WO2016114438A1 - 베체트병의 인간 세포 모델 및 이의 용도 - Google Patents

베체트병의 인간 세포 모델 및 이의 용도 Download PDF

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    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing induced pluri potent stem cells (iPSCs) derived from Behcet's disease patients and hematopoietic progenitor cells (HPCs) differentiated therefrom.
  • iPSCs induced pluri potent stem cells
  • HPCs hematopoietic progenitor cells
  • BD Behcet's disease
  • BD is a chronic, recurrent, systemic immune-related disease that affects arteries and veins of all sizes, causing symptoms and signals in a wide range of the body (Sakane et al. , 1999; Verity et al., 2003).
  • BD is now a global disease, but is more common in the Middle East, the Mediterranean, and Asia.
  • Some medications may help alleviate symptoms of BD or prevent complications in damaged organs, but to date there is no cure for BD. No accurate indicators or markers have been developed.
  • HSP-65 from microorganisms that reacts with human heat shock proteins (HSP) -60 is expected to respond to the activation of T cells. autoi ⁇ unity) (Ergun et al., 2001; Kaneko et al., 1997; Lehner, 1997).
  • IL interleukin
  • IL-10 Mizuki et al., 2010; Remmers et al., 2010
  • HLA human leukocyte antigen
  • B51 human leukocyte antigen -B51
  • MCP- mononuclear leukocyte chemotactic protein -Umonocyte chemoat tract ant protein-1
  • MCP- Hou et al. 2010
  • MIF migration inhibitory factor
  • miR-155 Zhou et al., 2014
  • T cell mediated immune response influenced by genetically intrinsic and extrinsic facilitation factors, is believed to play a critical role in the immune pathogenesis of BD.
  • Increasing the percentage of activated T is associated with BD's disease activity (Bank et al., 2003; Triolo et al., 2003), and neutrophil hyperact ivat ion is also associated with BD (Car let to et al., 1997; Eksioglu-Demiralp et al., 2001), I L-KHamzaoui et al.
  • Thl cytokines IL-12, IL-18, IFN
  • Th2 cytokine TL-4 IL-12, IL-18, IFN
  • Thl-related chemokine receptors including CXCR3 and CCR5
  • CXCR3 and CCR5 CXCR3 and CCR5
  • Thl7 cells producing pro-inflammatory cytokine IL-17 is higher in patients with activated BD compared to Thl cells (Hamzaoui, 2011), and also the inflammatory produced by Th22 cells in BD.
  • Stem cells are cells in the pre-differentiation stage of each cell constituting the tissue, which can be obtained from embryonic, fetal and adult tissues. Various organizations It refers to a cell with potential differentiation potential that can differentiate into cells.
  • Stem cells are differentiated into specific cells due to differentiation stimulation (environment), and unlike differentiated cells in which cell division is stopped, they can proliferate because they can self-renewal by cell division. It can be differentiated into other kinds of cells by different environment or differentiation stimulus, so it has plasticity in differentiation.
  • hPSCs Human pluri potent stem cells
  • iPSCs induced pluri otent stem cells
  • the in vitro differentiation system can produce tissue-specific differentiated cells having the same immunological and genetic characteristics as the patient, as well as the development of patient-specific cell therapy without immune rejection. It is known to be an effective evaluator for understanding the mechanisms of complex diseases during the early development of organogenesis (Muotri, AR (2009) Epilepsy Behav 14 Supl 1: 81-85; Marchetto, MC, B. Winner, et al. (2010) Hum Mol Genet 19 (R1): R71-76).
  • iPSCs from patients with various genetic diseases show disease-specific phenotypes when directly differentiated into disease-related cell types (Park, IH et al. Cell 134). , 877-886 (2008); Tiscornia, G. et al. Nature medicine 17, 1570-1576 (2011)). Because these disease-specific iPSCs can be differentiated into tissue cells that are directly related to the cause or damage of the disease, differentiated tissue-cells with disease characteristics can be used to study specific mechanisms or develop therapeutics to identify the cause of the disease. It can be useful.
  • Disease-specific biomarkers discovered using disease-specific iPSCs technology can be used as an indicator of disease characteristics, status or rate (Ziegler et al., 2012; Zineh and Huang, 2011), and their further development may contribute to broadening the availability of biological samples related to diseases including tissues, cells or biofluids.
  • Human primary cells derived from patients may be useful for the development of biomarkers, but they are generally difficult to obtain and have a limited lifespan in vitro.
  • human induced pluripotent stem cells (iPSCs) with excellent proliferation and differentiation potential have the potential to produce unlimited organ-specific progenitor cells and mature cells performing specific functions, thereby enabling a variety of technical applications.
  • iPSCs which can potentially present the patient's disease phenotype and clinical symptoms, provide distinct advantages in developing disease-specific biomarkers for diagnostic, prognostic, predictive and therapeutic uses. do. Therefore, the present inventors have endeavored to establish a human cell model for the study of Behcet's disease (BD) based on patient-derived iPSCs technology, resulting in the induction of pluri derived BD from fibroblasts of BD patients.
  • otent stem cells iPSCs
  • HPCs hematopoietic precursor cells
  • a disease model cell associated with Behcet's disease 8 genes (AGTR2, CA9, CD44) as candidates for BD biomarkers in comparative transcript analysis , CXCL1, HTN3, IL-2, PTGER4 and TSLP) were selected and confirmed that they exhibit distinct gene expression patterns that are differentiated compared to healthy controls, iPSCs from patients with other immune diseases such as rheumatoid arthritis and It was confirmed that the expression level is also distinguished from HPCs.
  • the BD-x-specific expression variation at the protein level was examined in the eight candidate gene groups, and it was confirmed that the increase in protein expression of CXCL1 is closely related to BD.
  • BD CXCL1 is a high-performance BD biomarker that confirms that CXCL1 protein secretion is specifically associated with BD in BD cell disease models such as patient-derived somatic cells, BD-iPSCs, BD-HPCs, and BD patient serum. It was confirmed that it can function as a BD-specific biomarker at both expression and protein expression levels.
  • 34 drug commercially available FDA-approved anti-inflammatory and immunosuppressive agents were tested for drug reaction. The utility of HPCs as a human cell disease model and the superiority of CXCL1 as a biomarker were verified in terms of selectivity, reproducibility and sensitivity.
  • BD disease model cells of the present invention patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) and iPSCs—using biomarker genes and proteins using BD-derived HPCs for diagnostic and drug screening methods of BD
  • iPSCs patient-derived induced pluripotent stem cells
  • iPSCs patient-derived induced pluripotent stem cells
  • iPSCs using biomarker genes and proteins using BD-derived HPCs for diagnostic and drug screening methods of BD
  • the present invention was completed by presenting a human cell model and a biomarker of BD, which can be usefully used for research on the cause of BD development and the development of therapeutic agents.
  • Non-Patent Document 2 Aktas Cetin, E. et al. , 2013.Rheumatol Int. 33: 733 ⁇ 741.
  • Non-Patent Document 3 Ben Ahmed et al., 2004. Arthritis Rheum. 50: 2291-2295.
  • Non-Patent Document 4 Davatchi, F. 2012. Pathol og Res Int. 2012: 607921.
  • Non-Patent Document 5 Durante, W. et al. , 1994. Thromb Res. 75: 63-71.
  • Non-Patent Document 6 Evereklioghi, C. et al. , 2002. Mediators Inflamm. 11: 87-93.
  • Non-Patent Document 7 Firestein, G.S. 2003. Nature. 423: 356-361.
  • Non-Patent Document 8 Frassanito, M.A. et al., 1999. Arthritis Rheum. 2: 1967-1974.
  • Non-Patent Document 9 Hamzaoui,. 2011. Clin Exp Rheumatol. 29: S71-76.
  • Non-Patent Document 10 Houman, H. et al. , 2004. J Autoimmun. He 273.
  • Non-Patent Document 12 Leek, R.D. . et al 1994. J Leukoc Biol. 56: 423-435.
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  • Non-Patent Document 14 0'Neill, T.W. et al. , 1994. Br J Rheumatol. 33: 115-117
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  • Non-Patent Document 16 Salvigiotto, G. et al., 2011. PLoS One. 6: el7829.
  • Non-Patent Document 17 Son, M.Y. et al. , 2013. Stem Cells. 31: 2374-2387.
  • Non-Patent Document 18 Son, M.Y. et al. , 2011a. PLoS One. 6: el9134.
  • Non-Patent Document 19 Son, M.Y. et al. , 2011b. J Cell Mol Med. 15: 152-165.
  • Non-Patent Document 20 Son, M.Y. et al. , 2014. Hum Mol Genet. 23: 1802-1816.
  • Non-Patent Document 21 Sugita, S., et al., 2013. J Immunol. 190: 5799-5808.
  • Non-Patent Document 22 Tanaka, T. et al., 2012. Blood. 120: 1299-1308.
  • Non-Patent Document 23 Vaccar ino, L. et al., 2013. Biochem Genet.
  • Non-Patent Document 24 Verity, D.H. et al. , 2003. Br J Ophthalmol
  • Non-Patent Document 25 Zhou, Z.Y. et al. , 2012. Autoimmun Rev. 11: 699-704.
  • Non-Patent Document 26 Ziegler, A. et al. , 2012. Hum Genet. 131: 1627-1638.
  • Non-Patent Document 27 Zineh, I., and S.M. Huang. 2011. Biomark Med. 5: 705-713.
  • An object of the present invention is to develop a human cell model that can directly reflect the disease characteristics of patients with Behcet's disease (BD) using induced pluri otent stem cells (iPSCs) technology. To provide.
  • BD Behcet's disease
  • iPSCs induced pluri otent stem cells
  • the present invention provides a model of induced pluripotent stem cells (iPSCs) of Behcet's disease (BD) characterized in any one or more of the following i) to iii).
  • iPSCs induced pluripotent stem cells
  • BD Behcet's disease
  • iPSCs form of normal cells
  • pi uri potency marker proteins including 0CT4, NANOG, TRA-1-60 and SSEA;
  • pluripotency marker gene mRNA including 0CT4, S0X2, NANOG and REX.
  • ii) providing a method for producing a Behcet's disease iPSCs model in vitro, comprising obtaining iPSCs derived in step i).
  • the present invention also provides a model of hematopoietic progenitor cells (HPCs) of Behcet's disease characterized by any one or more of the following i) to vi):
  • HPCs hematopoietic progenitor cells
  • hematopoietic marker expression including CD43 and CD45;
  • hematopoietic marker gene expression including SCL, GATAl, GATA2, KDR, CD34, CD43, and CD45;
  • pro-inflammatory cytokines comprising IL-6, IL-8 and TNFa compared to normal cells
  • hematopoietic cells of iPSCs prepared in step 0 hematopoietic progenitor cells (HPCs);
  • iii) providing a method for producing a Behcet's disease hematopoietic progenitor cell model in vitro, comprising obtaining HPCs derived in step ii).
  • ii) a method of using iPSCs or hematopoietic progenitor cells as a model of Behcet's disease, comprising analyzing the characteristics of the embryoid body differentiation markers or hematopoietic progenitor cells induced in step i).
  • the present invention is a kit for diagnosing Behcet's disease (BD), comprising one or more of the following genes or primer pairs that specifically amplify the following genes:
  • An angiotensin II receptor, type 2 (AGTR) gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
  • a carbonic anhydrase IX (CA9) gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
  • the CD44 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3;
  • HTN3 statin 3 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4;
  • PTGER4 prostaglandin E receptor 4, subtype EP4 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5;
  • TSLP thymic stromal lymphopoiet in gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 is provided.
  • the present invention comprises one or more of the following proteins or antibodies specifically binding to the following proteins, Behcet's disease diagnostic kit:
  • AGTR2 angiotensin II receptor, type 2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
  • a carbonic anhydrase IX (CA9) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • CD44 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;
  • HTN3 histatin 3 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • PTGER4 pros tag land in E receptor 4, subtype EP4 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13
  • HTN3 histatin 3 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • PTGER4 pros tag land in E receptor 4, subtype EP4 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13
  • HTN3 histatin 3 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • PTGER4 pros tag land in E receptor 4, subtype EP4
  • TSLP thymic stromal lymphopoietin
  • step iii) determining that the subject is at risk of Behcet's disease or at risk of Behcet's disease if the expression level of the gene or protein analyzed in step ii) is increased compared to a normal control group; How to provide information for diagnosis of medical conditions
  • step ⁇ screening a test substance whose level of gene or protein analyzed in step ⁇ ) decreases as compared to the untreated control group.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing Behcet's disease (BD), which comprises one or more of the following genes or primer pairs that specifically amplify the following genes:
  • An angiotensin II receptor, type 2 (AGTR) gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
  • a carbonic anhydrase IX (CA9) gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
  • the CD44 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3;
  • HTN3 histatin 3 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4;
  • PTGER4 prostaglandin E receptor 4, subtype EP4 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5;
  • TSLP thymic stromal lymphopoiet in
  • the present invention comprises one or more of the following proteins or antibodies specifically binding to the following proteins, the use of the kit for diagnosing Behcet's disease:
  • AGTR2 angiotensin II receptor, type 2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
  • a carbonic anhydrase IX (CA9) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10;
  • CD44 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;
  • HTN3 histatin 3 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • PTGER4 prostag Iandin E receptor 4, subtype EP4 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13
  • HTN3 histatin 3 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • PTGER4 prostag Iandin E receptor 4, subtype EP4 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13
  • HTN3 histatin 3 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • PTGER4 prostag Iandin E receptor 4, subtype EP4
  • TSLP thymic stromal lymphopoiet in
  • iPSCs Induced luri potent stem cells
  • BD Behcet's disease
  • HPCs hematopoietic progenitor cells that reproduce the characteristics of the disease appearing in BD patients
  • HPCs hematopoietic progenitor cells that reproduce the characteristics of the disease appearing in BD patients
  • the BD human cell model of the present invention is a pathogenesis mechanism of BD. It can be usefully used for analytical research and therapeutic research.
  • iPSCs induced pluri potent stem cells
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a process for producing iPSCs derived from BD.
  • FIG. 3A is a diagram confirming colony morphology and pluripotency marker expression of BD-iPSCs
  • Figure 3b is a comparison of karyotypes of 1? ⁇ 3 (control-3) and BD-iPSCs from healthy controls;
  • 3C is a diagram quantitatively confirming the expression of pluripotency marker genes of BD-derived iPSCs
  • 3D is a diagram confirming the expression of the trioderm differentiation-specific marker gene of the embryoid body (EB) differentiated from BD-iPSCs in vitro;
  • Figure 3e is a diagram confirming the pluripotency by inducing teratoma generation from BD-iPSCs in vivo.
  • HPCs hematopoietic progenitor cells
  • 4A is a schematic diagram showing the process of differentiating BD-HPCs from BD-iPSCs.
  • Figure 4b is a diagram confirming the ratio of CD43 and CD45 positive cells to select differentiated BD-HPCs.
  • Figure 5a is a diagram confirming the expression of hematopoietic marker genes in somatic cells, iPSCs and HPCs from control and BD patients;
  • 5B is a diagram confirming the possibility of differentiation of BD-iPSCs-derived HPCs into hematopoietic lineage cells through cell colonization analysis.
  • FIG. 5C shows IL-6, IL-8, TNF ⁇ , and INFy of HPCs derived from BD-iPSCs This figure confirms the secretion level of pro-inflammatory cytokines.
  • FIG. 6 is a diagram showing Behcet's disease biomarker gene selection by analyzing gene expression patterns in iPSCs and HPCs derived from BD patients;
  • 6A is a schematic diagram illustrating a process for selecting BD specific genes as BD biomarkers from HPCs from BD patients;
  • Figure 6b is a microarray analysis showing the overall gene expression of somatic cells, iPSCs and HPCs derived from BD patients;
  • 6C is a diagram showing KEGG pathway analysis confirming biological pathways exhibiting synergistic expression in BD-HPCs.
  • 6D is a diagram comparing expression levels of 217 genes selected as genes encoding cytokines and chemokines from BD-HPCs with HPCs derived from the control group.
  • FIG. 7 shows a microarray analysis comparing gene expression levels of cytokines and chemokines in somatic cells, iPSCs, and HPCs from BD patients compared to controls.
  • Figure 8 shows the results of the principal component analysis (Pr inc ipal component analysi s, PCA) to confirm the gene expression patterns of cells derived from BD and Rheumatoid arthritis (RA) patients.
  • Figure 9a is a diagram showing the change in the overall gene expression pattern in BD-HPCs with or without predni solone (PreD) or hydroxychloroquine sul fate (HCQ);
  • 9B is a diagram confirming cytotoxicity against BD-HPCs according to the PRED or HCQ treatment concentration
  • Figure 9c is a diagram confirming whether the morphology of the cell colonies for BD-HPCs with or without PRED or HCQ treatment;
  • Figure 9d is a diagram confirming the change in the degree of gene expression of biological processes in BD-HPCs with or without PRED or HCQ treatment
  • Figure 9e is a diagram confirming the change in the degree of gene expression having molecular function in BD-HPCs with or without PRED or HCQ treatment
  • Figure 9d is a diagram confirming the change in the degree of gene expression of biological processes in BD-HPCs with or without PRED or HCQ treatment
  • Figure 9e is a diagram confirming the change in the degree of gene expression having molecular function in BD-HPCs with or without PRED or HCQ treatment
  • 9F confirms similar expression changes of up-regulated anti-inflammatory cytokine and chemokine genes in BD-HPCs for PRED or HCQ treatment.
  • FIG. 10A shows gene expression changes in BD-HPCs with or without PRED or HCQ treatment for 8 genes of AGTR2, CA9, CD44, CXCL1, HTN3, IL-2, PTGER4 and TSLP selected as BD biomarker candidate genes. Comparisons made through microarray analysis; And
  • 10B is a quantitative comparison of gene expression changes in BD-HPCs with or without PRED or HCQ treatment in BD biomarker candidate genes.
  • FIG. 11 is a diagram confirming the application of the BD-HPCs in a diagnostic method using a BD biomarker
  • 11A is a diagram confirming CXCL1 protein concentration in culture supernatant of HPCs from independent BD patients;
  • Lib is a diagram confirming the concentration of CXCL1 protein in the culture supernatant of HPCs derived from somatic cells obtained from each of three BD patients;
  • 11C shows the concentration of CXCL1 protein in culture supernatants of somatic cells and iPSCs from BD patients
  • Figure lid is a quantitative comparison of the expression levels of the CXCL1 gene in other cells such as hepatocytes (endoderm), cardiomyocytes (mesoderm) and neural precursors (ectoderm) differentiated from BEHPSCs; And
  • Figure lie is a comparison of CXCL1 protein concentrations in the culture supernatants of other cells such as hepatocytes (endoderm), cardiomyocytes (mesoderm) and neural precursors (ectoderm) differentiated from BD-iPSCs.
