WO2016120824A1 - Una composición farmacéutica soluble en agua que comprende, al menos, una sustancia terapéuticamente activa y, al menos, una sustancia con capacidad para formar micelas - Google Patents

Una composición farmacéutica soluble en agua que comprende, al menos, una sustancia terapéuticamente activa y, al menos, una sustancia con capacidad para formar micelas Download PDF

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micelles
water
teicoplanin
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PCT/IB2016/050437
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Dante Miguel Beltramo
Roxana Valeria ALASINO
Néstor GARCIA
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Consejo Nacional De Investigaciones Científicas Y Técnicas (Conicet)
Centro De Excelencia En Productos Y Procesos Córdoba
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Definitions

  • the present invention relates to a water-soluble pharmaceutical composition
  • a water-soluble pharmaceutical composition comprising at least one therapeutically active substance and at least one substance capable of forming micelles, wherein said therapeutically active substance is selected from drugs with hydrophobic characteristics for the treatment of cancer patients and wherein said substance capable of forming micelles is selected from the compounds Teicoplanin, Dalbavancin and Oritavancin.
  • the present invention relates to a water-soluble pharmaceutical composition
  • a water-soluble pharmaceutical composition comprising, as therapeutically active substances, one or more hydrophobic drugs used in the treatment of cancer patients and in addition, one or more compounds with a structure of the lipoglycolipopeptide, which possess bactericidal properties. and have the ability to self assemble to form micelles, which allow solubilizing and transporting said hydrophobic drugs.
  • this invention relates to an injectable and sterile composition, made of micelles from antibiotics known as lipoglycopeptides, which interact spontaneously non-covalently with albumin and allow the solubilization, transport and release of hydrophobic molecules used for treatment. of tumors BACKGROUND OF THE INVENTION
  • a pharmaceutical formulation containing ideally strong hydrophobic active ingredients would be one that allows a high solubility of the drug in an aqueous medium, that is stable as a complex without dissolution, that remains for as long as possible circulating in blood, increasing the possibility of reaching the tumor cells and that, at the same time and if possible, only concentrate on the specific site of action.
  • active substances that have a hydrophobic nature and that have a very low or limited water solubility
  • active substances that have a hydrophobic nature and that have a very low or limited water solubility
  • those used in oncological treatments such as Paclitaxel and Docetaxel
  • antifungal drugs Amphotericin B.
  • Paclitaxel is a molecule that interacts and promotes the polymerization of tubulin to form highly stable microtubules (MT). These MT stabilization results produce the inhibition of the normal dynamics of the reorganization of the microtubule network. This does not happen with other antimicrotubular agents such as, for example, colchicine, vincristine or vinblastine, which cause disassembly of the MT network.
  • Ptx has a very low water solubility (about 1 . That is why several pharmaceutical companies and authors have proposed different approaches to the development of Ptx formulations for intravenous infusion. Thus, it has been shown that certain organic solvents are capable of partially dissolving Ptx. However, when a solvent miscible with the water containing Ptx is diluted in an aqueous medium and in which the latter is at a concentration close to that of its saturation point, the drug begins to precipitate.
  • the injectable form of Ptx is currently marketed internationally by Bristol-Myers Squibb Co. (New York, N.Y.) in a single dose of 30 mg (5 ml).
  • each milliliter of the formulation contains approximately 6 mg of Ptx, 527 mg of Cremofor EL, and 49.7% (vol / vol) of dehydrated alcohol.
  • this concentrated formulation can be diluted with physiological solution, 5% dextrose in water, 5% dextrose in physiological or Ringer solution with 5% dextrose in water (Goldspiel, 1994, "Pharmaceuticallssues: Preparation, Administration, Stability, and CompatibilitywithOtherMedications” Ann. Pharmacotherapy, vol. 28, pp. S23-26. Harvey Whitney Books Company).
  • the maximum tolerated dose of Ptx is limited by its toxicity. In humans, the greatest toxic effects of Ptx are observed at concentrations ranging from around 100 to about 250 mg / m 2 .
  • concentrations ranging from around 100 to about 250 mg / m 2 .
  • granulocytopenia is mentioned in the literature (Holmes FA et al., "Phase II trial of taxol, an active drug in the treatment of metastaticbreastcancer", J NatlCancer inst. 1991, 83: 1797-1805 ) and symptomatic peripheral neuropathy, the latter being the main non-hematological toxicity (Rowinsky EK et al., 1995, ReviewArticle. Drug Therapy - Paclitaxel (Taxol) N. Engl. J. Med. Vol 332: 1004-1014 N.15 ).
  • Ptx was prepared in a formulation, both in the lyophilized solid state, and in the liquid state, for parenteral application.
  • US 6,743,826 describes a method for obtaining soluble Ptx through interaction with human albumin or recombinant human albumin.
  • US patent application 2005282734 Al a lyophilized formulation or a water soluble composition is described, which contains Ptx or Docetaxel, bound to human albumin, where the concentration of Ptx is greater than 500 ug / ml. But nevertheless, in said application it is not explicitly disclosed what the solubility of Ptx in the formulation would be.
  • the albumin molecule plays a central role in the transport of hydrophobic molecules such as Ptx. Its direction in different tissues is related to the ability of albumin to interact with cell receptors and cell accumulation (Gradishar wj, 2006, "Albumin-boundpaclitaxel: A next-generationtaxane,.
  • the albumin-Ptx complex is reversible, a condition that allows it to be transported in the body and released on the cell surface.About binding to the receptor, albumin initiates the so-called transcytosis of the albumin-Ptx complex through the wall of the endothelial cells of the blood vessels, facilitating the passage of the Albumin-Ptx complex (called ABI-007) to the interstitial complex and, therefore, allowing its direct exposure to the tumor surface (ibrahim NK et al., 2002 , "Phase I and pharmacokineticstudy of ABI-007, a Cremophor-free, protein-stabilized, nanoparticleformulation of paclitaxel", ClinCancer Res-; 8: 1038-1044; Gradishar WJ, 2006, "Albumin -boundpaclitaxel: A next-generationtaxane ", ExpertOpinPharmacother, 7: 1041-1053; Drummond D.C.
  • Albumin accumulates in tumors, possibly and in part, as a result of the secretion of the so-called albumin binding protein, (SPARC, secretedprotein, acidic and rich in cysteine, also called BM-40) , which may result in the intratumoral accumulation of Ptx bound to albumin (Fukunaga-Kalabis M. and Herlyn M., 2007,
  • encapsulated antitumor or antifungal drugs are not fully understood although, it is believed, they could result either from the ability of liposomes to slowly release an encapsulated drug into the bloodstream, or from the interaction of the Liposome with the surface of the tumor, to slowly release the drug directly at the site of the tumor.
  • a serious problem with drugs encapsulated in liposomes is that these drugs have been found to be rapidly released from liposomes after encapsulation.
  • strongly lipophilic (water insoluble) drugs that partition into the lipid bilayer of a liposome seem, in some cases, to markedly modify the physical properties of the membranes, to such an extent that the membrane itself becomes unstable and can no longer retain the drug, freeing it in the middle. Based on these observations, what should be achieved is that, in an encapsulating system of drugs such as liposomes, the liposome can be protected by stabilizing it in order to prevent these unwanted interactions between liposome-drugs.
  • a very important property that should be achieved in these formulations is an increase in plasma circulation time.
  • Biodistribution studies are carried out on specifically selected organs or tissues, analyzing the lipid content of the liposomes used or the drugs under study, in samples obtained from tissue homogenization.
  • the addition to the liposomes of lipid molecules with sugars or Lipids containing amino groups (or carboxyls, in the case of monosialogangliosides) such as the GM1 monosialoganglioside significantly reduce the accumulation of liposome lipids in the liver and spleen.
  • a formulation combines an internal pH of the liposome of 2 and the presence of GM1 in the bilayer of the liposome.
  • a micelle is a colloidal association that has regions that have a strong anisotropy and a water solubility gradient that decreases from the outside to the inside. That is why micelles are capable of solubilizing a wide range of solutes.
  • Micelles can solubilize insoluble organic matter due to their ability to incorporate such matter into their highly hydrophobic region.
  • the three or four carbon atoms are all trans and, therefore, is a less fluid domain. Therefore, this region, being weakly hydrophobic, could be partially hydrated. In this way, a transition area between the purely hydrophobic and purely hydrophilic zones is achieved.
  • the molecules that enter this zone must be slightly compatible, both with the hydrophobic zone of the lipid chain and with the solvated region of the polar head and, therefore, must behave as unfriendly molecules.
  • active ingredients with hydrophobic characteristics they tend to be fixed directly in the deep region of the micelle through interaction with the hydrophobic chains of fatty acids.
  • the polar head of the micelles there is the possibility of achieving a wide range of compositions. This implies the possibility of obtaining micelles with surfaces that have different characteristics, which could be used to associate different active substances.
  • the polar head region can be attached to a large number of conjugated ions. Therefore, it is similar to a concentrated electrolytic solution.
  • the diffuse ionic bilayer found in charged micelles extends over the so-called Stern layer.
  • Micelles can dissolve active agents, so they are an excellent system to capture and incorporate insoluble or partially insoluble molecules.
  • the use of micelles in systems of these characteristics could be limited to relatively small molecules that can accommodate the highly anisotropic structure of fatty acid chains. This could be due to the fact of occupying the intermediate region or because they can accommodate within the fatty acid chains.
  • Emulsions and, above all, micelle suspensions are not necessarily stable and may not reach sites of interest.
  • emulsions and micelles loaded with active agents have greater motility than liposomes. In general, micelles are considered stable only when they are in equilibrium with the surfactant monomer of which they are composed.
  • the micelles in the absence of equilibrium monomer, the micelles can be disassembled into the water soluble monomer to finally be completely diluted. Similarly, in the absence of an equilibrium monomer, the droplets of a microemulsion can coalesce to form larger droplets, which are eventually lost. Therefore, when a preparation of micelles is diluted, for example due to intravenous administration, they can dissolve and disperse in the medium, leaking their contents into the bloodstream in a matter of seconds. Similarly, emulsion preparations show the same instability principle.
  • GM1 monosialoganglioside micelles are capable of solubilizing or stably associating hydrophobic drugs, such as Paclitaxel or Amphotericin B.
  • GM1 decreases 32% after 72 hours of dialysis, while the GMl-Ptx complex decreases only 3%.
  • lipopeptide micelles as agents for transporting drugs is described in European patent application EP2264047 (Al) "High puritylipopeptides, lipopeptidemicells and processesforpreparingsame".
  • This document essentially describes the purification and characterization of the physicochemical properties of lipopeptides, their ability to form micelles, as well as a complete characterization of their properties as antibiotics.
  • Daptomycin Dapto
  • this publication mentions the potential use of antibiotic lipopeptides as transporters of hydrophobic drugs.
  • This document does not describe the use of lipoglicopeptide micelles for the specific incorporation of drugs with hydrophobic characteristics for the treatment of cancer patients.
  • the present invention relates to a water-soluble pharmaceutical composition
  • a water-soluble pharmaceutical composition comprising at least one therapeutically active substance and at least one substance capable of forming micelles, wherein said therapeutically active substance is selected from drugs with hydrophobic characteristics for the treatment of cancer patients and where said substance with Ability to form micelles is selected from the compounds Teicoplanin, Dalbavancin and Oritavancin.
  • Figure 1 Sephadex G200 chromatographic profile of the Teicoplanin-Paclitaxel -o- complex, and of the Teicoplanin-Paclitaxel-Albumin- n- complex .
  • Figure 2 Graph of Teicoplanin particle size determination by dynamic light scattering technique. The particle size data in nanometers appears in the lower right margin.
  • Figure 3 Graph of the particle size determination of the Teicoplanin-Paclitaxel complex by the dynamic light scattering technique. The particle size data in nanometers appears in the lower right margin.
  • Figure 4 Graph of the particle size determination of the Teicoplanin-Paclitaxel-Albumin complex by the dynamic light scattering technique. The particle size data in nanometers appears in the lower right margin.
