WO2016186412A1 - 선형 업컨버전 형광 특성을 이용한 생체물질 검출 방법 - Google Patents

선형 업컨버전 형광 특성을 이용한 생체물질 검출 방법 Download PDF

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WO2016186412A1
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김세훈
정봉현
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박경미
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances

Definitions

  • the present invention relates to a method for assaying the detection of biomaterials using linear upconversion fluorescence properties.
  • Fluorescent materials are basically present in the sample (blood, sputum, etc.) or the detector plate, and these fluorescent materials serve as background noise in fluorescence-based detection. In addition, when using a conventional conventional fluorescent particles, such background noise is detected together, so the detection sensitivity of the target signal is limited.
  • Upconversion nanoparticles unlike quantum dots, which are chemically stable, non-quenching, and biochemically heavily used, have a maximum emission wavelength that is not size-dependent and can easily be multicolored by changing host crystals and RE doping materials. It can emit light.
  • UCNPs are used for flow cytometry, photodynamic therapy, and diagnostics, and as luminescent labels in biological assays such as immunoassays and genetic analysis, and for chemical sensing and imaging of cells. have.
  • UCNPs upconversion nanoparticles
  • a laser which is a high power coherent excitation light source, is required. High cost and not easy to observe
  • the present inventors have completed the present invention by developing a novel linear upconversion nanoparticle that can be observed with a general LED light source by applying the linear upconversion fluorescence property to a method for biomaterial detection.
  • Another object of the present invention is to provide a biomaterial detection system using a dye having linear upconversion fluorescence properties.
  • a biomaterial detection method using a dye having a linear up-conversion fluorescence property comprising the step.
  • conversion fluorescence refers to a wide range of optical phenomena that absorbs low energy light and emits high energy light.
  • linear upconversion fluorescence refers to linear optical phenomena following single photon absorption rather than multiphoton absorption based.
  • non-linear upconversion fluorescence is a phenomenon in which two or more photons in the fluorescence are sequentially absorbed to emit high energy, which is different from the linear upconversion fluorescence of the present invention.
  • the phosphor having the linear upconversion fluorescence property may be, but is not limited to, a phosphor having Stokes' shift ⁇ 100 nm.
  • Stokes' shift or “Stokes shift” means the difference between the excitation light energy and the emission energy in the Stokes law.
  • Phosphors exhibiting the linear upconversion fluorescence in the detection method of the present invention are not limited thereto.
  • DPP Diketo Pyrrolo Pyrrole
  • acene, fluorescein, rhodamine, jade Photograph, thiazine, cyanine, rubrene, bodiphy, resorrupine and hemicyanin may be any one or more selected from the group consisting of.
  • the present invention is not necessarily limited thereto, and any phosphor that exhibits linear upconversion fluorescence properties, preferably a phosphor having Stokes' shift ⁇ 100 nm may be used.
  • R1 and R2 are the same or different from each other, hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 60 carbon atoms, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 3 to 30 carbon atoms, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 6 to 60 carbon atoms, or An unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted heteroaryl group having 2 to 6 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted condensed polycyclic group having 6 to 6 carbon atoms.
  • the DPP derivative is preferably
  • the phosphor may be in contact with a molecule for detecting a biomaterial.
  • the phosphor may be a fluorescent nanostructure of a type supported on the nanostructure or conjugated to the nanostructure.
  • nanostructure refers to a nano-sized structure, wherein the nanostructure is not limited in size, and may include particles larger than the nanoparticles, that is, microparticles and the like. Any size may be used as long as it can carry or bond a fluorescent dye having the linear upconversion fluorescent property of the invention.
  • the nanostructures are not limited thereto, but may be any one or more selected from the group consisting of nanoparticles, nanobeads, nanoemulsions, micelles, liposomes, and nanoparticle suspensions.
  • the nanostructures may be preferably polystyrene beads.
  • the nano-bead may be preferably 1 to 1000 nm in size, but is not limited thereto.
  • the phosphor is conjugated with a molecule for detecting a biomaterial, and the phosphor conjugated with the molecule for detecting a biomaterial and the biomaterial react to form a reaction complex of the phosphor and the biomaterial. It may be to form.
  • the biomaterial detection molecule may be any one or more selected from the group consisting of a protein, an antibody, a gene, a lipid, an enzyme, an aptamer, and a ligand, but is not limited thereto. Any material that can be combined is possible.
  • Step iii) of the detection method of the present invention may be to excite the reaction complex with a light source having a long wavelength region of 5-50 nm longer than the maximum emission wavelength of the phosphor.
  • the light source is not limited thereto, but may be preferably a light emitting diode (LED) or a lamp. That is, the light source of the present invention can use a light source other than a laser, and can be observed by a general LED light source, thereby reducing the cost of securing the fluorescence measuring system of the present invention.
  • the light emission signal emitted from the reaction complex may be a light emission signal of a short wavelength region 10-100 nm shorter than the wavelength of the excitation light.
  • the biological material is preferably, but not limited to, tissue extract, cell lysate, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid It may be one or more selected from the group consisting of peritoneal fluid and blood blood spot (dried blood spot).
  • sample of the present invention includes, without limitation, any sample that can be treated in the method or diagnostic kit of the present invention, and in particular, may be a liquid sample that can be treated evenly in the diagnostic kit.
  • the analytical sample may be any material that may include a target biomolecule, and in particular, may be a material separated from the living body and various materials to which the living body is exposed or processed.
  • the substances separated from the living body may be blood, urine, runny nose, cells, extracted DNA, RNA, protein, and the like.
  • the detection method of the present invention is a step of manufacturing a biosensor, biochip or kit for detecting a biomaterial by placing a linear upconversion fluorescent nanostructure conjugated with the biomaterial detection molecule on a biochip or kit or strip sensor for biomaterial detection. It may further include.
  • the present invention also relates to a biological material detection system 10, with reference to FIG.
  • a biomaterial diagnostic kit 120 including a injection unit into which a biomaterial is injected and a phosphor having a linear upconversion fluorescence property, and a reaction unit forming a reaction complex of the biomaterial and the phosphor;
  • a light source unit 110 providing a light source to the reaction unit of the biomaterial diagnosis kit
  • a measurement unit 140 for detecting and measuring the collected light emission signals.
  • the light source unit 110 provides a biological material detection system 10 using a dye having a linear upconversion fluorescence property, characterized in that to provide a light source having a longer wavelength than the maximum emission wavelength of the phosphor.
  • the phosphor may be, but is not limited to, a phosphor having Stokes' shift ⁇ 100 nm.
  • the light source unit may include an excitation filter for filtering light emitted from the light source, and the light emission signal collector may include a lens for projecting the filtered light.
  • the excitation filter is for passing only a predetermined wavelength of the light source.
  • the lens of the light emitting signal collecting unit may mean an objective lens and an eyepiece, and may include a light emitting filter between the objective lens and the eyepiece, like a conventional microscope.
  • the objective lens is for collecting the emitted light
  • the light emitting filter is to facilitate the measurement by transferring the light collected by the objective lens to the measuring unit (Fig. 1).
  • the spacing between the light source unit, the filter, and the lens may be arranged so that a user may observe the biological material.
  • the diagnostic kit may be a rapid diagnostic kit or an ELISA kit, but is not limited thereto.
  • the diagnostic kit may be used as a rapid diagnostic kit.
  • the rapid diagnostic kit may include a reaction pad, a membrane, and an absorption pad including a sample pad, a conjugate pad, a signal band, and an identification band.
  • the sample pad may mean an injection part for injecting a sample
  • the conjugate pad and the membrane may mean a reaction part.
  • the liquid sample wets the dry sample pad, moves to the conjugate pad, and the analyte is combined with the antibody stored in the dry state to form a complex.
  • the conjugate pad moves to the conjugate pad, and the analyte is combined with the antibody stored in the dry state to form a complex.
  • Signal and identification bands are printed on the surface of the separation membrane, and complexes may accumulate in the signal band when analyte is included in the sample.
  • the antibody of the conjugate pad is connected to a substance such as gold particles or latex beads, so that when a certain amount or more of the complex is aggregated, it can be observed as a signal generated from the signal band part.
  • the identification band of the membrane is printed with an antibody that binds to the antibody in the reservoir, and the standard for determining the effectiveness of the test by determining whether the liquid sample has moved to the required portion and whether the antibody is operating through the presence or absence of the identification band signal.
  • the absorbent pad attached to the end of the separation membrane may serve as a pump to absorb the liquid sample moved through the separation membrane and to continuously move the liquid sample.
  • the biomaterial diagnostic kit of the present invention stores the antibody chemically connected to the fluorescent substance in a dry state in a conjugate pad by using a linear upconversion fluorescence property, and injects a sample (biomaterial) into the sample pad for testing. Proceed. Thereafter, the analyte in the sample (biomaterial) is moved to the conjugate pad to form a conjugate with the stored antibody and to the separation membrane. The conjugate accumulates in the signal band, and the extra fluorescent substance-binding antibody passes through the separation membrane and is absorbed by the absorption pad. In this case, the conjugate of the analyte and the fluorescent substance connecting antibody selectively adsorbed to the signal band may receive energy from the light source unit to generate fluorescence.