  • FIG. 12 shows the concentrations of CXCL1 and IL-6 proteins in serum samples obtained from control and BD patients.
  • FIG. 13 is a diagram confirming whether or not BD-HPCs are applied to drug screening using BD biomarkers; FIG.
  • Figure 13a is a diagram confirming the change in the concentration of IL-6 in the BD-HPCs culture supernatant when treated with 34 FOA approved drugs.
  • Figure 13b is a diagram showing the change in concentration of CXCL1 in the supernatant of BD-HPCs culture when treated with 34 FDA approved drugs.
  • the present invention provides a model of induced phiripotent stem cells (iPSCs) of Behcet's disease (BD) characterized in any one or more of the following i) to Hi):
  • iPSCs induced phiripotent stem cells
  • BD Behcet's disease
  • iPSCs form of normal cells
  • pi uri potency marker proteins including 0CT4, NANOG, TRA-1-60 and SSEA;
  • pluripotency marker gene mRNA including 0CT4 'S0X2, NAN0G and REX.
  • the present inventors screened BD patients and healthy controls (see Table 1) and produced iPSCs (BD-iPSCs) having pluripotency from somatic cells of fibroblasts isolated therefrom (FIG. 1). 1 and 2), BD-iPSCs are genetically identical to BD patients (see Table 2) and exhibit colony morphology and karyotype similar to normal embryonic stem cells (hESCs) (see FIGS. 3A and 3B) , BD -iPSCs ⁇ It was confirmed that it has pluripotency in vitro (in vitro) and in vivo (see Figure 3).
  • the iPSCs model derived from BD of the present invention exhibits pluripotency while maintaining the same characteristics as the cells of a BD patient, and thus the iPSCs model can be usefully used for analytical research for the neural development of BD.
  • the present invention
  • ii) providing a method for producing a Behcet's disease iPSCs model in vitro, comprising obtaining iPSCs derived in step i).
  • Induction of the step i) is characterized in that it uses the ectopic expression of the pluripotent markers (ectopic expression), specifically, the ectopic expression is a reprogramming factor (reprogramming factor) 0CT4, S0X2 , Using a retrovirus containing C-MYC and KLF4 (Son MY et. Al. Stem cells 31, 2374-2387; 2013) or through transformation of an episomal vector expressing the reprogramming factor Any method known in the art for producing iPSCs, including methods, may be used.
  • reprogramming factor 0CT4, S0X2
  • the present invention also provides a model of hematopoietic progenitor cells (HPCs) of Behcet's disease characterized by any one or more of the following i) to vi).
  • HPCs hematopoietic progenitor cells
  • hematopoietic marker expression including CD43 and CD45;
  • hematopoietic marker gene expression including SCL, GATA1, GATA2, KDR, CD34, CD43, and CD45;
  • pro-inflammatory cytokines comprising IL-6, IL-8 and TNFa compared to normal cells
  • HPCs differentiated from BD-iPSCs are CD43 and CD45 positive cells (see Figure 4b), express hematopoietic marker gene expression, BFU-E (erythroid cells; erythroid cel ls), CFU-G (granulocytes; granulocytes), CFU-M (Macrophages; macrophages) and CFU-GMs (granular leukocytes, macrophages) were confirmed to differentiate into multi- lineage hematopoietic cells (see FIG. 5).
  • BFU-E erythroid cells; erythroid cel ls
  • CFU-G granulocytes; granulocytes
  • CFU-M Macrophages; macrophages
  • CFU-GMs granular leukocytes, macrophages
  • cytokines IL-6, IL-8, TNF a and INF y that have been reported to have increased secretion levels in BD patients to determine whether representative phenotypes in BD can be expressed in BD-HPCs.
  • the secretion level of pre-inflammatory cytokines including, the secretion level of IL-6 IL-8 and TNF a is increased in BI) -HPCs compared to the normal control group (see FIG.
  • the pathological symptoms of BD can be significantly expressed in HPCs derived from BD-iPSCs, confirming that BD-iPSCs can be used as a model of Behcet's disease.
  • hematopoietic progenitor cells differentiated from iPSCs derived from BD patients of the present invention have differentiation capacity as hematopoietic progenitor cells, and can effectively confirm the increased secretion level of inflammatory Yolkukine in BD patients. It can be usefully used as a human-derived cell model for the onset research of In addition, the present invention
  • ii) inducing iPSCs produced in step i) into hematopoietic progenitor cells; And iii) obtaining HPCs derived in step ⁇ ).
  • a method for producing a Behcet's disease hematopoietic progenitor cell model in vitro is provided.
  • Induction of the step i) is preferably characterized by using ectopic expression of the pluripotent marker (pluripotent marker), specifically, the ectopic expression is a reprogramming factor (reprograging factor) 0CT4, Transformation using a retrovirus comprising SOx2, C-MYC and KLF4 (Son MY et. Al, Stem cells 31, 2374-2387; 2013) or transformation of an episomal vector expressing the reprogramming factor Any method known in the art for producing iPSCs, including methods, may be used.
  • reprogramming factor reprograging factor
  • hematopoietic progenitor cells differentiated from iPSCs derived from BD patients of the present invention have differentiation capacity as hematopoietic progenitor cells, and can effectively confirm the increased secretion of inflammatory-chitocaine in BD patients
  • a method of producing the hematopoietic progenitor cell model May be usefully used as a human-derived cell model for the study of the development of BD.
  • ii) a method of using iPSCs or hematopoietic progenitor cells as a model of Behcet's disease, comprising analyzing the characteristic of differentiation markers or hematopoietic progenitor cells of the embryoid body induced in step i).
  • the differentiation markers of the embryoid body are ectoderm markers NESTIN and TUJ1, endoderm markers S0X17 and F0XA2, and mesoderm markers alpha-smooth muscle actin ( ⁇ -SMA) and It is preferable to express any one or more of DESMIN, but is not limited thereto.
  • the hematopoietic progenitor cells are preferably characterized by any one of the following i) to vi), but are not limited thereto:
  • hematopoietic marker expression including CD43 and CD45;
  • hematopoietic markers including SCL, GATA1, GATA2, KDR, CD34, CD43 and CD45 Gene expression;
  • pro-inflammatory cytokines comprising IL-6, IL-8 and TNF a compared to normal cells
  • the present inventors to select a gene that shows a difference when the genes expressed in somatic cells, iPSCs and HPCs differentiated from BD patients compared to the gene expression pattern of normal cells, Comparison of gene expression levels of normal cells and BD patient-derived cells by microarray analysis (see FIG. 6A) showed no significant difference in expression between BD-derived fibroblasts and iPSCs, whereas normal controls in BD-HPCs. Genes encoding 217 cytokines, chemokines and their receptor families were selected as genes with an expression level that is 1.7 times higher than that (see FIG. 6).
  • BD-HPCs showed the same characteristics, whereas cytokines containing IL-6, IL-8 and TNF ⁇ in BD-HPCs.
  • chemokines containing IL-6, IL-8 and TNF ⁇ in BD-HPCs since the degree of gene expression of chemokines did not change (see FIG. 7), from Rheumatoid arthr itis (RA) patients reported to have symptoms similar to BD in order to further select novel genes associated with BD patients. IPSCs and HPCs were derived and compared with BD-HPCs. As a result, only cytokine and chemokine-related genes out of 217 genes were regulated in BD-HPCs and RA-HPCs.
  • predni solone PreD
  • HCQ hydroxychloroquine sul fate
  • the BD-HPCs showed higher expression level than the normal control group, but the expression level decreased to the normal level after drug treatment as AGTR2, CA9, CD44, Eight genes of CXCL1, HTN3, IL-2, PTGER4 and TSLP were selected (see Figures 9 and 10).
  • the present inventors confirmed the protein expression level and gene expression level distributed in the culture medium for CXCL1, in order to confirm whether the BD-specific biomarker selected as a BD indicator can be measured in serum tissues and cell samples.
  • BD-HPCs showed significant increases in protein secretion and gene expression levels compared to normal controls, and the increase in CXCL1 secretion levels in BD-HPCs was significantly higher than in somatic cells or BD-iPSCs in BD patients. It was confirmed that the difference was shown (see FIGS. 11 and 12).
  • iPSCs derived from BD patients and differentiated hematopoietic progenitor cells from BD patients of the present invention not only maintain similar gene expression patterns in BD patients, but also change in gene expression and inflammatory-cytokine secretion levels for drugs.
  • iPSCs derived from BD patients and hematopoietic progenitor cells differentiated therefrom are useful as cell models of the diagnostic and therapeutic screening methods for BD, and CXCL1 can be usefully used as a biomarker.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing Behcet's disease (Behcet's di sease, BD) comprising one or more of the following genes or primer pairs that specifically amplify the following genes.
  • the present invention specifically to amplify the following gene or the following gene Provided is the use of a diagnostic kit for Behcet's disease (BD), comprising one or more primer pairs.
  • BD Behcet's disease
  • AGTR2 angiotensin I I receptor, type 2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1;
  • a carboni c anhydrase IX (CA9) gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2;
  • CD44 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3;
  • HTN3 stat in 3 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4;
  • PTGER4 pros tag land in E receptor 4, subtype EP4 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5;
  • TSLP thymi c stromal lymphopoiet in) gene consisting of a cheap sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the kit for diagnosing Behcet's disease of the present invention may further include one or two or more primer pairs which specifically amplify the following genes, but is not limited thereto:
  • CXCL1 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7;
  • IL-2 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8.
  • Behcet's disease biomarker of the present invention not only exhibits significantly increased expression levels in the Behcet's disease cell model, but also decreases the expression levels to normal cell levels when treated with BD therapies.
  • the biomarker gene may be usefully used in a diagnosis kit for Behcet's disease because it exhibits more sensitive sensitivity than IL-6, which is used as an E. Behcet's disease biomarker.
  • the agent for analyzing the expression level of the Behcet's disease biomarker gene is a primer, a probe or an antisense nucleotide which binds to the gene, and specifically amplifies a specific region of the gene.
  • the kit for diagnosing Behcet's disease includes RT-PCR kits, competitive PCR kits, real-time PCR kits, and RNase protection assays.
  • RNase protect ion assay (RPA) kit, Northern blot ting kit or DNA chip kit can be used in the form of, but not limited to, those skilled in the art It can be made through all known methods.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing Behcet's disease, characterized in that it comprises one or more than one of the following proteins or antibodies specifically binding to the following proteins.
  • the present invention provides a use of the kit for diagnosing Behcet's disease, which comprises one or more of the following proteins or antibodies specifically binding to the following proteins.
  • An AGTR2 angiotensin I I receptor, type 2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9;
  • a carbonic anhydrase IX (CA9) protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10;
  • CD44 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;
  • HTN3 stat in 3 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12
  • PTGER4 prostaglandin E receptor 4, subtype EP4 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID 13;
  • TSLP thymi c stromal lymphopoiet in protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14.
  • the diagnostic kit for Behcet's disease of the present invention may further include one or two or more of the following proteins or antibodies specifically binding to the following proteins, but is not limited thereto:
  • CXCL1 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15;
  • IL-2 protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID 16.
  • Behcet's disease biomarker of the present invention not only exhibits significantly increased secretion levels in the Behcet's disease cell model, but also decreases the secretion levels to normal cell levels when treated with BD therapies.
  • the biomarker protein may be usefully used in a diagnosis kit for Behcet's disease because it shows a more sensitive sensitivity than IL-6, which is used as an E. Behcet's disease biomarker.
  • the kit for diagnosing Behcet's disease of the present invention is in the form of an ELISA (Enzyme-l inked i® nosorbent assay) kit, a sandwich ELISA kit, a protein chip kit, a rapid kit, or a MRKMul t iple react ion moni tor ing (KIT) kit.
  • ELISA Enzyme-l inked i® nosorbent assay
  • sandwich ELISA kit a sandwich ELISA kit
  • a protein chip kit a rapid kit
  • KIT MRKMul t iple react ion moni tor ing
  • the antibody may include both a polyclonal antibody and a monoclonal antibody.
  • Polyclonal antibodies can be prepared by injecting the protein or fragment thereof into an external host with an ant igen according to conventional methods known to those skilled in the art.
  • external hosts include mammals such as mice, rats, sheep, and rabbits.
  • Immunogens are generally administered by intramuscular, intraperitoneal, or subcutaneous injection with an adjuvant to increase antigenicity. Is administered to immunize an external host. Serum may be collected from an immunized external host at regular intervals to collect serum showing enhanced titers and specificity for antigens or to isolate and purify antibodies therefrom to produce polyclonal antibodies specific for the Behcet's disease biomarker protein of the present invention. have.
  • Monoclonal antibodies can be prepared using methods of producing immortalized cell lines by fus i on (Kohler G et al., Nature, 256: 495-497, 1975). Briefly describing the method, first, the pure Bechett bottle of the present invention Biomarker Proteins Mice are immunized with proteins or fragments thereof, or peptides thereof are synthesized and combined with bovine serum albumin to immunize mice. Antibody-producing B lymphocytes isolated from immunized mice are fused with myeloma cells of human or mouse to produce immortalized hybridoma cells.
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • a functional fragment of an antibody molecule means a fragment having at least antigen binding capacity, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2, and Fv.
  • the antibody that can specifically bind to the Behcet's disease biomarker protein or fragment thereof of the present invention can be bound to a sol id substrate to facilitate subsequent steps such as washing or separating the complex.
  • Solid substrates include, for example, well plates made of synthetic resin, nitrocellulose, glass substrates, metal substrates, glass fibers, microspheres and microbeads.
  • the synthetic resins include polyester, polyvinyl, polyvinyl chloride, polystyrene, polypropylene PVDF and nylon.
  • the sample when a sample obtained from an individual is contacted with an antibody capable of specifically binding to the Behcet's disease biomarker protein or fragment thereof of the present invention bound to a solid substrate, the sample may be diluted to a suitable degree prior to contact with the antibody. .
  • the kit may further comprise a detector that specifically binds to an antibody capable of specifically binding to the Behcet's disease biomarker protein or fragment thereof of the present invention.
  • the detector may be a conjugate labeled with a chromophore, a fluorescent substance, a radioisotope or a colloid, and preferably It will be a secondary antibody that can specifically bind to an antibody that can specifically bind to the Behcet's disease biomarker protein or fragment thereof.
  • the chromase may be peroxidase, alkaline phosphatase or acid phosphatase (eg horseradi sh peroxidase);
  • fluorescent materials colloidal gold, fluorescein carboxylic acid (FCA), poloresin isothiocyanate (FITC), Rhodamine-Bi sothiocyanate (RITC), fluorescein thiourea (FTH), 7- Aceoxycoumarin-3-yl, fluorescein-5-yl, fluorescein-6-yl, 2 ', 7'-dichlorofluorescin-5-yl, 2', 7'-dichlorofluorescein- 6-yl, dihydrotetramethyllosamine-4-yl, tetramethyldamine-5-yl, tetramethyldamine-6-yl,
  • the kit can diagnose MCI by measuring the antigen antibody response of the antigen-antibody complex or by measuring the amount of the detector after treating the antigen-antibody complex.
  • As the antigenic antibody reaction enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation, fluorescence immunoassay, enzyme substrate coloration, antigen antibody coagulation, etc. can be performed. It can be through luminescence, absorbance, reflection or transmission.
  • HTS high throughput screening
  • a fluorescence method performed by detecting a fluorescence by attaching a fluorescent material to the sensitizer or a radiation method performed by detecting a radiation by attaching a radioisotope to the detector
  • SPR (surface plasmon resonance) method or SPR system to measure the change in polarosmon resonance on the surface in real time without labeling the detector It is preferable to use an SPRK surface plasmon resonance imaging method for imaging but not limited thereto.
  • the substrate that induces color development may be selected and used according to chromosome enzymes, and TMB (3, 3 ', 5, 5' -tetramethyl bezidine), ABTS [2, 2 '-azin, Ms ' (3 — Ethylbenzothiazol ine ⁇ 6—sul fonic acid), or OPD (o—phenyl enedi amine).
  • TMB 3, 3 ', 5, 5' -tetramethyl bezidine
  • ABTS 2, 2 '-azin, Ms ' (3 — Ethylbenzothiazol ine ⁇ 6—sul fonic acid
  • OPD o—phenyl enedi amine
  • a chromogenic substrate such as TMB is decomposed by the chromophore bound to the detector to generate a chromosome deposit and detect the presence or absence of Behcet's disease biomarker protein protein of the present invention by visually confirming the deposition degree of the chromosome deposit.
  • the fluorescence method is a method of spotting a detector labeled with the fluorescent material using a fluorescence scanner program to confirm a signal, and applying the method to confirm the degree of binding.
  • the SPR system can analyze the binding degree of the antibody in real time without labeling the sample with a fluorescent material, but has the disadvantage that simultaneous sample analysis is impossible. In the case of SPRI, it is possible to analyze multiple samples simultaneously using a microalignment method, but it has a disadvantage of low detection intensity.
  • the kit may further include a wash solution for removing the remaining substances after the antigen-binding reaction and the reaction of the detection.
  • the wash solution preferably comprises a phosphate complete solution, NaCl and Tween 20, more preferably a buffer solution (PBST) consisting of 0.02 M phosphate buffer, 0.13 M NaCK and 0.05% Tween 20. However, it is not limited thereto.
  • PBST buffer solution
  • the washing solution reacts the antibody to the antigen-antibody conjugate, and then washes 3 to 6 times by adding an appropriate amount to the fixed body.
  • the reaction solution is preferably sulfuric acid solution (H 2 SO 4), but is not limited thereto.
  • the kit may further include a positive control comprising the Behcet's disease biomarker protein standard antigen of the present invention and a negative control comprising the antiserum of the animal not injected with the antigen.
  • Behcet's disease biomarker protein expression level measurement of the present invention is a protein Chip analysis, immunoassay, ligand binding assay, Matrix Desorpt ion / Ionizat ion Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF) analysis, Su If ace Enhanced Laser Desorpt ion / Ionizat ion Time of Flight Mass Spectrometry (SELD I ⁇ TOF) Analysis, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, complement fixation, two-dimensional electrophoresis, liquid chromatography-mass spectrometry, IX ⁇ MS), LC-MS / MS (1 i quid chromatography ⁇ Mass
  • Behcet's disease biomarker of the present invention exhibits a significantly increased secretion level in the Behcet's disease cell model, and is significantly more sensitive than IL-6, which is previously used as a Behcet's disease biomarker. Genes and proteins can be usefully used for the diagnosis of Behcet's disease.
