WO2016182336A1 - 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법 - Google Patents

음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법 Download PDF

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WO2016182336A1
WO2016182336A1 PCT/KR2016/004923 KR2016004923W WO2016182336A1 WO 2016182336 A1 WO2016182336 A1 WO 2016182336A1 KR 2016004923 W KR2016004923 W KR 2016004923W WO 2016182336 A1 WO2016182336 A1 WO 2016182336A1
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fruit
sound waves
genes
expression
ethylene
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PCT/KR2016/004923
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정미정
박수철
이진수
김주열
이수인
김진아
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대한민국(농촌진흥청장)
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    • A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
    • A23B7/015—Preserving by irradiation or electric treatment without heating effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
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    • A23L3/30—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by irradiation without heating by treatment with ultrasonic waves

Definitions

  • the present invention relates to a method of delaying the maturation of fruit by sonication of a specific sound range.
  • Tomatoes, apples, and peaches are fruits belonging to the Climacteric type. During ripening, the respiration rapidly increases and accordingly, the amount of ethylene is rapidly increased. On the other hand, non-climacteric type fruits, such as grapes and citrus, have little change in breathing, and thus ethylene is insignificant.
  • Ethylene is a plant hormone involved in various processes such as ripening of fruits, seed germination, fruit and flowers, leaf aging and defoliation of leaves and flowers. Ethylene is an essential hormone for the ripening of fruits. Blocking the generation of ethylene, or not recognizing ethylene, fruit is not matured properly. Therefore, inhibiting the production of ethylene delays aging and extends the storage period. Fruits begin to ripen rapidly in the presence of ethylene, to a ripening state suitable for eating, and after this stage a deterioration process called aging. Techniques for inhibiting ethylene synthesis and action for the maintenance and long-term storage of fruits and crops have been studied for a long time and are widely used commercially (Postharvest Biology and Technology, vol. 43, no. 1, pp. 23- 27 (2007); Journal of experimental botany, vol. 57, no. 12, pp. 3313-3325 (2006).
  • Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2005-117919 relates to a method for inhibiting ethylene production of a plant, wherein ACC oxidase and iron ions are absorbed by absorbing one or two or more metal ions selected from the group of Ni, Cu, and Co from the outside of the plant. Disclosed is a method for inhibiting ethylene production of a plant, which is characterized by preventing its association with. However, there is no known technique for inhibiting ethylene production of plants through sonication.
  • the present inventors have completed the present invention by confirming that the maturation of the fruit is delayed by inhibiting ethylene synthesis by treating plants with sound waves of a specific range.
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2005-117919
  • Non-Patent Document 1 Postharvest Biology and Technology, vol. 43, no. 1, pp. 23-27 (2007)
  • Non-Patent Document 2 Journal of experimental botany, vol. 57, no. 12, pp. 3313-3325 (2006)
  • the present invention provides a method for delaying the maturation of fruit using sound waves.
  • the present invention provides a method for delaying the maturation of fruit using sound waves comprising treating a plant with sound waves from 900 Hz to 1200 Hz, preferably from 900 Hz to 1100 Hz.
  • the sound wave treatment is preferably to process the sound wave of 900 Hz to 1100 Hz with a loudness of 50 to 100 dB for 4 to 8 hours, and to a loudness of 80 dB (decibel) for 6 hours at 1000 Hz. More preferably, it is not limited thereto.
  • the inventors of the present invention such as 0 Hz, 250 Hz, 500 Hz, 800 Hz, 1 kHz, 1.5 kHz, etc.
  • Single sound waves of the band were treated for 1, 3, 6 and 18 hours and the color change of the tomato was observed.
  • the aging delay effect was the best when treated for 6 hours under 1 kHz monosonic condition, the lag delay effect was negligible in other monosonic conditions and treatment time (Fig. 1).
  • when treated for 1 hour in 1 kHz single sound conditions showed a delayed maturation effect of about 20 ⁇ 30% compared to the control (Fig. 2).
  • the term "sound wave” refers to a phenomenon in which a compressed portion having a relatively high air density and a lean portion having a low air density propagate to the outside formed by the vibration of an object.
  • sound waves are classified into an audible wave having a frequency of approximately 20 to 20000 Hz, an infrasonic wave having a frequency of 20 Hz or less, and an ultrasonic wave having a region of 20000 Hz or more.
  • the general music is composed of composite sound waves, and in the present invention, sound waves of a specific band are used instead of the compound sound waves.
  • Specific sound processing was made using the Adoba Audition 3.0 software (Adobe System Company) program to produce the desired sound waves and processed them on the plants through the speakers mounted in the noise-free growth phase.
  • ripening of fruit used in the present invention means that the fruit of the early solid state is sweetened, flavored, colored, and processed through the process of decreasing organic acid, increasing pigmentation, and increasing respiration. And hemicellulose are decomposed and fruit is softened. In this specification, the maturation of the fruit is used in the same sense as the ripening of the fruit. Changes in the color of the rind are an important indicator of the degree of ripening. In the case of tomatoes, the rind changes from green to orange and red.
