WO2016126026A2 - 당뇨병 치료 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

당뇨병 치료 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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박경수
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    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating diabetes and the use thereof containing a low concentration of PERK (Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3) inhibitor as an active ingredient.
  • PERK Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3
  • the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) is a cellular environment specialized for posttranslational modification and folding of proteins, with about one-third of the intracellular proteins being proteins in the rough ER. After translation, modification, ie, folding, assembly, glycosylation, and disulfide bonds results in active protein structures.
  • ER stress refers to the inflow of immature proteins beyond the ability of the endoplasmic reticulum to process by the physiological or pathological environment into the endoplasmic reticulum, or to the depletion of the endoplasmic reticulum due to the depletion of calcium in the endoplasmic reticulum. It means the state beyond the ER protein folding load. When endoplasmic reticulum occurs, cells have a defense mechanism to survive. This is called the ER stress response.
  • the endoplasmic reticulum stress response is mediated by three signaling systems present in the endoplasmic reticulum: PERK, IRE-1 ⁇ / XBP-1 (inositol-requiring 1 ⁇ / X-box binding protein 1), and ATF6 (activating transcription factor). Specifically, the following four reactions are known.
  • the first reaction is to prevent translation of a new protein into the endoplasmic reticulum by inhibiting translational attenuation from ribosomes into proteins.
  • protein synthesis is reduced as a result of the reduced activity of the eukaryotic translation initiation factor 2 (eIF2) polymer, which collects tRNA with the starting methionyl attached to the 40S ribosomal subunit.
  • eIF2 eukaryotic translation initiation factor 2
  • the second reaction is to induce the expression of the endoplasmic reticulum chaperon, such as Bip (HSPA5), which is required to fold the protein, thereby enhancing the vesicular folding ability.
  • the endoplasmic reticulum chaperon such as Bip (HSPA5)
  • Transcription of the gene encoding the endoplasmic reticulum chaperone but not the cytoplasmic chaperone is activated through a signaling pathway known as the unfolded protein response (UPR).
  • UTR unfolded protein response
  • IRE1, PERK and ATF6 are endoplasmic reticulum proteins that detect the presence of misfolded proteins in the endoplasmic reticulum. Under normal conditions, these signaling molecules remain inactive through the interaction of the lumen region with the protein chaperone Bip.
  • Bip is an ER member of the Hsp70 protein chaperone aggregate that interacts with an unfolded polypeptide chain. When vesicles are exposed to stress, Bip binds to unfolded proteins and is released from these stress sensors. Isolation of IRE1 from Bip activates protein kinase and endoribonuclease activity to initiate conjugation of XBP1, which produces a major transcription factor in UPR gene expression. When isolated from Bip, PERK is activated, phosphorylates the alpha subunit of eIF2 and attenuates protein synthesis.
  • the third reaction is ER stress-associated degradation (ERAD), which is a process in which folds or folds of proteins in the endoplasmic reticulum are removed by the ubiquitin-proteasome system in the cytoplasm. .
  • ESD ER stress-associated degradation
  • the fourth reaction is that the vesicle stresses are so severe that they cannot be overcome by the above three reactions, and when the vesicles cannot restore their function, the apoptosis pathway is activated to remove damaged cells.
  • the vesicle stress response is an important compensatory mechanism for protecting cells by preserving vesicle function under various cellular stresses, but in recent years, the endoplasmic reticulum stress response is caused by a faulty signaling system, causing or causing diseases. It is known that there is. In other words, the vesicle stress response is well observed in beta cells, hepatocytes, and osteoblasts of the pancreas, which are active in synthesizing and secreting proteins. Recently, many studies have shown that vesicle stress causes diabetes, Parkinson's disease, and glutamine multimers. It has been shown to act as a cause of various diseases such as agglutination disease, Huntington's disease, Alzheimer's disease, ischemic disease, cardiovascular disease, high homocysteosis and atherosclerosis.
  • various diseases such as agglutination disease, Huntington's disease, Alzheimer's disease, ischemic disease, cardiovascular disease, high homocysteosis and atherosclerosis.
  • abnormal endoplasmic reticulum is particularly susceptible to the function of insulin, and in the case of type 1 diabetes Much of the beta cell death occurs through the process of endoplasmic reticulum stress, and in type 2 diabetes, stress kinases that are activated by endoplasmic reticulum disrupt cells by disrupting cell signaling initiated by insulin. It has been reported to be insensitive to insulin.
  • vesicle stress-related diseases such as cancer, diabetes, Parkinson's disease, glutamine multimer-induced coagulation disease, Huntington's disease, Alzheimer's disease, ischemic disease, cardiovascular disease, high homocysteosis and arteriosclerosis
  • vesicle stress response mechanisms such as cancer, diabetes, Parkinson's disease, glutamine multimer-induced coagulation disease, Huntington's disease, Alzheimer's disease, ischemic disease, cardiovascular disease, high homocysteosis and arteriosclerosis
  • abnormalities of the vesicle function are particularly susceptible to insulin secretion function, and in case of type 2 diabetes, Stress kinases that are activated due to endoplasmic reticulum have been reported to make cells insensitive to insulin by disrupting cellular signal transduction initiated by insulin.
  • PERK is a membrane protein that is located in the ER membrane and consists of a stress-sensing domain and a cytosolic kinase domain, and plays an important role in the unfolded protein response of cells against ER stress.
  • Complete PERK deletion (PERK-/-) has been reported to reduce insulin secretion of pancreatic beta cells, insulin secretion, and neonatal diabetes in both humans and rats, and high levels of PERK inhibitors in mouse and human beta cells. It has been reported that there is a decrease in insulin secretion even when the treatment is completely inhibited PERK function. However, for cancer and degenerative neuropathy, the administration of these PERK inhibitors has been shown to have a therapeutic effect.
  • the present inventors have found a novel use of the present invention that can treat diabetes when low concentrations of PERK inhibitors, which are known to be effective in the treatment of cancer and degenerative neurological diseases, are treated at low concentrations rather than high concentrations.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating diabetes and its use containing a low concentration of PERK inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating diabetes, comprising 40 ⁇ 100 nM concentration of the PERK (Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3) inhibitor as an active ingredient.
  • PERK Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3
  • the present invention also provides a method for preventing or treating diabetes, comprising administering the low concentration of a PERK inhibitor to a subject.
  • the present invention also provides a use of the low concentration of PERK inhibitors for the prevention or treatment of diabetes.
  • the PERK inhibitor is "1- [5- (4-amino-7-methyl-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-yl) indole of Formula 1 -1-yl] -2- (3-trifluoromethylphenyl) ethanone "(hereinafter referred to as” GSK2606414 ").
  • the PERK inhibitor is represented by the following Formula 2 "1- (5- (4-amino-7-methyl-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-5-yl)- 4-fluoroindolin-1-yl) -2- (6-methylpyridin-2-yl) ethanone "(hereinafter referred to as” GSK2656157 ").
  • the PERK inhibitor is characterized by increasing the plasma insulin concentration by increasing the amount of cytosolic calcium and insulin secretion in the islet cells.
  • the low concentration of PERK inhibitor according to the present invention has the effect of alleviating diabetes by increasing calcium and insulin in pancreatic islet cells by hyperglycemia stimulation.
  • the low concentration of PERK inhibitors according to the invention has the effect of alleviating diabetes by increasing insulin in vivo in diabetic mice.
  • composition of the present invention containing a low concentration of PERK inhibitor having the above effects as an active ingredient can be usefully used for the prevention or treatment of diabetes.
  • PERKi PERK inhibitor
  • FIG. 2 shows that insulin secretion caused by hyperglycemia is decreased when INS1 832/13 beta cells, rat pancreatic islets, and human pancreas are treated with a high concentration of 1.0 ⁇ M of PERK inhibitor (PI; GSK2606414) (FIG. 2A).
