WO2016174648A1 - Pérolas de ureia combinadas com aldiminas, processo de obtenção e usos na agricultura, e aplicações das aldiminas no tratamento de infecções bacterianas - Google Patents

Pérolas de ureia combinadas com aldiminas, processo de obtenção e usos na agricultura, e aplicações das aldiminas no tratamento de infecções bacterianas Download PDF

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WO2016174648A1
WO2016174648A1 PCT/IB2016/052491 IB2016052491W WO2016174648A1 WO 2016174648 A1 WO2016174648 A1 WO 2016174648A1 IB 2016052491 W IB2016052491 W IB 2016052491W WO 2016174648 A1 WO2016174648 A1 WO 2016174648A1
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WO
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urea
aldimines
aldimine
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och
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PCT/IB2016/052491
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French (fr)
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Luzia VALENTINA MODOLO
Ângelo DE FATIMA
Leandro TORRES DE SOUZA
Lívia PEREIRA HORTA
Cleiton MOREIRA DA SILVA
Gisele MARIA BARBOSA
Luiza BRAGA FERREIRA
Ivanildo EVÓDIO MARRIEL
Original Assignee
Universidade Federal De Minas Gerais - Ufmg
Fundação De Amparo À Pesquisa Do Estado De Minas Gerais- Fapemig
Embrapa
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05C—NITROGENOUS FERTILISERS
    • C05C9/00—Fertilisers containing urea or urea compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C05G3/90—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity for affecting the nitrification of ammonium compounds or urea in the soil

Definitions

  • the present invention relates to aldimine-combined urea pearls, as well as their process of obtaining and applications as an enhanced agricultural efficiency nitrogen fertilizer, in addition to the use of aldimines alone as urease inhibitors for treatment of Helicobacter pylori infections.
  • aldimines are important compounds for the development of new urease inhibitors of agricultural and clinical interest.
  • NBPT N-butyltriamide thiophosphate
  • aldimines important compounds for the development of new urease inhibitors of agricultural and clinical interest.
  • aldimine-combined urea beads were as effective as or more effective than NBPT-combined urea beads in improving the growth and development of Poaceae plants, such as millet.
  • NBPT is marketed for agricultural purposes as the main component of a liquid mixture composed of stabilizers. It is up to the farmer to add this NBPT-containing mixture to the urea according to the manufacturer's set proportions before the urea-based formulation can be used for soil fertilization.
  • urea pearls combined with aldimines constitute a This product is very attractive to the farmer, as it does not require any preparation before its use in soil fertilization, as well as the convenience of transporting the point of sale of the agricultural input to the place of use by the farmer.
  • the present invention is therefore used to inhibit ureases enzymes present in soil microbiota, enabling greater uptake and use of nitrogen by plants, thereby increasing food productivity.
  • it can be used in alternative therapy to combat diseases caused by pathogenic microorganisms dependent on the activity of the urease enzyme, especially in controlling infections caused by Helicobacter pylori, as demonstrated by the excellent inhibitory activities of Canavalia ensiformis purified urease enzyme, that this substance class presented.
  • Agricultural production is responsible for generating 23% of Gross Domestic Product (GDP) in Brazil and the country is the fourth largest consumer of fertilizers in the world, with consumption only lower than China, India and the United States.
  • GDP Gross Domestic Product
  • the Brazilian fertilizer industry is unable to meet domestic demand and the need to import large quantities of these inputs generates external dependence and causes deficits in the balance.
  • Nitrogen is one of the chemical elements that plants require the most because it is an essential component for the formation of biomolecules such as amino acids, nucleic acids and chlorophylls, which play a key role in the integrity and function of plant cells. Thus, deficiency of this nutrient impairs plant growth and development and the use of nitrogen fertilizers considerably increases agricultural productivity.
  • Urea was the first organic molecule to be synthesized from the combination of ammonia and carbon dioxide, consisting of one of the most widely used nitrogen fertilizers in the world.
  • the structure of this compound is constituted by 46% of N in the amidic form and, because it contains high nitrogen content in relation to the other nitrogen fertilizers, the urea has the most attractive price per tonne of N on the market.
  • urea production also has the lowest transportation and storage costs. This substance is applied at planting or in cover, in the form of granules, and ease of management is another factor that contributes to its use.
  • Urea-based fertilizers are widely used in the fertilization of forage grasses, no-tillage maize crops, citrus, coffee and rice.
  • Ureases occur in various living organisms such as plants, bacteria, fungi, algae and invertebrates. In the presence of these enzymes, urea hydrolysis is about 10 14 times faster. Thus, nitrogen, an essential element for protein and nucleic acid synthesis, is readily available to organisms. Due to such catalysis, ureases can rapidly hydrolyze soil-applied urea, resulting in significant nitrogen losses resulting in low agricultural productivity.
  • Urea can be rapidly hydrolyzed (2 to 3 days), depending on soil temperature and humidity, as well as the amount and form in which this fertilizer is applied.
  • the ureolytic activity of soils therefore, has great relevance for agriculture. This activity occurs in the soil due to the presence of microorganisms and organic matter of plant origin. Besides economic damage, rapid hydrolysis of urea also causes environmental damage as the ammonia produced is known to be an air pollutant. Excessive release of NH 3 , due to the increasing demand for fertilizer use, gradually unbalances the global N cycle, which can lead in the long run to disastrous environmental consequences. Additionally, the excessive use of urea as fertilizer leads to contamination of water bodies by NO3 " leaching, which is repelled by negative soil charges, reaching the water table.
  • Slow release fertilizers are formed by condensation compounds of urea and urea-aldehydes, characterized by low solubility.
  • Controlled-release fertilizers are sulfur-coated products or polymers, which provide a physical barrier against nutrient exposure, which is gradually and gradually released into the environment. Both types of fertilizers have a high production cost, restricting their use to high value-added market niches such as seedling nurseries and gardening.
  • Stabilized fertilizers contain additives such as urease and nitrification inhibitors. These products reduce N losses by delaying the hydrolysis of the nitrogenous compound.
  • stabilized fertilizer options those containing urease inhibitors are the most commercially available, including in Brazil.
  • the use of stabilized fertilizers with urea inhibitors provides for the application of smaller amounts of agricultural input to the soil, resulting in reduced emissions of polluting gases and water contamination due to product leaching.
  • ureases are objects of study for the potential inhibition of the activity of ureases of agricultural interest. By preventing rapid hydrolysis, inhibitors increase the chances that rainfall, irrigation or mechanical operations will incorporate urea into the soil.
  • Compounds with the potential to act as urease inhibitors may be divided into the following groups according to the function of their structures and modes of binding with the enzyme: i) metals; ii) agents capable of complexing the Ni 2+ ion (s) present at the active urease site; iii) structural compounds analogous to urea that compete with the active site of the enzyme.
  • Figure 1 Among the most investigated compounds ( Figure 1) are thiourea, thiols ( ⁇ -mercaptoethanol), acetohydroxamic acid, amides and esters of phosphoric acid (phenyl phosphorodiamidate (PPD), phosphoric triamide (PTA) and N-butyltriamide thiophosphate (NBPT)), boric acid, metal complexes containing Hg 2+ , Ag + and Cu 2+ , phosphate buffer pH ⁇ 7.5, as well as quinones.
  • PPD phenyl phosphorodiamidate
  • PTA phosphoric triamide
  • NBPT N-butyltriamide thiophosphate
  • NBPT V-Butyltriamide Phosphate
  • SANZ-COBENA A. et al. Effect of water addition and the urease inhibitor NBPT on the abatement of ammonia emission from surface applied Atmospheric Environment 45: 1517-1524, 201 1).
  • this substance only becomes a potent urease inhibitor after undergoing biotransformation by soil microbiota, resulting in oxo-NBPT ( Figure 2). Its binding to urease decreases the rate of urea hydrolysis over a period of approximately 14 days (CONTIN, TLM Urea treated with NBPT urease inhibitor in sugarcane fertilization harvested without firing.
  • One of the main commercially available formulations is a liquid urease inhibitor that can be impregnated directly into urea or tank mixed with urea-containing dry fertilizer liquid such as urea-ammonium nitrate (UAN).
  • UAN urea-ammonium nitrate
  • the active ingredient is thiophosphoric N- (n-butyl) triamide (NBPT).
  • the formulation has in its composition 20-25% of NBPT which must be mixed with nitrogen fertilizers immediately before soil fertilization (CANTARELLA, H .; MARCELINO, R.
  • CANTARELLA, H .; MARCELINO, R. The use of urease inhibitor to increase the efficiency of urea. 1 - Symposium on Recent Information for Agricultural Production Optimization (INPI, Piracicaba, 15-16, 1996). Fits It should be emphasized that the efficiency of this substance as a urease inhibitor is conditioned to its metabolization by soil microbiota. As it is a US patent product, the importation of NBPT costs high costs to agricultural production in Brazil. Thus, it is of great economic interest to develop a commercial formulation based on urea and urease inhibitors of national origin.
  • WO 9722568 describes the use of concentrated triamide / V-alkyl thiophosphoric mixtures in a solvent which may be propylene glycol and / V-methyl pyrrolidone, for inhibition of ureases.
  • WO 2009079994 describes the use as an urease inhibitor of a concentrated solution of N-alkyl thiophosphoric triamide with a compound containing an amino group boiling above 100 ° C.
  • WO 2010072184 describes a liquid composition containing phosphoric or thiophosphoric derivatives of triamide and one or more hydroxy acid esters, heterocyclic alcohols, cyclic carbonic acid esters and dicarboxylic acid esters.
  • the aforementioned technologies have a number of limitations, for example the low storage stability of treated urea, the high toxicity of the solvents used in the formulations and their effects on the aquatic and terrestrial environment. .
  • the present invention addresses these shortcomings.
  • Figure 1 illustrates the combined (and non-combined) urea beads of the present invention with albimine 3B4 or NBPT at different mass / mass ratios.
  • Figure 2 shows the chemical structures of some urease inhibitors.
  • Figure 3 shows the chemical equation of oxo-NBPT / V-butyltriamide phosphate (NBPT) biotransformation.
  • Figure 4 shows the chemical equation that represents the general reaction to obtain an aldimine.
  • Figure 5 shows the chemical structures of Series 3A aldimines.
  • Figure 6 shows the chemical structures of the 3B series aldimines.
  • Figure 7 shows the chemical structures of the 3C series aldimines.
  • Figure 8 shows the chemical structures of the 3D series aldimines.
  • Figure 9 shows the chemical structures of 3E series aldimines.
  • Figure 10 shows the chemical structures of the 3F series aldimines.
  • Figure 11 shows the chemical structures of the G-series aldimines.
  • Figure 12 shows the chemical structures of the 3H and 3l series aldimines.
  • Figure 13 presents the chemical equation representing the reaction between an aromatic aldehyde and an aromatic amine, specific for the synthesis of aromatic aldimine 3A4.
  • Figure 14 shows the infrared spectrum obtained for aromatic aldimine 3A4.
  • Figure 15 shows hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum [ 1 H NMR; 200 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3A4.
  • Figure 16 shows the carbon nuclear magnetic resonance spectrum [ 13 C NMR; 50 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3A4.
  • Figure 17 presents the chemical equation representing the reaction between an aromatic aldehyde and an aromatic amine, specific for the synthesis of aromatic aldimine 3B3.
  • Figure 18 shows the infrared spectrum obtained for aromatic aldimine 3B3.
  • Figure 19 shows the hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum [ 1 H NMR; 200 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3B3
  • Figure 20 shows the carbon nuclear magnetic resonance spectrum [ 13 C NMR; 50 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3B3
  • Figure 21 presents the chemical equation representing the reaction between an aromatic aldehyde and an aromatic amine, specific for the synthesis of aromatic aldimine 3B4.
  • Figure 22 shows the infrared spectrum obtained for aromatic aldimine 3B4.
  • Figure 23 shows hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum [ 1 H NMR; 200 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3B4.
  • Figure 24 shows the carbon nuclear magnetic resonance spectrum [ 13 C NMR; 50 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3B4.
  • Figure 25 presents the chemical equation representing the reaction between an aromatic aldehyde and an aromatic amine, specific for the synthesis of aromatic aldimine 3C4.
  • Figure 26 shows the infrared spectrum obtained for aromatic aldimine 3C4.
  • Figure 27 shows the hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum [ 1 H NMR; 200 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3C4
  • Figure 28 shows the carbon nuclear magnetic resonance spectrum [ 13 C NMR; 50 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3C4
  • Figure 29 presents the chemical equation representing the reaction between an aromatic aldehyde and an aromatic amine, specific for the synthesis of aromatic aldimine 3D4.
  • Figure 30 shows the infrared spectrum obtained for aromatic aldimine 3D4.
  • Figure 31 shows hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum [ 1 H NMR; 200 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3D4.
  • Figure 32 shows the carbon nuclear magnetic resonance spectrum [ 13 C NMR; 50 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3D4.
  • Figure 33 presents the chemical equation representing the reaction between an aromatic aldehyde and an aromatic amine, specific for the synthesis of aromatic aldimine 3D6.
  • Figure 34 shows the infrared spectrum obtained for the 3D6 aromatic aldimine.
