WO2016128171A1 - Cell culture plate - Google Patents

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WO2016128171A1
WO2016128171A1 PCT/EP2016/050746 EP2016050746W WO2016128171A1 WO 2016128171 A1 WO2016128171 A1 WO 2016128171A1 EP 2016050746 W EP2016050746 W EP 2016050746W WO 2016128171 A1 WO2016128171 A1 WO 2016128171A1
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WO
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cell culture
pedestal
culture plate
insert
liquid
Prior art date
Application number
PCT/EP2016/050746
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German (de)
French (fr)
Inventor
Moriz Walter
Andreas Traube
Tobias Brode
Original Assignee
Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C12M25/04—Membranes; Filters in combination with well or multiwell plates, i.e. culture inserts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates

Definitions

  • the invention relates to improved cell culture plates for the in vitro cultivation of biological cells and tissue as well as improved cultivation methods using such cell culture plates.
  • Cell culture plates also referred to as microtiter plates or multiwell plates, are known for the cultivation of biological cells or tissues both in the laboratory and especially in automated production of artificial biological tissue ("tissue engineering"), which have an outer, generally rectangular, surface and in the dimensions of standardized frames and usually contain several regularly arranged wells, so-called “wells", for receiving cell culture medium in which biological cells or tissue pieces can be incubated and cultivated in parallel approaches to each other.
  • tissue engineering artificial biological tissue
  • a particular variant of this is a cell culture plate with cup-shaped cell culture inserts which can be used therein, the so-called “inserts.”
  • These cell culture inserts generally have a semipermeable membrane or a net on the bottom side for accommodating biological cells or tissue
  • the biological cells or tissue cultivated therein are then in direct contact with cell culture medium both on the top side and on the bottom side, and can be supplied with nutrients, among other things, with cell culture medium within the respective cup-shaped cell culture insert and with cell culture turmediunn in the recess of the cell culture plate on the other hand.
  • these cell culture inserts, together with the biological cells or tissues cultured therein can be easily removed from the cell culture plate and otherwise processed further.
  • Cell culture plates for receiving such cell culture inserts thus have clear advantages in the cultivation of cells and tissue compared to such multiwell plates, wherein the cells or tissues are cultivated directly on the bottom of the respective well.
  • known arrangements of cell culture plate and cell culture inserts still have disadvantages in practical application: it has especially in the handling of a cell culture plate filled with cell culture medium and / or a necessary change or replacement of cell culture medium proved to be particularly disadvantageous that the cells and tissue cultivated in the cell culture inserts are mechanically impaired by occurring local currents and turbulence of the medium or even fall dry at times.
  • the problem here is that, especially at the cell culture inserts, especially in the region of the bottom-side membrane, in particular because of their porous structure, air bubbles form and remain trapped there even after the change of media. This leads to a local media and thus nutrient undersupply of the biological cells and tissue, which can lead to the death of the entire piece of tissue as the culturing period progresses.
  • high purge rates must be used to eliminate the dropped air bubbles and trapped air due to purge pressure.
  • this is, as stated above, mechanically very stressful for the cultured cells or tissues.
  • the invention was based on the technical problem of improving known cell culture plates for receiving cell culture inserts in such a way that the abovementioned disadvantages can be eliminated and improved, and also alternative cultivation conditions can be created for cells and tissues cultured therein.
  • the technical problem is completely solved by the provision of a novel designed cell culture plate, suitable for the inclusion of known cell culture inserts for the cultivation of biological cells or tissues, having the features of claim 1
  • the invention in this first aspect is a cell culture plate having at least one trough-shaped depression (well) for receiving cell culture inserts (inserts) and liquid cell culture medium.
  • the at least one recess has one or more pedestals which can each be assigned to the cell culture inserts which can be accommodated in the recess.
  • one (1) usually cup-shaped cell culture insert element has exactly one (1 ) Podium assigned to the pit.
  • one (1) cell culture insert in the cell culture plate is associated with a plurality of pedestals of the well, but preferably arranged in a group.
  • a plurality of cell culture inserts, preferably arranged in a group, in the cell culture plate are associated with precisely one (1) pedestal of the well.
  • the pedestal and the receptive cell culture insert are now spaced apart from one another such that a local distance space can form between the top side of the pedestal and the bottom side of the cell culture insert when the cell culture insert is inserted there into the cell culture plate.
  • the distance, and thus the size of the local distance space is predeterminable or adjustable by the structural dimensioning of the cell culture plate and the pedestal.
  • the invention provides in particular that the local distance space formed by the spacing of pedestal and ingestible cell culture insert can accommodate liquid cell culture medium due to the known co-operation of cohesive and adhesive forces, according to the invention independent of the actual level of the cell culture medium in the well itself.
  • the stationary fluid meniscus formed there from culture medium can effectively suppress or prevent a mechanical impairment of the cells or tissue and also the disadvantageous dry-trapping. It turns out that this distance space represents a flow obstacle, as a result of which a local "calming zone" is formed and effective turbulences of the cell culture medium in the area of the membrane of the ingestible cell culture insert can be effectively reduced or completely suppressed
  • the volume of the liquid meniscus which can be formed in the local distance space can be determined by selecting the spacing of the pedestal and the receptive cell culture insert
  • the fluid meniscus that can be formed in a local distance space preferably has a volume of 100 to 350 ⁇ , more preferably from 150 to 250 ⁇ .
  • the liquid meniscus which can be generated according to the invention in the local distance space is advantageously a residual volume which, in the event of a required media change, results from the depression of the cell space. culture plate on the membrane of the cell culture insert, so as to "buffer off" mechanical, physical and / or chemical disturbances on the tissue, which would otherwise be accompanied by a medium change.
  • the liquid meniscus according to the invention permits small volumes below the same in the same way to work, for example, dyeings and drug tests efficiently and quickly, since only a small volume, preferably up to 350 ⁇ , must be used or exchanged below each cell culture insert the small liquid volume below the cell culture insert also allows novel tests with high temporal resolution, since this small volume of liquid is quickly exchangeable.
  • the cell culture plate thus permits the bottom-side application of cell culture medium only in the region of the distance space formed, with the remainder of the well of the cell culture plate, in which the cell culture insert is suspended, remaining unfilled.
  • This is particularly interesting in connection with the application of solid substances and active substances to the biological cells and tissue from the underside of the cell culture insert, since due to the small volume of the distance space, a rapid change of media, for example by pipetting, can take place and / or simultaneously only one low culture media must be used.
  • staining with the so-called MTT essay can be carried out particularly simply and efficiently with the cell culture plate according to the invention, with a particularly low volume of the MTT reagent can be given under the cell culture insert.
  • this can preferably be restricted to a volume of about 100 to 350 .mu.l, whereas in current cell culture plates, in some cases several milliliters of a reagent must be added to the entire well in order to adequately wet the cells and tissue in the cell culture inserts.
  • Cell culture inserts which can be used according to the invention are known per se, and have on the bottom side a cell culture membrane or network, whereupon the biological cells or tissue rest during the incubation and cultivation and can optionally adhere. Multiple cell culture inserts may be grouped together in a frame. Inserts for cell culture plates thus consist in particular of a frame and a plurality of cup-shaped cell culture inserts arranged in series; Frame and cup-shaped cell culture inserts are particularly integrally formed, for example as an injection molded part, with cell culture membranes used therein. The inclusion of the cell culture insert in the cell culture plate is carried out individually or in particular in the form of a plurality of rows of cell culture inserts arranged in rows in a common frame.
  • the cell culture or the inserts are placed in a first embodiment in the cell culture plate or in particular mounted on a formed on the cell culture insert frame member.
  • it is provided to clamp the cell culture insert or the individual cells, individually or in a frame, into the cell culture plate and to hold it in a form-fitting and preferably frictionally engaged manner.
  • the cell culture insert itself or its frame can have, in particular, an oblique chamfer or a conical shape which engages with a counter-structure of the cell culture plate.
  • the top of the pedestal is adapted in shape to the shape of the underside, especially the culture membrane, of the respective cell culture insert.
  • the pedestal therefore preferably has essentially the shape of a cylinder or conical stump with a preferably circular cut surface which forms its top side.
  • the top of the pedestal is preferably oriented parallel to the bottom of the cell culture plate.
  • the pedestal essentially has the shape of a cuboid, cube or a truncated pyramid with a preferably rectangular or square cut surface.
  • the cell culture plate according to the invention thus allows a strong reduction of the process times by a faster exchange of culture medium or of test reagents.
  • the cell culture plate according to the invention also allows cell culture to be carried out in one and the same cell culture plate using the total volume of the cell culture plate and subsequently or in an intermediate step to reduce the liquid volume to the fluid meniscus, there by means of test reagents and similar tests Perform live staining without having to change the cell culture plate or need to be replaced.
  • the pedestal on the top side at least one spacer (spacer) for determining / fixing the distance of the cell culture insert can be accommodated there from the pedestal.
  • the spacer or spacers are preferably on the circumference of the pedestal.
  • at least two opposing spacers are provided on the pedestal, more preferably four opposing spacers.