  • PI PERK inhibitor
  • Figure 3 is, to the PERK inhibitor (GSK2606414) in rat islet cells were treated at different concentrations, the results (Fig. 3c) was observed for Ca 2 + concentration change (Figs. 3a and 3b), and insulin secretion in the cytoplasm due to glucose stimulus.
  • FIG. 5 shows the results of observing changes in total volume (IEQ) (FIG. 5A) and pancreatic size (FI) (FIG. 5B) of mouse islets in order to evaluate viability of the islets after treatment with PERK inhibitor (GSK2606414).
  • Figure 6 shows the results of observing the calcium transit (cytoplasmic Ca 2+ ) changes over time after treatment with 40-80 nM PERK inhibitor (GSK2606414) on INS1 832/13 beta cells.
  • Figure 7 is a result of measuring glucose concentration by collecting blood before and after glucose load in diabetic mice to confirm the change in the blood glucose after treatment with PERK inhibitor (GSK2656157) for 2 weeks.
  • FIG. 8 shows the results of an intraperitoneal glucose tolerance test (FIG. 8A) and diabetic-induced mice after two weeks of administration of PERK inhibitors in mice to confirm bioinsulin secretion after treatment with PERK inhibitors (GSK2656157) for two weeks. Blood is collected before and after the glucose load to measure insulin concentration (8b).
  • FIG. 9 is a human islet cell PERK inhibitor (GSK2606414) 50 or when treated with 100 nM of the low concentration, observation of the Ca 2 + increase (Fig. 9a) and the insulin secretion increase in the cytoplasm due to glucose stimulation ( Figure 9b) to be.
  • FIG. 10 shows the results of observing changes in total volume (IEQ) (FIG. 10A) and pancreatic size (FI) (FIG. 10B) of human islets in order to evaluate viability of islets after treatment with PERK inhibitor (GSK2606414).
  • composition for treating diabetes of the present invention is characterized by including a low concentration of PERK inhibitor as an active ingredient.
  • the compound 'GSK2606414' (GSK), which is known as a PERK inhibitor, is known to have anti-cancer effect and therapeutic effect of degenerative neurological disease by inhibiting dimer formation of PERK units.
  • the concentration of GSK2606414 to completely inhibit the function of PERK is a high concentration in the range of approximately 0.6 ⁇ 2.0 uM (Journal of Biological Chemistry Vol. 287, No. 53, pp44338-44344).
  • This concentration range can be determined by observing the degree to which protein synthesis is induced by restoring protein synthesis inhibitory activity by GSK2606414 (PERKi) when thapsigargin (Tg), an ER-stress inducer, is treated to cells.
  • Tg thapsigargin
  • the protein synthesis rate was measured by Western blotting the amount of puromycinylated nascent peptide (Puro) by treating the cells with puromycin (see Fig. 1).
  • PERK is important for the normal development and function of insulin-secreting pancreatic beta cells.
  • GSK2606414 a PERK-specific inhibitor (PERKi)
  • PERKi a PERK-specific inhibitor
  • INS1 832/13 beta cells INS1 832/13 beta cells
  • rat pancreatic islets rat pancreatic islets
  • human islets a PERK-specific inhibitor
  • the Ca 2+ signaling by glucose stimulation, cell membrane (plasma membrane) with a Ca 2+ influx or ER Ca is adjusted through the release of a 2 + cytoplasm of the cytoplasmic Ca 2+ concentration, that is, [Ca 2 + ] since c is increased is an important regulator of GSIS (Glucose Stimulated Insulin Secretion), [Ca 2 +] I checked the effect of c by GSK2606414 suppressed the Ca 2+ influx into the cytoplasm of the [Ca 2+] c is Decrease was reported (FIG. 2B).
  • GSIS Glucose Stimulated Insulin Secretion
  • GSK2606414 when GSK2606414 is treated in pancreatic islets at a low concentration of 40 to 100 nM, preferably 40 nM, 50 nM, or 100 nM, diabetes can be treated as opposed to the effect of diabetic in the conventional high concentration treatment.
  • the inventors have, for the concentration determination of the PERK Inhibitor (PI), rat pancreatic the GSK2606414 the cells 20, 40, 80, 100, 250, a treatment by 500 nM concentration of Ca 2 + concentration change of cytoplasm and glucose stimulation
  • PI PERK Inhibitor
  • rat pancreatic the GSK2606414 the cells 20 40, 80, 100, 250
  • a treatment by 500 nM concentration of Ca 2 + concentration change of cytoplasm and glucose stimulation By observing the insulin secretion amount, it was finally confirmed that 40 ⁇ 100 nM range, preferably 40 nM concentration of the cytoplasmic Ca 2 + and insulin secretion by glucose stimulation (Fig. 3).
  • Fig. 3 insulin secretion by glucose stimulation
  • pancreatic islets 40 nM of GSK2606414 was treated in mouse islets, and then the change in Islet Equivalent volume (IEQ) and pancreatic islet size (Fragment Index, FI) was observed. As a result, it can be seen that there is no significant difference with the control (vehicle) treatment (Fig. 5).
  • PI PERK Inhibitor
  • GSK2656157 has been demonstrated in rodent experiments that it has an anticancer effect at high concentrations (more than 100 mg / kg / day) that completely inhibits the activity of PERK
  • the dose to partially inhibit the PERK is calculated by referring to this. 10 mg / kg / day) was orally administered to 10-12 weeks old diabetic mice. As a result, it was confirmed that the blood glucose concentration measured during feeding significantly decreased within 2 weeks (Fig. 7).
  • the concentration of GSK2606414 was determined to be 50 or 100 nM higher than the concentration of the mouse (40 nM) in consideration of the human body weight. Ca 2 + and insulin secretion were all confirmed to be increased (Fig. 9).
  • the concentration range affects the survival of human islets, after treating 50 or 100 nM of GSK2606414 to human islets, the total islet volume (Islet Equivalent volume, IEQ) and islet size (Fragment Index, FI) observed the change, it can be seen that there is no significant difference from the control (vehicle) treatment (Fig. 10).
  • PERK inhibitor (PI) is sufficient to significantly reduce the activity of the target protein PERK, and there is no particular limitation, but “GSK2606414” or “GSK2656157” is preferred.
  • compositions of the present invention may further comprise components such as existing therapeutically active ingredients, other adjuvants, pharmaceutically acceptable carriers and the like.
  • pharmaceutically acceptable carriers include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and the like.
  • the term "individual” means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, cow, and the like. Mean mammal.
  • the "pharmaceutically effective amount” means the type and severity of the disease to be administered, the age and sex of the patient, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of administration, the duration of treatment, the factors including the concurrent drug, and the like. It is determined according to factors well known in the medical field and can be easily determined by those skilled in the art in such an amount that the maximum effect can be obtained without any side effects in consideration of all the above factors.
  • composition of the present invention is not limited in the method of administration as long as it can reach the target tissue.
  • examples include oral administration, arterial injection, intravenous injection, transdermal injection, intranasal administration, coronary administration or intramuscular administration.
  • the daily dosage is about 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, preferably administered once to several times a day.
  • composition of the present invention can be used in a variety of drugs, foods and beverages for the prevention and improvement of diabetes, and can be used in the form of powders, granules, tablets, capsules or beverages.
  • pancreatic tumors Patients who underwent partial resection for pancreatic tumors were taken a normal part (0.3-1.5 g) of the resected pancreas with prior consent, and the pancreatic islets were isolated similarly to the separation method in the mice.
  • the mouse / human pancreatic culture can be cultured by treating GSK2606414 (GSK) dissolved in DMSO. After one day, the culture solution is exchanged and cultured for a total of 36 hours.