  • FIG. 7 Electron photomicrograph at 250,000 x by the Teicoplanin-Paclitaxel-Alumina complex particles. The green numbers represent the size of the micelles.
  • micelles can be coated with polymers or proteins that allow: i) stabilize micelle complexes with drugs and / or ii) serve as agents for micelles to access the desired tissue.
  • the present invention relates to a water soluble pharmaceutical composition, comprising at least one therapeutically active substance and at least one substance capable of forming micelles, wherein said therapeutically active substance is selected from drugs with hydrophobic characteristics for the treatment of cancer patients and where the substance capable of forming micelles is selected from the compounds Teicoplanin, Dalbavancin and Oritavancin.
  • the composition of the invention comprises drugs with hydrophobic characteristics, useful in the treatment of cancer patients, which are selected among the antitumor drugs.
  • the composition of the invention comprises at least one drug selected from Paclitaxel and Docetaxel.
  • compositions of the present invention could incorporate hydrophobic antifungal drugs such as Amphotericin B.
  • a water soluble pharmaceutical composition which comprises at least one antitumor drug with hydrophobic characteristics and at least one substance capable of forming micelles selected from the Teicoplanin, Dalbavancin and Oritavancin compounds, wherein said compounds they are forming micelles and wherein said at least one antitumor drug with hydrophobic characteristics is attached to the micelles in a non-covalent manner.
  • the above-mentioned composition comprises at least one drug selected between Paclitaxel and Docetaxel.
  • Another particular object of the invention is a water-soluble pharmaceutical composition
  • a water-soluble pharmaceutical composition comprising an anti-tumor drug with hydrophobic characteristics and a substance capable of forming micelles, wherein said anti-tumor drug is Paclitaxel and wherein said substance capable of forming micelles is Teicoplanin.
  • the composition of the invention comprises Paclitaxel and Teicoplanin in a molar ratio of between about 1: 5 and 1: 100.
  • the water soluble pharmaceutical composition of the invention comprises between about 1 mg / ml and about 10 mg / ml of Paclitaxel and between about 10 mg / ml and about 200 mg / ml of Teicoplanin.
  • Another particular object of the invention is a water soluble pharmaceutical composition
  • a water soluble pharmaceutical composition comprising a drug. antitumor with hydrophobic characteristics and a substance capable of forming micelles, wherein said antitumor drug is Docetaxel and wherein said substance capable of forming micelles is Teicoplanin.
  • the composition of the invention comprises Docetaxel and Teicoplanin in a molar ratio of between about 1: 5 and 1: 100.
  • the water soluble pharmaceutical composition of the invention between about 1 mg / ml and about 10 mg / ml of Docetaxel and between about 10 mg / ml and about 200 mg / ml of Teicoplanin.
  • the soluble pharmaceutical composition is a sterile injectable composition.
  • the water soluble pharmaceutical composition of the invention is a lyophilized composition.
  • the composition is in the form of lyophilisate and can be reconstituted with a solvent selected from a solution of distilled water, a saline solution (0.9% NaCl), a phosphate buffered saline solution (PBS) , distilled water containing 5% dextrose, a saline solution with 5% dextrose and a 20% human albumin solution, so as to obtain a sterile translucent composition.
  • a solvent selected from a solution of distilled water, a saline solution (0.9% NaCl), a phosphate buffered saline solution (PBS) , distilled water containing 5% dextrose, a saline solution with 5% dextrose and a 20% human albumin solution, so as to obtain a sterile translucent composition.
  • the term "micelle” is understood as a colloidal association having regions with a strong anisotropy and a gradient of decreasing water solubility, which goes from the outside to the inside of it.
  • the micelles of Teicoplanin, Dalbavancin and Oritavancin are capable of spontaneously incorporating therapeutically active substances with hydrophobic characteristics, useful in the treatment of cancer patients. In particular they are able to spontaneously incorporate Paclitaxel and Docetaxel.
  • composition according to the invention that comprises Teicoplanin as a micelle-forming agent is that of presenting as long as possible plasma circulation.
  • liposomes are structures quickly removed from the blood (15 to 30 minutes) due to their interaction with the cells of the endothelial reticulum system (RES). That is why such structures must be modified, for example, by the addition of lipids with sugars or with polymers such as, for example, polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • a composition according to the invention containing Teicoplanin may have a much longer plasma circulation time, it being possible to reach a half-life between about 70 and 100 hours.
  • composition according to the invention comprising Teicoplanin as a micelle forming agent can be spontaneously coated with Albumin (Alb) ⁇ Bonati, M., GL Tra ⁇ na, R. Rosina and G. Buniva (1988) J. Antimicmb. Chemother
  • albumin in addition to preventing the removal of nanostructures by the reticuloendothelial system (RES), is capable of interacting with cellular receptors and starting the mechanism of transcytosis through capillary endothelial cells . Through this mechanism, it would be possible to pass this albumin molecule and the associated molecules and deposit them near the surface of the tumor.
  • RES reticuloendothelial system
  • Teicoplanin micelles incorporating Paclitaxel (Ptx) or Docetaxel (Dtx), to form the Teicoplanin-Paclitaxel (Teico-Ptx) or Teicoplanin-Docetaxel (Teico-Dtx) complex have the ability of joining albumin. In this way, it is possible to generate an Alb-Teico-Ptx or Alb-Teico-Dtx ternary complex, which can be used to reach the tumor cells.
  • the size of the nanostructure of the micelles of the compositions according to the present invention is also an important factor, since the molecules or complexes that have a molecular weight (MW) of less than 40 kDa are quickly filtered by the kidney.
  • the nanostructure of the Teico-Ptx complex has a PM of the order of 50 to 60 kDa and the Teico-Ptx-Alb ternary complex has a PM of about 250 to 300 kDa.
  • GR red blood cells
  • Teicoplanin nor the Teico-Ptx complex interacts with red blood cells (GR), although they can quickly reach and interact with different tissues, such as skin, ascites and synovial fluids, pericardium, pleura, bones, kidney, trachea, adrenal glands, fatty tissue, cerebrospinal fluid and also with lymphocytes.
  • Teicoplanin micelles have a higher Ptx loading capacity than those that allow other formulations based on micelles, reaching up to about 10 mg / ml.
  • the formulations currently available in the market only reach concentrations between 5 and 6 mg / ml of Paclitaxel.
  • the compositions of the invention may be adapted to be administered intravenously (IV) to a patient.
  • the compositions of the invention can be liquid formulations or lyophilized formulations that can be reconstituted with a sterile solution, to obtain an injectable, sterile and translucent formulation.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention are specifically described for Teicoplanin, Dalbavancin and Oritavancin micelles, the person skilled in the art will know that, using the teachings of the present invention, other lipoglicopeptide-type compounds and, in particular, Other antibiotics of lipoglicopeptide type could be used.
  • other antibiotics may lipoglycopeptide type which have a critical micelle concentration (CMC) of about 80XL (T 6M used
  • the PM of the Teicoplanin micelles with Paclitaxel ranges between 50 and 70 kDa and the Alb-Teico-Ptx complex ranges between about 250 and 300 kDa.
  • Teicoplanin micelles loaded with Ptx or Dtx have a greater stability than that of unloaded Teicoplanin micelles, which would demonstrate that a hydrophobic molecule, such as Ptx or Dtx , could itself regulate the mechanisms of dissociation of the micelle, thus favoring the stabilization of the micellar form.
  • a loss of approximately 25% of the Teicoplanin molecules was observed after 48 hours of dialysis, while for the Teico-Ptx complex a loss of between 5 and 8% was observed.
  • the Teico-Ptx and Teico-Dtx complexes can interact spontaneously and not covalently, through a Hydrophobic interaction with the albumin molecule, generating a new structure as a ternary complex, highly stabilized. Due to the presence of the albumin molecule, such complexes could trigger a mechanism of transcytosis through the endothelial cells into the interstitial medium. Subsequently, in a manner similar to that demonstrated for the albumin-Ptx complex (ABI007), the complexes could bind to the receptor or SPARC proteins located in the area where the tumor tissue is located.
  • compositions which turn out to be a particular object of the present invention, which comprise a vehicle composed of molecules of one or more antibiotics of the lipoglycopeptide type that form micelles, selected from Teicoplanin, Dalbavancina and Oritavancina, which allow the non-covalent incorporation of oncological drugs with hydrophobic properties and which, in addition, can be spontaneously coated with a serum protein such as albumin.
  • the albumin may be selected from human albumin, recombinant human albumin, bovine albumin and human albumin containing fatty acids.
  • the micelles according to the invention are coated with human serum albumin, with or without fatty acids, in an antibiotic: albumin ratio of 1: 2 or 1: 4 (w / w).
  • the present invention relates to a water soluble pharmaceutical composition in which the antibiotic micelles are coated with albumin containing folic acid coupled. covalently; Even more particularly, the amount of folic acid covalently bound to albumin ranges from to 20% of total albumin.
  • the lipoglycopeptide-antitumor drug antibiotic complex can be vehiculized to humans by prior injection into transfusion bags containing human albumin, human serum or whole human plasma.
  • the Teico-Ptx and Teico-Dtx complexes would specifically bind albumin to generate the biologically active ternary complexes Teico-Ptx-Alb and Teico-Dtx-Alb once the composition of the invention was injected into bags of transfusion containing human albumin, human serum or plasma.
  • the inventors of the present have found that, due to the interaction with Teicoplanin micelles, it is possible to obtain an increase in the solubility of a hydrophobic bioactive agent in an aqueous medium, such as Ptx or elDtx, from less than 1 g / ml up to 10 mg / ml (about 10,000 times).
  • the pharmaceutical composition of this invention is adapted for intravenous administration (iv). Even more preferably, it is a stable and translucent intravenous composition.
  • the water soluble pharmaceutical composition of this invention can be lyophilized or is in a lyophilized form. In the latter case, the composition can be reconstituted with a solvent such as distilled water, saline (0.9% NaCl), phosphate buffered saline (PBS), distilled water containing 5% dextrose and saline with dextrose at 5% .
  • the pharmaceutical composition comprises a substance capable of forming micelles selected from Teicoplanin, Dalbavancin and Oritavancin.
  • the substance capable of forming micelles is Teicoplanin.
  • dalbavancin, oritavancin and telavancin are semisynthetic derivatives of teicoplanin, chloroeremomycin and vancomycin, in respective order. Below is a brief description of each of these three substances.
  • Teicoplanin is a glycopeptide chemically related to vancomycin, which has a wide range of activity against Gram-positive bacteria.
  • Teicoplanin is a complex glycopeptide because it is composed of a linear heptapeptide that contains three molecules of p-OH-phenyl-glycine, 2 molecules of di-OH-phenyl-glycine and 2 of tyrosine, linked through an interaction glycosidic with a tricky and 2 acetylglucosamine molecules, with a PM of about 1,564 kDa. When this molecule interacts with fatty acids via glucosamine, it is transformed into a lipo-glycopeptide.
  • R 4-Decenoic acid with a PM of 1877.67
  • Dalbavancina CAS Registry [171500-79-1] is the generic name given to the compound that responds to the following structural formula:
  • OritavancinaCAS Registry [171099-57-3] is the generic name given to the compound that responds to the following structural formula:
  • the pH of the Teicoplanin micelles ranges from 6 to 8. In an even more preferred embodiment, the pH of the micelles ranges from 6 to 7.5.
  • the water soluble pharmaceutical compositions of the present invention have, on average, a size smaller than 200 nm; even more particularly, less than 100 nm, preferably, between 5 nm and 80 nm and, even more preferably, between 5 nm and 25 nm.
  • the formulations of the present invention can be prepared by means of a passive loading method.
  • bioactive agents can be encapsulated in antibiotic micelles at higher concentrations than the current ones, using a simple method such as incubation at room temperature or cold, during which incorporation is carried out spontaneously.
