WO2016136441A1

WO2016136441A1 - 画像処理装置、画像処理方法、及び画像処理プログラム

Info

Publication number: WO2016136441A1
Application number: PCT/JP2016/053615
Authority: WO
Inventors: 一谷　修司
Original assignee: コニカミノルタ株式会社
Priority date: 2015-02-23
Filing date: 2016-02-08
Publication date: 2016-09-01
Also published as: JPWO2016136441A1; JP6635108B2; EP3264362A1; EP3264362A4; US10451554B2; US20180038796A1

Abstract

　自動的に画像処理を施して作成された画像の一部を、ユーザーが容易に修正可能な画像処理装置、画像処理方法、及び画像処理プログラムを提供する。　本発明の画像処理装置は、標本内の細胞を撮影した画像から関心画像を作成する画像処理装置において、前記画像を入力する細胞画像入力手段と、前記画像内に一又は複数の対象画像を設定する設定手段と、前記対象画像のそれぞれに対して、所定のパラメーターを用いた画像処理を施して複数の候補画像を作成する作成手段と、前記作成手段によって作成された前記複数の候補画像を表示する表示手段と、を備えることを特徴とする。

Description

画像処理装置、画像処理方法、及び画像処理プログラム

　本発明は、画像処理装置、画像処理方法、及び画像処理プログラムに関し、特に病理診断に用いられる画像処理に関する。

　人や動物等の生物から採取された組織切片を顕微鏡で観察して病変の有無や病変の種類について診断する、いわゆる病理診断が盛んに行われている。病理診断では、まず採取した組織を固定するために脱水し、パラフィンによるブロック化といった処理を行った後、２～８μｍの厚さの薄片に切り、パラフィンを取り除き、染色して顕微鏡観察して画像データ（細胞画像）を生成し、細胞の核の大きさや形の変化、組織としてのパターンの変化等の形態学的な情報、染色情報を解析して診断を行う。かかる細胞画像から関心領域（例えば、細胞領域）等を抽出する画像処理を手作業で行うと、膨大な手間がかかり、また、作業者ごとの誤差も大きい。

　近年では、例えば組織切片の画像から効率よく特定タンパクが過剰発現している癌領域を把握できるようにするため、画像処理を自動的に行う技術が数多く提案されている。標本を撮影した画像において、例えば複数の細胞が重なっている場合であっても個々の細胞の輪郭を自動的に抽出するための技術が提案されている。

　例えば、特許文献１には、細胞画像上で複数の細胞が重畳している場合においても、細胞形状を個別に抽出可能な技術が記載されている（段落００１８参照）。具体的には、細胞の染色濃度（濃度勾配）に着目して、細胞輪郭形成画素の濃度勾配ベクトルとその画素から細胞中心位置までの変位ベクトルとの内積値の符号の正負を求めてかかる技術を実現しようとしている（段落００２７～００２８、図１０、段落００８４～００８８、図１３～図１６など参照）。

　また、特許文献２には、Watershed法により、複数の細胞が重なっている輪郭上で、くびれている部分を個々の細胞の境界として認識し、境界で分割した各々を単一の細胞として検出することが記載されている。

　また、特許文献３には、細胞内の観察対象物の特徴量に基づいて、画像のピクセルごとの属性値を評価することにより、画像内の関心領域を自動的に識別する技術が記載されている。

特開２０００－３２１０３１号公報特開２００６－０７９１９６号公報特表２００８－５２７５４６号公報

　実際のところ、細胞を撮影した画像においては、細胞の状態や細胞の種類に応じて細胞ごとの特徴量が異なる場合が多いため、画像内の全ての細胞に対して細胞領域を高精度に抽出するためには、画像処理に用いるパラメーターの値等を細胞ごとに調整する必要がある。しかし、細胞ごとにパラメーターの値等を調整して高精度に細胞領域を抽出する画像処理を自動的に行うことは困難であり、自動抽出された細胞領域に対して、ユーザーが部分的に修正を加える必要があった。また、例えば、蛍光物質を用いて染色された生体物質の発現を示す蛍光画像を作成する場合にも、異物混入によるノイズ等を除く処理を自動的に行うことは困難であり、ユーザーが蛍光画像に部分的に修正を加える必要があった。しかし、手作業で効率よく画像の一部を修正することは手間がかかるという問題点があった。
　本発明の主な目的は、自動的に画像処理を施して作成された画像の一部を、ユーザーが容易に修正可能な画像処理装置、画像処理方法、及び画像処理プログラムを提供することにある。

本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
　１．標本内の細胞を撮影した画像から関心画像を作成する画像処理装置において、
　前記画像を入力する細胞画像入力手段と、
　前記画像内に一又は複数の対象画像を設定する設定手段と、
　前記対象画像のそれぞれに対して、所定のパラメーターを用いた画像処理を施して複数の候補画像を作成する作成手段と、
　前記作成手段によって作成された前記複数の候補画像を表示する表示手段と、
を備えることを特徴とする画像処理装置。

　２．前記画像における所定の特徴量の偏りを定量的に判断する判断手段を備え、
　前記判断手段により前記特徴量の偏りが所定の基準よりも大きいと判断された場合、前記設定手段は前記特徴量に基づいて複数の前記対象画像を設定する
　ことを特徴とする第１項に記載の画像処理装置。

　３．前記標本において、細胞又は細胞核が染色されている
　ことを特徴とする第１項又は第２項に記載の画像処理装置。

　４．前記作成手段は、ユーザーによる操作を介して前記パラメーターの値を連続的に変化させた前記候補画像を作成する
　ことを特徴とする第１項から第３項の何れか一項に記載の画像処理装置。

　５．前記作成手段は、前記対象画像の輝度、色度、及びエッジのうち少なくとも１つを前記パラメーターとして用いた画像処理を施す
　ことを特徴とする第１項から第４項の何れか一項に記載の画像処理装置。

　６．前記作成手段は、複数のパラメーターを用いて前記対象画像に画像処理を施し、
　前記表示手段は、各次元軸に相異なるパラメーターを設定し、設定されたパラメーターの値に対応する位置に前記候補画像を配置して表示する
　ことを特徴とする第１項から第５項の何れか一項に記載の画像処理装置。

　７．前記候補画像の面積、周囲長、円形度、及び楕円率のうち少なくとも１つに基づいて、前記候補画像が前記関心画像であるか否かを評価する評価値を算出して評価する評価手段を備え、
　前記表示手段は、前記パラメーターの値が互いに異なる複数の前記候補画像を表示する際、前記評価値に基づいて複数の前記候補画像の配置を決定して表示する
　ことを特徴とする第１項から第６項の何れか一項に記載の画像処理装置。

　８．前記表示手段に表示する前記複数の候補画像として、画像処理に用いられた前記パラメーターの値が所定の範囲内である候補画像をユーザー操作により選択する表示候補画像選択手段を備える
　ことを特徴とする第１項から第６項の何れか一項に記載の画像処理装置。

　９．前記対象画像に群を指定する指定手段を備え、
　前記作成手段は、前記指定手段によって同一群に指定された前記対象画像に対して、同一の値のパラメーターを用いた画像処理を施す
　ことを特徴とする第１項から第８項の何れか一項に記載の画像処理装置。

　１０．前記標本は、蛍光物質を集積した蛍光粒子によって特定の生体物質が染色された標本であり、
　前記特定の生体物質の位置を前記蛍光粒子の蛍光に基づく蛍光輝点で表す、前記画像と同一視野範囲の蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段を備え、
　前記蛍光画像における前記蛍光輝点の位置を抽出する蛍光輝点抽出手段を備え、
　前記作成手段は、前記候補画像と前記蛍光輝点の位置に基づいた前記パラメーターを用いて画像処理を施す
　ことを特徴とする第１項から第９項の何れか一項に記載の画像処理装置。