  • GSK2606414 GSK2606414
  • pancreatic islets were washed with KRBH (Krebs-Ringer-Bicarbonate-HEPES) solution (2.8 mM low glucose) and then incubated with the same solution at 37 ° C. for 20 minutes (fasting) and washed again. Then, 10 to 15 pancreatic islets were put into a 96 well plate and placed in KRBH (2.8 mM low glucose) containing Fluo-4 NW dye mix (Molecular Probes) and incubated at 37 ° C. for 40 minutes. After collecting supernatant (LG; low glucose), changes in cytosolic Ca 2+ concentration by KRBH (17.5 mM high glucose) stimulation were measured.
  • KRBH Kerat-Ringer-Bicarbonate-HEPES
  • Example 1-2 The low glucose supernatant (LG) and high glucose supernatant (HG) obtained in Example 1-2 were subjected to immunoassay using an ELISA kit (80-INSHU-E 10.1, ALPCO) to measure the secreted insulin concentration. .
  • the mouse pancreatic islets were treated with GSK2606414 (Note) GSK lower than the concentration range of the 100 ⁇ 500 nM, that is, 20, 40, 80 nM concentration to observe whether the increase in the Ca 2 + concentration of the cytoplasm.
  • GSK2606414 Note
  • Figure 3b it was observed that the Ca 2 + concentration of the cytoplasm was increased in the concentration range of 40 ⁇ 80 nM.
  • Example 3 40 PERK Inhibitor (PI) treatment with nM concentration
  • Example 2 and based on the result of, after the rat islet cells, in the treatment of 40 nM GSK2606414 36 hours, the cytosolic Ca + 2, the amount was measured. At this time, the experiment was performed on 11 mice, and R / R0 of the control group and the experimental group was analyzed by paired t-test (p ⁇ 0.01) and statistically processed.
  • Example 2 Based on the results of Example 2, the mouse pancreatic cells were treated with 40 nM of GSK2606414 for 36 hours, and then insulin secretion was measured. At this time, the experiment was conducted on 9 mice, and the insulin amount of the control group and the experimental group was analyzed by the Mann Whitney test (p ⁇ 0.01) and statistically processed.
  • insulin secretion was significantly increased when glucose (17.5 mM, HG) was stimulated compared to glucose (2.8 mM, LG) at low concentration, and 40 nM compared to control (vehicle).
  • glucose (17.5 mM, HG) was stimulated compared to glucose (2.8 mM, LG) at low concentration, and 40 nM compared to control (vehicle).
  • HG high glucose
  • Example 4 Pancreatic islets Viability assessment
  • IEQ Islet Equivalent volume
  • FI pancreatic islet size
  • the IEQ measurement was performed by placing a fraction of the isolated pancreatic islets in a non-coated dish (35x10mm), observing the microscope at 40 times magnification, measuring the diameter of each pancreatic pancreas, and then converting the volume of each pancreatic pancreas having a diameter of 150 um to 1 and adding them together. After that, the total islets were divided into fractions and fractions. As a result, as shown in Figure 5a, even when treated for a long time (36 hours) of 40 nM GSK2606414 it was confirmed that there is no significant change in the number of pancreatic islets compared to the control (vehicle).
  • Example 4-1 The total IEQ value obtained in Example 4-1 was divided by the total number of pancreatic islets to calculate a fragment index indicating the average size of the pancreatic islets. As a result, as shown in Figure 5b, it was confirmed that there is no significant change in pancreatic islet size compared to the control (vehicle) even after 40 nM GSK2606414 treatment for a long time (36 hours).
  • INS1 832/13 cells on PRMI 1640 (10% FBS) medium were seeded (3x10 4 cells) in 96 well plates and cultured overnight, and vehicle (DMSO) was treated with GSK2606414 (DMSO) as a control group. Incubate for up to 48 hours without changing the medium. Then, incubated with KRBH (2.8 mM low glucose) solution for 20 minutes at 37 ° C. (fasting) and washing with the same solution, and then in KRBH (2.8 mM Low Glucose) solution containing Fluo-4 NW dye mix (Molecular Probes). Put and incubated for 40 minutes at 37 °C.
  • KRBH 2.8 mM low glucose
  • the GSK2606414 treatment group began to increase the amount of cytoplasmic Ca 2 + upon stimulation of high glucose (17.5 mM) from about 6 hours, it was confirmed that the maximum increase after about 12 hours.
  • GSK2656157 was dissolved in 0.5% hydroxypropyl methyl cellulose, 0.1% tween-80 (pH 6.75) in distilled water, and then administered via gastric gavage twice daily at 5 mg / kg from 10 to 12 weeks of age.
  • the control group was administered in the same way twice a day vehicle with the same volume without GSK2656157.
  • Example 6-1 the mice that had been treated with GSK2656157 for 2 weeks were fasted for 16 hours, and blood was collected from the orbital vein to measure blood glucose and serum was isolated. Thereafter, 1 g / kg of glucose was injected intraperitoneally and 30 minutes later, blood was collected from the orbital vein to measure blood glucose and serum was separated.
  • Insulin concentrations in serum were measured by ELISA (ALPCO, Salem, MA, USA), and the values between the vehicle and the PI group were compared using the Mann Whitney test (*, p ⁇ 0.05, mice in each group were 9 heads (PI), 14 heads (control)
  • Fasting insulin index was calculated by the following blood glucose (glucose_0) and insulin (insulin_0) concentrations measured after 16 hours of fasting (this is the IG ratio index, which is commonly used in humans).
  • the stimulated insulin index was calculated as follows, including blood glucose (glucose_30) and insulin (insulin_30) concentrations measured 30 minutes after glucose loading (this is an insulinogenic index, which is commonly used in humans).
  • the insulin secretion index calculated by blood glucose and insulin concentration before and after glucose load was not significantly different from the fasting insulin secretion, but the insulin secretion stimulated with glucose was significantly increased after PI administration. It was found to increase.
  • Example 7 human On the islet cells PERK Inhibitor (PI) processing
  • Example 2 Based on the results of Example 2 by the rat islet cell targeting, 24 to after 36 hours treatment, cytosolic Ca 2 + quantity by selecting the concentration range for the GSK2606414 50 nM or 100 nM was measured on human islet cells . At this time, the experiment was performed on 6 patient-derived samples, and R / R0 of the control group and the experimental group was analyzed by paired t-test (p ⁇ 0.05) and statistically processed.
  • Example 2 of the mouse islet cells Based on the results of Example 2 of the mouse islet cells, a concentration range of 50 nM or 100 nM of GSK2606414 was selected for human pancreatic cells and treated with GSK2606414 for 24 to 36 hours, and then insulin secretion was measured. At this time, the subjects were sampled from 6 patients, and the amount of insulin in the control group and the experimental group was analyzed by Mann Whitney test (p ⁇ 0.05) and statistically processed.
  • the insulin secretion was significantly increased during the high glucose (17.5 mM, HG) stimulation compared to the low glucose (1.67 mM, LG), and also 50 or 100 compared to the control (vehicle).
  • HG high glucose
  • Example 8 human Pancreatic islets Viability assessment
  • IEQ Islet Equivalent volume
  • FI Fragment Index
  • the IEQ measurement was performed by placing a fraction of the isolated pancreatic islets in a non-coated dish (35x10mm), observing the microscope at 40 times magnification, measuring the diameter of each pancreatic pancreas, and then converting the volume of each pancreatic pancreas having a diameter of 150 um to 1 and adding them together. After that, the total islets were divided into fractions and fractions. As a result, as shown in Figure 10a, even if the 50 or 100 nM GSK2606414 all treated for a long time (24 ⁇ 36 hours) it was confirmed that there is no significant change in the number of pancreatic islets compared to the control (vehicle).