  • the method of delaying the maturation of fruit using the sound waves of the present invention may be to delay the maturation of fruit by processing sound waves to suppress the expression of ethylene biosynthesis related genes.
  • the ethylene biosynthesis related gene may be any one or more genes selected from the group consisting of LeACS2, LeACS4 and LeACO1.
  • the plant may be a fruit of the plant.
  • the tomato fruit of the step (mature green) step was harvested and treated with sound waves on the tomato fruit.
  • the fruit is preferably any one selected from the group consisting of tomatoes, apples, pears, bananas, peaches, plums, blueberries, mangoes, apricots, kiwis, pineapples, blueberries, persimmons, melons, avocados and figs, in particular tomatoes Most preferably, but not limited to.
  • ethylene is a hormone that promotes aging of fruits, flowers, and leaves, and is referred to as a ripening hormone or an aging hormone. Inhibiting the production of ethylene delays aging and thus improves the shelf life of plants, which is very useful for freshness and long-term storage of fruits. For this reason, techniques for inhibiting ethylene synthesis and action have been widely used commercially (Postharvest Biology and Technology, vol. 43, no. 1, pp. 23-27 (2007); J. Experimental Botany, vol. 57, no.12, pp.3313-3325 (2006).
  • the present invention estimates the possibility that sonication can inhibit ethylene biosynthesis by analyzing the expression patterns of key genes involved in ethylene synthesis after sonication. It was.
  • the precursor S-adenosyl methionine (SAM) is converted to ACC (1-aminocycloprapane-1-carboxylic acid) by ACC synthase (ACS).
  • the ACC converted in the second step synthesizes the end product ethylene by ACC oxidase (ACO).
  • ACO ACC oxidase
  • two enzymes play a key role in ethylene biosynthesis.
  • ethylene biosynthesis is controlled by two systems, System 1 and System 2.
  • System 1 operates auto-inhibitory in mature growth stages and is present at low levels in all tissues, including non-ripening fruits.
  • LeACS1 (Lycopersicon esculentum ACS1) and LeACS6 (Lycopersicon esculentum ACS6) two genes are associated with one system.
  • LeACS2 Licopersicon esculentum ACS2
  • LeACS4 Two genes are involved.
  • the ripening of respiratory fruits and the aging of petals are carried out by System 2, and expression of ACS and ACO genes is essential.
  • the present inventors observed that the expression of the ACS and ACO genes was suppressed as a result of processing sound waves in the Arabidopsis in the Arabidopsis.
  • LeACO1 gene is closely related to the ripening of tomato fruit (The New phytologist, vol.203, no.1, pp.206-218 (2014); Science, vol. 306, no. 5701, pp. 1513-1515 (2004); Journal of experimental botany, vol. 60, no. 12, pp. 3311-3336 (2009)).
  • ACO1 and ACO4 genes are known to be closely involved in ripening.
  • the ACO1 gene is a representative major gene among ACO genes expressed in mature tomato fruit.
  • ethylene synthesis-related genes that are closely related to ripening by periodically sampling while storing the tomato fruit after sonication Variation patterns of were analyzed by Q-PCR (Quantitative PCR, Real-time PCR).
  • Q-PCR Quantitative PCR, Real-time PCR
  • LeACS1, LeACS6, LeACS2, LeACS4 and ACOs which are essential functions of ethylene biosynthesis related to ripening
  • LeACS1 and LeACS6 genes which are involved in System 1 at low basal levels in all tissues, including non-ripnening fruits, were not significantly affected by sonication regardless of ripening.
  • representative genes involved in the system 2 LeACS2, LeACS4 and LeACO1 genes showed a significant decrease in the amount of expression by sonication (Figs. 4 and 5).
  • the method of delaying the maturation of fruit using sound waves of the present invention can delay the ripening of fruits with short shelf life after harvesting, not only can the economic loss be reduced, but also the maintenance of fresh produce after harvesting in the future ( It can be used for keeping freshness and long term storage.
  • 1 is a graph comparing the ripening degree of tomato fruit after treatment with various single sound waves (0, 250 Hz, 500 Hz, 800 Hz, 1 kHz, 1.5 kHz) for 6 hours and storage at room temperature for 14 hours.
  • Figure 2 is a view showing a photograph comparing the color change of tomato fruit by sonication:
  • Figure 3 is a diagram showing the expression patterns of the LeACS1A and LeACS6 gene by sonication:
  • Figure 4 is a diagram showing the expression patterns of LeACS2 and LeACS4 gene by sonication:
  • Figure 5 is a diagram showing the expression pattern of the LeACO1 gene by sonication:
  • Yongin tomatoes in greenhouses after the harvest in mid-April was not about 500000000000000000 2,014 days of blooming Farmhouse (Solanum lycopersicum ) only the tomato of the stage of myeongsuk (mature green) was selected and used in the experiment.