  • DPP Diketo Pyrrolo Pyrrole
  • formula (1) any one selected from the group consisting of acene, fluorescein, rhodamine, oxazine, thiazine, cyanine, rubrene, bodiphy, resorrupine and hemicyanine
  • the present invention may be, but is not limited to, any one of phosphors exhibiting linear upconversion fluorescence characteristics, preferably, phosphors having Stokes' shift ⁇ 100 nm.
  • R1 and R2 are the same or different from each other, hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 60 carbon atoms, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 3 to 30 carbon atoms, substituted or substituted with 6 to 60 carbon atoms, or An unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted heteroaryl group having 2 to 6 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted condensed polycyclic group having 6 to 6 carbon atoms.
  • the DPP derivative is preferably
  • the phosphor may be in contact with a molecule for biomaterial detection by itself.
  • the phosphor may be a fluorescent nanostructure of a type supported on the nanostructure or conjugated to the nanostructure.
  • the nanostructures may be any one or more selected from the group consisting of, but not limited to, nanoparticles, nanobeads, nanoemulsions, micelles, liposomes, and nanoparticle suspensions.
  • the nanostructures may be preferably polystyrene beads.
  • the nano-bead may be preferably 1 to 1000 nm in size, but is not limited thereto.
  • the reaction complex of the biomaterial and the phosphor of the detection system is not limited thereto, but the phosphor is conjugated with a molecule for detecting a biomaterial in the reaction unit, and the phosphor in which the molecule for detecting the biomaterial is conjugated.
  • the biomaterial may be formed by reaction.
  • the molecule for detecting a biomaterial may be any one or more selected from the group consisting of proteins, antibodies, genes, lipids, enzymes, aptamers and ligands, but is not limited thereto. Any material that can complementarily compliment the material is possible.
  • the light source having a longer wavelength than the maximum emission wavelength of the phosphor may be, but is not limited to, a light source having a long wavelength region of 5-50 nm longer than the maximum emission wavelength of the phosphor.
  • the light source is not limited thereto, but may be preferably a light emitting diode (LED) or a lamp. That is, the light source of the present invention can be used not only a laser but also a light source other than the laser, and can be observed by a general LED light source, thereby reducing the cost of securing the fluorescence measuring system of the present invention.
  • the light emission signal of the phosphor is a light emission signal having a shorter wavelength than the wavelength of the excitation light, and may be a light emission signal of a short wavelength region 10-100 nm shorter than the wavelength of the excitation light.
  • the biological material is preferably, but not limited to, tissue extract, cell lysate, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, peritoneal fluid And it may be any one or more selected from the group consisting of blood blood (dried blood spot).
  • the present invention also provides a linear upconversion based biomaterial diagnostic kit comprising a phosphor having linear upconversion fluorescence properties.
  • diagnostic kit includes the linear upconversion fluorescent nanoparticles and biomaterial detection molecules of the present invention, and may further include a configuration of other reagents, tools, and the like required for the target biomaterial detection process.
  • the diagnostic kit may be manufactured as a rapid diagnostic kit capable of detecting the biomaterial of the present invention, and may be manufactured as various types of diagnostic kits.
  • the biomaterial detection molecule is not limited thereto, but may be any one or more selected from the group consisting of proteins, antibodies, genes, lipids, enzymes, aptamers, and ligands, and most preferably, antibodies.
  • biomaterial refers to any substance that can be found in or outside a living body, which causes a specific reaction to a living body or occurs by a specific state or reaction.
  • the biomaterial of the present invention may be a compound, protein, DNA, RNA or cell.
  • target biomaterial refers to a substance to which the diagnostic kit of the present invention is to detect the presence or content thereof, and specifically, a substance which has a specific interaction with the detection molecule constituting the diagnostic kit. it means.
  • the linear upconversion fluorescent nanostructure may be one in which a fluorescent dye exhibiting linear upconversion fluorescence properties is supported or conjugated to the nanostructure.
  • the fluorescent dye exhibiting the linear upconversion fluorescence properties is any one selected from the group consisting of DPP (Diketo Pyrrolo Pyrrole) derivative represented by the following formula (1), acene, fluorescein, rhodamine, oxazine, thiazine, cyanine and hemicyanine There may be more than one.
  • DPP Diketo Pyrrolo Pyrrole
  • R1 and R2 are the same or different from each other, hydrogen, a substituted or unsubstituted alkyl group having 1 to 60 carbon atoms, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 3 to 30 carbon atoms, substituted or substituted with 6 to 60 carbon atoms, or An unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted heteroaryl group having 2 to 6 carbon atoms, or a substituted or unsubstituted condensed polycyclic group having 6 to 6 carbon atoms.
  • UCNPs upconversion nanoparticles
  • a laser a high power coherent excitation light source
  • the linear upconversion fluorescent nanoparticle-based diagnostic kit of the present invention can be observed with an LED light source, thereby reducing system development costs.
  • 3,6-Di (thiophen-2-yl) pyrrolo [3,4-c] pyrrole using thiophene-2 carbonitrile and dimethyl succinate -1,4 (2H, 5H) -dione was synthesized, followed by addition of Ethylhexyl bromide to 2,5-bis (2-ethylhexyl) -3,6-di (thiophen-2-yl) pyrrolo [3,4- c] pyrrole-1,4 (2H, 5H) -dione was synthesized.
  • the linear upconversion fluorescent nanostructure of the present invention can detect only the signal of the particles without background noise, and can significantly improve the S / N ratio and sensitivity.
  • the fluorescence of the linear upconversion nanostructure of the present invention can be observed with a general LED light source, there is a cost saving effect in securing a biomaterial diagnosis system.
  • FIG. 1 is a block diagram showing a biological material detection system of the present invention.
  • Fig. 2 shows the absorption and fluorescence spectra of DPP-Th of the present invention (A) and the linear upconversion fluorescence spectrum (B) of polystyrene nanobeads carrying DPP-Th (DPP-Th: 2,5-bis (2-). ethylhexyl) -3,6-di (thiophen-2-yl) pyrrolo [3,4-c] pyrrole-1,4 (2H, 5H) -dione).
  • FIG. 3 shows the results of linear upconversion fluorescence according to the supported phosphor concentration of DPP-Th loaded polystyrene nanobeads of the present invention (DPP-Th: 2,5-bis (2-ethylhexyl) -3,6- di (thiophen-2-yl) pyrrolo [3,4-c] pyrrole-1,4 (2H, 5H) -dione).
  • DPP-Th 2,5-bis (2-ethylhexyl) -3,6- di (thiophen-2-yl) pyrrolo [3,4-c] pyrrole-1,4 (2H, 5H) -dione
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a rapid kit for diagnosing a biological material prepared using the linear upconversion fluorescent material of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of the configuration of the linear upconversion fluorescence based rapid kit detection system of the present invention.
  • Figure 6 shows a rapid kit measurement apparatus that can detect a biological material using the linear upconversion nanoparticles according to the present invention.
  • FIG. 7 shows the results of comparing linear upconversion fluorescence signal sensitivity of DPP-Th bearing nanobeads with the general downconversion fluorescence signal on the rapid kit diagnostic strip of the present invention.
  • FIG. 8 shows DPP-Th loaded nanobeads (A), Rubrene-supported polymer surfactant micelle nanoparticles (micelle, Pluronic F127) (B), aqueous solution of Resorufin compared to human serum on the rapid kit diagnostic strip of the present invention.
  • A DPP-Th loaded nanobeads
  • B Rubrene-supported polymer surfactant micelle nanoparticles
  • D linear upconversion fluorescence signal sensitivity of the Rhodamine B aqueous solution
  • D the general downconversion fluorescence.
  • Figures 9a and 9b is a result of confirming the immune response on the rapid kit-based membrane using the linear upconversion nanoparticles according to the present invention.
  • Example 2 5 ⁇ 10 ⁇ 5 M of 100 ⁇ l DPP-Th THF (Tetrahydrofuran) solution obtained in Example 1 was added to 600 ⁇ l of 0.4 w / v% carboxylated polystyrene beads (100 nm, Invitrogen). The mixture was stirred slowly at room temperature for 30 minutes. Thereafter, THF was removed using a rotary thickener to prepare linear upconversion nanobeads.
  • DPP-Th THF Tetrahydrofuran
  • FIG. 2 shows the absorption and fluorescence spectra of DPP-Th of the present invention (A) and the linear upconversion fluorescence spectrum (B) of polystyrene nanobeads carrying DPP-Th (DPP-Th: 2,5-bis (2-ethylhexyl) -3,6-di (thiophen-2-yl) pyrrolo [3,4-c] pyrrole-1,4 (2H, 5H) -dione).