　１１．前記表示手段は、前記蛍光画像の前記対象画像と同一範囲の画像を前記候補画像と重ね合わせて表示する
　ことを特徴とする第１０項に記載の画像処理装置。

　１２．ユーザー操作を介して前記複数の候補画像の一つを選択する選択手段を備える
　ことを特徴とする第１項から第１１項の何れか一項に記載の画像処理装置。

　１３．前記選択手段により選択された候補画像を関心画像として確定する確定手段を備える
　ことを特徴とする第１２項に記載の画像処理装置。

　１４．標本内の細胞を撮影した画像から関心画像を作成する画像処理方法において、
　前記画像を入力する細胞画像入力工程と、
　前記画像内に一又は複数の対象画像を設定する設定工程と、
　前記対象画像のそれぞれに対して、所定のパラメーターを用いた画像処理を施して複数の候補画像を作成する作成工程と、
　前記作成工程によって作成された前記複数の候補画像を表示する表示工程と、
　ユーザー操作を介して前記複数の候補画像の一つを選択する選択工程と、
　前記選択工程により選択された一つの候補画像を関心画像として確定する確定工程を備える
　ことを特徴とする画像処理方法。

　１５．標本内の細胞を撮影した画像から関心画像を作成するコンピュータを、
前記画像を入力する細胞画像入力手段、
　前記画像内に一又は複数の対象画像を設定する設定手段、
　前記対象画像のそれぞれに対して、所定のパラメーターを用いた画像処理を施して複数の候補画像を作成する作成手段、
　前記作成手段によって作成された前記複数の候補画像を表示する表示手段、
　ユーザー操作を介して前記複数の候補画像の一つを選択する選択手段、
　前記選択手段により選択された一つの候補画像を関心画像として確定する確定手段、
　として機能させることを特徴とする画像処理プログラム。

　本発明によれば、自動的に画像処理を施して作成された画像の一部を、ユーザーが容易に修正可能な画像処理装置、画像処理方法、及び画像処理プログラムを提供することができる。

病理診断支援システムの構成を概略的に示す図である。画像処理装置の機能的構成を概略的に示すブロック図である。実施例における画像解析処理の流れを概略的に示すフローチャートである。蛍光輝点の抽出工程の流れを概略的に示すフローチャートである。細胞の抽出工程の流れを概略的に示すフローチャートである。候補画像の表示方法の例を示す模式図である。候補画像の表示方法の例を示す模式図である。候補画像の表示方法の例を示す模式図である。候補画像の表示方法の例を示す模式図である。明視野画像の一例である。明視野画像から作成された二値画像の一例である。本発明の方法により作成された関心画像の一例である。変形例２における画像解析処理の流れを概略的に示すフローチャートである。変形例２における候補画像の表示方法の例を示す模式図である。変形例３における候補画像の表示方法の例を示す模式図である。変形例４における候補画像の表示方法の例を示す模式図である。変形例４における候補画像の表示方法の例を示す模式図である。

　以下、図面を参照しながら本発明の好ましい形態について説明する。

＜病理診断支援システム１０の構成＞
　図１に、本発明の画像処理装置を備えた病理診断支援システム１０の全体構成例を示す。
　病理診断支援システム１０は、所定の染色試薬で染色された人体の組織切片の顕微鏡画像を取得し、取得された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における特定の生体物質の発現を定量的に表す特徴量を出力するシステムである。

　図１に示すように、病理診断支援システム１０は、顕微鏡画像取得装置１Ａと、画像処理装置２Ａと、がケーブル３Ａなどのインターフェースを介してデータ送受信可能に接続されて構成されている。
　顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２Ａとの接続方式は特に限定されない。たとえば、顕微鏡画像取得装置１Ａと画像処理装置２ＡはＬＡＮ（Local Area Network）により接続されることとしてもよいし、無線により接続される構成としてもよい。

　顕微鏡画像取得装置１Ａは、公知のカメラ付き光学顕微鏡であり、スライド固定ステージ上に載置されたスライド上の組織切片の顕微鏡画像を取得し、画像処理装置２Ａに送信するものである。
　顕微鏡画像取得装置１Ａは、照射手段、結像手段、撮像手段、通信Ｉ／Ｆなどを備えて構成されている。照射手段は、光源、フィルターなどにより構成され、スライド固定ステージに載置されたスライド上の組織切片に光を照射する。結像手段は、接眼レンズ、対物レンズなどにより構成され、照射した光によりスライド上の組織切片から発せられる透過光、反射光、または蛍光を結像する。撮像手段は、ＣＣＤ(Charge Coupled Device)センサーなどを備え、結像手段により結像面に結像される像を撮像して顕微鏡画像のデジタル画像データを生成する顕微鏡設置カメラである。通信Ｉ／Ｆは、生成された顕微鏡画像の画像データを画像処理装置２Ａに送信する。
　顕微鏡画像取得装置１Ａでは、明視野観察に適した照射手段および結像手段を組み合わせた明視野ユニット、蛍光観察に適した照射手段および結像手段を組み合わせた蛍光ユニットが備えられており、ユニットを切り替えることにより明視野／蛍光を切り替えることが可能である。

　なお、顕微鏡画像取得装置１Ａとしては、カメラ付き顕微鏡に限定されず、たとえば、顕微鏡のスライド固定ステージ上のスライドをスキャンして組織切片全体の顕微鏡画像を取得するバーチャル顕微鏡スライド作成装置（たとえば、特表２００２－５１４３１９号公報参照）などを用いてもよい。バーチャル顕微鏡スライド作成装置によれば、スライド上の組織切片全体像を表示部で一度に閲覧可能な画像データを取得することができる。

　画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された顕微鏡画像を解析することにより、観察対象の組織切片における特定の生体物質の発現分布を算出する。
　図２に、画像処理装置２Ａの機能構成例を示す。
　図２に示すように、画像処理装置２Ａは、制御部２１、操作部２２、表示部２３、通信Ｉ／Ｆ２４、記憶部２５などを備えて構成され、各部はバス２６を介して接続されている。

　制御部２１は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、ＲＡＭ（Random Access Memory）などを備えて構成され、記憶部２５に記憶されている各種プログラムとの協働により各種処理を実行し、画像処理装置２Ａの動作を統括的に制御する。
　たとえば、制御部２１は、記憶部２５に記憶されている画像処理プログラムとの協働により画像解析処理（図３参照）を実行し、設定手段、作成手段、選択手段、確定手段、判断手段、評価手段、表示候補画像選択手段、指定手段、及び蛍光輝点抽出手段としての機能を実現する。

　操作部２２は、文字入力キー、数字入力キー、各種機能キーなどを備えたキーボードと、マウスやタッチペンなどのポインティングデバイスを備えて構成され、キーボードで押下操作されたキーの押下信号とマウスやタッチペンによる操作信号とを、入力信号として制御部２１に出力する。

　表示部２３は、たとえばＣＲＴ（Cathode Ray Tube）やＬＣＤ（Liquid Crystal Display）などのモニタを備えて構成されており、制御部２１から入力される表示信号の指示に従って、各種画面を表示する表示手段としての機能を実現する。

　通信Ｉ／Ｆ２４は、顕微鏡画像取得装置１Ａをはじめとする外部機器との間でデータ送受信を行なうためのインターフェースである。通信Ｉ／Ｆ２４は、細胞画像入力手段及び蛍光画像入力手段として機能する。