  • Example ⁇ 1-1> The tomatoes selected in Example ⁇ 1-1> were appropriately placed in a noiseless growth chamber (Soundless Growth Chamber) manufactured by a speaker and treated with sound waves. Acoustic wave treatment was performed for 5 hours of 1, 3, 6 and 18 hours with no single processing and 5 different single sound waves of 250 Hz, 500 Hz, 800 Hz, 1 kHz and 1.5 kHz. , dB) was fixed at 80 dB.
  • single-waves of various frequency ranges such as 250 Hz, 500 Hz, 800 Hz, 1 kHz, 1.5 kHz are selected to be selected in the tomato of the mature green stage.
  • Tomatoes which had been sonicated, were periodically observed for color change while being stored at 24 ° C on the basis of normal temperature distribution, and photographs were taken using a digital camera (EOS550D, Canon, Japan) at the same place. Changes in the color of the skin are an important indicator of the degree of ripening. In the case of tomatoes, the skin changes from green to orange and red.
  • the treatment time of all single sound waves was set to 6 hours.
  • Figure 2 shows a photograph of the change in the skin color after 2 days, 5 days, 7 days, 10 days, 14 days while keeping the tomato fruit treated for 6 hours under 1 kHz single sonic conditions at room temperature.
  • Statistical analysis of the skin color of the tomato fruit showed a maturity delay effect of about 20-30% compared to no treatment at 1 kHz treatment (Fig. 2).
  • Q-PCR quantitative PCR
  • ACS 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase
  • ACO ACC oxidase
  • System 1 In tomato fruit, ethylene biosynthesis is controlled by two systems, System 1 and System 2.
  • System 1 operates in mature growth and is present at low levels in all tissues, including non-ripening fruits, regardless of ripening.
  • Two genes, LeACS1 and LeACS6, are involved in System 1.
  • System 2 functions during fruit and petal aging, involving two genes, LeACS2 and LeACS4, and the expression of the ACS and ACO genes is essential.
  • LeACO1 gene is closely related to ripening of tomato fruit (Journal of Experimental Botany, vol. 53, no. 377, pp. 2057-2063 (2002); Science); , vol. 306, no. 26, pp. 1513-1515 (2004); Journal of Experimental Botany, vol. 60, no. 12, pp. 3311-3336 (2009); The New Phytologist, vol. 203, no. 1, pp. 206-218 (2014)).
  • the ACO1 gene is a representative major gene among the ACO genes expressed in aged tomato fruit.
  • LeACS1, LeACS6, LeACS2, LeACS4 and ACO are key functions of ethylene biosynthesis related to ripening.
  • Example 2 the sonication conditions of the tomato fruit were sonicated. Specifically, according to the experimental method described in ⁇ Example 1> after harvesting tomato was treated with a single sound of 1 kHz for 6 hours. During the sonication, the tomato fruit was sampled periodically and the expression patterns of the five genes of Example ⁇ 3-1> were analyzed by Q-PCR.
  • the tomato fruit of the Green Green stage was periodically sampled for 14 days after 6 hours of treatment at 1 kH, and frozen at liquid nitrogen immediately after sampling, and then stored at -121 ° C. until used for the experiment.
  • Isolation of tomato RNA was extracted using a plant RNeasy extraction kit (Qiagen) using 100 mg of ground tomato powder.
  • CDNA was synthesized using ampfiRivert Platinum cDNA Synthesis Master Mix (GenDEPOT, South Korea) using 2 ⁇ g of extracted total RNA.
  • qPCR real-time quantitative PCR
  • StepOnePlus TM Real-Time PCR Systems, Applied Biosystems was performed with SYBR Premix Ex TaqTM kit (TaKaRa).
  • PCR condition is holding cycle (Holding Stage) 95 °C 1 minute, cycling stage (Cycling Stage) 95 °C 5 seconds, 60 °C 34 seconds conditions 40 cycles, Melting Curve Stage (Melting Curve Stage) 95 °C 15 seconds 60 ° C. for 1 minute and 95 ° C. for 15 seconds.
  • LeACS1 and LeACS6 genes related to System 1 maintains a certain level of expression in the mature green phase, but has a pattern in which the expression level decreases significantly when ripening begins.
  • the LeACS1 gene increased up to 1 day after sonication, and the LeACS6 gene increased up to 2 days after sonication and then decreased.
  • the expression of LeACS1 and LeACS6 genes increased and decreased repeatedly without any pattern. From these results, the effect of sound waves on the expression of LeACS1 and LeACS6 genes was estimated to be very small (FIG. 3).
  • LeACS2 and LeACS4 genes related to System 2 which regulates fruit ripening and petal aging, were different when treated with sound waves. Specifically, in the absence of sound processing, the expression level was maintained until 10 days, but the expression increased rapidly up to 3,000-fold for LeACS2 gene and about 1,400-fold for LeACS4 gene between 12 and 14 days. Showed.
  • the expression of the LeACS2 and LeACS4 genes decreased and increased slightly after 7 days after sonication, but the increase in the amount of expression was so small that it was incomparable with the sonic treatment (Fig. 4). Therefore, it can be estimated from the fact that as the expression of LeACS2 and LeACS4 genes decreased, the amount of ethylene synthesis decreased accordingly.

