FR3106897A1

FR3106897A1 - Procédé de détection de microorganismes dans un échantillon

Info

Publication number: FR3106897A1
Application number: FR2001039A
Authority: FR
Inventors: Caroline Paulus; Thomas Bordy; Olivier CIONI; Camille Deforceville
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2020-02-03
Filing date: 2020-02-03
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2040-02-03
Also published as: EP4100867A1; FR3106897B1; WO2021156192A1

Abstract

Procédé de caractérisation d'un échantillon, comportant des microorganismes, le procédé comportant une obtention d’images de l’échantillon en différents instants de mesure. A partir des images obtenues on forme des images de comparaison, chaque image de comparaison correspondant à une comparaison d’une image obtenue à un instant de mesure et une image obtenue à un instant de référence. A partir des images de comparaison, on détermine des régions d’intérêt dans chaque image de l’échantillon. Le procédé comporte une extraction d’une même région d’interêt dans plusieurs images, pour former des vignettes. Les vignettes correspondant à une même région d’intérêt sont utilisées en tant que données d’entrée d’un algorithme d’intelligence artificielle supervisé, de façon à déterminer la présence de microorganismes se développant. Figure 8A.

Description

Procédéde détectionde microorganismesdans un échantillon

Le domaine technique de l'invention est la caractérisation de microorganismes, notamment la caractérisation de levures ou de bactéries.

ART ANTERIEUR

L'utilisation de microorganismes tels des levures ou des bactéries, ou leurs dérivés, trouve de nombreuses applications dans de nombreux domaines. Dans le domaine de l'agroalimentaire, par exemple, l'utilisation de levures est répandue dans différents secteurs, tels la boulangerie, la production de vin, la brasserie ou encore la fabrication de produits laitiers. L'application de levures ou de bactéries concerne de nombreux aliments par le biais de probiotiques, ces derniers étant par exemple ajoutés à des céréales ou à des aliments pour animaux. En dehors de l'agroalimentaire, de nombreux domaines industriels peuvent mettre en œuvre des microorganismes. Il s'agit par exemple de l'agriculture ou de l'horticulture, avec le développement de produits phytosanitaires ou de fertilisants plus respectueux de l'environnement, ou encore de la production de biocombustibles obtenus à partir de végétaux. D'autres applications concernent le domaine de la pharmacie, du diagnostic médical

A des fins de contrôle qualité, l'étape de caractérisation de tels microorganismes constitue un maillon essentiel de la chaîne de production. Des contrôles microbiologiques sont fréquemment utilisés, sur des échantillons prélevés dans des milieux de culture, de façon à détecter et dénombrer les microorganismes vivants. La mise en culture sur des boîtes de Pétri est toujours très utilisée, mais comporte certains inconvénients, en particulier la préparation, la durée de l'analyse et l'impossibilité de détecter des microorganismes vivants et non cultivables.

Le document WO2018/215337 décrit un dispositif et un procédé permettant d'effectuer une classification entre les levures vivantes, mortes ou vivantes mais non cultivables. Le document EP3462381 décrit un dispositif et un procédé permettant de détecter des microorganismes dans un échantillon alimentaire.

Les inventeurs proposent une méthode alternative, de façon à effectuer un dénombrement de microorganismes vivants, et se développant, dans un échantillon.

Un premier objet de l'invention est un procédé de caractérisation d'un échantillon, comportant des microorganismes disposés de préférence au contact d'un milieu propice à leur développement, le procédé comportant les étapes suivantes :

illumination de l'échantillon par une source de lumière;
à l’aide d’un capteur d'image, obtention d’images de l’échantillon, chaque image représentant l’échantillon à un instant de mesure;
comparaison d’une image de l’échantillon, à un instant de mesure, avec une image de référence, représentant l’échantillon à un instant de référence, de façon à établir une image de comparaison, l’image de comparaison étant représentative d'une variation de l'échantillon entre l'instant de mesure et l'instant de référence, l’instant de référence étant choisi parmi les instants de mesure;
répétition de l’étape c) pour différents instants de mesure, de façon à obtenir différentes images de comparaison, chaque image de comparaison pouvant être associée à un instant de mesure;
à partir des images de comparaison, définition d'au moins une région d'intérêt chaque région d'intérêt correspondant à une partie d'au moins une image de comparaison dans laquelle une variation de l'échantillon est détectée ;
sur plusieurs images de l’échantillon, résultant de l’étape b), extraction de vignettes ( ), chaque vignette comportant une région d'intérêt ( , définie au cours de l'étape e), de façon à former au moins une pile de vignettes ( ), chaque pile de vignettes correspondant à une même région d'intérêt ( extraite de plusieurs images ( ) de l’échantillon ;
utilisation de chaque pile de vignettes formées lors de l'étape f) en tant que données d'entrée d'un algorithme d'intelligence artificielle supervisé ;
à partir de l'algorithme d'intelligence artificielle supervisé, confirmation ou non confirmation de la présence de microorganismes se développant dans chaque région d'intérêt définie dans l'étape e).

L’étape f) peut comporter une formation d’autant de piles de vignettes que de régions d’intérêt distinctes définies lors de l’étape e).

Au cours de l’étape f), chaque pile de vignettes est associée à une région d’intérêt.

Par vignette, il est entendu une portion d’image, de taille inférieure à la taille de l’image. Chaque image comporte des pixels. Chaque vignette peut comporter un nombre de pixels au moins 10 fois ou au moins 100 fois inférieur au nombre de pixels de l’image.

L'algorithme d'intelligence artificielle supervisé peut être un réseau de neurones. Le réseau de neurones peut être un réseau de neurones convolutifs.

Selon un mode de réalisation, chaque image étant définie selon des pixels, l'étape e) comporte :

e-i) pour chaque pixel, sélection d’une image de comparaison dont la valeur, audit pixel, est soit minimale, soit maximale ;
e-ii) formation d'une image de variation, dont la valeur, en chaque pixel, est déterminée par l'image de comparaison sélectionnée lors de la sous-étape e-i) ;
e-iii) définition d’au moins une d'intérêt à partir de l'image de variation.

L’image de variation peut ainsi être formée par une combinaison d’images de comparaison. Chaque pixel de l’image de variation est établi à partir de la valeur, audit pixel, d’une image de comparaison.

L’étape e) peut comporter une détermination de coordonnées d’intérêt, dans l’image de variation, chaque coordonnée d’intérêt correspondant potentiellement à un microorganisme. Chaque région d’intérêt est alors définie autour de chaque coordonnée d’intérêt. La forme et la dimension de chaque région d’intérêt sont de préférence prédéterminés.