  • Figure 35 shows the hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum [ 1 H NMR; 200 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3D6
  • Figure 36 shows the carbon nuclear magnetic resonance spectrum [ 13 C NMR; 50 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3D6
  • Figure 37 presents the chemical equation representing the reaction between an aromatic aldehyde and an aromatic amine specific for the synthesis of aromatic aldimine 3D10.
  • Figure 38 shows the infrared spectrum obtained for the 3D10 aromatic aldimine.
  • Figure 39 shows the hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum [ 1 H NMR; 200 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3D10
  • Figure 40 shows the carbon nuclear magnetic resonance spectrum [ 13 C NMR; 50 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3D10
  • Figure 41 presents the chemical equation representing the reaction between an aromatic aldehyde and an aromatic amine, specific for the synthesis of aromatic aldimine 3E5.
  • Figure 42 shows the infrared spectrum obtained for aromatic aldimine 3E5.
  • Figure 43 shows hydrogen nuclear magnetic resonance spectrum [ 1 H NMR; 200 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3E5
  • Figure 44 shows the carbon nuclear magnetic resonance spectrum [ 13 C NMR; 50 MHz, (CD 3 ) 2 SO] obtained for aromatic aldimine 3E5
  • Figure 45 shows the mass loss percentages of aromatic aldimines 3A4, 3B3, 3B4, 3C4 and NBPT obtained by thermogravimetric analysis (TGA) in nitrogen flow 50 ml_ min “1 and heating ratio 10 ° C min "1 .
  • TGA thermogravimetric analysis
  • Figure 46 shows the mass loss percentages of 3D4, 3D6, 3D10, 3E5 and NBPT aromatic aldimines obtained by thermogravimetric analysis (TGA) at nitrogen flow 50 ml_ min “1 and heating ratio 10 ° C min "1 .
  • TGA thermogravimetric analysis
  • Figure 47 shows the changes in kinetic parameters for Canavalia ensiformis urease in the presence of 3B4 (100 ⁇ or 200 ⁇ ), Michaelis-Menten Plot (left graph); Lineweaver-Burk plot (right graph).
  • Figure 50 shows the relative growth rate of 56-day-old millet plants as a function of treatment with a single dose of urea combined with 3B4 or NBPT at the indicated mass / mass ratios for a period of 30 days.
  • the present invention relates to aldimine-combined urea pearls, as well as their process of obtaining and applications as enhanced agricultural efficiency nitrogen fertilizer ( Figures 48 to 50), in addition to the use of aldimines per se. as urease inhibitors for the treatment of Helicobacter pylori infections (Tables 1 - 12).
  • Aldimines have a wide range of biological activities, such as antifungal, antibacterial, antimalarial, anticancer, anti-inflammatory, antiviral and antipyretic activity. These characteristics make aldimines important compounds for the development of new urease inhibitors of agricultural and clinical interest.
  • the process of obtaining the aldimine-combined urea beads begins first with the synthesis of the aldimines encoded as 3A2 to 3A10; 3B2 to 3B8, and 3B10; 3C2 to 3C10; 3D2 to 3D10; 3E2 to 3E10; 3F2 to 3F6 and 3F8 to 3F10; 3G2 to 3G10; 3H2 to 3H10 and 3I2 (Tables 1 to 8; Figures 5 to 12), comprising the following steps:
  • aldimines a) insertion of ethanolic solutions containing equimolar amounts of an aldehyde and an amine into a microwave reactor.
  • the aldehyde is selected from the group comprising benzaldehyde, 2-hydroxybenzaldehyde, 3-hydroxybenzaldehyde, 4-hydroxybenzaldehyde, 2,3-dihydroxybenzaldehyde, 3,4-dihydroxybenzaldehyde, 2,3,4-trihydroxy -benzaldehyde, piperonal, 4-fluoro-benzaldehyde, trans-cinnamaldehyde, 2-nitro-trans-cinnamaldehyde, 4-nitro-trans-cinnamaldehyde, 4-nitro-benzaldehyde, 4-methoxy-trans-cinnamaldehyde, 4- / V, N-dimethyl franscinmaldehyde, fufuraldehyde, 5-nitrofufuraldehyde and
  • step (b) irradiation of the mixture from step (a) in the microwave reactor at a temperature in the range of 60 to 100 ° C, under maximum power, in the range of 180 to 200 W, with ramp time of 2 to 5 min, 2 to 10 min reaction under maximum agitation followed by cooling; c) purification of aldimine obtained in (b).
  • aldimines 3A2 to 3A10; 3B2 to 3B8 and 3B10; 3C2 to 3C10; 3D2 to 3D10; 3E2 to 3E10; 3F2 to 3F6 and 3F8 to 3F10; 3G2 to 3G10; 3H2 to 3H10 and 3I2 (Tables 1 to 8; Figures 5 to 12) obtained in step (b) were via recrystallization using specific solvents and alone for each aldimine such as methanol, ethanol, butanol, acetonitrile, acetone or ethyl acetate, in the ratio of 1 -5: 10-50 (aldimine mass / solvent volume). Aldimines were obtained in yields ranging from 60 to 100%.
  • the combined urea beads and the aldimines subject to this application were prepared, which involved the following steps: a) dissolving one of the aldimines 3A2 to 3A10; or 3B2 to 3B8, and 3B10; or 3C2 to 3C10; or 3D2 to 3D10; or 3E2 to 3E10; or 3F2 to 3F6 and 3F8 to 3F10; or 3G2 to 3G10; or 3H2 to 3H10; or 3I2 - Tables 1 to 8; Figures 5 to 12 - in an organic solvent at concentrations ranging from 2.5 g / L to 100 g / L; b) After complete solubilization, untreated urea beads were inserted into the aldimine solution obtained in step (a) at a ratio of 5 to 50 kg of urea for each 1 L to 10 L of aldimine solution; c) stirring the urea beads mechanically in the presence of each inhibitor solution obtained in step (
  • each pure aldimin (3A2 to 3A10; 3B2 to 3B8 and 3B10; 3C2 to 3C10; 3D2 to 3D10; 3E2 to 3E10; 3F2 to 3F10; 3F8 to 3F10; 3G2 to 3G10; 3H2 to 3H10 or Tables 1 - 8) occurred in an organic solvent such as acetone, ethanol, methanol, ethanolamine, diethaneamine, triethanolamine or ethyl acetate at concentrations between 2.5 g / L to 100 g / L.
  • an organic solvent such as acetone, ethanol, methanol, ethanolamine, diethaneamine, triethanolamine or ethyl acetate at concentrations between 2.5 g / L to 100 g / L.
  • the finished product comprised embedded / encapsulated or coated urea beads, preferably coated with one of aldimines 3A2 to 3A10; 3B2 to 3B8, and 3B10; 3C2 to 3C10; 3D2 to 3D10; 3E2 to 3E10; 3F2 to 3F6 and 3F8 to 3F10; 3G2 to 3G10; 3H2 to 3H10; or 3I2
  • urea pearls is characterized by being in the inhibition of urea enzymes present in the soil microbiota, preferably in the improvement of millet growth and development; while pure or combined aldimines are used to inhibit ureaolytic activity of ureases, thus constituting an alternative for the treatment of diseases caused by pathogenic microorganisms dependent on urease enzyme activity, preferably in the control of Helicobacter pylori infections. .
  • the 13 C NMR spectrum for aldimine 3A4 shows a total of 9 signals as expected.
  • the hydrogenated carbons signals from both aromatic rings are found, which appear at 15.15, 122.5, 128.3, 128.8 and 130.9 ppm.
  • the 1 H NMR spectrum of said compound shows greater complexity compared to that obtained for aldimine 3A4 due to the additional offsets resulting from ortho substitution in the aromatic ring of the starting aldehyde. Two multiplets are observed at ⁇ 6.80-7.02 and 7.27-7.45 ppm, integrated for four and three hydrogens, respectively.
  • Hydrogen signals from the starting aldehyde aromatic ring are verified as two integrated multiplets for one and three hydrogens at ⁇ 6.87-6.96 and 7.24-7.41 ppm.
  • the characteristic hydrogen signal from group -CH N- appears as a simplet at ⁇ 8.52 ppm.
  • an extended integrated signal for two hydrogens is observed at ô 9.57 ppm, attributed to the phenolic hydroxyl hydrogens.
  • the 13 C NMR spectrum for albimine 3B4 ( Figure 24) shows a total of 11 signals, as expected for the structure in question.
  • the hydrogenated carbon signals of both aromatic rings are observed, which appear at ⁇ 1 13.9, 1 15.2, 1 18.2, 1 19.9, 122.5 and 129, 8 ppm.
  • Four signals regarding unhydrogenated carbons are observed at ⁇ 137.9, 142.6, 156.3 and 157.7 ppm.
  • the 13 C NMR spectrum obtained for aldimin 3D6 shows a total of eleven signals.
  • the 13 C NMR spectrum obtained for aldimine 3D10 shows a total of 9 signals, given the large symmetry shown by the compound.
  • the most shielded region of the spectrum there is a set of four signals referring to the hydrogenated carbons of the aromatic rings, which are observed at ⁇ 1 15.8, 123, 1, 123.9 and 129.0 ppm.
  • Example 9 In vitro studies of the effect of aldimines on the urease activity of Canavalia ensiformis.
  • % IN (NH UR - NH 4 + IN / NH 4 + UR) x 100
  • NH 4 + UR and NH 4 + IN refer to the amounts of ammonium formed in nmols during the incubation period in the absence or presence of inhibitor, respectively.
  • aldimine 3A9 showed the highest potential for inhibition of urease activity (52 and 49%) in reactions containing 10 and 20 mM urea, respectively (Table 1).
  • Compounds 3A4 and 3A8 exhibited efficiency just above 20% (Table 1).
  • the other compounds obtained similar results to thiourea, aldimine 3A6 had no inhibitory activity (Table 1).
  • Table i Result of the effect of aldimines of series 3A on the purified urease activity of Canavalia ensiformis. All test compounds were used at the final concentration of 500 ⁇ .
  • the compound that exhibited the highest percent inhibition of the urease enzyme in the 3C series was 3C4 aldimine (53 and 52%) at 10 and 20 mM urea concentrations (Table 3).
  • Compound 3C3 had an average inhibition of 30%, and molecule 3C10 showed inhibition just above 20% only at the 10 mM urea concentration (Table 3).
  • the results obtained for compounds 3C2, 3C5, 3C6, 3C7 and 3C9 were similar to thiourea, while aldimine 3C8 showed little expressive inhibitory activity (Table 3).
  • aldimines 3D4, 3D5, 3D7, 3D9 and 3D10 exhibited the most significant inhibition percentages of urease enzyme, with results comparable to hydroxyurea (Table 4).
  • Compounds 3D3 and 3D6 showed inhibition percentage just over 20%, while the results obtained for aldimines 3D2 and 3D8 were practically null (Table 4).
  • aldimine 3H2 showed the highest percentage inhibition of urease activity (69 and 69%) at 10 and 20 mM urea concentrations (Table 8).
  • Compounds 3H3, 3H7 and 3H8 showed results just above 20% inhibition (Table 8).
  • Aldimines 3H4, 3H5, 3H9 and 3H10 exhibited poorly expressed urease inhibition, as did the only tested compound in the 31 series ( Figure 12), aldimine 3I2 (Table 8).
  • Example 10 Effect of selected aldimines on soil microbiota ureases activity.
  • the soil fractions were sieved, homogenized and stored at -4 ° C until experimental procedures were performed.
  • the tests were performed with 0.5 g of dry soil, which was incubated for 1 h at 37 ° C, under agitation of 150 rpm, with 72 mM urea solution containing or not each of the aldimines in the final concentration of 500 ⁇ .
  • the reaction was quenched with 5 ml KCl / HCl (both at 1 M) for 30 min with stirring at 150 rpm. After decantation, 20 ⁇ _ aliquots of the supernatant were collected and 100 ⁇ _ of solution containing sodium salicylate, sodium citrate, sodium tartrate and sodium nitroprusside were added.
  • Table 10 Result of the effect of selected aldimines in the in vitro test on the activity of dystrophic latosol microbiota ureases.
  • the aldimine 3D4 had the highest inhibition percentage, being about 1.5 times greater than that presented by the reference inhibitor NBPT (Table 10).
  • Compounds 3C4 and 3D6 also exhibited significant inhibitory activity of the enzyme urease (above 70%), while aldimines 3A4, 3B3, 3B4, 3D10 and 3E5 showed satisfactory efficiency, with inhibition percentages between 62 and 69% (Table 10).
  • the results presented by the other compounds did not surpass the efficiency of the reference inhibitor NBPT (Table 10).
  • Albumin 3B4 and 3D4 were the most promising in inhibiting soil ureolytic activity, with IC50 values of 27 and 52 ⁇ , respectively (Table 11).
  • Compounds 3A4, 3B3, 3B4, 3C4, 3D4, 3D6, 3D10 and 3E5 showed intermediate efficiency, requiring concentrations between 98 and 129 ⁇ to reach the IC50.
  • Albumin 3C4 and 3D6 were less effective, with IC50 values greater than 230 ⁇ (Table 11).
  • Example 11 Thermogravimetry (TG) thermal stability assessment of aromatic aldimines 3A4, 3B3, 3B4, 3C4, 3D4, 3D6, 3D10, and 3E5 compared to NBPT.