  • six or more spacers are arranged in a ring shape on the circumference of the pedestal. It is provided that between the spacers only a narrow channel remains, what the volume within the distance space communicates with the volume outside the distance space, that is, with the remaining volume of the recess. By arranging the spacers and the spacing between them, the degree of liquid exchange and thus the flow obstacle between the liquid meniscus formed in the distance space and the surrounding volume in the depression can be adjusted. At the same time or as an alternative, the volume of the fluid meniscus in the distance space, in particular in conjunction with the surface properties of the pedestal and spacer, the capillary properties and the interaction of cohesive and adhesive forces, can thus also be determined.
  • a spacer for determining the Abstands may serve, in particular in conjunction with another, at least opposite spacers, in addition to the fixation and / or positioning of the recordable cell culture insert.
  • the spacer as such in a corresponding structure in the cell culture insert as it were “lock” form-fitting and thus determine the position.
  • a groove may be provided in the spacer, wherein a corresponding counter-structure may engage the cell culture insert.
  • the insertable cell culture insert preferably can be held in a form-fitting manner at its lower circumferential edge.
  • the invention further provides that, depending on the field of application, technical problem or stage of cultivation, one and the same cell culture insert in which the biological cells or tissue are just cultured, in each case different cell culture plates according to the invention are used, in particular by the spacing of the pedestals to the cell culture inserts - and thus in the size of the local distance space and there formed fluid meniscus - different.
  • the invention also provides a cell culture plate, wherein the at least one pedestal has at least one lateral extension at least on the upper side, which projects beyond the cross section of the pedestal hidden by the ingestible cell culture insert and thus allows direct access from above to the distance space under the cell culture insert.
  • the lateral extension thus offers access, for example via a pipetting robot, from above, laterally past the inserted cell culture insert, to the liquid meniscus in the local distance space under the cell culture insert.
  • the extension may be formed at a single location on the pedestal, but may also be formed at several locations on the perimeter of the pedestal. Alternatively, this extension can also be designed as a peripheral annular zone of the pedestal, outside the area of the upper side of the pedestal covered by the cross section of the inserted cell culture insert. In this case, the diameter of the pedestal is simply greater than the diameter of the cell culture insert used there.
  • the at least one extension is located at the point at which recesses for the access of pipette tips to the bottom of the recess of a standard culture plate are provided in conventional cell culture plates and cell culture inserts. In a preferred embodiment, this extension can expand and set the volume of the liquid miniscus formed in the spacer space by appropriate dimensioning.
  • the invention also takes advantage of the interaction of adhesion and cohesion of the liquid on the surfaces of the cell culture plate and the cell culture insert.
  • the volume of the fluid meniscus beneath the cell culture insert can be predetermined in addition or alternatively to the choice of the distance of the cell culture application from the pedestal.
  • the invention also contemplates, alternatively or additionally, determining the volume of the fluid meniscus beneath each cell culture insert by adjusting the hydrophobicity and thus the wetting angle of the respective surfaces, particularly the surface of the pedestal. By changing the wetting angle, the volume of the liquid meniscus can be adjusted. It is understood that the cell culture plate is essentially suitable and intended for use with aqueous media. A transfer of the conditions to the use of oily media and the resulting surface properties can now readily be adapted by those skilled in the art, having regard to the teaching described herein.
  • the cell culture plate in the side wall forming the trough-shaped depression has at least one separate access, which preferably extends to the bottom of the depression. Via this access, the at least one depression of the cell culture plate can be emptied or filled from the outside without otherwise opening the cell culture plate must become. For example, a lid applied to protect the culture on the cell culture plate may remain.
  • the invention provides in particular that the at least one access is arranged at least or exclusively on the short end face of the usually rectangular cell culture plate. By positioning the access on the short side, the plate can continue to be handled with commercially available gripping systems, particularly in automated processes.
  • the invention also relates to a method for culturing biological cells or tissues in vitro in or on a cell culture insert, which is used in a well of a cell culture plate according to the invention, wherein the method is characterized in that liquid cell culture medium during the cultivation of biological cells or Tissue is maintained as a level-independent liquid meniscus between the cell culture insert and the pedestal of the cell culture plate.
  • liquid cell culture medium is kept in the form of a fluid meniscus only in the distance space between cell culture insert and pedestal; more preferably, no cell culture medium is located at the bottom of the well of the cell culture insert outside the pedestal.
  • the method according to the invention for culturing biological cells or tissues in vitro in the cell culture plate according to the invention comprises at least one process of media change of liquid cell culture medium, whereby old cell culture medium present in a first step of the medium change is removed from the bottom of the well and transferred to the cell culture plate a fresh cell culture medium is introduced into the depression in a subsequent step, whereby in both steps, that is also after the removal of far from the Zellkulturnnediunns from the bottom of the well and before filling the fresh cell culture medium always a liquid meniscus of the cell culture medium between cell culture insert and pedestal of the cell culture plate remains.
  • the invention also provides for the use of a base-side pedestal in a depression of a cell culture plate according to the invention for the purpose of forming a liquid meniscus independent of the media fill level of the well under a cell culture insert insertable into the depression.
  • the volume of the liquid meniscus which can be formed in the local distance space can be predetermined by the choice of the height of the spacer on the pedestal to the receptive cell culture insert.
  • Figure 1 shows an oblique view of a first embodiment of the cell culture plate 10 in a special form with a single trough-shaped recess 12 for receiving Zellkultureins2011- zen. From the bottom of the recess 12 regularly arranged pedestals 30 protrude upwards. At each pedestal 30 four pairs of opposing spacers 32 are formed here. In addition, the pedestals 30 each have a lateral extension 38 at least on top. In addition, the cell culture plate 10 has an access 16 to the trough-shaped depression 12.
  • FIG. 2 shows a sectional view of the cell culture plate according to FIG. 1, in which cell culture inserts 20 are inserted.
  • the podiums 30 are in or formed on the bottom 14 of the recess 12.
  • the bottom side 22 of the cell culture insert is fixedly spaced from the pedestals 30 in the inserted state via the spacers 32 formed on the pedestals 30, so that a spacer space 36 is formed between the bottom 22 of the cell culture insert 20 and the pedestal 30 rising from the recess 12 contains a level-independent liquid meniscus in the ready state.
  • a shoulder 34 is provided on each of the spacers 32 and engages the bottom 22 of the cell culture insert 20 to secure the cell culture insert 20 at least in a horizontal direction (lateral) in position. Not shown in this sectional drawing are formed on the pedestals 30 side extensions 38th
  • FIG. 3 shows an oblique and sectional view of the cell culture plate 10 according to FIGS. 1 and 2.
  • FIG. 4 shows a top view of the cell culture plate 10 according to FIGS. 1, 2 and 3.
  • Figure 5 shows schematically in plan view various embodiments of the arrangement of the spacers 32 on the pedestal 30.
  • the connection provides at least two opposing spacers 32, which are preferably each provided with a shoulder 34 (Figure 5a).
  • a plurality of spacers are arranged along the circumference of the pedestal along a crown, wherein the intermediate space formed between the spacers are dimensioned such that thus the liquid exchange between the distance space and the environment is set (Figure 5c).

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Abstract

The invention relates to a cell culture plate (10) which comprises at least one trough-shaped depression (Well) (12) for receiving cell culture inserts (Inserts) (20) and a liquid medium. Said cell culture plate is characterised in that the depression (12) comprises at least one platform (30) able to be associated with the cell culture inserts (20) to be received, and as the result of a predefinable spacing between the platform (30) and a cell culture insert (20) inserted here, a local distancing space (36) between the platform (30) and the cell culture insert (20) can be formed.

Description

Zellkulturplatte  Cell culture plate
Beschreibung description
Die Erfindung betrifft verbesserte Zellkulturplatten für die in vitro Kultivierung biologischer Zellen und Gewebe sowie verbesserte Kultivie- rungsverfahren unter Verwendung solcher Zellkulturplatten. The invention relates to improved cell culture plates for the in vitro cultivation of biological cells and tissue as well as improved cultivation methods using such cell culture plates.
Für die Kultivierung von biologischen Zellen oder Geweben sowohl im Labor als auch besonders in der automatengestützten Serienfertigung künstlicher biologischer Gewebe („tissue engineering") sind Zellkulturplatten, auch als Mikrotiterplatten oder Multiwellplatten be- zeichnet, bekannt. Diese weisen einen äußeren, in der Regel rechteckigen und in den Abmessungen standardisierten Rahmen auf und enthalten in der Regel mehrere regelmäßig angeordnete Vertiefungen, so genannte„wells", zur Aufnahme von Zellkulturmedium worin biologische Zellen oder Gewebestücke in parallelen Ansätzen ne- beneinander inkubiert und kultiviert werden können. Cell culture plates, also referred to as microtiter plates or multiwell plates, are known for the cultivation of biological cells or tissues both in the laboratory and especially in automated production of artificial biological tissue ("tissue engineering"), which have an outer, generally rectangular, surface and in the dimensions of standardized frames and usually contain several regularly arranged wells, so-called "wells", for receiving cell culture medium in which biological cells or tissue pieces can be incubated and cultivated in parallel approaches to each other.