  • the phosphor has a Stokes' shift of about 20 nm, and the loaded polystyrene nanobeads can be confirmed to have a fluorescent component of shorter wavelength region (540-570 nm) than excitation light under 580 nm excitation.
  • the fluorescent properties of the novel linear upconversion nanostructures were confirmed. As a result, it was confirmed that the developed particles have upconversion fluorescent components that absorb long wavelength light and emit short wavelength light. In addition, the fluorescence intensity (intensity) according to the concentration of the supported fluorescent dye was measured. The results are shown in FIG.
  • Rapid kit 120 was produced based on a generally known configuration. Specifically, a rapid diagnostic kit 120 including a sample pad 121, a conjugation pad 122, a membrane 125, and an absorption pad was manufactured.
  • the sample pad of the rapid diagnostic kit 120 means the injection unit 121 of the present invention, the conjugation pad 122, the signal pad 123, the confirmation band 124, the membrane 125 and
  • the absorbent pad means the reaction part 126.
  • the biomaterial detection system 10 shown in FIG. 5 was constructed using the linear upconversion nanoparticle-based rapid diagnostic kit 120.
  • the LED light source 110 is positioned so that the excitation light is irradiated to the rapid diagnostic kit 110 through the excitation filter (not shown), the fluorescence generated on the diagnostic kit 120 is the objective lens 131 light emission filter 132 And the eyepiece 133 to reach the measurement unit 140.
  • the objective lens 131 is arranged to fit the focal length on the kit 120, and is designed to measure the fluorescence signal of the corresponding focal region on the kit 120 (FIGS. 5 and 6).
  • the signal sensitivity of the linear upconversion fluorescence relative to the background on the diagnostic strip was measured using the linear upconversion nanoparticles of Example 2 (FIG. 7).
  • FBS fetal bovine serum
  • DPP-Th nanobeads 4 mg / ml in DW
  • linear upconversion fluorescence characteristics were confirmed using an imaging system according to the conditions of Table 1 below. Linear upconversion fluorescence and general fluorescence characteristics herein are measured under the conditions of Table 1 below.
  • the target signal can be measured with high sensitivity without using background noise by using a light source such as an LED.
  • Resorufin solution and Rhodamine B aqueous solution were each prepared in phosphate-buffered saline (PBS, pH 8.0) and distilled water to a concentration of 10 -5 M, DPP-Th is a dye concentration of 10 - was prepared by dilution with 5 M.
  • the materials were mixed with human serum in a 1: 1 volume ratio and placed on the diagnostic strip to confirm the linear upconversion fluorescence properties (FIG. 8). As shown in Figure 8, the linear up-conversion fluorescence according to the present invention can be seen that the background noise due to autofluorescence of the serum (serum) almost compared with the normal fluorescence.
  • Antibodies were modified on the surface of the linear upconversion nanoparticles of Example 2 and immunoreactivity experiments were performed using serum and protein solutions on nitrocellulose membranes.
  • the antibody modification process was as follows: 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride aqueous solution (30 ⁇ l, 100) in an aqueous solution containing the linear upconversion nanoparticles of Example 2 (1 ml, 3 mg / ml) mg / ml) was added and reacted for 15 minutes at room temperature.
  • CRP C-reactive protein
  • the experiment for confirming the immune response on the nitrocellulose membrane was performed as follows. Membrane fixed with control antibody (antirabbit IgG; R & D system) and test antibody (mAb-CRP; R & D system) was blocked with blocking buffer 1% BSA (PBS) and washed three times with PBS. After the entire membrane, the antibody-modified linear upconversion nanoparticles, antigen (CRP) and serum was mixed with a solution and then washed three times with PBST. After performing the immune response experiment, the fluorescence of the nitrocellulose membrane was measured and the results are shown in FIGS. 9A and 9B.
  • Example 6 The antibody formula linear upconversion nanoparticles of Example 6 were loaded onto the conjugation pad of the diagnostic kit according to Example 3, and particle flow characteristics through eluent loading were observed as linear upconversion signals. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 10, in the linear upconversion fluorescence mode, particle flow characteristics are confirmed and a signal with minimal background noise in the membrane region can be observed.
  • Linear upconversion fluorescence properties were applied to genetic analysis. It is known to detect target genes using metal nanoparticles conjugated with probe genes.
  • a linear upconversion fluorescence technique according to the present invention is applied to a conventionally known method. Specifically, a gold nanoparticle-phosphor platform (gold nanobeacon) may be manufactured and used as a turn-on fluorescent sensor through a target DNA hybridization reaction.
  • the gene sequences used for genetic analysis are as follows:
  • Probe DNA sequence (hairpin type): 5'-SH- (CH 2 ) 6 -TCG CTG AGA TCG GGA TCC CCA AAA TCA GCG A- (CH 2 ) 6 -TAMRA-3 '(Bionic)
  • Gold nanoparticles conjugated with the probe DNA were reacted with the target DNA, and then fluorescence was measured. Specifically, after reacting 1.5 nM nanobeacon and 100 nM target DNA (pH 7 Tris buffer) for 1 hour at 37 °C, the generated fluorescence signal was compared according to the presence or absence of serum. The results are shown in FIG.

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Abstract

본 발명은 i) 선형 업컨버전 형광 특성을 가지는 형광체를 준비하고; ii) 상기 형광체와 생체물질을 반응시켜서 형광체와 생체물질의 반응복합체를 형성하고; iii) 상기 반응복합체를, 상기 형광체의 최대발광파장보다 장파장의 광원으로 여기시키고; iv) 상기 여기된 반응복합체로부터 방출되는, 상기 여기광의 파장보다 단파장인 발광 신호를 탐지하여 측정하는; 단계를 포함하는, 선형 업컨버전 형광 특성을 가진 염료를 이용한 생체물질 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 선형 업컨버전 형광 특성을 가진 염료를 이용한 생체물질 검출 시스템 및 키트에 관한 것이다.

Description

선형 업컨버전 형광 특성을 이용한 생체물질 검출 방법
본 발명은 선형 업컨버전 형광 특성을 이용한 생체물질의 검출 어세이(assay) 방법에 관한 것이다.
대상 검체 (혈액, 객담 등)나 검출기판에는 기본적으로 형광을 띄는 물질들이 존재하여 형광 기반의 검출에 있어서 이러한 형광 물질은 배경잡음으로 작용한다. 또한 일반적인 종래 형광 입자를 사용할 경우 이러한 배경잡음이 함께 감지되므로 표적신호의 검출감도가 제한적이다.
업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticles: UCNPs)는 화학적으로 안정하고 소광이 없으며 생화학적으로 많이 사용되고 있는 양자점과는 달리, 최대 발광 파장이 크기-의존이 아니며 호스트 결정과 RE 도핑물질을 변화시켜 쉽게 다중 색 발광을 할 수 있다. 이러한 특성을 이용하여 UCNPs는 흘림 세포계측(flow cytometry), 광역학 요법(photodynamic therapy), 진단 등에 활용되고 있으며 면역분석법과 유전자 분석 같은 생물학적 분석에서 발광 표지로 사용되고 화학적 감지/세포의 영상화에도 활용되고 있다.
그러나 기존의 업컨버전 나노입자(UCNPs)를 이용한 형광은 대부분 무기 나노결정의 비선형 업컨버전 방식으로 (이광자 및 다중광자를 흡수함), 이를 관측하기 위해서는 고전력의 결맞음 상태의 여기광원인 레이저가 필요한바 비용이 높고 관측이 용이하지 않다.
이에 본 발명자들은, 선형 업컨버전 형광 특성을 생체물질 검출을 위한 방법에 적용함으로써, 일반 LED 광원으로도 관측이 가능한 신규 선형 업컨버전 나노입자를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 선형 업컨버전 형광 특성을 가진 염료를 이용한 생체물질 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 선형 업컨버전 형광 특성을 가진 염료를 이용한 생체물질 검출 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 선형 업컨버전 형광 특성을 가지는 형광체를 포함하는 선형 업컨버전 기반의 생체물질 진단 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
i) 선형 업컨버전 형광 특성을 가지는 형광체를 준비하고;
ii) 상기 형광체와 생체물질을 반응시켜서 형광체와 생체물질의 반응복합체를 형성하고;
iii) 상기 반응복합체를, 상기 형광체의 최대발광파장보다 장파장의 광원으로 여기시키고;
iv) 상기 여기된 반응복합체로부터 방출되는, 여기광의 파장보다 단파장인 발광 신호를 탐지하여 측정하는;
단계를 포함하는, 선형 업컨버전 형광 특성을 가진 염료를 이용한 생체물질 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 용어, “업컨버전(upconversion) 형광”은 저에너지의 광을 흡수하여 고에너지의 광을 방출하는 넓은 범위의 광학 현상을 말한다.