Le procédé peut comporter, suite à la sous-étape e-ii):

segmentation de l'image de variation, entre une première partie, et une deuxième partie, complémentaire de la première partie, la segmentation étant effectuée par rapport à un seuil d'intensité ;
à partir de l'image de variation segmentée, détermination de coordonnées d’intérêt correspondant potentiellement à un microorganisme ;

de telle sorte que l'étape e-iii) comporte une définition d’au moins une région d'intérêt autour de chaque coordonnée d’intérêt déterminée au cours de la sous-étape e-ii).

Selon une possibilité, lors de l'étape f), chaque vignette comporte une seule région d'intérêt définie au cours de l'étape e).

L’échantillon peut être disposé entre la source de lumière et le capteur d’image.

Selon un mode de réalisation, aucune optique de formation d'image n'est disposé entre l'échantillon et le capteur d'image.

Selon un mode de réalisation, un système optique s'étend entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique définissant un plan objet et un plan image, le procédé étant tel que:

le capteur d'image définit un plan de détection, le plan de détection étant décalé par rapport au plan image ;
et/ou l'échantillon définit un plan d'échantillon, le plan d'échantillon étant décalé par rapport au plan objet.

Selon un mode de réalisation, l’étape b) comporte, à chaque instant de mesure:

b-i) acquisition d’une image par le capteur d’image à l’instant de mesure;
b-ii) application d’un opérateur de reconstruction holographique à l’image acquise de façon à obtenir une image complexe dans un plan de reconstruction;
b-iii) obtention de l’image de l’échantillon, à l’instant de mesure, à partir de l’image complexe résultant de la sous-étape b-ii).

L’image de l’échantillon peut par exemple être obtenue à partir du module et/ou de la phase et/ou de la partie réelle et/ou de la partie imaginaire de l’image complexe obtenue au cours de la sous-étape b-ii).

De préférence, lors de la sous-étape b-ii), le plan de reconstruction est un plan selon lequel s’étend l’échantillon. De préférence, le plan de reconstruction est parallèle à un plan de détection selon lequel s’étend le capteur d’image.

Selon une possibilité, le procédé peut comporter, suite à l’étape h), une étape i) de comptage de régions d’intérêt considérées comme comportant des microorganismes se développant dans l‘échantillon.

Préalablement à l’étape h), le procédé peut comporter un apprentissage de l'algorithme d'intelligence artificielle supervisé, l'apprentissage étant réalisé en utilisant des échantillons de calibration comportant des microorganismes se développant dont la localisation est connue.

Selon un mode de réalisation préféré, lors de l'étape b), les instants de mesure sont compris entre un instant initial et un instant final. Lors de l’étape c), l'instant de référence peut correspondre à l'instant initial ou à l'instant final.

Selon un mode de réalisation, lors de l'étape c), l'instant de référence est un instant antérieur ou postérieur à chaque instant de mesure. Il peut par exemple s’agir de l’instant immédiatement antérieur ou de l’instant immédiatement postérieur à chaque instant de mesure.

Un deuxième objet de l’invention est un dispositif de caractérisation d'un échantillon, l'échantillon comportant des microorganismes, le dispositif comportant :

une source de lumière ;
un capteur d'image ;
un support configuré pour maintenir l'échantillon ;
un processeur, programmé pour mettre en œuvre les étapes c) à h) du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.

Le dispositif peut comporter des caractéristiques décrites en lien avec le premier objet de l’invention.

L'invention sera mieux comprise à la lecture de l'exposé des exemples de réalisation présentés, dans la suite de la description, en lien avec les figures listées ci-dessous.

FIGURES

La figure 1 est un exemple de dispositif permettant une mise en œuvre de l'invention.

La figure 2 schématise les principales étapes d'un procédé mis en œuvre par l'invention.

Les figures 3A à 3L sont des images d'un échantillon obtenues à différents instants successifs, formant une série d'images. Il s'agit d'images obtenues en mettant en œuvre un dispositif tel que représenté sur la figure 1.

La figure 4A montre un exemple de région d'intérêt comportant des microorganismes se développant dans l'échantillon.

La figure 4B montre des profils d'intensité de plusieurs images d'une même série d'images de l’échantillon, dans la région d'intérêt représentée sur la figure 4A.

La figure 4C montre des profils d'intensité de plusieurs images de comparaison, résultant de comparaisons d'images de la série d'images décrite en lien avec la figure 4B.

La figure 4D montre un profil horizontal d'une image de variation établie pour la série d'images décrite en lien avec la figure 4B.

Sur les figures 4B à 4D, chaque profil est déterminé le long d’une ligne en pointillés tracés sur la figure 4A.

La figure 5A est une image de variation correspondant à la série d'images représentée sur les figures 3A à 3L.

La figure 5B est l'image de variation représentée sur la figure 5A après détection des régions d’intérêt.

La figure 6 est une région d’intérêt définie à partir de l’image 5B.

Les figures 7A à 7H sont des vignettes extraites des images d'une même série d'images, chaque vignette correspondant à la région d’intérêt représentée sur la figure 6.

Les figures 8A à 8C sont des exemples de piles de vignettes formant les données d'entrée d'un algorithme de type réseau de neurones convolutifs.

La figure 9 schématise une architecture d'un réseau de neurones convolutifs.

Les figures 10A à 10F montrent une pile de vignettes représentatives du développement de microorganismes.

Les figures 10G à 10L montrent une pile de vignettes représentatives d'un déplacement dans l'échantillon.

La figure 11 est un graphe montrant l'évolution de la performance du procédé en fonction de l'étendue temporelle de la série d'images.

Les figures 12A à 12C sont une comparaison de détection de microorganismes respectivement selon une méthode de référence, selon un procédé basé sur une analyse de la morphologie de l'image de variation, et selon un procédé selon l'invention.

Les figures 12D à 12F sont une comparaison de détection de microorganismes respectivement selon une méthode de référence, selon un procédé basé sur une analyse de la morphologie de l'image de variation, et selon un procédé selon l'invention.

Les figures 12G à 12I sont une comparaison de détection de microorganismes respectivement selon une méthode de référence, selon un procédé basé sur une analyse de la morphologie de l'image de variation, et selon un procédé selon l'invention.

La figure 13A est un graphe montrant, pour différents échantillons, un nombre de microorganismes dénombrés respectivement avec un procédé basé sur une analyse de la morphologie de l'image de variation (axe des ordonnées) et un procédé de référence (axe des abscisses).