  • TG Thermogravimetry
  • NBPT were analyzed using TGA 50H thermobalance (Shimadzu). The samples were packed in alumina crucibles (AI2O3) and the experiments were conducted under a dynamic nitrogen atmosphere under 50 mL min -1 flux. Heating was performed from room temperature to 600 ° C at a rate of 10 ° C min. "1 .
  • Example 12 Determination of aldimin 3D6 inhibition profile on Canavalia ensiformis urease.
  • Example 13 Obtaining Urea Beads Combined with Aromatic Aldimines or NBPT.
  • Each aldimine or NBPT was dissolved in organic solvent such as acetone, ethanol, methanol, ethanolamine, dietanoamine, triethanolamine, ethyl acetate, among others, at concentrations ranging from 2.5 g / L to 100 g / L. .
  • organic solvent such as acetone, ethanol, methanol, ethanolamine, dietanoamine, triethanolamine, ethyl acetate, among others.
  • urea beads were mechanically stirred in the presence of the solutions and kept in hoods at room temperature until complete evaporation of the organic solvents.
  • Representative images of urea beads combined or not with albimine 3B4 or NBPT (0.05% and 0.25%; w / w) are shown in Figure 48.
  • the effect of albimine 3B4 on plant growth and development was investigated in the so ⁇ o-Cenchrus americanus (millet) system under greenhouse cultivation.
  • the experimental design consisted of quadruplicate treatments using urea pearls (150 ppm N) combined with aldimines according to the mass / mass ratio of 0.25%, 0.50% or 1.00%.
  • Urea pearls (150 ppm N) combined with NBPT at the same mass / mass ratios were employed as a positive urease inhibition control.
  • Millet sowing was performed in pots containing 3 kg of sieved dystrophic red latosol soil. Thinning was done after 10 days of sowing, maintaining 8 seedlings (with uniform growth) per pot.
  • Figure 48 illustrates millet shoot development in combination urea or 3B4 aldimine or NBPT cultivation at different doses over a period of 14 days.
  • the contribution of imine 3B4 in increasing millet size was even more pronounced after 30 days of urea treatment combined with this urease inhibitor (Figure 49).
  • the fee of relative growth of shoot height at the end of the experiment (56 days after sowing of which 30 days under combined urea treatment) was more expressive in plants grown in the presence of 0.50% (w / w) 3B4, presenting values comparable to those observed for plants grown in the presence of NBPT at 1.00% (w / w) ( Figure 50).

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Abstract

A matéria trata de um processo de obtenção de pérolas de uréia combinadas com aldimina por meio da adição de pérolas de uréia em uma solução de aldimina em solvente orgânico. Após agitação mecânica e completa homogeneização, procede-se a evaporação do solvente orgânico. O produto obtido por tal processo compreende pérolas de ureia incorporadas/encapsuladas ou revestidas com aldimina. Tais pérolas de ureia são usadas na inibição de enzimas ureases presentes no solo, preferencialmente na melhoria do crescimento e desenvolvimento de culturas agrícolas produzidas a partir do uso de fertilizantes à base de ureia.

Description

PÉROLAS DE UREIA COMBINADAS COM ALDIMINAS, PROCESSO DE OBTENÇÃO E USOS NA AGRICULTURA, E APLICAÇÕES DAS ALDIMINAS NO TRATAMENTO DE INFECÇÕES BACTERIANAS.
[001 ] A presente invenção refere-se às pérolas de ureia combinadas com aldiminas, bem como o seu processo de obtenção e aplicações como fertilizante nitrogenado de eficiência agrícola aumentada, além do uso das aldiminas, por si só, como inibidores de urease para o tratamento de infecções por Helicobacter pylori. Assim, as aldiminas são compostos importantes para o desenvolvimento de novos inibidores de urease de interesse agrícola e clínico.
[002] As aldiminas possuem ampla gama de atividades biológicas, tais quais atividade antifúngica, antibacteriana, antimalárica, anticâncer, anti-inflamatória, antiviral e antipirética. Apesar de conhecidas várias de suas propriedades farmacológicas, as aldiminas presentes em pérolas de ureia ainda não foram exploradas do ponto de vista agronómico e também terapêutico, quanto ao potencial de inibição de ureases, visto que infecções por Helicobacter pylori são associadas ao aumento da atividade urease por células desta bactéria no estômago. Por exemplo, quando comparadas ao NBPT (tiofosfato de N- butiltriamida), um inibidor de urease amplamente empregado na agricultura, as aldiminas apresentaram vantagens como baixo custo, facilidade sintética e maior estabilidade térmica. Tais características tornam as aldiminas importantes compostos para o desenvolvimento de novos inibidores de urease de interesse agrícola e clínico. Adicionalmente, pérolas de ureia combinadas com aldiminas mostraram-se tão efetivas quanto ou mais efetivas que pérolas de ureia combinadas com NBPT na melhoria do crescimento e desenvolvimento de plantas da família Poaceae, a exemplo do milheto. Destaca-se que o NBPT é comercializado para fins agrícolas como o componente principal de uma mistura no estado líquido composta por estabilizantes. Cabe ao agricultor adicionar esta mistura contendo NBPT à ureia, de acordo com as proporções definidas pelo fabricante, antes que a formulação à base de ureia possa ser empregada na adubação de solos. Sendo assim, pérolas de ureia combinadas com aldiminas constituem um produto bastante atrativo para o agricultor tanto por dispensar qualquer preparo antes de seu uso na adubação de solos quanto pela praticidade de transporte do ponto de venda do insumo agrícola para o local de uso pelo agricultor. A presente invenção, portanto, é utilizada para inibir enzimas ureases presentes na microbiota do solo, viabilizando uma maior captação e uso de nitrogénio por plantas, aumentando assim, a produtividade de alimentos. Além disso, pode ser utilizada na terapia alternativa para o combate de doenças ocasionadas por microrganismos patogênicos dependentes da atividade da enzima urease, especialmente no controle de infecções causadas por Helicobacter pylori, conforme demonstrado pelas excelentes atividades inibitórias da enzima urease, purificada de Canavalia ensiformis, que esta classe de substância apresentou.
[003] A produção agrícola é responsável por gerar 23% do Produto Interno Bruto (PIB) no Brasil e o país é o quarto maior consumidor de fertilizantes do mundo, com consumo inferior somente em relação à China, índia e Estados Unidos. Entretanto, a indústria brasileira de fertilizantes não é capaz de suprir a demanda do mercado interno e a necessidade de importação de grandes quantidades desses insumos gera dependência externa e ocasiona déficits sobre a balança.
[004] O nitrogénio é um dos elementos químicos que as plantas requerem em maior quantidade por ser um componente essencial para a formação de biomoléculas tais como aminoácidos, ácidos nucléicos e clorofilas, que desempenham papel fundamental na integridade e no funcionamento das células vegetais. Assim, a deficiência deste nutriente compromete o crescimento e desenvolvimento vegetal e o uso de fertilizantes nitrogenados aumenta consideravelmente a produtividade agrícola.
[005] A ureia foi a primeira molécula orgânica a ser sintetizada a partir da combinação entre amónia e gás carbónico, consistindo em um dos fertilizantes nitrogenados mais utilizados mundialmente. A estrutura deste composto é constituída por 46% de N na forma amídica e, por conter elevado conteúdo de nitrogénio em relação aos demais fertilizantes nitrogenados, a ureia possui o preço mais atrativo por tonelada de N no mercado. Além disso, a produção da ureia também apresenta o mais baixo custo de transporte e estocagem. Essa substância é aplicada no plantio ou em cobertura, na forma de grânulos, e a facilidade de manejo é outro fator que contribui para sua utilização. Fertilizantes à base de ureia são amplamente empregados na fertilização de gramíneas forrageiras, culturas de milho em sistema de plantio direto, citrus, cafeeiro e arrozeiro.
[006] As ureases ocorrem em vários organismos vivos, como plantas, bactérias, fungos, algas e invertebrados. Na presença dessas enzimas, a hidrólise da ureia é cerca de 1014 vezes mais rápida. Dessa forma, o nitrogénio, elemento imprescindível para a síntese de proteínas e ácidos nucleicos, é prontamente disponibilizado aos organismos. Devido a essa catálise, as ureases podem rapidamente hidrolisar a ureia aplicada ao solo, implicando em perdas significativas de nitrogénio que resultam em baixa produtividade agrícola.
[007] A elucidação recente da estrutura tridimensional da urease de Canavalia ensiformis possibilitou a maior compreensão dos requerimentos estruturais necessários à atividade catalítica dessa classe de enzimas nos diferentes organismos. As ureases de plantas e fungos possuem uma única cadeia polipeptídica enquanto as de bactérias apresentam duas a três subunidades distintas, denominadas α, β e γ. A grande similaridade na sequência de aminoácidos entre as ureases sugere que as mesmas são variantes de uma enzima ancestral comum, sendo a presença de dois íons Ni2+ essencial à atividade catalítica. A incorporação de Ni2+ na estrutura proteica requer a participação de proteínas acessórias, que parecem atuar como chaperonas específicas.
[008] A ureia pode ser rapidamente hidrolisada (2 a 3 dias), dependendo da temperatura e umidade do solo, bem como da quantidade e forma pela qual esse fertilizante é aplicado. A atividade ureolítica dos solos, portanto, possui grande relevância para a agricultura. Essa atividade ocorre no solo devido à presença de microrganismos e matéria orgânica de origem vegetal. Além de prejuízos económicos, a rápida hidrólise da ureia implica também em danos ambientais, visto que a amónia produzida é reconhecidamente um poluente atmosférico. A liberação excessiva de NH3, devido à demanda cada vez maior pelo uso de fertilizantes, gradualmente desequilibra o ciclo global de N, podendo levar em longo prazo a consequências ambientais desastrosas. Adicionalmente, o uso excessivo de ureia como fertilizante acarreta na contaminação de corpos d'água pela lixiviação do NO3", que é repelido pelas cargas negativas do solo, chegando aos lençóis freáticos.
[009] Alternativas para aumentar o aproveitamento de N pelas culturas agrícolas estão relacionadas à utilização de fertilizantes com eficiência aprimorada e diversos modos de ação. Os fertilizantes de liberação lenta são formados por compostos de condensação de ureia e ureia-aldeídos, caracterizados por baixa solubilidade. Fertilizantes de liberação controlada são produtos recobertos por enxofre ou polímeros, o que propicia uma barreira física contra a exposição do nutriente, que passa a ser liberado ao ambiente de forma regular e gradual. Estes dois tipos de fertilizantes possuem elevado custo de produção, restringindo o uso a nichos de mercado de alto valor agregado, tais como viveiros de mudas e jardinagem. Os fertilizantes estabilizados contêm aditivos tais como os inibidores de urease e de nitrificação. São produtos que reduzem perdas de N por retardarem a hidrólise do composto nitrogenado. Dentre as opções de fertilizantes estabilizados, aqueles contendo inibidores de urease são os de maior expressão comercial, inclusive no Brasil. Além das vantagens económicas, a utilização de fertilizantes estabilizados com inibidores de ureases proporciona a aplicação de menores quantidades do insumo agrícola no solo, resultando na redução da emissão de gases poluentes e contaminação de águas em decorrência da lixiviação do produto.
[0010] Vários compostos orgânicos e inorgânicos são objetos de estudo quanto ao potencial de inibição da atividade de ureases de interesse agrícola. Ao prevenir a rápida hidrólise, os inibidores aumentam as chances de que chuvas, irrigação ou operações mecânicas incorporem a ureia ao solo. [001 1 ] Os compostos com potencial para atuar como inibidores de urease podem ser divididos nos seguintes grupos, de acordo com a função de suas estruturas e modos de ligação com a enzima: i) metais; ii) agentes capazes de complexar o(s) íon(s) Ni2+ presentes no sítio ativo da urease; iii) compostos análogos estruturais à ureia, que competem para com o sítio ativo da enzima. Dentre os compostos mais investigados (Figura 1) estão a tioureia, os tióis (β- mercaptoetanol), o ácido acetoidroxâmico, amidas e ésteres de ácido fosfórico (fosforodiamidato de fenila (PPD), triamida fosfórica (PTA) e tiofosfato de N- butiltriamida (NBPT)), ácido bórico, complexos metálicos contendo Hg2+, Ag+ e Cu2+, tampão fosfato a pH < 7,5, bem como quinonas.