　記憶部２５は、たとえばＨＤＤ（Hard Disk Drive）や半導体の不揮発性メモリーなどで構成されている。記憶部２５には、前述のように各種プログラムや各種データなどが記憶されている。
　その他、画像処理装置２Ａは、ＬＡＮアダプターやルーターなどを備え、ＬＡＮなどの通信ネットワークを介して外部機器と接続される構成としてもよい。

　本実施形態では、画像処理装置２Ａは、顕微鏡画像取得装置１Ａから送信された明視野画像および蛍光画像を用いて解析を行うようになっている。
　「明視野画像」とは、ヘマトキシリン染色試薬（Ｈ染色試薬）、ヘマトキシリン－エオジン染色試薬（ＨＥ染色試薬）を用いて染色された組織切片を、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて明視野で拡大結像および撮影することにより得られる顕微鏡画像であって、当該組織切片における細胞の形態を表す細胞形態画像である。ヘマトキシリン（Ｈ）は青紫色の色素であり、細胞核、骨組織、軟骨組織の一部、漿液成分など（好塩基性の組織など）を染色する。エオジン（Ｅ）は赤～ピンク色の色素であり、細胞質、軟部組織の結合組織、赤血球、線維素、内分泌顆粒など（好酸性の組織など）を染色する。
　「蛍光画像」とは、蛍光染色試薬を用いて染色された組織切片に対し、顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて所定波長の励起光を照射して蛍光発光させ、この蛍光を拡大結像および撮影することにより得られる顕微鏡画像である。
　「蛍光染色試薬」とは、特定の生体物質と特異的に結合および／または反応する生体物質認識部位が結合した蛍光物質内包ナノ粒子を含む染色試薬であり、「蛍光物質内包ナノ粒子」とは蛍光物質を内包したナノ粒子である（以下、蛍光粒子）。
　蛍光画像に現れる蛍光は、蛍光染色試薬の蛍光物質内包ナノ粒子（蛍光物質）が励起して発光したものであり、組織切片における、生体物質認識部位に対応する特定の生体物質の発現を示すものである。

＜蛍光染色試薬や染色方法＞
　蛍光染色試薬や当該蛍光染色試薬を用いた組織切片の染色方法について説明する。

（１）蛍光物質
　蛍光染色試薬に用いられる蛍光物質としては、蛍光有機色素および量子ドット（半導体粒子）を挙げることができる。２００～７００ｎｍの範囲内の波長の紫外～近赤外光により励起されたときに、４００～１１００ｎｍの範囲内の波長の可視～近赤外光の発光を示すことが好ましい。

　蛍光有機色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子などを挙げることができる。
　具体的には、５－カルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－フルオレセイン、５，６－ジカルボキシ－フルオレセイン、６－カルボキシ－２’，４，４’，５’，７，７’－ヘキサクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－２’，４，７，７’－テトラクロロフルオレセイン、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン　６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、およびＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　３５０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４０５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４３０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５１４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５４６、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５６８、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６１０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３３、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６３５、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６６０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６８０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７００、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　７５０、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ　４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ　５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ　５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ　５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ　５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ　５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ　６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ　６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７などを挙げることができる。これら蛍光有機色素は単独で使用されてもよいし、複数種を混合して使用されてもよい。

　量子ドットとしては、II－VI族化合物、III－V族化合物、またはIV族元素を成分として含有する量子ドット（それぞれ、「II－VI族量子ドット」、「III－V族量子ドット」、「IV族量子ドット」ともいう。）のいずれかを用いることができる。これら量子ドットも単独で使用されてもよいし、複数種を混合して使用されてもよい。
　具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅが挙げられるが、これらに限定されない。

　上記量子ドットをコアとし、その上にシェルを設けた量子ドットを用いることもできる。下記では、シェルを有する量子ドットの表記法として、コアがＣｄＳｅ、シェルがＺｎＳの場合、ＣｄＳｅ／ＺｎＳと表記する。
　たとえば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＧａＰ／ＺｎＳ、Ｓｉ／ＳｉＯ₂、Ｓｉ／ＺｎＳ、Ｇｅ／ＧｅＯ₂、Ｇｅ／ＺｎＳなどを用いることができるが、これらに限定されない。

　量子ドットは必要に応じて、有機ポリマーなどにより表面処理が施されているものを用いてもよい。たとえば、表面カルボキシ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）、表面アミノ基を有するＣｄＳｅ／ＺｎＳ（インビトロジェン社製）などが挙げられる。

（２）蛍光物質内包ナノ粒子
　「蛍光物質内包ナノ粒子」とは、上記のとおり蛍光物質を内包したナノ粒子であって、詳しくは蛍光物質をナノ粒子の内部に分散させたものをいい、蛍光物質とナノ粒子自体とが化学的に結合していてもよいし、結合していなくてもよい。
　ナノ粒子を構成する素材は特に限定されるものではなく、シリカ、ポリスチレン、ポリ乳酸、メラミンなどを挙げることができる。

　蛍光物質内包ナノ粒子は、公知の方法により作製することが可能である。
　たとえば、蛍光有機色素を内包したシリカナノ粒子は、ラングミュア　８巻　２９２１ページ（１９９２）に記載されているＦＩＴＣ内包シリカ粒子の合成を参考に合成することができる。ＦＩＴＣの代わりに所望の蛍光有機色素を用いることで種々の蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を合成することができる。
　量子ドットを内包したシリカナノ粒子は、ニュー・ジャーナル・オブ・ケミストリー　３３巻　５６１ページ（２００９）に記載されているＣｄＴｅ内包シリカナノ粒子の合成を参考に合成することができる。
　蛍光有機色素を内包したポリスチレンナノ粒子は、米国特許４３２６００８（１９８２）に記載されている重合性官能基をもつ有機色素を用いた共重合法や、米国特許５３２６６９２（１９９２）に記載されているポリスチレンナノ粒子への蛍光有機色素の含浸法を用いて作製することができる。
　量子ドットを内包したポリマーナノ粒子は、ネイチャー・バイオテクノロジー１９巻６３１ページ（２００１）に記載されているポリスチレンナノ粒子への量子ドットの含浸法を用いて作製することができる。

　蛍光物質内包ナノ粒子の平均粒径は特に限定されないが、３０～８００ｎｍ程度のものを用いることができる。また、粒径のばらつきを示す変動係数（＝（標準偏差／平均値）×１００％）は特に限定されないが、２０％以下のものを用いることが好ましい。
　平均粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、各計測値を円の面積としたときの円の直径を粒径として求めた値である。本実施形態では、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とする。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とする。

（３）生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子との結合
　「生体物質認識部位」とは、特定の生体物質と特異的に結合および／または反応する部位である。
　特定の生体物質としては、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではないが、代表的にはタンパク質（ペプチド）および核酸（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）などが挙げられる。
　したがって、生体物質認識部位としては、前記タンパク質を抗原として認識する抗体やその抗体に特異的に結合する他のタンパク質など、および前記核酸にハイブリタイズする塩基配列を有する核酸などが挙げられる。
　具体的な生体物質認識部位としては、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２に特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）に特異的に結合する抗ＥＲ抗体、細胞骨格を形成するアクチンに特異的に結合する抗アクチン抗体などが挙げられる。
　中でも、抗ＨＥＲ２抗体および抗ＥＲ抗体を蛍光物質内包ナノ粒子に結合させたもの（蛍光染色試薬）は、乳癌の投薬選定に用いることができ、好ましい。

　生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子の結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着および化学吸着などが挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。