  • the coating of the antibiotic-Ptx or antibiotic-Dtx with human albumin micelle occurs spontaneously and not covalently, through a hydrophobic interaction. This coating finally generates a ternary complex composed of antibiotic-Ptx-Alb or antibiotic-Dtx-Alb.
  • Teicoplanin can be summarized as follows:
  • Teicoplanin Lyophilized Teicoplanin is diluted in distilled water by gentle and slow stirring at a temperature of 4 C for at least 12 hours. Next, Teicoplanin micelles are incubated with one tenth of their volume (1/10 vol / vol) with solvents such as ethanol or dimethyl sulfoxide, which contain hydrophobic antitumor drugs.
  • the transparent aqueous formulation of micelles containing the encapsulated antitumor or antifungal drugs is then incubated with purified human albumin, human plasma or human serum, in order to ensure an interaction of the albumin with the charged micelles. This incubation can be carried out at room temperature for at least 2 hours.
  • the formulations composed of Teico-Ptx or Teico-PTX-albumin are finally again lyophilized.
  • the present invention also relates to a process for obtaining micelles containing at least one encapsulated hydrophobic bioactive agent. Said procedure comprises the following steps:
  • the lyophilisate obtained by the above-mentioned procedure can be suspended in a pharmaceutically acceptable solution.
  • the amount of the different bioactive agents incorporated in the Teicoplanin micelles can be determined by the use of spectroscopic techniques or appropriate chromatographic techniques, such as high pressure liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • the micelles according to the present invention can be loaded with the anti-tumor agent, for example, Dtx or Ptx previously solubilized in organic solvents such as ethanol or dimethylsulfoxide.
  • the amount of ethanol or dimethylsulfoxide used for the incorporation of Docetaxel and Paclitaxelen Teicoplanin micelles vary from 5 to 15% of the total volume.
  • the solvents used to load the micelles with the therapeutically active substances can be removed by a method adapted to this purpose. For example, they can be removed by dialysis or by molecular filtration using Sephadex G25.
  • compositions of the invention could incorporate drugs other than Ptx and Dtx into the composition of the invention.
  • other drugs could be incorporated into the compositions of the invention would be those that are defined by an octanol / water partition coefficient greater than 1, preferably greater than 5.
  • Representative drugs in this category include prostaglandins, testosterone, estradiol, vitamin e, cortisone, and dexamethasone.
  • the compositions of the present invention could incorporate hydrophobic antifungal drugs such as, for example, Amphotericin B.
  • mice formed by antibiotics such as lipo-glycopeptide Teicoplanin and other antibiotics such as cyclic lipopeptide Daptomycin, show different capacity to incorporate Ptx or Dtx inside, with Teicoplanin presenting twice the loading capacity of Daptomycin.
  • the results obtained by the authors of this invention clearly show that the structures formed by each micelle are clearly different and this translates into a change in the ability to solubilize Ptx or Dtx.
  • An electron microscopy study shows that the Teicoplanin micelles of this invention are spherical.
  • the results reveal that the formation of the Teico-Ptx complex does not produce a substantial change in the size of the micelle. See, for example, figures 2, 3 and 4.
  • Teicoplanin micelles have a half-life in blood that ranges between 70 and 100 hours, which is much higher than Daptomycin micelles, which have a half-life between 7 and 10 hours.
  • the Teicoplanin micelles are stable 48 hours at 25 ° C and 35 days at 4 ° C.
  • the maximum suggested doses of Daptomycin to avoid unwanted side effects or cytotoxicity are in the order of 10 to 12 mg / kg / day.
  • the maximum suggested dose is 20 mg / Kg / day, which speaks of the possibility of applying a greater amount of Teicoplanin to transport higher doses of drugs.
  • the solutions were incubated at 25 ° C for at least 4 hours and then centrifuged at 15,000 xg for 10 minutes in order to eliminate the insoluble Ptx potential that had not been encapsulated in the teicoplanin micelles. Finally, and in order to remove the remaining DMSO, the samples were dialyzed with a 20mM phosphate buffer solution at pH 6 for 12 hours. The quantification of the Ptx incorporated in the teicoplanin micelles was carried out by the use of HPLC.
  • Ptx is loaded into teicoplanin micelles at a concentration of 5 mg / ml as described in Example 1, but for 30 minutes at a temperature of 4 ° C, 25 ° C and 37 ° C. After incubation, the samples were centrifuged at 15,000 xg for 10 minutes and dialyzed against distilled water, for 12 hours, at 4 ° C. Finally, the amount of Ptx incorporated into the teicoplanin micelle in soluble form was quantified by HPLC. The results show that the change in temperature at which the Ptx is charged does not produce a significant increase in incorporation. The load in all conditions was greater than 90%.
  • Teico-Ptx micelles containing 200 mg / ml of Teico and 5 mg of Ptx were prepared as described in the previous examples. A portion of these micelles were incubated with a volume of human serum albumin 200 mg / ml. (Laboratory of Blood Products dependent on the National University of Córdoba) at 37 ° C for 3 hours. Finally, Sephadex G200 was chromatographed to determine the elution profile of each preparation. See Figure 1
  • 200 ul of a solution of Teico micelles (200 mg / ml) loaded with 5 mg / ml of Ptx were incubated in the presence of 200 ul of 200 mg / ml of albumin, for 4 hours, to generate the ternary complex Teico-Ptx- Alb.
  • each preparation was subjected to chromatography on Sephadex G200.
  • the sown volume was 250 ul.
  • the Vo of the column is 5 ml determined using dextran blue.
  • Teico-PTX micelles elute with an apparent 50 kDa hydrodynamic radius (black circles). However, when the complex was incubated with albumin to form the Teico-PTX-Alb ternary complexes, they present Absorbance at 280 nm for the detection of Albumin (red circles). This result shows that the binding of albumin to the Teico-Ptx micelles produces a change in the PM of 50 kDa, towards a PM of about 200 kDa.
  • Tumoral cells HEP-2 were incubated in MEM containing fetal bovine serum 2% (Natocor-Villa Carlos Paz - Cordoba - Argentina) in a CO 2 incubator 5% CO 2 to confluence. Different concentrations of the compositions mentioned below were added to the cell culture:
  • Ptx control in DMSO at concentrations of 5, 10, 20 and 50 nM.
  • Teico-Ptx Micelles The Ptx present in Teico micelles is in the same concentrations as those of the Ptx control.

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Abstract

Una composición farmacéutica soluble en agua que comprende, al menos, una sustancia terapéuticamente activa y, al menos, una sustancia con capacidad para formar micelas, en donde dicha sustancia terapéuticamente activa se selecciona entre las drogas con características hidrófobas para el tratamiento de pacientes oncológicos y en donde dicha al menos una sustancia con capacidad para formar micelas se selecciona entre los antibióticos del tipo de los lipoglicopéptidos, tales como la Teicoplanina, Dalbavancina y Oritavancina.

Description

UNA COMPOSICION FARMACEUTICA SOLUBLE EN AGUA QUE COMPRENDE, AL MENOS, UNA SUSTANCIA TERAPÉUTICAMENTE ACTIVA Y, AL MENOS, UNA SUSTANCIA
CON CAPACIDAD PARA FORMAR MICELAS
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica soluble en agua que comprende, al menos, una sustancia terapéuticamente activa y, al menos, una sustancia con capacidad para formar micelas, en donde dicha sustancia terapéuticamente activa se selecciona entre las drogas con características hidrófobas para el tratamiento de pacientes oncológicos y en donde dicha sustancia con capacidad para formar micelas se selecciona entre los compuestos Teicoplanina, Dalbavancina y Oritavancina .
Así, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica soluble en agua que comprende, como sustancias terapéuticamente activas, uno o más fármacos hidrófobos utilizados en el tratamiento de pacientes oncológicos y además, uno o más compuestos con estructura delipoglicolipopéptido, los cuales poseen propiedades bactericidas y presentan la capacidad de autoensamblarse para formar micelas, los cuales permiten solubilizar y transportar dichos fármacos hidrófobos. En particular, esta invención se refiere a una composición inyectable y estéril, hecha de micelas a partir de antibióticos conocidos como lipoglicopéptidos, los cuales interaccionan espontáneamente de forma no covalente con albúmina y permiten la solubilización, transporte y liberación de moléculas hidrofóbicas utilizadas para el tratamiento de tumores. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La eficacia de muchas drogas, especialmente las de características hidrofóbicas, se encuentra limitada, principalmente, por su incapacidad para alcanzar el sitio correcto de acción terapéutica. En muchos casos, y aun cuando la droga es soluble en agua, sólo una pequeña fracción de la dosis administrada alcanza su sitio terapéutico, mientras que la mayor parte de la droga se distribuye a través de todo el organismo. Así, la distribución en órganos y tejidos sanos frecuentemente limita la dosis. Por lo tanto, una formulación farmacéutica que contenga principios activos fuertemente hidrofóbicos ideal, sería aquella que permita una gran solubilidad de la droga en medio acuoso, que sea estable como complejo sin disolución, que permanezca por el mayor tiempo posible circulando en sangre, incrementando la posibilidad de alcanzar las células tumorales y que, al mismo tiempo y de ser posible, sólo se concentre en el sitio de acción específico .
Entre los principios activos que presentan naturaleza hidrofóbica y que poseen una solubilidad en agua muy baja o limitada pueden mencionarse, por ejemplo, aquellos utilizados en tratamientos oncológicos (tales como el Paclitaxel y el Docetaxel) y dentro de los antimicóticos la Anfotericina B.
El Paclitaxel (Ptx) es una molécula que interactúa y promueve la polimerización de la tubulina para formar microtúbulos altamente estables (MT) . Estos resultados de estabilización de MT producen la inhibición de la dinámica normal de la reorganización de la red de microtúbulos. Esto no ocurre con otros agentes antimicrotubulares tales como, por ejemplo, la colchicina, la vincristina o la vinblastina, los cuales producen el desemsamblamiento de la red de MT .
Una de las principales dificultades encontradas en el desarrollo de medicamentos que contienen Ptx ha sido su gran insolubilidad en agua. Las formulaciones de fármacos con baja solubilidad en agua tradicionalmente se han elaborado en forma de emulsiones o mediante la asociación de los activos con coloides, tales como micelas. Los coloides pueden disolver al activo y, por lo tanto, pueden aumentarla concentración del mismo en medio acuoso.
En particular, el Ptx posee una muy baja solubilidad en agua (alrededor de 1
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. Es por ello que varias empresas farmacéuticas y autores han propuesto diferentes enfoques para el desarrollo de formulaciones de Ptx para infusión intravenosa. Asi, se ha demostrado que ciertos disolventes orgánicos son capaces de disolver parcialmente el Ptx. No obstante, cuando se diluye en un medio acuoso un solvente miscible con el agua que contiene Ptx y en el cual este último se encuentra en una concentración cercana a la de su punto de saturación, la droga comienza a precipitar.
La forma inyectable de Ptx, es actualmente comercializada internacionalmente por Bristol-Myers Squibb Co . (New York, N.Y.) en una sola dosis de 30 mg (5 mi) .
Cada mililitro de la formulación contiene aproximadamente 6 mg de Ptx, 527 mg de Cremofor EL, y 49,7 % (vol/vol) de alcohol deshidratado. Para su administración, esta formulación concentrada puede ser diluida con solución fisiológica, 5% dextrosa en agua, 5% dextrosa en fisiológica o bien solución Ringer con 5% dextrosa en agua (Goldspiel, 1994, "Pharmaceuticallssues : Preparation, Administration, Stability, and CompatibilitywithOtherMedications " Ann . Pharmacotherapy, vol . 28, pp. S23-26. Harvey Whitney Books Company) . No obstante, es de destacar que la formulación de Ptx en Cremofor/etanol al ser diluida en medio acuoso, comienza a inestabilizarse, observándose con el tiempo la aparición de precipitados fibrosos. Las formulaciones de Ptx en Cremofor se encuentran reveladas en la patente US 5,504,102.