Eine besondere Variante davon ist eine Zellkulturplatte mit darin einsetzbaren becherförmigen Zellkultureinsätzen, den so genannten „inserts". Diese Zellkultureinsätze weisen bodenseitig in der Regel eine semipermeable Membran oder ein Netz auf, zur Aufnahme bio- logischer Zellen oder Gewebe. Die Zellkultureinsätze werden jeweils in die Vertiefungen dieser Zellkulturplatte eingebracht. Darin kultivierte biologische Zellen oder Gewebe stehen dann sowohl auf der Oberseite als auch auf der Unterseite direkt mit Zellkulturmedium in Kontakt und können von diesen unter anderem mit Nährstoffen ver- sorgt werden, und zwar mit Zellkulturmedium innerhalb des jeweiligen becherförmigen Zellkultureinsatzes einerseits und mit Zellkul- turmediunn in der Vertiefung der Zellkulturplatte andererseits. Vorteilhafterweise können diese Zellkultureinsätze zusammen mit den darin kultivierten biologischen Zellen oder Geweben einfach aus der Zellkulturplatte entnommen und anderweitig weiterverarbeitet wer- den. A particular variant of this is a cell culture plate with cup-shaped cell culture inserts which can be used therein, the so-called "inserts." These cell culture inserts generally have a semipermeable membrane or a net on the bottom side for accommodating biological cells or tissue The biological cells or tissue cultivated therein are then in direct contact with cell culture medium both on the top side and on the bottom side, and can be supplied with nutrients, among other things, with cell culture medium within the respective cup-shaped cell culture insert and with cell culture turmediunn in the recess of the cell culture plate on the other hand. Advantageously, these cell culture inserts, together with the biological cells or tissues cultured therein, can be easily removed from the cell culture plate and otherwise processed further.
Zellkulturplatten zur Aufnahme solcher Zellkultureinsätze weisen also an sich deutliche Vorteile bei der Kultivierung der Zellen und Gewebe gegenüber solchen Multiwellplatten auf, worin die Zellen oder Gewebe direkt auf dem Boden der jeweiligen Vertiefung kultiviert werden. Aber insbesondere in Zusammenhang mit dem automatengestützten Neuaufbau von Gewebestrukturen aus isolierten Einzelzellen weisen bekannte Anordnungen aus Zellkulturplatte und Zellkultureinsätzen in der praktischen Anwendung noch Nachteile auf: Besonders bei dem Handling einer mit Zellkulturmedium befüllten Zellkulturplatte und/oder bei einem notwendigen Wechseln oder Ersetzen von Zellkulturmedium hat es sich als besonders nachteilig erwiesen, dass die in den Zellkultureinsätzen kultivierten Zellen und Gewebe durch auftretende lokalen Strömungen und Verwirbelungen des Mediums mechanisch beeinträchtigt werden oder gar zeitweise trocken fallen. Letzteres führt vor allem durch die Kapillarkräfte an der Membran des Einsatzes, durch den fehlenden Auftrieb der Zellen im Medium und/oder durch die unterbrochene Nährstoffversorgung und Pufferwirkung des Mediums zu teils erheblichen Schäden oder Beeinträchtigungen an den Zellen oder Geweben. Da Transpor- te und der regelmäßige Medienwechsel allerdings für die Kultivierung der Zellen oder Gewebe generell notwendig sind, ist es wünschenswert, diese Maßnahmen in diesen Zellkultursystemen schonend und ohne wesentliche Beeinträchtigung der kultivierten Zellen oder Gewebe durchführen zu können. Für den Medienwechsel werden üblicherweise in die Vertiefungen der Zellkulturplatte absenkbare Pipetten, bei maschineller Verarbeitung durch Pipettierroboter, eingetaucht und das Zellkulturnnediunn abgesaugt beziehungsweise frisches Medium eingespült. Dabei muss auch die Bildung von Luftblasen oder Schaum verhindert werden. Problematisch ist dabei allerdings, dass sich vor allem an den Zellkultureinsätzen, besonders im Bereich der bodenseitigen Membran, insbesondere wegen deren porösen Struktur, Luftblasen bilden und dort auch nach dem Medienwechsel fortdauernd gefangen blei- ben. Dies führt zu einer lokalen Medien- und damit Nährstoffunterversorgung der biologischen Zellen und Gewebe, was bei fortschreitender Kultivierungsdauer das Absterben des gesamten Gewebestücks zur Folge haben kann. Sollen in herkömmlichen Systemen solche Luftblasen vermieden oder beseitigt werden, muss mit hohen Spülraten gearbeitet werden, um die gefallenen Luftblasen und Lufteinschlüsse durch den Spüldruck zu beseitigen. Dies ist aber, wie oben ausgeführt, mechanisch sehr belastend für die kultivierten Zellen oder Gewebe. Cell culture plates for receiving such cell culture inserts thus have clear advantages in the cultivation of cells and tissue compared to such multiwell plates, wherein the cells or tissues are cultivated directly on the bottom of the respective well. However, in particular in connection with the automatic assisted rebuilding of tissue structures from isolated single cells, known arrangements of cell culture plate and cell culture inserts still have disadvantages in practical application: it has especially in the handling of a cell culture plate filled with cell culture medium and / or a necessary change or replacement of cell culture medium proved to be particularly disadvantageous that the cells and tissue cultivated in the cell culture inserts are mechanically impaired by occurring local currents and turbulence of the medium or even fall dry at times. The latter leads, in particular by the capillary forces on the membrane of the insert, by the lack of buoyancy of the cells in the medium and / or by the interrupted nutrient supply and buffer effect of the medium to considerable damage or adverse effects on the cells or tissues. However, since transport and the regular change of media are generally necessary for the cultivation of the cells or tissue, it is desirable to be able to carry out these measures in these cell culture systems gently and without significant impairment of the cultured cells or tissue. For the change of media usually drop-sinkable pipettes are immersed in the wells of the cell culture plate, with machine processing by pipetting and aspirated the Zellkulturnnediunn or flushed fresh medium. The formation of air bubbles or foam must also be prevented. However, the problem here is that, especially at the cell culture inserts, especially in the region of the bottom-side membrane, in particular because of their porous structure, air bubbles form and remain trapped there even after the change of media. This leads to a local media and thus nutrient undersupply of the biological cells and tissue, which can lead to the death of the entire piece of tissue as the culturing period progresses. In conventional systems, if such air bubbles are to be avoided or eliminated, high purge rates must be used to eliminate the dropped air bubbles and trapped air due to purge pressure. However, this is, as stated above, mechanically very stressful for the cultured cells or tissues.
Außerdem hat es sich gezeigt, dass in bekannten derartigen Zellkul- tursystemen die Prozesszeiten für die Medienwechsel zu lang und/oder die auszutauschenden Volumina zu groß sein können. In addition, it has been found that in known cell culture systems of this kind the process times for the media changes may be too long and / or the volumes to be exchanged may be too large.
Der Erfindung lag das technische Problem zugrunde, bekannte Zellkulturplatten zur Aufnahme von Zellkultureinsätzen derart zu verbessern, dass die vorgenannten Nachteile beseitigt und verbesserte und auch alternative Kultivierungsbedingungen für darin kultivierte Zellen und Gewebe geschaffen werden können. Das technische Problem wird vollständig gelöst durch die Bereitstellung einer neuartig gestalteten Zellkulturplatte, geeignet für die Aufnahme von an sich bekannten Zellkultureinsätzen für die Kultivierung von biologischen Zellen oder Geweben, mit den Merkmalen nach Anspruch 1 The invention was based on the technical problem of improving known cell culture plates for receiving cell culture inserts in such a way that the abovementioned disadvantages can be eliminated and improved, and also alternative cultivation conditions can be created for cells and tissues cultured therein. The technical problem is completely solved by the provision of a novel designed cell culture plate, suitable for the inclusion of known cell culture inserts for the cultivation of biological cells or tissues, having the features of claim 1
Die Erfindung ist dabei in diesem ersten Aspekt eine Zellkulturplatte mit mindestens einer wannenförmigen Vertiefung (Well) für die Aufnahme von Zellkultureinsätzen (Inserts) und flüssigem Zellkulturmedium. Diese ist erfindungsgemäß besonders dadurch gekennzeich- net, dass die mindestens eine Vertiefung eines oder mehrere Podeste aufweist, die den in die Vertiefung aufnehmbaren Zellkultureinsätzen jeweils zuordenbar sind: Jeweils einem (1 ) in der Regel becherförmigen Zellkultureinsatzelement ist dabei in der Zellkulturplatte genau ein (1 ) Podest der Vertiefung zugeordnet. In einer alternativen Ausgestaltung sind einem (1 ) Zellkultureinsatz in der Zellkulturplatte mehrere, bevorzugt aber in einer Gruppe angeordnete, Podeste der Vertiefung zugeordnet. In einer weiteren alternativen Ausgestaltung sind mehreren, bevorzugt in einer Gruppe angeordneten, Zellkultureinsätzen in der Zellkulturplatte genau ein (1 ) Podest der Vertiefung zugeordnet. The invention in this first aspect is a cell culture plate having at least one trough-shaped depression (well) for receiving cell culture inserts (inserts) and liquid cell culture medium. According to the invention, this is characterized in particular by the fact that the at least one recess has one or more pedestals which can each be assigned to the cell culture inserts which can be accommodated in the recess. In each case one (1) usually cup-shaped cell culture insert element has exactly one (1 ) Podium assigned to the pit. In an alternative embodiment, one (1) cell culture insert in the cell culture plate is associated with a plurality of pedestals of the well, but preferably arranged in a group. In a further alternative embodiment, a plurality of cell culture inserts, preferably arranged in a group, in the cell culture plate are associated with precisely one (1) pedestal of the well.