　生体物質認識部位と蛍光物質内包ナノ粒子との間にはこれらを連結する有機分子があってもよい。たとえば、生体物質との非特異的吸着を抑制するため、ポリエチレングリコール鎖を用いることができ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製ＳＭ（ＰＥＧ）１２を用いることができる。

　蛍光物質内包シリカナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。
　たとえば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。
　具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシラン、ポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（たとえば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ－ｓｉｌａｎｅ　ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）などが挙げられる。
　シランカップリング剤を用いる場合、２種以上を併用してもよい。

　蛍光有機色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。
　たとえば、得られた蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離またはろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子を得ることができる。続いてアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じて、ＥＤＣ（１－Ｅｔｈｙｌ－３－［３－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）社製）のような縮合剤を用いることもできる。

　必要により、有機分子で修飾された蛍光有機色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例として、アミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　４［Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した蛍光有機色素内包シリカナノ粒子ができる。

　蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子へ生体物質認識部位を結合させる場合、蛍光物質が蛍光有機色素の場合でも、量子ドットの場合でも同様の手順を適用することができる。すなわち、アミノ基などの官能基をもつポリスチレンナノ粒子へ蛍光有機色素、量子ドットを含浸することにより、官能基もつ蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子を得ることができ、以降ＥＤＣまたはｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣを用いることで、抗体結合した蛍光物質内包ポリスチレンナノ粒子ができる。

　生体物質認識部位の一例として、特定抗原を認識する抗体には、M.アクチン,M.S.アクチン,S.M.アクチン,ACTH,Alk-1,α1-アンチキモトリプシン,α1-アンチトリプシン,AFP,bcl-2,bcl-6,β-カテニン,BCA 225,CA19-9,CA125,カルシトニン,カルレチニン,CD1a,CD3,CD4,CD5,CD8,CD10,CD15,CD20,CD21,CD23,CD30,CD31,CD34,CD43,CD45,CD45R,CD56,CD57,CD61,CD68,CD79a,"CD99,MIC2",CD138,クロモグラニン,c-KIT,c-MET,コラーゲンタイプIV,Cox-2,サイクリンD1,ケラチン,サイトケラチン（高分子量）,パンケラチン,パンケラチン,サイトケラチン　5/6,サイトケラチン　7,サイトケラチン8,サイトケラチン8/18,サイトケラチン14,サイトケラチン19,サイトケラチン20,CMV,E-カドヘリン,EGFR,ER,EMA,EBV,第VIII因子関連抗原,ファッシン,FSH,ガレクチン-3,ガストリン,GFAP,グルカゴン,グリコフォリン　A,グランザイムB,hCG,hGH,ヘリコバクターピロリ,HBc抗原,HBs抗原,ヘパトサイト特異抗原,HER2,HSV-I,HSV-II,HHV-8,IgA,IgG,IgM,IGF-1R,インヒビン,インスリン,カッパL鎖,Ki67,ラムダL鎖,LH,リゾチーム,マクロファージ,メランA,MLH-1,MSH-2,ミエロパーオキシダーゼ,ミオゲニン,ミオグロビン,ミオシン,ニューロフィラメント,NSE,p27 (Kip1),p53,p53,P63,PAX　5,PLAP,ニューモシスティス　カリニ,ポドプラニン（D2-40）,PGR,プロラクチン,PSA,前立腺酸性フォスファターゼ,Renal　Cell　Carcinoma,S100,ソマトスタチン,スペクトリン,シナプトフィジン,TAG-72,TdT,サイログロブリン,TSH,TTF-1,TRAcP,トリプターゼ,ビリン,ビメンチン,WT1,Zap-70が挙げられる。

（４）染色方法
　下記染色方法は病理組織切片に限定せず、培養細胞にも適用可能である。
　組織切片の作製方法は特に限定されず、公知の方法により作製されたものを用いることができる。

（４．１）脱パラフィン工程
　キシレンを入れた容器に組織切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
　次いで、エタノールを入れた容器に組織切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
　次いで、水を入れた容器に組織切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中で水を交換してもよい。

（４．２）賦活化処理
　公知の方法にならい、組織切片の生体物質の賦活化処理を行う。
　賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０－１３０℃、時間は５－３０分で行うことができる。
　次いで、ＰＢＳ（Phosphate　Buffered　Saline：リン酸緩衝生理食塩水）を入れた容器に、賦活化処理後の組織切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。

（４．３）蛍光染色試薬を用いた染色
　蛍光染色試薬のＰＢＳ分散液を組織切片に載せ、組織切片の生体物質と反応させる。
　蛍光染色試薬の生体物質認識部位を変えることにより、さまざまな生体物質に対応した染色が可能となる。蛍光染色試薬として、数種類の生体物質認識部位が結合された蛍光物質内包ナノ粒子を用いる場合には、それぞれの蛍光物質内包ナノ粒子ＰＢＳ分散液を予め混合しておいてもよいし、別々に順次組織切片に載せてもよい。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
　蛍光染色試薬による染色を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど、公知のブロッキング剤を滴下することが好ましい。
　次いで、ＰＢＳを入れた容器に、染色後の組織切片を浸漬させ、未反応の蛍光物質内包ナノ粒子の除去を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。カバーガラスを組織切片に載せ、封入する。必要に応じて市販の封入剤を使用してもよい。
　なお、ＨＥ染色試薬を用いるＨＥ染色はカバーガラスによる封入前に行う。

（５）蛍光画像の取得
　染色した組織切片に対し顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、広視野の顕微鏡画像（蛍光画像）を取得する。顕微鏡画像取得装置１Ａにおいて、蛍光染色試薬に用いた蛍光物質の吸収極大波長および蛍光波長に対応した励起光源と蛍光検出用光学フィルターとを選択する。
　蛍光画像の視野は、３ｍｍ²以上であることが好ましく、３０ｍｍ²以上であることがさらに好ましく、３００ｍｍ²以上であることがさらに好ましい。

＜病理診断支援システム１０の動作（画像処理方法を含む。）＞
　以下、病理診断支援システム１０において、上記説明した明視野画像および蛍光画像からを取得して本発明の画像処理方法を用いて関心画像を作成する動作について、病理診断情報の生成を行う工程を合わせて説明する。ここでは、特定の生体物質としてＨＥＲ２タンパクが染色された乳癌組織の組織切片を観察対象とし、細胞の領域を関心領域として抽出した画像を関心画像とする。

　まず、操作者は、ＨＥ染色試薬と、蛍光染色試薬（抗ＨＥＲ２抗体が結合した蛍光物質内包ナノ粒子）との、２種の染色試薬を用いて同一の組織切片を染色する。
　その後、顕微鏡画像取得装置１Ａを用いて、（ａ１）～（ａ５）の手順により明視野画像および蛍光画像を取得する。
（ａ１）操作者は、ＨＥ染色試薬と蛍光染色試薬とにより染色された組織切片をスライドに載置し、そのスライドを顕微鏡画像取得装置１Ａのスライド固定ステージに設置する。
（ａ２）ユニットを明視野ユニットに設定し、撮影倍率、及びピントの調整を行い、組織切片上の観察対象の領域を視野に納める。
（ａ３）撮像手段で撮影を行って明視野画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。
（ａ４）ユニットを蛍光ユニットに変更する。
（ａ５）視野および撮影倍率を変えずに撮像手段で撮影を行って蛍光画像の画像データを生成し、画像処理装置２Ａに画像データを送信する。

　その後、画像処理装置２Ａを用いて、明視野画像および蛍光画像に基づき画像解析処理を実行する。
　図３に、画像解析処理のフローチャートを示す。
　図３に示す画像解析処理は、制御部２１と記憶部２５に記憶されている画像処理プログラムとの協働により実行され、制御部２１はその画像処理プログラムにしたがって下記の処理を実行する。