[0012] O fosfato de /V-butiltriamida (NBPT) é um dos compostos mais eficientes para controlar a hidrólise da ureia (SANZ-COBENA, A. et al. Effect of water addition and the urease inhibitor NBPT on the abatement of ammonia emission from surface applied urea. Atmospheric Environment 45: 1517-1524, 201 1 ). Entretanto, essa substância só se torna um potente inibidor de urease após sofrer biotransformação pela microbiota do solo, originando o oxo-NBPT (Figura 2). Sua ligação à urease diminui a velocidade de hidrólise da ureia para um período de aproximadamente 14 dias (CONTIN, T.L.M. Ureia tratada com o inibidor da urease NBPT na adubação de cana-de-açúcar colhida sem despalha a fogo. Dissertação de Mestrado, Instituto Agronómico de Campinas, 2007; CHIEN, S.H.; PROCHNOW, L I.; CANTARELLA, H. Recent developments of fertilizer production and use to improve nutrient efficiency and minimize environmental impacts. Advances in Agronomy 102: 267-322, 2009). Uma das principais formulações disponíveis comercialmente, é um inibidor de urease líquido que pode ser impregnado diretamente na ureia ou misturado em tanque com líquido fertilizante seco que contém ureia, tal como nitrato de ureia- amônio (UAN). O ingrediente activo é N- (n-butil) triamida tiofosfórico (NBPT). A formulação possui em sua composição de 20 a 25% de NBPT que deve ser misturada aos fertilizantes nitrogenados imediatamente antes da fertilização do solo (CANTARELLA, H.; MARCELINO, R. O uso de inibidor de urease para aumentar a eficiência da uréia. 1- Simpósio sobre Informações Recentes para Otimização da Produção Agrícola. INPI, Piracicaba, 15-16, 1996). Cabe ressaltar que a eficiência dessa substância como inibidora de urease está condicionada à sua metabolização pela microbiota do solo. Por ser um produto de patente norte-americana, a importação de NBPT onera altos custos à produção agrícola no Brasil. Assim, é de grande interesse económico o desenvolvimento de uma formulação comercial baseada em ureia e inibidores de urease de procedência nacional.
[0013] A formulação relatada acima, também, pode ser encontrada no estado sólido. O concentrado seco quando adicionado a UAN, minimiza a volatilização, desnitrificação e lixiviação de nitrogénio para a parte de ureia de UAN.
[0014] Por outro lado, as aldiminas, compreendem uma das mais versáteis classes de substâncias orgânicas. Obtidas usualmente por meio da condensação entre aldeídos e aminas primárias (Figura 3), essas substâncias são caracterizadas pela presença do grupamento HC=N.
[0015] Tais substâncias mostram possuir uma ampla gama de atividades biológicas a citar: atividade antifúngica, antibacteriana, antimalárica, anticâncer, anti-inflamatória, antiviral e antipirética (DA SILVA, CM. et al. Schiff bases: a short review of their biological activities. Journal of Advanced Research, 2: 1 -8, 201 1 ; PRZYBYLSKI, P. et al. Biological properties of Schiff bases and azo derivatives of phenols. Current Organic Chemistry, 13: 124-148, 2009). Contudo, até o presente momento poucos trabalhos descrevem a avaliação da atividade inibitória da enzima urease por essa classe de compostos. Em geral, tais trabalhos estão relacionados a estudos da atividade inibitória por complexos metálicos obtidos a partir de aldiminas. Adicionalmente, tais relatos indicam que as aldiminas estudadas, por si só, apresentam atividade pouco expressiva ou são inativas (LI, X. et al. Synthesis, structure and urease inhibition studies of dimeric copper(ll) complexes with a tridentate Schiff base ligand derived from tetrahydrofurfurylamine. Inorgânica Chimica Acta, 408: 46- 52, 2013; YOU, Z.L.; ZHOU, P. New method for the synthesis of bis-Schiff base trinuclear cobalt(ll) complex with urease inhibitory activity. Inorganic Chemistry Communications, 10: 1273-1275, 2007; SHI, D.H.; et al. Synthesis, crystal structure and urease inhibitory activities of Schiff base metal complexes. Inorganic Chemistry Communications, 10: 404-406, 2007; ZHANG, N. et al. Unprecedented preparation of b/s-Schiff bases and their manganese(lll) complexes with urease inhibitory activity. Inorganic Chemistry Communications, 14: 1636-1639, 201 1 ; IKRAM, M. et al. Synthesis and distinct urease enzyme inhibitory activities of metal complexes of Schiff-base ligands: Kinetic and thermodynamic parameters evaluation from TG-DTA analysis. Thermochimica Acta, 555: 72-80, 2013; DONG, X. et al. Synthesis, structures and urease inhibition studies of copper(ll) and nickel(ll) complexes with bidentate N,O- donor Schiff base ligands. Journal of Inorganic Biochemistry, 108: 22-29, 2012; CHEN, W. et al. Synthesis, molecular docking and biological evaluation of Schiff base transition metal complexes as potential urease inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry, 45: 4473-4478, 2010; SANTANA, I.K.S. Atividade de ureases em solos e avaliação de potenciais inibidores. Dissertação de Mestrado, Universidade Federal de Viçosa, 201 1 ). Contudo, mesmo que complexos metálicos de aldiminas demonstrassem potencial com inibidores de urease, o uso de tais complexos para esta finalidade resultaria no aumento da concentração de metais no solo ou na biofase, causando toxicidade às plantas, animais e seres humanos.
[0016] Em um dos poucos trabalhos que apontam as aldiminas como potenciais inibidores de urease, Aslam e colaboradores (201 1 ) sintetizaram uma série de compostos a partir da condensação entre diferentes aldeídos e tiossemicarbazida, e avaliaram suas atividades frente à urease de Canavalia ensiformis. Os resultados mostraram que as aldiminas sintetizadas foram substancialmente mais ativas que a tioureia, um conhecido inibidor, e que suas atividades estão relacionadas às estruturas dos aldeídos de partida (ASLAM, M.A. Synthesis, biological assay in vitro and molecular docking studies of new Schiff base derivatives as potential urease inhibitors. European Journal of Medicinal Chemistry, 46: 5473-5479, 201 1 ).
[0017] Considerando-se os resultados descritos por Aslam e colaboradores (201 1 ) e a escassez de produtos no mercado capazes de inibirem ureases visando ao aumento da eficiência dos insumos agrícolas à base de ureia, as aldiminas se apresentam como importantes compostos no desenvolvimento de novos inibidores.
[0018] Por meio de busca na literatura patentária e não patentária, nenhum produto ou processo sintético foram encontrados de forma idêntica ao objeto do presente pedido de patente, tampouco que comprometesse a atividade inventiva da presente tecnologia.
[0019] Sabe-se que tanto as triamidas /V-alquil trifosfóricas quanto o NBPT são inibidores da urease. O NBPT, entretanto, é ceroso, muito viscoso e sensível ao calor e à um idade. Algumas formulações são necessárias para minimizar a decomposição durante o armazenamento e distribuição.
[0020] O pedido de patente WO 9722568 descreve utilização de misturas concentradas de triamida /V-alquil tiofosfórica em um solvente que pode ser propilenoglicol e /V-metil pirrolidona, para a inibição de ureases.
[0021 ] O pedido WO 2009079994 descreve a utilização como inibidor de urease de uma solução concentrada de triamida N-alquil tiofosfórica com um composto contendo um grupo amino com ponto de ebulição acima de 100°C.
[0022] Já o pedido WO 2010072184 descreve uma composição líquida que contém derivados fosfóricos ou tiofosfóricos da triamida e um ou mais ésteres de hidroxiácidos, álcoois heterocíclicos, ésteres cíclicos de ácidos carbónicos e ésteres de ácidos dicarboxílicos.
[0023] Existe um produto comercial para inibir ureases com aplicação na agricultura, e com marca registrada em alguns países (Disponível em http://www.agrotain.com/us/home; acessado em 08/10/2014).
[0024] Constata-se, no entanto, que as tecnologias citadas anteriormente apresentam uma série de limitações, por exemplo, a baixa estabilidade durante a armazenagem da ureia tratada, a alta toxicidade dos solventes utilizados nas formulações e efeitos desses no ambiente aquático e terrestre. A presente invenção, por sua vez, supre essas deficiências.
[0025] Por isso, há a necessidade da existência de um processo que resulte em um produto melhorado e que possa ser utilizado na inibição da ação da urease; seja na agricultura, seja no tratamento de doenças associadas à atividade urease (MODOLO, L, V. et al. An overview on the potential of natural products as urease inhibitors: a review. Journal of Advanced Research, 6: 35- 44, 2015), tal qual corresponde ao proposto no presente documento, pois o mesmo apresenta elevada estabilidade, baixa toxicidade e maior controle na liberação de aldiminas durante a utilização.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0026] A Figura 1 ilustra as pérolas de ureia combinadas, objeto da presente invenção, (e não combinadas) com a aldimina 3B4 ou NBPT, a diferentes proporções massa/massa.
[0027] A Figura 2 mostra as estruturas químicas de alguns inibidores de urease.
[0028] A Figura 3 mostra a equação química da biotransformação do fosfato de /V-butiltriamida (NBPT) oxo-NBPT.
[0029] A Figura 4 mostra a equação química que representa a reação geral para obtenção de uma aldimina.
[0030] A Figura 5 mostra as estruturas químicas das aldiminas da série 3A.
[0031 ] A Figura 6 mostra as estruturas químicas das aldiminas da série 3B.
[0032] A Figura 7 mostra as estruturas químicas das aldiminas da série 3C.
[0033] A Figura 8 mostra as estruturas químicas das aldiminas da série 3D.
[0034] A Figura 9 mostra as estruturas químicas das aldiminas da série 3E.
[0035] A Figura 10 mostra as estruturas químicas das aldiminas da série 3F.
[0036] A Figura 11 mostra as estruturas químicas das aldiminas da série G.
[0037] A Figura 12 mostra as estruturas químicas das aldiminas das séries 3H e 3l. [0038] A Figura 13 apresenta a equação química que representa a reação entre um aldeído aromático e uma amina aromática, específica para a síntese da aldimina aromática 3A4.
[0039] A Figura 14 mostra o espectro no infravermelho obtido para a aldimina aromática 3A4.
[0040] A Figura 15 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogénio [RMN de 1 H; 200 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3A4.
[0041 ] A Figura 16 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de carbono [RMN de 13C; 50 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3A4.
[0042] A Figura 17 apresenta a equação química que representa a reação entre um aldeído aromático e uma amina aromática, específica para a síntese da aldimina aromática 3B3.
[0043] A Figura 18 mostra o espectro no infravermelho obtido para a aldimina aromática 3B3.
[0044] A Figura 19 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogénio [RMN de 1 H; 200 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3B3
[0045] A Figura 20 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de carbono [RMN de 13C; 50 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3B3
[0046] A Figura 21 apresenta a equação química que representa a reação entre um aldeído aromático e uma amina aromática, específica para a síntese da aldimina aromática 3B4.
[0047] A Figura 22 mostra o espectro no infravermelho obtido para a aldimina aromática 3B4. [0048] A Figura 23 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogénio [RMN de 1 H; 200 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3B4.
[0049] A Figura 24 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de carbono [RMN de 13C; 50 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3B4.
[0050] A Figura 25 apresenta a equação química que representa a reação entre um aldeído aromático e uma amina aromática, específica para a síntese da aldimina aromática 3C4.
[0051 ] A Figura 26 mostra o espectro no infravermelho obtido para a aldimina aromática 3C4.
[0052] A Figura 27 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogénio [RMN de 1 H; 200 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3C4
[0053] A Figura 28 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de carbono [RMN de 13C; 50 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3C4
[0054] A Figura 29 apresenta a equação química que representa a reação entre um aldeído aromático e uma amina aromática, específica para a síntese da aldimina aromática 3D4.
[0055] A Figura 30 mostra o espectro no infravermelho obtido para a aldimina aromática 3D4.
[0056] A Figura 31 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogénio [RMN de 1 H; 200 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3D4.
[0057] A Figura 32 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de carbono [RMN de 13C; 50 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3D4. [0058] A Figura 33 apresenta a equação química que representa a reação entre um aldeído aromático e uma amina aromática, específica para a síntese da aldimina aromática 3D6.
[0059] A Figura 34 mostra o espectro no infravermelho obtido para a aldimina aromática 3D6.
[0060] A Figura 35 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogénio [RMN de 1 H; 200 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3D6
[0061 ] A Figura 36 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de carbono [RMN de 13C; 50 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3D6
[0062] A Figura 37 apresenta a equação química que representa a reação entre um aldeído aromático e uma amina aromática, específica para a síntese da aldimina aromática 3D10.
[0063] A Figura 38 mostra o espectro no infravermelho obtido para a aldimina aromática 3D10.
[0064] A Figura 39 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogénio [RMN de 1 H; 200 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3D10
[0065] A Figura 40 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de carbono [RMN de 13C; 50 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3D10
[0066] A Figura 41 apresenta a equação química que representa a reação entre um aldeído aromático e uma amina aromática, específica para a síntese da aldimina aromática 3E5.
[0067] A Figura 42 mostra o espectro no infravermelho obtido para a aldimina aromática 3E5. [0068] A Figura 43 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogénio [RMN de 1 H; 200 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3E5
[0069] A Figura 44 mostra o espectro de ressonância magnética nuclear de carbono [RMN de 13C; 50 MHz, (CD3)2SO] obtido para a aldimina aromática 3E5
[0070] A Figura 45 apresenta as percentagens de perda de massa das aldiminas aromáticas 3A4, 3B3, 3B4, 3C4 e do NBPT obtidas por análise termogravimétrica (TGA), em fluxo de nitrogénio 50 ml_ min"1 e razão de aquecimento 10 °C min"1.