  • Example 8-1 The total IEQ value obtained in Example 8-1 was divided by the total number of pancreatic islets to calculate a fragment index indicating the average size of the pancreatic islets. As a result, as shown in Figure 10b, it was confirmed that there is no significant change in the size of the pancreatic islets compared to the control (vehicle) even if treated for a long time (24 ⁇ 36 hours) of 50 or 100 nM GSK2606414.

Abstract

본 발명은 저농도의 PERK(Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3) 저해제를 유효성분으로 함유하는, 당뇨병 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 고혈당 자극에 의한 췌장 베타세포 내 칼슘 및 인슐린을 증가시킴으로써 혈중 인슐린 농도를 높이고, 당뇨병을 치료할 수 있다.

Description

당뇨병 치료 조성물 및 이의 용도
본 발명은 저농도의 PERK(Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3) 저해제를 유효성분으로 함유하는, 당뇨병 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
소포체(ER, endoplasmic reticulum)의 내강은 번역 후 변형(posttranslational modification)과 단백질의 폴딩(folding)을 위해 특수화된 세포적 환경으로서, 세포 내 단백질의 약 1/3이 조면소포체(rough ER)에서 단백질로 번역 후 변형, 즉 폴딩(folding)과 조립(assembly), 당화(glycation) 및 이황화결합(disulfide bond) 등의 과정을 통해 활성형 단백질 구조가 된다.
소포체 스트레스(ER stress)란 생리적 혹은 병리적 환경에 의해 소포체가 처리할 수 있는 능력 이상의 미성숙 단백질이 소포체 내로 유입이 되거나 소포체 내 칼슘이 고갈되어 소포체 기능에 장애가 발생하는 것을 말하며, 주로 단백질 폴딩 용량을 넘어서서 ER 단백질 폴딩 부하를 초과한 상태를 의미한다. 소포체 스트레스가 발생하면 세포는 생존하기 위한 방어기전을 가지는데 이를 소포체 스트레스 반응(ER stress response)이라고 한다. 소포체 스트레스 반응은 소포체 막에 존재하는 세 가지의 신호전달체계인 PERK, IRE-1α/XBP-1 (inositol-requiring 1α/X-box binding protein 1) 및 ATF6 (activating transcription factor)에 의해 매개되며, 구체적으로는 다음의 4가지 반응이 알려져 있다.
첫 번째 반응은, 리보좀에서 mRNA로부터 단백질로 번역되는 것을 억제(translational attenuation)하여 소포체 내로 새로운 단백질이 유입되는 것을 막는 것이다. 정상적으로는 개시 메티오닐이 붙어있는 tRNA를 40S 리보솜 소 단위체로 수집하는 eIF2 (eukaryotic translation initiation factor 2) 중합체의 활성이 감소되는 결과로 단백질 합성이 줄어든다.
두 번째 반응은, 단백질을 폴딩시키는데 필요한 Bip(HSPA5)와 같은 소포체 샤페론(chaperon)의 발현을 유도하여 소포체의 폴딩 능력을 향상시키는 것이다. 세포질 샤페론이 아닌 소포체 샤페론을 코딩하는 유전자의 전사는 UPR(unfolded protein response)로 알려진 신호전달 경로를 통해 활성화된다. 포유류에서, IRE1, PERK와 ATF6는 소포체 내강에서 잘못 폴딩된 단백질들의 존재를 감지하는 소포체 막 관통 단백질이다. 정상적인 상태에서 이 신호전달 분자들은 단백질 샤페론인 Bip가 있는 내강 영역의 상호작용을 통해 비활성 상태를 유지한다. Bip는 폴딩되지 않은 폴리펩티드 사슬과 상호작용하는 Hsp70 단백질 샤페론 집합체의 ER 소재 구성원이다. 소포체가 스트레스에 노출되었을 때 Bip는 폴딩되지 않은 단백질에 결합하여 이 스트레스 센서들로부터 분비된다. Bip로부터 IRE1의 분리는 UPR 유전자 발현의 주요 전사 인자를 발생시키는 XBP1의 접합을 개시하기 위해 단백질 키나아제와 엔도리보뉴클라제 활성을 활성화시킨다. Bip로부터 분리되었을 때 PERK가 활성화되고, eIF2의 알파 소단위를 인산화시키고 단백질 합성을 약화시킨다.
세 번째 반응은, 소포체 스트레스 관련 분해(ER stress-associated degradation, ERAD)로 소포체에서 폴딩되지 않거나 잘못 폴딩된 단백질을 세포질 내 유비퀴틴-프로테아솜(ubiquitin-proteasome) 시스템을 통해 분해하여 제거하는 과정이다.
네 번째 반응은, 소포체 스트레스가 위의 세 가지 반응으로 극복이 되지 못할 정도로 심각하게 되고 소포체가 제 기능을 회복할 수 없을 때는 세포자연사(apoptosis) 경로가 활성화되어 손상된 세포를 제거한다.
이와 같이, 소포체 스트레스 반응은 다양한 세포성 스트레스에서 소포체 기능을 보존하여 세포를 보호하기 위한 중요한 보상 기전이지만, 최근에는 잘못된 신호전달 시스템으로 인하여 과도한 소포체 스트레스 반응이 유발되어 이로 인해 야기되거나 유발되는 질병들이 있다는 것이 알려지고 있다. 즉, 소포체 스트레스 반응은 특히 단백질을 합성하여 분비하는 기능이 활발한 췌장의 베타세포, 간세포, 조골세포와 같은 곳에서 잘 관찰되고 있으며, 최근 많은 연구들은 소포체 스트레스가 당뇨병, 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증과 같은 여러 가지 질환의 병인으로 작용함을 보여 주고 있다.
특히, 췌장의 베타세포(beta cell)는 인슐린을 분비하기 위해 특별히 발달된 구조의 소포체를 지니고 있기 때문에, 소포체 기능의 이상은 특히 인슐린의 기능에 문제를 일으키기 쉬우며, 제1형 당뇨의 경우는 베타세포 사멸의 상당 부분이 소포체 스트레스의 과정을 통해 일어나고, 2형 당뇨의 경우는 소포체 스트레스로 인해 활성화되는 스트레스 효소들(stress kinases)이 인슐린에 의해 시작되는 세포 신호 전달을 붕괴시킴으로써 세포들로 하여금 인슐린에 대해 둔감하게 하는 것으로 보고되었다.
따라서, 소포체 스트레스를 조절하여 암, 당뇨병, 파킨슨병, 글루타민다량체 유발 응집 질환, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 허혈성 질환, 심혈관질환, 고호모시스테인증 및 동맥경화증과 같은 소포체 스트레스 관련 질환의 발생을 예방하고 치료를 할 수 있을 것으로 제시되고 있으나, 소포체 스트레스반응 기전에 대해서는 알려지지 않은 부분이 많아 이에 대한 연구가 부족한 실정이다.
특히, 췌장의 베타세포(beta cell)는 인슐린을 분비하기 위해 특별히 발달된 구조의 소포체를 지니고 있기 때문에, 소포체 기능의 이상은 특히 인슐린 분비 기능에 문제를 일으키기 쉬우며, 제2형 당뇨의 경우는 소포체 스트레스로 인해 활성화되는 스트레스 효소들(stress kinases)이 인슐린에 의해 시작되는 세포 신호 전달을 붕괴시킴으로써 세포들로 하여금 인슐린에 대해 둔감하게 하는 것으로 보고되었다.
