WO2016159435A1 - 제니핀 또는 이의 유도체를 포함하는 면역활성 증강용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

제니핀 또는 이의 유도체를 포함하는 면역활성 증강용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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이선미
김소진
김준성
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Sungkyunkwan University
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Sungkyunkwan University
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for enhancing immunological activity and the use thereof, which comprises jennypin or derivatives thereof, and more particularly, to a pharmaceutical composition or a food composition for enhancing immunological activity comprising jennypin or derivatives thereof.
  • the immune response is a self-defense system that exists in the host, and is a biological phenomenon that distinguishes and removes various substances and organisms that invade from the outside.
  • This self-defense surveillance system consists of two main mechanisms: humoral immunity and cellular immunity.
  • Immune enhancement refers to all actions that elevate the specific or non-specific, cellular and humoral immune responses of such hosts, and recently, the use of immune enhancement in the treatment of infections or tumors has attracted much attention.
  • the agents used to enhance the immunity are divided into general immune enhancers and specific immune enhancers according to specificity, and active according to the function It can be divided into immunopotentiator and passive immunopotentiator.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems in the prior art, the present inventors have been researched to find a natural material to enhance the immune activity, as a result of the inhibition of the inhibition of T lymphocytes T lymphocytes in the immunosuppressive state The effects of improving and enhancing immune activity have been identified and the present invention has been completed based on this.
  • composition for enhancing immune activity comprising jennypin or a derivative thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for enhancing the immune activity comprising a nippin or a derivative thereof as an active ingredient.
  • the composition can increase the number of CD4 + and / or CD8 + cells.
  • the composition may inhibit apoptosis of CD4 + and / or CD8 + cells.
  • the composition may inhibit the expression of one or more proteins selected from the group consisting of Bim, FADD, caspase-3 and caspase-8 proteins, which are whole apoptosis molecules.
  • the composition may increase the expression of Bcl-2 protein, which is an anti-apoptotic molecule.
  • the composition may reduce the number of regulatory T cells (Treg).
  • the composition may increase the production of pro-inflammatory cytokines IL-2 and / or IFN- ⁇ .
  • the composition may reduce the production of anti-inflammatory cytokines IL-10 and / or IL-4.
  • the present invention provides a food composition for enhancing immune activity, comprising jennypin or a derivative thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for enhancing immune activity, comprising administering to a subject a composition comprising jennypin or a derivative thereof.
  • Jenny pin or derivatives thereof according to the present invention is characterized by increasing the number of CD4 + T cells and / or CD8 + T cells, reducing the number of regulatory T cells (Treg).
  • Teg regulatory T cells
  • it is a natural material, it can reduce the side effects that occur frequently in chemicals. Therefore, it is expected that it can be usefully used as an active ingredient of a pharmaceutical composition or food composition that enhances immune activity.
  • 3 is a result of confirming the change in the number of CD4 + and CD8 + lymphocytes in the spleen according to the treatment with jennypin.
  • Figure 6 shows the results of the change in the ratio of CD4 + CD25 + Foxp3 + and CD4 + CD25 + CTLA4 + regulatory T cells in the spleen following the treatment with Jenny pin.
  • Figure 7 is a result confirming the change in cytokine secretion in the spleen following the treatment with jennypin.
  • the present invention provides a composition for enhancing immune activity, comprising jennypin or a derivative thereof as an active ingredient, wherein the composition comprises a pharmaceutical composition or a food composition.
  • Genipin in the present invention refers to a component that represents the main pharmacological efficacy of the gardenia fruit (garia) as a non-sugar portion of the geniposide, a natural component of the iridoid glycoside family, It can be represented as.
  • Geniine has been reported to promote the secretion of gastric acid, to inhibit antioxidant activity and nitric oxide (NO) production or to improve pathological tissue lesions in a hepatotoxicity model, but enhanced immune activity by inhibition of T lymphocyte death revealed in the present invention. The use was first identified by the inventor.
  • the term "derived from genipin” refers to the same activity as Genipin, and include compounds that have an effect of enhancing immune activity, without limitation, for example, geniposide, genipiodiic acid (genipiodisic acid), penta-acetyl geniposide; Molecular Pharmacology, 70 (3), 997-1004, 2006), 6a-hydroxygeniposide, 6b-hydroxygeniposide 6b-dhydroxygeniposide), 6a-methoxygeniposide or 6b-methoxygeniposide (Journal of Health Science, 52 (6), 743-747, 2006). Preferably it may be geniposide. It is apparent to those skilled in the art that zenithposide is metabolized to jennypin by the intestinal bacteria in the body at the time of ingestion.
  • the composition may exhibit an immune activity enhancing effect by inhibiting the reduction of immune cells, which is one of the main features of immunosuppression.
  • composition according to the present invention can exhibit an effect of enhancing immune activity by inhibiting cell death of immune cells.
  • the apoptosis rate of CD4 + and CD8 + lymphocytes is significantly suppressed (FIG. 4). It was confirmed that the expression of Bim, FADD, caspase-3 and caspase-8 proteins, which are whole apoptosis molecules, was suppressed, and that Bcl-2 protein, which is an anti-apoptotic molecule, was increased (see FIG. 5).
  • CD4 + T cells are the major effector cells in the acquired immune system, and they play an important role in the anti-inflammatory response.
  • helper T lymphocytes can be divided into Th1, Th2 and regulatory T cells.