본 발명의 용어, “선형 업컨버전 형광”은, 다중광자 흡수 기반이 아닌 단일 광자 흡수에 따른 선형 광학 현상을 의미한다. 통상의 비선형 업컨버전 형광의 경우, 형광 중에서 둘 또는 둘 이상의 광자가 순차적으로 흡수되어 고에너지를 발광하는 현상인바, 본 발명의 선형 업컨버전 형광과 차이가 있다.
본 발명의 상기 검출방법에서 선형 업컨버전 형광 특성을 갖는 형광체는 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게 Stokes' shift <100 nm 인 형광체일 수 있다. 본 발명의 용어, “Stokes' shift" 또는 “스토크스 이동”은 스토크스의 법칙에 있어서의 여기광 에너지와 발광 에너지의 차를 의미한다.
본 발명의 상기 검출방법에서 상기 선형 업컨버전 형광 특성을 나타내는 형광체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 하기 화학식 1로 표시되는 DPP(Diketo Pyrrolo Pyrrole) 유도체, 아센, 플루오레세인, 로다민, 옥사진, 티아진, 시아닌, 루브렌, 보디피, 레조루핀 및 헤미시아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 그러나 반드시 이로 제한되는 것은 아니며, 선형 업컨버전 형광 특성을 나타내는 형광체, 바람직하게 Stokes' shift <100 nm 인 형광체라면 어느 것이든 이용가능하다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016005166-appb-I000001
(상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이한 수소,　탄소수 1 내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 알킬기, 탄소수 3 내지 탄소수 30의 치환 또는 비치환된 사이클로알킬기, 탄소수 6 내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 아릴기, 탄소수 2　내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기, 또는 탄소수 6　내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 축합 다환기를 나타낸다.)
본 발명의 구체예에서, 상기 DPP 유도체는 바람직하게
2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-1,4(2H,5H)-디온 [2,5-bis(2-ethylhexyl)-3,6-di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione][화학식 2];
2,5-비스(2-에틸헥실)-2,5-디하이드로-3,6-디페닐-피롤로[3,4-c]피롤-1,4-디온 [2,5-bis(2-ethylhexyl)-2,5-dihydro-3,6-diphenyl-pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4-dione][화학식 3];
5-(2,5-비스(2-에틸헥실)-1,2,4,5-테트라하이드로-1,4-디옥소-3-(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-6-일)티오펜-2-카발데히드 [5-(2,5-bis(2-ethylhexyl)-1,2,4,5-tetrahydro-1,4-dioxo-3-(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrol-6-yl)thiophene-2-carbaldehyde][화학식 4]; 또는
5,5'-(2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디옥소-2,3,5,6-테트라하이드로피롤로[3,4c]피롤-1,4-디일)비스(티오펜-2-카발데히드) [5,5'-(2,5-Bis(2-ethylhexyl)-3,6-dioxo-2,3,5,6-tetrahydropyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4-diyl)bis(thiophene-2-carbaldehyde)][화학식 5]
일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게 하기 화학식 2로 표시되는 2,5-bis(2-ethylhexyl)-3,6-di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione일 수 있다.
[화학식 2]
2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-1,4(2H,5H)-디온
Figure PCTKR2016005166-appb-I000002
[화학식 3]
2,5-비스(2-에틸헥실)-2,5-디하이드로-3,6-디페닐-피롤로[3,4-c]피롤-1,4-디온
Figure PCTKR2016005166-appb-I000003
[화학식 4]
5-(2,5-비스(2-에틸헥실)-1,2,4,5-테트라하이드로-1,4-디옥소-3-(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-6-일)티오펜-2-카발데히드
Figure PCTKR2016005166-appb-I000004
[화학식 5] 5,5'-(2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디옥소-2,3,5,6-테트라하이드로피롤로[3,4c]피롤-1,4-디일)비스(티오펜-2-카발데히드)
Figure PCTKR2016005166-appb-I000005
본 발명의 상기 검출방법의 i) 단계에서, 상기 형광체는 그 자체로 생체물질 검출용 분자와 접할될 수 있다. 또는 바람직하게 상기 형광체는 나노구조체에 담지되거나, 나노구조체에 접합(conjugation)된 형태의 형광 나노구조체일 수 있다.
본 발명의 용어, "나노구조체"는 나노 크기의 구조체를 의미하며, 이때, 상기 나노구조체는 그 크기가 한정되는 것이 아니라, 상기 나노입자보다 큰 입자, 즉 마이크로입자 등을 포함할 수 있으며, 본 발명의 선형 업컨버전 형광 특성을 갖는 형광 염료를 담지하거나 또는 접합할 수 있는 크기라면 어떠한 크기라도 무방하다.
상기 나노구조체는 이에 제한되는 것은 아니나, 나노입자, 나노비드, 나노에멀전, 마이셀, 리포좀 및 나노입자 현탁액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 구체예에서 상기 나노구조체는 바람직하게는 폴리스티렌계 비드일 수 있다. 본 발명에서 상기 나노 비드는 바람직하게는 1~1000 nm의 크기일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 검출방법의 ii) 단계는, 상기 형광체가 생체물질 검출용 분자와 접합하고, 상기 생체물질 검출용 분자가 접합된 형광체와 상기 생체물질이 반응하여 상기 형광체와 생체물질의 반응복합체를 형성하는 것일 수 있다.
이때, 상기 생체물질 검출분자는 단백질, 항체, 유전자, 지질, 효소, 앱타머(aptamer) 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 검출하고자 하는 생체물질과 상보적으로 결합할 수 있는 물질이라면 어느 것이든지 가능하다.
본 발명의 상기 검출방법의 iii) 단계는, 상기 형광체의 최대발광파장보다 5-50 nm 더 긴 장파장 영역의 광원으로 상기 반응복합체를 여기하는 것일 수 있다. 이 때, 광원은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 LED(light emitting diode) 또는 램프인 것일 수 있다. 즉, 본 발명의 광원은 레이저가 아닌 광원을 사용할 수 있고, 일반 LED 광원으로도 관측이 가능하므로, 본 발명의 형광 측정 시스템을 확보하는데 비용 절감 효과가 있다.
본 발명의 상기 검출방법의 iv) 단계는, 반응복합체로부터 방출되는 발광 신호가, 상기 여기광의 파장보다 10-100 nm 더 짧은 단파장 영역의 발광 신호인 것일 수 있다.
본 발명의 상기 검출방법에 있어서, 상기 생체물질은 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 및 혈액여지(dried blood spot)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 용어, "시료"는 본 발명의 방법 또는 진단 키트에 처리할 수 있는　시료라면 제한 없이 포함하며, 특히　진단 키트에 균등하게 처리할 수 있는 액상　시료일 수 있다. 본 발명에서 분석 시료는 표적 생체분자를 포함할 수 있는 모든 물질일 수 있으며, 특히 생체가 노출되거나 생체에 처리되는 각종 물질들과 생체에서 분리된 물질들일 수 있다. 상기 생체에서 분리된 물질들은 구체적으로는, 혈액, 소변, 콧물, 세포, 추출된 DNA, RNA, 단백질 등일 수 있다.
또한 본 발명의 검출방법은 상기 생체물질 검출분자가 접합된 선형 업컨버전 형광 나노구조체를 생체물질 검출용 바이오칩 또는 키트 또는 스트립센서 상에 위치시켜 생체물질 검출용 바이오센서, 바이오칩 또는 키트를 제조하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 생체물질 검출 시스템(10)에 관한 것으로, 도 1을 참조하면,
생체물질이 주입되는 주입부 및 선형 업컨버전 형광 특성을 가지는 형광체를 포함하며, 상기 생체물질과 형광체의 반응복합체를 형성하는 반응부로 이루어진 생체물질 진단키트(120);
상기 생체물질 진단키트의 반응부에 광원을 제공하는 광원부(110);
상기 반응복합체의 형광체를 여기시키는 여기광의 파장보다 단파장인 발광 신호를 탐지하는 발광 신호 수집부(130); 및
상기 수집된 발광 신호를 탐지하여 측정하는 측정부(140);를 포함하며,
상기 광원부(110)는 상기 형광체의 최대발광파장보다 장파장의 광원을 제공하는 것을 특징으로 하는 선형 업컨버전 형광 특성을 가진 염료를 이용한 생체물질 검출 시스템(10)을 제공한다.
상기 검출 시스템에서, 상기 형광체는 이에 제한되는 것은 아니나, Stokes' shift <100 nm 인 형광체일 수 있다.
한편, 상기 광원부는 상기 광원으로부터 발하는 빛을 필터링하는 여기필터를 포함할 수 있으며, 상기 발광 신호 수집부는 상기 필터링된 빛을 투사시키는 렌즈를 포함할 수 있다. 한편, 상기 여기필터는 상기 광원의 소정파장만을 통과시키기 위한 것이다. 이에 더하여, 상기 발광 신호 수집부의 렌즈는 대물렌즈와 접안렌즈를 의미할 수 있으며, 상기 대물렌즈와 접안렌즈의 사이에는 통상적인 현미경과 같이, 발광필터를 포함할 수 있다. 상기 대물렌즈는 방사된 빛을 모아주기 위한 것이며, 상기 발광필터는 상기 대물렌즈로 모은 빛을 상기 측정부로 전달하여 측정이 용이하게 하기 위함이다(도 1).