Erfindungsgemäß sind Podest und aufnehmbarer Zellkultureinsatz nun derart voneinander beabstandet, sodass sich jeweils zwischen Oberseite des Podests und Bodenseite des Zellkultureinsatzes ein lokaler Distanzraum ausbilden kann, wenn der Zellkultureinsatz dort in die Zellkulturplatte eingesetzt ist. Der Abstand, und damit die Größe des lokalen Distanzraums, ist durch die bauliche Dimensionierung der Zellkulturplatte und des Podests vorbestimmbar oder einstellbar. Die Erfindung sieht besonders vor, dass der durch die Beabstandung von Podest und aufnehmbarenn Zellkultureinsatz gebildete lokale Distanzraum aufgrund des an sich bekannten Zusammenwirkens von Kohäsions- und Adhäsionskräften flüssiges Zellkulturmedium aufnehmen kann, und zwar erfindungsgemäß unabhängig von dem konkreten Füllstand des Zellkulturmediums in der Vertiefung selbst. Vorteilhafterweise kann durch den dort gebildeten stationären Flüssigkeitsmeniskus aus Kulturmedium, vor allem beim Transport und besonders beim Wechsel des Mediums in der Vertiefung, eine me- chanische Beeinträchtigung der Zellen oder Gewebe und auch das nachteilige Trockenfallen wirksam unterdrückt oder verhindert werden. Es zeigt sich, dass dieser Distanzraum ein Strömungshindernis darstellt, wodurch eine lokale„Beruhigungszone" entsteht und nachteilige Verwirbelungen des Zellkulturmediums im Bereich der Memb- ran des aufnehmbarem Zellkultureinsatzes wirksam vermindert oder gänzlich unterdrückt werden können. Auf diese Weise erlaubt die erfindungsgemäße Zellkulturplatte durch das Podest eine schonendere und verlässlichere Kultivierung der biologischen Zellen und Gewebe in den Zellkultureinsätzen. Das Volumen des in dem lokalen Distanzraum jeweils ausbildbaren Flüssigkeitsmeniskus durch Wahl der Beabstandung von Podest und aufnehmbaren Zellkultureinsatz bestimmbar. Der in einem lokalen Distanzraum ausbildbare Flüssigkeitsmeniskus hat bevorzugt ein Volumen von 100 bis 350 μΙ, besonders bevorzugt von 150 bis 250 μΙ. According to the invention, the pedestal and the receptive cell culture insert are now spaced apart from one another such that a local distance space can form between the top side of the pedestal and the bottom side of the cell culture insert when the cell culture insert is inserted there into the cell culture plate. The distance, and thus the size of the local distance space, is predeterminable or adjustable by the structural dimensioning of the cell culture plate and the pedestal. The invention provides in particular that the local distance space formed by the spacing of pedestal and ingestible cell culture insert can accommodate liquid cell culture medium due to the known co-operation of cohesive and adhesive forces, according to the invention independent of the actual level of the cell culture medium in the well itself. Advantageously, the stationary fluid meniscus formed there from culture medium, especially during transport and especially when changing the medium in the well, can effectively suppress or prevent a mechanical impairment of the cells or tissue and also the disadvantageous dry-trapping. It turns out that this distance space represents a flow obstacle, as a result of which a local "calming zone" is formed and effective turbulences of the cell culture medium in the area of the membrane of the ingestible cell culture insert can be effectively reduced or completely suppressed The volume of the liquid meniscus which can be formed in the local distance space can be determined by selecting the spacing of the pedestal and the receptive cell culture insert The fluid meniscus that can be formed in a local distance space preferably has a volume of 100 to 350 μΙ, more preferably from 150 to 250 μΙ.
Der erfindungsgemäß erzeugbare Flüssigkeitsmeniskus in dem lokalen Distanzraum ist vorteilhafterweise ein Residualvolumen, welches bei einem erforderlichen Medienwechsel aus der Vertiefung der Zell- kulturplatte an der Membran des Zellkultureinsatzes verbleibt, um so mechanische, physikalische und/oder chemische Störungen an dem Gewebe, welchem ansonsten mit einem Medienwechsel einhergehen, gleichsam „Abzupuffern". Andererseits erlaubt der erfindungs- gemäß bildbare Flüssigkeitsmeniskus mit der gleichen Weise kleinen Volumina unterhalb der Membran des Zellkultureinsatzes zu arbeiten, um beispielsweise Färbungen und Wirkstofftestungen effizient und schnell durchführen zu können, da nur ein kleines Volumen, bevorzugt bis 350 μΙ, unterhalb jedes Zellkultureinsatzes verwendet oder ausgetauscht werden muss. Das kleine Flüssigkeitsvolumen unterhalb des Zellkultureinsatzes erlaubt auch neuartige Testungen mit hoher zeitlicher Auflösung, da dieses kleine Flüssigkeitsvolumen schnell austauschbar ist. The liquid meniscus which can be generated according to the invention in the local distance space is advantageously a residual volume which, in the event of a required media change, results from the depression of the cell space. culture plate on the membrane of the cell culture insert, so as to "buffer off" mechanical, physical and / or chemical disturbances on the tissue, which would otherwise be accompanied by a medium change. On the other hand, the liquid meniscus according to the invention permits small volumes below the same in the same way To work, for example, dyeings and drug tests efficiently and quickly, since only a small volume, preferably up to 350 μΙ, must be used or exchanged below each cell culture insert the small liquid volume below the cell culture insert also allows novel tests with high temporal resolution, since this small volume of liquid is quickly exchangeable.
Alternativ oder zusätzlich gestattet die Zellkulturplatte die bodenseiti- ge Applikation von Zellkulturmedium also lediglich im Bereich des gebildeten Distanzraums, wobei der Rest der Vertiefung der Zellkulturplatte, worin der Zellkultureinsatz eingehängt ist, unbefüllt bleiben kann. Dies ist besonders interessant in Zusammenhang mit der Applikation von Festsubstanzen und Wirksoffen auf die biologischen Zellen und Gewebe von der Unterseite des Zellkultureinsatzes aus, da dadurch aufgrund des geringen Volumens des Distanzraumes ein schneller Medienwechsel, beispielsweise durch Pipettieren, erfolgen kann und/oder gleichzeitig eine nur geringe Kulturmedienmenge verwendet werden muss. Beispielsweise in Zusammenhang mit der Testung von Gewebemodellen und Untersuchung von Substanzen auf Gewebewirkungen, beispielsweise mögliche toxische Eigenschaften, kann mit der erfindungsgemäßen Zellkulturplatte besonders einfach und effizient eine Färbung mit dem sogenannten MTT- Essay durchgeführt werden, wobei ein besonders geringes Volumen des MTT-Reagenzes unter dem Zellkultureinsatz gegeben werden kann. Dieses kann erfindungsgemäß bevorzugt auf ein Volumen von etwa 100 bis 350 μΙ beschränkt werden, wohingegen in gängigen Zellkulturplatten teilweise mehrere Milliliter eines Reagenzes in die gesamte Vertiefung (well) gegeben werden muss, um die Zellen und Gewebe in den Zellkultureinsätzen ausreichend zu benetzen. Alternatively or additionally, the cell culture plate thus permits the bottom-side application of cell culture medium only in the region of the distance space formed, with the remainder of the well of the cell culture plate, in which the cell culture insert is suspended, remaining unfilled. This is particularly interesting in connection with the application of solid substances and active substances to the biological cells and tissue from the underside of the cell culture insert, since due to the small volume of the distance space, a rapid change of media, for example by pipetting, can take place and / or simultaneously only one low culture media must be used. For example, in connection with the testing of tissue models and examination of substances for tissue effects, for example possible toxic properties, staining with the so-called MTT essay can be carried out particularly simply and efficiently with the cell culture plate according to the invention, with a particularly low volume of the MTT reagent can be given under the cell culture insert. According to the invention, this can preferably be restricted to a volume of about 100 to 350 .mu.l, whereas in current cell culture plates, in some cases several milliliters of a reagent must be added to the entire well in order to adequately wet the cells and tissue in the cell culture inserts.