  • the present invention can be usefully used for the diagnosis of Behcet's disease.
  • the Behcet's disease biomarker of the present invention decreases the expression level to the level of normal cells in the Behcet disease cell model treated with Behcet's disease, it shows a significant sensitivity than IL-6, which is conventionally used as Behcet's disease Baomarker.
  • Behcet's disease biomarker genes and proteins of the present invention can be usefully used in screening methods for candidate drugs for treatment of Behcet's disease.
  • the present invention will be described in detail by way of examples.
  • BD patients and healthy controls were selected and somatic cells were obtained from them.
  • biopsy was performed from 2 BD female patients (mean age: 39 ⁇ 1, 1) and 2 healthy controls (mean age: 61 ⁇ 10 years) to derive fibroblasts (Dermal fibroblast, DF) and synovial cells (SNC) were isolated.
  • Blood samples were obtained from a BD patient group (mean age: 46.8 ⁇ 9.3 years) and a healthy control group (mean age: 55.0 ⁇ 3.8 years) consisting of a total of seven men and four women. Their diagnosis was based on the diagnostic criteria of the International Research Group for Behcet's Disease (O'Neill, TW et al., 1994. Br J Rheumatol. 33: 115-117.).
  • all studies were conducted by the National Bioethics Review Board (Korea National). I Inst itute for Bioethics Pol icy; KoNIBP) (IRB no. P01-201404-BS-05).
  • BD patients and healthy controls were selected as described in Table 1 below, from which synovial cells (SNC) or dermal fibroblasts (DF) were obtained as somatic cells.
  • SNC synovial cells
  • DF dermal fibroblasts
  • BD ⁇ iPSCs Preparation of iPSCs (BD ⁇ iPSCs) of BD-derived ""
  • the 0CT4, S0X2, C-MYC and KLF4 Reprogramming cultures using expressing retroviruses produced iPSCs (BD-iPSCs) with pluripotency from BD patient somatic cells (FIG. 2).
  • the transfected cells contained 20% knockout SR (Invitrogen, USA), 1% non-essential amino acids (NEAA; Invitrogen, USA), 1 mM L-glutamine (L-glutamine; Invitrogen, USA), DMEM / F12 medium (Invitrogen, USA) containing 0.1 mM beta-mergatoethane ( ⁇ -mercaptoethanol; Sigma, USA) and 10 ng / H FGF2 (bFGF; Invitrogen, USA) Human iPSCs medium consisting of) was cultured with daily change. Two or three weeks after the start of the culture, iPSCs colonies were obtained similar to human embryonic stem cells (hESCs).
  • hESCs human embryonic stem cells
  • BD-iPSCs Obtained BD-derived iPSCs
  • human iPSCs medium As previously known, or by mTeSRl (StMCELL Techno 1 og ies, Canada) or Matrigel of MEF-conditioned medium.
  • mTeSRl Stem Cell Techno 1 og ies, Canada
  • Matrigel of MEF-conditioned medium BD biosciences, USA, USA
  • healthy SNC or DF cells were induced in the production of control iPSCs by the same method as described above, and a human embryonic stem cell line (hESC line) H9 cell line (WiCell Research Insititute, USA) was used.
  • hESC line human embryonic stem cell line
  • BI-iPSCs colony morphology and karyotype of BD-iPSCs were confirmed, and short tandem repeat (STR) analysis was performed. Specifically, the reprogramming of BE) BEiPSCs was induced in the same manner as in Example ⁇ 1-2>, followed by phase-contrast microscopy. The morphology of the colonies of BD-iPSCs was identified. In addition, karyotyping was performed through a standard chromosomal G-banding analysi s by GenDix Inc. (Korea). In addition, STR genotyping of control -iPSCs and BD-iPSCs was performed by HumanPass Inc. (HumanPass Inc., Korea) and compared with H9 hESCs, a normal human embryonic stem cell line.
  • HumanPass Inc. HumanPass Inc., Korea
  • a citric acid-acetone-formaldehyde solution was prepared using an AP staining kit (Alkaline phosphatase kit, Sigma Aldrich, USA) to BD-iPSCs prepared in Example ⁇ 1-2>. After fixing by addition, the nap was stained by adding an AP staining solution containing Naphthol / Fast Red violet and standing at room temperature for 15 minutes. After staining, the cell images were taken using a phase contrast microscope (Model name: 1 ⁇ 51; Olympus, Japan).
  • BD-iPSCs were confirmed to be positively stained in AP, a pluripotency marker (Fig. 3a).
  • Example ⁇ 1-2> 4% formaldehyde (formaldehyde) was treated in BEHPSCs prepared in Example ⁇ 1-2> and fixed at room temperature for 20 minutes, and a PBS solution containing 0.1% Triton X-OO (tritonX-lOO) was prepared. Permeability was imparted to the cell membrane by treatment for 20 minutes. After treatment, the treated cells were blocked with 2% bovine serum albumin (BSA) for 1 hour and then the anti-0CT4 antibody (1: 200 dilution, sc-9081, Santa) was used as the primary antibody.
  • BSA bovine serum albumin
  • BD-iPSCs After standing, it was finally washed again with PBST to immunofluorescein the BD-iPSCs, followed by a fluorescence microscope (Product name: Ax i overt 200M microscope; Carl Zeiss, Germany) or a phase contrast microscope (Olympus, Japan). Observation confirmed the expression of 0CT4, NANOG, TRA-1-60 and SSEA4 proteins.
  • 4'6-diamidino-2-phenylindole 4'6-diamidir-2-phenylindole, DAPI was treated to stain the nuclei of cells and compared.
  • qRT-PCR quantitative real-time PCRC Quantitative real-time PCR
  • BD-iPSCs were prepared by performing the method of Example ⁇ 1-2>, and then RNA was extracted from BD-iPSCs following the manufacturer's protocol using the RNeasy mini kit (Qiagen, USA). It was. Extracted RNA 1 to 2 / g as a template, using a Superscript III cDNA synthesis kit (Invitrogen, USA) was performed reverse transcription PCR (PT-PCR) for synthesizing cDNA of the cell genome. After RT-PCR termination, using the reaction product of RT-PCR and the forward and reverse primers described in Table 3 below, ABI PRISM 7500 Fast Real-time PCR system CA Biologics, USA) was used. PCR reaction was performed.
  • the expression level was confirmed by performing the same method as above, and the SNC or DF sample of the control group and the BD patient, and each produced therefrom based on the expression level in the hESC.
  • mRNA relative expression levels (fold relative to hESCs) of 0CT4, S0X2, NAN0G and REX1 genes in iPSCs were calculated. All experiments Three replicates were performed for each sample, and CT values for each target gene were determined using software provided by the manufacturer.
  • BD-derived iPSCs exhibit pluripotent in vitro
  • differentiation was induced to form embryoid bodies (EBs) from BD-iPSCs, and then endoderm in BD-embryos
  • EBs embryoid bodies
  • endoderm markers S0X17 and F0XA2
  • ectoderm markers NESTIN and TUJ1 Expression was confirmed.
  • BD-iPSCs prepared by performing the method of Example ⁇ 1-2>, an embryoid body differentiation medium, which is a DMED / F12 medium containing 10% serum replacement (SR) 7 days of incubation to induce differentiation into the embryoid body (BD-EB) derived from BD-iPSCs. Then, immunofluorescent staining was performed in the same manner as in Example ⁇ 2-3> to confirm the expression of NESTIN, TUJ1, S0X17, F0XA2, a-SMA or DESMIN protein.
  • SR serum replacement
  • Anti-DESMIN antibody (1:50 dilution; AB907, Chemicon, USA), anti-a-SMA antibody (1: 400 dilution; A5228, Sigma-Aldr ich, USA) as the primary antibody for immunofluorescence staining , Anti-F0XA2 antibody (1: 500 dilution; ab40874, Abeam, USA), anti-S0X17 antibody (1: 100 dilution; MAB1924, R & D Systems, USA), anti-TUJ1 antibody (1: 500 dilution; PRB- 435P, Covance, USA) or anti-NESTIN antibody (1: 100 dilution; MAB5326, Chemicon, USA) was used, respectively, and 4'6-diimidino- 2-phenylindole (to control the degree of expression) was used. 4'6-diamiclino-2-phenynndole (DAPI)) was compared to stain the nuclei of cells.
  • DAPI 4'6-diamiclin
  • BD differentiated cells express all three types of germ line markers of NESTIN, TUJ1, S0X17, F0XA2, ⁇ -SMA or DESMIN protein It was confirmed that it shows the starch (FIG. 3D).
  • BD-derived iPSCs exhibit pluripotent in vivo
  • teratoma format ion of BD-iPSCs was performed in immunocompromised nude mice.
  • the BD-iPSCs prepared by the same method as in Example ⁇ 1-2> were counted with 1x106 cells and mixed with Matrigel, followed by SPF / VAF immunodeficiency nude mice (Orient Biopsy, Korea). After subcutaneous injection into the dorsal lateral area, mice were bred. Two months after the injection, the mice were sacrificed and teratomas were obtained, and 4% formaldehyde was added and fixed in paraffin. Then, the paraffin-embedded tissue is cut out and treated with hematoxylin and eosin to treat endoderm, ectoderm, and mesoderm through H & E staining (Hematoxylin & Eosin staining).
  • Increasing or changing specific cytokine levels in serum obtained from BD patients may be a marker or risk factor for disease for BD (Agrawal et al., 2014; Aktas Cetin et al., 2013).
  • abnormally regulated production of various growth factors, cytokines, and chemokines is secreted by hematopoietic progenitor cells, resulting in hematopoietic cells in BD patients. It is associated with an immune response (Durante et al., 1994; Leek et al., 1994).
  • the present inventors have a feeder-free support according to a previously known method, as shown in the schematic shown in FIG.
  • human plasma fibronectin (Invitrogen, USA) was pre-coated in 6-well plates at 3 mg / cm2, and Rho-associated kinase (trade name: H1152, Sigma) MTeSRl medium with inhibitors of the USA) was added. Then, TrypLE Invitrogen, USA) was treated with BD-iPSCs prepared in the same manner as in Example ⁇ 1-2>, and then inoculated in the mTeSRl medium and cultured. After 24 hours, mTeSRl medium was removed and BEHPSCs were further incubated for 6 days in hematopoietic coitment medium, IMDM lnvitrogen, USA, which comprises the composition shown in Table 4 below.
  • BD-iPSCs were further incubated for 7 days in hematopoietic maturation medium, an IMDM comprising the composition shown in Table 4 below, to differentiate HPCs from BD-iPSCs.
  • BD-HPCs hematopoietic maturation medium
  • composition of the medium used for inducing differentiation of BD-HPCs in the present invention is a composition of the medium used for inducing differentiation of BD-HPCs in the present invention
  • VEGF recombinant human
  • Example 3-1 the method of Example 3-1 was performed to induce differentiation of BD-HPCs from BD-iPSCs for a total of 14 days.
  • the induced BD-HPCs were then obtained, isolated using 0.25% trypsin / EDTA, and 100 PBS / 1% FBS per 1 ⁇ 10 6 cells were added to suspend the cells.
  • anti-CD43-PE antibody and anti-CD45-APC antibody (above Miltenyi Biotech, Germany) were treated at 30 ° C for 30 minutes to label BD-HPCs and washed twice with PBS / W FBS.
  • flow cytometry was performed using the FACSCanto TM II system (BD Biosciences, USA) according to the manufacturer's protocol. The results were analyzed by BD FACSDiva software (BD Biosciences, USA).
  • BD-iPSCs-derived HPCs BD-HPCs
  • qRT-PCR was performed to determine the hematopoietic marker genes SCL, GATA1, GATA2, and somatic cells of SNC and DF from BD patients and controls.
  • MRNA transcription levels of KDR, CD34, CD43 and CD45 genes were identified.
  • Example ⁇ 1-2> and ⁇ 3-1> was performed to induce differentiation of BD-iPSCs and B-HPCs. Then, qRT-PCR reaction was performed in the same manner as in Example ⁇ 2 ⁇ 4> to confirm mRNA transcription levels of SCL, GATA1, GATA2, KDR, CD34, CD43, and CD45 genes. GAPDH gene was confirmed by the same method as described above as a control for correcting the expression level, and the SNC or DF sample of the control and BD patients based on the expression level of the gene in the control -iPSCs, produced from MRNA relative expression levels (fold relative to iPSCs) of hematopoietic marker genes in each iPSCs and HPCs were calculated.
  • CFUs colony-forming units
  • Multivalent lineage hematopoiesis such as BFU-E (erythroid cells), C JG (granular leukocytes; granulocytes), CFU-M (macrophages) and CFU-GM (granulocytes, macrophages) Cells were differentiated, forming colonies (FIG. 5B, left), and CFU numbers for each lineage-committed cells per 104 cells were control -HPCs and BI)- It was confirmed that there was no significant difference between HPCs (FIG. 5B, right).
  • pro-inflammatory cytokines containing the cytokines IL-6, IL-8, TNFa and INFy reported to have increased secretion levels in BD patients The level of secretion of caine was confirmed.
  • BD-iPSCs and BD-HPCs were performed by performing the methods of Examples ⁇ 1-2> and ⁇ 3-1> to obtain cells.
  • the resulting cells were disrupted, centrifuged, and cell seupernatant isolated, followed by a commercial ELISA kit (all R & D systems, for detection of human IL-6, human IL-8 or human TNFa). US) and ELISA assays were performed following the manufacturer's protocol.
  • concentrations of IL-6, IL-8 and TNF ⁇ were quantified using a Spectra Max M3 microplate reader (Molecular Devices, USA) and compared with HPCs induced differentiation from iPSCs from healthy controls. As a result, as shown in FIG.
  • BD-HPCs expression levels were significantly higher than those of pro-inflammatory cytokines secreted from differentiation-induced HPCsCcon iPSCs-HPCs) from healthy control-derived iPSCs.
  • IL-6 showed 1.7 to 1.8 times higher secretion levels
  • IL-8 showed 39.3 to 41.5 times higher secretion levels
  • TNF a was found to exhibit high secretion levels within 2.5 to 5.6 (FIG. 5C).
  • BD-iPSCs can be used as a model of Behcet's disease because it can be significantly expressed in HPCs derived from BD-iPSCs for the pathological symptoms of BD such as the active state of immune response.
  • fibroblasts (somatic cells) derived from BD patients, BI derived therefrom ) -iPSCs and BD-HPCs were obtained respectively.
  • BEHPSCs and BE ) -HPCs each cell-wide RNA was extracted using R easy Mini kit (Qiagen, USA), labeled with Cy3, based on single-color platform analysis.
  • the whole human genome Microarray 4X44 v2 (Agi lent Technology, USA) was shaken and microarray analysis was performed according to the manufacturer's protocol to compare gene expression patterns between normal control and BD patients.
  • IL-6, IL-8 and TNFa were included to identify gene expression levels in proinflammatory cytokines reported to have significantly higher levels of secretion from somatic cells, iPSCs and differentiated HPCs from BD patients. doing Gene expression levels of cytokines and chemokines were analyzed.
  • Example ⁇ 1-2> and ⁇ 3-1> were obtained respectively.
  • the method of Example ⁇ 5-1> was performed to analyze IL-6, IL-8, TNF, IFNG, IL-10, IL-12A, IL-12B, IL- by microarray and heat map analysis. 13, gene expression of IL-15, IL-17A, IL-17B, IL-18, IL-1A, IL-1B, IL4 and CCR5 was confirmed.
  • FIGS. 5C and 7 the levels of IL-6, IL-8 and TNF ⁇ secreted in the culture medium of BD-HPCs were significantly increased compared to the normal control group (FIG. 5C).
  • iPSCs and HPCs derived from rheumatoid arthritis (RA) patients reported to have symptoms similar to BD were constructed and compared with gene expression patterns of BIHiPCs (Everekl ioglu, C). et.al., 2002 .; Mege, J.L. et.al., 1993.).
  • the method of Examples ⁇ 1-2> and ⁇ 3-1> was performed to induce differentiation of BD-iPSCs and BI) -HPCs, thereby obtaining fibroblasts (somatic cells) derived from BD patients, BD-iPSCs and BD-HPCs were obtained respectively.
  • somatic cells derived from rheumatoid arthritis patients were obtained, and somatic cells of RA patients, RA-iPSCs and RA-HPCs derived therefrom were obtained in the same manner as BD cells.
  • the gene expression patterns of the selected 217 genes were confirmed by performing the method of Example ⁇ 5-1>, followed by principal component analysis (Pr incipal component analysi s, PCA), cytokine and The expression patterns of chemokines were divided and compared.
  • BD_HPCs Prednisolone, a drug used in the treatment of BD patients, to screen molecular biomarkers that can predict drug reactions in BD patients.
  • PRED or changes in gene expression in BD-HPCs with or without hydroxychloroquine sulfate (HCQ) treatment.
  • BD-iPSCs and BD-iPSCs are performed by performing the methods of the embodiments ⁇ 1-2> and ⁇ 3-1>.
  • BD-HPCs Differentiation of BD-HPCs was induced. After induction, the obtained cells were inoculated into 96-well plates at a density of 4 ⁇ 10 4 cells / well and then incubated for 4 days by treatment with PRED or HCQ (Sigma, USA) at various concentrations from 0.063 to 32 ⁇ . Then, a protocol provided by the manufacturer using Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Do j indo Laboratories, Japan) by adding 20 ⁇ CCK ⁇ 8 staining solution and incubating at 37 ° C for 2 hours. As a result, the cytotoxicity induced by drug treatment was confirmed. The absorbance of each well was measured at 450 nm wavelength using a Spectra Max M3 microplate reader (Molecular Devices).
  • BD-HPCs obtained by culturing PRED or HCQ were obtained, and microarray analysis was performed by the method of Example ⁇ 5-1> to confirm gene expression. Gene expression was confirmed using a Panther classification system (http://www.pantherdn.org) to compare the amount of expression, and selected genes with a difference of expression more than two times compared to the untreated control. As an untreated control, BD-HPCs not treated with PRED or HCQ were used after culturing under the same conditions.
  • BD-HPCs and RA-HPCs were induced by the methods of Examples ⁇ 1-2> and ⁇ 3x1>.
  • the PRED or HCQ was treated as in Example ⁇ 5-3>, and microarray analysis was performed to confirm the expression patterns of 217 genes selected in Sanger Example ⁇ 5-1>.
  • BD biomarker candidate genes were subjected to qRT-PCR reaction in the same manner as in Example ⁇ 2-4> to quantitatively compare expression levels with normal controls.
