'exprime sous la forme :
Figure imgf000022_0003
le terme■ ■ étant un terme de normalisation.
Selon un deuxième exemple de ce mode de réalisation, toujours en considérant trois bandes spectrales,
Figure imgf000023_0001
Ainsi, selon ce mode de réalisation, la fonction de pondération prend la forme d'un vecteur Fp r), de dimension 2N, N étant le nombre de bandes spectrales considérées, dont chaque terme représente soit le module soit l'argument d'une fonction de pondération F°p r) associée à une bande spectrale λ,. Cette fonction de pondération peut être obtenue par le produit matriciel suivant :
F°(r-) = K °
Où K est une matrice de pondération, de dimension 2N x2N, chaque terme kg de la matrice de pondération représentant le poids associé soit à l'argument, soit à la phase, de l'amplitude complexe Aj p (r) associée à la bande spectrale λ} .
Selon ce mode de réalisation, chaque coordonnée du vecteur Ap représente soit le module, soit l'argument, d'une amplitude complexe, Aj p (r) dans une bande spectrale j.
De même que dans l'exemple précédent, la fonction de pondération est de préférence normalisée, de telle sorte que chaque terme F°p s'exprime sous la forme :
Figure imgf000023_0002
et
6
Arg (¾ (r)) = 1 Y j arg( p (r))
Quel que soit le cas de figure, les coefficients d'une matrice de pondération peuvent être préalablement déterminés, soit de façon arbitraire, soit en se basant sur des essais expérimentaux.
Par exemple, il est possible d'établir un coefficient de régression linéaire oty entre deux composantes i et j du vecteur Ap (r), en considérant une pluralité de positions axiales (r) dans le plan de l'échantillon, de façon à obtenir une statistique suffisante. Le coefficient ky de la matrice de pondération peut alors être déterminé en fonction de ce coefficient de régression linéaire oty, éventuellement affecté d'un terme tenant compte de la dispersion autour du modèle de régression linéaire. Dans un tel cas de figure, la diagonale de la matrice de pondération peut être constituée de coefficients kû égaux à 1.
Cela permet d'établir une fonction de pondération F°p, associé à la longueur d'onde λ,, prenant en compte la corrélation entre les différents termes du vecteur Ap (r).
Variantes concernant la source de lumière ou le photodétecteur.
Dans les exemples donnés en lien avec les figures 1 et 2, la source de lumière 11, apte à émettre une onde lumineuse 12 dans différentes bandes spectrales, comporte trois sources de lumière élémentaires lli, II2, II3, prenant la forme de diodes électroluminescentes, émettant respectivement dans une première bande spectrale λι, une deuxième bande spectrale λ2 et une troisième bande spectrale λ3, les bandes spectrales étant différentes les unes des autres, et, de préférence, ne se recouvrant pas. La source de lumière 11 peut également comporter une source de lumière blanche llw, placée en amont d'un dispositif de filtrage 19, par exemple une roue à filtres, apte à interposer un filtre de bande passante λ, entre la source de lumière blanche et l'échantillon, comme représenté sur la figure 5, de telle sorte que l'image I, formée par le photodétecteur 16 soit représentative de ladite bande passante λ,. Plusieurs filtres, présentant des bandes passantes différentes les unes des autres, sont alors successivement interposés entre la source de lumière llw et l'échantillon 10.
Selon une variante, le dispositif de filtrage 19 peut également être un filtre tribande, définissant une pluralité de bandes spectrales. Un exemple de filtre convenant à l'application est le filtre Tri-Band 458, 530 & 628 nm - Edmund Optics, définissant des bandes spectrales respectivement centrées sur les longueurs d'onde 457 nm, 530 nm et 628 nm. Cela permet une illumination de l'échantillon simultanément à l'aide de 3 longueurs d'onde.
L'utilisation d'un diffuseur 17, tel que précédemment décrit, entre la source de lumière et le diaphragme 18 est préférable, et cela quel que soit le mode de réalisation.