Erfindungsgemäß einsetzbare Zellkultureinsätze sind an sich bekannt, und weisen bodenseitig eine Zellkulturembran oder Netz auf, worauf die biologischen Zellen oder Gewebe während der Inkubation und Kultivierung aufliegen und gegebenenfalls anhaften können. Mehrere Zellkultureinsätze können in einem Rahmen zu einer Gruppe oder Reihe zusammengefasst sein. Einsätze für Zellkulturplatten bestehen so insbesondere aus einem Rahmen und mehreren in Reihe angeordneten becherförmigen Zellkultureinsätzen; Rahmen und becherförmige Zellkultureinsätze sind dabei besonders einstückig, beispielsweise als Spritzgussteil, mit darin eingesetzten Zellkulturmembranen ausgebildet. Die Aufnahme des Zellkultureinsatzes in der Zellkulturplatte, erfolgt jeweils einzeln oder besonders in Form von mehreren, reihig in einem gemeinsamen Rahmen angeordneten Gruppen von Zellkultureinsätzen. Der oder die Zellkultureinsätze werden in einer ersten Ausgestaltung in die Zellkulturplatte gestellt oder insbesondere an einem an dem Zellkultureinsatz ausgebildeten Rahmenelement eingehängt. Alternativ ist vorgesehen, der oder die Zellkultureinsätze, einzeln oder in einem Rahmen zusammengefasst in die Zellkulturplatte zu klemmen und dort formschlüssig und bevorzugt reibschlüssig zu halten. Der Zellkultureinsatz selbst oder sein Rahmen kann dazu besonders eine schräge Fase oder eine konische Form aufweisen, die mit einer Gegenstruktur der Zellkulturplatte in Eingriff kommt. Es ist bevorzugt, dass die Oberseite des Podest in ihrer Form der Form der Unterseite, besonders also der Kulturmembran, des jeweiligen Zellkultureinsatzes angepasst ist. Das Podest weist daher bevorzugt im Wesentlichen die Form eines Zylinders oder Kegel- Stumpfs auf mit einer bevorzugt kreisrunden Schnittfläche, welche dessen Oberseite bildet. Die Oberseite des Podests ist bevorzugt parallel zum Boden der Zellkulturplatte orientiert. In alternativer Ausgestaltung, besonders bei Zellkultureinsätzen mit rechteckigem oder quadratischem Boden, weist das Podest im Wesentlichen die Form eines Quaders, Würfels oder eines Pyramidenstumpfs mit einer bevorzugt rechteckigen oder quadratischen Schnittfläche auf. Weitere davon abgeleitete, kombinierte oder erweiterte Ausgestaltungen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Cell culture inserts which can be used according to the invention are known per se, and have on the bottom side a cell culture membrane or network, whereupon the biological cells or tissue rest during the incubation and cultivation and can optionally adhere. Multiple cell culture inserts may be grouped together in a frame. Inserts for cell culture plates thus consist in particular of a frame and a plurality of cup-shaped cell culture inserts arranged in series; Frame and cup-shaped cell culture inserts are particularly integrally formed, for example as an injection molded part, with cell culture membranes used therein. The inclusion of the cell culture insert in the cell culture plate is carried out individually or in particular in the form of a plurality of rows of cell culture inserts arranged in rows in a common frame. The cell culture or the inserts are placed in a first embodiment in the cell culture plate or in particular mounted on a formed on the cell culture insert frame member. Alternatively, it is provided to clamp the cell culture insert or the individual cells, individually or in a frame, into the cell culture plate and to hold it in a form-fitting and preferably frictionally engaged manner. For this purpose, the cell culture insert itself or its frame can have, in particular, an oblique chamfer or a conical shape which engages with a counter-structure of the cell culture plate. It is preferred that the top of the pedestal is adapted in shape to the shape of the underside, especially the culture membrane, of the respective cell culture insert. The pedestal therefore preferably has essentially the shape of a cylinder or conical stump with a preferably circular cut surface which forms its top side. The top of the pedestal is preferably oriented parallel to the bottom of the cell culture plate. In an alternative embodiment, especially in cell culture inserts with rectangular or square bottom, the pedestal essentially has the shape of a cuboid, cube or a truncated pyramid with a preferably rectangular or square cut surface. Further derived, combined or extended embodiments are also the subject of the invention.
Die erfindungsgemäße Zellkulturplatte erlaubt damit eine starke Re- duktion der Prozesszeiten durch einen schnelleren Austausch von Kulturmedium beziehungsweise von Testreagenzien. In diesem Zusammenhang erlaubt die erfindungsgemäße Zellkulturplatte auch, dass in ein und derselben Zellkulturplatte zunächst die Zellkultivierung unter Verwendung des Gesamtvolumens der Vertiefung der Zellkulturplatte durchgeführt wird und anschließend oder in einem Zwischenschritt das Flüssigkeitsvolumen auf den Flüssigkeitsmeniskus reduziert wird, um dort mittels Testreagenzien und ähnlichen Tests oder Lebendfärbungen durchzuführen, ohne dass dazu die Zellkulturplatte gewechselt wird oder ausgetauscht werden muss. In bevorzugter Ausgestaltung weist das Podest oberseitig mindestens einen Abstandshalter (spacer) zur Bestimmung/Festlegung des Abstandes des dort aufnehmbaren Zellkultureinsatzes von dem Podest auf. Der oder die Abstandshalter sind bevorzugt am Umfang des Podests angeordnet. Bevorzugt sind zumindest zwei sich gegenüberliegende Abstandshalter an dem Podest vorgesehen, besonders bevorzugt sind vier sich gegenüberliegende Abstandshalter. The cell culture plate according to the invention thus allows a strong reduction of the process times by a faster exchange of culture medium or of test reagents. In this connection, the cell culture plate according to the invention also allows cell culture to be carried out in one and the same cell culture plate using the total volume of the cell culture plate and subsequently or in an intermediate step to reduce the liquid volume to the fluid meniscus, there by means of test reagents and similar tests Perform live staining without having to change the cell culture plate or need to be replaced. In a preferred embodiment, the pedestal on the top side at least one spacer (spacer) for determining / fixing the distance of the cell culture insert can be accommodated there from the pedestal. The spacer or spacers are preferably on the circumference of the pedestal. Preferably, at least two opposing spacers are provided on the pedestal, more preferably four opposing spacers.
In einer besonderen Ausgestaltung sind sechs oder mehr Abstands- halter kranzförmig an dem Umfang des Podests angeordnet. Dabei ist vorgesehen, dass zwischen den Abstandshaltern lediglich ein schmaler Kanal bleibt, worüber das Volumen innerhalb des Distanzraums mit dem Volumen außerhalb des Distanzraums, das heißt mit dem restlichen Volumen der Vertiefung kommuniziert. Durch Anord- nung der Abstandshalter und der Beabstandung dieser zueinander kann der Grad des Flüssigkeitsaustausches und damit des Strömungshindernisses zwischen dem im Distanzraum gebildeten Flüssigkeitsmeniskus und dem umgebenden Volumen in der Vertiefung eingestellt werden. Gleichzeitig oder alternativ kann so auch das Vo- lumen des Flüssigkeitsmeniskus im Distanzraum, vor allem im Zusammenspiel mit den Oberflächeneigenschaften von Podest und Abstandshalter, den Kapillareigenschaften und dem Zusammenwirken von Kohäsions- und Adhäsionskräften, festgelegt werden. In a particular embodiment, six or more spacers are arranged in a ring shape on the circumference of the pedestal. It is provided that between the spacers only a narrow channel remains, what the volume within the distance space communicates with the volume outside the distance space, that is, with the remaining volume of the recess. By arranging the spacers and the spacing between them, the degree of liquid exchange and thus the flow obstacle between the liquid meniscus formed in the distance space and the surrounding volume in the depression can be adjusted. At the same time or as an alternative, the volume of the fluid meniscus in the distance space, in particular in conjunction with the surface properties of the pedestal and spacer, the capillary properties and the interaction of cohesive and adhesive forces, can thus also be determined.