  • eight genes of AGTR2, CA9, CD44, CXCL1, HTN3, IL-2, PTGER4 and TSLP were selected as BD biomarker candidate genes from a total of 217 genes (FIG. 10A).
  • Quantitative analysis of gene expression confirmed that the expression levels of these eight genes were specifically increased in non-drug-treated BD-HPCs compared to normal controls or drug-treated BI) -HPCs. It was confirmed that it can be used as a BD biomarker for diagnosis and prediction of drug reaction (FIG. 10B).
  • Example 6 BD—Checking whether HPCs are applied to a diagnostic method using BD biomarkers
  • Example ⁇ 5-4> In order to confirm whether the BD-specific biomarker selected in Example ⁇ 5-4> can be measured in serum, tissue, and cell samples as BD index, CXCL1, which showed the largest difference among the selected biomarkers, was subjected to The protein expression level secreted in the culture was confirmed.
  • differentiation of BEHPSCs and BD-HPCs was performed by performing the methods of Examples ⁇ 1-2> and ⁇ 3 # 1> to obtain cells.
  • the obtained cells were separated from the cell supernatant by the method of Example ⁇ 4-3> and subjected to ELISA analysis to quantify the concentration of secreted CXCL1 protein.
  • a BD sample independent BD-HPCs obtained from three BD patients were used by adding one of the two BD patients described in Table 1 above.
  • HPCs derived from differentiation from control -iPSCs were used. Used.
  • BD-iPSCs are induced to differentiate into endoderm hepatocytes, mesoderm cardiomyocytes, and ectoderm neural progenitors, and then secrete CXCL1 protein. After confirming the level, qRT-PCR reaction was performed in the same manner as in Example ⁇ 2-4> to confirm the expression level of the CXCL1 gene.
  • BD-HPCs of the present invention can be used as a disease model for recognizing biomarkers and investigating molecular immune pathogenesis of BD (i ⁇ unopathogenes is).
  • the concentrations in the BD patient serum of the CXCL1 protein and the IL-6 protein used as the BD indicator were confirmed (Everekl ioglu, C. et. al., 2002; Hamzaoui, ⁇ . 2011.)
  • Example ⁇ 4-3> serum samples of BD patients and controls were separated, and ELISA analysis was performed by the method of Example ⁇ 4-3> to quantify serum IL-6 and CXCL1 protein concentrations.
  • the secretion level of CXCL1 was confirmed in BD-HPCs treated with drugs.
  • BE -iPSCs and by performing the method of Examples ⁇ 1-2> and ⁇ 3-1> Differentiation of BD-HPCs was induced to obtain cells.
  • the obtained cells were seeded in a 96-well plate containing hematopoietic maturation medium described in Table 4 above at a density of 4 ⁇ 10 4 cells / well, and then cultured for 1 day.
  • 34 drugs were identified from the FDA approved library (# BML-2843, EMZO Life Science Inc., USA), which are known to exhibit anti-inflammatory and immunosuppressive effects. Were treated in each well at a concentration of ⁇ ⁇ and incubated for 2 days. after that.
  • Example ⁇ 4-3> As untreated control, BD-HPCs treated with DMS0 without drug treatment were used.
  • betamethasone (be t ame t ha sone) 392.5 anti-inflammatory, immunosuppressive
  • Hydrocortisone Acetate Hydrocortisone Acetate (Hydrocor t i sone 404.5 anti-inflammatory
  • Loteprednol etacarbonate (Lo t epr edno 1 467.0 anti-inflammatory.
  • Penicillamine (apenicillamine, 149.2 immunosuppressant, chelator)
  • Triamcinolone Acetonide Triamcinolone 434.5 anti-inflammatory; steroid system

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Abstract

본 발명은 베체트병(Behcet's disease, BD) 환자로부터 유래된 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPSCs) 및 이로부터 분화 유도된 조혈전구세포(hematopoietic progenitor cells, HPCs)의 제조 방법, 및 상기 세포를 베체트병의 인간 세포모델로서 이용하는 용도에 관한 것으로, 구체적으로 베체트병 환자의 섬유아세포로부터 유래된 유도만능 줄기세포는, BD 환자에서 나타나는 질환의 특징을 재현하는 조혈전구세포로 분화할 수 있으며, 상기 세포에서 BD의 질환 증상인 세포 내 전염성 사이토카인 및 케모카인의 유전자 발현 및 단백질 분비 수준 등을 효과적으로 확인할 수 있으므로, 본 발명의 BD 인간 세포 모델 및 바이오마커는 BD의 발병 기전 분석 연구 및 치료제 개발 연구에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
베체트병의 인간 세포 모델 및 이의 용도 【기술분야】
본 발명은 베체트병 (Behcet's disease) 환자로부터 유래된 유도만능 줄기세포 (induced pluri potent stem cells; iPSCs) 및 이로부터 분화 유도된 조혈전구세포 (hematopoietic progenitor cells, HPCs)의 제조 방법，상기 세포를 베체트병의 인간 세포모델로서 이용하는 용도, 및 상기 세포를 이용하여 발굴된 베체트병-특이적인 바이오마커의 용도에 관한 것이다.
【배경기술】
베체트병 (Behcet's disease, BD)은 만성적으로 재발성인， 전신성의 면역-연관된 질병으로， 모든 크기의 동맥 및 정맥에 영향을 미치기 때문에， 신체의 넓은 범위에서 증상과 신호를 유발한다 (Sakane et al. , 1999； Verity et al., 2003). BD는 현재 세계적으로 나타나는 질병이나， 중동이나 지중해 연안 지역과 아시아에서 더욱 빈번하게 나타난다. 몇몇의 약물들은 손상을 입은 기관들을 대상으로 BD의 증상을 완화시키거나， 합병증을 방지하는데 도움올 줄 수 있으나， 현재까지 BD에 대해 완치의 방법은 없으며, 또한, 진단하는 방법과 예후를 판단할 수 있는 정확한 지표 또는 마커도 개발된 바 없는 실정이다.
BD의 병원 (etiology) 및 발병 기전은 아직 불분명하나， 연구자들은 감염성 또는 환경적인 인자, 유전적인 요소， 및 면역 시스템의 이상 (abnormalities)과 같은 요소들이 관련되어 있는 것으로 가정하고 있다. 감염성 병원으로서， 단순 포진 바이러스 (herpes simplex virus) (Eglin et al. , 1982； Sohn et al. , 1998), 스트랩토코커스 산구이니스 (Streptococcus sanguinis) (Yoshikawa et al., 1996) , 헬리코박터 파이로리 (Helicobacter pylori Ersoy et al. , 2007) 및 칼라마이디아 슈모니아 (Chlamydia pneumonia) (AyasHogluet al., 2004)등이 BD의 유발 요인으로 작용하는 것에 대해 보고된 바 있다.
인간의 열 충격 단백질 (heat shock proteins, HSP)-60과 상호 반웅하는 미생물의 HSP-65는 T 세포의 활성화에 대해 반웅할 수 있는 것으로 예상되며， 이는 BD에서 감염에 의한 면역 반웅과 자가면역 (autoi醒 unity)에서 중요한 역할을 한다 (Ergun et al. , 2001; Kaneko et al. , 1997； Lehner , 1997) . 또한, 다른 연구들은 인터류킨 (IL)-23R, IL-10(Mizuki et al. , 2010; Remmers et al . , 2010), STAKHou et al . , 2012)， 인간 백혈구 항원 (human leukocyte antigen, HLA)-B51(Demirseren et al. , 2014； Ohno et al. , 1982), 단핵 백혈구 화학주화성의 단백질 -Umonocyte chemoat tract ant protein-1, MCP-l)(Hou et al. 2010)， 이동 억제 요소 (migration inhibitory factor, MIF) (Zheng et al . , 2012) 및 miR-155(Zhou et al . , 2014) 등이 BD에 대한 민감성에 작용할 수 있는 유전적인 요인임을 보고한 바 있다.
BD에서 자연 면역 (innate immunity) 및 획득 면역 (acquired immunity) 모두를 포함하는 비정상적인 면역 반웅은 또한 BD의 병리학적 기작올 밝혀내기 위해 광범위하게 연구되었다 (Kapsimali et al., 2010). 유전적으로 내인적 (intrinsic) 및 외인적 (extrinsic)인 촉진 요소에 의해 영향을 받는 T 세포 매개의 면역 반웅은 BD의 면역 발병 기전에서 증심적인 역할을 하는 것으로 여겨진다. 활성화된 T의 비율 증가가 BD의 질병 활성과 연관되어있고 (Bank et al. , 2003； Triolo et al . , 2003) , 호중구의 과활성화 (Neutrophil hyperact ivat ion)또한 BD와 연관되어 있으며 (Car let to et al. , 1997； Eksioglu-Demiralp et al. , 2001), I L- KHamzaoui et al. , 1990； Pay et al. , 2006)， IL-6(Adam and Calikoglu, 2004； Wang et al . , 1992) , IL-8(Zouboulis et al . , 2000) 및 종양 괴사 인자 (tumor necrosis factor, TNF)(Touma et al. , 2010)와 같은 전-염증성 사이토카인 (pro-inf la隱 atory cytokine)의 증가된 수준이 BD 환자 내에서 면역 반웅과 연관되어 있음이 보고되었다. 많은 연구 결과에서 BD의 병인 기전에서 우세한 Thl 반웅이 중심적 역할을 하고 있음을 확인하였다 (Frassanito et al., 1999； Ilhanet al. , 2008) . 활성화된 BD환자 내에서 Thl사이토카인 (IL-12, IL-18, IFN)의 수준이 증가하는 반면， Th2 사이토카인인 TL-4의 수준은 감소한다 (Vaccarino et al. , 2013； Zhou et al. , 2012). Thl 반웅의 양극화와 일치하는ᅳ CXCR3 및 CCR5를 포함하는 Thl-관련 케모카인 수용체의 발현은 BD 환자에서 또한 상향-조절된다 (Ben Ahmed et al. , 2004； Houman et al. , 2004) . 최근 연구들은 또한， 전-염증성 사이토카인 IL-17을 생산하는 Thl7 세포의 비율이 Thl 세포에 비해 활성화 BD를 가지는 환자에서 높게 나타나며 (Hamzaoui, 2011)， 또한， BD에서 Th22 세포에 의해 만들어지는 염증성 사이토카인 IL-22의 발현 수준이 높아져， 염증성 반웅에 연관됨을 보고하였다 (Sugita et al. , 2013). 이와 같이， BD에 대한 연구들이 계속되고， 발전 되었음에도 불구하고， 발병 증상 및 신호가， 시간의 흐름에 따라 다양한 정도로 신체 전체에 걸쳐 복합작인 위치에 영향을 미치는 수많은 다른 염증성 질병의 것과 유사하게 나타나며, BD의 징후 (manifestations)는 수개월 또는 심지어 수년간 나타날 수도 있고 지속적인 것처럼 보이지 않을 수도 있어 다른 면역질환과 구별된 BD의 진단 및 치료법을 적용하기가 매우 어려운 실정이다.
현재 많이 사용되고 있는 BD에 대한 최근의 임상 진단 방법은 국제 베체트병 연구그룹 (International Study Group for Behcet's Disease(ISGBD) , 1990)과 일본 베체트병 연구회에서 제안한 기준 (Behcet's Disease Research Committee of Japan, 1987)에 기반하고 있으며， 복합적이고， 종합적인 경험과 주관적인 판단에 의존적이다. 현재까지 BD의 검출 및 진단， 치료 방법， 예후 등에 적용하기 위한 신뢰할 만한 임상적인 바이오마커는 존재하지 않는다. 따라서， BD-특이적 바이오마커의 추가적인 연구가 BD의 조기 치료 및 적절한 치료법 개발올 위해 필수적으로 요구되고 있는 실정이다. 줄기세포 (stem cell)는 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있으며， 미분화 상태에서 무한 증식이 가능한 자가재생산능 및 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성인 분화능을 가진 세포를 말한다. 줄기세포는 분화 자극 (환경)에 의하여 특정 세포로 분화가 진행되며， 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산 (self-renewal)할 수 있어 증식 (proliferation, expansion)하는 특성이 있으며， 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 종류의 특정 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성 (plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.
유도만능 줄기세포 (induced pluri otent stem cells; iPSCs)를 포함하는 인간 전분화능 줄기세포 (Human pluri potent stem cells; hPSCs)는 인체를 구성하는 거의 모든 조직 세포 종류로 분화할 수 있는 우수한 분화능을 가지고 있다. 특히， 환자 -유래 iPSCs의 경우 시험관 내 분화 시스템에서 환자와같은 면역적, 유전적 특성을 가진 조직-특이적 분화세포를 생산할 수 있음으로 인해 면역 거부반응이 없는 환자-맞춤형 세포치료제 개발뿐만 아니라， 기관 형성 (organogenesis)의 초기 발달 동안에 복합적 질병의 메커니즘을 이해하는데 효과적인 평가자로 알려져 있다 (Muotri, A. R. (2009) Epilepsy Behav 14 Sup l 1： 81-85； Marchetto, M. C. , B. Winner, et al. (2010) Hum Mol Genet 19(R1): R71-76).
현재까지， 다양한 유전적 질병을 가지는 환자로부터 유래된 iPSCs가 질병과 -관련 있는 세포 종류로 직접 분화되었을 때 질병-특이적인 표현형 (phenotypes)을 나타냄이 보고되고 있다 (Park, I. H. et al. Cell 134, 877-886 (2008)； Tiscornia, G. et al. Nature medicine 17, 1570-1576 (2011)). 이러한 질병ᅳ특이적인 iPSCs는 질병의 직접적인 원인 또는 손상부위와 관련 있는 조직 세포로 분화될 수 있음으로 인해， 질환 특성을 보유한 분화 조직-세포는 질병의 원인을 규명하기 위한 구체적인 기작 연구 또는 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다. 질환 -특이 iPSCs 기술을 이용하여 발굴된 질병-특이적 바이오마커는 질병 특성 , 상태 또는 속도의 지표로 사용될 수 있으며 (Ziegler et al. , 2012； Zineh 및 Huang, 2011)， 이들의 추가적인 개발은 조직, 세포 또는 생체액 (biofluid)을 포함하는 질병에 관련된 생체 시료의 이용 가능성을 넓히는데 기여할 수 있다. 환자로부터 유래된 인간 일차적인 세포는 바이오마커의 개발을 위해 유용하게 사용될 수 있으나， 이들은 일반적으로 수득하는데 어려울 뿐 아니라 시험관 내 (in vitro)에서 제한된 수명을 가진다. 하지만, 증식 및 분화능이 우수한 인간의 유도만능 줄기세포 (iPSCs)는 기관-특이적인 전구 세포 및 특정 기능을 수행하는 성숙한 세포를 제한없이 생산할 수 있는 잠재력이 있어 기술적으로 다양한 적용을 가능케 한다. 환자의 질병 표현형 및 임상적인 증상을 잠재적으로 나타낼 수 있는 환자 유래의 iPSCs는 진단， 예측 (prognostic), 예견 (predictive) 및 치료적인 용도를 위한 질병-특이적인 바이오마커를 개발하는데 있어서 뚜렷한 장점을 제공한다. 따라서， 본 발명자들은 환자 -유래 iPSCs기술을 기반으로 베체트병 (BD)을 연구하기 위한 인간 세포 모델을 확립하기 위해 노력한 결과， 우선적으로 BD 환자의 섬유아세포로부터 BD 유래의 유도만능 줄기세포 (induced pluri otent stem cells; iPSCs)를 제작하였고， 이로부터 질병과 관련된 분화 세포인 조혈전구세포 (hematopoietic precursor cell , HPCs)의 분화를 유도하였다. 상기 BD 환자 유래의 iPSCs는 시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo)에서 전분화능 (pluripotency)을 가져， iPSCs로서의 특징을 나타냄을 확인하였다. BD 환자 유래의 iPSCs로부터 베체트병과 관련된 질환 모델 세포인 HPCs로 분화를 유도한 결과， 비교를 통한 전사체 분석 (Comparative transcr iptome analysis)에서 BD바이오마커에 대한 후보자로서 8개 유전자 (AGTR2, CA9, CD44, CXCL1, HTN3, IL— 2， PTGER4 및 TSLP)를 선별하고, 이들이 건강한 대조군과 비교하여 차별화되는 뚜렷한 유전자 발현 양상을 나타냄올 확인하였으며， 류마티스 관절염과 같은 다른 면역성 질환을 가지는 환자로부터 유래된 iPSCs 및 HPCs와도 발현 수준이 구별되는 것을 확인하였다. 또한， 선별된 8개 후보 유전자군을 대상으로 단백질 수준에서의 BD-x특이적인 발현변이를 조사한 결과， CXCL1의 단백질 발현 증가가 BD와 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였다. BD 환자 -유래 체세포, BD-iPSCs, BD-HPCs 등의 BD 세포 질환 모델 및 BD 환자 혈청에서 CXCL1 단백질 분비가 BD와 연관되어 특이적으로 증가되어 있음을 확인함으로써 CXCL1은 성능이 우수한 BD 바이오마커로서 유전자 발현 및 단백질 발현 수준 모두에서 BD-특이적인 바이오마커로서 기능할 수 있음을 확인하였다.ᅳ 또한， 상업적으로 시판되고 있는 FDA 승인 항염증제 및 면역억제제 34종을 대상으로 약물 반웅성을 조사한 결과, BD-HPCs의 인간 세포질환모델로서의 유용성 및 CXCL1의 바이오마커로서의 우수성을 선택성, 재현성 및 민감성 측면에서 검증하였다. 본 발명의 BD 질환모델세포， 환자ᅳ유래 유도만능 줄기세포 (induced pluri otent stem cells; iPSCs) 및 iPSCs—유래 HPCs를 이용하여 바이오마커 유전자 및 단백질을 BD의 진단 및 약물 스크리닝 방법에 적용할 수 밌음을 확인하여, BD의 발병 원인 규명 연구 및 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있는 BD의 인간 세포 모델 및 바이오마커를 제시함으로써 본 발명을 완성하였다. 【선행기술문헌】
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【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 유도만능 줄기세포 (induced pluri otent stem cells; iPSCs) 기술을 이용하여 베체트병 (Behcet's disease, BD) 환자의 질환 특성을 그대로 반영할 수 있는 인간 세포 모델을 개발하고， 이의 용도를 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】 상기 목적을 달성하기 위해， 본 발명은 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 베체트병 (Behcet's disease, BD)의 유도만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPSCs) 모델을 제공한다.
i) 정상 세포의 iPSCs 형태;
ii) 0CT4, NANOG, TRA-1-60 및 SSEA를 포함하는 전분화능 마커 (pi uri potency marker) 단백질을 발현; 및
iii) 0CT4, S0X2, NANOG및 REX를 포함하는 전분화능 마커 유전자 mRNA를 발현.