  • Th1 cells produce interferon-gamma (IFN- ⁇ ) and interleukin-2 (IL-2), which are responsible for cell mediated immunity and inflammatory responses.
  • Th2 cells produce interleukin-4 (IL-4) and interleukin-10 (IL-10), which are responsible for the humoral immune system and anti-inflammatory responses.
  • Regulatory T cells are a type of T lymphocyte, also called inhibitory T cells.
  • Regulatory T cells play a role in maintaining homeostasis of the immune system by inhibiting cytokine secretion of other inflammatory cells, inhibiting the differentiation of T lymphocytes or inducing apoptosis of T lymphocytes. Recent reports have shown that excessive proliferation of regulatory T cells is one of the factors inducing immunosuppression.
  • CD4 + CD25 + Foxp3 + and CD4 + CD25 + CTLA4 + Regulatory T cell ratios were markedly inhibited, Th1-derived cytokines (IFN- ⁇ and IL-2) production increased, and Th2-derived cytokine (IL-4 and IL-10) production was reduced (FIG. 6). And FIG. 7).
  • composition according to the present invention can be usefully used for preventing, ameliorating or treating diseases caused by immunodeficiency, immunodeficiency or immune system damage by enhancing immune activity.
  • composition according to the invention when the composition according to the invention is in the form of a pharmaceutical composition, it may comprise a pharmaceutically effective amount of nippin alone or one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to increase immune activity.
  • the effective dose level depends on the type of disease, severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent drug use, and other factors well known in the medical field. Can be determined.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the age, sex, condition, weight of the patient, the absorption of the active ingredient in the body, the inactivation rate and excretion rate, the type of disease, the drug used in general May be administered 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg daily or every other day or divided into 1 to 3 times a day per kg body weight.
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention include, but are not limited to, saline, buffered saline, water, glycerol and ethanol, and any suitable agent known in the art may be used.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to an individual in need thereof, including humans.
  • Formulations may be, but are not limited to, powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • composition according to the present invention can also be used as a dietary supplement composition for enhancing immune activity.
  • jennypin can be easily utilized in the production of health functional foods, such as the main raw materials, side ingredients, food additives, functional foods or beverages that are effective for enhancing immune activity.
  • the "health functional food” is a biological defense rhythm control having a food group or a food composition to which added value to act and express the function of the food to a specific purpose using physical, biochemical, biotechnological methods, etc. It means a food processed and designed to fully express the body control function on disease prevention and recovery to the living body, which may further include food acceptable food additives, suitable carriers, excipients and commonly used It may further comprise a diluent.
  • the health functional food composition of the present invention is a variety of nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and fillers (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof, alginic acid And salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like, which components can be used independently or in combination.
  • the amount of the jenny pin may include from 0.001% to 90% by weight of the total weight of the health functional food, preferably from 0.1% to 40% by weight, may be below the above range for long-term intake use
  • the active ingredient is not limited to the above range because there is no problem in terms of safety and can be used in an amount above the above range.
  • Jenny Fin is a company of Wako Pure Chemical Industries, Ltd. It was purchased from (Osaka, Japan). Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS), penicillin / streptomycin and fetal bovine serum (FBS) were purchased from Gibco Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Antibodies for flow cytometry (FACS) were purchased from eBioscience (San Jose, CA, USA). Other cell culture materials were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). All test materials used reagent grade.
  • mice were supplied with ICR male mice (27-29 g) from Orient Bio Co., Ltd. and purified for 1 week before being used for the experiment. All experimental animals were purified in a laboratory where the contrast was controlled at temperature and 12 hour intervals, and the solid feed (orient bio) and water were ingested freely. All animal experiments were approved by the Animal Experiment Ethics Committee of the College of Pharmacy, Sungkyunkwan University, and were tested according to the guidelines of the National Institutes of Health (NIH publication No. 86-23, revised 1985).
  • CLP Cecal ligation and puncture
  • mice were anesthetized with ketamine (ketamine; 100 mg / kg; Yuhan Corporation, Seoul, Korea) and xylazine (xylazine; 10 mg / kg; Bayer, Leverkusen, Germany), followed by Chaudry et al. (Chaudry IH, Wichterman).
  • Septicemia was induced through CLP according to the method of KA, Baue AE.Effect of sepsis on tissue adenine nucleotide levels.Surgery 1979; 85: 205-11. That is, the medial abdominal cavity was incised to expose the cecum to the outside, and the end of the septic valve was ligated with 3.0 sutures so as to prevent intestinal obstruction.
  • Splenocytes were blocked for 15 minutes with anti-mouse CD16 / CD32 antibody. After that, the reaction was stopped by flow cytometry buffer and centrifuged to obtain pellet. The isolated splenocytes were reacted with anti-CD3 (PerCP-Cy5.5), anti-CD4 (APC), anti-CD8 (PE), anti-CD25 (PE) and anti-CTLA4 (APC) antibodies. Intracellular staining was stained using Foxp3 / Transcription factor staining buffer. Flow cytometry was performed using GuavaSoft TM software and Guava easyCyte8 (Millipore, Billerica, Mass., USA).
  • Protein samples were loaded onto 7.5-18% polyacrylamide gels and then separated to protein size using SDS-PAGE.
  • the separated protein was transferred to PVDF membrane using Trans-Blot Cell, and blocked with 5% skim milk powder (solvent: TBST) for 1 hour at room temperature. Thereafter, the primary antibody was reacted at 4 ° C. overnight, and the secondary antibody was reacted at room temperature for 1 hour the next day.