Neben der Funktion als Abstandshalter zur Bestimmung des Ab- Standes kann dieser, besonders im Zusammenwirken mit einem anderen, zumindest gegenüberliegenden Abstandshalter, zusätzlich zur Fixierung und/oder Positionierung des aufnehmbaren Zellkultureinsatzes dienen. Dazu kann der Abstandshalter als solcher in einer entsprechenden Struktur in dem Zellkultureinsatz gleichsam form- schlüssig "einrasten" und so die Position festlegen. So kann in dem Abstandshalter eine Nut vorgesehen sein, worin eine entsprechende Gegenstruktur an dem Zellkultureinsatz in Eingriff kommen kann. In einer weiteren und bevorzugten Ausgestaltung ist an mindestens einem, bevorzugt an mindestens zwei gegenüberliegenden Abstandshaltern eine Schulter oder ein Absatz ausgebildet, worin der einsetzbare Zellkultureinsatz, vorzugsweise an seiner unteren umlaufenden Kante formschlüssig gehalten werden kann. Diese Siche- rung der Position und Fixierung des aufnehmbaren Zellkultureinsatzes stellt vor allem im Zusammenhang mit der maschinellen Handhabung der Zellkulturplatte bei der vollautomatischen Fertigung und/oder Testung von biologischen Geweben eine signifikante Verbesserung gegenüber bisherigen Zellkulturplatten mit Zellkulturein- Sätzen dar, worin beispielsweise die Sicherung der Position beziehungsweise die Zentrierung der Zellkultureinsätze den Vertiefungen der Zellkulturplatte durch besondere bauliche Mittel an den Zellkultureinsätzen selbst erfolgen muss. Es hat sich aber gezeigt, dass diese baulichen Maßnahmen an den Zellkultureinsätzen selbst deren Handling erschwert. Demgegenüber erlaubt die erfindungsgemäße Zellkulturplatte die Verwendung einfacher strukturierter Zellkultureinsätze in Standardform. Gegenüber bekannten Systemen zur Positionierung von Zellkultureinsätzen (Inserts) in Zellkulturplatten bietet dieses neue System also auch den Vorteil, dass trotz einer erweiter- ten Funktionalität gängige Zellkultureinsätze unverändert einsetzbar sind, um den erfindungsgemäßen technischen Vorteil zu erreichen. In addition to the function of a spacer for determining the Abstands this may serve, in particular in conjunction with another, at least opposite spacers, in addition to the fixation and / or positioning of the recordable cell culture insert. For this purpose, the spacer as such in a corresponding structure in the cell culture insert as it were "lock" form-fitting and thus determine the position. Thus, a groove may be provided in the spacer, wherein a corresponding counter-structure may engage the cell culture insert. In a further and preferred embodiment is at least a, preferably formed on at least two opposing spacers, a shoulder or a shoulder, wherein the insertable cell culture insert, preferably can be held in a form-fitting manner at its lower circumferential edge. This securing of the position and fixation of the ingestible cell culture insert, especially in connection with the mechanical handling of the cell culture plate in the fully automated production and / or testing of biological tissues, represents a significant improvement over previous cell culture plates with cell culture inserts, in which, for example, the safety of the Position or the centering of the cell culture inserts the wells of the cell culture plate must be made by special structural means to the cell culture inserts themselves. However, it has been shown that these structural measures on the cell culture inserts themselves make their handling more difficult. In contrast, the cell culture plate according to the invention allows the use of simpler structured cell culture inserts in standard form. Compared to known systems for positioning of cell culture inserts in cell culture plates, this new system therefore also has the advantage that, despite an extended functionality, common cell culture inserts can be used unchanged in order to achieve the technical advantage according to the invention.
Die Erfindung sieht weiter vor, dass, je nach Anwendungsgebiet, technischer Fragestellung oder Kultivierungsstadium, ein und derselbe Zellkultureinsatz, worin die biologischen Zellen oder Gewebe ge- rade kultiviert werden, in jeweils unterschiedliche erfindungsgemäße Zellkulturplatten eingesetzt werden, die sich insbesondere durch die Beabstandung der Podeste zu den Zellkultureinsätzen - und damit in der Größe des lokalen Distanzraums und des dort ausbildbaren Flüssigkeitsmeniskus - unterscheiden. Gegenstand der Erfindung ist auch eine Zellkulturplatte, worin das mindestens eine Podest zumindest oberseitig mindestens eine seitliche Erweiterung aufweist, die über den von dem aufnehmbaren Zellkultureinsatz verdeckten Querschnitt des Podests hinausragt und so einen direkten Zugang von oben auf den Distanzraum unter dem Zellkultureinsatz ermöglicht. Die seitliche Erweiterung bietet also, beispielsweise über einen Pipettierroboter, von oben, seitlich an dem eingesetzten Zellkultureinsatz vorbei, Zugang zu dem Flüssigkeitsmeniskus in dem lokalen Distanzraum unter dem Zellkultureinsatz. Die Erweiterung kann an einer einzigen Stelle an dem Podest ausgebildet sein, kann aber auch an mehreren Stellen am Umfang des Podests gebildet sein. Alternativ kann diese Erweiterung auch als umlaufende ringförmige Zone des Podests, außerhalb der von dem Querschnitt des eingesetzten Zellkultureinsatzes abgedeckten Be- reichs der Oberseite des Podests ausgebildet sein. In diesem Fall ist der Durchmesser des Podests einfach größer als der Durchmesser des dort eingesetzten Zellkultureinsatzes. The invention further provides that, depending on the field of application, technical problem or stage of cultivation, one and the same cell culture insert in which the biological cells or tissue are just cultured, in each case different cell culture plates according to the invention are used, in particular by the spacing of the pedestals to the cell culture inserts - and thus in the size of the local distance space and there formed fluid meniscus - different. The invention also provides a cell culture plate, wherein the at least one pedestal has at least one lateral extension at least on the upper side, which projects beyond the cross section of the pedestal hidden by the ingestible cell culture insert and thus allows direct access from above to the distance space under the cell culture insert. The lateral extension thus offers access, for example via a pipetting robot, from above, laterally past the inserted cell culture insert, to the liquid meniscus in the local distance space under the cell culture insert. The extension may be formed at a single location on the pedestal, but may also be formed at several locations on the perimeter of the pedestal. Alternatively, this extension can also be designed as a peripheral annular zone of the pedestal, outside the area of the upper side of the pedestal covered by the cross section of the inserted cell culture insert. In this case, the diameter of the pedestal is simply greater than the diameter of the cell culture insert used there.
Besonders vorteilhaft ist durch eine einfache Anpassung des ansonsten üblichen Verfahrwegs eines Pipettierroboters zum Aus- tausch von Zellkulturmedium aus der gesamten Vertiefung nun unmittelbar Zugang beziehungsweise Austausch von Flüssigkeit in dem Distanzraum ermöglicht, ohne dass dazu aufwändige bauliche Anpassungen oder Anforderungen an dem Pipettierroboter gestellt werden müssten. Lediglich die Eintauchtiefe der Pipettenspitze muss der Podesthöhe angepasst werden. Besonders bevorzugt befindet sich die mindestens eine Erweiterung an derjenigen Stelle, an der im herkömmlichen Zellkulturplatten und Zellkultureinsätzen Ausnehmungen für den Zugang von Pipettenspitzen zu dem Boden der Vertiefung einer Standardkulturplatte vorgesehen sind. In einer bevorzugten Ausgestaltung kann diese Erweiterung über entsprechende Dimensionierung das Volumen des in dem Distanzraum gebildeten Flüssigkeitsminiskus erweitern und festlegen. Hierbei macht sich die Erfindung ebenfalls die Zusammenwirkung von Adhäsion und Kohäsion der Flüssigkeit an den Oberflächen der Zellkulturplatte und dem Zellkultureinsatz zunutze. Je nach Anwendungsziel und Einsatzgebiet der Zellkulturplatte kann so das Volumen des Flüssigkeitsmeniskus unterhalb des Zellkultureinsatzes zusätzlich oder alternativ zur Wahl des Abstandes des Zellkultureinsat- zes von dem Podest vorbestimmt werden. A simple adaptation of the otherwise customary travel path of a pipetting robot for exchanging cell culture medium from the entire depression now makes it possible to directly access or exchange liquid in the spacer space without having to make complex structural adjustments or demands on the pipetting robot. Only the immersion depth of the pipette tip must be adjusted to the height of the pedestal. Particularly preferably, the at least one extension is located at the point at which recesses for the access of pipette tips to the bottom of the recess of a standard culture plate are provided in conventional cell culture plates and cell culture inserts. In a preferred embodiment, this extension can expand and set the volume of the liquid miniscus formed in the spacer space by appropriate dimensioning. Here, the invention also takes advantage of the interaction of adhesion and cohesion of the liquid on the surfaces of the cell culture plate and the cell culture insert. Depending on the application target and field of application of the cell culture plate, the volume of the fluid meniscus beneath the cell culture insert can be predetermined in addition or alternatively to the choice of the distance of the cell culture application from the pedestal.
Die Erfindung sieht außerdem vor, alternativ oder zusätzlich, das Volumen des Flüssigkeitsmeniskus unterhalb jedes Zellkultureinsatzes durch Einstellen der Hydrophobizität und damit des Benet- zungswinkels der entsprechenden Oberflächen, besonders der Oberfläche des Podests, zu bestimmen. Durch Änderung des Benet- zungswinkels kann das Volumen des Flüssigkeitsmeniskus eingestellt werden. Es versteht sich, dass die Zellkulturplatte im Wesentlichen zur Anwendung bei wässrigen Medien geeignet und vorgesehen ist. Eine Übertragung der Verhältnisse auf die Verwendung von öligen Medien und die dadurch bedingten Oberflächeneigenschaften kann der Fachmann in Kenntnis der hierin beschriebenen Lehre nun ohne weiteres anpassen. The invention also contemplates, alternatively or additionally, determining the volume of the fluid meniscus beneath each cell culture insert by adjusting the hydrophobicity and thus the wetting angle of the respective surfaces, particularly the surface of the pedestal. By changing the wetting angle, the volume of the liquid meniscus can be adjusted. It is understood that the cell culture plate is essentially suitable and intended for use with aqueous media. A transfer of the conditions to the use of oily media and the resulting surface properties can now readily be adapted by those skilled in the art, having regard to the teaching described herein.