또한， 본 발명은
i) 시험관 내 (in vitro)에서 베체트병 환자로부터 분리된 섬유아세포 (fibroblasts)를 iPSCs로 유도하는 단계; 및
ii)상기 단계 i)에서 유도된 iPSCs를 수득하는 단계를 포함하는 시험관 내에서 베체트병 iPSCs 모델의 제조 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 하기 i) 내지 vi) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 베체트병의 조혈전구세포 (hematopoietic progenitor cells, HPCs) 모델을 제공한다:
i) CD43 및 CD45를 포함하는 조혈 마커 발현;
ii) SCL, GATAl, GATA2, KDR, CD34, CD43 및 CD45를 포함하는 조혈 마커 유전자 발현 ;
iii) 정상 세포에 비해， IL-6, IL-8 및 TNFa를 포함하는 전-염증성 사이토카인의 분비 수준 증가; 및
iv) 정상 세포에 비해， CXCL1 유전자의 발현 수준 증가;
V) 정상 세포에 비해， CXCL1 단백질의 분비 수준 증가; 및
vi) 정상 세포에 비해， IL-2 유전자의 발현 수준 증가.
또한， 본 발명은
i) 시험관 내에서 베체트병 환자로부터 분리된 섬유아세포를 iPSCs로 제작하는 단계 ; 및
ii) 상기 단계 0에서 제작한 iPSCs를 조혈전구세포 (hematopoietic progenitor cells, HPCs)로 유도하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 유도된 HPCs를 수득하는 단계를 포함하는， 시험관 내에서 베체트병 조혈전구세포 모델의 제조 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은
i) 베체트병 iPSCs 모델로부터 배상체 (embryoid body, EB) 또는 조혈전구세포 (HPCs)로 분화를 유도하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 유도된 배상체의 분화 마커 또는 조혈전구세포의 특징을 분석하는 단계를 포함하는, iPSCs 또는 조혈전구세포를 베체트병의 모델로 사용하는 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 하기 유전자 또는 하기 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍을 하나 또는 둘 이상 포함하는， 베체트병 (Behcet's disease, BD)의 진단용 키트:
서열번호 1의 염기서열로 구성되는 AGTR2( angiotensin II receptor, type 2) 유전자;
서열번호 2의 염기서열로 구성되는 CA9(carbonic anhydrase IX) 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 CD44유전자;
서열번호 4의 염기서열로 구성되는 HTN3(hi statin 3) 유전자;
서열번호 5의 염기서열로 구성되는 PTGER4(prostaglandin E receptor 4， subtype EP4) 유전자； 및
서열번호 6의 염기서열로 구성되는 TSLP thymic stromal lymphopoiet in) 유전자를 제공한다.
또한， 본 발명은 하기 단백질 또는 하기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 하나 또는 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 하는， 베체트병의 진단용 키트:
서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 AGTR2(angiotensin II receptor, type 2) 단백질;
서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 CA9(carbonic anhydrase IX) 단백질; 서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되는 CD44 단백질;
서열번호 12의 아미노산 서열로 구성되는 HTN3(histatin 3) 단백질; 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 PTGER4( pros tag land in E receptor 4， subtype EP4) 단백질; 및
서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 TSLP(thymic stromal lymphopoietin) 단백질을 제공한다.
또한， 본 발명은
i) 개체로부터 분리된 시료를 제 9항 또는 게 11항의 키트에 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 처리한 키트에서 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 분석하는 단계 ; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 분석한 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군과 비교하여 증가하는 경우 상기 개체를 베체트병에 걸리거나 또는 베체트병에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는， 베체트병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을쎄공한다.
또한, 본 발명은
i) 제 9항 또는 제 11항의 키트에 피검물질을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 처리한 키트에서 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 분석하는 단계 ; 및
iii) 상기 단계 Π)에서 분석한 유전자 또는 단백질의 수준이 무처리 대조군에 비교하여 감소하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는， 베체트병의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 하기 유전자 또는 하기 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍을 하나 또는 둘 이상 포함하는， 베체트병 (Behcet's disease, BD)의 진단용 키트의 용도:
서열번호 1의 염기서열로 구성되는 AGTR2( angiotensin II receptor, type 2) 유전자;
서열번호 2의 염기서열로 구성되는 CA9(carbonic anhydrase IX) 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 CD44유전자;
서열번호 4의 염기서열로 구성되는 HTN3(histatin 3) 유전자;
서열번호 5의 염기서열로 구성되는 PTGER4(prostaglandin E receptor 4, subtype EP4) 유전자； 및
서열번호 6의 염기서열로 구성되는 TSLP( thymic stromal lymphopoiet in) 유전자를 제공한다.
아울러, 본 발명은 하기 단백질 또는 하기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 하나 또는 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 하는， 베체트병의 진단용 키트의 용도:
서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 AGTR2(angiotensin II receptor, type 2) 단백질;
서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 CA9(carbonic anhydrase IX) 단백질;
서열번호 11의 아미노산서열로 구성되는 CD44 단백질;
서열번호 12의 아미노산 서열로 구성되는 HTN3(histatin 3) 단백질; 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 PTGER4(prostagIandin E receptor 4， subtype EP4) 단백질 ; 및
서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 TSLP(thymic stromal lymphopoiet in) 단백질을 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명의 베체트병 (Behcet's disease, BD) 환자의 섬유아세포로부터 유래된 유도만능 줄기세포 (induced luri potent stem cells; iPSCs)는， BD 환자에서 나타나는 질환의 특징을 재현하는 조혈전구세포 (hematopoietic progenitor cells, HPCs)로 분화할 수 있으며, 상기 세포에서 BD의 질환 증상인 세포 내 전염성 사이토카인 및 케모카인의 유전자 발현 및 단백질 분비 수준 등을 효과적으로 확인할 수 있으므로, 본 발명의 BD 인간 세포 모델은 BD의 발병 기전 분석 연구 및 치료제 개발 연구에 유용하게 사용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 베체트병 (Behcet's disease, BD) 환자 유래의 유도만능 줄기세포 (induced pluri potent stem cells; iPSCs)를 제조하고， 바이오마커를 개발하기 위한 본 발명의 모식도이다.
도 2는 BD 유래의 iPSCs 제조 과정을 나타내는 모식도이다.
도 3은 BD 유래 iPSCs의 특징을 확인한 도이다;
도 3a는 BD-iPSCs의 집락 형태 및 전분화능 마커 발현을 확인한 도이고; 도 3b는 건강한 대조군 유래의 1?^3(대조군 ? 3) 및 BD-iPSCs의 핵형을 비교한 도이며;
도 3c는 BD 유래 iPSCs의 전분화능 마커 유전자의 발현을 정량적으로 확인한 도이고;
도 3d는 시험관 내에서 BD-iPSCs로부터 분화된 배상체 (embryoid body, EB)의 삼배엽 분화-특이능 마커 유전자의 발현을 확인한 도이고; 및
도 3e는 생체 내 (in vivo)에서 BD-iPSCs로부터 기형종 발생을 유도하여 전분화능을 확인한 도이다.
도 4는 BD 유래 iPSCs로부터 조혈전구세포 (hematopoietic progenitor cells, HPCs)의 분환를 나타낸다;
도 4a는 BD-iPSCs로부터 BD-HPCs를 분화하는 과정을 나타내는 모식도이고; 및
도 4b는 분화된 BD-HPCs을 선별하기 위해 CD43 및 CD45 양성세포의 비율을 확인한 도이다.
도 5는 BD-iPSCs 유래 HPCs의 특징을 나타낸다;
도 5a 대조군 및 BD 환자 유래의 체세포， iPSCs 및 HPCs에서 조혈 마커 유전자의 발현을 확인한 도이고;
도 5b는 세포 집락 형성 분석을 통해 BD-iPSCs 유래 HPCs의 조혈 계통 세포로의 분화 가능성을 확인한 도이며 ; 및
도 5c는 BD-iPSCs 유래 HPCs의 IL-6, IL-8, TNF α 및 INFy를 포함하는 전-염증성 사이토카인의 분비 수준을 확인한 도이다.
도 6은 BD환자 유래의 iPSCs및 HPCs에서 유전자 발현 양상 분석을 통한 베체트병 바이오마커 유전자 선별을 나타내는 도이다;
도 6a은 BD 환자 유래의 HPCs로부터 BD 특이적인 유전자를 BD 바이오마커로서 선별하기 위한 과정을 나타내는 모식도이며;
도 6b는 BD 환자 유래의 체세포， iPSCs 및 HPCs의 전체적인 유전자 발현 양상을 확인한 마이크로어레이 분석을 나타낸 도이고;
도 6c는 BD-HPCs에서 상승 발현되는 양상을 나타내는 생물학적 경로들을 확인한 KEGG 경로 분석을 나타내는 도이며; 및
도 6d는 BD-HPCs에서 사이토카인 및 케모카인을 암호화하는 유전자로서 선별한 217 개 유전자의 발현 정도를 대조군 유래 HPCs와 비교한 도이다.
도 7은 BD 환자 유래의 체세포， iPSCs 및 HPCs에서 사이토카인 및 케모카인의 유전자 발현 정도를 대조군과 비교한 마이크로어레이 분석을 나타낸다.
도 8은 BD 및 류마티스 관절염 (Rheumatoid arthr i t i s , RA) 환자 유래 세포의 유전자 발현 양상을 확인하기 위한 주성분분석 (Pr inc ipal component analysi s , PCA) 결과를 나타낸다.
도 9는 BD— HPCs에서 약물 처리를 통한 바이오마커 후보 유전자의 선별을 나타낸다;
도 9a는 프레드니솔론 (predni solone , PRED) 또는 황산히드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine sul fate , HCQ)의 처리 유무에 따른 BD-HPCs 내 전체적인 유전자 발현 양상의 변화를 나타내는 도이고;
도 9b는 PRED 또는 HCQ 처리 농도에 따른 BD-HPCs에 대한 세포 독성을 확인한 도이며;
도 9c는 PRED 또는 HCQ 처리 유무에 따론 BD-HPCs에 대한 세포 집락의 형태 변화 여부를 확인한 도이고;
도 9d는 PRED 또는 HCQ 처리 유무에 따른 BD-HPCs 내 생물학적 과정의 유전자 발현 정도의 변화를 확인한 도이며; 도 9e는 PRED 또는 HCQ 처리 유무에 따른 BD-HPCs 내 분자적인 기능을 가지는 유전자 발현 정도의 변화를 확인한 도이고; 및
도 9f는 PRED 또는 HCQ 처리에 대해 BD-HPCs 내 상향 조절되는 항염증성 사이토카인 및 케모카인 유전자의 유사한 발현 변화를 확인한 도이다.
도 10은 BD-HPCs의 진단 및 약물 반웅 예측을 위한 BD 바이오마커의 선별을 나타낸다;
도 10a는 BD 바이오마커 후보군 유전자로서 선별한 AGTR2 , CA9 , CD44 , CXCL1 , HTN3 , IL-2 , PTGER4 및 TSLP의 8 개 유전자에 대해, PRED또는 HCQ처리 유무에 따른 BD-HPCs 내 유전자 발현 변화를 마이크로어레이 분석을 통해 비교한 도이며; 및
도 10b는 BD 바이오마커 후보군 유전자에서 PRED 또는 HCQ 처리 유무에 따른 BD-HPCs 내 유전자 발현 변화를 정량적으로 비교한 도이다.
도 11은 BD-HPCs에서 BD 바이오마커를 이용한 진단 방법으로의 적용 여부를 확인한 도이다;
도 11a는 독립적인 BD 환자 유래의 HPCs의 배양 상층액 내 CXCL1 단백질 농도를 확인한 도이고;
도 lib는 BD환자 3명으로부터 각각 수득한 체세포로부터 유래된 HPCs의 배양 상층액 내 CXCL1 단백질 농도를 확인한 도이며;
도 11c는 BD 환자 유래의 체세포 및 iPSCs의 배양 상충액 내 CXCL1 단백질의 농도를 확인한 도이고;
도 lid는 BEHPSCs로부터 분화된 간세포 (내배엽)， 심장근육세포 (중배엽) 및 신경 전구체 (외배엽)과 같은 다른 세포에서 CXCL1 유전자의 발현 수준을 정량 비교한 도이며; 및
도 lie는 BD-iPSCs로부터 분화된 간세포 (내배엽)， 심장근육세포 (중배엽) 및 신경 전구체 (외배엽)과 같은 다른 세포의 배양 상층액 내 CXCL1 단백질 농도를 비교한 도이다.
도 12는 대조군 및 BD 환자로부터 수득한 혈청 시료 내에서 CXCL1 및 IL-6 단백질의 농도를 확인한 도이다. 도 13은 BD-HPCs에서 BD 바이오마커를 이용한 약물 스크리닝으로의 적용 여부 확인한 도이다;
도 13a는 34개의 FOA승인된 약물을 처리하였을 때， BD-HPCs배양 상층액 내 IL-6의 농도 변화를 확인한 도이며； 및
도 13b는 34개의 FDA승인된 약물을 처리하였을 때， BD-HPCs배양 상층액 내 CXCL1의 농도 변화를 확인한 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다 . 본 발명은 하기 i) 내지 Hi) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 베체트병 (Behcet's disease, BD)의 유도만능 줄기세포 (induced phiripotent stem cells; iPSCs) 모델을 제공한다:
i) 정상 세포의 iPSCs 형태;
ii) 0CT4, NANOG, TRA-1-60 및 SSEA를 포함하는 전분화능 마커 (pi uri potency marker) 단백질을 발현; 및
iii) 0CT4ᅳ S0X2, NAN0G및 REX를 포함하는 전분화능 마커 유전자 mRNA를 발현 .
본 발명의 구체적인 실시예에 있어세 본 발명자들은 BD 환자와 건강한 대조군을 선별하고 (표 1 참조) 이들로부터 분리된 섬유아세포의 체세포로부터 전분화능을 가진 iPSCs(BD-iPSCs)를 제작한 결과 (도 1 및 도 2 참조)， BD-iPSCs는 BD 환자와 유전적으로 동일성을 가지고 (표 2 참조)， 정상적인 배아줄기세포 (hESCs)와 유사한 집락 형태 및 핵형을 나타내며 (도 3a 및 도 3b 참조)， BD-iPSCs^ 시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo)에서 전분화능을 가지는 것을 확인하였다 (도 3 참조).
따라서， 본 발명의 BD 유래의 iPSCs 모델은 BD 환자의 세포와 동일한 특성을 유지하면서 전분화능을 나타내므로， 상기 iPSCs 모델은 BD의 신경 발달을 위한 분석 연구에 이용하는 방법에 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은
i) 시험관 내 (in vitro)에서 베체트병 환자로부터 분리된 섬유아세포 (fibroblasts)를 iPSCs로 유도하는 단계; 및 '
ii)상기 단계 i)에서 유도된 iPSCs를 수득하는 단계를 포함하는， 시험관 내에서 베체트병 iPSCs 모델의 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 i)의 유도는 전분화능 마커 (pluripotent marker)의 아소상 발현 (ectopic expression)을 사용하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하며, 구체적으로 상기 이소성 발현은 리프로그래밍 인자 (reprogramming factor)인 0CT4, S0X2, C-MYC및 KLF4을 포함하는 레트로바이러스 (retrovirus)를 이용하는 방법 (Son MY et. al. Stem cells 31， 2374-2387； 2013) 또는 상기 리프로그래밍 인자를 발현하는 에피솜 백터의 형질전환을 통한 방법 등을 포함하는， iPSCs를 제조하기 위해 당업계에 알려진 방법이라면 어떠한 것도 사용할 수 있다.
본 발명의 BD 유래의 iPSCs 모델은 BD 환자의 세포와 동일한 특성을 유지하면서 전분화능을 나타내므로， 상기 iPSCs 모델의 제조방법은 BD의 신경 발달올 위한 분석 연구에 이용하는 방법에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 하기 i) 내지 vi) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 베체트병의 조혈전구세포 (hematopoietic progenitor cells, HPCs) 모델을 제공한다.
i) CD43 및 CD45를 포함하는 조혈 마커 발현;
ii) SCL, GATA1 , GATA2, KDR, CD34, CD43 및 CD45를 포함하는 조혈 마커 유전자 발현;
iii) 정상 세포에 비해， IL-6, IL-8 및 TNFa를 포함하는 전-염증성 사이토카인의 분비 수준 증가; 및
iv) 정상 세포에 비해， CXCL1 유전자의 발현 수준 증가;
v) 정상 세포에 비해, CXCL1 단백질의 분비 수준 증가; 및
vi) 정상 세포에 비해， IL-2유전자의 발현 수준 증가. 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에 있어서， 본 발명자들은
BD-iPSCs으로부터 분화된 세포를 BE 대한 세포 모델로서 사용할 수 있는지 확인하기 위해， BD-iPSCs를 조혈전구세포 (HPCs)로 분화 유도한 결과 (도 4a 참조)， BD-iPSCs로부터 분화된 HPCs(BD-HPCs)는 CD43및 CD45양성 세포로서 (도 4b참조)， 조혈 마커 유전자 발현를 발현하고， BFU-E (적혈구계 세포; erythroid cel ls) , CFU-G (과립성 백혈구; granulocytes) , CFU-M (대식 세포; macrophages) 및 CFU-GM (과립성 백혈구， 대식세포)와 같은 다가-계통의 조혈 세포로 분화되는 것을 확인하였다 (도 5 참조) .
또한., 본 발명자들은 BD에서 나타나는 대표적인 표현형을 BD-HPCs에서 나타낼 수 있는지 확인하기 위해， BD 환자에서 분비 수준이 증가하는 것으로 보고된 사이토카인인 IL-6, IL-8 , TNF a 및 INF y를 포함하는 전—염증성 사이토카인의 분비 수준을 확인한 결과， 정상 대조군에 비해 BI)-HPCs에서 IL-6 IL-8 및 TNF a의 분비 수준이 증가하며 (도 5c 참조)， 면역 반웅의 활성화 상태와 같은 BD의 병리학적인 증상에 대해 BD-iPSCs로부터 유래된 HPCs에서 유의적으로 나타낼 수 있어， BD-iPSCs가 베체트병의 모델로서 사용될 수 있음을 확인하였다.