PERK는 ER membrane에 위치하며 스트레스 센싱 도메인과 세포질 kinase 도메인으로 구성되는 막단백질로서, ER stress에 대항하여 세포가 적응하기 위한 반응(unfolded protein response)에서 중요한 역할을 한다. Complete PERK deletion (PERK -/-)은 사람과 쥐 모두에서 인슐린을 분비하는 췌장 베타세포의 감소와 인슐린 분비저하, neonatal diabetes를 유발한다고 보고된 바 있고, 마우스와 사람의 베타세포에 PERK 저해제를 고농도로 처리하여 PERK 기능을 완전히 억제할 때에도 마찬가지로 인슐린 분비의 저하가 있는 것이 보고된 바 있다. 그러나 암이나 퇴행성 신경병에 대해서는, 이러한 PERK 저해제의 투여가 치료적 효과가 있음이 밝혀졌다.
이에, 본 발명자는 종래 암 및 퇴행성 뇌신경 질환의 치료에 효과가 있다고 알려진 PERK 저해제를 고농도가 아닌 저농도로 처리할 경우, 당뇨병을 치료할 수 있다는 신규 용도를 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 저농도의 PERK 저해제를 유효성분으로 함유하는, 당뇨병 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, 40~100 nM 농도의 PERK(Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3) 저해제를 유효성분으로 함유하는, 당뇨병 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 저농도의 PERK 저해제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 상기 저농도의 PERK 저해제의 당뇨병의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 PERK 저해제는 하기 화학식 1의 "1-[5-(4-아미노-7-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)인돌-1-일]-2-(3-트리플루오로메틸페닐)에타논"(이하, "GSK2606414"라고 함)인 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2016000628-appb-I000001
본 발명의 다른 구현예로, 상기 PERK 저해제는 하기 화학식 2의 "1-(5-(4-아미노-7-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-4-플루오로인돌린-1-일)-2-(6-메틸피리딘-2-일)에타논"(이하, "GSK2656157"라고 함)인 것을 특징으로 한다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2016000628-appb-I000002
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 PERK 저해제는 췌도세포에서 세포질 칼슘양 및 인슐린 분비량을 증가시킴으로써 혈중 인슐린 농도를 높이는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 저농도의 PERK 저해제는 고혈당 자극에 의한 췌도세포 내 칼슘 및 인슐린을 증가시킴으로써 당뇨병을 완화시키는 효과를 갖는다.
본 발명에 따른 저농도의 PERK 저해제는 당뇨병 생쥐의 생체 내에서(in vivo) 인슐린을 증가시킴으로써 당뇨병을 완화시키는 효과를 갖는다.
따라서, 상기 효과를 갖는 저농도의 PERK 저해제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 당뇨병의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은, 600 nM(0.6 uM) 이상의 고농도로 PERK inhibitor(PERKi; GSK2606414)를 처리시, PERK의 기능이 완전히 억제됨을 보여주는 웨스턴 블랏팅 결과 및 정량 그래프이다.
도 2는, INS1 832/13 베타세포, 쥐의 췌도, 인간의 췌도에 각각 PERK inhibitor(PI; GSK2606414)를 1.0 uM의 고농도로 처리시, 고혈당에 의한 인슐린 분비가 감소되고(도 2a), 세포질의 Ca2 + 양이 감소되어(도 2b), 당뇨병이 유발된다는 것을 보여주는 결과이다.
도 3은, 생쥐 췌도세포에 PERK inhibitor(GSK2606414)를 농도별로 처리하여, 포도당 자극에 의한 세포질의 Ca2 + 농도 변화(도 3a 및 도 3b) 및 인슐린 분비량을 관찰한 결과(도 3c)이다.
도 4는, 생쥐 췌도세포에 PERK inhibitor(GSK2606414)를 40nM의 저농도로 처리시, 포도당 자극에 의한 세포질의 Ca2 + 증가(도 4a) 및 인슐린 분비량 증가(도 4b)를 관찰한 결과이다.
도 5는, PERK inhibitor(GSK2606414) 처리 후의 췌도 생존율(viability)을 평가하기 위하여, 생쥐 췌도의 총부피(IEQ)(도 5a) 및 췌도 크기(FI)(도 5b) 변화를 관찰한 결과이다.
도 6은, INS1 832/13 베타세포에 40~80 nM의 PERK inhibitor(GSK2606414) 처리 후 calcium transit(세포질 Ca2+) 변화를 시간별로 관찰한 결과이다.
도 7은, 2주간의 PERK inhibitor(GSK2656157) 처리 후의 생체 혈당의 변화를 확인하기 위하여, 당뇨병 생쥐에게 포도당 부하 전후 혈액을 채취하여 포도당 농도를 측정한 결과이다.
도 8은, 2주간의 PERK inhibitor (GSK2656157) 처리 후의 생체 인슐린 분비능을 확인하기 위하여, 생쥐에 2주간 PERK inhibitor를 투여를 마친 후 복강 내 당부하 검사를 실시한 결과(도 8a) 및 당뇨병 유발 생쥐에게 포도당 부하 전후 혈액을 채취하여 인슐린 농도를 측정한 결과(8b)이다.
도 9는, 인간 췌도세포에 PERK inhibitor(GSK2606414)를 50 또는 100 nM의 저농도로 처리시, 포도당 자극에 의한 세포질의 Ca2 + 증가(도 9a) 및 인슐린 분비량 증가를 관찰한 결과(도 9b)이다.
도 10은, PERK inhibitor(GSK2606414) 처리 후의 췌도 생존율(viability)을 평가하기 위하여, 인간 췌도의 총부피(IEQ)(도 10a) 및 췌도 크기(FI)(도 10b) 변화를 관찰한 결과이다.
본 발명의 당뇨병 치료용 조성물은 저농도의 PERK 저해제를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
종래, PERK 저해제로 알려진 화합물 'GSK2606414'((주)GSK)는, PERK units의 dimer 형성을 억제함으로써 항암효과 및 퇴행성 뇌신경질환의 치료효과가 있음이 알려져 있다.
또한, PERK의 기능(단백질 합성 저해)을 완전히 억제하기 위한 GSK2606414의 농도는 대략 0.6~2.0 uM 범위의 고농도임이 알려져 있다(Journal of Biological Chemistry Vol.287, No.53, pp44338-44344). 이러한 농도범위는, ER-스트레스 유발물질인 thapsigargin(Tg)을 세포에 처리시, PERK에 의한 단백질 합성 저해 활성이 GSK2606414(PERKi)에 의해 회복되어 단백질 합성이 유도되는 정도를 관찰함으로써 결정될 수 있다. 이때, 단백질 합성율은 세포를 puromycin으로 처리하여 puromycinylated nascent peptide(Puro) 양을 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다(도 1 참조).
또한, 종래 이러한 결과는, PERK 기질인 eIF2α의 인산화(eIF2αP)가 GSK2606414에 의해 억제되는 농도범위와도 일치하는 것이다. GSK2606414는 PERK의 kinase 도메인에 대한 결합력이 강하기 때문에 ATP와 경쟁하여 PERK의 kinase 활성을 저해하는데, PERK 기질인 eIF2α의 인산화 억제효과를 다양한 농도의 GSK2606414(PERKi)로 처리함으로써 PERK 활성을 완전히 차단하는데 필요한 농도가 0.6-2.0 uM 범위로 확인된 것이다.
뿐만 아니라, 췌장 베타세포(β cell)에 GSK2606414(PERK Inhibitor; PI)를 1.0 uM의 고농도 처리하면, 인슐린 분비가 감소된다는 것이 알려져 있다(Journal of Biological Chemistry, 2013 Nov 22; 288(47):33824-36).
즉, PERK는 인슐린을 분비하는 췌장 베타세포의 정상적인 발생 및 기능에 중요한데, 포도당 자극(처리) 이전에 PERK 특이적 억제제(PERKi)인 GSK2606414를 INS1 832/13 베타세포, 쥐의 췌도, 인간의 췌도에 처리시 이들 세포에서 모두 인슐린 분비가 감소됨이 보고되었다(도 2a).