In einer besonderen Ausgestaltung der Erfindung weist die Zellkulturplatte in der die wannenförmige Vertiefung bildenden Seitenwand zumindest einen separaten Zugang auf, der bevorzugt bis zum Boden der Vertiefung reicht. Über diesen Zugang kann die mindestens eine Vertiefung der Zellkulturplatte von außen entleert oder befüllt werden, ohne dass dazu die Zellkulturplatte anderweitig geöffnet werden muss. Beispielsweise kann ein zum Schutz der Kultur auf die Zellkulturplatte aufgelegter Deckel verbleiben. Die Erfindung sieht dabei besonders vor, dass sich der wenigstens eine Zugang zumindest oder ausschließlich an der kurzen Stirnseite der üblicherweise rechteckig ausgebildeten Zellkulturplatte angeordnet ist. Durch die Positionierung des Zugangs an der kurzen Seite kann die Platte besonders in automatisierten Prozessen weiterhin mit handelsüblichen Greifsystemen gehandhabt werden. In a particular embodiment of the invention, the cell culture plate in the side wall forming the trough-shaped depression has at least one separate access, which preferably extends to the bottom of the depression. Via this access, the at least one depression of the cell culture plate can be emptied or filled from the outside without otherwise opening the cell culture plate must become. For example, a lid applied to protect the culture on the cell culture plate may remain. The invention provides in particular that the at least one access is arranged at least or exclusively on the short end face of the usually rectangular cell culture plate. By positioning the access on the short side, the plate can continue to be handled with commercially available gripping systems, particularly in automated processes.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Kultivierung von biologi- sehen Zellen oder Geweben in vitro in oder auf einen Zellkultureinsatz, welcher in eine Vertiefung einer erfindungsgemäßen Zellkulturplatte eingesetzt wird, dabei ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass flüssiges Zellkulturmedium während der Kultivierung der biologischen Zellen oder Gewebe als füllstandsunabhängiger Flüs- sigkeitsmeniskus zwischen dem Zellkultureinsatz und dem Podest der Zellkulturplatte gehalten wird. Bevorzugt wird ausschließlich in dem Distanzraum zwischen Zellkultureinsatz und Podest flüssiges Zellkulturmedium in Form eines Flüssigkeitsmeniskus gehalten; besonders bevorzugt befindet sich an dem Boden der Vertiefung des Zellkultureinsatzes außerhalb des Podestes kein Zellkulturmedium. The invention also relates to a method for culturing biological cells or tissues in vitro in or on a cell culture insert, which is used in a well of a cell culture plate according to the invention, wherein the method is characterized in that liquid cell culture medium during the cultivation of biological cells or Tissue is maintained as a level-independent liquid meniscus between the cell culture insert and the pedestal of the cell culture plate. Preferably, liquid cell culture medium is kept in the form of a fluid meniscus only in the distance space between cell culture insert and pedestal; more preferably, no cell culture medium is located at the bottom of the well of the cell culture insert outside the pedestal.
Alternativ oder zusätzlich enthält das erfindungsgemäße Verfahren zur Kultivierung von biologischen Zellen oder Geweben in vitro in der erfindungsgemäßen Zellkulturplatte mindestens einen Vorgang des Medienwechsels von flüssigem Zellkulturmedium, dabei wird in ei- nem ersten Schritt des Medienwechsels vorhandenes altes Zellkulturmedium von dem Boden der Vertiefung entfernt und in einem nachfolgenden Schritt frisches Zellkulturmedium in die Vertiefung eingefüllt, wobei in beiden Schritten, das heißt auch nach dem Ent- fernen des Zellkulturnnediunns von dem Boden der Vertiefung und vor dem Einfüllen des frischen Zellkulturmediums stets ein Flüssigkeitsmeniskus des Zellkulturmediums zwischen Zellkultureinsatz und Podest der Zellkulturplatte verbleibt. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines bodensei- tigen Podests in einer Vertiefung einer erfindungsgemäßen Zellkulturplatte zum Zwecke der Ausbildung eines vom Medien-Füllstand der Vertiefung unabhängigen Flüssigkeitsmeniskus unter einem in die Vertiefung einsetzbaren Zellkultureinsatzes. Besonders ist dabei vorgesehen, dass das Volumen des in dem lokalen Distanzraum ausbildbaren Flüssigkeitsmeniskus durch die Wahl der Höhe des Abstandshalters an dem Podest zu dem aufnehmbaren Zellkultureinsatz vorbestimmbar ist. Alternatively or additionally, the method according to the invention for culturing biological cells or tissues in vitro in the cell culture plate according to the invention comprises at least one process of media change of liquid cell culture medium, whereby old cell culture medium present in a first step of the medium change is removed from the bottom of the well and transferred to the cell culture plate a fresh cell culture medium is introduced into the depression in a subsequent step, whereby in both steps, that is also after the removal of far from the Zellkulturnnediunns from the bottom of the well and before filling the fresh cell culture medium always a liquid meniscus of the cell culture medium between cell culture insert and pedestal of the cell culture plate remains. The invention also provides for the use of a base-side pedestal in a depression of a cell culture plate according to the invention for the purpose of forming a liquid meniscus independent of the media fill level of the well under a cell culture insert insertable into the depression. In particular, it is provided that the volume of the liquid meniscus which can be formed in the local distance space can be predetermined by the choice of the height of the spacer on the pedestal to the receptive cell culture insert.
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher beschrieben, ohne dass diese beschränkend zu verstehen wären. The invention will be described in more detail by the following embodiments, without these being limiting.
Figur 1 zeigt eine Schrägaufsicht auf eine erste Ausführungsform der Zellkulturplatte 10 in einer Sonderform mit einer einzigen wannenförmigen Vertiefung 12 zur Aufnahme von Zellkultureinsät- zen. Vom Boden der Vertiefung 12 ragen regelmäßig angeordnete Podeste 30 nach oben. An jedem Podest 30 sind hier vier sich paarweise gegenüberliegende Abstandshalter 32 ausgebildet. Zusätzlich weisen die Podeste 30 zumindest oberseits jeweils eine seitliche Erweiterung 38 auf. Zusätzlich weist die Zellkulturplatte 10 einen Zu- gang 16 zu der wannenförmigen Vertiefung 12 auf. Figure 1 shows an oblique view of a first embodiment of the cell culture plate 10 in a special form with a single trough-shaped recess 12 for receiving Zellkultureinsät- zen. From the bottom of the recess 12 regularly arranged pedestals 30 protrude upwards. At each pedestal 30 four pairs of opposing spacers 32 are formed here. In addition, the pedestals 30 each have a lateral extension 38 at least on top. In addition, the cell culture plate 10 has an access 16 to the trough-shaped depression 12.
Figur 2 Zeigt eine Schnittansicht der Zellkulturplatte nach Figur 1 , worin Zellkultureinsätze 20 eingesetzt sind. Die Podeste 30 sind in oder an dem Boden 14 der Vertiefung 12 ausgebildet. Die Bodenseite 22 des Zellkultureinsatzes ist im eingesetzten Zustand über die an den Podesten 30 ausgebildeten Abstandshalter 32 fest von den Podesten 30 beabstandet, sodass sich zwischen dem Boden 22 des Zellkultureinsatzes 20 und dem aus der Vertiefung 12 aufragenden Podest 30 ein Distanzraum 36 ausgebildet wird, der im betriebsbereiten Zustand einen füllstandsunabhängigen Flüssigkeitsmeniskus enthält. Zusätzlich ist an den Abstandhaltern 32 jeweils ein Absatz 34 vorgesehen, der mit dem Boden 22 des Zellkultureinsatzes 20 in Eingriff steht, um den Zellkultureinsatz 20 zumindest in eine Horizontalrichtung (seitlich) in der Position zu sichern. Nicht gezeigt in dieser Schnittzeichnung sind die an den Podesten 30 ausgebildeten seitlichen Erweiterungen 38. FIG. 2 shows a sectional view of the cell culture plate according to FIG. 1, in which cell culture inserts 20 are inserted. The podiums 30 are in or formed on the bottom 14 of the recess 12. The bottom side 22 of the cell culture insert is fixedly spaced from the pedestals 30 in the inserted state via the spacers 32 formed on the pedestals 30, so that a spacer space 36 is formed between the bottom 22 of the cell culture insert 20 and the pedestal 30 rising from the recess 12 contains a level-independent liquid meniscus in the ready state. In addition, a shoulder 34 is provided on each of the spacers 32 and engages the bottom 22 of the cell culture insert 20 to secure the cell culture insert 20 at least in a horizontal direction (lateral) in position. Not shown in this sectional drawing are formed on the pedestals 30 side extensions 38th
Figur 3 Zeigt eine Schräg- und Schnittansicht der Zellkulturplat- te 10 nach Figur 1 und 2. FIG. 3 shows an oblique and sectional view of the cell culture plate 10 according to FIGS. 1 and 2.
Figur 4 Zeigt eine Draufsicht der Zellkulturplatte 10 nach Figur 1 , 2 und 3. FIG. 4 shows a top view of the cell culture plate 10 according to FIGS. 1, 2 and 3.