[0071 ] A Figura 46 mostra as percentagens de perda de massa das aldiminas aromáticas 3D4, 3D6, 3D10, 3E5 e do NBPT obtidas por análise termogravimétrica (TGA), em fluxo de nitrogénio 50 ml_ min"1 e razão de aquecimento 10 °C min"1.
[0072] A Figura 47 apresenta as alterações nos parâmetros cinéticos para a urease de Canavalia ensiformis na presença de 3B4 (100 μΜ ou 200 μΜ), Plotagem de Michaelis-Menten (gráfico à esquerda); Plotagem de Lineweaver- Burk (gráfico à direita).
[0073] A Figura 48 apresenta imagens representativas de plantas de milheto com 30 dias de vida em que, aos 16 dias pós-germinação, as plantas foram tratadas, em dose única, com ureia combinada com 3B4 (a 0,25, 0,50 e 1 ,00%, respectivamente; fotos superiores) e NBPT (a 0,25, 0,50 e 1 ,00%, respectivamente; fotos inferiores) nas relações massa/massa indicadas. Obs: barras = 18 cm.
[0074] A Figura 49 apresenta imagens representativas de plantas de milheto com 56 dias de vida e sob tratamento com uma única dose de ureia combinada com 3B4 (foto superior) e NBPT (foto inferior) nas relações massa/massa indicadas, por um período de 30 dias. Barras = 18 cm.
[0075] A Figura 50 mostra a taxa de crescimento relativo da altura das plantas de milheto com 56 dias de vida, em função do tratamento com uma única dose de ureia combinada com 3B4 ou NBPT nas relações massa/massa indicadas, por um período de 30 dias.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA
[0076] A presente invenção refere-se às pérolas de ureia combinadas com aldiminas, bem como o seu processo de obtenção e aplicações como fertilizante nitrogenado de eficiência agrícola aumentada (Figuras 48 a 50), além do uso das aldiminas, por si só, como inibidores de urease para o tratamento de infecções por Helicobacter pylori (Tabelas 1 - 12). As aldiminas possuem ampla gama de atividades biológicas, tais quais atividade antifúngica, antibacteriana, antimalárica, anticâncer, anti-inflamatória, antiviral e antipirética. Tais características tornam as aldiminas importantes compostos para o desenvolvimento de novos inibidores de urease de interesse agrícola e clínico.
[0077] O processo de obtenção das pérolas de ureia combinadas com aldiminas inicia-se primeiramente com a síntese das aldiminas, codificadas como 3A2 a 3A10; 3B2 a 3B8, e 3B10; 3C2 a 3C10; 3D2 a 3D10; 3E2 a 3E10; 3F2 a 3F6 e 3F8 a 3F10; 3G2 a 3G10; 3H2 a 3H10 e 3I2 (Tabelas 1 a 8; Figuras 5 a 12), compreendendo as seguintes etapas:
1 - Síntese das aldiminas a) inserção de soluções etanólicas contendo quantidades equimolares de um aldeído e de uma amina, em um reator de microondas. O aldeído é selecionado do grupo compreendendo benzaldeído, 2-hidroxi-benzaldeído, 3- hidroxi-benzaldeído, 4-hidroxi-benzaldeído, 2,3-diidroxi-benzaldeído, 3,4- diidroxi-benzaldeído, 2,3,4-triidroxi-benzaldeído, piperonal, 4-fluoro- benzaldeído, frans-cinamaldeído, 2-nitro-frans-cinamaldeído, 4-nitro-frans- cinamaldeído, 4-nitro-benzaldeído, 4-metoxi-frans-cinamaldeído, 4-/V,/V-dimetil- frans-cinamaldeído, fufuraldeído, 5-nitro-fufuraldeído e picolinaldeído; e a amina é selecionada do grupo compreendendo anilina, 2-hidroxi-anilina, 3- hidroxi-anilina, 4-hidroxi-anilina, 2-metoxi-anilina, 4-metoxi-anilina, 4-cloro- anilina, 4-fluoro-anilina, 4-trifluoro-metilanilina, 4-tiometil-anilina, 2-ciano-anilina, 4-ciano-anilina, 4-nitro-anilina, 1 -adamantilamina e ácido 4-amino-5-hidroxi- naftaleno-2,7-sulfônico. b) irradiação da mistura proveniente da etapa (a) no reator de microondas à temperatura na faixa de 60 a 100 °C, sob potência máxima, na faixa de 180 a 200 W, com tempo de rampa de 2 a 5 min, tempo de reação de 2 a 10 min, sob agitação máxima, seguida de resfriamento; c) purificação da aldimina obtida em (b).
[0078] A purificação das aldiminas 3A2 a 3A10; 3B2 a 3B8 e 3B10; 3C2 a 3C10; 3D2 a 3D10; 3E2 a 3E10; 3F2 a 3F6 e 3F8 a 3F10; 3G2 a 3G10; 3H2 a 3H10 e 3I2 (Tabelas 1 a 8; Figuras 5 a 12) obtidas na etapa (b) foi via recristalização, utilizando-se solventes específicos e isoladamente para cada aldimina, tais quais o metanol, etanol, butanol, acetonitrila, acetona ou acetato de etila, na razão de 1 -5: 10-50 (massa da aldimina/volume de solvente). As aldiminas foram obtidas em rendimentos na faixa de 60 a 100%.
2- Preparação das pérolas de ureia combinadas com as aldiminas
[0079] Uma vez obtidas as aldiminas puras, procedeu-se à preparação das pérolas de ureia combinadas com as aldiminas, objeto deste pedido, que envolve as seguintes etapas: a) dissolução de uma das aldiminas 3A2 a 3A10; ou 3B2 a 3B8, e 3B10; ou 3C2 a 3C10; ou 3D2 a 3D10; ou 3E2 a 3E10; ou 3F2 a 3F6 e 3F8 a 3F10; ou 3G2 a 3G10; ou 3H2 a 3H10; ou 3I2 - Tabelas 1 a 8; Figuras 5 a 12 - em um solvente orgânico a concentrações na faixa de 2,5 g/L a 100 g/L; b) após completa solubilização, pérolas de ureia, sem nenhum tratamento prévio, foram inseridas na solução de aldimina, obtida na etapa (a), na razão de 5 a 50 kg de ureia para cada 1 L a 10 L de solução de aldimina; c) agitação das pérolas de ureia, mecanicamente, na presença de cada solução de inibidor obtida na etapa (b), para completa homogeneização; sendo as pérolas mantidas em capela de exaustão até a evaporação completa do solvente orgânico, para a obtenção do produto pérolas de ureia combinadas (encapsuladas ou revestidas, preferencialmente revestidas) com as aldiminas. [0080] Vale salientar que a dissolução de cada aldimina pura (3A2 a 3A10; 3B2 a 3B8 e 3B10; 3C2 a 3C10; 3D2 a 3D10; 3E2 a 3E10; 3F2 a 3F6 e 3F8 a 3F10; 3G2 a 3G10; 3H2 a 3H10 ou 3I2; Tabelas 1 - 8) ocorreu em um solvente orgânico, tal como acetona, etanol, metanol, etanolamina, dietanoamina, trietanolamina ou acetato de etila, nas concentrações entre 2,5 g/L a 100 g/L.
[0081 ] O produto final compreendeu pérolas de ureia incorporadas/encapsuladas ou revestidas, preferencialmente revestidas, com uma das aldiminas 3A2 a 3A10; 3B2 a 3B8, e 3B10; 3C2 a 3C10; 3D2 a 3D10; 3E2 a 3E10; 3F2 a 3F6 e 3F8 a 3F10; 3G2 a 3G10; 3H2 a 3H10; ou 3I2
[0082] O uso das pérolas de ureia caracteriza-se por ser na inibição de enzimas ureases presentes na microbiota do solo, preferencialmente na melhoria do crescimento e desenvolvimento de milheto; enquanto que as aldiminas puras ou combinadas entre si são utilizadas na inibição da atividade ureolítica de ureases, constituindo, portanto, uma alternativa para o tratamento de doenças ocasionadas por microrganismos patogênicos dependentes da atividade da enzima urease, preferencialmente no controle de infecções causadas por Helicobacter pylori.
[0083] Assim sendo, a invenção pode ser melhor compreendida através dos seguintes exemplos, não limitantes.
Exemplo 1 - Síntese e caracterização estrutural da aldimina aromática 3A4.
[0084] O composto 3A4 foi obtido por meio da condensação entre o benzaldeído (4 mol) e a 4-hidroxi-anilina (4 mol) em 10 mL de etanol sob irradiação de microondas por 2 min, conforme representado na Figura 13. O produto da reação (3A4) foi obtido em 80% de rendimento após purificação por recristalização, utilizando-se etanol como solvente.
[0085] O espectro no infravermelho obtido para a aldimina 3A4 (Figura 14) apresenta bandas características de estiramento de ligações O-H e Csp 2-H na região compreendida entre 3200 e 3000 cm"1. Bandas provenientes de estiramento das ligações C=N e C=C também são observadas em 1618, 1604, 1587, 1506 e 1450 cm"1.
[0086] No espectro de RMN de 1 H do referido composto (Figura 15) observa-se um par de dupletos centrados em ô 6,84 e 7,23 ppm, com constantes de acoplamento escalar iguais a 8,7 Hz, atribuídos aos hidrogênios que se encontram nas posições orto e meta em relação a hidroxila fenólica, respectivamente. Dois multipletos nas regiões compreendidas entre (57,45-7,59 e 7,85-7,99 ppm, com integração correspondendo a um total de cinco hidrogênios, são atribuídos aos hidrogênios do anel aromático proveniente do aldeído de partida. O sinal referente ao hidrogénio do grupamento -CH=N- é observado como um simpleto em (58,62 ppm. Por fim, outro simpleto em (59,57 ppm corresponde ao hidrogénio do grupamento -OH.
[0087] O espectro de RMN de 13C para a aldimina 3A4 (Figura 16) apresenta um total de 9 sinais, conforme esperado. Numa região mais blindada do espectro verificam-se os sinais referentes aos carbonos hidrogenados de ambos os anéis aromáticos, que aparecem em ô 1 15,7, 122,5, 128,3, 128,8 e 130,9 ppm. Três sinais de carbonos não hidrogenados são observados numa região mais blindada do espectro, em ô 136,5, 142,6 e 156,3 ppm, juntamente com o carbono do grupamento -CH=N-, em ô 157,2 ppm.
Exemplo 2 - Síntese e caracterização estrutural da aldimina aromática 3B3.
[0088] O composto 3B3 foi obtido por meio da condensação entre o 2- hidroxibenzaldeído (6 mol) e a 4-hidroxianilina (6 mol) em 15 mL de etanol, sob irradiação de microondas por 2 min, conforme representado na Figura 17. O produto da reação (3B3) foi obtido em 90% de rendimento após purificação por recristalização, utilizando-se etanol como solvente.
[0089] O espectro no infravermelho obtido para a aldimina 3B3 (Figura 18) apresenta uma banda característica de estiramento de ligação O-H em 3390 cm"1. Bandas provenientes de estiramentos de ligações C=N e C=C são observadas em 1614, 1573, 1506, 1494, 1456 e 1443 cm"1. [0090] O espectro de RMN de 1H do referido composto (Figura 19) apresenta uma maior complexidade quando comparado ao obtido para a aldimina 3A4 devido aos desdobramentos adicionais originados da substituição em orto no anel aromático do aldeído de partida. Dois multipletos são observados em ô 6,80-7,02 e 7,27-7,45 ppm, integrados para quatro e três hidrogênios, respectivamente. Um dupleto duplo integrado para um hidrogénio também é verificado em ô 7,60 ppm, completando os sinais referentes aos hidrogênios dos anéis aromáticos. O sinal característico do hidrogénio do grupamento -CH=N- aparece como um simpleto em ô 8,90 ppm. Observam-se ainda dois simpletos largos referentes aos hidrogênios dos grupamentos fenólicos em (59,68 e 13,42 ppm.
[0091 ] No espectro de RMN de 13C obtido para a aldimina 3B3 (Figura 20) verificam-se os sinais referentes aos carbonos hidrogenados de ambos os anéis aromáticos em ô 1 16,0, 1 16,5, 1 19,0, 122,7, 132,2 e 132,6 ppm. Os sinais de carbonos não hidrogenados são observados em ô 1 19,5, 139,2, 157,0 e 160,2 ppm, sendo que este último aparece sobreposto ao sinal referente ao carbono do grupamento -CH=N-.
Exemplo 3 - Síntese e caracterização estrutural da aldimina aromática 3B4.
[0092] O composto 3B4 foi obtido por meio da condensação entre o 3- hidroxibenzaldeído (mol) e a 4-hidroxianilina (10 mol) em 25 ml_ de etanol, sob irradiação de microondas por 4 min, conforme representado na Figura 21. O produto da reação (3B4) foi obtido em 87% de rendimento após purificação por recristalização, utilizando-se etanol como solvente.