  • the amount of protein was detected using a chemiluminescence detection system (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea) and quantified using Total Lab TL120 software (Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastle, UK).
  • Bim, B-cell lymphoma (Bcl) -2, Fas-Associated protein with Death Domain (FADD), caspase-3 and caspase-8 antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) and measured proteins The amount was normalized by dividing by the protein amount of ⁇ -actin (Sigma-Aldrich).
  • mice were administered immediately after CLP surgery and 24 hours after nippin (1, 2.5 and 5 mg / kg) or PBS (solvent) through the tail vein.
  • nippin 1, 2.5 and 5 mg / kg
  • PBS solvent
  • survival was observed up to 7 days after sepsis induction, and confirmed that no further deaths occurred during the 3 weeks (10 per group).
  • the CLP group showed a survival rate of 50% on day 1 after CLP and maintained a survival rate of 20% from day 2 to day 7.
  • mice arbitrarily divided the mice into four groups (6 to 8 per group): (a) solvent administered sham group ('sham'), (b) 2.5 mg / kg jennypin administered sham group ('genipin' ), (c) solvent administered CLP group ('CLP') and (d) 2.5 mg / kg jennypin administered CLP group ('CLP + genipin').
  • sham is a mouse that did not induce sepsis as a control.
  • Reduction of immune cells is one of the most important features of immunosuppression.
  • the change in the number of immune cells in the four groups separated through Example 2 was measured. More specifically, in the case of the 'CLP' and 'CLP + genipin' group, 2.5 mg / kg of PBS (solvent) or Jennypin 2.5 mg / kg immediately after CLP surgery according to the method of Example 1-3 and 24 hours after the tail vein Administered via. Meanwhile, 2.5 mg / kg of PBS (solvent) or jennypin were also administered through the tail vein in the 'sham' and 'genipin' groups, respectively.
  • the spleen was homogenized using a syringe rubber and filtered using a 70- ⁇ m nylon mesh strainer to remove cellular debris. Erythrocytes in the filtered cells were digested with an RBC lysis buffer, and the number of separated cells was measured using a hemocytometer.
  • the ratio of CD4 + and CD8 + lymphocytes to the total CD3 + cells in the spleen of the 'Sham' group was 10.1 ⁇ 0.2% and 5.4 ⁇ 0.2%, respectively.
  • the ratio of CD4 + and CD8 + lymphocytes to the total CD3 + cells in the spleen of the 'CLP' group was reduced to 28.7% and 35.2% of the sham group, respectively.
  • the 'CLP + genipin' group it was confirmed that this reduction was significantly suppressed ( * p ⁇ 0.05 ** p ⁇ 0.01 compared to sham group. + P ⁇ 0.05 compared to CLP group.).
  • the ratio of CD25 + CTLA4 + lymphocytes to CD4 + lymphocytes in the spleen of the 'Sham' group was 0.34 ⁇ 0.04%.
  • 'CLP' group of the spleen in CD25 + CTLA4 + ratio of lymphocytes for CD4 + lymphocytes are one group ( 'CLP + genipin' administration of, Jenny pin was increased 3.6 times as compared to 'sham' group group ), This increase was significantly suppressed ( ** p ⁇ 0.01 compared to sham group. + P ⁇ 0.05 compared to CLP group.).
  • interleukin-2 interleukin-2
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • IL-10 interleukin-10
  • enzyme immunoassay enzyme immunoassay
  • the secretion amount of the spleen cells IL-2 and IFN- ⁇ in the 'Sham' group was 212.5 ⁇ 9.2 and 1876.6 ⁇ 226.2 pg / mL, respectively.
  • IL-2 and IFN- ⁇ secretion of splenocytes of the 'CLP' group decreased by 57% and 37% compared to the sham group, but the genipine group ('CLP + genipin' group). In the case of), it can be seen that the decrease is remarkably recovered.
  • the secretion amount of IL-10 and IL-4 of splenocytes was 71.2 ⁇ 5.6 and 15.8 ⁇ 2.5 pg / mL, respectively.
  • IL-10 and IL-4 secretion of splenocytes of 'CLP' group increased 1.6 and 2.5 times, respectively, compared to sham group, but the nippin group ('CLP + genipin' group) This increase was significantly suppressed ( * p ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01 compared to sham group. + P ⁇ 0.05 , ++ p ⁇ 0.01 compared to CLP group.).
  • Jenny pin or a derivative thereof according to the present invention increases the number of CD4 + T cells and / or CD8 + T cells, decreases the number of regulatory T cells (Treg), increases the secretion of inflammatory cytokines in a state of reduced immunity, etc. There is a characteristic which shows an effect. In addition, it is a natural material, it can reduce the side effects that occur frequently in chemicals. Thus, it can be usefully used as an active ingredient of a pharmaceutical composition or food composition to enhance immune activity.

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Abstract

본 발명은 제니핀 또는 이의 유도체를 포함하는 면역활성 증진용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 제니핀 또는 이의 유도체를 포함하는 면역활성 증진용 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 제니핀 또는 이의 유도체는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 수 를 증가시키고, 조절 T 세포(Treg) 수를 감소시키는 등의 효과를 나타내는 특징이 있다. 또한 천연물 소재인바, 화학물질에서 빈번히 나타나는 부작용도 감소시킬 수 있다. 이에, 면역활성을 증강시키는 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

제니핀 또는 이의 유도체를 포함하는 면역활성 증강용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 제니핀 또는 이의 유도체를 포함하는 면역활성 증강용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 제니핀 또는 이의 유도체를 포함하는 면역활성 증강용 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다.