Figur 5 Zeigt schematisch in der Draufsicht verschiedene Ausgestaltungen der Anordnung der Abstandshalter 32 an dem Podest 30. Im einfachsten Fall sieht die Verbindung zumindest zwei sich gegenüberliegende Abstandhalter 32 vor, die bevorzugt mit jeweils einem Absatz 34 versehen sind (Figur 5a). In einer anderen Ausgestaltung sind mehrere Abstandshalter am Umfang des Podests entlang kranzförmig angeordnet, wobei die zwischen dem Abstandshal- ter gebildeten Zwischenraum derart dimensioniert sind, dass damit der Flüssigkeitsaustausch zwischen dem Distanzraum und der Umgebung eingestellt wird (Figur 5c). Figure 5 shows schematically in plan view various embodiments of the arrangement of the spacers 32 on the pedestal 30. In the simplest case, the connection provides at least two opposing spacers 32, which are preferably each provided with a shoulder 34 (Figure 5a). In another embodiment, a plurality of spacers are arranged along the circumference of the pedestal along a crown, wherein the intermediate space formed between the spacers are dimensioned such that thus the liquid exchange between the distance space and the environment is set (Figure 5c).

Claims

Ansprüche claims
1 . Zellkulturplatte (10) mit mindestens einer wannenförmigen Vertiefung (Well) (12) für die Aufnahme von Zellkultureinsätzen (Inserts) (20) und flüssigem Medium, dadurch gekennzeichnet, dass die Vertiefung (12) mindestens eines den aufnehmbaren1 . Cell culture plate (10) having at least one well-shaped recess (well) (12) for receiving cell culture inserts (20) and liquid medium, characterized in that the recess (12) at least one of the receivable
Zellkultureinsätzen (20) zuordenbares Podest (30) aufweist, so dass durch eine vorbestimmbare Beabstandung des Podest (30) von einem dort eingesetzten Zellkultureinsatz (20) ein lokaler Cell culture inserts (20) assignable pedestal (30), so that by a predeterminable spacing of the pedestal (30) from a cell culture insert used there (20) a local
Distanzraum (36) zwischen Podest (30) und Zellkultureinsatz (20) ausbildbar ist. Distance space (36) between pedestal (30) and cell culture insert (20) can be formed.
2. Zellkulturplatte (10) nach Anspruch 1 , wobei das Podest (30) oberseitig mindestens einen Abstandshalter (32) zur Festlegung der Beabstandung aufweist. 2. Cell culture plate (10) according to claim 1, wherein the pedestal (30) on the upper side at least one spacer (32) for fixing the spacing.
3. Zellkulturplatte (10) nach Anspruch 2, wobei mindestens ein Abstandshalter (32) an dem Podest (30) zusätzlich mindestens einen Absatz (34) zur seitlichen Fixierung und Positionierung des aufnehmbaren Zellkultureinsatzes (20) zumindest an diesem Podest (30) aufweist. 3. Cell culture plate (10) according to claim 2, wherein at least one spacer (32) on the pedestal (30) additionally at least one shoulder (34) for lateral fixation and positioning of the ingestible cell culture insert (20) at least on this pedestal (30).
4. Zellkulturplatte (10) nach Anspruch 3, wobei mindestens zwei gegenüberliegende Abstandshalter (32) jeweils einen Absatz (34) aufweisen, der mit dem Umfang der Bodenseite (22) des 4. cell culture plate (10) according to claim 3, wherein at least two opposing spacers (32) each have a shoulder (34) with the circumference of the bottom side (22) of the
aufnehmbaren Zellkultureinsatzes (20) in Eingriff gebracht werden kann, um diesen zu fixieren. removable cell culture insert (20) can be engaged to fix this.
5. Zellkulturplatte (10) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei in dem Distanzraum (36) jeweils lokal ein 5. cell culture plate (10) according to any one of the preceding claims, wherein in the spacer space (36) each locally
Flüssigkeitsmeniskus eines flüssigen Mediums unabhängig von dem Pegel des flüssigen Mediums in der Vertiefung (12) selbst haltbar ist. Liquid meniscus of a liquid medium, regardless of the level of the liquid medium in the recess (12) itself is durable.
6. Zellkulturplatte (10) nach Anspruch 5, wobei das Volumen des Flüssigkeitsmeniskus des flüssigen Mediums durch Vorbestimung der Beabstandung des Podests (30) von dem dort aufnehmbaren Zellkultureinsatz (20) bestimmbar ist. 6. cell culture plate (10) according to claim 5, wherein the volume of the liquid meniscus of the liquid medium by predetermining the spacing of the pedestal (30) from the there recordable cell culture insert (20) is determinable.
7. Zellkulturplatte (10) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das Podest (30) mindestens eine seitliche Erweiterung (38) aufweist, die über den von dem aufnehmbaren Zellkultureinsatz (20) verdeckten Querschnitt des Podests (30) hinausragt und so einen Zugang von oben auf deren Distanzraum (36) ermöglicht. The cell culture plate (10) according to any one of the preceding claims, wherein the pedestal (30) has at least one lateral extension (38) which projects beyond the cross section of the pedestal (30) hidden by the ingestible cell culture insert (20) and thus provides access to on top of the distance space (36) allows.
8. Zellkulturplatte (10) nach Anspruch 7, wobei das Volumen des in dem lokalen Distanzraum (36) ausbildbaren Flüssigkeitsmeniskus durch die Dimensionierung der seitlichen Erweiterung (38) des Podests (30) vorbestimmbar ist. 8. cell culture plate (10) according to claim 7, wherein the volume of the in the local distance space (36) can be formed fluid meniscus by the dimensioning of the lateral extension (38) of the pedestal (30) can be predetermined.
9. Zellkulturplatte (10) nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der in dem lokalen Distanzraum (36) ausbildbare 9. cell culture plate (10) according to any one of claims 5 to 8, wherein in the local distance space (36) ausbildbare
Flüssigkeitsmeniskus ein Volumen von 100 bis 350 μΙ hat.  Fluid meniscus has a volume of 100 to 350 μΙ.
10. Zellkulturplatte (10) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei jedem einzelnen Podest (30) jeweils genau ein 10. cell culture plate (10) according to any one of the preceding claims, wherein each individual pedestal (30) respectively exactly one
Zellkultureinsatz (20) zugeordnet ist. Cell culture insert (20) is assigned.
11 . Verwendung eines bodenseitigen Podests (30) in einer Vertiefung (12) einer Zellkulturplatte (10) zur Ausbildung eines füllstandsunabhängigen lokalen Flüssigkeitsmeniskus flüssigen Mediums unter einem in die Vertiefung (12) einsetzbaren 11. Use of a base-side pedestal (30) in a recess (12) of a cell culture plate (10) for forming a level-independent local liquid meniscus liquid medium under a in the recess (12) usable
Zellkultureinsatzes (20). Cell culture insert (20).
12. Verwendung nach Anspruch 11 , wobei das Volumen des12. Use according to claim 11, wherein the volume of
Flüssigkeitsmeniskus durch die Höhe eines Abstandshalters (32) an dem Podest (30) zur Beabstandung des aufnehmbaren Fluid meniscus by the height of a spacer (32) on the pedestal (30) for spacing the receivable
Zellkultureinsatzes (20) bestimmbar ist. Cell culture insert (20) is determinable.
13. Verfahren zur Kultivierung von biologischen Zellen oder Geweben in vitro in einenn Zellkultureinsatz (20) eingesetzt in eine Vertiefung (12) in einenn der Ansprüche 1 bis 10 charakterisierten Zellkulturplatte (10), dadurch gekennzeichnet, dass in der A method for culturing biological cells or tissues in vitro in a cell culture insert (20) inserted into a well (12) in a cell culture plate (10) characterized in any one of claims 1 to 10, characterized in that in the
Vertiefung (12) flüssiges Zellkulturnnediunn als füllstandsunabhängiger Flüssigkeitsmeniskus von Zellkulturnnediunn in einenn lokalen Distanzraum (36) zwischen Zellkultureinsatz (20) und Podest (30) der Zellkulturplatte (10) gehalten wird. Well (12) liquid Zellkulturnnediunn is maintained as a level-independent liquid meniscus of Zellkulturnnediunn in a local distance space (36) between the cell culture insert (20) and pedestal (30) of the cell culture plate (10).
14. Verfahren nach Anspruch 13 mit mindestens einem Vorgang des Medienwechsels des flüssigen Zellkulturmediums, wobei in einem ersten Schritt des Medienwechsels vorhandenes altes 14. The method of claim 13 with at least one process of media change of the liquid cell culture medium, wherein in a first step of the media change existing old
Zellkulturmedium von dem Boden (14) der Vertiefung (12) entfernt wird und in einem nachfolgenden Schritt frisches Zellkulturmedium in die Vertiefung (12) eingefüllt wird, wobei während beider Schritte stets ein Flüssigkeitsmeniskus des Mediums in dem lokalen Cell culture medium from the bottom (14) of the recess (12) is removed and filled in a subsequent step, fresh cell culture medium in the recess (12), wherein during both steps always a liquid meniscus of the medium in the local
Distanzraum (36) zwischen Zellkultureinsatz (20) und Podest (30) verbleibt.  Distance space (36) between cell culture insert (20) and pedestal (30) remains.
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