Como ocurre con la mayoría de los agentes quimioterapéuticos , la dosis máxima tolerada de Ptx se encuentra limitada por su toxicidad. En los seres humanos, los mayores efectos tóxicos del Ptx se observan a concentraciones que van desde alrededor de los 100 hasta alrededor de los 250 mg/m2. Por ejemplo, entre los efectos adversos, en la literatura se encuentran mencionados la granulocitopenia (Holmes F. A. y col., "Phase II trial of taxol, an active drug in thetreatment of metastaticbreastcancer" , J NatlCancer inst. 1991, 83:1797-1805) y la neuropatía periférica sintomática, siendo esta última la principal toxicidad no hematológica (Rowinsky E. K. y col., 1995, ReviewArticle . Drug Therapy - Paclitaxel (Taxol) N. Engl . J. Med. Vol 332:1004-1014 N.15) .
Más recientemente, el Ptx fue preparado en una formulación, tanto en estado sólido liofilizado, como en estado líquido, para su aplicación en forma parenteral. En la patente US 6,743,826 se describe un método para obtener Ptx soluble por medio de la interacción con albúmina humana o albúmina humana recombinante . Por otra parte, en la solicitud de patente US 2005282734 Al, se describe una formulación liofilizada o una composición soluble en agua, que contiene Ptx o Docetaxel, unidos a albúmina humana, donde la concentración de Ptx es mayor a los 500 ug/ml . Sin embargo, en dicha solicitud no se revela explícitamente cual sería la solubilidad del Ptx en la formulación.
La molécula de albúmina, juega un rol central en el transportede moléculas hidrofóbicas tales como el Ptx. Su dirección en los distintos tejidos está relacionada a la capacidad de interacción de la albúmina con los receptores celulares y por la acumulación celular (Gradishar w.j., 2006, "Albumin-boundpaclitaxel : A next- generationtaxane, . ExpertOpinPharmacother; 7:1041-1053) . El complejo albúmina-Ptx es reversible, una condición que le permite ser transportada en el organismo y ser liberada en la superficie celular. Por medio de la unión al receptor, la albúmina inicia la denominada transcitosis del complejo albúmina-Ptx a través de la pared de las células endoteliales de los vasos sanguíneos, facilitando el pasaje del complejo Albúmina-Ptx (denominado ABI-007) al complejo intersticial y, por lo tanto, permitiendo su exposición directa a la superficie del tumor (ibrahim N.K. y col., 2002, "Phase I and pharmacokineticstudy of ABI-007, a Cremophor-free, protein-stabilized, nanoparticleformulation of paclitaxel", ClinCancer Res-; 8 : 1038-1044 ; Gradishar W.J., 2006, "Albumin-boundpaclitaxel : A next-generationtaxane", ExpertOpinPharmacother, 7:1041-1053; Drummond D.C. y col., 1999, "Optimizingliposomesfordelivery of chemotherapeuticagents to solidtumors" . Pharmacol Rev.; 51:691-743) .La albúmina se acumula en los tumores, posiblemente y en parte, como resultado de la secreción de la denominada proteína fijadora de albúmina, (SPARC, secretedprotein, acidic and rich in cysteine, también llamada BM-40), lo cual puede resultar en la acumulación intratumoral de Ptx unido a la albúmina (Fukunaga-Kalabis M. y Herlyn M., 2007,
"Unravelingmysteries of themultifunctionalprotein SPARC", J Invest
Dermatol; 127 : 2497-2498) . Por otra parte, recientemente, otras estrategias para obtener Ptx soluble en agua han sido reveladas en la literatura especializada tales como, por ejemplo, mediante su conjugación a polímeros como el poliglutámico (patente US 7,384,977) .
Los mecanismos de acción de las drogas antitumorales o antimicóticas encapsuladas , no se encuentran completamente entendidos aunque, se cree, podrían resultar o bien consecuencia de la capacidad de los liposomas para liberar lentamente en el torrente circulatorio una droga encapsulada, o bien de la interacción del liposoma con la superficie del tumor, para liberar lentamente la droga directamente en el sitio del tumor. Sin embargo, un grave problema que presentan las drogas encapsuladas en liposomas es que se ha encontrado que estas drogas son rápidamente liberadas de los liposomas luego de su encapsulación . Más aún, drogas fuertemente lipofílicas (insolubles en agua) que particionan en la bicapa lipídica de un liposoma parecen, en algunos casos, modificar marcadamente las propiedades físicas de las membranas, en un grado tal que la propia membrana se inestabiliza y ya no puede retener la droga, liberándola al medio. En base a estas observaciones, lo que se debería lograr es que, en un sistema encapsulante de drogas como son los liposomas, se pueda proteger al liposoma estabilizándolo de modo de prevenir estas interacciones indeseadas entre liposoma-droga .
Una propiedad muy importante que se debería lograr en estas formulaciones es un incremento en el tiempo de circulación plasmática. Los estudios de biodistribución se llevan a cabo sobre órganos o tejidos específicamente seleccionados, analizando el contenido de los lípidos de los liposomas utilizados o de las drogas en estudio, en muestras obtenidas de la homogeneización de los tejidos. El agregado a los liposomas de moléculas lipídicas con azúcares o lípidos conteniendo grupos aminos (o carboxilos, en el caso de losmonosialogangliósidos ) tales como el monosialogangliósido GM1, reduce significativamente la acumulación de los lipidos del liposoma en el hígado y el bazo. Por ejemplo, en el caso de la droga vincristina, una formulación combina un pH interno del liposoma de 2 y la presencia de GM1 en la bicapa del liposoma. La administración endovenosa de esta formulación conteniendo 2, 3 ó 4 mg/Kg de droga, a ratones inoculados con células tumorales P388, fue capaz de producir un gran sobrevida en los animales respecto de los controles. Varios laboratorios también han evaluado la posibilidad de incrementar el tiempo de vida medio de circulación de los liposomas diseñando artificios para la superficie de los mismos, que los hagan similares a los glóbulos rojos (GR) .
El rol de los carbohidratos de superficie en el reconocimiento celular es un fenómeno ampliamente estudiado
(Ashwell G. y Morell A.G., 1974, "The role of surfacecarbohydrates in thehepaticrecognition and transport of circulatingglyco-proteins", AdvEnzymol 41:99-128; Hakormori S., 1981, "Glycosphingolipids in celular interaction, differentiation, and oncogenesis" . AnnuRevBiochem . vol . 50:733-764) . Asimismo, la química, el metabolismo y las funciones biológicas de los gangliósidos y del ácido siálico, han sido profundamente estudiadas (Schauer, R., 1982, "Chemistry, metabolism, and biologicalfunctions of sialic acids", Adv . Carbohydrate Chem. Biochem .40 , 131-23; Ledeen R. W. y col., 1998, "Sphinglolipids as signaling modulators in the nervous system", Annals of the New Cork Academy of Science, Vol 845) .Ha sido descrito que la incorporación del gangliósido GM1 en liposomas compuestos de fosfatidil colina (PC) y colesterol incrementa significativamente el tiempo de vida media de circulación de los mismos (Bedu-Addo F.K. y L. Huang, 1996, "Effect of matrixlipidchainlengthonliposomescontainingcholesterol and ganglioside GMi : Implications in drugdelivery", Journal PharmaceuticalSciences, Voluine 85, Issue 7 , Pages 714 - 719).
Los resultados presentados y los comentarios anteriores demuestran claramente la necesidad vigente que existe de desarrollar formulaciones que contengan sustancias hidrofóbicas, solubles en agua y que puedan contener cantidades efectivas de dichas sustancias activas, tales como, por ejemplo, Paclitaxel y Docetaxel, pero que no presenten las desventajas causadas por la insolubilidad de las drogas arriba mencionadas.
Otras estrategias para la formulación de drogas muy poco solubles en agua ha sido tradicionalmente el uso de emulsiones y otras asociaciones coloidales tales como, por ejemplo, las micelas, un tipo de estructura que disuelve las drogas y, además, incrementa su concentración en medio acuoso (Patente 6,296,870) .
Una micela es una asociación coloidal que tiene regiones que presentan una anisotropia fuerte y un gradiente de solubilidad en agua que decrece desde el exterior hacia su interior. Es por ello que las micelas son capaces de solubilizar una amplia gama de solutos.
Las micelas pueden solubilizar materia orgánica insoluble debido a su capacidad para incorporar dicha materia en la región altamente hidrofóbica de las mismas. En la parte más externa de la cadena hidrocarbonada, los tres o cuatro átomos de carbono son todos trans y, por lo tanto, es un dominio menos fluido. Por lo tanto, esta región, por ser débilmente hidrofóbica, podría ser parcialmente hidratada. De esta manera, se logra un área de transición entre las zonas puramente hidrófoba y puramente hidrófila. Las moléculas que entran en esta zona deben ser ligeramente compatibles, tanto con la zona hidrófoba de la cadena lipidica como con la región solvatada de la cabeza polar y, por lo tanto, deben comportarse como moléculas antipáticas. En el caso de los principios activos con características hidrófobas, éstos tienden a fijarse directamente en la región profunda de la micela a través de la interacción con las cadenas hidrófobas de los ácidos grasos.
En lo que refiere a la cabeza polar de las micelas, existe la posibilidad de conseguir una amplia gama de composiciones. Esto implica la posibilidad de obtener micelas con superficies que presentan diferentes características, las cuales se podrían utilizar para asociar diferentes sustancias activas. En el caso particular de las micelas iónicas, la región de la cabeza polar se puede a unir una gran cantidad de iones conjugados Por lo tanto, resulta similar a una solución electrolítica concentrada. Más aún, la bicapa iónica difusa que se encuentra en las micelas cargadas, se extiende sobre la así llamada capa de Stern.
Las micelas pueden disolver agentes activos, por lo que constituyen un excelente sistema para capturar e incorporar moléculas insolubles o parcialmente insolubles . No obstante, se ha propuesto que la utilización de micelas en sistemas de estas características podría estar limitada a moléculas relativamente pequeñas que se puedan acomodar en la estructura altamente anisotrópica de las cadenas de ácidos grasos . Esto podría ser por el hecho de ocupar la región intermedia o debido a que pueden acomodarse dentro de las cadenas de ácidos grasos. Las emulsiones y, sobre todo, las suspensiones de micelas no son necesariamente estables y pueden no llegar a los sitios de interés. No obstante, es conocido que las emulsiones y las micelas cargadas con agentes activos presentan una mayor motilidad que los liposomas. En general, las micelas se consideran estables sólo cuando están en equilibrio con el monómero tensioactivo de la que están compuestas. Por lo tanto, en ausencia de monómero de equilibrio, las micelas se pueden desarmar en el monómero soluble en agua para, finalmente, diluirse completamente. Del mismo modo, en ausencia de monómero de equilibrio, las gotas de una microemulsión pueden coalescer para formar gotas más grandes, las cuales finalmente se pierden. Por lo tanto, cuando una preparación de micelas se diluye, por ejemplo debido a la administración intravenosa, estas pueden disolverse y dispersarse en el medio, con fugas de su contenido en el torrente sanguíneo en cuestión de segundos. De manera similar, las preparaciones en forma de emulsión muestran el mismo principio inestabilidad.
Recientemente, se publicó la solicitud de patenteUS20130195924Al "Water-soluble pharmaceutical composition comprising at least one therapeutic active substance having hydrophobic properties and at least one compound selected from a monosialoglycosphinglolipids, glycosphingolipids or a mixture of sialoglycosphingolipids and glycosphingolipids" . En ella y con el objeto de resolver algunos de los problemas arriba mencionados, se propone que las micelas de monosialogangliosidos GM1 son capaces de solubilizar o asociar de manera estable drogas hidrofóbicas, tales como el Paclitaxel o la Anfotericina B. Esta propiedad se debe, por un lado, a la baja concentración micelar critica (eme) del GM1, la cual está en el orden de 1( 8 1( 10 M y, por el otro, a que la presencia de la droga hidrofóbica dentro de las micelas de GM1 produce un aumento de la estabilidad de las micelas, tal como se demuestra mediante experimentos de diálisis. Asi, el GM1 disminuye un 32% luego de 72 hs de diálisis, mientras que el complejo GMl-Ptx disminuye sólo un 3%.