면역반응이란 숙주 내에 존재하는 자기방어체계로서, 외부로부터 침입해오는 각종 물질이나 생명체를 자기자신과 구별해내어 제거하는 생물학적 현상이다. 이러한 자기방어를 위한 감시체계는 크게 두 가지 기작에 의해 이루어지는데 하나는 체액성 면역, 그리고 다른 하나는 세포성 면역이다. 면역 증강이란 이러한 숙주의 특이 또는 비특이, 세포성 및 체액성 면역반응을 상승시키는 모든 작용을 말하며, 최근에 감염이나 종양 등의 치료에 면역 증강이 이용되면서 많은 관심을 불러일으키고 있다.
예컨대, 패혈증의 경우, 최근 패혈증의 면역반응에 대한 많은 연구들이 이루어지고 있다. 즉, 몇몇 연구자들은 패혈증으로부터 유래되는 이병률과 사망률은 염증 반응을 동반하는 지속적인 면역 활성화의 결과라고 주장하는 반면, 다른 연구자들은 면역 억제의 결과라고 주장하기도 한다. 패혈증 환자를 대상으로 소염제를 이용한 수많은 임상실험에서 생존률을 향상시키는데 실패하였으며, 이러한 결과는 패혈증에서 주요한 사망의 원인으로서 과염증 반응에 대하여 재평가하게 만들었다. 최근 Hotchkiss 등(Hotchkiss RS, Monneret G, Payen D. Immunosuppression in sepsis: a novel understanding of the disorder and a new therapeutic approach. The Lancet Infectious diseases 2013;13:260-8.)은 동물 실험과 임상환자 실험 모두에서 패혈증 시 주된 사망 원인은 면역억제와 관련된 면역세포의 손실이라고 보고하였다.
상기와 같이, 면역억제 상태를 개선하고 면역활성을 증강시킴으로써 다양한 질환의 치료에 적용이 가능한데, 면역 증강에 이용되는 제제들은 특이성에 따라 일반 면역강화제와 특이 면역강화제로 구분되며, 또 기능에 따라 능동 면역강화제와 수동 면역강화제로 구분할 수 있다.
하지만, 이러한 면역 증강물질은 그 자체의 독성, 면역반응의 차이 등 여러 가지 부작용으로 인해 현재 인간에게 사용할 수 있는 물질은 극히 제한된 실정이고 그 효능도 매우 미미한 것으로 알려져 면역 증강제 개발에 있어서 커다란 장벽이 되어왔다. 따라서, 부작용이 없으면서 유용한 면역 증강효과를 나타내는 천연물질의 개발은 대단히 중요한 의미를 가지는바, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(국내 등록특허 10-0565442 등) 아직 미비한 실정이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 면역활성을 증강시키는 천연물 소재를 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 제니핀이 T 림프구의 사멸을 억제하여 면역억제 상태를 개선시키고, 면역활성을 증강시키는 효과를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 제니핀 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 제니핀 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포 수를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포의 세포사멸을 억제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 전세포자멸사 분자인 Bim, FADD, caspase-3 및 caspase-8 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 발현을 억제시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 항세포자멸사 분자인 Bcl-2 단백질 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 조절 T 세포(Treg) 수를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 전염증 사이토카인인 IL-2 및/또는 IFN-γ 생산을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 항염증 사이토카인인 IL-10 및/또는 IL-4 생산을 감소킬 수 있다.
또한, 본 발명은 제니핀 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 식품 조성물을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 제니핀 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역활성 증강 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 제니핀 또는 이의 유도체는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포 수를 증가시키고, 조절 T 세포(Treg) 수를 감소시키는 등의 효과를 나타내는 특징이 있다. 또한 천연물 소재인바, 화학물질에서 빈번히 나타나는 부작용도 감소시킬 수 있다. 이에, 면역활성을 증강시키는 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 CLP 유도 패혈증 모델에서 제니핀 처치에 따른 생존율 변화를 확인한 결과이다.
도 2는 제니핀 처치에 따른 비장세포 수 변화를 확인한 결과이다.
도 3은 제니핀 처치에 따른 비장 내 CD4+ 및 CD8+ 림프구 수 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 제니핀 처치에 따른 비장 내 CD4+ 및 CD8+ 림프구 세포자멸사 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 제니핀 처치에 따른 비장 내 Bim, Bcl-2, FADD, caspase-3 및 caspase-8 단백질 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 제니핀 처치에 따른 비장 내 CD4+CD25+Foxp3+ 및 CD4+CD25+CTLA4+ 조절 T 세포 비율 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 제니핀 처치에 따른 비장 내 사이토카인 분비 변화를 확인한 결과이다.
본 발명은 제니핀 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.