La figure 13B est un graphe montrant, pour différents échantillons, un nombre de microorganismes dénombrés respectivement avec un procédé selon l'invention (axe des ordonnées) et un procédé de référence (axe des abscisses).

La figure 14 est un autre exemple de dispositif permettant une mise en œuvre de l'invention.

EXPOSE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS

La figure 1 représente un exemple de dispositif selon l’invention. Une source de lumière 11 est apte à émettre une onde lumineuse 12, dite onde lumineuse incidente, se propageant en direction d’un échantillon 10, selon un axe de propagation Z. L’onde lumineuse est émise selon une bande spectrale d'illumination Δλ.

L’échantillon 10 est un échantillon que l’on souhaite caractériser. Il comprend notamment des microorganismes . L’échantillon 10 peut comporter des nutriments permettant le développement des microorganismes. L’échantillon 10 peut par exemple comporter des aliments broyés, ces derniers étant destinés à l’alimentation, par exemple à la nutrition animale. Il s’agit par exemple de matière grasse, de viande, et des fibres végétales, en particulier sous forme de farine. Le mélange peut également comporter des compléments alimentaires, par exemple des vitamines. Le mélange comporte également des microorganismes, en particulier des bactéries ou levures, utilisées en tant que complément alimentaire, sous forme de probiotiques.

Un objectif de l'invention est d'évaluer une quantité de microorganismes se développant dans l'échantillon. Le terme quantité désigne un nombre ou une concentration. Par microorganisme, on entend notamment une levure, une bactérie, une spore, un champignon ou une cellule, qu'il s'agisse d'une cellule eucaryote ou procaryote, ou une microalgue. L’échantillon 10 peut être solide. Il peut par exemple prendre la forme d’une poudre, obtenue par broyage d’aliments comportant des microorganismes. Selon un mode de réalisation, l'échantillon peut comporter milieu de culture, propice au développement de microorganismes. Il peut s'agir d'un milieu de culture liquide ou prenant la forme d'une gélose.

L’échantillon 10 est, dans cet exemple, contenu dans une chambre 15. La chambre 15 peut avoir une épaisseur e, selon l’axe de propagation, variant typiquement entre 10 µm et 5 mm, et est de préférence comprise entre 20 µm et 500 µm. L’échantillon est maintenu sur un support 10s à une distance d d'un capteur d'image 16. La concentration de microorganismes peut varier entre 500 par microlitre et 5000 par microlitre.

La distance D entre la source de lumière 11 et la chambre 15 est de préférence supérieure à 1 cm. Elle est de préférence comprise entre 2 et 30 cm. Avantageusement, la source de lumière, vue par l’échantillon, est considérée comme ponctuelle. Cela signifie que son diamètre (ou sa diagonale) est préférentiellement inférieur au dixième, mieux au centième de la distance entre la chambre fluidique 15 et la source de lumière. Sur la figure 1, la source de lumière est une diode électroluminescente. Elle est généralement associée à diaphragme 18, ou filtre spatial. L’ouverture du diaphragme est typiquement comprise entre 5 µm et 1 mm, de préférence entre 50 µm et 500 µm. Dans cet exemple, le diaphragme est fourni par Thorlabs sous la référence P150S et son diamètre est de 150 µm. Le diaphragme peut être remplacé par une fibre optique, dont une première extrémité est placée face à la source de lumière 11 et dont une deuxième extrémité est placée en regard de l’échantillon 10. Le dispositif représenté sur la figure 1 comporte également un diffuseur 17, disposé entre la source de lumière 11 et le diaphragme 18. L’usage d’un tel diffuseur permet de s’affranchir de contraintes de centrage de la source de lumière 11 par rapport à l’ouverture du diaphragme 18. La fonction d’un tel diffuseur est de répartir le faisceau lumineux, produit par une source de lumière élémentaire 11 selon un cône d’angle α. De préférence, l’angle de diffusion α varie entre 10° et 80°. Alternativement, la source de lumière peut être une source laser, telle une diode laser. Dans ce cas, il n'est pas utile de lui associer un filtre spatial ou un diffuseur.

De préférence, la bande spectrale d’émission Δλ de l’onde lumineuse incidente 12 a une largeur inférieure à 100 nm. Par largeur de bande spectrale, on entend une largeur à mi-hauteur de ladite bande spectrale.

L’échantillon 10 est disposé entre la source de lumière 11 et le capteur d’image 16 précédemment évoqué. Ce dernier s’étend de préférence parallèlement, ou sensiblement parallèlement au plan selon lequel s’étend l’échantillon. Le terme sensiblement parallèlement signifie que les deux éléments peuvent ne pas être rigoureusement parallèles, une tolérance angulaire de quelques degrés, inférieure à 20° ou 10° étant admise. Dans cet exemple, l'échantillon s'étend selon un plan XY, perpendiculaire à l'axe de propagation Z.

Le capteur d’image 16 est apte à former une image de l'échantillon 10 selon un plan de détection . Dans l’exemple représenté, il s’agit d’un capteur d’image comportant une matrice de pixels, de type CCD ou un CMOS. Le plan de détection s’étend de préférence perpendiculairement à l’axe de propagation Z de l’onde lumineuse incidente 12. La distance entre l’échantillon 10 et la matrice de pixels du capteur d’image 16 est préférentiellement comprise entre 50 µm et 2 cm, de préférence comprise entre 100 µm et 2 mm.

On remarque, dans ce mode de réalisation, l’absence d’optique de grossissement ou de formation d'image entre le capteur d’image 16 et l’échantillon 10. Cela n’empêche pas la présence éventuelle de microlentilles de focalisation au niveau de chaque pixel du capteur d’image 16, ces dernières n’ayant pas de fonction de grandissement de l’image acquise par le capteur d’image, leur fonction étant d'optimiser l'efficacité de détection.

Sous l’effet de l’onde lumineuse incidente 12, les microorganismes présents dans l'échantillon peuvent engendrer une onde diffractée 13, susceptible de produire, au niveau du plan de détection , des interférences, en particulier avec une partie de l’onde lumineuse incidente 12' transmise par l’échantillon. Par ailleurs, l’échantillon peut absorber une partie de l’onde lumineuse incidente 12. Ainsi, l’onde lumineuse 14, transmise par l’échantillon, et à laquelle est exposé le capteur d’image 16, désignée par le terme "onde d'exposition", peut comprendre:

une composante 13 résultant de la diffraction de l’onde lumineuse incidente 12 par les microorganismes présents dans l'échantillon ;
une composante 12' résultant de la transmission de l’onde lumineuse incidente 12 par l’échantillon, une partie de cette dernière pouvant être absorbée dans l'échantillon.