Le photodétecteur 16 peut, comme précédemment décrit, être un photodétecteur matriciel RGB, ce qui permet d'acquérir successivement ou simultanément différentes des images ΙΙ..Ι,...ΙΝ différentes bandes spectrales λι..λί...λΝ. Dans ce cas, la source de lumière peut être une source de lumière blanche llw, auquel cas les différentes images peuvent être acquises simultanément. Il peut également s'agir d'un photodétecteur 16 monochrome, auquel cas la source de lumière 11 est apte à générer, successivement, une onde lumineuse dans différentes bandes spectrales λι..λί...λΝ. Dans une telle configuration, la source lumineuse comporte soit plusieurs sources de lumière élémentaires lli, II2, II3, soit un dispositif de filtrage 19, comme précédemment décrit. Dans un tel cas de figure, l'échantillon est successivement exposé à des ondes lumineuses incidentes 12Ι..12,...12Ν, N étant le nom bre de bandes spectrales considérées. Une image I, (l≤i≤N), représentative de l'onde lumineuse 22, transmise par l'échantillon est alors acquise à chaque exposition.
Essais réalisés.
Des essais ont été réalisés selon la configuration représentée sur la figure 1 et décrite ci-dessus. L'échantillon est une lame d'anatomopathologie, comportant une coupe de colon coloré par Hematoxyline Eosine Safran. La source de lumière est disposée à une distance Δ égale à 5 cm de l'échantillon, cette distance séparant le diaphragme 18 de l'échantillon 10.
Les figures 6A, 6B et 6C représentent une image d u module |^4° p (r) | de l'amplitude complexe ^ι,ρ ") de l'onde 22i transmise par l'échantillon, dans le plan P0 de l'échantillon, dans la première bande spectrale λι s'étendant entre 450 et 465 nm, ces images éta nt obtenues après un nom bre d'itérations p respectivement égal à 1, 3 et 10.
Les figures 7 A, 7B et 7C représentent une image du module |^2,p(r) | de l'amplitude complexe ^2,p(r) de l'onde 222 transmise par l'échantillon, dans le plan Po de l'échantillon, dans la deuxième bande spectrale λ2 s'étendant entre 520 et 535 nm, ces images étant obtenues après un nom bre d'itérations p respectivement égal à 1, 3 et 10.
Les figures 8A, 8B et 8C représentent une image du module |^3,p(r) | de l'amplitude complexe ° p(r) de l'onde 223 transmise par l'échantillon, dans le plan Po de l'échantillon, dans la troisième ba nde spectrale λ3 s'étendant entre 620 et 630 nm, ces images étant obtenues après un nom bre d'itérations p respectivement égal à 1, 3 et 10. On remarque que le niveau de gris moyen de ces images est plus important que le niveau de gris des images des figures 6A, 6B, 6C, 7A, 7B et 7C. Cela est dû a u fait que l'échantillon à la coloration rouge-violet de l'échantillon.
Les figures 9A, 9B et 9C représentent respectivement la com binaison des images 6A-7A-8A, 6B- 7B-8B; 6C-7C-8C. Ces figures permettent d'avoir une représentation en couleur de l'échantillon, en prenant en compte simultanément les trois bandes spectrales λι, λ2 et λ3. Sur chaque série d'images, on observe une augmentation du contraste en fonction du nombre d'itérations. On peut également constater la formation d'images dont la résolution spatiale est satisfaisante lorsque le nombre d'itérations est inférieur ou égal à 10, ce qui limite le temps de calcul à quelques secondes. Le procédé est donc apte l'observation d'échantillons, sur champ large, et à cadences élevées. Il permet d'obtenir des images selon une ou plusieurs bandes spectrales, le rendant compatible avec les procédés de coloration couramment pratiqués dans le domaine de l'anatomocytopathologie.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'observation d'un échantillon (10), comportant les étapes suivantes :
i) illumination de l'échantillon à l'aide d'une source de lumière (11), produisant une onde lumineuse (12) se propageant selon un axe de propagation (Z),
ii) acquisition, à l'aide d'un photodétecteur (16), d'une pluralité d'images (II... IN) de l'échantillon, formées dans un plan de détection (P), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le photodétecteur (16), chaque image étant représentative d'une onde lumineuse (22i) transmise par l'échantillon sous l'effet de ladite illumination, dite onde lumineuse transmise, chaque image (I,) étant acquise selon une bande spectrale (λ,) différente l'une de l'autre,
le procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend également les étapes suivantes :
iii) détermination, à partir de chaque image acquise (I,) selon une bande spectrale (λ,), d'une amplitude complexe initiale
Figure imgf000027_0001
(r)) de l'onde lumineuse transmise (22,), selon ladite bande spectrale, dans ledit plan de détection (P),
iv) rétropropagation de chaque amplitude complexe (