이러한 광원부, 필터 및 렌즈의 배열 간격 등은 사용자가 상기 생체 물질을 관찰하기 용이하도록 배열할 수 있다.
이에 더하여, 본 발명의 상기 검출시스템에 있어서, 상기 진단 키트는 래피드 진단키트 또는 ELISA 키트인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 실시예에서는 진단 키트를 래피드 진단키트로 사용할 수 있다.
이러한 경우, 상기 래피드 진단키트는 시료패드, 콘주게이트패드, 신호밴드와 확인밴드로 구성된 반응부, 멤브레인 및 흡수패드로 이루어질 수 있다. 상기 시료패드는 시료를 주입하기 위한 주입부를 의미할 수 있으며, 상기 콘주게이트 패드와 멤브레인은 반응부를 의미할 수 있다.
보다 구체적으로, 생체물질이 시료패드에 가해지면 액체인 시료는 건조상태의 시료패드를 적신 후, 콘주게이트 패드로 이동하여 분석대상물은 건조상태로 저장되어 있는 항체와 결합을 이루어 복합체를 형성하며, 멤브레인을 따라 이동하게 된다. 분리 멤브레인의 표면에는 신호밴드와 확인밴드가 인쇄되어 있으며, 시료내에 분석대상물이 포함되어 있는 경우 신호밴드부분에 복합체가 축적될 수 있다. 콘주게이트 패드의 항체에는 금 입자 또는 라텍스 비드 등의 물질이 연결되어 있어 일정량 이상의 복합체가 응집되는 경우 신호밴드부에서 발생하는 신호로 관찰할 수 있다.
이에 더하여, 멤브레인의 확인밴드에는 저장부의 항체와 결합하는 항체가 인쇄되어 있어 확인밴드의 신호유무를 통해 액체시료가 필요부분까지 이동 여부 및 항체의 작동여부를 판정하여 검사의 실효성 여부를 판독하는 기준으로 사용하며, 분리멤브레인의 말단에 부착된 흡수패드는 분리멤브레인을 통해 이동한 액체시료를 흡수하여 액체시료가 지속적으로 이동하도록 하는 펌프역할을 할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 생체물질 진단키트는 선형 업컨버전 형광 특성을 이용하여 형광물질이 화학연결된 항체를 콘주게이트 패드에 건조상태로 저장하고, 시료(생체물질)을 시료패드에 주입하여 검사를 진행한다. 그 후, 시료(생체물질) 내에 분석대상물은 콘주게이트 패드로 이동하여 저장된 항체와 결합체를 이루어 분리멤브레인으로 이동한다. 신호밴드에 결합체가 축적되고, 여분의 형광물질 결합항체는 분리멤브레인을 통과하여 흡수패드에 흡수된다. 이때, 신호밴드에 선택적으로 흡착된 분석대상물과 형광물질 연결항체의 결합체는 광원부로부터 에너지를 받아 형광을 발생시킬 수 있다.
또한 상기 검출 시스템에서, 상기 선형 업컨버전 형광 특성을 나타내는 형광체는,
하기 화학식 1로 표시되는 DPP(Diketo Pyrrolo Pyrrole) 유도체, 아센, 플루오레세인, 로다민, 옥사진, 티아진, 시아닌, 루브렌, 보디피, 레조루핀 및 헤미시아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 선형 업컨버전 형광 특성을 나타내는 형광체, 바람직하게 Stokes' shift <100 nm 인 형광체라면 어느 것이든 이용가능하다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016005166-appb-I000006
(상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이한 수소, 　탄소수 1 내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 알킬기, 탄소수 3 내지 탄소수 30의 치환 또는 비치환된 사이클로알킬기, 탄소수 6 내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 아릴기, 탄소수 2　내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기, 또는 탄소수 6　내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 축합 다환기를 나타낸다.)
본 발명의 구체예에서, 상기 DPP 유도체는 바람직하게
2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-1,4(2H,5H)-디온 [2,5-bis(2-ethylhexyl)-3,6-di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione];
2,5-비스(2-에틸헥실)-2,5-디하이드로-3,6-디페닐-피롤로[3,4-c]피롤-1,4-디온 [2,5-bis(2-ethylhexyl)-2,5-dihydro-3,6-diphenyl-pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4-dione];
5-(2,5-비스(2-에틸헥실)-1,2,4,5-테트라하이드로-1,4-디옥소-3-(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-6-일)티오펜-2-카발데히드 [5-(2,5-bis(2-ethylhexyl)-1,2,4,5-tetrahydro-1,4-dioxo-3-(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrol-6-yl)thiophene-2-carbaldehyde]; 또는
5,5'-(2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디옥소-2,3,5,6-테트라하이드로피롤로[3,4c]피롤-1,4-디일)비스(티오펜-2-카발데히드) [5,5'-(2,5-Bis(2-ethylhexyl)-3,6-dioxo-2,3,5,6-tetrahydropyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4-diyl)bis(thiophene-2-carbaldehyde)]
일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게 하기 화학식 2로 표시되는 2,5-bis(2-ethylhexyl)-3,6-di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione일 수 있다.
[화학식 2]
2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-1,4(2H,5H)-디온
Figure PCTKR2016005166-appb-I000007
[화학식 3]
2,5-비스(2-에틸헥실)-2,5-디하이드로-3,6-디페닐-피롤로[3,4-c]피롤-1,4-디온
Figure PCTKR2016005166-appb-I000008
[화학식 4]
5-(2,5-비스(2-에틸헥실)-1,2,4,5-테트라하이드로-1,4-디옥소-3-(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-6-일)티오펜-2-카발데히드
Figure PCTKR2016005166-appb-I000009
[화학식 5] 5,5'-(2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디옥소-2,3,5,6-테트라하이드로피롤로[3,4c]피롤-1,4-디일)비스(티오펜-2-카발데히드)
Figure PCTKR2016005166-appb-I000010
본 발명의 상기 검출시스템에서, 상기 형광체는 그 자체로 생체물질 검출용 분자와 접할될 수 있다. 또는 바람직하게 상기 형광체는 나노구조체에 담지되거나, 나노구조체에 접합(conjugation)된 형태의 형광 나노구조체일 수 있다.
상기 나노구조체는 이에 제한되는 것은 아니나 나노입자, 나노비드, 나노에멀전, 마이셀, 리포좀 및 나노입자 현탁액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 구체예에서 상기 나노구조체는 바람직하게는 폴리스티렌계 비드일 수 있다. 본 발명에서 상기 나노 비드는 바람직하게는 1~1000 nm의 크기일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검출시스템의 상기 생체물질과 형광체의 반응복합체는, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 반응부 내에서 상기 형광체가 생체물질 검출용 분자와 접합되어 있고, 상기 생체물질 검출용 분자가 접합된 형광체와 상기 생체물질이 반응함으로써 형성되는 것일 수 있다.
상기 검출시스템에 있어서, 상기 생체물질 검출용 분자는 단백질, 항체, 유전자, 지질, 효소, 앱타머(aptamer) 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 검출하고자 하는 생체물질과 상보적으로 결합할 수 있는 물질이라면 어느 것이든지 가능하다.
상기 검출시스템에 있어서, 상기 형광체의 최대발광파장보다 장파장의 광원은, 이에 제한되는 것은 아니나 상기 형광체의 최대발광파장보다 5-50 nm더 긴 장파장 영역의 광원인 것일 수 있다. 이 때, 광원은 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게 LED(light emitting diode) 또는 램프인 것일 수 있다. 즉, 본 발명의 광원은 레이저 뿐만 아니라 레이저가 아닌 광원을 사용할 수 있고, 일반 LED 광원으로도 관측이 가능하므로, 본 발명의 형광 측정 시스템을 확보하는데 비용 절감 효과가 있다.
상기 검출시스템에 있어서, 상기 형광체의 발광신호는, 여기광의 파장보다 단파장인 발광 신호로, 상기 여기광의 파장보다 10-100 nm 더 짧은 단파장 영역의 발광 신호인 것일 수 있다.
상기 검출시스템에 있어서, 상기 생체물질은 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 및 혈액여지(dried blood spot)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 선형 업컨버전 형광 특성을 가지는 형광체를 포함하는 선형 업컨버전 기반의 생체물질 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 용어 “진단 키트”는 본 발명의 선형 업컨버전 형광 나노입자 및 생체물질 검출분자를 포함하는 것으로, 표적 생체물질 검출과정에서 필요한 기타 시약, 도구 등의 구성을 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 진단 키트는 본 발명의 생체물질을 검출할 수 있는 래피드(rapid) 진단 키트로 제작될 수 있으며, 다양한 형태의 진단 키트로 제작될 수 있다.
상기 생체물질 검출분자는 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게 단백질, 항체, 유전자, 지질, 효소, 앱타머(aptamer) 및 리간드로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 항체일 수 있다.