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Abstract

본 발명은 특정 음역대의 음파처리에 의한 과실의 성숙을 지연시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 음파처리한 식물의 과실은 에틸렌 생합성 유전자의 발현이 억제되어 과실의 성숙이 지연되었으므로, 수확 후 농산물의 선도유지 및 장기저장에 활용이 가능한 효과가 있다.

Description

음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법
본 발명은 특정 음역대의 음파처리에 의한 과실의 성숙을 지연시키는 방법에 관한 것이다.
과실은 익는 동안 호흡발생 패턴에 따라 2가지 유형으로 구분되는데 토마토, 사과, 복숭아 등은 호흡급등형(Climacteric type)에 속하는 과실로서 숙성하는 동안 호흡이 급증하고 그에 따라 에틸렌의 발생량도 급속히 증가한다. 한편 포도와 밀감등 비호흡 급등형(Non-climacteric type) 과실은 호흡의 변화가 거의 없으며, 따라서 에틸렌의 발생도 미미하다.
에틸렌은 식물호르몬으로서 과실의 숙성, 종자발아, 과실과 꽃 그리고 잎의 노화와 잎과 꽃등의 탈리등 다양한 과정에 관여한다. 에틸렌은 과실의 숙성에 필수적인 호르몬으로 에틸렌의 발생이 차단되거나, 에틸렌을 인지하지 못하면 과실은 알맞게 숙성되지 못하기 때문에, 에틸렌의 생성을 억제시키면 노화가 지연되고 저장기간도 연장된다. 과실은 에틸렌이 있을 경우 급격히 익기 시작하여 먹기에 적합한 숙성상태에 이르고 이 단계를 지나면 노화라고 불리는 품질저하 과정이 진행되게 된다. 과실류나 농작물의 선도유지 및 장기저장을 위해 에틸렌 합성 및 작용을 억제하는 기술은 오랫동안 연구되어 왔으며, 상업적으로도 널리 이용되고 있다(Postharvest Biology and Technology, vol.43, no.1, pp.23-27(2007년); Journal of experimental botany, vol.57, no.12, pp.3313-3325(2006년)).
일본 공개특허공보 제2005-117919호는 식물의 에틸렌 생성 억제 방법에 관한 것으로, Ni, Cu, Co의 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 금속 이온을 식물의 외부로부터 흡수시킴으로써, ACC 산화 효소와 철이온과의 결합을 방지하는 것을 특징으로 하는 식물의 에틸렌 생성 억제 방법을 개시하고 있다. 그러나 음파 처리를 통해 식물의 에틸렌 생성을 억제하는 기술은 알려지지 않았다.
이에 본 발명자들은 식물을 특정 음역대의 음파로 처리하여 에틸렌 합성을 억제함으로써 과실의 성숙이 지연되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
(특허문헌 1) 일본 공개특허공보 제2005-117919호
(비특허문헌 1) Postharvest Biology and Technology, vol.43, no.1, pp.23-27(2007년)
(비특허문헌 2) Journal of experimental botany, vol.57, no.12, pp.3313-3325(2006년)
본 발명의 목적은 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 식물에 900 Hz 내지 1200 Hz의 음파, 바람직하게는 900 Hz 내지 1100 Hz의 음파를 처리하는 것을 포함하는 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법을 제공한다.
상기 음파 처리는 900 Hz 내지 1100 Hz의 음파를 4시간 내지 8시간 동안 50 내지 100 dB의 소리 크기로 처리하는 것이 바람직하며, 1000 Hz에서 6시간 동안 80 dB(데시벨)의 소리 크기로 처리하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명자들은 성숙 지연효과가 있는 최적의 음역대와 처리시간을 선발하고자 녹숙과 단계의 토마토에 0 Hz, 250 Hz, 500 Hz, 800 Hz, 1 kHz, 1.5 kHz 등 다양한 음역대의 단일음파를 1, 3, 6, 18시간 동안 처리하고 토마토의 색상변화를 관찰하였다. 그 결과, 1 kHz 단일음파조건으로 6시간 동안 처리하였을 때 숙기지연 효과가 가장 우수하였으며, 다른 단일음파조건 및 처리 시간에서는 숙기지연 효과가 미미하였다(도 1). 또한, 1 kHz 단일음파조건으로 6시간 동안 처리하였을 때 대조군에 비해 약 20~30% 정도의 숙기지연 효과를 보였다(도 2).
본 발명에서 사용된 용어, "음파"는 물체의 진동에 의해 형성된 공기 밀도가 상대적으로 높은 압축부와 공기 밀도가 낮은 희박부가 외부로 전파되는 현상을 말한다. 진동수에 따라 음파는 진동수가 대략 20~20000 Hz인 가청음파(audible wave), 진동수가 20 Hz 이하의 영역인 저음파(infrasonic wave), 20000 Hz 이상의 영역인 초음파(ultrasonic wave)로 구분된다. 일반적인 음악은 복합 음파로 구성되어 있으며, 본 발명에서는 복합 음파가 아닌 특정 음역대의 음파를 이용하였다. 특정음파처리는 Adoba Audition 3.0 software(Adobe System Company) 프로그램을 이용하여 원하는 음파를 만들어서 무소음 생장상 내에 장착된 스피커를 통해 식물체에 처리하였다.