또한, 포도당 자극에 의한 Ca2 + signaling은, 세포막(plasma membrane)을 통한 Ca2 + influx 또는 ER Ca2 +의 세포질로의 release를 통하여 조절되며, 세포질의 Ca2+ 농도, 즉 [Ca2 +]c 증가는 GSIS(Glucose Stimulated Insulin Secretion)의 중요한 조절인자이기 때문에, [Ca2 +]c에 미치는 효과를 확인한 결과 GSK2606414에 의해 세포질내로의 Ca2+ influx가 억제되어 [Ca2+]c이 감소됨이 보고되었다(도 2b).
그러나 본 발명에서는 췌도세포에 40~100 nM 범위, 바람직하게는 40 nM, 50 nM, 또는 100 nM의 저농도로 GSK2606414를 처리시, 종래 고농도 처리시의 당뇨 유발효과와는 반대로 당뇨병을 치료할 수 있음을 최초로 발견하였다.
우선, 본 발명자는, PERK Inhibitor(PI)의 농도결정을 위하여, 생쥐 췌도세포에 GSK2606414를 20, 40, 80, 100, 250, 500 nM 농도별로 처리하여 세포질의 Ca2 + 농도 변화 및 포도당 자극에 의한 인슐린 분비량을 관찰하여, 최종적으로 40~100 nM 범위, 바람직하게는 40 nM의 농도에서 세포질의 Ca2 + 농도와 포도당 자극에 의한 인슐린 분비량이 증가함을 확인하였기 때문에(도 3), 40 nM의 농도를 선정하여 생쥐 췌도세포를 대상으로 후속실험을 수행하였다.
이후, 본 발명에서 선정된 40 nM의 저농도로 GSK2606414를 생쥐 췌도세포에 처리한 결과, 세포질의 Ca2 + 및 (포도당 자극에 의한) 인슐린 분비량이 모두 증가됨을 확인하였다(도 4).
또한, GSK2606414가 췌도의 생존에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 생쥐 췌도세포에 40 nM의 GSK2606414를 처리한 후, 췌도 총부피(Islet Equivalent volume, IEQ)와 췌도 크기(Fragment Index, FI) 변화를 관찰한 결과, 대조군(vehicle) 처리시와 큰 차이가 없음을 알 수 있었다(도 5).
또한, 40~80 nM의 GSK2606414를 INS1 832/13 베타세포에 처리하여 calcium transit 변화를 시간별로 관찰한 결과, GSK2606414 처리군은 대략 6시간 후부터 세포질 Ca2 + 양이 증가하기 시작하여, 12시간 후쯤에 최대로 증가함을 확인하였다(도 6).
저농도의 PERK Inhibitor(PI)에 의한 베타세포 내 인슐린 분비 증가 효과가, 시험관내(in vitro) 뿐만 아니라 생체 내(in vivo)에서도 관찰되는지 확인하기 위하여, 당뇨병 유발 생쥐에게 저농도의 PI(GSK2656157)를 2주간 투여하였다. 종래, GSK2656157는 PERK의 활성을 완전히 억제하는 고농도(100 mg/kg/day 이상)에서 항암 효과가 있다는 것이 설치류 실험에서 증명된 바 있기 때문에, 이를 참고하여 PERK를 부분적으로 억제하는 용량을 계산하여(10 mg/kg/day) 10~12주령의 당뇨병 생쥐에게 경구 투여하였다. 그 결과, 섭식 중 측정한 혈중 포도당 농도가 2주 이내에 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(도 7).
또한, 2주간의 투여 후 시행한 복강 내 당부하 검사에서 16시간 금식 후에도 통계적으로 유의하게 감소된 혈당을 관찰할 수 있었다(도 8a). 당부하 전과 30분 후의 혈당과 인슐린 농도로 계산한 인슐린 분비지수는, 공복 인슐린 분비에 있어서는 유의한 차이가 없었으나 당부하로 자극된 인슐린 분비는 PI 투여 후 유의하게 증가되어 있었다 (도 8b). 따라서, 저용량의 PI는 생체 내에서도 포도당에 의한 인슐린 분비를 자극하여 혈당을 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.
생쥐 췌도세포를 대상으로 한 결과에 기초하여, 인간 췌도세포를 대상으로 더욱 실험을 수행하였다. 이때, GSK2606414의 농도 결정은, 인간 체중을 고려하여 생쥐의 농도(40 nM)보다 상위인 50 또는 100 nM로 선정하였으며, 생쥐 췌도세포와 마찬가지로 50 또는 100 nM의 GSK2606414 처리시 포도당 자극에 의한 세포질의 Ca2 + 및 인슐린 분비량이 모두 증가됨을 확인하였다(도 9). 또한, 상기 농도범위가 인간 췌도의 생존에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 인간 체도세포에 50 또는 100 nM의 GSK2606414를 처리한 후, 췌도 총부피(Islet Equivalent volume, IEQ)와 췌도 크기(Fragment Index, FI) 변화를 관찰한 결과, 대조군(vehicle) 처리시와 큰 차이가 없음을 알 수 있었다(도 10).
이러한 결과는, 본 발명에 따른 저농도의 PERK 저해제가, 고혈당 자극에 의한 췌장 베타세포의 세포질 칼슘양 및 인슐린 분비를 증가시킴으로써 당뇨병을 예방 또는 치료할 수 있음을 의미하는 것이다.
본 명세서에서 "PERK 저해제(PI)"는 표적 단백질인 PERK의 활성을 유의하게 감소시키는 것이면 족하고 특별한 제한은 없으나, "GSK2606414" 또는 "GSK2656157"인 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 기존 치료 활성 성분, 기타 보조제, 약제학적으로 허용 가능한 담체 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올 등을 포함한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한, 본 발명에서 "약학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 당뇨병의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 실험방법
1-1. 췌도 분리 및 PERK Inhibitor(PI) 처리
마우스 췌도
마우스를 경추탈골로 희생하여 70% EtOH로 샤워 후 복부절개하고, Collagenase P solution (Roche, #1213 865)을 pancreatic duct 내로 주입하여, 부풀어오른 췌장을 적출하였다. 이후, 조직을 Collagenase P solution에 담그어 37℃ 수조에 넣고 15분간 반응시키고, 10% FBS가 포함된 HBSS(complete media)를 첨가하여 소화반응을 종료시켰다. HBSS로 세척한 후 500 um mesh에 부어서 필터링하고, Ficoll (Biochrome) gradient를 이용하여 췌도층을 분리하였다. 그 다음, HBSS로 수차례 세척, PRMI1640(10% FBS) 배지(Gibco)에 배양하였다.
인간 췌도
췌장 종양으로 부분절제술을 받은 환자에게 사전동의를 얻어 절제한 췌장 중 정상 부분(0.3~1.5 g)을 취하여, 상기 마우스에서의 분리방법과 유사하게 췌도를 분리하였다.
이때, 마우스/인간 췌도 배양은 DMSO에 녹인 GSK2606414((주)GSK)을 처리하여 배양할 수 있으며, 하루 지나 배양액을 교환하고 총 36시간 배양한다.
1-2. 포도당 자극에 의한 세포질 칼슘 어세이
KRBH(Krebs-Ringer-Bicarbonate-HEPES)　용액(2.8 mM low glucose)으로 췌도를 세척한 후 같은 용액으로 37℃에서 20분 배양하고(fasting), 다시 세척하였다. 그 다음, 96 well plate에 10∼15개의 췌도를 넣고 Fluo-4 NW dye mix(Molecular Probes)가 포함된 KRBH(2.8 mM low glucose)에 넣고 37℃에서 40분 배양하였다. 상청액(LG; low glucose) 수집 후, KRBH(17.5 mM high glucose) 자극에 의한 세포질 Ca2+ 농도 변화를 측정하였다. 이때, Ca2 + 농도는 Infinite F200 PRO(TECAN, Austria)를 이용하여 형광을 측정(excitation at 494nm/emission at 516 nm)한 후, 형광비(fluorescence ratio; R)를 baseline R(R0)에 대한 비로 표시하였다.