Por otra parte, la utilización de micelas de lipopéptidos como agentes para transportar fármacos, se describe en la solicitud de patente Europea EP2264047 (Al) "High puritylipopeptides, lipopeptidemicelles and processesforpreparingsame". En dicho documento, se describe esencialmente la purificación y la caracterización de las propiedades fisicoquímicas de los lipopéptidos, su capacidad para formar micelas, como así también una completa caracterización de sus propiedades como antibióticos. En particular, se revela la utilización de un lipopéptido cíclico particular conocido como Daptomicina (Dapto) , el cual presenta actividad contra bacterias Gram positivas. De manera general, en dicha publicación se menciona el potencial uso de lipopéptidos antibióticos como transportadores de drogas hidrofóbicas . En dicho documento no se describe la utilización de micelas de lipoglicopéptidos para la incorporación específica de drogas con características hidrófobas para el tratamiento de pacientes oncológicos
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica soluble en agua que comprende, al menos, una sustancia terapéuticamente activa y, al menos, una sustancia con capacidad para formar micelas, en donde dicha sustancia terapéuticamente activa se selecciona entre las drogas con características hidrófobas para el tratamiento de pacientes oncológicos y en donde dicha sustancia con capacidad para formar micelas se selecciona entre los compuestos Teicoplanina, Dalbavancina y Oritavancina .
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Perfil cromatográfico en Sephadex G200 del complejo Teicoplanina-Paclitaxel -o- , y del complejo Teicoplanina-Paclitaxel-Albúmina -n- .
Figura 2. Gráfico de la determinación del tamaño de las partículas de Teicoplanina por la técnica de dispersión dinámica de la luz. En el margen inferior derecho aparece el dato del tamaño las partículas en nanómetros.
Figura 3. Gráfico de la determinación del tamaño de las partículas del complejo Teicoplanina-Paclitaxel por la técnica de dispersión dinámica de la luz. En el margen inferior derecho aparece el dato del tamaño las partículas en nanómetros .
Figura 4. Gráfico de la determinación del tamaño de las partículas del complejo Teicoplanina-Paclitaxel-Albúmina por la técnica de dispersión dinámica de la luz . En el margen inferior derecho aparece el dato del tamaño las partículas en nanómetros.
Figura 5. Microfotografía electrónica a 150.000 x por las partículas del complejo Teicoplanina. La barra negra representa 200 nm. Figura 6. Microfotografía electrónica a 250.000 x por las partículas del complejo Teicoplanina-Paclitaxel . Los números verdes representan el tamaño de las micelas.
Figura 7. Microfotografía electrónica a 250.000 x por las partículas del complejo Teicoplanina-Paclitaxel-Alúmina . Los números verdes representan el tamaño de las micelas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Con el fin de utilizar adecuadamente una nanoestructura de micelas como un sistema de carga, transporte y liberación de fármacos en el torrente sanguíneo, es necesario mejorar los problemas del comportamiento de las nanoestructuras del arte previo, de acuerdo con los siguientes aspectos fundamentales :
1 - evitar los problemas relacionados con la disolución de las micelas, causados por el fenómeno de dilución,
2 - obtener una estructura con una superficie o con propiedades fisicoquímicas y o eléctricas que eviten su interacción con las células rojas de la sangre,
3 - lograr que las micelas puedan ser recubiertas por polímeros o proteínas que permitan: i) estabilizar los complejos de las micelas con las drogas y/o ii) servir como agentes para que las micelas accedan al tejido deseado.
4 - obtener una estructura lo suficientemente pequeña (menor a 100 nm) como para evitar su rápida remoción del torrente sanguíneo por el sistema retículo endotelial.
5 - obtener una estructura con un Peso Molecular superior a 40 kDa, con el fin de evitar su rápida eliminación mediante el sistema renal. Los inventores de la presente han desarrollado una nueva estrategia que mejora considerablemente los problemas del arte previo y, en particular, han desarrollado composiciones farmacéuticas novedosas basadas en nanomicelas estables que permiten cargar concentraciones altas de sustancias terapéuticamente activas en general y de drogas con características hidrófobas para el tratamiento de pacientes oncológicos en particular.
Así, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica soluble en agua, que comprende, al menos, una sustancia terapéuticamente activa y, al menos, una sustancia con capacidad para formar micelas, en donde dicha sustancia terapéuticamente activa se selecciona entre las drogas con características hidrófobas para el tratamiento de pacientes oncológicos y en donde la sustancia con capacidad para formar micelas se selecciona entre los compuestos Teicoplanina, Dalbavancina y Oritavancina ..
En una realización particular, la composición de la invención comprende drogas con características hidrófobas, útiles en el tratamiento de pacientes oncológicos, las cuales se seleccionan entre las drogas antitumorales . En realizaciones preferidas, la composición de la invención comprende al menos una droga seleccionada entre el Paclitaxel y el Docetaxel.
El experto en la técnica sabrá deducir que otras drogas con características hidrófobas podrían ser incorporadas a las composiciones de la presente invención y obtener las ventajas descritas en la presente. A modo de ejemplo, las composiciones de la presente invención podrían incorporar drogas hidrófobas antimicóticas como, por ejemplo, Anfotericina B.
Es un objeto particular de la invención, una composición farmacéutica soluble en agua, que comprende al menos una droga antitumoral con características hidrófobas y al menos una sustancia con capacidad para formar micelas seleccionada entre los compuestos Teicoplanina, Dalbavancina y Oritavancina.. en donde dichos compuestos se encuentran formando micelas y en donde dicha al menos una droga antitumoral con características hidrófobas se encuentra unida a la micelas de forma no covalente. En una realización especialmente preferida, la composición arriba mencionada comprende al menos una droga seleccionada entre el Paclitaxel y el Docetaxel .
Otro objeto particular de la invención es una composición farmacéutica soluble en agua que comprende una droga antitumoral con características hidrófobas y una sustancia con capacidad para formar micelas, en donde dicha droga antitumoral es Paclitaxel y en donde dicha sustancia con capacidad para formar micelas es la Teicoplanina. En una realización especialmente preferida, la composición de la invención comprende Paclitaxel y Teicoplanina en una relación molar de alrededor de entre 1:5 y 1:100. En otra realización especialmente preferida, la composición farmacéutica soluble en agua de la invención comprende entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 10 mg/ml de Paclitaxel y entre alrededor de 10 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml de Teicoplanina.
Otro objeto particular de la invención es una composición farmacéutica soluble en agua que comprende una droga antitumoral con características hidrófobas y una sustancia con capacidad para formar micelas, en donde dicha droga antitumoral es Docetaxel y en donde dicha sustancia con capacidad para formar micelas es la Teicoplanina . En una realización especialmente preferida, la composición de la invención comprende Docetaxel y Teicoplanina en una relación molar de alrededor de entre 1:5 y 1:100. En otra realización especialmente preferida, la composición farmacéutica soluble en agua de la invención entre alrededor de 1 mg/ml y alrededor de 10 mg/ml de Docetaxel y entre alrededor de 10 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml de Teicoplanina .
En una realización particular de la invención, la composición farmacéutica soluble es una composición inyectable estéril. En una realización especialmente preferida, la composición farmacéutica soluble en agua de la invención es una composición liofilizada.
En realizaciones particulares de la invención, la composición se encuentra en forma de liofilizado y puede ser reconstituida con un disolvente seleccionado entre una solución de agua destilada, una solución salina (NaCl 0,9 %), una solución tampón salina de fosfato (PBS), agua destilada que contiene 5 % de dextrosa, una solución salina con dextrosa al 5% y una solución de albúmina humana al 20 %, de manera de obtener una composición translúcida estéril .
De acuerdo con la presente invención, se entiende por el término "micela" a una asociación coloidal que tiene regiones con una fuerte anisotropía y un gradiente de solubilidad decreciente de agua, que va desde el exterior hacia el interior de la misma .
Entre otras ventajas de la invención, podemos mencionar las siguientes :
1- Las micelas de Teicoplanina, Dalbavancina y Oritavancina son capaces de incorporar espontáneamente sustancias terapéuticamente activas con características hidrófobas, útiles en el tratamiento de pacientes oncológicos. En particular son capaces de incorporar espontáneamentePaclitaxel y Docetaxel.
2- Una propiedad destacada de una composición de acuerdo con la invención que comprenda a la Teicoplanina como formadora de micelas, es la de presentar el mayor tiempo posible de circulación plasmática. Es sabido que los liposomas son estructuras rápidamente removidas de la sangre (15 a 30 minutos) debido a su interacción con las células del sistema retículo endotelial (RES) . Es por ello que dichas estructuras deben ser modificadas, por ejemplo, mediante el agregado de lípidos con azucares o con polímeros tales como, por ejemplo, el polietilenglicol (PEG) . Se ha descrito que el agregado de PEG incrementa el tiempo de circulación en sangre de los liposomas de 30 min a unas 40 horas. Por el contrario, una composición de acuerdo con la invención conteniendo Teicoplanina puede presentar un tiempo de circulación en plasma mucho mayor, siendo posible alcanzar un tiempo de vida media de entre alrededor de 70 y 100 horas.
3- Una composición de acuerdo con la invención que comprenda a la Teicoplanina como formadora de micelas puede ser recubierta espontáneamente con Albúmina (Alb) {Bonati, M., G.L. Traína, R. Rosina y G. Buniva (1988) J. Antimicmb. Chemother.
21 (Suppi. A): 29-37) para proveer de una interacción más especifica de la micela con el tumor. En este sentido, ha sido descrito previamente que la albúmina, además de evitar la remoción de las nanoestructuras por el sistema reticuloendotelial (RES), es capaz de interaccionar con los receptores celulares y comenzar el mecanismo de transcitosis a través de las células del endotelio capilar. Mediante este mecanismo, seria posible el pasaje de esta molécula de albúmina y de las moléculas asociadas y depositarlas cerca de la superficie del tumor. De acuerdo con realizaciones particulares de la presente invención, las micelas de Teicoplanina que incorporan Paclitaxel (Ptx) o Docetaxel (Dtx) , para formar el complejo Teicoplanina- Paclitaxel (Teico-Ptx) o Teicoplanina-Docetaxel (Teico-Dtx) presentan la capacidad de unirse a la Albúmina. De esta manera, resulta posible generar un complejo ternario Alb- Teico-Ptx o Alb-Teico-Dtx, el cual puede ser utilizado para alcanzar las células tumorales.
4- El tamaño de la nanoestructura de las micelas de las composiciones de acuerdo con la presente invención también resulta un factor importante, ya que las moléculas o complejos que poseen un peso molecular (PM) menor a 40 kDa son rápidamente filtradas por el riñon. De acuerdo con la presente invención, la nanoestructura del complejo Teico- Ptx tiene un PM del orden de 50 a 60 kDa y el complejo ternario Teico-Ptx-Alb tiene un PM de alrededor de 250 a 300 kDa.
5- Otra propiedad critica de las formulaciones inyectables de drogas antitumorales es que las mismas eviten todo tipo de interacción con los glóbulos rojos (GR) , los cuales representan la primera hipersuperficie celular con la cual podrían interaccionar, liberando su contenido. De acuerdo con la presente invención, ni la Teicoplanina ni el complejo Teico-Ptx interacciona con los glóbulos rojos (GR), aunque pueden llegar rápidamente e interaccionar con diferentes tejidos, tales como la piel, los líquidos ascíticos y sinovial, el pericardio, la pleura, los huesos, el riñon, la tráquea, las glándulas suprarrenales, el tejido graso, el líquido cefalorraquídeo y también con los linfocitos .