[0093] O espectro no infravermelho obtido para a aldimina 3B4 (Figura 22) apresenta uma forte banda de absorção característica de estiramento de ligações O-H em 3275 cm"1. Bandas provenientes de estiramentos das ligações C=N e C=C são observadas em 1589, 1505 e 1454 cm"1. Uma banda de absorção intensa, característica de estiramento de ligações C-O, também é verificada em 1230 cm"1. [0094] No espectro de RMN de 1 H do referido composto (Figura 23) observam-se dois dupletos centrados em ô 6,82 e 7,20 ppm, integrados para dois hidrogênios cada, correspondendo aos hidrogênios das posições orto e meta em relação a hidroxila do anel aromático derivado da amina de partida. Os sinais referentes aos hidrogênios do anel aromático do aldeído de partida são verificados como dois multipletos integrados para um e três hidrogênios em ô 6,87-6,96 e 7,24-7,41 ppm. O sinal característico do hidrogénio do grupamento -CH=N- aparece como um simpleto em ô 8,52 ppm. Por fim, um sinal alargado integrado para dois hidrogênios é observado em ô 9,57 ppm, atribuído aos hidrogênios das hidroxilas fenólicas.
[0095] O espectro de RMN de 13C para a aldimina 3B4 (Figura 24) apresenta um total de 1 1 sinais, de acordo com o esperado para a estrutura em questão. Numa região mais blindada do espectro são observados os sinais referentes aos carbonos hidrogenados de ambos os anéis aromáticos, que aparecem em ô 1 13,9, 1 15,2, 1 18,2, 1 19,9, 122,5 e 129,8 ppm. Quatro sinais referentes a carbonos não hidrogenados são observados em ô 137,9, 142,6, 156,3 e 157,7 ppm. Por fim, o sinal característico do carbono do grupamento - CH=N- é verificado em ô 157,2 ppm.
Exemplo 4 - Síntese e caracterização estrutural da aldimina aromática 3C4.
[0096] O composto 3C4 foi obtido por meio da condensação entre o piperonal (18 mol) e a 4-hidroxianilina (18 mol) em 70 ml_ de etanol, sob irradiação de microondas por 10 min, conforme representado na Figura 25. O produto da reação (3C4) foi obtido em 98% de rendimento após purificação por recristalização, utilizando-se etanol como solvente.
[0097] O espectro no infravermelho obtido para a aldimina 3C3 (Figura 26) apresenta bandas características de estiramentos de ligações C=N e C=C em 1605, 1583, 1505, 1445 cm"1.
[0098] No espectro de RMN de 1 H do referido composto (Figura 27) observa-se um simpleto integrado para dois hidrogênios em ô 6, 10 ppm, atribuído aos hidrogênios do grupamento -OCH2O-. Dois dupletos integrados para dois hidrogênios cada são observados em ô 6,80 e 7, 15 ppm, com constantes de acoplamento escalar iguais a 8,6 Hz, correspondendo aos hidrogênios das posições orto e meta em relação à hidroxila fenólica, respectivamente. Os sinais referentes aos hidrogênios do anel aromático do aldeído de partida aparecem em ô 7,01 ppm (dupleto), ô 7,36 ppm (dupleto duplo) e ô 7,45 ppm (dupleto). Por fim, os sinais dos hidrogênios do grupamento -CH=N- e -OH são observados como simpletos em ô 8,47 e 9,48 ppm, respectivamente.
[0099] No espectro de RMN de 13C obtido para o composto 3C4 (Figura 28) observa-se o sinal referente ao carbono do grupamento metilenodioxi (- OCH2O-) em ô 101 ,6 ppm, sendo o único que apresenta fase invertida no subespectro DEPT135. Sinais de carbonos hidrogenados pertencentes aos anéis aromáticos aparecem em δ 106,0, 108,3, 1 15,7, 122,4 e 125, 1 ppm. Os sinais referentes aos carbonos não hidrogenados são observados em ô 131 ,3, 142,7, 148,0, 149,7 e 156,0 ppm, juntamente com o sinal do carbono do grupamento -CH=N-, que aparece em ô 156,5 ppm.
Exemplo 5 - Síntese e caracterização estrutural da aldimina aromática 3D4.
[00100] O composto 3D4 foi obtido por meio da condensação entre o 4- fluorobenzaldeído (6 mol) e a 4-hidroxianilina (6 mol) em 18 mL de etanol, sob irradiação de microondas por 5 min, conforme representado na Figura 29. O produto da reação (3D4) foi obtido em 82% de rendimento após purificação por recristalização, utilizando-se etanol como solvente.
[00101 ] O espectro no infravermelho obtido para a aldimina 3D4 (Figura 30) apresenta uma banda de absorção característica de estiramento de ligações O- H em 3073 cm"1. Bandas provenientes dos estiramentos das ligações C=N e C=C também são observadas em 1615, 1602, 1507 e 1443 cm"1. Uma forte banda de absorção aparece em 1223 cm"1 , proveniente dos estiramentos das ligações C-O. E em 1 160 cm"1 observa-se uma banda de absorção de intensidade média, característica de estiramentos das ligações C-F de fluoretos de arila.
[00102] No espectro de RMN de 1 H do referido composto (Figura 31 ) observam-se dois dupletos integrados para dois hidrogênios cada, centrados em (5 6,82 e 7,20 ppm, atribuídos aos hidrogênios das posições orto e meta em relação ao grupamento hidroxila, respectivamente. Um tripleto centrado em ô 7,30 ppm, com constantes de acoplamento escalar iguais a 8,7 Hz, é atribuído aos hidrogênios das posições orto em relação ao átomo de flúor. Em ô 7,94 ppm observa-se um dupleto duplo, com constantes de acoplamento escalar iguais a 8,7 e 5,8 Hz, atribuído aos hidrogênios das posições meta em relação ao átomo de flúor. Os sinais referentes aos hidrogênios dos grupamentos - CH=N- e -OH se apresentam como simpletos em ô 8,59 e 9,57 ppm, respectivamente.
[00103] No espectro de RMN de 13C obtido para a aldimina 3D4 (Figura 32) observam-se os sinais referentes aos carbonos provenientes do anel aromático da amina de partida em δ 1 15,8, 122,5, 142,5 e 156,4 ppm. Os sinais referentes aos carbonos do anel aromático do aldeído de partida aparecem como dupletos centrados em δ 1 15,8, 130,5, 133,2 e 163,7 ppm, com constantes de acoplamento escalar iguais a 21 ,8, 8,8, 2,9 e 247, 1 Hz, respectivamente, devido aos acoplamentos C-F. Por fim, o sinal referente ao carbono do grupamento -CH=N- é observado em 155,9 ppm.
Exemplo 6 - Síntese e caracterização estrutural da aldimina aromática 3D6.
[00104] O composto 3D6 foi obtido por meio da condensação entre o trans- cinamaldeído (20 mol) e a 4-hidroxianilina (20 mol) em 60 ml_ de etanol, sob irradiação de microondas por 10 min, conforme representado na Figura 33. O produto da reação (3D6) foi obtido em 95% de rendimento após purificação por recristalização, utilizando-se etanol como solvente. [00105] O espectro no infravermelho obtido para a aldimina 3D6 (Figura 34) apresenta bandas características de estiramentos de ligações C=N e C=C em 1621 , 1606, 1587, 1505 e 1446 cm"1.
[00106] No espectro de RMN de 1 H do referido composto (Figura 35) observa-se o sinal do hidrogénio do grupamento -CH=N- em ô 8,39 ppm, que se apresenta como um dupleto (J = 8,2 Hz) devido ao acoplamento com o hidrogénio vinílico vizinho. Esse sinal é característico para todos os compostos derivados do frans-cinamaldeído e seu deslocamento químico não é muito influenciado pela presença de substituintes nos anéis aromáticos. Adicionalmente, verifica-se também o sinal referente ao hidrogénio do grupamento -OH, que se apresenta como um simpleto largo em (5 9,56 ppm. Os sinais referentes aos hidrogênios aromáticos, assim como aos hidrogênios vinílicos, são observados entre (56,79-7,67 ppm.
[00107] O espectro de RMN de 13C obtido para a aldimina 3D6 (Figura 36) apresenta um total de onze sinais. O sinal correspondente ao carbono do grupamento -CH=N- se apresenta como o mais desblindado, em ô 158,5 ppm. Outro sinal característico, também observado numa região mais desblindada do espectro, corresponde ao carbono diretamente ligado ao grupamento -OH, observado em ô 156,4 ppm.
Exemplo 7 - Síntese e caracterização estrutural da aldimina aromática 3D10.
[00108] O composto 3D10 foi obtido por meio da condensação entre o 4- nitrobenzaldeído (5 mol) e a 4-hidroxianilina (5 mol) em 30 ml_ de etanol, sob irradiação de microondas por 7 min, conforme representado na Figura 37. O produto da reação (3D10) foi obtido em 83% de rendimento após purificação por recristalização, utilizando-se etanol como solvente.
[00109] O espectro no infravermelho obtido para a aldimina 3D10 (Figura 38) apresenta uma banda de absorção intensa em 3436 cm"1 proveniente do estiramento da ligação O-H do anel fenólico. Bandas provenientes dos estiramentos das ligações C=N e C=C também são observadas em 1625, 1597, 1578, 1443 cm"1. Duas bandas intensas aparecem em 1505 e 1336 cm"1 , atribuídas aos estiramentos assimétrico e simétrico, respectivamente, do grupamento -NO2.
[001 10] O espectro de RMN de 1H do referido composto (Figura 39) apresenta um dupleto integrado para dois hidrogênios, centrado em (56,83 ppm, com constante de acoplamento escalar igual a 8,8 Hz, referente aos hidrogênios que se encontram nas posições orto em relação ao substituinte hidroxila. Outro dupleto centrado em ô 7,29 ppm, também integrado para dois hidrogênios, é atribuído aos hidrogênios das posições meta à hidroxila fenólica. Numa região mais desblindada do espectro são observados outros dois dupletos, em (58,09 e 8,30 ppm, ambos com constantes de acoplamento escalar iguais 8,9 Hz, atribuídos aos hidrogênios das posições meta e orto em relação ao grupamento nitro, respectivamente. Um simpleto é observado em ô 8,75 ppm, correspondendo ao sinal do hidrogénio do grupamento -CH=N-. Por fim, outro simpleto é observado em ô 9,71 ppm, atribuído ao hidrogénio do grupamento -OH.
[001 1 1 ] O espectro de RMN de 13C obtido para a aldimina 3D10 (Figura 40) apresenta um total de 9 sinais, visto a grande simetria apresentada pelo composto. Na região mais blindada do espectro verifica-se um conjunto de quatro sinais referentes aos carbonos hidrogenados dos anéis aromáticos, que são observados em ô 1 15,8, 123, 1 , 123,9 e 129,0 ppm. Outros quatros sinais de carbonos não hidrogenados são observados numa região mais blindada do espectro, em (5 141 ,6, 142, 1 , 148,3, e 157,3 ppm, juntamente com o carbono do grupamento -CH=N-, que é observado em ô 154,6 ppm.
Exemplo 8 - Síntese e caracterização estrutural da aldimina aromática 3E5.
[001 12] O composto 3E5 foi obtido por meio da condensação entre o furfuraldeído (10 mol) e a 4-hidroxianilina (10 mol) em 45 mL de etanol, sob irradiação de microondas por 8 min, conforme representado na Figura 41. O produto da reação (3E5) foi obtido em 78% de rendimento após purificação por recristalização, utilizando-se etanol como solvente.
[001 13] No espectro no infravermelho obtido para a aldimina 3E5 (Figura 42) observam-se bandas características de estiramento de ligações C=N e C=C em 1627, 1584, 1559, 1505 e 1443 cm"1.
[001 14] No espectro de RMN de 1 H do referido composto (Figura 43) observam-se dois dupletos integrados para dois hidrogênios cada em ô 6,81 e 7, 19 ppm, atribuídos aos hidrogênios das posições orto e meta em relação a hidroxila fenólica, respectivamente. Os sinais referentes aos hidrogênios do anel heteroaromático são verificados em ô 6,66, 7,05 e 7,89 ppm. Em ô 8,42 ppm observa-se um simpleto integrado para um hidrogénio, atribuído ao hidrogénio do grupamento -CH=N-. Por fim, em ô 9,54 ppm verifica-se um simpleto largo característico do hidrogénio do grupamento -OH.
[001 15] O espectro de RMN de 13C obtido para a aldimina 3E5 (Figura 44) apresenta um total de nove sinais, sendo seis referentes a carbonos hidrogenados e três referentes a carbonos não hidrogenados. Na região mais blindada do espectro verifica-se um conjunto de quatro sinais referentes a carbonos hidrogenados de ambos os anéis aromático e heteroaromático (ô 1 12,4, 1 15,4, 1 15,8 e 122,4 ppm). Sinais de carbonos não hidrogenados são observados numa região de maior deslocamento químico (ô 142,3, 152,4 e 156,4 ppm), juntamente com os sinais referentes aos carbonos dos grupamentos -CH=N- e =CH-O- do anel hereroaromático (ô 145, 1 e 145,7 ppm).
Exemplo 9 - Estudos in vitro do efeito de aldiminas sobre a atividade urease de Canavalia ensiformis.