본 발명의 용어, "생체물질"은 생체 내외에서 발견될 수 있는 물질로서, 생체에 특정 반응을 일으키거나 특정 상태나 반응에 의해 발생하는 모든 물질을 말한다. 바람직하게는, 본 발명의 생체물질은 화합물, 단백질, DNA, RNA 또는 세포일 수 있다. 본 발명에서 용어, "표적 생체물질"은 본 발명의　진단키트가 존재 또는 함량을 검출하고자 하는 대상 물질을 의미하며, 구체적으로는 상기　진단키트를 구성하는 검출분자와 특이적 상호반응을 하는 물질을 의미한다.
상기 선형 업컨버전 형광 나노구조체는 선형 업컨버전 형광 특성을 나타내는 형광 염료가 나노구조체에 담지되거나 또는 접합(conjugation)된 것일 수 있다.
상기 선형 업컨버전 형광 특성을 나타내는 형광 염료는 하기 화학식 1로 표시되는 DPP(Diketo Pyrrolo Pyrrole) 유도체, 아센, 플루오르세인, 로다민, 옥사진, 티아진, 시아닌 및 헤미시아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016005166-appb-I000011
(상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이한 수소, 　탄소수 1 내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 알킬기, 탄소수 3 내지 탄소수 30의 치환 또는 비치환된 사이클로알킬기, 탄소수 6 내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 아릴기, 탄소수 2　내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기, 또는 탄소수 6　내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 축합 다환기를 나타낸다.)
종래의 업컨버전 나노입자(UCNPs)를 이용한 형광은 대부분 무기 나노결정의 비선형 업컨버전 방식으로 (이광자 및 다중광자를 흡수함) 이를 관측하기 위해서는 고전력의 결맞음 상태의 여기광원인 레이저가 필요한바 비용이 높고 관측이 용이하지 않았다. 그러나 본 발명의 선형 업컨버전 형광 나노 입자 기반 진단 키트는 LED 광원으로도 관측이 가능한바, 시스템 개발 비용 절감이 가능하다.
본 발명의 구체예에서는 티오펜-2-카보나이트릴(thiophene-2 carbonitrile) 및 디메틸숙시네이트(Dimethyl succinate)를 이용해 3,6-Di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione을 합성한 후, Ethylhexyl bromide를 첨가해 2,5-bis(2-ethylhexyl)-3,6-di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione를 합성하였다. 이후, 2,5-bis(2-ethylhexyl)-3,6-di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione을 폴리스티렌 비드에 담지하여 신규 선형 업컨버전 나노 입자를 합성하였으며, 개발된 입자는 업컨버전 형광 특성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 본 발명의 신규 선형 업컨버전 나노입자를 이용해 이용해 래피드 키트(Rapid kit) 진단 시스템을 개발하였다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 선형 업컨버전 형광 나노구조체는 배경잡음 없이 입자의 신호만을 검출할 수 있어 S/N비 및 민감도를 획기적으로 향상시킬 수 있다. 또한 본 발명의 선형 업컨버전 나노구조체의 형광은 일반 LED 광원으로도 관측이 가능하므로, 생체물질 진단 시스템 확보에 있어 비용 절감 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 생체물질 검출 시스템을 나타낸 블록도이다.
도 2는 본 발명의 DPP-Th의 흡수 및 형광 스펙트럼 (A)과 DPP-Th가 담지된 폴리스티렌 나노비드의 선형업컨버전 형광 스펙트럼 (B)이다 (DPP-Th: 2,5-bis(2-ethylhexyl)-3,6-di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione).
도 3은 본 발명의 DPP-Th가 담지된 폴리스티렌 나노비드의 담지 형광체 농도에 따른 선형업컨버전 형광 특성을 나타내는 결과이다 (DPP-Th: 2,5-bis(2-ethylhexyl)-3,6-di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione).
도 4는 본 발명의 선형 업컨버전 형광 재료를 이용해 제조한 생체 물질 진단을 위한 래피드 키트의 모식도이다.
도 5는 본 발명의 선형 업컨버전 형광 기반 래피드 키트 검출 시스템의 구성에 대한 모식도이다.
도 6은 본 발명에 따른 선형 업컨버젼 나노입자를 이용하여 생체물질을 검출할 수 있는 래피드 키트 측정 장치를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 래피드 키트 진단 스트립 상에서, DPP-Th 담지 나노비드의 선형 업컨버전 형광 신호 감도를 일반 다운컨버젼 형광 신호와 비교하여 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명의 래피드 키트 진단 스트립 상에서의 인간 혈청(human serum) 대비 DPP-Th 담지 나노비드 (A), Rubrene 담지 고분자 계면활성제 미셀 나노입자 (micelle, Pluronic F127) (B), Resorufin 수용액 (C), Rhodamine B 수용액 (D)의 선형 업컨버전 형광 신호 감도를 일반 다운컨버젼 형광과 비교하여 나타낸 결과이다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명에 따른 선형 업컨버젼 나노입자를 이용하여 래피드 키트 기반의 멤브레인 상에서 면역반응을 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 선형 업컨버젼 나노입자를 이용한 래피드 진단 키트 적용 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 선형 업컨버젼 형광 특성을 활용하여 유전자 분석을 수행한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 선형 업컨버전 염료( DPP - Th ) 합성
실시예 1-1. 3,6- Di(thiophen-2-yl)pyrrolo [3,4-c] pyrrole -1,4( 2H,5H )- dione 의 합성
소듐(2.65 g, 0.13 mol) 및 FeCl3 의 혼합물을 t-아밀 알코올(250 mL)에 용해하였다. 혼합물은 용액이 연한 노란색으로 변할때까지 110℃ 에서 교반하였다. 3시간동안 110℃ 에서 가열한 후, 티오펜-2 카보나이트릴(thiophene-2 carbonitrile, 11.9 g, 0.12 mol)을 반응 혼합물에 넣고 0.5 시간동안 유지하였다. 디메틸 숙시네이트(Dimethyl succinate, 5.29 g, 0.04 mol)를 1.5시간 동안 드롭방식(drop-wise)으로 천천히 첨가하고, 반응 혼합물을 120℃ 에서 4시간 동안 교반하였다. 이후, 0℃로 쿨링하고, 반응 혼합물을 MeOH/HCl 에 침강시켰다. 얻어진 고체를 정제하고 뜨거운 MeOH 로 세척하고, 감압하여 건조하였다. 상기 방법으로 어두은 붉은색 고체인 3,6-Di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione를 10.2 g (84.8 %) 얻어 정제 없이 사용하였다.
실시예 1-2. 2,5-bis(2- ethylhexyl )-3,6- di(thiophen-2-yl)pyrrolo [3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione(DPP-Th)의 합성
상기 실시예 1-1에서 얻어진 3,6-Di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione (4 g, 0.013 mol) 및 K2CO3 (5.5 g, 0.039 mol) 를 아르곤 상태에서 DMF (140 mL)에 현탁하였다. 반응 혼합물을 110 ℃에서 3시간동안 교반하였다. 드롭 방식으로 2-에틸헥실 브로마이드(2-Ethylhexyl bromide, 9 g, 0.046 mol)를 첨가하고, 24시간동안 반응 혼합물을 유지하였다. 상온에서 쿨링 후, 용매는 회전농축기(rotary evaporator)로 제거하였다. 이후, 물을 첨가하고, 물로 크루드를 정제하였다. 잔여물은 MeOH로 재결정하여 정제하였다. 최종적으로 갈색 고체인 2,5-bis(2-ethylhexyl)-3,6-di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione 1.1g(15.7 %)을 얻었다.
실시예 2. 선형 업컨버전 나노비드 제조 및 선형 업컨버전 나노비드의 형광 특성
실시예 1에서 얻은 5×10-5 M의 100㎕ DPP-Th 의 THF(Tetrahydrofuran) 용액을 0.4 w/v% 카복실화된 폴리스티렌 비드(100 nm, 인바이트로젠) 600㎕ 에 첨가하였다. 혼합액을 상온에서 30분간 천천히 교반하였다. 이후, 회전농축기로 THF를 제거하여 선형 업컨버전 나노비드를 제조하였다.
이에 더하여, 도 2 는 본 발명의 DPP-Th의 흡수 및 형광 스펙트럼 (A)과 DPP-Th가 담지된 폴리스티렌 나노비드의 선형업컨버전 형광 스펙트럼 (B)이다 (DPP-Th: 2,5-bis(2-ethylhexyl)-3,6-di(thiophen-2-yl)pyrrolo[3,4-c]pyrrole-1,4(2H,5H)-dione). 상기 형광체는 약 20 nm의 Stokes' shift를 가지며, 담지된 폴리스티렌 나노비드는 580 nm 여기 하에서 여기광보다 단파장 영역(540-570 nm)의 형광 성분을 가지는 것을 확인할 수 있다.