따라서， 본 발명의 BD 환자 유래의 iPSCs로부터 분화된 조혈전구세포는 조혈전구세포로서의 분화능을 가지는 동시에, BD 환자에서 나타나는 염증성ᅳ카이토카인의 분비 증가 정도를 효과적으로 확인할 수 있으므로， 상기 조혈전구세포는 BD의 발병 연구를 위한 인간 유래 세포 모델로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은
i ) 시험관 내에서 베체트병 환자로부터 분리된 섬유아세포를 iPSCs로 제작하는 단계 ; 및
i i )상기 단계 i )에서 제작한 iPSCs를 조혈전구세포로 유도하는 단계; 및 i i i ) 상기 단계 Π )에서 유도된 HPCs를 수득하는 단계를 포함하는， 시험관 내에서 베체트병 조혈전구세포 모델의 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 i)의 유도는 전분화능 마커 (pluripotent marker)의 이소성 발현 (ectopic expression)을 사용하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하며， 구체적으로 상기 이소성 발현은 리프로그래밍 인자 (reprogra隱 ing factor)인 0CT4, S0X2, C-MYC및 KLF4을 포함하는 레트로바이러스 (retrovirus)를 이용하는 방법 (Son MY et. al， Stem cells 31， 2374-2387； 2013) 또는 상기 리프로그래밍 인자를 발현하는 에피솜 백터의 형질전환을 통한 방법 등을 포함하는, iPSCs를 제조하기 위해 당업계에 알려진 방법이라면 어떠한 것도 사용할 수 있다.
본 발명의 BD 환자 유래의 iPSCs로부터 분화된 조혈전구세포는 조혈전구세포로서의 분화능을 가지는 동시에, BD 환자에서 나타나는 염증성-카이토카인의 분비 증가 정도를 효과적으로 확인할 수 있으므로， 상기 조혈전구세포 모델의 제조 방법은 BD의 발병 연구를 위한 인간 유래 세포 모델로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은
i) 베체트병 iPSCs 모델로부터 배상체 (embryoid body, EB) 또는 조혈전구세포 (HPCs)로 분화를 유도하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 유도된 배상체의 분화 마커 또는 조혈전구세포와 특징을 분석하는 단계를 포함하는， iPSCs 또는 조혈전구세포를 베체트병의 모델로 사용하는 방법을 제공한다.
상기 배상체의 분화마커는 외배엽 (ectoderm) 마커인 NESTIN 및 TUJ1, 내배엽 (endodenn) 마커인 S0X17 및 F0XA2, 및 중배엽 (mesoderm) 마커인 알파-평활근 액틴 ( α-smooth muscle actin, α-SMA) 및 DESMIN 중 어느 하나 이상을 발현하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다.
상기 조혈전구세포는 하기 i) 내지 vi) 중 어느 하나를 특징으로 하는 것이 바람직하나， 이에 한정되지 않는다:
i) CD43 및 CD45를 포함하는 조혈 마커 발현;
ii) SCL, GATA1, GATA2, KDR, CD34, CD43 및 CD45를 포함하는 조혈 마커 유전자 발현;
i i i ) 정상 세포에 비해, IL-6, IL-8 및 TNF a를 포함하는 전-염증성 사이토카인의 분비 수준 증가; 및
iv) 정상 세포에 비해， CXCL1 유전자의 발현 수준 증가;
V ) 정상 세포에 비해, CXCL1 단백질의 분비 수준 증가; 및
vi ) 정상 세포에 비해， IL-2 유전자의 발현 수준 증가. 본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에 있어서， 본 발명자들은 BD 환자의 체세포， iPSCs 및 이로부터 분화된 HPCs에서 발현되는 유전자가 정상 세포의 유전자 발현 양상과 비교하였을 때 차이를 나타내는 유전자를 선별하기 위해， 마이크로어레이 분석을 통한 정상 세포 및 BD 환자 유래 세포의 유전자 발현 수준을 비교한 결과 (도 6a 참조)， BD 환자 유래의 섬유아세포 및 iPSCs에서는 유의적인 발현 차이를 나타내지 않는 반면， BD-HPCs에서 정상 대조군에 비해 1.7배 이상 발현 수준이 증가하는 유전자로서， 217개의 사이토카인， 케모카인 및 이들의 수용체 패밀리를 암호화하는 유전자를 선별하였다 (도 6 참조) .
또한， BD 환자 체세포에서 전염증성 사이토카인의 분비 수준이 유의적으로 높으며， BD-HPCs 또한 동일한 특징을 나타내는 것을 확인한 반면， BD-HPCs에서 IL-6, IL-8및 TNF α를 포함하는 사이토카인 및 케모카인의 유전자 발현 정도가 변화하지 않았으므로 (도 7 참조)， BD 환자와 연관된 신규한 유전자를 추가적으로 선별하기 위해서, BD와 유사한 증상을 가지는 것으로 보고된 류마티스 관절염 (Rheumatoid arthr i t i s , RA)환자로부터 유래된 iPSCs및 HPCs를 제작하여 BD-HPCs와 유전자 발현 양상을 비교한 결과，총 217개 유전자 중에서 사이토카인 및 케모카인 관련된 유전자만이 BD-HPCs 및 RA-HPCs에서 공통적으로 조절되는 유전자로서 11 개의 유전자를 선별하였다 (도 8 참조) . 또한， BD 환자에 대하여, 약물 반웅을 예측할 수 있도록 하는 분자적인 바이오마커를 선별하기 위해서, BD 환자의 치료에 사용되고 있는 약물인 프레드니솔론 (predni solone , PRED) 또는 황산히드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine sul fate , HCQ)의 처리 유무에 따른 BD-HPCs 내 유전자 발현 변화를 확인한 결과， BD-HPCs에서 정상 대조군에 비해 높은 발현 수준을 나타내나， 약물 처리 후 정상 수준으로 발현 수준이 감소하는, BD 바이오마커 후보군 유전자로서 AGTR2 , CA9 , CD44 , CXCL1 , HTN3 , IL-2 , PTGER4 및 TSLP의 8 개 유전자를 선별하였다 (도 9 및 도 10 참조) .
또한， 본 발명자들은 선별한 BD특이적인 바이오마커가 BD지표로서 혈청 조직 및 세포 시료 내에서 측정될 수 있는지 확인하기 위해， CXCL1을 대상으로 배양액에 분바된 단백질 발현 수준 및 유전자 발현 수준을 확인한 결과， BD-HPCs에서 정상 대조군에 비해 유의적인 단백질 분비 수준 및 유전자 발현 수준의 증가를 나타내는 것을 확인하였으며， BD-HPCs에서 나타나는 CXCL1 분비 수준의 증가 정도는 BD 환자의 체세포 또는 BD-iPSCs에서 나타나는 바에 비해 현저한 차이를 나타내는 것을 확인하였다 (도 11 및 도 12 참조) .
또한， 본 발명에서 선별한 BD 바이오마커를 BD에 대한 약물 스크리닝에 적용할 수 있는지 여부를 확인하기 위해서， 34개의 약물을 처리한 BD-HPCs에서 CXCL1의 분비 수준을 확인한 결과， IL-6 및 CXCL1이 약물 처리에 대해 BD-HPCs에서 분비 경향은 유사하나， CXCL1이 IL-6에 비해 약물에 대한 민감도가 높은 것을 확인하였다 (도 13 참조) . 따라서， 본 발명의 BD 환자 유래의 iPSCs 및 이로부터 분화된 조혈전구세포는 BD 환자에서 나타나는 유전자 발현 패턴을 유사하게 유지하고 있을 뿐 아니라， 약물에 대한 유전자 발현 및 염증성 -사이토카인 분비 수준의 변화를 유의적으로 확인할 수 있으므로， 상기 BD 환자 유래의 iPSCs 및 이로부터 분화된 조혈전구세포는 BD의 진단 및 치료제 스크리닝 방법의 세포 모델로서， CXCL1은 바이오마커로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 하기 유전자 또는 하기 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍을 하나 또는 둘 이상 포함하는, 베체트병 (Behcet ' s di sease , BD)의 진단용 키트를 제공한다.
또한， 본 발명은 하기 유전자 또는 하기 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍을하나 또는 둘 이상 포함하는, 베체트병 (Behcet ' s di sease , BD)의 진단용 키트의 용도를 제공한다.
서열번호 1의 염기서열로 구성되는 AGTR2(angiotensin I I receptor , type 2) 유전자;
서열번호 2의 염기서열로 구성되는 CA9(carboni c anhydrase IX) 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 CD44 유전자;
서열번호 4의 염기서열로 구성되는 HTN3(hi stat in 3) 유전자;
서열번호 5의 염기서열로 구성되는 PTGER4( pros tag land in E receptor 4， subtype EP4) 유전자; 및
서열번호 6의 염가서열로 구성되는 TSLP thymi c stromal lymphopoiet in) 유전자.
본 발명의 베체트병의 진단용 키트에는 추가로 하기 유전자 또는 하기 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍을 하나 또는 둘 이상 포함할 수 있으나， 이에 한정되지 않는다:
서열번호 7의 염기서열로 구성되는 CXCL1 유전자; 및
서열번호 8의 염기서열로 구성되는 IL-2 유전자.
본 발명의 베체트병 바이오마커는 베체트병 세포 모델에서 유의적으로 증가하는 발현 수준을 나타낼 뿐 아니라， BD 치료제를 처리하였을 때 발현 수준이 정상 세포 수준으로 감소하며， 이러한 증가 또는 감소하는 발현 수준은 기존에 베체트병 바이오마커로 사용되고 있는 IL-6 보다 유의적인 민감성을 나타내므로， 상기 바이오마커 유전자는 베체트병의 진단용 키트에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 베체트병의 진단용 키트에 있어서， 베체트병 바이오마커 유전자의 발현 수준을 분석하는 제제는 상기 유전자에 톡이적으로 결합하는 프라이머，프루브 또는 안티센스 뉴클레오티드이며，상기 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 베체트병의 진단용 키트는， RT-PCR( Reverse transcr ipt ion polymerase chain react ion) 키트， 경쟁적 PCR( compet i t ive PCR) 키트, 실시간 PCR(real-t ime PCR)키트, RNase보호 분석법 (RNase protect ion assay, RPA)키트， 노던 블럿팅 (Northern blot t ing) 키트 또는 DNA 칩 키트 등의 형태로서 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않고， mRNA 또는 DNA에 상보적으로 결합하는 방식을 이용한다면 당업자에게 알려진 모든 공지의 방법을 통해 이루어질 수 있다. 또한， 본 발명은 하기 단백질 또는 하기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 하나 또는 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 하는， 베체트병의 진단용 키트를 제공한다.
또한， 본 발명은 하기 단백질 또는 하기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 하나 또는 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 하는， 베체트병의 진단용 키트의 용도를 제공한다.
서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 AGTR2(angiotensin I I receptor , type 2) 단백질;
서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 CA9(carbonic anhydrase IX) 단백질;
서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되는 CD44 단백질;
서열번호 12의 아미노산 서열로 구성되는 HTN3(hi stat in 3) 단백질; 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 PTGER4(prostaglandin E receptor 4， subtype EP4) 단백질; 및
서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 TSLP( thymi c stromal lymphopoiet in) 단백질.
본 발명의 베체트병의 진단용 키트는 추가로 하기 단백질 또는 하기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 하나 또는 둘 이상 포함할 수 있으나， 이에 한정되지 않는다:
서열번호 15의 아미노산 서열로 구성되는 CXCL1 단백질; 및
서열번호 16의 아미노산 서열로 구성되는 IL-2 단백질. 본 발명의 베체트병 바이오마커는 베체트병 세포 모델에서 유의적으로 증가하는 분비 수준을 나타낼 뿐 아니라， BD 치료제를 처리하였을 때 분비 수준이 정상 세포 수준으로 감소하며， 이러한 증가 또는 감소하는 분비 수준은 기존에 베체트병 바이오마커로 사용되고 있는 IL-6 보다 유의적인 민감성올 나타내므로， 상기 바이오마커 단백질은 베체트병의 진단용 키트에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 베체트병의 진단용 키트는， ELISA(Enzyme-l inked i腿 nosorbent assay) 키트， 샌드위치 ELISA 키트， 단백질 칩 키트， 래피드 (rapid) 키트 또는 MRKMul t iple react ion moni tor ing) 키트 등의 형태로서 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않고， 펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열에 상보적으로 결합하는 방식을 이용한다면 당업자에게 알려진 모든 공지의 방법을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 베체트병의 진단용 키트에 있어서， 상기 항체는 다클론 항체 및 단클론 항체 모두를 포함할 수 있다.
다클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원 (ant igen)으로 상기 단백질 또는 그의 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 이러한 외부 숙주로는 마우스, 랫트， 양， 토끼와 같은 포유동물을 예로 들 수 있으며， 면역원은 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제 (adjuvant )와 함께 근육내， 복강내 또는 피하주사 등의 방법으로 투여되어 외부 숙주를 면역화시킨다. 면역화된 외부 숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성올 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제하여 본 발명의 베체트병 바이오마커 단백질에 특이적인 다클론 항체를 제조할 수 있다.
단클론 항체는 당업자에 알려진 융합 ( fus i on)에 의한 불멸화된 세포주 생성방법 (Kohler G et al . , Nature , 256 : 495-497 , 1975)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법을 간략히 설명하면， 먼저 순수한 본 발명의 베체트병 바이오마커 단백질 단백질 또는 그의 단편으로 마우스를 면역시키거나， 이의 펩티드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역시킨다. 면역이 된 마우스로부터 분리한 항체 -생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종세포와 융합하여 불멸화된 하이브리도마 세포를 생성한다. 이어， 효소면역분석법 (ELISA; Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)으로 하이브리도마 세포의 단클론 항체의 생성 여부를 조사하여 양성 클론을 선발하고 이를 배양한 후 항체를 분리， 정제하거나 쥐의 복강에 주입한 후 복수를 채취하여 본 발명의 베체트병 바이오마커 단백질에 특이적인 단클론 항체를 제조할 수 있다.
또한， 본 발명의 베체트병 바이오마커 단백질의 검출에 사용되는 항체는
2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab ' ) , F(ab ' )2 및 Fv 등이 있다.
상기 본 발명의 베체트병 바이오마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질 (sol id substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지로 제작된 웰플레이트， 니트로셀를로오스， 유리기판, 금속기판， 유리섬유， 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한， 상기 합성수지에는 폴리에스터， 폴리비닐， 폴리염화비닐， 폴리스티렌， 폴리프로필렌 PVDF 및 나일론 등이 있다. 또한, 개체로부터 수득된 시료를 고형 기질에 결합된 본 발명의 베체트병 바이오마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 경우， 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.
상기 키트는 추가로 상기 본 발명의 베체트병 바이오마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 특이적으로 결합하는 검출체를 포함할 수 있다. 상기 검출체는 발색효소， 형광물질， 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등으로 표지한 접합체 (conjugate)일 수 있고， 바람직하게는 상기 본 발명의 베체트병 바이오마커 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체일 것이다. 예를 들어， 상기 발색효소는 퍼록시다제 (peroxidase) , 알칼라인 포스파타제 (alkal ine phosphatase) 또는 산성 포스파타제 (acid phosphatase) [예: 양고추넁이 퍼록시다제 (horseradi sh peroxidase) ]일 수 있고; 형광물질인 경우， 콜로이드 골드 (Coloid gold) , 플루오레신카복실산 (FCA) , 폴루오레신 이소티오시아네이트 (FITC) , RITC(Rhodamine-B-i sothiocyanate) , 플루오레신 티오우레아 (FTH) , 7-아세록시쿠마린 -3-일， 플루오레신 -5-일， 플루오레신 -6-일， 2 ' , 7' -디클로로플루오레신 -5-일， 2 '，7 ' -디클로로플루오레신 -6-일， 디하이드로테트라메틸로사민 -4-일， 테트라메틸로다민 -5-일， 쎄트라메틸로다민 -6-일,
4， 4-디플루오로 -5， 7-디메틸 -4-보라 -3a， 4a-디아자 -s-인다센 -3-에틸 또는 4, 4-디플루오로— 5， 7-디페닐 -4-보라 -3a， 4a-디아자 -s-인다센 -3-에틸 등을 사용하는 것이 가능하나， 이에 제한되지 않는다.
상기 키트는 상기 항원항체 복합체의 항원항체 반웅을 측정하는 방법 또는 상기 항원항체 복합체에 검출체를 처리한 후 검출체의 양을 측정함으로써 MCI를 진단할 수 있다. 상기 항원항체 반웅으로서 효소면역측정법 (ELISA) , 면역침강법， 형광면역법， 효소기질발색법， 항원항체웅집법 등을 돌 수 있고， 검출체의 양 측정이나 존재 검출은 발색， 형광， 발광, 화학발광 (chemi luminescence) , 흡광도， 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다.
상기 검출체의 양을 탐색하는 방법으로는 초고속 스크리닝 (high throughput screening, HTS) 시스템을 이용하는 것이 바람직하고， 여기에는 검출체에 결합된 발색효소의 발색을 유도하는 기질을 처리하여 발색반웅을 측정하는 방법; 감출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법; 검출체의 표지 없이 표면의 폴라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRKsurface plasmon resonance imaging)방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. _
예를 들어 발색을 유도하는 기질은 발색효소에 따라 선택하여 사용하는 것이 바람직하며， TMB (3 , 3' , 5, 5 ' -tetramethyl bezidine) , ABTS [2 , 2 ' -azin으 Ms ' (3— ethylbenzothiazol ine一 6— sul fonic acid)] , OPD (o— phenyl enedi amine) 등을 사용할 수 있다. 이때， 발색제 기질은 완충용액 (0.1 M NaAc , pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 검출체에 결합된 발색효소에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고 그 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 본 발명의 베체트병 바이오마커 단백질 단백질의 존재 유무를 검출한다. 또한， 상기 형광법은 형광 스캐너 프로그램을 이용하여 상기 형광물질로 라벨링된 검출체를 스포팅하여 신호를 확인하는 방법으로， 이 방법을 적용하여 결합 정도를 확인할 수 있다. 상기 SPR 시스템은 형광법과는 달리 시료를 형광물질로 표지할 필요가 없이 항체의 결합 정도를 실시간으로 분석하는 것이 가능하나 동시다발적인 시료 분석이 불가능하다는 단점이 있다. SPRI의 경우에는 미세정렬 방법을 이용하여 동시다발적인 시료 분석이 가능하지만 탐지 강도가 낮은 단점이 있다.
상기 키트는 상기 항원항체 결합 반응 및 검출체의 결합반웅 후, 남은 물질들을 제거하기 위한 세척액을 추가로 포함할 수 있다. 상기 세척액은 인산염 완층용액， NaCl및 트원 20(Tween 20)을 포함하는것이 바람직하며， 0.02 M 인산염 완충용액， 0.13 M NaCK 및 0.05% 트휜 20(Tween 20)으로 구성된 완충용액 (PBST)이 더욱 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 세척액은 항원항체 결합반웅 후 항원항체 결합체에 검출체를 반웅시킨 다음 적당량을 고정체에 가하여 3 내지 6회 세척한다. 반웅 정지용액은 바람직하게는 황산 용액 (H2S04)이 사용될 수 있으나， 이에 제한되지는 않는다.