　まず、通信Ｉ／Ｆ２４により顕微鏡画像取得装置１Ａからの明視野画像および蛍光画像が入力されると（ステップＳ１：画像入力工程、蛍光画像入力工程）、制御部２１は、蛍光画像から蛍光輝点を抽出する（ステップＳ２：蛍光輝点抽出工程）。
　ステップＳ２では、図４に示されるとおり、蛍光画像から蛍光輝点の波長に応じた色成分を抽出し（ステップＳ２０１）、色成分抽出後の蛍光画像に閾値処理を施して二値画像を生成する（ステップＳ２０２）。ステップＳ２０１～Ｓ２０２により、蛍光画像から蛍光輝点が抽出された画像（蛍光輝点画像）が生成される。
　ステップＳ２０１では、たとえば、蛍光粒子の発光波長が５５０ｎｍである場合には、その波長成分を有する蛍光輝点のみが画像として抽出される。ステップＳ２０２の閾値処理の前に、細胞自家蛍光や他の不要信号成分などのノイズを除去する処理が施されてもよい。

　ステップＳ２０３の処理の後、明視野画像において関心画像作成のための画像処理を行う対象画像を設定する（ステップＳ３：設定工程）。対象画像の設定には公知の任意の方法を用いて良いが、ステップＳ４以降の処理において、対象画像ごとに画像処理を施して関心領域を示す画像を抽出するため、ステップＳ３においては、１つの関心領域（本実施の形態においては、個々の細胞）が異なる対象画像に分かれることがないように設定されることが好ましい。そのため、例えば、対象画像の候補を複数作成して、その中で面積が最大のものを対象画像として用いることが好ましい。また、従来知られている任意の画像処理方法を用いて設定された対象画像の候補に対して、例えば膨張処理を施して対象画像としてもよい。明視野画像において設定される対象画像の数は任意である。

　対象画像を設定する工程（ステップＳ３）の詳細は、例えば、図５のフローチャートに示される。
　制御部２１は、まず、明視野画像をモノクロ画像に変換する（ステップＳ３０１）。次いで、モノクロ画像に対し、予め定められた閾値で閾値処理を施して各画素の値を二値化し（ステップＳ３０２）、二値画像にノイズ処理、膨張処理等の画像処理を実行して、対象画像を設定する（ステップＳ３０３）。図８Ａは明視野画像の一例であり、設定された対象画像が点線に囲まれて示されている。

　ステップＳ３０２において用いられる閾値は任意であり、例えば実際の細胞よりも十分に大きな領域が二値画像で示されるように閾値を調整して、ステップＳ３０３において膨張処理を施すことなく対象画像を設定してもよい。
　ステップＳ３０３におけるノイズ処理は、具体的には、二値画像にクロージング処理を施すことにより行うことができる。クロージング処理は、膨張処理を行ってから同じ回数分だけ収縮処理を行う処理である。膨張処理は、注目画素からｎ×ｎ画素（ｎは２以上の整数）の範囲内にある画素に１つでも黒が含まれている場合に注目画素を黒に置き換える処理である。収縮処理は、注目画素からｎ×ｎ画素の範囲内にある画素に１つでも白が含まれている場合に注目画素を白に置き換える処理である。クロージング処理により、ノイズ等の小さい領域を除去することができる。
　ステップＳ３０１～Ｓ３０３により、明視野画像において細胞を包含する対象画像が設定される。
　なお、ステップＳ２とステップＳ３との処理は、順番を入れ替えてもよい。

　その後、制御部２１は、ステップＳ３で作成した対象画像のそれぞれに対して、候補画像を作成する（ステップＳ４：作成工程）。各対象画像に対して作成する候補画像の数は任意であるが、目的とする関心画像らしい画像を選択できるようにするため、複数作成されることが好ましい。
　候補画像の作成方法は任意であるが、例えば、対象画像の輝度、色度、又はエッジ等に基づく画像処理を施すことにより作成される。輝度に基づく画像処理を行う場合には、例えば、明視野画像の対象画像中の各画素の輝度値を算出して、閾値をパラメーターとして用いて二値化処理を行い、候補画像を作成する。色度に基づく画像処理を行う場合には、例えば、明視野画像の対象画像中の各画素をＲＧＢ分解して、所定の色成分に対して閾値をパラメーターとして用いて二値化処理を行い、候補画像を作成する。エッジに基づく画像処理を行う場合には、細胞のエッジを抽出する画像処理におけるパラメーターを変えて複数の候補画像を作成する。
　上記のような各画像処理において用いるパラメーターの値を所定の範囲内で変化させることにより、複数の候補画像が作成される。パラメーターの値の範囲は、組織標本や関心画像の種類、明視野画像の撮影条件、などに基づいて任意に設定され得る。

　次いで、制御部２１は、ステップＳ３で作成した各対象画像に対して、候補画像の一つを表示する（ステップＳ５）。
　図８Ｂは、ステップＳ５で表示される候補画像の一例であり、具体的には、図８Ａの全対象領域に対して同一の画像処理（コントラストと明度の調整及び二値化処理）が施されて作成された二値画像である。候補画像の表示方法は任意であるが、例えば、図８Ｂに示されるような二値画像を候補画像として表示する場合には、二値画像の黒い領域の輪郭以外の部分を透明化した候補画像と明視野画像を重ね合わせて表示することとすれば、明視野画像と候補画像の比較が容易となる。

　次いで、ユーザーが操作部２２を介して、表示されている候補画像のうち、修正したい画像を指定すると、制御部２１は、ステップＳ４で作成された複数の候補画像を表示部２３に表示する（ステップＳ６：表示工程）。ステップＳ６で表示される複数の候補画像は、指定された候補画像と同じ対象画像に対して、異なるパラメーターの値を用いて画像処理を施した画像である。図６Ａは、ステップＳ５で表示された候補画像４、及び細胞のエッジを抽出する画像処理においてパラメーターの値を変えた複数の候補画像５が表示された状態の一例を示す。

　なお、ステップＳ４で作成された候補画像の中から、ステップＳ６で表示される複数の候補画像を選択する工程を、ステップＳ５の前又は後に備えても良い（表示候補画像選択工程）。表示候補画像選択工程において、制御部２１は、例えばユーザーによる操作部２２を介した信号入力に基づいて、ステップＳ４で作成された候補画像の中から、所定の範囲のパラメーターを用いて画像処理を施された１つ以上の候補画像を選択する。例えば、図６Ａでは、ステップＳ６においてその候補画像をさらに分割するようなパラメーターの値を用いてエッジを抽出する画像処理を施された複数の候補画像４が選択されて表示されている。

　また、例えば、ユーザーが操作部２２による操作を介して表示部に表示されている候補画像の一つを指定すると、例えば図６Ｂに示されるように候補画像４の近傍にスライドバーが表示され、ユーザーによるスライドバーのスライダ操作に伴って、指定された候補画像４が、別の候補画像５に変化することとしても良い。具体的には、図６Ｂに示されるように、スライダ位置に伴って連続的に変化するパラメーターの値を用いてエッジを抽出する画像処理を施された候補画像５が表示される。
　なお、ユーザーによる操作は、スライドバーのスライダの操作に限られるものではなく、例えば、マウスのスクロール操作、キーボード操作等、公知の任意の操作方法を用いてよい。