본 발명에서의 용어 "제니핀(genipin)" 이란 이리도이드 배당체 계통의 천연 성분인 제니포사이드(geniposide)의 비당부분으로서 치자나무 과실(치자)의 주요 약리 효능을 나타내는 성분을 의미하며, 하기 화학식 1로 나타낼 수 있다. 제니핀은 위산의 분비를 촉진하고 항산화작용 및 산화질소(NO) 생성 저해작용 또는 간독성 모델에서 병리학적 조직 병변을 개선시킴이 보고된 바가 있으나, 본 발명에서 밝힌 T 림프구 사멸 억제에 의한 면역활성 증강 용도는 본 발명자에 의해 최초로 규명되었다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2015004131-appb-I000001
본 발명에서의 용어 "제니핀(genipin)의 유도체"란 제니핀과 동일한 활성을 나타내며, 면역활성을 증강시키는 효과가 있는 화합물은 제한없이 포함되나, 그 예로 제니포사이드(geniposide), 제니피오다이식산(genipiodisic acid), 펜타-아세틸제니포사이드(penta-acetyl geniposide; Molecular Pharmacology, 70(3), 997-1004, 2006), 6a-하이드록시제니포사이드(6a-hydroxygeniposide), 6b-하이드록시제니포사이드(6b-dhydroxygeniposide), 6a-메토오시제니포사이드 (6a-methoxygeniposide) 또는 6b-메토오시제니포사이드 (6b-methoxygeniposide)이다(Journal of Health Science, 52(6), 743-747, 2006). 바람직하게는 제니포사이드 일 수 있다. 제니포사이드는 섭취시 체내 장내 세균에 의해서 제니핀으로 대사되므로, 제니핀과 동일한 효과가 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 면역억제의 주요한 특징 중 하나인 면역세포의 감소를 억제시킴으로써 면역활성 증강 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, CLP로 유도된 패혈증 모델을 사용하여 제니핀 처치에 따른 비장 내 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 수의 변화를 확인한 결과, 제니핀을 투여한 군의 경우, T 림프구의 감소가 현저히 억제됨을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명에 따른 조성물은 면역세포의 세포사멸을 억제함으로써 면역활성 증강 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 제니핀 처치에 따른 면역세포의 세포사멸 억제를 확인한 결과, 제니핀을 투여한 군의 경우, CD4+ 및 CD8+ 림프구의 세포자멸사 비율이 현저히 억제되고(도 4 참조), 전세포자멸사 분자인 Bim, FADD, caspase-3 및 caspase-8 단백질 발현이 억제되며, 항세포자멸사 분자인 Bcl-2 단백질 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 5 참조).
더욱이, CD4+ T 세포는 후천적 면역 시스템에서 주요한 효과기 세포(effector cell)이고, 이들은 항-염증 반응에서 중요한 역할을 한다. 분화 및 표현형에 근거하여 도움 T 림프구는 Th1, Th2 및 조절 T 세포로 나뉘어질 수 있다. Th1 세포는 인터페론-감마(IFN-γ) 및 인터루킨-2(IL-2)를 생산하며, 이들은 세포 매개 면역 및 염증반응을 담당한다. Th2 세포는 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-10(IL-10)을 생산하며, 이들은 체액성 면역 시스템과 항염증 반응을 담당한다. 조절 T 세포는 T 림프구의 일종으로 억제성 T 세포라고 불리기도 한다. 조절 T 세포는 다른 염증 세포의 사이토카인 분비를 억제하거나 T 림프구의 분화 억제 또는 T 림프구의 세포자멸사를 유도함으로써 면역 시스템의 항상성을 유지하는 역할을 한다. 최근 보고에 따르면, 조절 T 세포의 과도한 증식이 면역억제를 유도하는 요인 중 하나로 밝혀졌다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 제니핀 처치에 따른 조절 T 세포 비율 변화 및 사이토카인 분비 변화를 확인한 결과, 제니핀을 투여한 군의 경우, CD4+CD25+Foxp3+ 및 CD4+CD25+CTLA4+ 조절 T 세포 비율이 현저히 억제되고, Th1 유래 사이토카인(IFN-γ 및 IL-2) 생산이 증가하며, Th2 유래 사이토카인(IL-4 및 IL-10) 생산이 감소됨을 확인하였다(도 6 및 도 7 참조).
이에, 본 발명에 따른 조성물은 면역활성을 증강시킴으로서 면역결핍, 면역저하 또는 면역계 손상으로 인한 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물이 약학적 조성물의 형태인 경우, 약학적으로 유효한 양의 제니핀을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 면역활성을 증가시키기에 충분한 양을 말한다. 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1㎏ 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 모두 사용 가능하다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 인간을 포함하여 면역활성 증강을 필요로 하는 개체에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명에 따른 조성물은 면역활성을 증강시키는 건강기능 식품 조성물로도 사용할 수 있다.
그러므로 본 발명에서, 제니핀은 면역활성 증강에 효과가 있는 건강기능식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료의 제조에 용이하게 활용할 수 있다.
본 발명에서 상기 "건강기능식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 이는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 제니핀의 양은 전체 건강기능식품 중량의 0.001 중량% 내지 90 중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 40 중량%로 포함할 수 있고, 장기간 섭취 용도일 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으나, 유효성분이 안전성 면에서 아무런 문제가 없어 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있기 때문에 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 실험 물질
제니핀은 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)에서 구입하였다. Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지, Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS), penicillin/streptomycin 및 fetal bovine serum (FBS)은 Gibco Life Technologies (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 유세포 분석 (FACS)을 위한 항체는 eBioscience (San Jose, CA, USA)에서 구입하였다. 이 외의 세포 배양 물질들은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 모든 실험 물질은 reagent grade를 사용하였다.
1-2. 실험동물
실험동물은 ㈜ 오리엔트바이오로부터 ICR계 웅성 생쥐 (27-29 g)를 공급받아 1 주일 동안 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 온도 및 12시간 간격으로 명암이 조절되는 실험실에서 순화하였으며, 고형 사료 (오리엔트바이오) 및 물은 자유롭게 섭취시켰다. 모든 동물 실험은 성균관대학교 약학 대학 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았으며, National Institutes of Health의 가이드라인 (NIH publication No. 86-23, revised 1985)에 따라 실험하였다.