상기 키트는 본 발명의 베체트병 바이오마커 단백질 표준 항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한,본 발명의 베체트병 바이오마커 단백질 발현 수준 측정은 단백질 칩 분석， 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이， MALDI-TOF(Matrix Desorpt ion/Ionizat ion Time of Flight Mass Spectrometry)분석， SELD Iᅳ TOF (Su If ace Enhanced Laser Desorpt ion/Ionizat ion Time of Flight Mass Spectrometry)분석， 방사선 면역분석， 방사 면역확산법， 오우크테로니 면역 확산법， 로케트 면역전기영동， 조직면역 염색, 보체 고정 분석법， 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석 (liquid chromatographyᅳ Mass Spectrometry, IXᅳ MS)， LC-MS/MS( 1 i quid chromatographyᅳ Mass
Spectrometry/ Mass Spectrometry) , 웨스턴 블릿"， EL I SAC enzyme linked i誦 unosorbentassay) 및 샌드위치 ELISA로 구성된 군으로부터 선택할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 본 발명은
i) 개체로부터 분리된 시료를 본 발명의 키트에 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 처리한 키트에서 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 분석하는 단계 ; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 분석한 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군과 비교하여 증가하는 경우 상기 개체를 베체트병에 걸리거나 또는 베체트병에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 베체트병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 본 발명의 베체트병 바이오마커는 베체트병 세포 모델에서 유의적으로 증가하는 분비 수준을 나타내어， 기존에 베체트병 바이오마커로 사용되고 있는 IL-6 보다 유의적인 민감성을 나타내므로， 본 발명의 베체트병 바이오마커 유전자 및 단백질은 베체트병의 진단 방법에 유용하게 사용될 수 있다. 아울러 , 본 발명은
i) 본 발명의 키트에 피검물질을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 처리한 키트에서 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 분석하는 단계; 및
iii) 상기 단계 Π)에서 분석한 유전자 또는 단백질의 수준이 무처리 대조군에 비교하여 감소하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는， 베체트병의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 베체트병 바이오마커는 베체트병 치료제를 처리한 베체트병 세포 모델에서 정상 세포 수준으로 발현 수준이 감소하여, 기존에 베체트병 바아오마커로 사용되고 있는 IL-6 보다 유의적인 민감성을 나타내므로， 본 발명의 베체트병 바이오마커 유전자 및 단백질은 베체트병의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있다. 이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 베체트병 (Behcet's disease, BD) 유래의 유도 -만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPSCs)의 제조
<1-1>베체트병 환자 및 건강한 대조군의 선별 및 시료의 수득
본 발명의 실시예를 수행하기 위해서， BD 환자와 건강한 대조군을 선별하고， 이들로부터 체세포 (somatic cell)을 수득하였다.
구체적으로, BD여성 환자 2명 (평균 나이 : 39±1서 1)및 건강한 대조군인 여성 2 명 (평균 나이: 61±10 세)으로부터 생검 (biopsy)을 수행하여 진피의 섬유아세포 (Dermal fibroblast, DF) 및 활액세포 (synovial cell, SNC)를 분리하였다. 혈액 시료는 남성 4 명 및 여성 3 명의 총 7 명으로 구성된 BD 환자군 (평균 나이: 46.8±9.3 세) 및 건강한 대조군 (평균 나이: 55.0±3.8 세)으로부터 각각 수득하였다. 이들의 진단은 베체트병에 대한 국제 연구 그룹의 진단 기준에 기반하였다 (O'Neill, T.W. et al . , 1994. Br J Rheumatol. 33:115-117.). 또한， 모든 연구는 국가생명윤리심의위원회 (Korea National I Inst itute for Bioethics Pol icy; KoNIBP)에서 승인한 바를 따랐다 ( IRB no . P01-201404-BS-05) .
그 결과， 하기 [표 1]에 기재된 바와 같이 BD 환자 및 건강한 대조군을 선별하였고， 이로부터 활액세포 (SNC) 또는 진피 섬유아세포 (DF)를 체세포로서 수득하였다.
【표 11
본 발명의 BD-iPSCs 및 대조군 -iPSCs를 제조하기 위한 체세포를 수득한 정보
Figure imgf000030_0001
<1-2> BD유래의 iPSCs(BD~iPSCs)의 제조 " " 본 발명의 실시예를 수행하기 위하여， 0CT4, S0X2 , C-MYC 및 KLF4를 발현하는 레트로바이러스 (retrovirus)를 이용한 리프로그래밍 배양 (Son, M.Y. et al., 2013)을 통해 BD 환자 체세포로부터 전분화능을 가진 iPSCs(BD-iPSCs)를 제작하였다 (도 2). r 구체적으로， 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 BD 환자 유래의 DF 및 SNC에 0CT4, S0X2, C-MYC 및 KLF4를 인코딩 (encoding)하는 레트로바이러스를 형질감염한 후， 미토마이신 C mitomycin C; Sigma 사， 미국)을 처리한 MEF 지지체 (feeder) 위에 두었다 (Son, M.Y. et al. , 2013； Son, M.Y. et al. , 2014) . 형질감염된 세포는 20% 낙아웃 SR(knockout SR; Invitrogen 사， 미국)， 1% 비 -필수 아미노산 (Non-Essential Amino acids, NEAA; Invitrogen사， 미국)， 1 mM L-글루타민 (L-glutamine; Invitrogen 사， 미국)， 0.1 mM 베타-머갑토에탄을 (β-mercaptoethanol; Sigma 사， 미국) 및 10 ng/ H FGF2(bFGF; Invitrogen 사， 미국)를 포함하는 DMEM/F12 배지 (Invitrogen 사， 미국)로 구성된 인간 iPSCs 배지를 매일 갈아주면서 배양하였다. 배양 개시 2 또는 3 주 후에 인간 배아 줄기 세포 (human embryonic stem cell, hESCs)와 유사한 iPSCs 집락 (colony)를 수득하였다. 수득한 BD 유래 iPSCs(BD-iPSCs)는 이전에 공지된 바를 따라 인간 iPSCs 배지의 MEF 지지체 층에서 유지하거나， mTeSRl ( STEMCELL Techno 1 og i es사， 캐나다 )또는 MEF-조건된 배지의 매트리겔 ( BD biosciences 사， 미국) 위에서 유지하였다 (Son, M.Y. et al. , 2011a). 대조군으로는， 건강한 대조군의 SNC 또는 DF 세포를 상기와 동일한 방법을 수행하여 대조군 iPSCs의 제작올 유도하였으며， 인간 배아 줄기 세포주 (hESC line)인 H9 세포주 (WiCell Research Insititute, 미국)을 사용하였다.
<실시예 2> BD유래 iPSCs의 특징 확인
<2-1> BD—iPSCs의 형태학적 (morphology) 특징 확인
BI)-iPSCs의 형태학적 특징을 확인하기 위하여， BD-iPSCs의 집락 형태 및 핵형을 확인하였고， 단연쇄반복 (Short Tandem Repeat , STR) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시예 <1-2>과 동일한 방법으로 BE)ᅳ iPSCs의 리프로그래밍을 유도한 다음， 위상차 현미경 (phase-contrast microscopy)으로 BD-iPSCs 집락의 형태를 확인하였다. 또한, 젠딕스 사 (GenDix Inc . , 한국)에 의뢰하여 표준 염색체 Gᅳ결합 분석 (Strandard chromosomal G-banding analysi s)을 통해 핵형 분석을 수행하였다. 아울러, 휴먼패스 사 (HumanPass Inc . , 한국)에 의뢰하여 대조군 -iPSCs 및 BD-iPSCs의 STR 유전형질 분석 (STR genotyping)을 수행하고， 이를 정상 인간 배아줄기세포주인 H9 hESCs와 비교하였다.
그 결과， 도 3a , 도 3b 및 하기 [표 2]에서 나타난 바와 같이， BD-섬유아세포로부터 유래된 BD— iPSCs의 유전적인 동일성 ( ident i ty)를 확인하였고 (표 2)， 제작된 BD-iPSCs는 인간 배아줄기세포 (hESCs)와 유사한 집락 형태 및 핵형을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3a 및 도 3b) .
【표 2】
BD 환자유래의 iPSCs에 대한 STR프로파일
Figure imgf000032_0001
<2-2> BD_iPSCs의 AKAlkal ine phosphatase) 염색
BD 환자로부터 유래한 BD-iPSCs의 전분화능 특성을 확인하기 위하여 전분화능 마쩌인 알칼라인 포스파타아제 염색 (Alkaline phosphatase staining, AP staining)을 실시하였다.
구체적으로, AP 염색 키트 (Alkaline phosphatase kit, Sigma Aldrich사， 미국)를 사용하여 구연산 (citrate)-아세톤—포름알데하이드 (Formaldehyde) 용액을， 상기 실시예 <1-2〉에서 제작한 BD-iPSCs에 가하여 고정 (fix)한 다음， 나프를 /패스트 레드 바이올렛 (Naphthol/ Fast Red violet)을 포함하는 AP 염색 용액을 가하여， 15 분 동안 상온에 방치하여 염색하였다. 염색 후， 세포 이미지는 위상차 현미경 (Phase contrast microscope) (모델명 : 1X51；올림푸스 사, 일본)을 이용하여 촬영하였다.
그 결과， 도 3a에서 나타난 바와 같이 BD-iPSCs는 전분화능 마커인 AP에 양성 염색됨올 확인하였다 (도 3a).
<2-3> BD유래 iPSCs의 다분화능 (pluripotency) 마커 단백질 발현 확인
BD 환자로부터 유래된 미분화 상태의 BD-iPSCs가 전분화능을 나타내는지 추가적으로 확인하기 위하여， BD-iPSCs에서 전분화능 마커 (pluripotency maker) 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2>에서 제작한 BEHPSCs에 4% 포름알데히드 (formaldehyde)를 처리하여 실온에서 20 분간 고정하고， 0.1% 트리톤 X-lOO(tritonX-lOO)을 포함하는 PBS용액을 20분간 처리하여 세포막에 투과성 (Permeability)를 부여하였다. 처리 후， 상기 처리한 세포를 2% 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA)로 1시간 동안 차단 (blocking)한 다음， 1차 항체로 항ᅳ 0CT4 항체 (1:200 희석 , sc-9081, Santa Cruz Biotechnology 사, 미국),항 -NAN0G항체 (1:100희석， sc-33759, Santa Cruz Biotechnology사， 미국)， 항 -TRA-1-60 항체 (1:100 희석， MAB4360, Chemicon 사， 미국) 또는 항—SSEA4 항체 ( 1： 100희석， MAB1435， R&D Systems사,미국)를 각각 처리하여 4°C에서 밤새 배양한 후， PBEST로 여러 번 세척하였다. 세척 후， 알렉사 플루오르 488(Alexa Fluor 488) 또는 알렉사 플루오르 594(Alexa Fluor 594)가 결합된 2차 항체 (1:400 희석， Invitrogen 사， 미국)를 처리하고 1 시간 동안 실온에서 방치한 다음， 최종적으로 다시 PBST로 세척하여 BD-iPSCs를 면역형광염색하고， 형광 현미경 (fluorescence microscope; 제품명 : Ax i overt 200M microscope; Carl Zeiss 사, 독일) 또는 위상차 현미경 (올림푸스 사， 일본)으로 관찰하여 0CT4, NANOG, TRA-1-60 및 SSEA4 단백질의 발현을 확인하였다. 발현의 정도를 대조하기 위해 4'6-디아미디노 -2-페닐인돌 (4'6-diamidir -2-phenylindole, DAPI)을 처리하여 세포의 핵을 염색하여 비교하였다.
그 결과， 도 3a에서 나타난,바와 같이 BD-iPSCs에서 전분화능 마커인 0CT4, NANOG, TRA-1-60 및 SSEA4 단백질이 정상 세포 수준으로 발현하는 것을 확인하였다 (도 3a) ·
<2-4> BD유래 iPSCs의 다분화능 (pluripotency) 마커 유전자발현 확인
BD환자로부터 유래된 口ᅵ분화 상태의 BD-iPSCs가 전분화능을 나타내는지 추가적으로 확인하기 위하여， 정량적 실시간 PCRCQuantitative real-time PCR, qRT-PCR)을 수행하여 BI)-iPSCs에서 전분화능 마커 유전자의 mRNA 전사 수준을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2〉의 방법을 수행하여 BD-iPSCs을 제작한 다음， RNeasy 미니 키트 (Qiagen 사， 미국)를 사용하여 제조사의 제공된 프로토콜을 따라ᅳ BD-iPSCs로부터 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA 1내지 2 /g을 주형으로 하고， Superscript III cDNA 합성 키트 (Invitrogen 사， 미국)를 이용하여 세포 유전체의 cDNA를 합성하기 위한 역전사 PCR(reverse transcruption PCR, PT-PCR)을 수행하였다. RT-PCR 종료 후, 상기 RT-PCR의 반웅 산물 및 하기 [표 3]에 기재된 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여， ABI PRISM 7500 Fast Real-time PCR systemCAp l ied Biosystems 사， 미국)을 이용하껴 qRT-PCR반웅을 수행하였다. 발현 수준을 보정하기 위한 대조군으로 GAPDH 유쟌자를 상기와 동일한 방법을 수행하여 발현량을 확인하였으며， hESC에서의 발현량을 기준으로 하여 대조군 및 BD환자의 SNC또는 DF시료， 및 이로부터 제작된 각각의 iPSCs에서의 0CT4, S0X2, NAN0G및 REX1유전자의 mRNA 상대적인 발현 수준 (fold relative to hESC)올 계산하였다. 모든 실험은 각각의 시료 당 3 회 반복 수행하였으며， 각각의 타겟 유전자에 대한 CT 값은 제조사에 의해 제공되는 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.
【표 3】
본 발명에서 정량적 실시간 PCR(Quant i tat ive real-t ime PCR, qRT-PCR)을 수행하기 위해 사용한 프라이머 및 이의 서열
그 결과， 도 3c에서 나타난 바와 같이 대조군 및 BD 환자 유래의 SNC 및 DF 시료에서는 전분화능 마커 유전자인 0CT4, S0X2, NAN0G 및 REX1 유전자의 mRNA 발현 수준이 나타나지 않는 것이 비해， 대조군 및 BD 환자 유래의 iPSCs에서는 0CT4, S0X2, NAN0G 및 REX1 유전자의 mRNA 발현 수준이 hESC와 유사한 수준으로 발현하는 것을 확인하였다 (도 3c).
<2-5>시험관 내 (In vitro)에서 BD유래 iPSCs의 다분화능 확인
BD 유래의 iPSCs가 시험관 내에서 전분화능 (pluripotent)을 나타내는지 확인하기 위해， BD-iPSCs로부터 배상체 (embryoid body, EB)를 형성하도록 분화를 유도한 다음， BD-배상체에서 내배엽 (endoderm) 마커인 S0X17 및 F0XA2, 중배엽 (mesoderm)마커인 알파-평활근 액틴 ( a -smooth muscle act in, α-SMA)및 DESMIN, 및 외배엽 (ectoderm) 마커인 NESTIN 및 TUJ1의 세 가지 배엽 (germ layer) 마커의 발현을 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2>의 방법을 수행하여 제작한 BD-iPSCs을， 10% 혈청 대체물 (serum replacement, SR)을 포함하는 DMED/F12 배지인 배상체 분화 배지 (embryoid body differentiation medium)에서 7 일간 배양하여 BD-iPSCs유래의 배상체 (BD-EB)로 분화를 유도하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <2-3>과 동일한 방법으로 면역형광염색하여 NESTIN, TUJ1, S0X17, F0XA2, a-SMA 또는 DESMIN 단백질의 발현을 확인하였다. 상기 면역형광염색을 위한 1차 항체로서 항 -DESMIN 항체 (1:50 희석; AB907, Chemicon 사， 미국)， 항 -a-SMA 항체 (1:400희석; A5228, Sigma-Aldr ich사， 미국), 항 -F0XA2항체 (1:500희석; ab40874, Abeam사， 미국) , 항 -S0X17항체 (1:100희석； MAB1924, R&D Systems사， 미국)， 항 -TUJ1항체 (1:500희석 ; PRB-435P, Covance사， 미국) 또는 항 -NESTIN 항체 (1:100 희석; MAB5326, Chemicon 사， 미국)를 각각 사용하였고， 발현의 정도를 대조하기 위해 4'6-디아미디노— 2-페닐인돌 (4'6-diamiclino-2-phenynndole, DAPI)을 처리하여 세포의 핵을 염색하여 비교하였다.
그 결과，도 3d에서 나타난 바와 같이 BD분화세포는 NESTIN, TUJ1, S0X17, F0XA2, α-SMA또는 DESMIN 단백질의 세 가지 형태 배엽 마커를 모두 발현하여 전분화능을 나타내는 것을 확인하였다 (도 3d).
<2-6>생체 내 (In vivo)에서 BD유래 iPSCs의 다분화능 확인
BD 유래의 iPSCs가 생체 내에서 전분화능 (pluripotent)을 나타내는지 확인하기 위해 , 면역력 저하 누드마우스에서 BD-iPSCs의 기형종 형성 (teratoma format ion)을 수행하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법을 수행하여 제작한 BD-iPSCs를 1X106세포로 계수하여 매트리겔과 흔합한 다음， SPF/VAF면역결핍 누드마우스 (오리엔트 바이오 시ᅳ， 한국)의 등 옆부분 지역 (dors으 lateral area)에 피하로 주입한 후， 마우스를 사육하였다. 주입 후 2 개월이 경과한 후에， 상기 마우스를 희생한 후， 기형종을 수득하여, 4% 포름알데하이드를 가하고 파라핀에 고정하였다. 그런 다음， 파라핀에 포매한 (embedded) 조직을 잘라내어， 해마토실린 (hematoxylin) 및 에오신 (Eos in)올 처리하여 H&E 염색 (Hematoxylin & Eosin staining)을 통해 내배엽 (endoderm) , 외배엽 (ectoderm)및 중배엽 (mesoderm)의 기형종 (teratoma)형성을 확인하였다. 그 결과， 도 3e에서 나타난 바와 같이 BD-iPSCs로부터 외배엽인 표피 조직 (Epidermis), 중배엽인 지방세포 (Adipose tissue) 및 연골 (cartilage), 및 내배엽인 내장 -유사 상피 세포 (Gut-like epithelium)에서 기형종이 형성되는 것을 확인하였다 (도 3e).