1-3. 포도당 자극에 의한 인슐린 어세이
상기 실시예 1-2에서 얻은 low glucose 상청액(LG) 및 high glucose 상청액(HG)에 대하여, ELISA kit(80-INSHU-E 10.1, ALPCO)를 이용하여 immunoassay를 수행하여 분비된 인슐린 농도를 측정하였다.
실시예 2: PERK Inhibitor(PI)의 농도 결정
종래, 600 nM(0.6 uM) 이상의 고농도로 GSK2606414((주)GSK)를 처리시, PERK의 기능이 완전히 억제되고(도 1), 베타세포의 경우 세포질의 Ca2 + 농도와 인슐린 분비가 감소된다는 것이 알려져 있기 때문에(도 2a 및 도 2b), 생쥐(mouse) 췌도세포에 GSK2606414를 상기 600 nM(0.6 uM) 보다 낮은 100, 250, 500 nM 농도별로 처리하여 세포질의 Ca2 + 농도 변화를 관찰하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 이들 100~500 nM의 농도범위에서는 여전히 세포질의 Ca2 + 농도가 감소하였다.
이에, 생쥐 췌도세포에 GSK2606414((주)GSK)를 상기 100~500 nM의 농도범위보다 더 낮은 범위, 즉 20, 40, 80 nM 농도별로 처리하여 세포질의 Ca2 + 농도가 증가하는지 관찰하였다. 그 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 40~80 nM 농도범위에서 세포질의 Ca2 + 농도가 증가됨이 관찰되었다.
또한, GSK2606414를 20, 40, 80 nM 농도별로 처리한 후, 포도당 자극에 의한 인슐린 분비가 향상되었는지도 관찰한 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 40 nM의 농도에서 인슐린 분비가 가장 증가됨을 알 수 있었다. 따라서, 40 nM를 선정하여 생쥐 췌도세포 대상의 후속실험을 더욱 수행하였다.
실시예 3: 40 nM 농도의 PERK Inhibitor(PI) 처리
3-1: 세포질 칼슘 변화 분석
상기 실시예 2의 결과에 기초하여, 생쥐 췌도세포에 40 nM의 GSK2606414를 36시간 처리한 후, 세포질 Ca2 + 양을 측정하였다. 이때 실험은 마우스 11마리를 대상으로 하였으며, 대조군과 실험군의 R/R0을 paired t-test로 분석(p< 0.01)하여 통계처리하였다.
그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 대조군(vehicle)에 비하여 40 nM의 GSK2606414에 노출된 경우, 고농도의 포도당(17.5 mM) 자극시 세포질 칼슘양이 유의하게 증가함을 알 수 있었다.
3-2: 인슐린 변화 분석
상기 실시예 2의 결과에 기초하여, 생쥐 췌도세포에 40 nM의 GSK2606414를 36시간 처리한 후, 인슐린 분비량을 측정하였다. 이때 실험은 마우스 9마리를 대상으로 하였으며, 대조군과 실험군의 인슐린 양을 Mann Whitney test로 분석(p< 0.01)하여 통계처리하였다.
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 저농도의 포도당(2.8 mM, LG)에 비하여 고농도의 포도당(17.5 mM, HG) 자극시 인슐린 분비가 유의하게 증가하였으며, 또한 대조군(vehicle)에 비하여 40 nM의 GSK2606414에 노출된 경우, 고농도의 포도당(HG) 자극에 의한 인슐린 분비량이 상당히 증가함을 알 수 있었다.
실시예 4: 췌도 생존율(viability) 평가
GSK2606414가 췌도의 생존에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 생쥐 췌도세포에 40 nM의 GSK2606414를 처리하기 전과 후의, 췌도 총부피(Islet Equivalent volume, IEQ)와 췌도 크기(Fragment Index, FI)를 비교측정한 후, 처리 후의 값을 기저값으로 나눈 비율을 그래프로 표시하였다.
4-1. IEQ 측정 방법
구체적으로, IEQ 측정은 분리한 췌도의 일부 분율을 비코팅 dish(35x10mm)에 깔고 40배율로 현미경 관찰하며 각 췌도의 지름을 측정한 후, 지름 150 um의 각 췌도의 부피를 1로 환산하여 합한 후 전체 췌도의 양으로 환산, 분율로 나누어 구하였다. 그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 40 nM의 GSK2606414를 장시간(36시간) 처리하여도 대조군(vehicle)과 비교하여 췌도 수에 유의있는 변화가 없음을 확인하였다.
4-2. FI 측정 방법
실시예 4-1에서 구한 총 IEQ값을 총 췌도수로 나누어, 췌도의 평균 크기를 나타내는 fragment index를 계산하였다. 그 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 40 nM의 GSK2606414를 장시간(36시간) 처리하여도 대조군(vehicle)과 비교하여 췌도 크기에 유의있는 변화가 없음을 확인하였다.
실시예 5: 시간별 calcium transit 관찰
Rat 베타세포주(INS1 832/13)에 40∼80 nM의 GSK2606414를 처리한 후 calcium transit 변화를 시간별로 관찰하기 위하여, 다음의 칼슘 어세이법을 실시하였다.
우선, PRMI 1640(10% FBS) 배지상의 INS1 832/13 세포를 96 well plate에 seeding(3x104 세포)하여 밤새 배양하고, 대조군으로 vehicle(DMSO)을 실험군으로 GSK2606414(DMSO)를 처리한 후, 배지 교체 없이 48시간까지 배양하였다. 이후, KRBH(2.8 mM low glucose) 용액으로 37℃에서 20분간 배양(fasting)하고 동일 용액으로 세척한 후, Fluo-4 NW dye mix(Molecular Probes)가 포함된 KRBH(2.8 mM Low Glucose) 용액에 넣고 37℃에서 40분간 배양하였다. 그 다음, KRBH(17.5 mM High Glucose)에 의한 세포질 Ca2 + 변화를 측정하였다. 이때, Ca2 + 농도는 Infinite F200 PRO(TECAN, Austria)를 이용하여 형광을 측정(excitation at 494 nm / emission at 516 nm)한 후, 형광비(fluorescence ratio; R)를 baseline R(R0)에 대한 비로 표시하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, GSK2606414 처리군은 대략 6시간 후부터 고농도 포도당(17.5 mM) 자극시 세포질 Ca2 + 양이 증가하기 시작하여, 12시간 후쯤에 최대로 증가함을 확인하였다.
실시예 6: 마우스 생체 내 혈당 저하 및 인슐린 분비 자극 효과
6-1: 혈당 저하 효과
마우스에 PERK inhibitor(GSK2656157)를 2주간 처리 후 생체 내 혈당 변화를 확인하기 위하여, 당뇨병 생쥐에게 포도당 부하 전후 혈액을 채취하여 포도당 농도를 측정하였다.
구체적으로, 4주령 B6 마우스에 60% 고지방 식이를 시작하고, 8주령에 50 mg/kg/day streptozotocin을 3일 연속 복강 투여하여 베타세포를 파괴하였다.
GSK2656157는 증류수 내 0.5% 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 0.1% tween-80 (pH 6.75) 에 녹여서 현탁한 후, 10~12주령부터 5 mg/kg씩 하루 2회 gastric gavage를 통해 투여하였다. 대조군은 GSK2656157을 섞지 않은 vehicle을 같은 부피로 하루 2회 같은 방법으로 투여하였다.