본 발명에서 사용된 용어, "과실의 성숙(ripening of fruit)"이란 초기의 단단한 상태의 과실이 유기산의 감소, 색소의 증가, 호흡 상승 등의 과정을 거쳐 감미, 향기, 색상을 띠고 세포벽의 펙틴질과 헤미셀룰로오스가 분해되어 과실이 연해지는 과정을 의미한다. 본 명세서에서 과실의 성숙은 과실의 숙성과 동일한 의미로 사용되었다. 과피 색상의 변화는 숙성의 정도를 나타내는 중요한 지표로 토마토의 경우 익으면서 과피가 녹색에서 주황색, 적색으로 변한다.
본 발명의 음파를 이용해 과실의 성숙을 지연시키는 방법은, 음파를 처리해 에틸렌 생합성 관련 유전자의 발현을 억제하는 것에 의하여 과실의 성숙을 지연시키는 것일 수 있다.
상기 에틸렌 생합성 관련 유전자는 LeACS2, LeACS4 및 LeACO1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자일 수 있다.
상기 식물은 식물의 과실일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 녹숙과(mature green) 단계의 토마토과실을 수확하여 토마토과실에 음파를 처리하였다.
상기 과실은 토마토, 사과, 배, 바나나, 복숭아, 자두, 블루베리, 망고, 살구, 키위, 파인애플, 참다래, 감, 멜론, 아보카도 및 무화과로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, 특히 토마토가 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, "에틸렌(ethylene)"은 과실이나 꽃, 그리고 잎의 노화를 촉진하는 호르몬으로서, 성숙(ripening)호르몬 혹은 노화호르몬이라고 일컫는다. 에틸렌의 생성을 억제하면 노화가 지연되고 따라서 식물의 저장성도 향상되어 과실류의 선도유지 및 장기저장에 매우 유용하다. 이러한 이유로 에틸렌 합성 및 작용을 억제하는 기술은 상업적으로 널리 이용되고 있다(Postharvest Biology and Technology, vol.43, no.1, pp.23-27(2007년); J. Experimental Botany, vol.57, no.12, pp.3313-3325(2006년)). 수확후 농산물의 성숙 및 후숙은 에틸렌의 생성과 밀접하게 연관되어 진행되므로 본 발명에서는 음파처리후 에틸렌 합성에 관여하는 핵심유전자들의 발현양상을 분석함으로써 음파처리가 에틸렌 생합성을 억제시킬 수 있는지 가능성을 추정하였다.
에틸렌의 생합성 경로의 첫 번째 단계에서 전구물질인 S-아데노실 메티오닌(S-adenosyl methionine; SAM)이 ACC 생성효소(ACC synthase; ACS)에 의해 ACC (1-aminocycloprapane-1-carboxylic acid)로 전환되고, 두 번째 단계에서 전환된 ACC가 ACC 옥시다아제(ACC oxidase; ACO)에 의해 최종산물인 에틸렌을 합성하게 된다. 이처럼 에틸렌 생합성에는 ACS와 ACO, 두 개의 효소가 핵심적인 역할을 한다. 토마토과실에서 에틸렌 생합성은 시스템(System) 1과 시스템 2의 두 개의 시스템으로 조절된다. 시스템 1은 오토-인히비토리(auto-inhibitory)하게 성숙생장기에 작동하며, 비성숙(non-ripening) 열매를 포함한 모든 조직에서 낮은 농도(basal level)로 존재한다. LeACS1(Lycopersicon esculentum ACS1)와 LeACS6(Lycopersicon esculentum ACS6) 두 개의 유전자는 시스템 1과 관련이 있다. 시스템 2는 과실과 꽃잎이 노화되는 동안에 기능하며, 여기에는 LeACS2(Lycopersicon esculentum ACS2)와 LeACS4(Lycopersicon esculentum ACS4) 두 개의 유전자가 관여한다. 호흡급등형 과실의 성숙(ripening)과 꽃잎의 노화 등은 시스템 2에 의해 진행되고, ACS 와 ACO 유전자의 발현이 필수적으로 요구된다. 본 발명자들은 선행연구에서 애기장대에 다양한 음역대의 음파를 처리한 결과, 상기의 ACS 와 ACO 유전자의 발현이 억제되는 것을 관찰하였다. LeACS2와 LeACS4유전자와 함께 LeACO1 유전자도 토마토과실의 숙성과 밀접한 연관이 있다는 연구결과가 많이 보고되고 있다(The New phytologist, vol.203, no.1, pp.206-218(2014년); Science, vol.306, no.5701, pp.1513-1515(2004년); Journal of experimental botany, vol.60, no.12, pp.3311-3336(2009년)). ACO 유전자들 중에는 ACO1 과 ACO4 유전자가 성숙(ripening)에 밀접하게 관여하고 있는 것으로 알려져 있는데, 특히 ACO1 유전자는 숙성된 토마토과실에서 발현되고 있는 ACO 유전자들 중 대표적인 주(major)유전자이다.