　複数の候補画像を同時に表示する場合、複数の候補画像の配置は、画像処理に用いたパラメーターの値に基づいて決められることが好ましい。例えば、図６Ａのように複数の候補画像５が直線に沿って表示される場合には、各候補画像５の画像処理に用いたパラメーターが、直線に沿って単調増加又は単調減少となるように表示されることが好ましい。これにより、ユーザーは、複数の候補画像５を容易に比較することできる。

　また、候補画像５の表示方法は上述した例に限られるものではなく任意であり、例えば図６Ｃに示されるように複数の候補画像５をステップＳ５で表示された候補画像４の周囲に表示してもよい。この場合には、ステップＳ５で表示された候補画像４を中心として時計回り又は反時計回りに、画像処理に用いたパラメーターの値が単調増加又は単調減少となるように複数の候補画像５が配置されて表示されることが好ましい。

　ステップＳ６では、１種類のパラメーターの値を変える画像処理を施して作成した複数の候補画像を表示するだけでなく、異なる複数種類のパラメーターを用いて、それぞれのパラメーターの値を変える画像処理を施した候補画像を表示しても良い。
　例えば、図７は、膨張の程度を指定するパラメーターＸ及び円形度を指定するパラメーターＹを用いて画像処理を施した複数の候補画像を表示した例を示す。図７では、パラメーターＸ及びＹをそれぞれ横軸及び縦軸とした二次元座標上の、画像処理に用いた各パラメーターの値に対応する位置に候補画像が表示されている。
　また、複数のパラメーターを用いた画像処理を行う場合には、まず、何れか一つのパラメーターの値を変化させる画像処理を施した複数の候補画像を、例えば図６Ａと同様に表示し、ユーザーが１つの候補画像５を選択すると、選択された候補画像５に対して、さらに別のパラメーターの値を変化させる画像処理を施した複数の候補画像が表示されることとしてもよい。

　次いで、ステップＳ７において、ユーザーが操作部２２を介してステップＳ６で表示された候補画像５の一つを選択すると（選択工程）、制御部２１は、ステップＳ６でユーザーが指定した候補画像４を、ステップＳ７でユーザーが選択した候補画像５に変更する。
　ユーザーが候補画像５の一つを選択する方法は任意であるが、例えば、複数の候補画像５が図６Ａのように表示されている場合には、ユーザーが操作部２２（例えば、マウス操作やタッチペンの操作）を介して候補画像５の一つを選択する。また、図６Ｂのようにスライドバーのスライダ操作等によって表示される候補画像５が変化する場合には、例えば所望の候補画像５が表示されている時に、ユーザーが操作部２２を介して所定の動作（例えば、所定のキー操作又はマウスやタッチペンによる操作）を行うことによって、その時点で表示されている候補画像５を選択する。

　ユーザーは、変更したい候補画像に対してステップＳ６～Ｓ７の処理を繰り返す。表示されている候補画像を変更する必要がないと判断すると、ユーザーは、操作部２２を介して確定信号を入力する。確定信号が入力されると、制御部２１は、表示されている候補画像を、関心画像として確定する（ステップＳ８：確定工程）。
　図８Ｃは、図８Ａの明視野画像から作成された関心画像の一例であり、黒で示された領域が、関心領域である。

　その後、関心画像と蛍光輝点画像との加算処理を実行して（ステップＳ９）、加算処理後の重ね合わせ画像に基づいて、診断情報（例えば、関心領域における蛍光輝点の密度）を生成する。（ステップＳ１０）。

　なお、いったん指定された対象画像は変更可能であることが好ましい。具体的には、例えば、ステップＳ６またはＳ７の処理の後、ユーザーが所定の動作（例えば、キーボードのキー操作等）を行うと、対象画像の指定をリセットして、ステップＳ３の処理に戻り、対象画像を再指定できることが好ましい。

［変形例１］
　制御部２１は、明視野画像の全体において、所定の特徴量の分布に偏りがあるか否かを定量的に判断し（判断工程）、偏りが所定の程度より少ない場合には、明視野画像全体を一つの対象画像として設定してもよい。変形例１によれば、明視野画像の全体において特徴量の分布に偏りがない場合には、画像の一部のみに、部分的な調整を行う必要がないとみなすことができるため、画像全体に一括して画像処理を施す従来の画像処理と同様の処理を行うこととなる。
　明視野画像の特徴量としては、例えば、コントラスト、グレースケール変換した諧調値、光学濃度平均、テクスチャ、及び色など、公知の任意のものを用いてよい。

　特徴量の分布の偏りを判断する方法は任意であるが、例えば、モノクロ変換した明視野画像の画素値を特徴量とする場合、明視野画像を所定の数の区画に分割し、それぞれの区画内の画素値の平均値を算出する。そして、区画ごとに算出された画素値の平均値の標準偏差を算出し、標準偏差が所定の値より大きい場合には、区画ごとの画素値のばらつきが大きく、特徴量の分布に偏りがあると判断する。

［変形例２］
　本発明の画像処理装置は、上記実施例のステップＳ３で設定される対象画像をグループ化した対象画像群を指定する指定手段を備えてもよい。
　以下、変形例２の画像処理を、図９のフローチャートを用いて具体的に説明する。なお、上述した実施例の画像処理と異なる構成を中心に説明し、共通する構成については説明を省略する。

　変形例２におけるステップＳ１０１～Ｓ１０３の処理は、上記実施例のステップＳ１～３の処理と同様である。次いで、制御部２１は、対象画像を表示部２３に表示する（ステップＳ１０４）。次いで、ユーザーは、操作部２２を介して、ステップＳ１０４で表示された対象画像から任意のものを選択してグループ化し、対象画像群を指定する（ステップＳ１０５：指定工程）。
　なお、ステップＳ１０４において、例えば明視野画像上に対象画像の輪郭が表示されていることとすれば、明視野画像全体と対象画像を比較が容易であり、特徴量が似ている対象画像を容易に選択してグループ化できるため好ましい。指定工程では、グループ化したい対象画像を、一つ一つ選択して指定しても良いし、又は、グループ化したい対象画像をマウス操作等により囲むことによって指定しても良い。
　なお、１つの明視野画像に対して指定される対象画像群の数は任意である。また、グループ化されない対象画像があっても良い。

　対象画像群が指定されると、制御部２１は、上記実施例のステップＳ４～Ｓ５と同様に候補画像を作成し、候補画像の一つを表示する（ステップＳ１０６）。ステップＳ１０６では、１つの対象画像群に指定された対象画像に対しては、一括して画像処理を施して１つの候補画像を作成し、表示する。図１０は、対象画像群ごとに作成された候補画像（点線で囲まれた画像）が表示された例を示す模式図である。

　次いで、ユーザーが操作部２２の操作を介して、表示されている候補画像のうち、修正したい画像を指定すると、上記実施例のステップＳ６と同様に、複数の候補画像を表示する（ステップＳ１０７）。図１０の模式図は、候補画像４から作成された複数の候補画像５がステップＳ１０７の工程で表示された例を示す。

　次いで、ステップＳ１０８において、ユーザーが操作部２２を介してステップＳ１０７で表示された候補画像５の一つを選択すると（選択工程）、制御部２１は、ステップＳ１０７でユーザーが指定した候補画像４を、ステップＳ１０８でユーザーが選択した候補画像５に変更する。
　ステップＳ１０９～Ｓ１１１の処理は、実施例のステップＳ８～Ｓ１０の処理と同様である。

　変形例２によれば、特徴量が似た対象画像をグループ化した対象画像群を指定することにより、上記実施例のステップＳ４以降で対象画像ごとに行っていた画像処理及びユーザー操作を介した修正を、対象画像群ごとに一括して行うことができる。これにより、画像処理の手間やコストが低減されるという利点がある。