Ces composantes forment des interférences dans le plan de détection. Aussi, l'image acquise par le capteur d'image comporte des figures d'interférences (ou figures de diffraction). Cette image forme un hologramme, qui est une signature du contenu de l'échantillon, et de son évolution dans le temps.

Un processeur 20, par exemple un microprocesseur, est apte à traiter chaque image acquise par le capteur d’image 16. En particulier, le processeur est un microprocesseur relié à une mémoire programmable 22 dans laquelle est stockée une séquence d’instructions pour effectuer les opérations de traitement d’images et de calculs décrites dans cette description. Le processeur peut être couplé à un écran 24 permettant l’affichage d’images acquises par le capteur d’image 16 ou calculées par le processeur 20.

Les inventeurs se sont basés sur le fait que sous l'effet du développement des microorganismes dans l'échantillon, formant des colonies, l'hologramme formé sur le capteur d'image évolue. Cette évolution peut être interprétable à l'œil nu ou au moyen d'algorithmes de traitement d'images simples lorsque l'échantillon est peu dense. Cependant, lorsque le nombre de microorganismes est important, l'interprétation des images est plus difficile et peut engendrer des erreurs sur le comptage des microorganismes ou sur leur localisation.

Les inventeurs ont conçu un procédé permettant de détecter et de dénombrer des microorganismes se développant dans un échantillon. Par se développer, on entend se multiplier, de façon à former des amas ou des colonies. Le procédé est basé sur l'observation du développement de ces amas ou de ces colonies au cours du temps.

Les principales étapes du procédé sont décrites en lien avec la figure 2.

Etape 100: Disposition de l'échantillon sur le support.

L'échantillon est disposé sur le support 10s, dans le champ d'observation du capteur d'image. Il est ensuite illuminé par la source de lumière 11.

Etape 110: Obtention d’une série d’images de l’échantillon

Au cours de cette étape, des images sont acquises successivement en différents instants de mesure , s'étendant selon une plage temporelle d'acquisition. L'indice est un entier strictement positif désignant le rang de chaque image dans la série d'images. La plage temporelle d'acquisition peut être comprise entre 1h et 20h, voire davantage. Les images peuvent être acquises selon une fréquence d'acquisition déterminée, par exemple toutes les heures.

Une image acquise par le capteur d’image 16, également appelée hologramme, ne permet pas d’obtenir une représentation suffisamment précise de l’échantillon observé. Cela est dû à l’absence d’optique de grossissement entre l’échantillon et le capteur d’image. On peut appliquer, à chaque image acquise par le capteur d’image, un opérateur de propagation holographique , de façon à calculer une grandeur représentative de l’onde lumineuse d'exposition 14. Il est alors possible de reconstruire une expression complexe de l’onde lumineuse 14 en tout point de coordonnées de l’espace, et en particulier dans un plan de reconstruction situé à une distance | | du capteur d’image 16, dite distance de reconstruction, ce plan de reconstruction étant de préférence le plan selon lequel s'étend l’échantillon, avec :

* désignant l'opérateur produit de convolution.

L’opérateur de propagation a pour fonction de décrire la propagation de la lumière entre le capteur d’image 16 et un point de coordonnées situé à une distance | | du capteur d'image. Il est alors possible de déterminer le module et/ou la phase ( ) l’onde lumineuse 14, en un point de l’espace de coordonnées ( ), avec:

;

.

Les opérateurs et désignent respectivement le module et l’argument.

L’opérateur de propagation est par exemple la fonction de Fresnel-Helmholtz, telle que:

)

avec ²=-1.

Autrement dit, l’expression complexe de l’onde lumineuse 14, en tout point de coordonnées de l’espace, est telle que:

Dans la suite de cette description, les coordonnées désignent une position radiale dans un plan radial XY perpendiculaire à l'axe de propagation Z. La coordonnée désigne une coordonnée selon l'axe de propagation Z.

L’expression complexe est une grandeur complexe dont l’argument et le module sont respectivement représentatifs de la phase et de l’intensité de l’onde lumineuse 14 d'exposition détectée par le capteur d’image 16 à l’instant de mesure . Le produit de convolution de l’image par l’opérateur de propagation permet d’obtenir une image complexe représentant une distribution spatiale de l’expression complexe de dans le plan de reconstruction considéré. De préférence, ce dernier est le plan selon lequel s’étend l’échantillon

A partir de l’image complexe , on peut obtenir une image représentative de l’échantillon, en considérant par exemple le module, et/ou la phase, et/ou la partie réelle, et/ou la partie imaginaire de l’image complexe . L'ensemble des images successivement obtenues forme une série d'images de l’échantillon, chaque image obtenue étant représentative de l’échantillon à un instant de mesure . Chaque image est associée à un instant de mesure , qui correspond à l’instant d’acquisition de l’image .Chaque image représente l’échantillon à l’instant .

L’obtention d’une image complexe peut s’accompagner d’un bruit de reconstruction important, usuellement désigné par le terme «twin image». Des algorithmes itératifs ont été décrits, permettant d’obtenir, par reconstruction holographique, une image complexe tout en minimisant le bruit de reconstruction. De tels algorithmes de reconstruction holographique sont par exemple décrits dans le document WO2017162985 (étapes 100 à 170, schématisées dans la figure 2A de WO2017162985) ou dans le document WO2016189257 (étapes 100 à 500, schématisées sur la figure 4 de WO2016189257).

Les figures 3A à 3L représentent des images obtenues par un dispositif tel que représenté sur la figure 1, durant une période temporelle d'acquisition de 11 heures, à partir d'un instant initial (fig. 3A). Ces images ont été obtenues par reconstruction holographique à partir d’images acquises toutes les heures. Chaque image acquise a fait l’objet d’une reconstruction holographique, telle que décrite dans WO2017162985, de façon à obtenir une image complexe reconstruite dans le plan de l’échantillon. On a ainsi obtenu des images , respectivement représentatives de l’échantillon à chaque instant de mesure , en déterminant le module de l’image complexe. Sur ces figures, l'échantillon comporte des granulés de nutrition animale, broyés, comprenant des levuresSaccharomyces cerevisiaedans un milieu de culture de type YPD (Yeast Peptone Dextrose). Les paramètres expérimentaux étaient les suivants :

source de lumière : LED à cadrans RGB Cree MC-E Color;
capteur d'image : capteur CMOS monochrome IDS UI-1492LE-M – 3840 x 2748 pixels;
distance capteur d'image – échantillon : 1 mm;
distance source de lumière – échantillon : 5 cm.