1-3. 맹장 결찰 및 천공법(cecal ligation and puncture; CLP)
생쥐에 케타민(ketamine; 100 mg/kg; Yuhan Corporation, Seoul, Korea) 및 자일라진(xylazine;10 mg/kg; Bayer, Leverkusen, Germany)을 근육 주사하여 마취시킨 후, Chaudry 등 (Chaudry IH, Wichterman KA, Baue AE. Effect of sepsis on tissue adenine nucleotide levels. Surgery 1979;85:205-11.)의 방법에 따라 CLP를 통해 패혈증을 유발시켰다. 즉, 복강 정중부를 절개하여 맹장을 외부로 노출시킨 후, 장폐색이 일어나지 않도록 회맹부 밸브의 말단을 3.0 봉합사로 결찰하였다. 이 후, 20게이지 카테터를 이용하여 맹장에 두 개의 구멍을 만들어 일정량의 분변을 유출시켰으며, 이를 포함하여 맹장을 다시 복강 내에 넣고 2.0 봉합사로 봉합한 후 탈수가 일어나지 않도록 1 mL의 생리식염수를 피하 주사하였다.
1-4. 유세포 분석법
비장세포는 항-마우스 CD16/CD32 항체로 15분간 blocking 하였다. 이 후, flow cytometry buffer로 반응을 정지시킨 후 원심 분리하여 pellet을 취하였다. 분리한 비장세포는 항-CD3 (PerCP-Cy5.5), 항-CD4 (APC), 항-CD8 (PE), 항-CD25 (PE) 및 항-CTLA4 (APC) 항체와 반응시켰다. 세포 내 염색은 Foxp3/Transcription factor 염색 완충액을 사용하여 염색하였다. 유세포 분석법은 GuavaSoft™ software 및 Guava easyCyte8(Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 실시하였다.
1-5. 웨스턴 블롯(Western blot)
단백질 샘플을 7.5-18%의 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩한 뒤, SDS-PAGE를 사용하여 단백질 크기대로 분리하였다. 분리된 단백질은 Trans-Blot Cell을 사용하여 PVDF membrane으로 옮겼으며, 5% 탈지분유 (용매: TBST)로 실온에서 1시간 blocking하였다. 이 후, 1 차 항체를 하룻밤 동안 4℃에서 반응시켰으며, 다음 날 2차 항체를 실온에서 1 시간 반응시켰다. 단백질의 양은 화학발광검출시스템 (iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)을 이용하여 검출하였으며, Total Lab TL120 software (Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastle, UK)를 이용하여 정량하였다. Bim, B-cell lymphoma (Bcl)-2, Fas-Associated protein with Death Domain (FADD), caspase-3 및 caspase-8 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였으며, 측정된 단백질 양은 β-actin (Sigma-Aldrich)의 단백질 양으로 나누어 표준화하였다.
1-6. 통계분석
생존율 평가 결과는 Kaplan-Meier curve 및 log-rank test로 분석하였다. 모든 결과는 평균 ± 평균의 표준오차로 나타내었으며, 결과의 유의성은 one-way analysis of variance로 분석하였다. 그룹 간의 차이는 Bonferronic correction을 통하여 p < 0.05를 기준으로 유의성을 검증하였다.
실시예 2. CLP 유도 패혈증 모델에서 제니핀 처치에 따른 생존율 변화 확인
생존율 평가를 위하여, CLP 수술 직후 및 24시간 후 생쥐에게 제니핀 (1, 2.5 및 5 mg/kg) 또는 PBS (용매)를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 제니핀의 용량과 투여 경로는 기존 논문(Kim TH, Yoon SJ, Lee SM. Genipin attenuates sepsis by inhibiting Toll-like receptor signaling. Molecular medicine 2012;18:455-65)을 참조하였다. 생존율은 패혈증 유도 후 7일까지 관찰하였으며, 이 후 3 주 동안 추가적인 사망이 일어나지 않았음을 확인하였다 (군당 10마리).
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, CLP군의 경우, CLP 후 1 일째 50%의 생존율을 보였으며 2 일째부터 7일째까지 20%의 생존율을 유지하였다. 반면, 제니핀을 투여한 군의 경우 CLP군에 비하여 생존율이 증가하였으며, 특히, 제니핀 2.5 mg/kg 용량을 투여한 군의 경우, CLP군에 비하여 생존율이 현저히 생존율을 증가됨을 확인할 수 있었다(p=0.0421).
한편, 상기 생존율 평가 결과를 바탕으로, 이후의 실험에서는 제니핀 2.5 mg/kg 용량으로 실험을 실시하였다. 또한, 실험군은 생쥐를 임의적으로 4 개의 군으로 나누었다 (군당 6~8마리): (a) 용매 투여 sham 군 ('sham'), (b) 2.5 mg/kg 제니핀 투여 sham 군 ('genipin'), (c) 용매 투여 CLP 군 ('CLP') 및 (d) 2.5 mg/kg 제니핀 투여 CLP 군 ('CLP + genipin'). 이때, sham은 대조군으로 패혈증을 유도하지 않은 생쥐이다.