　なお、ステップＳ１０５における対象画像群の設定は、ユーザーによる操作を介する設定に限られるものではない。例えば、制御部２１が、ステップＳ１０３で設定された各対象画像の特徴量を算出し、特徴量が近いものを同じ対象画像群に設定してもよい。対象画像の特徴量としては、コントラスト、グレースケール変換した諧調値、光学濃度平均、テクスチャ、色など公知の任意のものを用いてよい。

　なお、対象画像群を指定する工程は、図１０に記載されるように候補画像の作成前に限られるものではない。例えば、実施例のステップＳ１～Ｓ５を実行して候補画像が表示された後、候補画像と明視野画像に基づいてユーザーが対象画像群を指定し、図１０のステップＳ１０７～Ｓ１１１の処置を行っても良い。

　なお、いったん指定された対象画像群は変更可能であることが好ましい。具体的には、例えば、ステップＳ１０７又はＳ１０８の処理の後、ユーザーが所定の動作（例えば、キーボードのキー操作等）を行うと、ステップＳ１０５の処理に戻り、対象画像群の指定をリセットして再指定できることが好ましい。

［変形例３］
　上記実施例において、ステップＳ４の工程で作成された各候補画像が正しい関心画像であるか否かを評価する工程を備えても良い。具体的には、制御部２１は、例えば、候補画像の特徴量と、予め記憶部２５に記憶されている、標準的な関心領域の特徴量に基づいて、候補画像が正しい関心画像であるか否かを評価する。
　評価に用いる特徴量は、例えば、各領域の周囲長、面積、モーメント、楕円近似における適合度、長軸の長さ、離心率、又は楕円率（短径と長径の比）、形状、又は各領域に対応する部位の明視野画像のコントラスト、グレースケール変換した諧調値、光学濃度平均、テクスチャ、色、など任意のものが挙げられる。なお、評価の結果を定量化した評価値が算出されることとすれば、以下に説明するように、評価値に基づいて、正しい関心画像である可能性が高い候補画像を容易に選択可能となるため好ましい。

　変形例３によれば、例えば、実施例のステップＳ５において、評価値が最大である候補画像を表示することができる。さらに、評価値が所定の値以下である候補画像は、色を変えて表示したり、評価値が低いことを示すメッセージと共に表示したりすることが好ましい。これにより、通常通りに表示されている候補画像は評価値が高く、正しい関心画像とみなすことができるため、ユーザーは、評価値の低い候補画像のみに対して選択的に実施例のステップＳ５以降の処理を実行することが可能であり、手間が軽減されるという利点がある。

　また、実施例のステップＳ６において、図６Ａ、図７のように複数の候補画像を並べて表示する場合、例えば、評価値が最大である候補画像を中央、評価値が低い候補画像を端に表示しても良い。また、実施例のステップＳ５又はＳ６において候補画像と共に評価値を表示しても良い。
　これにより、ユーザーは評価値に基づいて容易に候補画像を選択することができる。

　また、実施例のステップＳ６で表示する候補画像を選択する表示候補画像選択工程を、評価値に基づいて実施しても良い。例えば、評価値が所定の値よりも大きい候補画像のみを選択して、ステップＳ６で表示する。
　また、候補画像の特徴量と、予め記憶部に記憶されている標準的な関心領域の特徴量に基づいて、表示候補画像選択工程を以下のように行ってもよい。
　例えば、標準的な関心領域（ここでは、細胞の領域）の面積に対して、ステップＳ５で表示された候補画像に表されている関心領域の面積が小さい場合には、図１１に示されるように、ステップＳ５で表示された候補画像４に、さらに統合処理または膨張処理を施した候補画像５をステップＳ６において表示することが好ましい。また、例えば、標準的な関心領域の面積に対して、ステップＳ５で表示された候補画像に表されている関心領域の面積が大きい場合には、図６Ａに示されるように、ステップＳ５で表示された候補画像４に対して、さらに分割処理または縮小処理を施した候補画像５を、ステップＳ６において表示することが好ましい。
　ステップＳ６で表示する候補画像をこのように選択することにより、ステップＳ６においては、特に正しい関心画像である可能性が高い候補画像のみが表示され、無駄な画像が表示されないため、画像処理の効率が高いという利点がある。

［変形例４］
　また、上記実施例において、例えば、細胞当たりのＨＥＲ２タンパクの発現が癌の悪性度の指標となることを利用して、ステップＳ２で抽出されたＨＥＲ２タンパクの発現を表す蛍光輝点画像を用いて画像処理を行っても良い。

　実施例のステップＳ３の対象画像の設定工程において蛍光輝点画像を用いる場合、例えば、ステップＳ３０１で作成したモノクロ画像と蛍光輝点画像を重ね合わせる加算処理を行い、ステップＳ３０２及びＳ３０３の処理では、全ての蛍光輝点がそれぞれ何れかの対象画像に含まれるように対象画像を設定する。これにより、細胞の一部が対象画像からはみ出すように対象画像が設定される危険性が減少するため好ましい。

　実施例のステップＳ４の候補画像の作成工程において蛍光輝点画像を用いる場合、例えば、膜タンパクであるＨＥＲ２タンパクの発現を示す蛍光輝点は細胞の輪郭付近に多く観察されることに基づいて、蛍光輝点が関心領域の輪郭付近に多く分布するような候補画像を作成すれば、より高精度に関心画像を作成することができる。
　実施例のステップＳ５の候補画像の表示工程において蛍光輝点画像を用いる場合、例えば、各蛍光輝点から候補画像に表される関心領域までの最短距離を算出し、その距離の総和が最小となるような候補画像を表示することができる。また、例えば、候補画像に表される関心領域における蛍光輝点の密度を算出し、最も高密度な候補画像を表示しても良い。

　また、例えば実施例のステップＳ６において、図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるように、候補画像４及び５に蛍光輝点（○）を重ねて表示すれば、ユーザーは蛍光輝点の分布に基づいて候補画像を選択することができる。

　以上の実施形態によれば、例えば組織標本画像における細胞領域抽出のように自動的かつ高精度な画像処理が難しい場合であっても、画像の一部に対して候補画像を表示してユーザーが選択可能なので、ユーザーが画像の一部のみを容易に修正することができる。これにより、関心画像を高精度かつ容易に作成可能であり、正確な病理診断につなげることができる。

　また、対象画像の特徴量の分布に基づいて制御部２１が対象画像群を設定することにより、部分的な調整を行うことが好ましい画像か否かを判断し、部分的な調整が不要であると判断された場合は、画像の全体に対して一括して画像処理を行うことができる。画像の部分的な調整が必要な場合でも、対象画像群を指定することにより、例えば特徴量が似ている対象画像に対しては画像処理を一括して行うことができる。これにより、画像処理の手間やコストを軽減することができる。

　また、スライドバーの操作等を介して候補画像を連続的に変化させて表示することにより、微細な修正が可能となる。
　また、対象画像の輝度、色度、及びエッジの少なくとも１つをパラメーターとして変化させる画像処理を施して候補画像を作成し、複数のパラメーターを変化させる画像処理を施した場合には、多次元空間において、各次元軸に相異なるパラメーターを設定し、設定されたパラメーターの値に対応する位置に候補画像を表示したり、また、各候補画像が正しい関心画像であるか否かの評価結果に基づいて、候補画像の表示方法、表示する候補画像、等を変えたりすることにより、ユーザーが正しい関心画像である可能性が高い候補画像を容易に選択できる。