Sur ces images, les microorganismes prennent une forme de taches s'assombrissant peu à peu. Ainsi, le développement de microorganismes se traduit, sur les images de la série d'images, d'un assombrissement progressif.

Sur chacune des figures 3A à 3L, on a matérialisé, par un cadre noir, une région d'intérêt de l'image correspondant à une même colonie de microorganismes. On observe que la colonie s'assombrit sous l'effet de la multiplication des microorganismes. L'assombrissement est attribué à la diffusion croissante et à l’atténuation de la lumière par les microorganismes. Cette particularité est utilisée dans l'étape 140.

Etape 1 2 0 : comparaison d'images.

L'objectif de cette étape est d'établir des images de comparaison, chaque image de comparaison correspondant à une comparaison entre deux images de la série d'images de l’échantillon. La comparaison peut prendre la forme d'une soustraction ou d'un ratio. Dans cet exemple, on effectue une comparaison de chaque image avec une image de référence , correspondant à un instant de référence . L'image de référence peut par exemple être l'image initiale représentant l’échantillon au début de la plage temporelle d'acquisition: . Ainsi, pour chaque image de l’échantillon , on calcule une image de comparaison telle que :

L’instant de référence peut également être l’instant final, auquel cas , où correspond au rang l’instant final.

Selon une variante, l'image de référence est l'image de l’échantillon à l’instant de mesure précédent l’instant correspondant à l'image : On obtient alors :

On comprend qu'au cours de l’étape 120, pour chaque image de l’échantillon obtenue lors de l'étape 110, on calcule une image de comparaison . Chaque image de comparaison est associée à un instant de mesure . Chaque image de comparaison représente une variation de l’échantillon entre l’instant de référence et l’instant de mesure .

Dans cet exemple, la comparaison prend la forme d'une soustraction. En variante, la comparaison peut prendre la forme d'un ratio

Etape 130: Formation d'une image de variation

A partir de chaque image de comparaison , on détermine une image de variation , cette dernière étant représentative d'une variation de l'échantillon durant la plage temporelle d'acquisition.

Chaque image de l’échantillon est définie selon des pixels de coordonnées , dans le plan de détection formé par le capteur d'image. Il en est de même de chaque image de comparaison . A partir des différentes images de comparaison résultant de l'étape 120, on calcule une image de variation . La valeur de l'image de variation en chaque pixel correspond à la valeur de l'image de comparaison traduisant un assombrissement maximal parmi les différentes images de comparaison.

Pour constituer l'image de variation, on sélectionne, pour chaque pixel , l'image de comparaison dont la valeur , pour le pixel considéré, traduit une différence maximale de deux images et sous l'effet du développement des microorganismes.

Lorsque, pour calculer chaque image de comparaison, l'image de référence est associée à un instant de référence antérieur à l’instant de mesure associé à l'image , et que l'image de référence est soustraite de chaque image de l’échantillon , ce qui correspond aux expressions (1) et (2), pour chaque pixel :

Lorsque, pour calculer chaque image de comparaison, l'image de référence représente l’échantillon à un instant de référence postérieur à l’instant de mesure de l'image , et que l'image de référence est soustraite de chaque image , pour chaque pixel , le développement des microorganismes entraîne un éclaircissement de l'image de référence. Dans ce cas,

D'une façon générale, l'image de variation est établie en utilisant, pour chaque pixel , l'image de comparaison dont la valeur correspond à un extremum, pour le pixel, parmi l'ensemble des images de comparaison . L'extremum traduit une augmentation de la diffusion sous l'effet du développement des microorganismes. En fonction de la façon selon laquelle l'image de comparaison est calculée, l’extremum est soit d'un maximum, soit d'un minimum.

Ainsi, l'image de variation peut donc être formée à partir de différentes images de comparaison .

Dans la suite de la description, on considère que l'image de référence est l'image initiale de la série d'images. Ainsi, l'image de variation est telle que :

On remarque que l'image de variation est définie pour l'ensemble de la série d'images résultant de l'étape 110.

La figure 4A montre une région d'intérêt d'une des images représentées sur les figures 3A à 3L, centrée sur des microorganismes se développant. Par région d'intérêt, on entend une partie d'une image de l’échantillon comportant un microorganisme ou une colonie de microorganismes. Des profils d'intensité ont été réalisés sur la même région d'intérêt, en considérant différentes images successivement obtenues, selon la ligne représentée en pointillés sur la figure 4A. Les profils correspondent à des images obtenues respectivement 0 heure (cf. figure 3A – référence ), 3 heures (cf. figure 3D - – référence ), 7 heures (cf. figure 3H – référence ) et 9 heures (cf. figure 3J - – référence ) après l'instant initial . L’instant initial correspond à la figure 3A. Les profils sont représentés sur la figure 4B. On observe que la présence de chaque microorganisme se traduit par des niveaux de gris plus faibles.

Des images de comparaison ont été formées en soustrayant l'image initiale (figure 3A) de façon à établir des images de comparaison , , , telles que définies selon l'expression (1). Les profils de chaque image de comparaison sont représentés sur la figure 4C. Le profil de l’image de comparaison est égal à 0. A partir des images de comparaison, on a formé une image de variation selon l'expression (5). Le profil de l'image de variation est représenté sur la figure 4D. Dans cet exemple, on constate que l'image de variation est essentiellement formée à partir des valeurs des pixels des images de comparaison et .

La figure 5A montre l'image de variation décrite dans le paragraphe précédent. On observe des traces sombres, dont certaines correspondent à des colonies de microorganismes se développant.

Cependant, sur l'image de variation, certaines traces sont formées non pas sous l'effet du développement des microorganismes dans l'échantillon, mais sous l'effet d'un déplacement de microorganismes ou autres particules à l'intérieur de l'échantillon (notamment lorsque ce dernier prend la forme d’une poudre), ou d'un déplacement d'une particule externe à l'échantillon, par exemple une poussière entre l'échantillon et le capteur d'image.

L'objectif des étapes suivantes est de déterminer, à partir des traces détectées sur l'image de variation , celles qui correspondent à un microorganisme se développant.

Etape 1 4 0: Détermination et localisation de régions d'intérêt à partir de l'image de variation

L'objectif de cette étape est de détecter des régions d'intérêt contenant respectivement au moins une trace détectée sur l'image de variation.