실시예 3. 제니핀 처치에 의한 면역활성 증강 효과 확인
3-1. 제니핀 처치에 따른 비장세포 수 변화 확인
면역세포의 감소는 면역억제 시에 나타나는 가장 중요한 특징 중 하나이다. 이에, 상기 실시예 2를 통해 분리한 4 개의 군에서 면역세포 수 변화를 측정하였다. 보다 구체적으로, 'CLP' 및 'CLP + genipin'군의 경우에는, 실시예 1-3의 방법에 의한 CLP 수술을 실시한 직후 및 24시간 후 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 한편, 'sham' 및 'genipin'군에도 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 각각 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 패혈증 유도 26 시간 후, 주사기 고무를 이용하여 비장을 균질화 시키고, 세포 파편 등을 제거하기 위해 70-μm 나일론 mesh strainer를 이용하여 여과하였다. 여과된 세포 중 적혈구는 적혈구 분해 용매 (RBC lysis buffer)로 분해하였으며, 분리된 세포의 수는 hemocytometer를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 'CLP' 군의 경우, 패혈증 유도 26 시간 후, 총 비장 세포의 수는 sham 군에 비하여 52.6% 감소하였으나. 제니핀을 투여한 군('CLP + genipin'군)의 경우, 총 비장 세포의 수 감소가 현저히 개선됨을 확인할 수 있었다(* p<0.05 compared to sham group. + p<0.05 compared to CLP group). 한편, 제니핀 단독 투여는 총 비장세포의 수에 영향을 미치지 않았다.
3-2. 제니핀 처치에 따른 비장 내 CD4 + 및 CD8 + 림프구 수 변화 확인
'CLP' 및 'CLP + genipin'군의 경우에는, 실시예 1-3의 방법에 의한 CLP 수술을 실시한 직후 및 24시간 후 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 한편, 'sham' 및 'genipin'군에도 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 각각 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 패혈증 유도 26 시간 후, 비장세포를 분리한 뒤, 항-CD4, 항-CD8 및 항-CD3 항체를 부착하여 상기 실시예 1-4의 유세포 분석을 실시하였다. 이때, 결과는 평균 ± 평균의 표준오차로 나타내었으며 군당 마리수는 6~8 마리이다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 'Sham' 군의 경우 비장 내 총 CD3+ 세포에 대한 CD4+ 및 CD8+ 림프구의 비율은 각각 10.1 ± 0.2% 및 5.4 ± 0.2%이었다. 한편, 패혈증 유도 26 시간 후, 'CLP'군의 비장 내 총 CD3+ 세포에 대한 CD4+ 및 CD8+ 림프구의 비율은 각각 sham군의 28.7% 및 35.2%로 감소하였으나, 제니핀을 투여한 군('CLP + genipin'군)의 경우 이러한 감소가 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다(* p<0.05 ** p<0.01 compared to sham group. + p<0.05 compared to CLP group.).
3-3. 제니핀 처치에 따른 비장 내 CD4 + 및 CD8 + 림프구 세포자멸사 변화 확인
'CLP' 및 'CLP + genipin'군의 경우에는, 실시예 1-3의 방법에 의한 CLP 수술을 실시한 직후 및 24시간 후 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 한편, 'sham' 및 'genipin'군에도 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 각각 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 패혈증 유도 26 시간 후, 비장세포를 분리한 뒤, 항-CD4, 항-CD8, Annexin V 및 PI 항체를 부착하여 상기 실시예 1-4의 유세포 분석을 실시하였다. 이때, 결과는 평균 ± 평균의 표준오차로 나타내었으며 군당 마리수는 6~8 마리이다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 'sham'군의 경우 비장 내 CD4+ 및 CD8+ 림프구의 세포자멸사 비율은 각각 5.2 ± 0.4% 및 4.8 ± 0.0%이었다. 한편, 패혈증 유도 26시간 후, 'CLP'군의 비장 내 CD4+ 및 CD8+ 림프구의 세포자멸사 비율은 각각 sham 군에 비하여 1.8 및 2.2 배 증가하였으나, 제니핀을 투여한 군('CLP + genipin' 군)의 경우 이러한 증가가 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다. (** p<0.01 compared to sham group. + p<0.05 ++ p<0.01 compared to CLP group.).
3-4. 제니핀 처치에 따른 비장 내 Bim, Bcl-2, FADD, caspase-3 및 caspase-8 단백질 발현 변화 확인
'CLP' 및 'CLP + genipin'군의 경우에는, 실시예 1-3의 방법에 의한 CLP 수술을 실시한 직후 및 24시간 후 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 한편, 'sham' 및 'genipin'군에도 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 각각 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 패혈증 유도 26 시간 후, 비장 내 Bim, Bcl-2, FADD(Fas-Associated protein with Death Domain), caspase-3 및 caspase-8의 단백질 발현량을 상기 실시예 1-3의 웨스턴 블롯(Western blot)법으로 측정하였다. 이때, 결과는 평균 ± 평균의 표준오차로 나타내었으며 군당 마리수는 6~8 마리이다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 패혈증 유도 26 시간 후, 'CLP'군의 비장 내 전세포사멸사(pro-apoptotic) 분자인 Bim 및 항세포사멸사(anti-apoptotic) 분자인 Bcl-2 단백질 발현량이 sham 군에 비하여 각각 3.3 및 3.6 배 증가하였다. 그러나 이와는 달리 제니핀을 투여한 군('CLP + genipin'군)의 경우 Bim 단백질 발현량이 현저히 억제되었으며, 증가된 Bcl-2 단백질 발현량은 더욱 증가됨을 확인할 수 있었다.