본 발명의 일 구체예에서, 숙기지연의 원인을 분자생물학적으로 규명함으로써 음파의 효과를 학술적으로 밝혀 보고자, 음파처리가 완료된 토마토과실을 보관하면서 주기적으로 샘플링하여 숙성과 밀접한 관련이 있는 에틸렌 합성 관련 유전자의 변이양상을 Q-PCR(Quantitative PCR, Real-time PCR)로 분석하였다. 특히, 숙성과 관련된 에틸렌 생합성에 핵심적인 기능을 하는 5개의 유전자, LeACS1, LeACS6, LeACS2, LeACS4 및 ACO들의 발현양상을 분석하였다. 그 결과, 숙성과 무관하게 비성숙(non-ripnening) 열매를 포함한 모든 조직에서 낮은 농도(basal level)로 존재하는 시스템 1에 관여하는 유전자인 LeACS1과 LeACS6 유전자는 음파처리에 의해 크게 영향을 받지 않았다(도 3). 그러나, 시스템 2에 관여하는 대표적인 유전자인 LeACS2, LeACS4 및 LeACO1 유전자는 음파처리에 의해 발현 양이 현저히 감소하는 결과를 보였다(도 4 및 도 5).
따라서, 본 발명에 따라 식물에 음파를 처리하면 LeACS2, LeACS4 및 LeACO1 유전자의 현저한 발현 감소로 인하여 에틸렌 합성이 감소 되고, 그에 따라 전반적인 숙성과정이 지연되는 것으로 판단할 수 있었다.
본 발명의 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법을 이용하면 수확 후 저장수명이 짧은 과실의 숙기를 지연시킬 수 있으므로, 경제적 손실을 절감할 수 있을 뿐 아니라 향후 보다 광범위한 수확 후 농산물의 선도유지(keeping freshness) 및 장기저장에 활용이 가능할 것이다.
도 1은 다양한 단일음파(0, 250 Hz, 500 Hz, 800 Hz, 1 kHz, 1.5 kHz)를 토마토과실에 6시간 동안 처리하고 실온 보관 14일 후, 토마토과실의 숙성 정도를 비교한 그래프이다.
도 2는 음파처리에 의한 토마토과실의 색상변화를 비교한 사진을 나타낸 도이다:
무처리, 음파를 처리하지 않음; 및
음파처리, 1 kHz의 단일음파를 6시간 동안 처리함.
도 3은 음파처리에 의한 LeACS1A와 LeACS6 유전자의 발현양상을 나타낸 도이다:
Control, 음파를 처리하지 않음; 및
Sound treatment, 1 kHz의 단일음파를 6시간 동안 처리함.
도 4는 음파처리에 의한 LeACS2와 LeACS4 유전자의 발현양상을 나타낸 도이다:
Control, 음파를 처리하지 않음; 및
Sound treatment, 1 kHz의 단일음파를 6시간 동안 처리함.
도 5는 음파처리에 의한 LeACO1 유전자의 발현양상을 나타낸 도이다:
Control, 음파를 처리하지 않음; 및
Sound treatment, 1 kHz의 단일음파를 6시간 동안 처리함.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실시예 1> 음파 처리한 토마토과실의 준비
<1-1> 토마토의 준비
경기도 용인시 농가의 온실에서 2014년 4월 중순경 개화한 지 약 50일 후에 수확한 토마토(Solanum lycopersicum)로 녹숙과(mature green) 단계의 토마토만 선별하여 실험에 사용하였다.
<1-2> 음파처리
상기 실시예 <1-1>에서 선별한 토마토를 스피커가 설치된 무소음 생장상(Soundless Growth Chamber; (주)한국과기산업 제조) 내에 적절히 배치시킨 후 음파를 처리하였다. 음파처리는 무(無)처리와 250 Hz, 500 Hz, 800 Hz, 1 kHz, 1.5 kHz의 5종류의 각기 다른 단일음파를 1, 3, 6, 18시간 동안 처리하였고, 이때 소리의 크기(데시벨, dB)는 80 dB로 고정하였다.
<실시예 2> 음파처리에 의한 토마토과실의 성숙 지연효과 검정
성숙 지연효과가 있는 최적의 음역대와 처리시간을 선발하고자 선별된 녹숙과(mature green) 단계의 토마토에 250 Hz, 500 Hz, 800 Hz, 1 kHz, 1.5 kHz 등 다양한 음역대의 단일음파를 1, 3, 6, 18시간 동안 처리한 후, 실온 보관하면서 주기적으로 토마토의 색상변화를 관찰하고 촬영하였다. 음파처리가 완료된 토마토는 상온 유통을 기준으로 24℃에 저장하면서 주기적으로 색상변화를 관찰하였으며, 사진촬영은 동일장소에서 디지털카메라(EOS550D, Canon, Japan)을 이용하여 촬영하였다. 과피 색상의 변화는 숙성 정도를 나타내는 중요한 지표로 토마토의 경우 익으면서 과피가 녹색에서 주황색, 적색으로 변한다.