Dans cet exemple, l'étape 140 comporte une binarisation de l'image de variation , sur la base d'un seuil prédéterminé. La figure 5B montre l'image de variation binarisée. Sur cette image, chaque tache sombre de l'image de variation, susceptible de correspondre à un microorganisme ou à une colonie de microorganismes, apparaît sous la forme d'une trace claire, dont on peut déterminer des coordonnées, par exemple les coordonnées du centroïde. Ainsi, à partir de l'image de variation, on détermine des coordonnées d'intérêt . Chaque coordonnée d'intérêt peut correspondre à un microorganisme (ou à une colonie de microorganismes), ou à un déplacement d’une particule dans l’échantillon 10.

Autour de chaque coordonnée d'intérêt , on définit une région d'intérêt . La dimension de chaque région d'intérêt est de préférence prédéfinie. Dans cet exemple, chaque région d'intérêt est un carré de 65 pixels de côté. La définition des dimensions des régions d'intérêt peut être effectuée préalablement, par exemple sur la base d'essais expérimentaux. Chaque région d'intérêt peut être définie de façon que son centre corresponde respectivement à chaque coordonnée d'intérêt .

La figure 6 représente un exemple de région d'intérêt définie autour d'une coordonnée d'intérêt, cette dernière étant le centroïde d'une trace blanche de l'image de variation après binarisation, la trace étant entourée par un cercle en pointillés sur la figure 5B.

Etape 150: Extraction de vignettes.

Au cours de cette étape, on définit une vignette à partir de chaque image de l’échantillon , résultant de l’étape 110. Chaque vignette correspond respectivement à une partie de l'image dans chaque région d'intérêt définie au cours de l'étape 140. Ainsi, pour chaque région d'intérêt définie au cours de l'étape 140, on obtient une pile de vignettes , chaque vignette correspondant à une extraction de la région d'intérêt dans l’image de l’échantillon . Les vignettes formées à partir de différentes images , dans une même région d'intérêt , forment une pile de vignettes .

correspond aux nombres d'images de l’échantillon prises en compte.

Les figures 7A à 7H sont des exemples de vignettes associées à une même région d'intérêt respectivement extraites de différentes images. On observe une variation de l’aspect des vignettes entre la figure 7A et la figure 7H. Ainsi, chaque pile de vignettes . est représentative d’une variation locale de l’échantillon, dans une même région d’intérêt .

Etape 160: Classification de chaque pile de vignettes .

Au cours de cette étape, chaque pile de vignettes est utilisée en tant que donnée d'entrée IN d'un réseau de neurones convolutifs CNN, dont la couche de sortie OUT permet de déterminer si la pile de vignettes correspond au développement d'un microorganisme ou non.

Les figures 8A, 8B et 8C sont des exemples de piles de vignettes.

La figure 9 schématise un exemple de différentes couches d'un réseau de neurones convolutifs. Un tel réseau est connu de l'homme du métier. Il est par exemple décrit dans Karpathy "Large-scale video classification with convolutional neural networks", 2014 IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. De façon connue en soi, le réseau de neurones convolutif comporte :

une couche d'entrée IN : cette couche est formée par une pile de vignettes ;
plusieurs couches de convolution CONV₁…CONV_k. Chaque couche de convolution compote un premier niveau, formé d'images obtenues par convolution d'au moins une image de la couche précédente par un filtre. Dans cet exemple, la taille du filtre est 3 x 3. Les paramètres de chaque filtre sont établis lors d'une phase d'apprentissage décrite par la suite. Les images formant le premier niveau font ensuite l'objet de transformations, pouvant comprendre :
un "pooling", il s'agit de remplacer les valeurs d'un groupe de pixels par une seule valeur, par exemple le moyenne, ou la valeur maximale, ou la valeur minimale du groupe considéré. Dans cet exemple, on applique un "max pooling", ce qui correspond au remplacement des valeurs de groupes de pixels de 2 par 2 par la valeur maximale dans le groupe ;
une rectification linéaire, usuellement désigné "RELU", permettant notamment de supprimer certaines valeurs des images du premier niveau. On peut par exemple supprimer les valeurs négatives en les remplaçant par la valeur 0.

Dans cet exemple, on a utilisé trois couches CONV_ksuccessives, avec 1 ≤ k ≤ 3.

A l'issue des trois couches de convolution, on dispose d'une couche VECT, formée d'un vecteur de dimension (1,9216). Chaque composante du vecteur VECT est une caractéristique (ou «feature») de la pile de vignettes formant l’entrée IN du réseau. Le vecteur VECT est utilisé en tant que vecteur d'entrée d'un réseau de neurones NN de type «fully connected» (directement connecté), terme usuel pour l’homme du métier. Chacune des composantes du vecteur VECT forme un nœud alimentant le réseau de neurones NN. Dans cet exemple, le réseau de neurones NN comporte une couche de sortie OUT directement connectée au vecteur VECT. La couche de sortie comporte des nœuds . Chaque nœud correspond à une classe. De façon connue par l'homme du métier, on détermine une valeur de chaque nœud de la couche de sortie en appliquant une fonction d'activation à une combinaison linéaire des valeurs des nœuds de la couche d’entrée. Dans cet exemple, la couche de sortie OUT comporte deux classes:

la pile de vignettes correspond à un microorganisme se développant;
la pile de vignettes ne correspond pas à un microorganisme se développant.

Ainsi, au niveau de la couche de sortie la valeur de chaque nœud est telle que :

où

est la valeur de chaque nœud de la couche précédente (termes du vecteur VECT);
est un biais associé à chaque nœud de la couche précédente
est une fonction d'activation associé au nœud de rang de la couche considérée;
est un terme de pondération pour le noeud de rang de la couche précédente et le nœud de rang de couche considérée.

La forme de chaque fonction d'activationf _n est déterminée par l'homme du métier. Il peut par exemple s'agir d'une fonction d'activationf _n est une fonction de type tangente hyperbolique ou sigmoïde.

La couche OUT comporte des valeurs permettant de confirmer ou d'infirmer que la présence de microorganismes se développant dans la région d'intérêt associée à la pile de vignettes .

Le réseau peut comporter une couche finale END, usuellement désignée par le terme «Softmax», comportant autant de composante que de classes, chaque composante représentant une probabilité d’appartenance à chaque classe.

Etape 170: comptage

Au cours de cette étape, on dénombre les microorganismes se développant dans l'échantillon, ces derniers étant confirmés au cours de l'étape 160.