[001 16] A triagem in vitro de 71 aldiminas foi realizada utilizando urease purificada de Canavalia ensiformis (Sigma-Aldrich). As reações, contendo ou não cada uma das aldiminas a 500 μΜ, foram constituídas de tampão fosfato 20 mM (pH 7,0) em EDTA 1 mM, urease 0,5 U/mL e ureia 10 ou 20 mM. Os sistemas de reação foram incubados a 25°C por 15 min, sob agitação de 600 rpm e na ausência de luz. Em seguida, as reações foram paralisadas com solução de fenol 1 % e nitroprussiato de sódio 0,005% com posterior adição de uma mistura de NaOH 0,5% e NaOCI 0,1 %. As reações foram incubadas a 50°C por 5 min, sob agitação de 600 rpm e na ausência de luz, para o desenvolvimento de coloração azul, característica da presença de NH4 +, que foi quantificado por medidas espectrofotométricas a 630 nm (WEATHERBURN, M.W. Phenol-hypochlorite reaction for determination of ammonia. Analytical Chemistry, 39: 971 -974, 1967; KRAJEWSKA, B.; CIURLI, S. Jack bean (Canavalia ensiformis) urease. Probing acid-base groups of the active site by pH variation. Plant Physiology and Biochemistry, 43: 651 -658. 2005; KRAJEWSKA, B. Ureases I. Functional, catalytic and kinetic properties: A review. Journal of Molecular Catalysis B-Enzymatic, 59: 9-21 , 2009). O NBPT, tioureia e hidroxiureia foram usados como controles positivos. Utilizou-se NH4CI como padrão e os resultados foram expressos em porcentagem de inibição (% IN), de acordo com a fórmula abaixo:
%IN = (NH UR - NH4 +IN / NH4 +UR) x 100, onde
[001 17] NH4 +UR e NH4 +IN se referem às quantidades de amónio formadas em nmols durante o período de incubação na ausência ou presença de inibidor, respectivamente.
[001 18] Das 71 aldiminas avaliadas, 32 exibiram atividade inibitória da enzima urease superior a 20%, a 500 μΜ, em comparação às reações enzimáticas contendo apenas ureia a 10 ou 20 mM. Os inibidores NBPT, tioureia e hidroxiureia foram utilizados como referência e apresentaram, respectivamente, percentual médio de inibição da atividade urease de 100%, 15% e 62% (Tabelas 1 - 8).
[001 19] Dentre os compostos da série 3A (Figura 5), a aldimina 3A9 apresentou o maior potencial de inibição da atividade urease (52 e 49%), em reações contendo ureia a 10 e 20 mM, respectivamente (Tabela 1 ). Os compostos 3A4 e 3A8 exibiram eficiência pouco superior a 20% (Tabela 1). Os demais compostos obtiveram resultados similares à tioureia, sendo que a aldimina 3A6 não teve qualquer atividade inibitória (Tabela 1 ). [00120] Tabela i. Resultado do efeito das aldiminas da série 3A na atividade de urease purificada de Canavalia ensiformis. Todos os compostos- teste foram usados na concentração final de 500 μΜ.
Inibição atividade urease
Composto-teste
Ureia 10 mM Ureia 20 mM
NBPT 100 100
Tioureia 15 16
Hidroxiureia 63 57
3A2 16 18
3A3 20 20
3A4 23 25
3A5 12 13
3A6 0 0
3A7 5 1 1
3A8 26 23
3A9 52 49
3A10 12 1 1
[00121 ] Na série 3B (Figura 6), os compostos 3B6 e 3B10 apresentaram atividade inibitória da urease de destaque (90 e 80%) e (89 e 75%), respectivamente, em reações contendo ureia a 10 e 20 mM (Tabela 2). Esses resultados foram os que mais se aproximaram do percentual de inibição exibido pelo inibidor-referência NBPT, entre todas as aldiminas testadas in vitro (Tabela 2). A eficiência dos compostos 3B3, 3B4 e 3B7 como inibidores da enzima urease foi similar à da hidroxiureia (Tabela 2). A aldimina 3B8 apresentou atividade inibitória pouco superior a 20%, enquanto os compostos 3B2 e 3B5 se mostraram praticamente inativos (Tabela 2).
[00122] Tabela 2. Resultado do efeito das aldiminas da série 3B na atividade de urease purificada de Canavalia ensiformis. Todos os compostos-teste foram usados na concentração final de 500 μΜ.
Inibição atividade urease (%)
Composto-teste
Ureia 10 mM Ureia 20 mM NBPT 100 100
Tioureia 15 16
Hidroxiureia 63 57
3B2 6 0
3B3 66 55
3B4 58 70
3B5 0 0
3B6 90 80
3B7 56 53
3B8 37 28
3B10 89 75
[00123] O composto que exibiu maior percentual de inibição da enzima urease na série 3C (Figura 7) foi a aldimina 3C4 (53 e 52%), nas concentrações de ureia a 10 e 20 mM (Tabela 3). O composto 3C3 apresentou 30% de inibição, em média, e a molécula 3C10 mostrou inibição pouco superior a 20% somente na concentração de ureia de 10 mM (Tabela 3). Os resultados obtidos para os compostos 3C2, 3C5, 3C6, 3C7 e 3C9 foram similares aos da tioureia, enquanto a aldimina 3C8 apresentou atividade inibitória pouco expressiva (Tabela 3).
[00124] Tabela 3. Resultado do efeito das aldiminas da série 3C na atividade de urease purificada de Canavalia ensiformis. Todos os compostos-teste foram usados na concentração final de 500 μΜ.
Inibição atividade urease (%)
Composto-teste
Ureia 10 mM Ureia 20 mM
NBPT 100 100
Tioureia 15 16
Hidroxiureia 63 57
3C2 17 10
3C3 34 30
3C4 53 52
3C5 20 0
3C6 14 0 3C7 14 5
3C8 5 6
3C9 1 1 6
3C10 22 15
[00125] Dentre os compostos da série 3D (Figura 8), as aldiminas 3D4, 3D5, 3D7, 3D9 e 3D10 exibiram percentuais de inibição da enzima urease mais significativos, com resultados comparáveis à hidroxiureia (Tabela 4). Os compostos 3D3 e 3D6 apresentaram percentual de inibição pouco superior a 20%, enquanto os resultados obtidos para as aldiminas 3D2 e 3D8 foram praticamente nulos (Tabela 4).
[00126] Tabela 4. Resultado do efeito das aldiminas da série 3D na atividade de urease purificada de Canavalia ensiformis. Todos os compostos-teste foram usados na concentração final de 500 μΜ
Inibição atividade urease (%)
Composto-teste
Ureia 10 mM Ureia 20 mM
NBPT 100 100
Tioureia 15 16
Hidroxiureia 63 57
3D2 5 0
3D3 22 21
3D4 55 47
3D5 63 62
3D6 29 47
3D7 50 49
3D8 0 0
3D9 49 41
3D10 46 18
[00127] Na série 3E (Figura 9), o composto 3E9 apresentou maior atividade inibitória da urease (66 e 64%), em reações contendo ureia a 10 e 20 mM (Tabela 5). A aldimina 3E8 exibiu 30% de inibição, em média, enquanto a aldimina 3E5 mostrou inibição pouco superior a 20% (Tabela 5). Os compostos 3E2, 3E3, 3E7 e 3E10 foram tão eficientes quanto à tioureia e as aldiminas 3E4 e 3E6 foram praticamente inativas (Tabela 5).
[00128] Tabela 5. Resultado do efeito das aldiminas da série 3E na atividade de urease purificada de Canavalia ensiformis. Todos os compostos-teste foram usados na concentração final de 500 μΜ.
Inibição atividade urease (%)
Composto-teste
Ureia 10 mM Ureia 20 mM
NBPT 100 100
Tioureia 15 16
Hidroxiureia 63 57
3E2 17 19
3E3 15 14
3E4 0 0
3E5 24 16
3E6 8 7
3E7 10 9
3E8 32 30
3E9 66 64
3E10 10 12
[00129] Na série 3F (Figura 10), os compostos 3F8 e 3F9 apresentaram percentuais de inibição de (39 e 36%) e (28 e 22%), respectivamente, nas concentrações de ureia de 10 e 20 mM (Tabela 6). As atividades inibitórias dos compostos 3F2, 3F3 e 3F10 foram equivalentes à do inibidor tioureia. Os demais compostos não apresentaram quaisquer percentuais de inibição (Tabela 6).
[00130] Tabela 6. Resultado do efeito das aldiminas da série 3F na atividade de urease purificada de Canavalia ensiformis. Todos os compostos-teste foram usados na concentração final de 500 μΜ.
Inibição atividade urease
Composto-teste
Ureia 10 mM Ureia 20 mM
NBPT 100 100 Tioureia 15 16
Hidroxiureia 63 57
3F2 9 15
3F3 18 18
3F4 0 0
3F5 0 0
3F6 0 0
3F8 28 22
3F9 39 36
3F10 18 17
[00131 ] Na série 3G (Figura 11 ), os compostos com maior inibição da atividade urease foram: 3G2 (26 e 21 %), 3G8 (21 e 64%) e 3G9 (21 e 16%), nas concentrações de ureia a 10 e 20 mM (Tabela 7). As aldiminas 3G4, 3G5, 3G6 e 3G7 exibiram percentuais de inibição comparáveis aos da tioureia, enquanto os compostos 3G3 e 3G10 apresentaram resultados praticamente nulos (Tabela 7).
[00132] Tabela 7. Resultado do efeito das aldiminas da série 3G na atividade de urease purificada de Canavalia ensiformis. Todos os compostos-teste foram usados na concentração final de 500 μΜ.
Inibição atividade urease (%)
Composto-teste
Ureia 10 mM Ureia 20 mM
NBPT 100 100
Tioureia 15 16
Hidroxiureia 63 57
3G2 26 21
3G3 4 1
3G4 19 17
3G5 19 8
3G6 19 19
3G7 14 1 1
3G8 21 64
3G9 21 16
3G10 4 0 [00133] Entre os compostos da série 3H (Figura 12), a aldimina 3H2 apresentou maior percentual de inibição da atividade urease (69 e 69%) nas concentrações de ureia de 10 e 20 mM (Tabela 8). Os compostos 3H3, 3H7 e 3H8 apresentaram resultados pouco superiores a 20% de inibição (Tabela 8). As aldiminas 3H4, 3H5, 3H9 e 3H10 exibiram inibição da urease pouco expressiva, assim como o único composto testado da série 31 (Figura 12), a aldimina 3I2 (Tabela 8).
[00134] Tabela 8. Resultado do efeito das aldiminas das séries 3H e 31 na atividade de urease purificada de Canavalia ensiformis. Todos os compostos- teste foram usados na concentração final de 500 μΜ.
Inibição atividade urease (%)
Composto-teste
Ureia 10 mM Ureia 20 mM
NBPT 100 100
Tioureia 15 16
Hidroxiureia 63 57
3H2 69 69
3H3 28 29
3H4 15 0
3H5 0 7
3H6 37 39
3H7 24 24
3H8 24 27
3H9 0 0
3H10 7 7
3I2 1 1 13
Exemplo 10 - Efeito das aldiminas selecionadas, na atividade de ureases da microbiota do solo.
[00135] Após triagem in vitro, os compostos que apresentaram atividade inibitória da urease de Canavalia ensiformis superior a 20% nas concentrações de ureia de 10 e/ou 20 mM foram selecionados para avaliação do potencial de inibição da atividade de ureases da microbiota do solo. Utilizou-se para os experimentos frações de solo classificado como latossolo distrófico, sendo coletados os primeiros 20 cm da camada superficial, na EMBRAPA Milho e Sorgo (Sete Lagoas, MG). As amostras de solo apresentaram as características físico-químicas mostradas na Tabela 9.
[00136] Tabela 9. Dados da análise de fertilidade do solo da região de Sete Lagoas-MG utilizado para os experimentos in vivo. Onde: *SB = soma de bases; **V = saturação de bases; ***MO = matéria orgânica.
Figure imgf000034_0001
[00137] Inicialmente as frações de solo foram peneiradas, homogeneizadas e armazenadas a -4°C até a realização dos procedimentos experimentais. Os testes foram realizados com 0,5 g de solo seco, que foi incubado por 1 h, a 37°C, sob agitação de 150 rpm, com solução de ureia a 72 mM contendo ou não cada uma das aldiminas na concentração final de 500 μΜ. A reação foi paralisada com 5 ml_ de KCI/HCI (ambos a 1 M) por 30 min, com agitação de 150 rpm. Após decantação, alíquotas de 20 μΙ_ do sobrenadante foram coletadas e adicionou-se 100 μΙ_ de solução contendo salicilato de sódio, citrato de sódio, tartarato de sódio e nitroprussiato de sódio. Essa mistura ficou em incubação por 15 min sob agitação a 600 rpm, à temperatura ambiente, na ausência de luz. Em seguida, adicionou-se 100 μΙ_ de solução contendo NaOH e hipoclorito de sódio e após 1 h de incubação sob agitação de 600 rpm, à temperatura ambiente e na ausência de luz, leituras espectrofotométricas foram realizadas a 660 nm. A quantificação do NH4 + liberado pela hidrólise da ureia nas amostras de solo foi realizada de acordo com o método colorimétrico do indofenol (KANDELER, E.; GERBER, H. Short-term assay of soil urease activity using colorimetric determination of ammonium. Biology and Fertility of Soils, 6: 68-72, 1988). O NBPT foi usado como controle positivo e etanol absoluto como controle negativo. Utilizou-se NH4CI como padrão e os resultados foram expressos em porcentagem de inibição.