단일음파 처리 시간에 따른 토마토의 색상변화를 관찰한 결과, 단일음파를 1, 3, 18시간 동안 처리하였을 경우 처리효과가 미미하거나 대조군에 비하여 결과가 좋지 않았다. 따라서 하기 실험에서는 모두 단일음파의 처리 시간을 6시간으로 설정하였다.
도 1에 각각의 단일음파를 6시간 동안 처리한 후, 실온 보관 14일 후의 토마토 과피 색상별 비율을 그래프로 나타내었다. 처리된 음파별로 토마토의 색상변화 정도가 달랐으나, 1 kHz 단일음파조건으로 6시간 동안 처리하였을 때 숙기지연 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다(도 1).
또한, 도 2에 1 kHz 단일음파조건으로 6시간 동안 처리한 토마토과실을 실온 보관하면서 2일, 5일, 7일, 10일, 14일 후 과피 색상의 변화를 촬영한 사진을 나타내었다. 토마토과실의 과피 색상을 통계처리한 결과, 1 kHz 처리 시 무처리에 비해 약 20~30% 정도의 숙기지연 효과를 보였다(도 2).
<실시예 3> 음파처리에 의한 에틸렌 합성 관련 유전자의 발현양상 분석
숙기지연의 원인을 분자생물학적으로 규명함으로써 음파의 효과를 학술적으로 밝혀 보고자, 음파처리가 완료된 토마토과실을 보관하면서 주기적으로 샘플링하여 숙성과 밀접한 관련이 있는 에틸렌 합성 관련 유전자의 변이양상을 Q-PCR(Quantitative PCR, Real-time PCR)로 분석하였다.
<3-1> 발현양상을 분석할 유전자의 선정
에틸렌 생합성에는 1-아미노사이클로프로판-1-카르복실산 합성효소(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase; ACS)와 ACC 옥시다아제(ACC oxidase; ACO) 두 개의 효소가 핵심적인 역할을 한다.
토마토과실에서 에틸렌 생합성은 시스템 1과 시스템 2의 두 개의 시스템으로 조절된다. 시스템 1은 성숙생장기에 작동하며 숙성과 무관하게 비성숙(non-ripening) 열매를 포함한 모든 조직에서 낮은 농도(basal level)로 존재하며, LeACS1과 LeACS6 두 개의 유전자가 시스템 1에 관련이 있다. 시스템 2는 과실과 꽃잎이 노화되는 동안에 기능하며, 여기에는 LeACS2와 LeACS4 두 개의 유전자가 관여하고, ACS와 ACO 유전자의 발현이 필수적으로 요구된다.
LeACS2와 LeACS4 유전자와 함께 LeACO1 유전자도 토마토과실의 숙성과 밀접한 연관이 있다는 연구결과가 많이 보고되고 있다(Journal of Experimental Botany, vol.53, no.377, pp.2057-2063(2002년); Science, vol.306, no.26, pp.1513-1515(2004년); Journal of Experimental Botany, vol.60, no.12, pp.3311-3336(2009년); The New Phytologist, vol.203, no.1, pp.206-218(2014년)). ACO1 유전자는 숙성된 토마토과실에서 발현되고 있는 ACO 유전자들 중 대표적인 주(major)유전자이다.
그러므로 숙성과 관련된 에틸렌 생합성에 핵심적인 기능을 하는 5개의 유전자, LeACS1, LeACS6, LeACS2, LeACS4 및 ACO들의 발현양상을 분석하였다.
<3-2> 토마토과실의 음파처리 조건
<실시예 2>에서 가장 효과가 좋은 것으로 나타난 음파처리 조건으로 토마토과실에 음파처리를 하였다. 구체적으로, <실시예 1>에 기재된 실험 방법에 따라 수확 후 토마토에 1 kHz의 단일음파를 6시간 동안 처리하였다. 음파처리가 완료된 토마토과실을 보관하면서 주기적으로 샘플링하여 상기 실시예 <3-1>의 5개의 유전자의 발현양상을 Q-PCR로 분석하였다.