Le réseau de neurones convolutifs a préalablement fait l'objet d'un apprentissage (étape 90), de façon à déterminer les paramètres des filtres de convolution ainsi que les paramètres liés à chaque nœud, c'est-à-dire les termes , , et définis en lien avec l'expression (7).

L'apprentissage est effectué en utilisant des séries d'images d’échantillons connus. Les inventeurs ont effectué un apprentissage en utilisant 7000 piles de vignettes dont la classe était connue. 80% des images ont été utilisées pour effectuer l'apprentissage proprement dit, tandis que les 20% restantes ont été utilisées pour valider l'algorithme.

Les figures 10A à 10F correspondent à une pile de vignettes correspondant au développement d'un microorganisme. Les figures 10G à 10L correspondent à une pile de vignettes correspondant à un mouvement dans l'échantillon, dans une partie de l’échantillon ne comportant pas de microorganisme. Le recours à algorithme d’intelligence artificielle supervisé permet de discriminer, parmi les variations locales détectées en analysant l’image de variation, celles qui correspondent effectivement à la croissance de microorganismes et celles qui ne correspondent qu’à un effet de mouvement et non au développement de microorganismes.

En effectuant l'apprentissage, les inventeurs ont constaté que la période temporelle d'acquisition des images a une influence sur le résultat. La figure 11 représente une évolution de la précision du résultat fourni par le réseau de neurones convolutifs (axe des ordonnées), en fonction de la période temporelle durant laquelle des images sont acquises (axe des abscisses – unité: heure). Lorsque la période temporelle est de 4h, la précision du résultat est de 87.8 %, c'est-à-dire que 87.8 % des résultats sont corrects. Lorsque la période temporelle est de 12h, la précision atteint 98%. La précision correspond au taux de piles de vignettes correctement classées.

Les inventeurs ont testé le procédé décrit en lien avec les étapes 100 à 170 sur des échantillons. Chaque échantillon a fait l'objet d'un comptage manuel visuel, au microscope, par un utilisateur expérimenté, ce comptage permettant d'obtenir une valeur de référence. Les échantillons comportaient des levuresSaccharomyces cerevisiaeréparties dans une matrice alimentaire de type granulés d’alimentation pour animal. On a ensuite comparé les valeurs résultant de l'application du procédé précédemment décrit avec les valeurs de référence.

Au cours de ces essais, on a également utilisé un algorithme basé sur une formation d'une image de variation, telle que décrite dans l'étape 130. Le comptage des microorganismes se développant est alors effectué par des opérations de filtrage et de traitement morphologique de l'image de variation : filtrage gaussien – filtrage d'Otsu (connu de l'homme du métier) – traitement morphologique (dilatation/érosion) – nettoyage de régions d'intérêt considérées comme aberrantes. Un tel algorithme, essentiellement basé sur une analyse morphologique, nécessite une mise au point longue, de façon à optimiser les différentes opérations successivement appliquées.

Les figures 12A, 12B et 12C correspondent respectivement à l'application, sur un échantillon, de la sélection manuelle (méthode de référence), de l'algorithme basé sur une analyse morphologique, et du procédé décrit en lien avec les étapes 100 à 170. On constate que ce dernier (figure 12C) est cohérent avec la méthode de référence (figure 12A). Sur chaque image, les microorganismes détectés sont représentés par un point blanc.

Les figures 12D, 12E et 12F correspondent respectivement à l'application, sur une autre partie de l'échantillon, de la sélection manuelle (méthode de référence), de l'algorithme basé sur une analyse morphologique et du procédé décrit en lien avec les étapes 100 à 170. On constate que ce dernier (figure 12F) est plus cohérent avec la méthode de référence (figure 12D).

Les figures 12G, 12H et 12I correspondent respectivement à l'application, sur une autre partie de l'échantillon, de la sélection manuelle (méthode de référence), de l'algorithme basé sur une analyse morphologique et du procédé décrit en lien avec les étapes 100 à 170. On constate que ce dernier (figure 12I) est cohérent avec la méthode de référence (figure 12G).

Les inventeurs ont réalisé des comptages sur 104 échantillons différents. Ces échantillons comportaient des levuresSaccharomyces cerevisiaedisposées dans des trois milieux différents, chaque milieu comportant des granules de nutrition animale.

On a déterminé des comptages de référence, effectués en balayant l'échantillon à l'aide d'un microscope. Les comptages de référence ont été comparés avec l'algorithme d’analyse morphologique et l'algorithme selon les étapes 100 à 170 préalablement décrites. Chaque algorithme a été mis en œuvre en utilisant 11 images acquises durant une période temporelle de 10 heures, avec une cadence d'acquisition de 1 image par heure.

La figure 13A montre, pour chaque échantillon, le comptage de référence (axe des abscisses) et le comptage réalisé avec l'algorithme d’analyse morphologique (axe des ordonnées). La moyenne des différences absolues entre les valeurs de référence et les valeurs données par l'algorithme d’analyse morphologique est égale à 12.9 %.

La figure 13B montre, pour chaque échantillon, le comptage de référence (axe des abscisses) en fonction du comptage réalisé avec l'algorithme mettant en œuvre le réseau de neurones convolutif (axe des ordonnées). La moyenne des différences absolues entre les valeurs de référence et les valeurs données par l'algorithme basé sur les réseaux de neurones est égale à 9.9 %.

Sur les figures 13A et 13B, chaque type de matrice alimentaire est respectivement repérée par un symbole de type triangle, rond ou carré.

Selon un mode de réalisation, une optique de formation d'image est disposée entre l'échantillon et le capteur d'image. Selon une variante, illustrée sur la figure 14, le dispositif comporte un système optique 19, définissant un plan objet P_objet un plan image P_im. Le capteur d'image 16 est alors disposé selon une configuration dite défocalisée, selon laquelle l'échantillon s'étend selon un plan décalé par rapport au plan objet, et/ou le capteur d'image s'étend selon un plan décalé par rapport au plan image. Par configuration défocalisée, on entend une configuration comportant un décalage de l'échantillon et/ou du capteur d'image par rapport à une configuration de mise au point, selon laquelle le plan de détection P₀est conjugué d'un plan P₁₀selon lequel s'étend l'échantillon. Le décalage δ est de préférence inférieur à 500 µm, voire à 200 µm. Il est de préférence supérieur à 10 µm ou 20 µm. De la même manière qu'en configuration sans lentille, une telle configuration permet l'obtention d'une image dans laquelle chaque microorganisme apparaît sous la forme d'une figure de diffraction, des interférences se produisant entre l'onde lumineuse émise par la source de lumière et se propageant jusqu'au capteur d'image et une onde de diffraction générée par chaque particule de l'échantillon. Dans l'exemple représenté sur la figure 14, le plan objet P_o _bjest confondu avec un plan P₁₀selon lequel s'étend l'échantillon et le plan image P_i _mest décalé par rapport au plan de détection P₀selon un décalage d. Le procédé décrit en lien avec les étapes 100 à 170 est applicable à des images acquises selon une telle configuration. Toutefois, une configuration en imagerie sans lentille est préférée, par le plus grand champ d'observation qu'elle procure. Selon une autre variante, le plan de détection est confondu avec le plan image et le plan de l’échantillon est confondu avec le plan objet. Chaque image est ainsi acquise selon une configuration focalisée.