또한, 패혈증 유도 26 시간 후, 'CLP'군의 비장 내 FADD, caspase-3 및 caspase-8 단백질 발현량은 sham 군에 비하여 각각 1.8, 2.1 및 4.0 배 증가하였으나, 제니핀을 투여한 군('CLP + genipin'군)의 경우 이러한 증가들이 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다(* p<0.05 ** p<0.01 compared to sham group. + p<0.05 ++ p<0.01 compared to CLP group.).
3-5. 제니핀 처치에 따른 비장 내 CD4 + CD25 + Foxp3 + 및 CD4 + CD25 + CTLA4 + 조절 T 세포 비율 변화 확인
'CLP' 및 'CLP + genipin'군의 경우에는, 실시예 1-3의 방법에 의한 CLP 수술을 실시한 직후 및 24시간 후 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 한편, 'sham' 및 'genipin'군에도 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 각각 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 패혈증 유도 26 시간 후, 비장세포를 분리한 뒤, 항-CD4, 항-CD25, 항-Foxp3 및 항-CTLA4 항체를 부착하여 상기 실시예 1-4의 유세포 분석을 실시하였다. CD25+Foxp3+ 및 CD25+CTLA4+ 림프구의 비율은 전체 CD4+ 림프구 수에 대한 비율로 계산하였다. 결과는 평균 ± 평균의 표준오차로 나타내었으며 군당 마리수는 6~8 마리이다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 'Sham' 군의 비장 내 CD4+ 림프구에 대한 CD25+Foxp3+ 림프구의 비율은 3.6 ± 0.2%이었다. 패혈증 유도 26시간 후, 'CLP'군의 비장 내 CD4+ 림프구에 대한 CD25+Foxp3+ 림프구의 비율은 sham 군에 비하여 1.5배 증가하였으나, 제니핀을 투여한 군('CLP + genipin'군)의 경우 이러한 증가가 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다.
또한, 'Sham' 군의 비장 내 CD4+ 림프구에 대한 CD25+CTLA4+ 림프구의 비율은 0.34 ± 0.04%이었다. 패혈증 유도 26시간 후, 'CLP'군의 비장 내 CD4+ 림프구에 대한 CD25+CTLA4+ 림프구의 비율은 'sham'군에 비하여 3.6배 증가하였지만, 제니핀을 투여한 군('CLP + genipin'군)의 경우 이러한 증가가 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다(** p<0.01 compared to sham group. + p<0.05 compared to CLP group.).
3-6. 제니핀 처치에 따른 비장 내 사이토카인 분비 변화 확인
'CLP' 및 'CLP + genipin'군의 경우에는, 실시예 1-3의 방법에 의한 CLP 수술을 실시한 직후 및 24시간 후 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 한편, 'sham' 및 'genipin'군에도 PBS (용매) 또는 제니핀 2.5 mg/kg를 각각 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 패혈증 유도 26 시간 후 분리한 비장세포(1×106/mL)를 항-CD3e (5 ug/mL; eBioscience) 및 항-CD28 (3 ug/mL; eBioscience) 항체로 24 시간 자극시켰다. 그리고 나서, 효소면역분석법 (BD Biosciences, San Diego, CA, USA)을 이용하여 비장 세포 배양 배지 내 인터루킨-2(IL-2), 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨-10(IL-10) 및 인터루킨-4(IL-4) 분비량을 측정하였다. 이때, 결과는 평균 ± 평균의 표준오차로 나타내었으며 군당 마리수는 6~8 마리이다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 'Sham' 군의 비장세포 IL-2 및 IFN-γ 분비량은 각각 212.5 ± 9.2 및 1876.6 ± 226.2 pg/mL이었다. 패혈증 유도 26 시간 후, 'CLP'군의 비장세포의 IL-2 및 IFN-γ 분비량은 각각의 sham군에 비하여 57% 및 37% 감소하였으나, 제니핀을 투여한 군('CLP + genipin'군)의 경우 이러한 감소가 현저히 회복됨을 확인할 수 있었다.
또한, 'Sham'군의 경우, 비장세포의 IL-10 및 IL-4 분비량은 각각 71.2 ± 5.6 및 15.8 ± 2.5 pg/mL이었다. 패혈증 유도 26 시간 후, 'CLP'군의 비장세포의 IL-10 및 IL-4 분비량은 sham군에 비해 각각 1.6 및 2.5배 증가하였으나, 제니핀을 투여한 군('CLP + genipin'군)의 경우 이러한 증가가 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다(* p<0.05, ** P<0.01 compared to sham group. + p<0.05,++ p<0.01 compared to CLP group.).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 제니핀 또는 이의 유도체는 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포 수를 증가시키고, 조절 T 세포(Treg) 수를 감소시키며 면역이 저하된 상태에서 염증성 사이토카인의 분비를 증가시키는 등의 효과를 나타내는 특징이 있다. 또한 천연물 소재인바, 화학물질에서 빈번히 나타나는 부작용도 감소시킬 수 있다. 이에, 면역활성을 증강시키는 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 유효성분으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (11)

  1. 제니핀 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 CD4+ 또는 CD8+ 세포 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 세포사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 Bim, FADD, caspase-3 및 caspase-8 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 Bcl-2 단백질 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 조절 T 세포(Treg) 수를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 IL-2 또는 IFN-γ 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 IL-10 또는 IL-4 생산을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제니핀 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 식품 조성물.
  10. 제니핀 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역활성 증강방법.
  11. 제니핀 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물의 면역활성 증강 용도.
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