구체적으로, 신규 선형 업컨버전 나노구조체의 형광 특성을 확인하였다. 그 결과, 개발된 입자는 장파장 빛을 흡수해 단파장 빛을 방출하는 업컨버전 형광 성분을 가지는 것을 확인하였다. 또한 담지된 형광 염료의 농도에 따른 형광 강도(intensity)를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
실시예 3. 선형 업컨버전 나노입자 기반 래피드 (Rapid) 진단 키트 및 측정 시스템 개발
실시예 2의 선형 업컨버전 나노입자를 이용해 생체 물질 진단을 위한 래피드 키트를 개발하였다 (도 4).
래피드 키트(120)는 일반적으로 알려진 구성을 바탕으로 제작하였다. 구체적으로, 시료패드(121), 컨쥬게이션 패드(122), 멤브레인(125) 및 흡수 패드를 포함한 래피드 진단 키트(120)를 제작하였다.
한편, 상기 래피드 진단키트(120)의 시료패드는 본 발명의 주입부(121)를 의미하며, 상기 컨쥬게이션 패드(122), 신호패드(123), 확인밴드(124), 멤브레인(125) 및 흡수 패드는 반응부(126)를 의미한다.
이에 더하여, 상기 선형 업컨버전 나노입자 기반 래피드 진단 키트(120)를 이용하여 도 5에 나타난 생체 물질 검출 시스템(10)을 구축하였다. 구체적으로, LED 광원(110)은 여기광이 여기필터(미도시)를 거쳐 래피드 진단 키트(110)에 조사되도록 위치하며, 진단 키트(120) 상에서 발생한 형광은 대물렌즈(131) 발광필터(132) 및 접안렌즈(133)를 거쳐 측정부(140)에 도달하도록 위치하였다. 상기 대물렌즈(131)는 키트(120) 상에 초점거리가 맞도록 배열되어, 키트(120) 상의 해당 초점영역의 형광 신호를 측정하도록 설계되었다 (도 5 및 6).
실시예 4. 선형 업컨버전 나노비드의 혈청 시료상에서의 형광 신호 감도 테스트
실시예 2의 선형 업컨버전 나노입자를 이용해 진단 스트립 상에서의 혈청(background) 대비 선형 업컨버전 형광의 신호 감도를 측정하였다 (도 7). 먼저, 1㎕ FBS (fetal bovine serum) 및 FBS에 1/10로 희석된 DPP-Th 나노비드 (4 mg/ml in DW)를 진단 스트립 상에 각각 위치시켰다. 그 후, 하기 표 1의 조건에 따른 이미징 시스템을 이용해 선형 업컨버전 형광 특성을 확인하였다. 본 명세서상의 선형 업컨버젼 형광 및 일반 형광 특성은 하기 표 1의 조건에서 측정한 것이다.
선형 업컨버전 형광 및 일반 다운컨버전 형광 측정 조건
일반 형광 (다운컨버젼) 선형 업컨버젼 형광
여기광 파장 500 nm 590 nm
측정 발광 파장 585 nm 550 nm
도 7을 통해, 본 발명에 따른 선형 업컨버전 형광 특성을 이용하면, LED 등의 광원을 이용해서 배경잡음 없이 표적신호를 고감도로 측정할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5. 선형 업컨버전 형광체의 혈청시료 상에서의 형광 신호 감도 테스트
실시예 2의 DPP-Th 담지 나노비드뿐만 아니라 Rubrene 담지 고분자 계면활성제 미셀 나노입자 (micelle, Pluronic F127), Resorufin 수용액, Rhodamine B 수용액의 혈청 시료 대비 선형 업컨버전 형광 신호 감도를 다운컨버젼 형광과 비교하였다. Rubrene 담지 미셀 나노입자는 고분자 계면활성제 (Pluronic F127) 20 mg, rubrene 1 mg를 THF 용액상에서 건조한 후 증류수를 첨가하여 재분산하여 준비하였다 (rubrene의 최종농도 4×10-4 M로 희석하였다). Resorufin 수용액과 Rhodamine B 수용액은 10-5 M의 농도로 각각 인산완충용액 (PBS, pH 8.0)와 증류수에 준비하였으며, DPP-Th 는 염료 농도10- 5 M로 희석하여 준비하였다. 상기 재료들은 human serum과 1:1 부피비로 혼합하여 진단 스트립상에 위치한 후 선형 업컨버전 형광 특성을 확인하였다(도 8). 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 선형 업컨버젼 형광은 일반 형광과 비교하여 혈청(serum)의 자가형광에 의한 배경잡음이 거의 없음을 확인할 수 있다.
실시예 6. 선형 업컨버전 나노입자를 이용한 면역반응 확인
실시예 2의 선형 업컨버전 나노입자의 표면에 항체를 수식하고 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에서 혈청과 단백질 용액을 사용하여 면역반응 실험을 수행하였다. 항체 수식 공정은 다음과 같다: 실시예 2의 선형 업컨버젼 나노입자가 포함된 수용액(1 ml, 3 mg/ml)에 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride 수용액(30 ㎕, 100 mg/ml)를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 여기에 항 C-reactive protein(CRP) 다클론 항체(pAb-CRP; Millipore사, Calbiochem)를 첨가하고(15 ㎕, 10 mg/ml) 실온에서 90분 동안 반응시켰다. 12,000 rpm에서 15분간 원심분리를 하여 3회 세척을 수행하고 3% Bovine serum albumin (BSA)로 블락킹하였다.
니트로셀룰로오스 멤브레인 상에서의 면역반응 확인을 위한 실험은 다음과 같이 수행하였다. control 항체(antirabbit IgG; R&D system)와 test 항체(mAb-CRP; R&D system)가 고정된 멤브레인을 블락킹 버퍼1 % BSA 포함 PBS)로 블락킹을 수행하고 PBS로 세 번 세척하였다. 이후 상기 막 전반에, 상기 항체 수식된 선형 업컨버전 나노입자, 항원(CRP) 및 혈청이 혼합된 용액을 도포한 후 PBST로 세번 세척하였다. 상기 면역반응 실험 수행 후 니트로셀룰로오스 멤브레인부의 형광을 측정하여 그 결과를 도 9a 및 도9b에 나타내었다. 도 9a에 나타난 것과 같이, 혈청 자체가 PBST 세척 후에도 막 전반에 걸쳐 흡착되는 것을 일반 형광에서확인 할 수 있다. 상기 항원과 항체 수식된 선형 업컨버전 나노입자, 혈청의 혼합물이 도포되었을 시, control 및 test 항체 고정부에서 선택적으로 강한 형광이 나오는 것을 알 수 있다. 일반 형광에서는 도포 용액에 포함된 혈청의 멤브레인 흡착에 따른 형광 신호가 함께 검출되어 강한 배경 잡음으로 작용하는 반면, 선형 업컨버전 형광에서는 항체 고정부에 결합한 나노입자의 신호가 높은 감도로 측정됨을 알 수 있다.
실시예 7. 선형 업컨버전 나노입자 기반 래피드 (Rapid) 진단 키트 적용
실시예 3에 따른 진단 키트의 컨쥬게이션 패드에 실시예 6의 항체수식 선형 업컨버전 나노입자를 담지하고 용출 로딩(eluent loading)을 통한 입자 유동 특성을 선형업컨버전 신호로 관측하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 것과 같이, 선형 업컨버젼 형광 모드에서 입자 유동 특성이 확인되고 멤브레인 영역의 배경 잡음이 최소화된 신호를 관측할 수 있다.
실시예 8. 선형 업컨버전 형광 기반 유전자 분석
선형업컨버전 형광 특성을 유전자 분석에 적용하였다. 프로브 유전자가 컨쥬게이션된 금속 나노입자를 이용하여 타겟 유전자를 검출하는 방법은 알려져 있다. 본 실시예에서는 종래 알려진 방법에 본 발명에 따른 선형 업컨버젼 형광 기술을 적용하였다. 구체적으로, 금 나노입자-형광체 플랫폼(gold nanobeacon)을 제작하여 타겟 DNA 혼성화반응을 통해 턴-온(turn-on) 형광센서로 활용할 수 있다. 유전자 분석에 사용한 유전자 서열은 다음과 같다:
프로브 DNA 서열(hairpin type): 5'-SH-(CH2)6-TCG CTG AGA TCG GGA TCC CCA AAA TCA GCG A-(CH2)6-TAMRA-3' (바이오니아)
타겟 DNA 서열: 5'-GGG GAT CCC GAT CTC AG-3' (바이오니아)
15 nm Au NP 및 프로브 DNA 를 1:100의 몰비로 반응시켰다. 그 다음 상기 반응물에 NaCl 용액을 (5 M)을 1시간 간격으로 총 4회에 걸쳐 첨가하여 최종 NaCl 농도가 0.3 M이 되도록 하였다. 그리고 세 번의 원심분리를 수행하여 정제하였다(14,000 rpm, 30 min, 4 ℃)
상기 프로브 DNA가 컨쥬게이션된 금 나노입자를 타겟 DNA와 반응시킨 다음 형광을 측정하였다. 구체적으로, 1.5 nM 나노비콘과 100 nM 타겟 DNA(pH 7 Tris 버퍼)를 37 ℃에서 1시간 동안 반응한 후, 발생한 형광 신호를 혈청의 유무에 따라 비교하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11을 보면, 소광되어 있던 형광체(TAMRA)의 형광이 타겟 DNA에 의해 디켄칭 (dequenching)되는 것을 혈청이 없는 환경에서 관측할 수 있다. 혈청이 존재하는 환경(50% 부피비)에서, 타겟 DNA에 의해 발생한 형광 신호가 혈청의 자가형광에 묻히는 것이 일반 형광 모드에서 관측된다. 그러나 선형 업컨버전 형광 모드에서는 혈청의 유무에 관계없이 형광체의 발생 형광 신호가 뚜렷이 관측되는 것을 알 수 있다.