보다 상세하게는, 녹숙(Mature Green) 단계의 토마토 열매를 1kH에서 6시간 처리 후 14일간 보관하면서 주기적으로 샘플링하였으며 샘플링 즉시 액체질소에 얼린 후 실험에 사용할 때까지 -121℃에 보관하였다. 토마토 RNA의 분리는 마쇄한 토마토의 분말 100mg을 사용하여 Plant RNeasy extraction kit (Qiagen)를 이용해서 추출하였다. 추출된 전체 RNA 2㎍을 이용해서 ampfiRivert Platinum cDNA Synthesis Master Mix (GenDEPOT, South Korea)로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA 30ng을 이용해 SYBR Premix Ex TaqTM kit (TaKaRa)로 실시간 정량 PCR(real-time quantitative PCR, qPCR; StepOnePlus™ Real-Time PCR Systems, Applied Biosystems)을 수행하였다. 이때 PCR 조건은 홀딩 단계(Holding Stage)는 95℃ 1분, 사이클링 단계(Cycling Stage)는 95℃ 5초, 60℃ 34초 조건으로 40 사이클, 멜팅 커브 단계(Melting Curve Stage)는 95℃ 15초, 60℃ 1분, 95℃ 15초 조건으로 설정하여 수행하였다.
<3-3> 에틸렌 생합성 관련 유전자의 발현양상 분석
먼저 시스템 1과 관련 있는 LeACS1, LeACS6 유전자의 발현은 녹숙(mature green)기에는 일정수준의 발현량을 유지하다가 숙성이 시작되면 발현량이 현저히 감소하는 패턴을 가진다. 도 3에 나타난 바와 같이, 음파 무(無)처리에서는 LeACS1 유전자는 음파처리 후 1일까지 증가, LeACS6 유전자는 음파처리 후 2일까지 증가하다가 그 이후에는 감소하는 경향을 보였다. 그러나, 음파를 처리한 경우, 일정한 패턴이 없이 LeACS1 및 LeACS6 유전자의 발현이 증가와 감소가 반복되는 현상을 보였다. 이 결과로 미루어 볼 때, LeACS1 및 LeACS6 유전자의 발현에 미치는 음파의 영향은 아주 미약한 것으로 추정되었다(도 3).
반면, 과실의 성숙(ripening)과 꽃잎의 노화 등을 조절하는 시스템 2와 관련있는 LeACS2와 LeACS4 유전자의 발현양상은 음파를 처리하였을 때 차이를 보였다. 구체적으로, 음파를 무(無)처리에서는 10일 후까지 일정 수준의 발현양이 유지되다가 12~14일 사이에 LeACS2 유전자는 최대 3,000배, LeACS4 유전자는 최대 약 1,400배 정도로 발현이 급격히 증가하는 양상을 보였다. 그에 비하여 음파 처리 시에는 7일 후까지는 LeACS2 및 LeACS4 유전자의 발현이 감소하다가 그 후에 약간 증가하는 경향이었으나, 발현량의 증가는 음파 무(無)처리와는 비교가 되지 않을 정도로 아주 미미하였다(도 4). 그러므로 LeACS2 및 LeACS4 유전자들의 발현이 감소됨에 따라 에틸렌의 합성량도 그만큼 감소하였다는 것을 미루어 추정할 수 있다.
또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 음파 무(無)처리 시에 토마토과실의 숙성이 진행되면서 에틸렌 합성 증가와 함께 ACO1 유전자의 발현도 증가하는데, 음파 처리한 경우에는 ACO1 유전자의 발현이 무(無)처리에 비해 현저히 감소되는 경향을 보였다. 음파처리에 의해 LeACS2와 LeACS4 유전자의 발현 감소와 더불어 ACO1 유전자의 발현 감소도 에틸렌 합성 억제의 원인으로 작용한 것으로 생각된다.
지금까지의 결과들을 종합해 볼 때, 숙성과 무관하게 비성숙(non-ripnening) 열매를 포함한 모든 조직에서 낮은 농도(basal level)로 존재하는 시스템 1에 관여하는 유전자인 LeACS1과 LeACS6 유전자는 음파처리에 의해 크게 영향을 받지 않았다. 그러나, 시스템 2에 관여하는 대표적인 유전자인 LeACS2, LeACS4 및 LeACO1 유전자는 음파처리에 의해 발현양이 현저히 감소하는 결과를 보였다.
따라서, 음파처리시 LeACS2, LeACS4 및 LeACO1 유전자의 현저한 발현 감소로 인하여 에틸렌 합성이 감소되고 그에 따라 전반적인 숙성과정이 지연되는 것으로 판단된다.

Claims (6)

  1. 식물에 900 Hz 내지 1200 Hz의 음파를 처리하는 것을 포함하는 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 음파 처리는 900 Hz 내지 1100 Hz의 음파를 4시간 내지 8시간 동안 50 내지 100 dB의 소리 크기로 처리하는 것을 특징으로 하는 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 음파를 처리해 에틸렌 생합성 관련 유전자의 발현을 억제하는 것에 의하여 과실의 성숙을 지연시키는 것을 특징으로 하는 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 에틸렌 생합성 관련 유전자는 LeACS2, LeACS4 및 LeACO1로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 식물은 식물의 과실인 것을 특징으로 하는 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 과실은 토마토, 사과, 배, 바나나, 복숭아, 자두, 블루베리, 망고, 살구, 키위, 파인애플, 참다래, 감, 멜론, 아보카도 및 무화과로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 음파를 이용한 과실의 성숙을 지연시키는 방법.
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