[00138] Dentre os 32 compostos avaliados, oito apresentaram atividade inibitória superior à do inibidor-referência NBPT, quando avaliados a 500 μΜ (Tabela 10).
[00139] Tabela 10. Resultado do efeito das aldiminas selecionadas no teste in vitro, sobre a atividade de ureases da microbiota de latossolo distrófico.
Inibição da atividade de ureases
Composto-teste
da microbiota do solo (%)
NBPT 52
3A4 62
3A8 10
3A9 13
3B3 65
3B4 69
3B6 29
3B7 13
3B8 18
3B10 13
3C3 10
3C4 75
3C10 9
3D3 30
3D4 80
3D5 33
3D6 71
3D7 21
3D9 28
3D10 67
3E5 62
3E8 1 1
3E9 18
3F8 15
3F9 3
3G2 3
3G8 7 3G9 8
3H2 6
3H3 2
3H6 2
3H7 2
3H8 15
[00140] A aldimina 3D4 apresentou a maior porcentagem de inibição, sendo cerca de 1 ,5 vezes maior que aquela apresentada pelo inibidor-referência NBPT (Tabela 10). Os compostos 3C4 e 3D6 também exibiram expressiva atividade inibitória da enzima urease (acima de 70%), enquanto as aldiminas 3A4, 3B3, 3B4, 3D10 e 3E5 apresentaram eficiência satisfatória, com percentuais de inibição entre 62 e 69% (Tabela 10). Os resultados apresentados pelos demais compostos não superaram a eficiência do inibidor- referência NBPT (Tabela 10).
[00141 ] De posse desses resultados, testes complementares foram realizados com as aldiminas 3A4, 3B3, 3B4, 3C4, 3D4, 3D6, 3D10 e 3E5 a fim de se determinar a concentração dos inibidores necessária para inibir em 50% a atividade de ureases da microbiota do solo (IC50). Nesses ensaios utilizou-se ureia na concentração de 10 mM e concentrações variadas de cada um dos compostos.
[00142] As aldiminas 3B4 e 3D4 se mostraram as mais promissoras na inibição da atividade ureolítica do solo, com valores de IC50 iguais a 27 e 52 μΜ, respectivamente (Tabela 11 ). Os compostos 3A4, 3B3, 3B4, 3C4, 3D4, 3D6, 3D10 e 3E5 apresentaram eficiência intermediária, sendo necessárias concentrações entre 98 e 129 μΜ para atingir o IC50. As aldiminas 3C4 e 3D6 se mostraram menos efetivas, com valores de IC50 superiores a 230 μΜ (Tabela 11 ).
[00143] Tabela 11. Resultado da determinação das concentrações de aldiminas necessárias para inibir em 50% a atividade de ureases da microbiota
Figure imgf000036_0001
Composto-teste IC50 (MM) 3A4 1 13
3B3 129
3B4 27
3C4 265
3D4 52
3D6 234
3D10 107
3E5 98
Exemplo 11 - Avaliação da estabilidade térmica por termogravimetria (TG) das aldiminas aromáticas 3A4, 3B3, 3B4, 3C4, 3D4, 3D6, 3D10, e 3E5 em comparação ao NBPT.
[00144] As amostras de 3A4, 3B3, 3B4, 3C4, 3D4, 3D6, 3D10, e 3E5 e
NBPT foram analisadas em termobalança TGA 50H (Shimadzu). As amostras foram acondicionadas em cadinhos de alumina (AI2O3) e os experimentos foram conduzidos em atmosfera dinâmica de nitrogénio sob fluxo de 50 mL min"1. O aquecimento foi realizado a partir da temperatura ambiente até 600 °C na razão de 10 °C min"1.
[00145] As curvas de TGA (Figura 45) das aldiminas 3A4, 3B3, 3B4 e 3C4 mostram claramente que estes compostos são termicamente mais estáveis que o NPBT. Até a temperatura de 170 °C o NBPT sofre uma perda de, aproximadamente, 15% em massa enquanto as aldiminas perdem, no máximo, 3%. Para as aldiminas 3D4, 3D6, 3D10, e 3E5 (Figura 46) verificou-se que, com exceção do composto 3D10, as demais aldiminas também se mostram mais estáveis que o NBPT. Dentre todos os compostos avaliados, as aldiminas 3B4 e 3D6 se apresentaram como os mais estáveis, com perda de massa inferior a 2% até a temperatura de 200 °C.
Exemplo 12 - Determinação do perfil de inibição da aldimina 3D6 sobre a urease de Canavalia ensiformis.
[00146] Estudos de cinética enzimática foram conduzidos com urease de Canavalia ensiformis com o intuito de se determinar o perfil de inibição da aldiminas, aqui tomada como exemplo a aldimina 3D6. Os experimentos de cinética foram feitos como descrito no exemplo 9, exceto que meios de reação individualizados foram preparados com concentrações variadas de ureia (1 a 32 mM) na presença ou não de 3D6 a 100 μΜ ou 200 μΜ. A Figura 47 apresenta as piotagens de Michaelis-Mentem e de Lineweaver-Burk (duplo recíproco) as quais evidenciam o comportamento de inibição mista exibido pela aldimina 3D6, caracterizada por alterações tanto no Vmax quanto no Km da ureia (Tabela 12)
[00147] Tabela 12. Resultados das alterações dos parâmetros cinéticos da urease de Canavalia ensiformis influenciadas pela presença de 3B4 no meio de reação.
Concentração de Vmax (μιηοΙ N H4 + min m (mM)
3Β4 (μΜ) mg proteína
0 4,5 20,3
100 4,4 18, 1
200 5,7 16,2
Exemplo 13 - Obtenção de pérolas de ureia combinadas com aldiminas aromáticas ou com NBPT.
[00148] Cada aldimina ou NBPT foi dissolvido em solvente orgânico tal como, acetona, etanol, metanol, etanolamina, dietanoamina, trietanolamina, acetato de etila, entre outros, a concentrações na faixa de 2,5 g/L a 100 g/L. Após completa solubilização dos sólidos, pérolas de ureia foram tratadas com as soluções de aldimina ou NBPT na razão de 5 a 50 kg de ureia para cada litro de solução de aldimina ou NBPT.
[00149] As pérolas de ureia foram agitadas mecanicamente na presença das soluções e mantidas em capelas de exaustão, à temperatura ambiente, até a evaporação completa dos solventes orgânicos. Imagens representativas de pérolas de ureia combinadas ou não com a aldimina 3B4 ou NBPT (0,05 % e 0,25%; m/m) são ilustradas na Figura 48. Exemplo 14 - Efeito de pérolas de ureia combinadas ou não com aldimina 3B4 ou NBPT no crescimento e desenvolvimento de plantas de Cenchrus americanus (= Pennisetum glaucum; milheto).
[00150] O efeito da aldimina 3B4 no crescimento e desenvolvimento de plantas foi investigado no sistema so\o-Cenchrus americanus (milheto) em cultivo em casa de vegetação. O delineamento experimental consistiu em tratamentos preparados em quadruplicatas nos quais se utilizou pérolas de ureia (150 ppm de N) combinadas com as aldiminas segundo a relação massa/massa de 0,25%, 0,50% ou 1 ,00%. Pérolas de ureia (150 ppm de N) combinadas com NBPT às mesmas relações massa/massa foram empregadas como controle positivo de inibição de urease. A semeadura do milheto foi realizada em vasos contendo 3 kg de solo latossolo vermelho distrófico peneirado. O desbaste das plantas foi efetuado após 10 dias da semeadura, mantendo-se 8 plântulas (com crescimento uniforme) por vaso. A aplicação em cobertura das pérolas de ureia combinadas ou não com os inibidores de urease no solo ocorreu 26 dias após a semeadura. Os controles consistiram em vasos contendo solo desprovido de ureia ou suplementado unicamente com ureia perolada. As plantas foram mantidas sob os tratamentos por um período de 30 dias, após o qual foi determinada a altura de cada planta por vaso para fins de comparação com os valores obtidos imediatamente antes da aplicação dos tratamentos. A partir dos dados obtidos, calculou-se a taxa de crescimento relativo da altura das plantas segundo a fórmula [ln(/A/í2)-ln(/A/íi)]/T, onde Afc e AI são a altura final e a inicial, respectivamente, e T o tempo (em dias) entre as medições inicial e final (GUANARATNE, A.M.T.A. et al. Release from root competition promotes tree seedling survival and growth following transplantation into human-induced grasslands in Sri Lanka. Forest Ecology and Management, v.262, p. 229-236, 201 1 ).
[00151 ] A Figura 48 ilustra o desenvolvimento da parte aérea de milheto em cultivo com ureia combinada ou com a aldimina 3B4 ou com NBPT a diferentes doses por um período de 14 dias. A contribuição da imina 3B4 no aumento do porte de milheto foi ainda mais acentuada após 30 dias de tratamento com ureia combinada com este inibidor de urease (Figura 49). A taxa de crescimento relativo da altura da parte aérea, ao final do experimento (56 dias após a semeadura dos quais 30 dias sob tratamento com ureia combinada), foi mais expressiva nas plantas cultivadas na presença de 3B4 a 0,50% (m/m), apresentando valores comparáveis ao observado para plantas cultivadas na presença de NBPT a 1 ,00% (m/m) (Figura 50).

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Processo de obtenção de pérolas de ureia, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) dissolução de cada aldimina pura em solvente orgânico tal como acetona, etanol, metanol, etanolamina, dietanoamina, trietanolamina ou acetato de etila, nas concentrações entre 2,5 g/L a 100 g/L; b) após completa solubilização, inserção das pérolas de uréia nas soluções de aldimina, obtidas na etapa (a), na razão de 5 a 50 kg de ureia para cada 1 a 10 L de solução de aldimina; c) agitação mecânica das pérolas de ureia, na presença de cada uma das soluções, obtidas na etapa (b), até completa homogeneização, e alocação em capelas de exaustão até a evaporação completa dos solventes orgânicos.
2. Processo de obtenção de pérolas de ureia, de acordo com a reivindicação 1, etapa "a", caracterizado por compreender as aldiminas
Figure imgf000041_0001
b. R3 é selecionado do grupo compreendendo -H, -OH, -CN ou -OCH: c. R4 é -H ou -OH; d. R5 é selecionado do grupo compreendendo -H, -F, -Cl, -OH, -CN,
-SCH3 ou -OCH3;
Figure imgf000042_0001
f. R6 é -H, -OH ou -N02;
g. R7 é -H ou -OH; h. R8 é selecionado do grupo compreendendo -H, -F, -OH, -NO2 -OCH3 ou -NH2; i. R9 é -H ou -OH;
Figure imgf000042_0002
k. n é 0 ou 1 .
3. Produto obtido através do processo definido na reivindicação 1, caracterizado por compreender pérolas de ureia incorporadas/encapsuladas ou revestidas, preferencialmente revestidas, com a aldimina
Figure imgf000042_0003
b. R3 é selecionado do grupo compreendendo -H, -OH, -CN ou -OCH: c. R4 é -H ou -OH; d. R5 é selecionado do grupo compreendendo -H, -F, -Cl, -OH, -CN,
-SCH3 ou -OCH3;
Figure imgf000043_0001
f. R6 é -H, -OH ou -N02; g. R7 é -H ou -OH; h. R8 é selecionado do grupo compreendendo -H, -F, -OH, -NO2 -OCH3 ou -NH2; i. R9 é -H ou -OH; j. R10 é -H ou -NO2; e k. n é 0 ou 1 .
4. Uso das pérolas de ureia, definidas na reivindicação 3, caracterizado por ser na inibição de enzimas ureases presentes no solo, preferencialmente na melhoria do crescimento e desenvolvimento de culturas agrícolas produzidas a partir do uso de fertilizantes à base de ureia.
5. Uso das aldiminas puras ou combinadas entre si, caracterizado pelas aldiminas
Figure imgf000043_0002
b. R3 é selecionado do grupo compreendendo -H, -OH, -CN ou -OCH: c. R4 é -H ou -OH; d. R5 é selecionado do grupo compreendendo -H, -F, -Cl, -OH, -CN,
-SCH3 ou -OCH3;
Figure imgf000044_0001
f. R6 é -H, -OH ou -N02;
g. R7 é -H ou -OH; h. R8 é selecionado do grupo compreendendo -H, -F, -OH, -NO2 ,-OCH3 ou -NH2; i. R9 é -H ou -OH;
Figure imgf000044_0002
k. n é 0 ou 1 , ser na inibição da atividade ureolítica de ureases, e no tratamento de doenças ocasionadas por microrganismos patogênicos dependentes da atividade da enzima urease, preferencialmente no controle de infecções causadas por Heiícobacter pylori.
PCT/IB2016/052491 2015-04-30 2016-05-02 Pérolas de ureia combinadas com aldiminas, processo de obtenção e usos na agricultura, e aplicações das aldiminas no tratamento de infecções bacterianas WO2016174648A1 (pt)

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PCT/IB2016/052491 WO2016174648A1 (pt) 2015-04-30 2016-05-02 Pérolas de ureia combinadas com aldiminas, processo de obtenção e usos na agricultura, e aplicações das aldiminas no tratamento de infecções bacterianas

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