<부호의 설명>
10: 생체물질 검출 시스템
110: 광원부
120: 진단키트
121: 주입부 122: 콘주게이트패드
123: 신호밴드 124: 확인밴드
125: 멤브레인 126: 반응부
130: 발광신호 수집부 131: 대물렌즈
132: 발광필터 133: 접안렌즈
140: 측정부

Claims (27)

  1. i) 선형 업컨버전 형광 특성을 가지는 형광체를 준비하고;
    ii) 상기 형광체와 생체물질을 반응시켜서 형광체와 생체물질의 반응복합체를 형성하고;
    iii) 상기 반응복합체를, 상기 형광체의 최대발광파장보다 장파장의 광원으로 여기시키고;
    iv) 상기 여기된 반응복합체로부터 방출되는, 여기광의 파장보다 단파장인 발광 신호를 탐지하여 측정하는;
    단계를 포함하는, 선형 업컨버전 형광 특성을 가진 염료를 이용한 생체물질 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 형광체는 Stokes' shift <100 nm 인 형광체인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 선형 업컨버전 형광 특성을 나타내는 형광체는,
    하기 화학식 1로 표시되는 DPP(Diketo Pyrrolo Pyrrole) 유도체, 아센, 플루오레세인, 로다민, 옥사진, 티아진, 시아닌, 루브렌, 보디피, 레조루핀 및 헤미시아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016005166-appb-I000012
    (상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이한 수소, 　탄소수 1 내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 알킬기, 탄소수 3 내지 탄소수 30의 치환 또는 비치환된 사이클로알킬기, 탄소수 6 내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 아릴기, 탄소수 2　내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기, 또는 탄소수 6　내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 축합 다환기를 나타낸다.)
  4. 제3항에 있어서,
    상기 DPP 유도체는,
    2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-1,4(2H,5H)-디온;
    2,5-비스(2-에틸헥실)-2,5-디하이드로-3,6-디페닐-피롤로[3,4-c]피롤-1,4-디온;
    5-(2,5-비스(2-에틸헥실)-1,2,4,5-테트라하이드로-1,4-디옥소-3-(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-6-일)티오펜-2-카발데히드; 또는
    5,5'-(2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디옥소-2,3,5,6-테트라하이드로피롤로[3,4c]피롤-1,4-디일)비스(티오펜-2-카발데히드)인 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 i) 단계에서, 상기 형광체는 나노구조체에 담지되거나, 나노구조체에 접합된 형태의 형광 나노구조체인 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 나노구조체는 나노입자, 나노비드, 나노에멀전, 마이셀, 리포좀 및 나노입자 현탁액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 ii) 단계는, 상기 형광체가 생체물질 검출용 분자와 접합하고, 상기 생체물질 검출용 분자가 접합된 형광체와 상기 생체물질이 반응하여 상기 형광체와 생체물질의 반응복합체를 형성하는 것인, 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 생체물질 검출용 분자는 단백질, 항체, 유전자, 지질, 효소, 앱타머(aptamer) 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 iii) 단계는, 상기 형광체의 최대발광파장보다 5-50 nm 더 긴 장파장 영역의 광원으로 여기하는 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 iii) 단계의 광원은 레이저, LED(light emitting diode) 또는 램프인 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 iv) 단계는, 반응복합체로부터 방출되는 발광 신호가, 상기 여기광의 파장보다 10-100 nm 더 짧은 단파장 영역의 발광 신호인 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 생체물질은 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 및 혈액여지(dried blood spot)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  13. 생체물질이 주입되는 주입부 및 선형 업컨버전 형광 특성을 가지는 형광체를 포함하며, 상기 생체물질과 형광체의 반응복합체를 형성하는 반응부로 이루어진 생체물질 진단키트;
    상기 생체물질 진단키트의 반응부에 광원을 제공하는 광원부;
    상기 반응복합체의 형광체를 여기시키는 여기광의 파장 보다 단파장인 발광 신호를 탐지하는 발광 신호 수집부; 및
    상기 수집된 발광 신호를 탐지하여 측정하는 측정부;를 포함하며,
    상기 광원부는 상기 형광체의 최대발광파장보다 장파장의 광원을 제공하는 것을 특징으로 하는 선형 업컨버전 형광 특성을 가진 염료를 이용한 생체물질 검출 시스템.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 광원부는
    상기 광원으로부터 발하는 빛을 필터링하는 여기필터; 및
    상기 여기필터의 전면에 위치하며, 필터링된 빛을 투사시키는 렌즈;를 포함하는 생체물질 검출 시스템.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 형광체는 Stokes' shift <100 nm 인 형광체인, 생체물질 검출 시스템.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 선형 업컨버전 형광 특성을 나타내는 형광체는,
    하기 화학식 1로 표시되는 DPP(Diketo Pyrrolo Pyrrole) 유도체, 아센, 플루오레세인, 로다민, 옥사진, 티아진, 시아닌, 루브렌, 보디피, 레조루핀 및 헤미시아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 생체물질 검출시스템:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016005166-appb-I000013
    (상기 화학식 1에서 R1 및 R2는 서로 동일하거나 상이한 수소, 　탄소수 1 내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 알킬기, 탄소수 3 내지 탄소수 30의 치환 또는 비치환된 사이클로알킬기, 탄소수 6 내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 아릴기, 탄소수 2　내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 헤테로아릴기, 또는 탄소수 6　내지 탄소수 60의 치환 또는 비치환된 축합 다환기를 나타낸다.)
  17. 제16항에 있어서,
    상기 DPP 유도체는,
    2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-1,4(2H,5H)-디온;
    2,5-비스(2-에틸헥실)-2,5-디하이드로-3,6-디페닐-피롤로[3,4-c]피롤-1,4-디온;
    5-(2,5-비스(2-에틸헥실)-1,2,4,5-테트라하이드로-1,4-디옥소-3-(티오펜-2-일)피롤로[3,4-c]피롤-6-일)티오펜-2-카발데히드; 또는
    5,5'-(2,5-비스(2-에틸헥실)-3,6-디옥소-2,3,5,6-테트라하이드로피롤로[3,4c]피롤-1,4-디일)비스(티오펜-2-카발데히드)인 생체물질 검출 시스템.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 형광체는 나노구조체에 담지되거나, 나노구조체에 접합된 형태의 형광 나노구조체인 것인, 생체물질 검출 시스템.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 나노구조체는 나노입자, 나노비드, 나노에멀전, 마이셀, 리포좀 및 나노입자 현탁액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 생체물질 검출 시스템.
  20. 제13항에 있어서,
    상기 생체물질과 형광체의 반응복합체는, 상기 반응부 내에서 상기 형광체가 생체물질 검출용 분자와 접합되어 있고, 상기 생체물질 검출용 분자가 접합된 형광체와 상기 생체물질이 반응함으로써 형성되는 것인, 생체물질 검출 시스템.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 생체물질 검출용 분자는 단백질, 항체, 유전자, 지질, 효소, 앱타머(aptamer) 및 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 생체물질 검출 시스템.
  22. 제13항에 있어서,
    상기 형광체의 최대발광파장보다 장파장의 광원은, 상기 형광체의 최대발광파장보다 5-50 nm더 긴 장파장 영역의 광원인 것인, 생체물질 검출 시스템.
  23. 제13항에 있어서,
    상기 여기 광원부의 광원은 LED(light emitting diode) 또는 램프인 생체물질 검출 시스템.
  24. 제13항에 있어서,
    상기 형광체의 발광 신호는, 상기 여기파장보다 10-100 nm 더 짧은 단파장 영역의 발광 신호인 것인 생체물질 검출 시스템.
  25. 제13항에 있어서,
    상기 생체물질은 조직 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 및 혈액여지(dried blood spot)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 생체물질 검출 시스템.
  26. 제13항에 있어서,
    상기 진단 키트는 래피드 진단키트 또는 ELISA 키트인 생체물질 검출 시스템.
  27. 선형 업컨버전 형광 특성을 가지는 형광체를 포함하는 선형 업컨버전 기반의 생체물질 진단 키트.
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