6- A diferencia de lo descripto hasta el presente, las micelas de Teicoplanina presentan una mayor capacidad de carga de Ptx que las que permiten otro tipo de formulaciones en base a micelas, llegando hasta alrededor de 10 mg/ml. En cambio, las formulaciones disponibles actualmente en el mercado solo llegan a concentraciones entre 5 y 6 mg/ml de Paclitaxel.
7- Además, otra ventaja es que una vez que se reconstituye la formulación liofilizada de Teico-Ptx, la misma es capaz de permanecer estable, sin precipitación del fármaco, al menos durante 35 días.
De acuerdo con realizaciones particulares de la invención, las composiciones de la invención pueden estar adaptadas para ser administradas de manera intravenosa (IV) a un paciente. Así, en realizaciones particulares, las composiciones de la invención pueden ser formulaciones líquidas o bien formulaciones liofilizadas que pueden ser reconstituidas con una solución estéril, para obtener una formulación inyectable, estéril y translúcida. Si bien las composiciones farmacéuticas de la presente invención se describen de manera especifica para micelas de Teicoplanina, Dalbavancina y Oritavancina, el experto en la técnica sabrá concluir que, utilizando las enseñanzas de la presente invención, otros compuestos de tipo lipoglicopéptido y, en particular, otros antibióticos de tipo lipoglicopéptido podrían ser utilizados. En particular, de acuerdo con las enseñanzas de la invención, podrían utilizarse otros antibióticos de tipo lipoglicopéptido que presenten una concentración micelar crítica (CMC) de alrededor de 80xl(T6M.
De acuerdo con los resultados obtenidos por los inventores de la presente, el PM de las micelas de Teicoplanina con Paclitaxel oscila entre 50 y 70 kDa y el complejo Alb- Teico-Ptx oscila entre alrededor de 250 y 300 kDa.
Por otra parte, los inventores de la presente han encontrado que las micelas de Teicoplanina cargadas con Ptx o Dtx presentan una estabilidad mayor a la de las micelas de Teicoplanina no cargadas, lo cual demostraría que una molécula hidrófoba, tal como el Ptx o el Dtx, podría regular por sí misma los mecanismos de disociación de la micela, favoreciendo de este modo a la estabilización de la forma micelar. De hecho, en experimentos de diálisis, se observó una pérdida de aproximadamente un 25 % de las moléculas de Teicoplanina luego de 48 hs de diálisis, mientras que para el complejo Teico-Ptx se observó una pérdida de entre el 5 y el 8 %.
Los complejos Teico-Ptx y Teico-Dtx pueden interactuar de una manera espontánea y no covalente, por medio de una interacción hidrofóbica con la molécula de albúmina, generando una nueva estructura como un complejo ternario, altamente estabilizado. Debido a la presencia de la molécula de albúmina, dichos complejos podrían desencadenar un mecanismo de transcitosis a través de las células endoteliales hacia el medio intersticial. Posteriormente, de manera similar a lo demostrado para el complejo albúmina-Ptx (ABI007), los complejos podrían unirse al receptor o a las proteínas SPARC ubicadas en la zona donde se encuentra el tejido tumoral.
Teniendo en cuenta los resultados arriba mencionados, los inventores de la presente han desarrollado composiciones farmacéuticas, las cuales resultan ser un objeto particular de la presente invención, las cuales comprenden un vehículo compuesto por moléculas de uno o más antibióticos del tipo lipoglicopéptido que forman micelas, seleccionadas entre Teicoplanina, Dalbavancinay Oritavancina, las cuales permiten la incorporación no covalente de fármacos oncológicos con propiedades hidrofóbicas y que, además, pueden ser recubiertosde forma espontáneacon una proteína sérica tal como la albúmina. En realizaciones particulares, la albúmina puede ser seleccionada entre albúmina humana, albúmina humana recombinante, albúmina bovina y albúmina humana que contiene ácidos grasos. En una realización especialmente preferida, las micelas de acuerdo con la invención, están recubiertas con albúmina sérica humana, con o sin ácidos grasos, en una relación antibiótico : albúmina de 1:2 o 1:4 (p/p) .
En otra forma de realización particular, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica soluble en agua en que las micelas de antibiótico están recubiertas con albúmina que contiene ácido fólico acoplado covalentemente; incluso mas particularmente, la cantidad ácido fólico covalentemente unido a la albúmina varia de a 20% de la albúmina total.
Asimismo, en realizaciones más particulares aún, el complejo antibiótico lipoglicopéptido-droga antitumoral, puede ser vehiculizado a los seres humanos por inyección previa en bolsas de transfusión que contienen albúmina humana, suero humano o plasma humano completo. Asi, en realizaciones particulares, los complejos Teico-Ptx y Teico-Dtx se unirían específicamente a la albúmina para generar los complejos ternario biológicamente activos Teico-Ptx-Alb y Teico-Dtx-Alb una vez inyectada la composición de la invención en bolsas de transfusión que contienen albúmina humana, suero humano o plasma.
Los inventores de la presente han encontrado que, debido a la interacción con las micelas de Teicoplanina, resulta posible obtener un aumento en la solubilidad de un agente bioactivo hidrófobo en un medio acuoso, tal como el Ptx o elDtx, desde menos de 1 g/ml hasta 10 mg/ml (unas 10.000 veces) . Por otra parte, dado que tanto los complejos que forman los compuestos Teicoplanina, Dalbavancina y Oritavancinacon el Ptx o el Dtx, como así también los unidos no covalentemente a albúmina, presentan una CMC baja (por ejemplo, la CMC de Teico-Ptx-Alb es de alrededor de 50xl0~6 M) , es que se logra que la droga para el tratamiento de pacientes oncológicos aumente su tiempo de vida en la circulación sanguínea. Es así que podría incrementarse la actividad terapéutica de la composición ya que tendría más tiempo para acceder a la zona del tumor. Por otra parte, resulta importante destacar que las composiciones de acuerdo con la invención no requieren la utilización de solventes que pudieran producir efectos indeseables en el paciente oncológico. Asi, por ejemplo, las composiciones de la invención no requieren del agregado de Cremofor y Etanol (50%-50%) , tal como es el caso de la formulación comercial de Taxol™, los cuales son causantes de muchos efectos secundarios indeseables cuando son administrados a los pacientes.
De acuerdo con una forma de realización preferida, la composición farmacéutica de esta invención está adaptada para la administración intravenosa (iv) . Incluso más preferiblemente, es una composición intravenosa estable y translúcida. En particular, la composición farmacéutica soluble en agua de esta invención se puede liofilizar o bien se encuentra en una forma liofilizada. En este último caso, la composición puede reconstituirse con un disolvente tal como agua destilada, solución salina (NaCl 0,9 %), solución tampón salino de fosfato (PBS), agua destilada que contenga 5 % de dextrosa y solución salina con dextrosa al 5% .
También es un objeto particular de esta invención producir una composición farmacéutica liofilizada y estéril que puede ser resuspendida en los disolventes mencionados más arriba, de manera que los fármacos antitumorales, tales como el Dtx o el Ptx puedan alcanzar una concentración final que va desde 0,1 a 20 mg / mi, preferiblemente, de 1 a 15 mg / mi, e incluso más preferiblemente, de 5 a 10 mg / mi . De acuerdo con la presente invención la composición farmacéutica comprende una sustancia con capacidad para formar micelas seleccionada entre la Teicoplanina, la Dalbavancina y la Oritavancina . En una forma preferida de la invención, la sustancia con capacidad para formar micelas es la Teicoplanina.
Todos los glucopéptidos comparten un núcleo heptapeptidico, lo cual les permite actuar como inhibidores de la síntesis de la pared celular por medio de la inactivación de los procesos de transglucosilación y transpeptidación de las cadenas de peptidoglucanos . Las modificaciones en este núcleo provocan cambios en la actividad de los distintos fármacos sintéticos. Así, la dalbavancina, la oritavancina y la telavancina son derivados semisintéticos de la teicoplanina, la cloroeremomicina y la vancomicina, en orden respectivo. continuación se incluye una breve descripción de cada una estas tres sustancias.
La Teicoplanina, es un glicopéptido relacionado químicamente a la vancomicina, que presenta un amplio rango de actividad frente a bacterias Gram-positivas . En realidad, la Teicoplanina es un glicopéptido complejo porque está compuesto por un heptapéptido lineal que contiene tres moléculas de p-OH-fenil-glicina, 2 moléculas de di-OH- fenil-glicina y 2 de tirosina, unidas a través de una interacción glicosídica con una mañosa y 2 moléculas de acetilglucosamina, con un PM de alrededor de 1,564 kDa. Cuando esta molécula interacciona con los ácidos grasos via glucosamina, se transforma en un lipo-glicopéptido . Hay 5 compuestos, cuando los ácidos grasos (R) son: R: ácido 4-decenoico con un PM de 1877,67
R: ácido 8-metilnonanoico con un PM de 1879, 6Í
R: ácido n-decanoico con un PM de 1879
R: ácido 8-metil decanoico con un PM 1893
R: ácido 9-metildecanoico con un PM 1893
Τίϊϊ-wíisáss ,¾·»3
Figure imgf000027_0001
Dalbavancina CAS Registry [171500-79-1] es el nombre genérico que recibe el compuesto que responde a la siguiente fórmula estructural:
Figure imgf000028_0001
OritavancinaCAS Registry [171099-57-3] es el nombre genérico que recibe el compuesto que responde a la siguiente fórmula estructural:
En una realización particular, el pH de las micelas de Teicoplanina oscila entre 6 y 8. En una realización aún más preferida, el pH de las micelas oscila entre 6 a 7,5.
En particular, las composiciones farmacéuticas solubles en agua de la presente invención presentan, en promedio, un tamaño menor que 200 nm; incluso más particularmente, menor que 100 nm, preferiblemente, entre 5 nm y 80 nm y, aún más preferiblemente, entre 5 nm y 25 nm.
Por otra parte, las formulaciones de la presente invención se pueden preparar por medio de un método de carga pasiva. Por ejemplo, los agentes bioactivos pueden ser encapsulados en las micelas de antibiótico a mayores concentraciones que las actuales, usando un método sencillo como el de la incubación a temperatura ambiente o en frió, durante el cual la incorporación se lleva a cabo de forma espontánea. Por otro lado, el recubrimiento de la micela de antibiótico-Ptx o antibiótico-Dtxcon albúmina humana se produce de una manera espontánea y no covalente, por medio de una interacción hidrofóbica. Este recubrimiento finalmente genera un complejo ternario compuesto por antibiótico-Ptx-Alb o antibiótico-Dtx-Alb .
Un procedimiento utilizable en la obtención de la composición de la invención, ejemplificada para la
Teicoplanina, se puede resumir de la siguiente manera: La
Teicoplanina liofilizada se diluye en agua destilada por agitación suave y lenta a temperatura de 4 C durante al menos 12 hs . A continuación, las micelas de Teicoplanina se incuban con un décimo de su volumen (1/10 vol/vol) con disolventes tales como etanol o dimetilsulfóxido, los cuales contienen a los fármacos hidrofóbicos antitumorales
Ptx o Dtx completamente solubilizados . Las muestras se agitan suavemente y se incuban a temperatura ambiente durante al menos 4 hs, hasta que la solución se torna completamente clara. A continuación, el disolvente orgánico se elimina de las micelas de Teicoplanina por medio de diálisis. Esta diálisis se lleva a cabo con una solución de grado farmacéutico con un pH adecuado (entre pH 6 y pH 7,5)
La formulación de micelas con el fármaco incorporado, esencialmente libre de disolventes y con el pH deseado, se centrifuga a 15.000 x g durante 10 minutos, a fin de eliminar cualquier compuesto insoluble hidrofóbico que no haya sido incorporado en las micelas. La formulación acuosa transparente de micelas que contiene a los fármacos antitumorales o antimicóticos encapsulados, a continuación se incuba con albúmina humana purificada, plasma humano o suero humano, a fin de garantizar una interacción de la albúmina con las micelas cargadas. Esta incubación puede llevarse a cabo a temperatura ambiente durante, al menos, 2 hs . Las formulaciones compuestas por Teico-Ptx o Teico-PTX- albúmina son finalmente nuevamente liofilizadas .
Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un procedimiento para obtener micelas que contienen, al menos, un agente bioactivo hidrófobo encapsulado. Dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:
(a) solubilizar el antibiótico en agua destilada o en una en una solución salina con un pH que varia de 5 a 7,5 siempre por sobre la CMC y luego mantener la solución con agitación suave a 4 C durante, por lo menos 12 hs;
(b) a la solución de micelas Teicoplanina obtenidas a partir de la etapa anterior, regarle una solución del agente bioactivo elegido al % en dimetilsulfóxido o etanol ;
(c) incubar dicha mezcla a temperatura ambiente, entre 2 y 12 hs, con el fin de garantizar la correcta incorporación del agente bioactivo a las micelas y, a continuación; (d) dializar la solución de micelas que contienen el principio bioactivo con una solución de agua destilada o una solución farmacéuticamente aceptable con un pH entre 5 y 7,5 durante 12 horas a temperatura 4 C, con el fin de eliminar el disolvente orgánico;
(e) Incubar las micelas de complejo Teicoplanina-fármaco con albúmina humana durante una o dos horas, a temperatura ambiente, con el fin de permitir la formación del complejo ternario Teicoplanina-drogas-albúmina;
(f) esterilizar la solución acuosa y transparente obtenida en la etapa anterior mediante filtración por 0,22 mieras; y
(g) liofilizar las micelas esterilizadas.
Para su administración por vía intravenosa, el liofilizado obtenido mediante el procedimiento arriba mencionado puede ser suspendido en una solución farmacéuticamente aceptable.
La cantidad de los diferentes agentes bioactivos incorporados en las micelas de Teicoplanina, se pueden determinar mediante la utilización de técnicas espectroscópicas o técnicas cromatográficas apropiadas, tales como la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) .
Los micelas de acuerdo con la presente invención pueden ser cargadas con el agente anti tumoral, por ejemplo, Dtx o Ptx previamente solubilizados en disolventes orgánicos tales como etanol o dimetilsulfóxido . En realizaciones particulares, la cantidad de etanol o dimetilsulfóxido utilizada para la incorporación de Docetaxel y Paclitaxelen las micelas de Teicoplanina varía de 5 a 15% del volumen total .
Los disolventes utilizados para cargar las micelas con las sustancias terapéuticamente activas, se pueden eliminar mediante un procedimiento adaptado a este propósito. Por ejemplo, se pueden eliminar por diálisis o por filtración molecular utilizando Sephadex G25.
El experto en la técnica sabrá comprender que, siguiendo con las enseñanzas de la presente invención, sería posible incorporar a la composición de la invención otros fármacos diferentes al Ptx y al Dtx. Así, otras drogas podrían ser incorporadas a las composiciones de la invención serían aquellas que se definen por un coeficiente de partición octanol/agua mayor que 1, preferiblemente mayor que 5. Los fármacos representativos de esta categoría incluyen a las prostaglandinas, la testosterona, el estradiol, la vitamina e, la cortisona, y la dexametasona . Asimismo, las composiciones de la presente invención podrían incorporar drogas hidrófobas antimicóticas como, por ejemplo, Anfotericina B.
Las micelas formadas por antibióticos, como es el caso del lipo-glicopeptidoTeicoplanina y otros antibióticos como es el lipopéptido cíclico Daptomicina, muestran diferente capacidad para incorporar Ptx o Dtx en su interior, presentando la Teicoplanina el doble de capacidad de carga que la Daptomicina. En este sentido, los resultados obtenidos por los autores de esta invención, muestran claramente que las estructuras formadas por cada micela son claramente diferentes y esto se traduce en un cambio en la capacidad para solubilizar Ptx o Dtx. Un estudio de microscopía electrónica muestra que las micelas de Teicoplanina de esta invención se presentan esféricas. Por otra parte, los resultados revelan que la formación del complejo Teico-Ptx no produce un cambio sustancial en el tamaño de la micela. Ver, por ejemplo, lasfiguras 2, 3 y 4.
Un estudio comparativo sobre las propiedades y características de las micelas de un lipoglicopéptido, la Teicoplanina (Teico) y las micelas de un antibiótico compuesto por un lipopéptido cíclico como la Daptomicina (Dapto) , resalta las diferencias y ventajas existentes entre ambas, que no solo difieren estructuralmente sino en sus propiedades para funcionar como nanocarriers . De los datos obtenidos de la literatura, y de resultados experimentales desarrollados por los inventores de la presente, se pueden remarcar los siguientes aspectos que se detallan a continuación.
1- Las micelas de Teicoplanina tienen un tiempo de vida media en sangre que oscila entre 70 y 100 horas, lo cual es muy superior a las micelas de Daptomicina, las cuales presentan un tiempo de vida media comprendido entre 7 y 10 hs .
2- En lo que respecta a la estabilidad de las micelas, mientras que las micelas de Daptomicina se mantienen estables y con actividad biológica por 12 hs a 25°C y por 48 hs a 4°C, las micelas de Teicoplanina son estables 48 hs a 25°C y 35 días a 4°C. 3- Las dosis máximas sugeridas de Daptomicina para evitar efectos colaterales indeseados o citotoxicidad están en el orden de 10 a 12 mg/kg/dia. Para la Teicoplanina, en cambio, la dosis máxima sugerida es de 20 mg/Kg/dia, lo cual habla de la posibilidad de aplicar una mayor cantidad de Teicoplanina para vehiculizar mayores dosis de fármacos.
4- En relación al punto anterior, resultados obtenidos por los inventores de la presente, demuestran que las micelas de ambas moléculas, Teicoplanina y Daptomicina, a la misma concentración, pueden incorporar Paclitaxel (Ptx) o Docetaxel (Dtx) . No obstante, mientras que la capacidad de carga máxima para la Teicoplanina es de 10 mg/ml, la de Daptomicina es de sólo 5 mg/ml.
5- Con respecto a la estabilidad en el tiempo de los complejos Teico-Ptx o Dapto-Ptx, resultados obtenidos por los inventores de la presente, demuestran que el complejo Dapto-Ptx se inestabiliza liberando el Ptx, el cual precipita dentro de las 48 hs. Por el contrario, el complejo Teico-Ptx se mantiene estable durante, al menos, 35 días.
6- En relación al tamaño de las micelas de ambas moléculas, resultados obtenidos por los inventores de la presente, demuestran que las micelas de Dapto y Dapto-Ptx tienen un diámetro de 5 y 5,5 nm, mientras que las de Teico y Teico- Ptx resultan un 40 % más grandes, ya que tienen un diámetro medio, medido por la técnica de la dispersión dinámica de la luz " dynamic light scattering" , de 8 y 9 nm respectivamente . 7- Finalmente, las concentraciones micelares criticas para cada caso, muestran que las micelas de Teico tiene una CMC de 100 μΜ, mientras que las micelas de Dapto a pH 4 tienen una CMC de 400 g/ml (250 μΜ) . Sin embargo, cuando Dapto es solubilizada a pH 6,5, la molécula de Dapto puede permanecer soluble aún a concentraciones de 150 mg/ml. Este punto también resulta crucial para pensar en una formulación estable para el transporte de fármacos hidrofóbicos, ya que a mayor CMC, mayor inestabilidad del complejo lo cual produce una más rápida liberación del fármaco por dilución en el torrente sanguíneo, como sería el caso de Daptomicina, lo cual resulta desfavorable para un buen sistema de transporte de fármacos intravenoso.
Recientemente se ha publicado un trabajo denominado " Characterization of cell- penetratinglipopeptidemicellesbyspectroscopicmethods" . Gehne S, Sydow K, Dathe M y Kumke MU. J PhysChem B. 2013 Nov 21 ; 117 ( 46 ) : 14215-25 , donde se describe la síntesis de otro lipopéptido . Los autores hacen mención a la formación de micelas de lipopéptidosaniónicos y catiónicos. Se mencionan estudios para evaluar la interacción de los mismos con células del endotelio capilar. Dentro de los estudios se describe que los derivados catiónicos resultaron ser muy fuertes tensioactivos con una baja eme en el rango micromolar (0,5- 14 uM) . La combinación de la propiedad de formación de micela y la capacidad de penetración celular podría allanar el camino para el desarrollo de una nueva clase de sistemas soporte de fármacos eficientes. En este trabajo dichos lipopéptidos solo han sido evaluados en sus propiedades fisicoquímicas pero no han sido estudiados como transportadores de drogas oncológicas hidrofóbicas .
EJEMPLOS Ejemplo 1
Carga de Paclitaxel en micelas de teicoplanina
Muestras conteniendo 400 mg de teicoplanina se disolvieron en 2 mi de agua destilada a un pH de 5,5 o bien en 2 mi de una solución tampón de fosfato 20 mM a pH 6, agitando suavemente con el fin de obtener una disolución completa. La solución se dejó en reposo durante al menos 4 horas a una temperatura de 4°C. Una alícuota de 0,5 mi se incubó con 25 μΐ de DMSO conteniendo cantidades crecientes de Paclitaxel (Ptx) , con el fin de llegar a las siguientes concentraciones finales: 1 mg/ml , 5 mg/ml , 10 mg/ml y 20 mg/ml .
Las soluciones se incubaron a 25 °C durante al menos 4 horas y después se centrifugaron a 15.000 xg durante 10 minutos a fin de eliminar el potencial Ptx insoluble que no se hubiera encapsulado en las micelas teicoplanina. Por último, y con el fin de eliminar el DMSO remanente, las muestras se dializaron con una solución tampón de fosfato 20mM a pH 6 durante 12 horas . La cuantificación del Ptx incorporado en las micelas de teicoplanina se llevó a cabo mediante el uso de HPLC.
Tabla I : Incorporación de Ptx en micelas de Teicoplanina
Teicoplanina Concentración de Ptx Ptx en micelas de
Teicoplanina
200 mg/ml 1 mg/ml 1 mg/ml
200 mg/ml 2 , 5 mg/ml 2 , 5 mg/ml
200 mg/ml 5 mg/ml 5 mg/ml
200 mg/ml 10 mg/ml 10 mg/ml
200 mg/ml 20 mg/ml 2 mg/ml Cuando se incrementa la concentración de Ptx a 20 mg/ml s produce un inestabilización del complejo, liberando todo Ptx, el cual precipita inmediatamente.
Ejemplo 2
Efecto de la temperatura en la carga de Ptx en micelas de Teicoplanina
Ptx se carga en las micelas de teicoplanina a una concentración de 5 mg/ml de acuerdo con lo descrito en el Ejemplo 1, pero durante 30 minutos a una temperatura de 4°C, 25°C y 37°C. Después de la incubación, las muestras se centrifugaron a 15.000 xg durante 10 minutos y se dializaron contra agua destilada, durante 12 horas, a 4 °C. Finalmente, la cantidad de Ptx incorporado en la micela de teicoplanina de forma soluble se cuantificó mediante HPLC. Los resultados muestran que el cambio en la temperatura a la que se carga la Ptx no produce un aumento significativo de la incorporación. La carga en todas las condiciones fue mayor del 90%.