　また、明視野画像だけでなく蛍光輝点画像も利用して、候補画像を作成したり、蛍光輝点を候補画像と合わせて表示したりすることにより、ユーザーが正しい関心画像である可能性が高い候補画像を選択しやすい。

　なお、本実施形態の記述内容は、本発明の好適な一例であり、これに限定されるものではない。
　例えば、実施例において、ステップＳ３の対象画像の設定に続けて、ステップＳ５の工程において候補画像の代わりに対象画像を表示し、ユーザーが対象画像の１つを選択すると、選択された対象画像に対して実施例のステップＳ４と同様に候補画像を作成の工程を行うこととしても良い。

　また、本実施形態では、細胞の領域を関心領域として抽出した画像を、最終目的の関心画像として作成する場合を例にとって説明したが、例えば、蛍光物質を用いて染色された生体物質の発現を示す蛍光画像を関心画像として、異物混入によるノイズ等を除くために、ユーザーが蛍光画像に部分的に修正を加える際に、本発明の画像処理を行ってもよい。
　特定の生体物質の例として乳癌におけるＨＥＲ２タンパクを挙げたが、これに限定されない。診断対象となる病変（がん）種に応じて、蛍光画像を取得する際の生体物質認識部位を異なるものとすれば、病変種に応じた生体物質の発現を医師に提供することが可能となる。

　また、本実施形態では、病理診断の対象を人体から採取した組織切片としたが、当該組織には培養組織も含まれるし、当該組織に代えて、当該組織から分離した細胞や培養細胞、血液中の細胞（例えば、赤血球、白血球、血小板等）、尿沈渣等を使用することも可能である。

　上記の説明では、本発明にかかる画像処理プログラムのコンピュータ読み取り可能な媒体としてＨＤＤや半導体の不揮発性メモリーなどを使用した例を開示したが、この例に限定されない。その他のコンピュータ読み取り可能な媒体として、ＣＤ-ＲＯＭなどの可搬型記録媒体を適用することも可能である。本発明にかかる画像処理プログラムのデータを、通信回線を介して提供する媒体として、キャリアウエーブ(搬送波)も適用される。
　その他、病理診断支援システム１０を構成する各装置の細部構成および細部動作に関しても、発明の趣旨を逸脱することのない範囲で適宜変更可能である。

　本発明は、病理診断に用いる画像の画像処理に好適に利用することができる。

　１Ａ　顕微鏡画像取得装置
　２Ａ　画像処理装置
　３Ａ　ケーブル
　１０　病理診断支援システム
　２１　制御部（設定手段、作成手段、表示手段、選択手段、確定手段、判断手段、評価手段、表示候補画像選択手段、指定手段、蛍光輝点抽出手段）
　２２　操作部
　２３　表示部
　２４　通信Ｉ／Ｆ（細胞画像入力手段、蛍光画像入力手段）
　２５　記憶部
　２６　バス

Claims

　標本内の細胞を撮影した画像から関心画像を作成する画像処理装置において、
　前記画像を入力する細胞画像入力手段と、
　前記画像内に一又は複数の対象画像を設定する設定手段と、
　前記対象画像のそれぞれに対して、所定のパラメーターを用いた画像処理を施して複数の候補画像を作成する作成手段と、
　前記作成手段によって作成された前記複数の候補画像を表示する表示手段と、
を備えることを特徴とする画像処理装置。
　前記画像における所定の特徴量の偏りを定量的に判断する判断手段を備え、
　前記判断手段により前記特徴量の偏りが所定の基準よりも大きいと判断された場合、前記設定手段は前記特徴量に基づいて複数の前記対象画像を設定する
　ことを特徴とする請求項１に記載の画像処理装置。
　前記標本において、細胞又は細胞核が染色されている
　ことを特徴とする請求項１又は２に記載の画像処理装置。
　前記作成手段は、ユーザーによる操作を介して前記パラメーターの値を連続的に変化させた前記候補画像を作成する
　ことを特徴とする請求項１～３の何れか一項に記載の画像処理装置。
　前記作成手段は、前記対象画像の輝度、色度、及びエッジのうち少なくとも１つを前記パラメーターとして用いた画像処理を施す
　ことを特徴とする請求項１～４の何れか一項に記載の画像処理装置。
　前記作成手段は、複数のパラメーターを用いて前記対象画像に画像処理を施し、
　前記表示手段は、各次元軸に相異なるパラメーターを設定し、設定されたパラメーターの値に対応する位置に前記候補画像を配置して表示する
　ことを特徴とする請求項１～５の何れか一項に記載の画像処理装置。
　前記候補画像の面積、周囲長、円形度、及び楕円率のうち少なくとも１つに基づいて、前記候補画像が前記関心画像であるか否かを評価する評価値を算出して評価する評価手段を備え、
　前記表示手段は、前記パラメーターの値が互いに異なる複数の前記候補画像を表示する際、前記評価値に基づいて複数の前記候補画像の配置を決定して表示する
　ことを特徴とする請求項１～６の何れか一項に記載の画像処理装置。
　前記表示手段に表示する前記複数の候補画像として、画像処理に用いられた前記パラメーターの値が所定の範囲内である候補画像をユーザー操作により選択する表示候補画像選択手段を備える
　ことを特徴とする請求項１～６の何れか一項に記載の画像処理装置。
　前記対象画像に群を指定する指定手段を備え、
　前記作成手段は、前記指定手段によって同一群に指定された前記対象画像に対して、同一の値のパラメーターを用いた画像処理を施す
　ことを特徴とする請求項１～８の何れか一項に記載の画像処理装置。
　前記標本は、蛍光物質を集積した蛍光粒子によって特定の生体物質が染色された標本であり、
　前記特定の生体物質の位置を前記蛍光粒子の蛍光に基づく蛍光輝点で表す、前記画像と同一視野範囲の蛍光画像を入力する蛍光画像入力手段を備え、
　前記蛍光画像における前記蛍光輝点の位置を抽出する蛍光輝点抽出手段を備え、
　前記作成手段は、前記候補画像と前記蛍光輝点の位置に基づいた前記パラメーターを用いて画像処理を施す
　ことを特徴とする請求項１～９の何れか一項に記載の画像処理装置。
　前記表示手段は、前記蛍光画像の前記対象画像と同一範囲の画像を前記候補画像と重ね合わせて表示する
　ことを特徴とする請求項１０に記載の画像処理装置。
　ユーザー操作を介して前記複数の候補画像の一つを選択する選択手段を備える
　ことを特徴とする請求項１～請求項１１の何れか一項に記載の画像処理装置。
　前記選択手段により選択された候補画像を関心画像として確定する確定手段を備える
　ことを特徴とする請求項１２に記載の画像処理装置。
　標本内の細胞を撮影した画像から関心画像を作成する画像処理方法において、
　前記画像を入力する細胞画像入力工程と、
　前記画像内に一又は複数の対象画像を設定する設定工程と、
　前記対象画像のそれぞれに対して、所定のパラメーターを用いた画像処理を施して複数の候補画像を作成する作成工程と、
　前記作成工程によって作成された前記複数の候補画像を表示する表示工程を備える
　ことを特徴とする画像処理方法。
　標本内の細胞を撮影した画像から関心画像を作成するコンピュータを、
前記画像を入力する細胞画像入力手段、
　前記画像内に一又は複数の対象画像を設定する設定手段、
　前記対象画像のそれぞれに対して、所定のパラメーターを用いた画像処理を施して複数の候補画像を作成する作成手段、
　前記作成手段によって作成された前記複数の候補画像を表示する表示手段、
　として機能させることを特徴とする画像処理プログラム。