Figure imgf000027_0002
Afp (r)) éta blie dans le plan de détection (P), selon une bande spectrale (λ,), pour déterminer une amplitude complexe ( l°p (r) de l'onde transmise (22i), selon chaque bande spectrale, dans un plan P0 selon lequel s'étend l'échantillon,
v) à partir d'une pluralité d'amplitudes complexes (A°p (r)) déterminées lors de l'étape iv), à différentes bandes spectrales, calcul d'une fonction de pondération (Fp (r), Fp (r)), dans le plan de l'échantillon (P0), la fonction de pondération étant calculée à partir d'une somme pondérée desdites amplitudes complexes (Ai p (r)), ou de leurs logarithmes (log( 1°p (r)) ou de leurs arguments (arg(A°p (r)), vi) propagation de la fonction de pondération (Fp (r), Fp (r)), dans le plan de détection (P), de façon à obtenir, pour chaque bande spectrale (λ,), une fonction de pondération
(Fp i (r)) dans ledit plan de détection (P), vii) mise à jour de chaque amplitude complexe (Afp (r)) de l'onde lumineuse (22,) transmise, selon chaque bande spectrale (λ,), dans le plan de détection (P), à l'aide de ladite fonction de pondération (F p (r)) obtenue, dans ladite bande spectrale (λ,), au cours de l'étape vi),
viii) répétition des étapes iv à vii jusqu'à l'atteinte d'un critère d'arrêt.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel, lors de l'étape iii), le module (mfp(r)) de l'amplitude complexe (Afp(r)) de l'onde transmise (22,) dans une bande spectrale (λ,) est déterminé en normalisant l'intensité (l,(r)) de l'image (I,) mesurée par le photodétecteur 16, dans ladite bande spectrale, par une intensité de référence (lo(r)) mesurée par ledit photodétecteur 16 en l'absence d'échantillon.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l'étape (iv), la détermination de l'amplitude complexe (A°p (r)) dans un plan de l'échantillon (P0), dans une bande spectrale (λ,), est obtenue en appliquant un opérateur de propagation (h), selon un axe de propagation (Z), à ladite amplitude complexe (Afp(r)), définie dans la même bande spectrale (λ,), dans le plan de détection (P).
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l'étape vi), ladite fonction de pondération (Fp i (r)), dans le plan de détection (P), est propagée en appliquant un opérateur de propagation (h), selon l'axe de propagation Z, à la fonction de pondération (Fp (r), Fp (r)), déterminée, dans le plan de l'échantillon (Po), au cours de l'étape v).
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l'étape vii), le module ( |^p (r) |) de l'amplitude complexe (Afp(r)) de l'onde lumineuse transmise (22,), selon une bande spectrale (λ,), dans le plan de détection (P), est calculé en fonction du module
Figure imgf000028_0001
1(τ)), dans ladite bande spectrale (λ,).
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l'étape vii), l'argument de l'amplitude complexe (Afp (r)) de l'onde lumineuse transmise (22,), selon une bande spectrale (λ,), dans le plan de détection (P), est calculé en fonction de l'argument de la fonction de pondération (F^p (r)) déterminée, dans ledit plan de détection et à ladite bande spectrale (λ,), au cours de l'étape vi).
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel, lors de l'étape v), la fonction de pondération (Fp° (r)) est commune à l'ensemble des bandes spectrales.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel l'étape v) comprend la détermination d'une pluralité de fonctions de pondérations (Fp j (r)), chaque fonction de pondération étant associée à une bande spectrale (λ,).
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant, suite à l'étape viii), l'étape
ix) : formation d'une image représentative du module ou de l'argument de l'amplitude complexe (Afp(r), |j4°p(r) | ) de l'onde (22,), transmise par l'échantillon (10), dans le plan de l'échantillon (Po) ou dans le plan de détection (P), selon au moins une bande spectrale (λ,).
10. Dispositif d'observation d'un échantillon (10) comportant :
une source de lumière (11), adaptée à illuminer ledit échantillon,
un photodétecteur (16), l'échantillon étant disposé entre la source de lumière (11) et le photodétecteur (16), le photodétecteur étant adapté à former une pluralité d'images (ΙΙ.. Ι,...ΙΝ), dans un plan de détection (P), d'une onde lumineuse (22,) transmise par l'échantillon sous l'effet de l'illumination par ladite source de lumière, chaque image étant obtenue selon une bande spectrale (λ,) différente l'une de l'autre, un processeur (20), adapté à traiter ladite pluralité d'images en exécutant des instructions, programmées dans une mémoire (23), mettant en œuvre un procédé selon l'une des revendications 1 à 9.
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