Tabla 2 : efecto de la Temperatura en la incorporación de
Ptx en micelas de Teicoplanina
Temperatura Teicoplanina Ptx agregado Ptx cargado (%)
100 mg/ml 5 mg 94
25 °C 100 mg/ml 5 mg 96
37 ÜC 100 mg/ml 5 mg 98 Ejemplo 3
Perfil cromatográfico en Sephadex G200 de micelas de Teico- Ptx y de Teico-Ptx acomplejadas con Albúmina
Micelas de Teico-Ptx conteniendo 200 mg/ml de Teico y 5 mg de Ptx se prepararon tal como se describe en los ejemplos anteriores. Una parte de estas micelas se incubaron con un volumen de albúmina de suero humano 200 mg/ml. (Laboratorio de Hemoderivados dependiente de la Universidad Nacional de Córdoba) a 37 ° C durante 3 horas. Finalmente, se sometieron a cromatografía el Sephadex G200 para determinar el perfil de elución de cada preparación. Ver Figura 1
Un volumen de 200 ul de micelas de Teico (200 mg/ml) fueron cargadas con Ptx para alcanzar una concentración final de 5 mg/ml de Ptx. Por otra parte, 200 ul de una solución de micelas Teico (200 mg/ml) cargadas con 5 mg/ml de Ptx se incubaron en presencia de 200 ul de 200 mg/ml de albúmina, durante 4 hs, para generar el complejo ternario Teico-Ptx- Alb. Luego cada preparación se sometió a cromatografía en Sephadex G200. El volumen sembrado fue de 250 ul . El Vo de la columna es de 5 mi determinado utilizando azul de dextrano. Como se puede ver, las micelas de Teico-PTX, eluyen con un radio hidrodinámico aparente de 50 kDa (círculos negros) . Sin embargo, cuando el complejo se incubó con albúmina para formar los complejos ternarios Teico-PTX-Alb, presentan Absorbancia a 280 nm para la detección de Albúmina (círculos rojos) . Este resultado muestra que la unión de la albúmina a las micelas de Teico- Ptx produce un cambio en el PM de 50 kDa, hacia un PM de alrededor de 200 kDa. Ejemplo 4
Estudio comparativo in vitro de la actividad citotóxica de Teico-Ptx frente a Ptx en un cultivo de células tumorales .
Células de origen tumoral como HEP-2, se incubaron en medio MEM conteniendo suero fetal bovino al 2% (Natocor-Villa Carlos Paz - Córdoba - Argentina) , en una incubadora de CO2 al 5% CO2, a confluencia. Diferentes concentraciones de las composiciones mencionadas a continuación se añadieron al cultivo celular:
a) - Ptx (control positivo) : Control de Ptx en DMSO a concentraciones de 5, 10, 20 y 50 nM.
b) - Micelas Teico-Ptx: El Ptx presente en las micelas de Teico se encuentra en las mismas concentraciones que las del control de Ptx.
c) - Micelas de Teico-Ptx-Alb y Teico-Ptx, en las mismas concentraciones que en el ítem b) , recubiertas con Albúmina, con una relación Teico-Alb 1/1 (p/p) .
d) - Micelas Control de Teicoplanina : Concentración de Teico igual a la usada en todos los experimentos anteriores (5 g/ml) .
La viabilidad celular se evaluó mediante ensayo MTT luego de 24 horas de incubación.
Muerte celular después de 24 hs de tratamiento
Ptx () Control-Ptx Teico-Ptx Teico-PTX-Alb Teico 5 μΜ
5 nM 10% 15% 14% 0%
10 nM 25% 35% 31% 0%
20 nM 40% 55% 60% 0%
50 nM 90% 95% 92% 0% Los resultados muestran que el Ptx puede ser liberado de las micelas de teicoplanina, aún en presencia de albúmina y matar a las células en cultivo. La Teicoplanina sola no tiene efecto en ningún tipo celular, mientras que el control dePtx en DMSO y en la formulación Teico-Ptx o el complejo ternario Teico-PTX-albúmina producen la muerte completa de las células tumorales, a las 24 horas, hasta una concentración de 50 ng/ml .
Ejemplo 5
Determinación del tamaño de partícula de Teico, Teico-Ptx y micelas Teico-PTX-Alb mediante dispersión dinámica de la luz (DLS)
En la Figura 2, se observa el Control de teicoplanina: Los resultados del análisis mediante DLS muestran un tamaño de partícula de 8 nm con un índice de polidispersidad de 0,017
En la Figura 3, se muestran resultados del análisis mediante DLS del complejo Teico-Ptx. En este caso, el tamaño de partícula fue de 9 nm y el índice de polidispersidad fue de 0.003.
En la Figura 4, se muestran Resultados del análisis mediante DSL del complejo Teico-PTX-Alb. El tamaño de la partícula fue de 14,5 nm y la polidispersidad de 0,25. Este resultado muestra un aumento en su comparación con Teico y con el complejo Teico-Ptx.
Ejemplo 6
Microscopía electrónica de micelas de Teico, Teico-Ptx y Teico-Ptx-Alb Las micelas se prepararon de la manera que se describe en los ejemplos 1-3 y luego se montaron sobre grillas para su observación en el microscopio electrónico. Ver Figuras 5, 6 y 7.
En la Figura 5, se presenta una fotomicrografía electrónica a 150.000 x de las micelas de Teicoplanina sola.
En la Figura 6, se presenta una fotomicrografía electrónica a 250.000 x de las micelas del complejo Teicoplanina-Ptx . La barra negra representa 100 nm
En la Figura 7, se presenta una fotomicrografía electrónica a 250.000 x de las micelas del complejo Teicoplanina-Ptx- Albumina. La barra negra representa 100 nm

Claims

REIVINDICACIONES
1 - Una composición farmacéutica soluble en agua, caracterizada porque comprende, al menos, una sustancia terapéuticamente activa y, al menos, una sustancia con capacidad para formar micelas, en donde dicha al menos una sustancia terapéuticamente activa se selecciona entre las drogas con características hidrófobas para el tratamiento de pacientes oncológicos y en donde dicha al menos una sustancia con capacidad para formar micelas se selecciona entre los compuestos Teicoplanina, Dalbavancina y Oritavancina .
2 - Una composición farmacéutica soluble en agua, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque dichas drogas con características hidrófobas para el tratamiento de pacientes oncológicos se seleccionan entre las drogas antitumorales .
3 - Una composición farmacéutica soluble en agua, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque comprende al menos una droga antitumoral con características hidrófobas y al menos una sustancia con capacidad para formar micelas seleccionada entre los compuestos Teicoplanina, Dalbavancina y Oritavancina... en donde dichos compuestos se encuentran formando micelas y en donde dicha al menos una droga antitumoral con características hidrófobas se encuentra unida a la micelas de forma no covalente .
4 - Una composición farmacéutica soluble en agua de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una droga antitumoral con características hidrófobas y una sustancia con capacidad para formar micelas, en donde dicha droga antitumoral es Paclitaxel y en donde dicha sustancia con capacidad para formar micelas es la Teicoplanina.
5 - Una composición farmacéutica soluble en agua de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque comprende Paclitaxel y Teicoplanina en una relación molar de alrededor de entre 1:5 y 1:100.
6 - Una composición farmacéutica soluble en agua de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque comprende entre alrededor de 1 mg/ml y 10 mg/ml de Paclitaxel y entre 10 mg/ml y 200 mg/ml de Teicoplanina.
7 - Una composición farmacéutica soluble en agua de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende una droga antitumoral con características hidrófobas y una sustancia con capacidad para formar micelas, en donde dicha droga antitumoral es Docetaxel y en donde dicha sustancia con capacidad para formar micelas es la Teicoplanina.
8 - Una composición farmacéutica soluble en agua de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque comprende Docetaxel y Teicoplanina en una relación molar de alrededor de entre 1:5 y 1:100.
9 - Una composición farmacéutica soluble en agua de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque comprende entre alrededor de 1 mg/ml y 10 mg/ml de Docetaxel y entre 10 mg/ml y 200 mg/ml de Teicoplanina.
10 - Una composición farmacéutica soluble en agua de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es una composición inyectable estéril .
11. Una composición farmacéutica soluble en agua de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque es una composición liofilizada.
12 - Una composición farmacéutica soluble en agua, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque dicha composición liofilizada puede ser reconstituida con un disolvente seleccionado entre una solución de agua destilada, una solución salina (NaCl 0,9 %), una solución tampón salina de fosfato (PBS), agua destilada que contiene 5 % de dextrosa, una solución salina con dextrosa al 5% y una solución de albúmina humana al 20 %, para obtener una composición translúcida estéril.
13. Una composición farmacéutica soluble en agua de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque es una composición liquida.
14 - Una composición farmacéutica soluble en agua, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende micelas de un al menos un compuesto seleccionado como la Teicoplanina, en donde dichas micelas se encuentran cargadas con drogas antitumorales con características hidrófobas y en donde dichas micelas se encuentran recubiertas de forma no covalente con albúmina.
15 - Una composición farmacéutica soluble en agua, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque la albúmina se selecciona entre albúmina humana, albúmina humana recombinante, albúmina humana que contiene ácidos grasos y albúmina bovina.
16 - Una composición farmacéutica soluble en agua, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque la relación antibiótico : albúmina es de entre alrededor de 1:2 y alrededor de 1:4 (p/p) .
17 - Una composición farmacéutica soluble en agua, de acuerdo con la reivindicación 15, caracterizada porque la albúmina contiene ácido fólico acoplado covalentemente.
18 - Una composición farmacéutica soluble en agua, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque la cantidad de ácido fólico covalentemente unido a la albúmina varia entre alrededor de 1 y alrededor de 20% de la albúmina total.
19 - Una composición farmacéutica soluble en agua, liofilizada y estéril, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque una vez resuspendida en un disolvente seleccionado entre una solución de agua destilada, una solución salina (NaCl 0,9 %), una solución tampón salina de fosfato (PBS), agua destilada que contiene 5 % de dextrosa, una solución salina con dextrosa al 5% y una solución de albúmina humana al
20 %, permite obtener una concentración final que va desde 0,1 a 10 mg/ml de una droga antitumoral seleccionada entre Paclitaxel y Docetaxel. 20 - Una composición farmacéutica soluble en agua, liofilizada y estéril, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque una vez resuspendida en un disolvente seleccionado entre una solución de agua destilada, una solución salina (NaCl 0,9 %), una solución tampón salina de fosfato (PBS) , agua destilada que contiene 5 % de dextrosa, una solución salina con dextrosa al 5% y una solución de albúmina humana al 20 %, permite obtener una concentración final que va desde 1 a 10 mg/ml de una droga antitumoral seleccionada entre Paclitaxel y Docetaxel
21 - Una composición farmacéutica soluble en agua, liofilizada y estéril, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque una vez resuspendida en un disolvente seleccionado entre una solución de agua destilada, una solución salina (NaCl 0,9 %), una solución tampón salina de fosfato (PBS) , agua destilada que contiene 5 % de dextrosa, una solución salina con dextrosa al 5% y una solución de albúmina humana al 20 %, permite obtener una concentración final que va desde 5 a 10 mg/ml de una droga antitumoral seleccionada entre Paclitaxel y Docetaxel
22 - Una composición farmacéutica soluble en agua, liofilizada y estéril, de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada porque una vez disuelta tiene un pH que oscila entre 6 y 8.
23 - Una composición farmacéutica soluble en agua, liofilizada y estéril, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque una vez disuelta tiene un pH que oscila entre 6 y 7,5.
24. - Una composición farmacéutica soluble en agua, liofilizada y estéril, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque presenta un tamaño promedio menor a 200nm.
25. - Una composición farmacéutica soluble en agua, liofilizada y estéril, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque presenta un tamaño promedio de entre 5 nm y 80 nm.
26. - Una composición farmacéutica soluble en agua, liofilizada y estéril, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque presenta un tamaño promedio de entre alrededor de 5 nm y alrededor de 25 nm.
27 - Una composición farmacéutica soluble en agua, caracterizada porque comprende, al menos, una sustancia terapéuticamente activa y, al menos, una sustancia con capacidad para formar micelas, en donde dicha al menos una sustancia terapéuticamente activa se selecciona entre las drogas antimicóticascon características hidrófobas y en donde dicha al menos una sustancia con capacidad para formar micelas se selecciona entre los compuestos Teicoplanina, Dalbavancina y Oritavancina„
28 - Una composición farmacéutica soluble en agua, de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque dicha sustancia terapéuticamente activa seleccionada entre las drogas antimicóticas es la Anfotericina B y dicha al menos una sustancia con capacidad para formar micelas es la Teicoplanina.
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