L'invention peut être mise en œuvre, de façon non limitative, dans le domaine de l'agroalimentaire, ou dans le contrôle de procédés industriels, dans le contrôle de l'environnement, ou encore dans le domaine de la microbiologie ou du diagnostic clinique. de la biologie, ou dans le contrôle de l'environnement, ou encore dans le domaine de l'agroalimentaire ou du contrôle de procédés industriels.

Claims

Procédé de caractérisation d'un échantillon, comportant des microorganismes disposés au contact d'un milieu propice à leur développement, le procédé comportant les étapes suivantes :
illumination de l'échantillon (10) par une source de lumière (11);

à l’aide d’un capteur d'image (16), obtention d’images de l’échantillon ( ), chaque image représentant l’échantillon à un instant de mesure( ) ;

comparaison d’une image de l’échantillon, à un instant de mesure ( ), avec une image de référence ( ), représentant l’échantillon à un instant de référence ( ), de façon à établir une image de comparaison ( ), l’image de comparaison étant représentative d'une variation de l'échantillon entre l'instant de mesure ( ) et l'instant de référence ( ), l’instant de référence étant choisi parmi les instants de mesure;

répétition de l’étape c) pour différents instants de mesure ( ), de façon à obtenir différentes images de comparaison ( ), chaque image de comparaison étant associée à un instant de mesure( );

à partir des images de comparaison ( ), définition d'au moins une région d'intérêt ( , chaque région d'intérêt correspondant à une partie d'au moins une image de comparaison ( ), dans laquelle une variation de l'échantillon est détectée;

sur plusieurs images de l’échantillon, résultant de l’étape b), extraction de vignettes ( ), chaque vignette comportant une région d'intérêt ( , définie au cours de l'étape e), de façon à former au moins une pile de vignettes ( ), chaque pile de vignettes correspondant à une même région d'intérêt ( extraite de plusieurs images ( ) de l’échantillon ;

utilisation de chaque pile de vignettes formées lors de l'étape f) en tant que données d'entrée d'un algorithme d'intelligence artificielle supervisé ;

à partir de l'algorithme d'intelligence artificielle supervisé, confirmation ou non confirmation de la présence de microorganismes se développant dans chaque région d'intérêt définie dans l'étape e).
Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'algorithme d'intelligence artificielle supervisé est un réseau de neurones.
Procédé selon la revendication 2, dans lequel le réseau de neurones est un réseau de neurones convolutifs.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel chaque image étant définie selon des pixels ( ), l'étape e) comporte :
e-i) pour chaque pixel, sélection d’une image de comparaison ( ), dont la valeur, audit pixel, est soit minimale, soit maximale ;

e-ii) formation d'une image de variation ( ), dont la valeur, en chaque pixel, est déterminée par l'image de comparaison sélectionnée lors de la sous-étape e-i) ;

e-iii) définition d’au moins une région d'intérêt ( à partir de l'image de variation.
Procédé selon la revendication 4, comportant, suite à la sous-étape e-ii) :
segmentation de l'image de variation, entre une première partie, et une deuxième partie, complémentaire de la première partie, la segmentation étant effectuée par rapport à un seuil d'intensité ;

à partir de l'image de variation segmentée, détermination de coordonnées d’intérêt ( correspondant potentiellement à un microorganisme ;
de telle sorte que l'étape e-iii) comporte une définition d'au moins une région d'intérêt ( autour de chaque coordonnée d’intérêt déterminée au cours de la sous-étape e-ii).
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape f), chaque vignette comporte une seule région d'intérêt définie au cours de l'étape e).
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'échantillon est disposé entre la source de lumière et le capteur d'image.
Procédé selon la revendication 7, dans lequel aucune optique de formation d'image n'est disposé entre l'échantillon et le capteur d'image.
Procédé selon la revendication 7, dans lequel un système optique (19) s'étend entre l'échantillon et le capteur d'image, le système optique définissant un plan objet (P_obj) et un plan image (P_im), le procédé étant tel que :
le capteur d'image définit un plan de détection (P₀), le plan de détection étant décalé par rapport au plan image (P_im);

et/ou l'échantillon définit un plan d'échantillon (P₁₀), le plan d'échantillon étant décalé par rapport au plan objet (P_obj).
Procédé selon l’une quelconque des revendications 8 ou 9, dans lequel l’étape b) comporte, à chaque instant de mesure( ):
b-i) acquisition d’une image par le capteur d’image ( ), à l’instant de mesure;

b-ii) application d’un opérateur de reconstruction holographique à l’image acquise ( ) de façon à obtenir une image complexe ( ) dans un plan de reconstruction;

b-iii) obtention de l’image de l’échantillon ( ), à l’instant de mesure, à partir de l’image complexe ( ) résultant de la sous-étape b-ii).
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant, suite à l’étape h), une étape i) de comptage des régions d'intérêt considérées comme comportant des microorganismes se développant dans l'échantillon.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant, préalablement à l'étape h), un apprentissage de l'algorithme d'intelligence artificielle supervisé, l'apprentissage étant réalisé en utilisant des échantillons de calibration comportant des microorganismes se développant dont la localisation est connue.
Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel lors de l'étape b), les instants de mesure sont compris entre un instant initial et un instant final, et dans lequel lors de l’étape c), l'instant de référence ( ) correspond à l'instant initial ou à l'instant final.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel lors de l'étape c), l'instant de référence est un instant antérieur ou postérieur à chaque instant de mesure.
Dispositif de caractérisation d'un échantillon, l'échantillon comportant des microorganismes, le dispositif comportant :
une source de lumière (11);

un capteur d'image (16);

un support (10s), configuré pour maintenir l'échantillon ;

un processeur, programmé pour mettre en œuvre les étapes c) à h) du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.