총 2주 투여 동안, 2일마다 오후에 꼬리정맥에서 채혈하여 혈당을 측정하고 (One Touch, Johnson & Johnson, Milpitas, CA, USA), repeated measure ANOVA를 이용하여 통계 분석하였다(*, p < 0.05, 각 군당 생쥐는 9두(PI), 14두(대조군)).
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 섭식 중 측정한 혈중 포도당 농도가 2주 이내에 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
6-2: 인슐린 분비 자극 효과
마우스에 PERK inhibitor(GSK2656157)를 2주간 처리 후 생체 내 인슐린 분비능을 확인하기 위하여, 당뇨병 생쥐에게 포도당 부하 전후 혈액을 채취하여 인슐린 농도를 측정하였다.
구체적으로, 상기 실시예 6-1에서 2주간 GSK2656157 투여를 마친 생쥐를 16시간 금식시킨 뒤 안와정맥에서 채혈하여 혈당을 측정하고 혈청을 분리하였다. 이후, 1 g/kg의 포도당을 복강 내 주사한 뒤 30분 후에 안와정맥에서 채혈하여 혈당을 측정하고 혈청을 분리하였다.
혈청에서 인슐린 농도는 ELISA 기법으로 측정(ALPCO, Salem, MA, USA)하고, 대조군(vehicle)과 PI 투여군 사이의 값을 Mann Whitney test를 이용하여 비교하였다(*, p < 0.05, 각 군당 생쥐는 9두(PI), 14두(대조군))
그 결과, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 2주간의 투여를 마치고 시행한 복강 내 당부하 검사에서 16시간 금식 후에도 통계적으로 유의하게 감소된 혈당을 관찰할 수 있었다.
Fasting insulin index는 16시간 금식 후 측정한 혈당(glucose_0)과 인슐린(insulin_0) 농도로 다음과 같이 계산하였다(이는 IG ratio라는 index로, 사람에서 흔히 사용하는 index임)
(Insulin_0 / glucose_0 ) × 1000
Stimulated insulin index는 포도당 부하 30분 후 측정한 혈당(glucose_30)과 인슐린(insulin_30) 농도까지 포함하여 다음과 같이 계산하였다(이는 insulinogenic index로, 사람에서 흔히 사용하는 index임)
(insulin_30 - insulin_0)/(glucose_30 - glucose_0)× 1000
이후, Vehicle과 PI 투여군 사이의 값을 Mann Whitney test를 이용하여 비교하였다(*, p < 0.05; NS, no significant difference, 각 군당 생쥐는 9두(PI), 12~14두(대조군))
그 결과, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 당부하 전과 30분 후의 혈당과 인슐린 농도로 계산한 인슐린 분비지수는, 공복 인슐린 분비는 유의한 차이가 없었으나 당부하로 자극된 인슐린 분비는 PI 투여 후 유의하게 증가됨을 알 수 있었다.
실시예 7: 인간 췌도세포에 대한 PERK Inhibitor(PI) 처리
7-1: 세포질 칼슘 변화 분석
생쥐 췌도세포를 대상으로 한 상기 실시예 2의 결과에 기초하여, 인간 췌도세포에 GSK2606414를 50 nM 또는 100 nM의 농도범위를 선정하여 24~36시간 처리한 후, 세포질 Ca2 + 양을 측정하였다. 이때 실험은 6명의 환자 유래 샘플을 대상으로 하였으며, 대조군과 실험군의 R/R0을 paired t-test로 분석(p< 0.05)하여 통계처리하였다.
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 대조군(vehicle)에 비하여 50 또는 100 nM의 GSK2606414에 노출된 경우 모두, 고농도의 포도당(17.5 mM) 자극시 세포질 칼슘양이 유의하게 증가함을 알 수 있었다.
7-2: 인슐린 변화 분석
생쥐 췌도세포를 대상으로 한 상기 실시예 2의 결과에 기초하여, 인간 췌도세포에 GSK2606414를 50 nM 또는 100 nM의 농도범위를 선정하여 GSK2606414를 24~36시간 처리한 후, 인슐린 분비량을 측정하였다. 이때 실험은 6명의 환자 유래 샘플을 대상으로 하였으며, 대조군과 실험군의 인슐린 양을 Mann Whitney test로 분석(p< 0.05)하여 통계처리하였다.
그 결과, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 저농도의 포도당(1.67 mM, LG)에 비하여 고농도의 포도당(17.5 mM, HG) 자극시 인슐린 분비가 유의하게 증가하였으며, 또한 대조군(vehicle)에 비하여 50 또는 100 nM의 GSK2606414에 노출된 경우 모두, 고농도의 포도당(HG) 자극에 의한 인슐린 분비량이 상당히 증가함을 알 수 있었다.
실시예 8: 인간 췌도 생존율(viability) 평가
GSK2606414가 인간 췌도의 생존에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 인간 췌도세포에 50 또는 100 nM의 GSK2606414를 처리하기 전과 후의, 췌도 총부피(Islet Equivalent volume, IEQ)와 췌도 크기(Fragment Index, FI)를 비교측정한 후, 처리 후의 값을 기저값으로 나눈 비율을 그래프로 표시하였다.
8-1. IEQ 측정 방법
구체적으로, IEQ 측정은 분리한 췌도의 일부 분율을 비코팅 dish(35x10mm)에 깔고 40배율로 현미경 관찰하며 각 췌도의 지름을 측정한 후, 지름 150 um의 각 췌도의 부피를 1로 환산하여 합한 후 전체 췌도의 양으로 환산, 분율로 나누어 구하였다. 그 결과, 도 10a에 나타낸 바와 같이, 50 또는 100 nM의 GSK2606414 모두 장시간(24~36시간) 처리하여도 대조군(vehicle)과 비교하여 췌도 수에 유의있는 변화가 없음을 확인하였다.
8-2. FI 측정 방법
실시예 8-1에서 구한 총 IEQ 값을 총 췌도수로 나누어, 췌도의 평균 크기를 나타내는 fragment index를 계산하였다. 그 결과, 도 10b에 나타낸 바와 같이, 50 또는 100 nM의 GSK2606414 모두 장시간(24~36시간) 처리하여도 대조군(vehicle)과 비교하여 췌도 크기에 유의있는 변화가 없음을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (8)

  1. PERK(Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3) 저해제를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물로서, 상기 PERK 저해제는 40∼100 nM의 저농도로 함유되어 있는 것을 특징으로 하는, 당뇨병 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 PERK 저해제는 하기 화학식 1의 1-[5-(4-아미노-7-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)인돌-1-일]-2-(3-트리플루오로메틸페닐)에타논인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016000628-appb-I000003
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 PERK 저해제는 하기 화학식 2의 1-(5-(4-아미노-7-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-4-플루오로인돌린-1-일)-2-(6-메틸피리딘-2-일)에타논인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2016000628-appb-I000004
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 PERK 저해제는 췌도세포에서 세포질 칼슘양 및 인슐린 분비량을 증가시킴으로써 혈중 인슐린 농도를 높이는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 40∼100 nM 저농도의 PERK(Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3) 저해제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 PERK 저해제는 하기 화학식 1의 1-[5-(4-아미노-7-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)인돌-1-일]-2-(3-트리플루오로메틸페닐)에타논인 것을 특징으로 하는, 당뇨병 예방 또는 치료 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2016000628-appb-I000005
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 PERK 저해제는 하기 화학식 2의 1-(5-(4-아미노-7-메틸-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-4-플루오로인돌린-1-일)-2-(6-메틸피리딘-2-일)에타논인 것을 특징으로 하는, 당뇨병 예방 또는 치료 방법.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2016000628-appb-I000006
  8. 40∼100 nM 저농도의 PERK(Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 3) 저해제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 당뇨병 예방 또는 치료 용도.
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