<실시예 3> BD 유래의 조혈 조혈좋조조전구체 세포 (hematopoietic progenitor cells, HPCs)의 분화유도
<3-1> BD_iPSCs로부터 HPCs로의 분화유도
BD 환자로부터 수득한 혈청 내에서 특이적인 사이토카인의 수준이 증가하거나 변하는 것은， BD에 대한 질병의 마커 또는 위험 인자가 될 수 있다 (Agrawal et al. , 2014； Aktas Cetin et al. , 2013) . 추가로， 다양한 성장 인자, 사이토카인， 및 케모카인의 비정상적으로 조절된 생산은 조혈전구세포에 의해 분비되어， 최종적으로 분화된 세포 (hematopoietic cell)는 BD 환자 내의 면역반응과 연관되어 나타난다 (Durante et al. , 1994； Leek et al. , 1994) . 따라서， 본 발명자들은 BI)-iPSCs으로부터 분화된 HPCs를， BD에 대한 모델로서 사용할 수 있는지 확인하기 위해， 도 4a에 나타난 모식도와 같이, 이전에 공지된 방법을 따라 지지체가 없고 (feeder-free), 청이 없는 (serum-free)， 정의된 시스템을 사용하여 BD-iPSCs을 HPCs으로 분화 유도하였다 (Salvagiotto et al. , 2011) (도 4a).
구체적으로, 인간 플라즈마 피브로넥틴 (human plasma fibronectin; Invitrogen사， 미국)을 6_웰 플레이트에 3 mg/cm2으로 전 -코팅하고， Rho—연관된 인산화 효소 (Rho-associated kinase) (제품명: H1152, Sigma 사， 미국)의 억제제를 첨가한 mTeSRl 배지를 첨가하였다. 그런 다음, 상기 실시예 <1-2〉와 동일한 방법을 수행하여 제작한 BD-iPSCs에 TrypLE Invitrogen 사, 미국)을 처리한 후， 상기 mTeSRl 배지에 접종하여 배양하였다. 24 시간 후에， mTeSRl 배지를 제거하고， 하기 [표 4]에 기재된 조성을 포함하는 IMDM lnvitrogen사, 미국)인 조혈 몰입 배지 (hematopoietic co麵 itment medium)에서 BEHPSCs를 6 일 동안 추가 배양하였다. 그런 다음， 상기 조혈 몰입 배지를 제거하고, 하기 [표 4]에 기재된 조성을 포함하는 IMDM인 조혈 성숙 배지 (hematopoietic maturation medium)에서 BD-iPSCs를 7 일 동안 추가 배양하여， BD-iPSCs로부터 분화된 HPCs(BD-HPCs)를 수득하였다. 모든 배양은 질소로 균형을 맞춘， 5% 산소 (02)의 저산소 환경에서 수행되었다.
【표 4】
본 발명에서 BD-HPCs 분화 유도를 위해 사용한 배지의 조성
배지명 ᄋ
노 물질명 제조사
조혈몰입배지 HIT Stem Cell Technologies사, 미국
1χ
450 mM 모노티오글리세롤 (monothiog Sigma사， 미국
lycerol )
0.1 mM 비—필수 아미노산 (NEAA) Invitrogen사, 미국
2 mM L-글루타민 Invitrogen사， 미국 50 ng/ad 재조합 인간 R&D Systems사， 미국
BMP4( recombinant human
BMP4)
50 ng/ l 재조합 인간 Invitrogen사, 미국
VEGF( recombinant human
VEGF)
조혈성숙배지 5 U/mi 해파린 (heparin) Sigma사, 미국
25 ng/ml 인간 재조합 FLT3L Peprotech사, 미국
25 ng/mi 트롬보포에이틴 (Thrombopoie Invitrogen사， 미국
tin, TP0)
25 ng/roe 인간 재조합 SCF Invitrogen사， 미국
10 ng/ml IL-3 Invitrogen사， 미국
10 ng/m« IL-6 Invitrogen사, 미국
<3-2>분화된 BIHPCs의 선별
상기 방법으로 분화된 BD-iPSCs 유래의 HPCs를 선별하기 위해， 유세포 분석 (flow cytometry analysis)을 수행하여 CD43 및 CD45 양성 세포를 선별하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <3-1>의 방법을 수행하여， BD-iPSCs로부터 BD-HPCs의 분화를 총 14 일 동안 유도하였다. 그런 다음， 상기 유도된 BD-HPCs를 수득하고， 0.25%트립신 (trypsin)/EDTA을 이용하여 분리하고， 1X106 세포 당 100 의 PBS/1% FBS를 가하여 세포를 현탁하였다. 그런 다음， 항- CD43-PE항체 및 항- CD45-APC항체 (이상 Miltenyi Biotech사， 독일)를 4°C에서 30 분 동안 처리하여 BD-HPCs를 표지하고， PBS/W FBS로 2 회 세척한 후， FACSCanto™ II시스템 (BD Biosciences사， 미국)을 이용하여 제조사의 제공하는 프로토콜에 따라 유세포 분석을 수행하였다. 수행한 결과는 BD FACSDiva 소프트웨어 (BD Biosciences 사, 미국)으로 분석하였다.
그 결과， 도 4b에서 나타난 바와 같이 14 일 동안의 분화 유도 후에，
BD-iPSCs 및 대조군 -iPSCs로부터 , 각각 80%이상의 세포가 CD43및 CD45에 대해 양성을 나타내는 HPCs로 분화된 것을 확인하였다 (도 4b).
<실시예 4> BD-iPSCs 유래 HPCs의 특징 확인 <4-l> BD-iPSCs유래 HPCs의 조혈 마커 유전자발현 확인
BD-iPSCs유래 HPCs(BD-HPCs)의 분화 효과를 확인하기 위하여 , qRT-PCR을 수행하여 BD 환자 및 대조군 유래의 SNC 및 DF의 체세포， iPSCs 및 HPCs에서 조혈 마커 유전자인 SCL, GATA1 , GATA2 , KDR, CD34, CD43및 CD45유전자의 mRNA 전사 수준을 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2>및 <3-1〉의 방법을 수행하여 BD-iPSCs 및 B으 HPCs의 분화를 유도하였다. 그런 다음， 상기 실시예 <2ᅳ4〉와 동일한 방법으로 qRT-PCR반웅을 수행하여， SCL, GATA1, GATA2, KDR, CD34, CD43및 CD45 유전자의 mRNA 전사 수준을 확인하였다. 발현 수준을 보정하기 위한 대조군으로 GAPDH 유전자를 상기와 동일한 방법을 수행하여 발현량을 확인하였으며， 대조군 -iPSCs에서의 상기 유전자의 발현량을 기준으로 대조군 및 BD환자의 SNC또는 DF시료， 이로부터 제작된 각각의 iPSCs, 및 HPCs에서의 조혈 마커 유전자의 mRNA 상대적인 발현 수준 (fold relative to iPSCs)를 계산하였다.
그 결과, 도 5a에서 나타난 바와 같이 대조군 및 BD 환자에서 유래된
HPCs 모두 효과적으로 분화되어， 조혈 마커 유전자인 SCL, GATA1, GATA2, KDR, CD34, CD43 및 CD45 유전자의 발현 수준을 유의적으로 나타내는 것을 확인하였다 (도 5a). <4-2> BD-iPSCs유래 HPCs의 조혈 계통 세포로의 분화가능성 확인
BD-HPCs가 다가 -계통 조혈 세포 (multi-lineage hematopoietic cell)로 분화될 수 있는지의 가능성을 확인하기 위해서， BD-HPCs를 조혈 계통 세포로 분화한 후 집락 -형성 단위 (colony-forming unit, CFU) 분석을 수행하였다. 구체적으로， 상기 실시예 <1-2>및 <3-1>의 방법을 수행하여 BD-iPSCs및 BD-HPCs의 분화를 유도하였다. 그런 다음， CD45 마이크로비드 (CD45 MicroBeads)를 사용하여 MACS 분리 (Magnetic Activated Cell Sorter separation)를 통해 정제한 CD45+ HPCs를， 상업적으로 사용 가능한 메틸셀를로오즈-기반의 무혈청 배지 (available methyl ce 1 lulose-based serum-free medium; 제품명: MethoCultTM Optimum; Cat no. 04034, Stem Cell Technologies 사， 미국)에서 3 주 동안 배양한 다음， 제조사의 제공하는 프로토콜을 따라 CFU 분석을 수행하였다. CFU 숫자는 도립 현미경 (inverted microscope)을 사용하여 수동적으로 계수하였다.
그 결과， 도 4d에서 나타난 바와 같이 대조군 -HPCs 및 BD-HPCs 모두가
BFU-E (적혈구계 세포; erythroid cells), C J-G (과립성 백혈구; granulocytes), CFU-M (대식 세포; macrophages) 및 CFU-GM (과립성 백혈구， 대식세포)와 같은 다가-계통의 조혈 세포로 분화되어, 질락 (colony)를 형성하는 것을 확인하였으며 (도 5b, 왼쪽)， 104 개의 세포 당 각각의 계통 -위탁 세포 (lineage-committed cells)에 대한 CFU숫자는 대조군 -HPCs및 BI)-HPCs간에 유의적인 차이를 나타내지 않음을 확인하였다 (도 5b, 오른쪽).
<4-3> BD-iPSCs 유래 HPCs의 조혈 계통 세포로의 분화 가능성 확인
BD에서 나타나는 대표적인 표현형을 BE)-HPCs에서 나타낼 수 있는지 확인하기 위해， BD환자에서 분비 수준이 증가하는 것으로 보고된 사이토카인인 IL-6, IL-8, TNFa 및 INFy를 포함하는 전-염증성 사이토카인의 분비 수준을 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2〉및 <3— 1>의 방법을 수행하여 BD-iPSCs및 BD-HPCs의 분화를 유도하여, 세포를 수득하였다. 수득한 세포는 파쇄한 후， 원심분리하고 세포 상층액 (cell seupernatant)을 분리한 다음， 인간 IL-6, 인간 IL-8 또는 인간 TNFa의 검출올 위해 사용하는 상업적 ELISA 키트 (모두 R&D systems 사， 미국)를 사용하여， 제조사의 제공하는 프로토콜을 따라 ELISA 분석올 수행하였다. 분석 후에는 Spectra Max M3 마이크로플레이트 리더기 (Molecular Devices사， 미국)를 사용하여 IL-6, IL-8및 TNF α의 농도를 정량하여， 건강한 대조군 유래의 iPSCs로부터 분화 유도한 HPCs와 비교하였다. 그 결과， 도 5c에서 나타난 바와 같이 건강한 대조군 유래의 iPSCs로부터 분화 유도된 HPCsCcon iPSCs-HPCs)에서 분비된 전-염증성 사이토카인의 농도에 비해 BD-HPCs에서 유의적으로 높은 발현 수준을 나타내어， IL-6는 1.7내지 1.8배 높은 분비 수준을 나타내었고， IL-8는 39.3내지 41.5배 높은 분비 수준을 나타내었으며， TNF a는 2.5 내지 5.6 내 높은 분비 수준을 나타내는 것을 확인하였다 (도 5c) . 이를 통해, 면역 반웅의 활성화 상태와 같은 BD의 병리학적인 증상에 대해 BD-iPSCs로부타 유래된 HPCs에서 유의적으로 나타낼 수 있으므로， BD-iPSCs가 베체트병의 모델로서 사용될 수 있음올 확인하였다.
<실시예 5> BD 환자 유래의 iPSCs 및 이로부터 분화된 조혈 전구체 세포의 유전자발현 양상을통한베체트병 바이오마커 유전자의 선별
<5-1>정상세포 및 BD환자유래 세포의 유전자발현 양상비교
BD 환자의 체세포， iPSCs 및 이로부터 분화된 HPCs에서 발현되는 유전자가， 정상 세포의 유전자 발현 양상과 비교하였을 때 차이를 나타내는 유전자를 선별하기 위해， 도 6a에 나타난 모식도를 따라 마이크로어레이 분석을 통한 정상 세포 및 BD 환자 유래 세포의 유전자 발현 수준을 확인하여 이를 비교하였다 (도 6a) .
구체적으로， 상기 실시예 <1-2>및 <3-1〉의 방법을 수행하여 BD-iPSCs 및 BD-HPCs의 분화를 유도하여， BD 환자 유래의 섬유아세포 (체세포)， 이로부터 유래된 BI)-iPSCs 및 BD-HPCs를 각각 수득하였다. 수득한 BI)ᅳ체세포， BEHPSCs 및 BE)-HPCs로부터， R easy Mini 키트 (Qiagen사， 미국)을 이용하여 각각의 세포 전체 RNA를 추출하고， Cy3로 표지하여， 단일 -색상 플랫품 분석 기반의 Whole Human Genome Microarray 4X44 v2( Agi lent Technology사， 미국)와 흔성화하고， 제조사의 제공하는 프로토콜에 따라 마이크로어레이 분석을 수행하여， 정상 대조군과 BD 환자 유래와 세포 간 유전자 발현 양상을 비교하였다.
그런 다음， 비교한 결과를 분석하기 위해서， GeneSpr ing GX 7.3(Agi lent Technology 사， 미국)으로 유전자 발현 분석 및 주성분 분석 (pr incipal component analysi s , PCA)을 수행하여， 정상 대조군과 BD 환자 유래 세포 간에 1.7 배 이상의 발현 비율을 나타내는 유전자를 선별하였다. 선별한 유전자의 기능은 GeneCard 데이터베이스 (http : //www. genecards . org/)를 사용하여 확인하였고, 위계적 군집 분석 (hierarchical cluster analysis) 및 히트맵 (heat map) 분석은 MeV v4.9를 이용하여 작성하였다. KEGG 경로 분석 (KEGG pathway analysis)은 DAVID Bioinformatics Resource
(http://david.abcc. ncifcrf.gov)를 이용하여 수행하였다. 또한， 생물학적 과정 및 분자적 기능을 분석하기 위해서는， PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships; http://www.pantherdb.org/)을 이용하였고， 생물학적 네트워크에 관한 정보는 사이토스케이프 (Cytoscape; http://www.cytoscape.org/)를 이용하여 정보를 수집하였다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 con iPSCs-HPCs와 비교하였을 때， BD-HPCs에서 1.7 배 이상의 유전자 발현 수준을 나타낸 유전자로서， 총 1，355 개 유전자를 선별하였으며， 히트맵 분석 및 군집 분석 수행을 통해 건강한 대조군 유래의 체세포 (섬유아세포)， iPSCs 및 HPCs와 BD 환자 유래의 세포 사이에서 전체적인 유전자 발현은 유의적인 변화를 나타내지 않는 것을 확인하였다 (도 6b). 또한， KEGG 경로 분석 결과， BD-HPCs에서 상승 발현되는 양상을 나타내는 경로들은， 질병과 관련된 연관성이 강한 사이토카인 및 케모카인을 포함하는， 다양한 생장 인자와 관련되어 있음을 확인하였다 (도 6c). 또한, 유전자 은를리지 (gene ontology) 및 GeneCard 데이터베이스 분석을 통해, 상기 선별한 1，355 개 유전자 중에서， 16.01%인 217 개 유전자가 BIHiPCs에서 사이토카인， 케모카인 및 이들의 수용체 패밀리를 암호화하는 유전자임을 확인하였다. BD-HPCs에서 나타난 바와 비교하였을 때， BD 환자 유래의 섬유아세포 및 iPSCs에서는 정상 대조군 유래 세포와 비교하여 상기 217 개 유전자에 대해 유의적인 발현 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였다 (도 6(1).
<5-2> 정상 세포 및 BD 환자 유래 세포의 전염증성 사이토카인 유전자 발현 정도비교
BD 환자의 체세포， iPSCs 및 이로부터 분화된 HPCs에서 유의적으로 높은 수준의 분비량을 나타내는 것으로 보고된 전염증성 사이토카인에 있어서 유전자 발현 정도를 확인하기 위해， IL-6, IL-8 및 TNFa를 포함하는 사이토카안 및 케모카인의 유전자 발현 정도를 분석하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2>및 <3-1>의 방법을 수행하여 BD-iPSCs및 BD-HPCs의 분화를 유도하여， BD 환자 유래의 섬유아세포 (체세포)， 이로부터 유래된 BD-iPSCs 및 BD-HPCs를 각각 수득하였다. 그런 다음， 상기 실시예 <5-1〉의 방법을 수행하여 마이크로어레이 및 히트맵 분석을 통해 IL-6, IL-8, TNF, IFNG, IL-10 , IL-12A, IL-12B, IL-13 , IL-15, IL-17A, IL-17B, IL-18, IL-1A, IL-1B, IL4 및 CCR5의 유전자 발현 양상을 확인하였다.
그 결과， 도 5c 및 도 7에서 나타난 바와 같이 정상 대조군에 비해서 BD-HPCs의 배양액 내에 분비된 IL-6 , IL-8 및 TNF α의 수준이 유의적으로 증가하는 것에 비해 (도 5c)， BD-HPCs내에서 IL-6, IL— 8및 TNF α의 유전자 발현 수준에서는 유의적인 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였다 (도 7) .
<5-3> BD환자및 류마티스 관절염 (Rheumatoid arthritis, RA)유래 세포의 유전자발현 양상비교
BD 환자와 연관된 신규한 유전자를 추가적으로 선별하기 위해서， BD와 유사한 증상을 가지는 것으로 보고된 류마티스 관절염 (RA) 환자로부터 유래된 iPSCs 및 HPCs를 제작하여 BIHiPCs와 유전자 발현 양상을 비교하였다 (Everekl ioglu , C. et . al . , 2002.； Mege , J .L. et . al . , 1993. ) . 구체적으로， 상기 실시예 <1-2〉및 <3-1〉의 방법을 수행하여 BD-iPSCs및 BI)-HPCs의 분화를 유도하여， BD 환자 유래의 섬유아세포 (체세포)， 이로부터 유래된 BD-iPSCs 및 BD-HPCs를 각각 수득하였다. 또한， 류마티스 관절염 환자 유래의 체세포를 수득하여， BD세포와 동일한 방법으로 류마티스 관절염 환자의 체세포， 이로부터 유래된 RA-iPSCs및 RA-HPCs를 각각 수득하였다. 그런 다음， 상기 실시예 <5-1>의 방법을 수행하여 선별한 217개의 유전자에 대한 세포 내 유전자 발현 양상을 확인하고， 주성분분석 (Pr incipal component analysi s , PCA)을 수행하여， 사이토카인 및 케모카인의 발현 양상을 나누어 비교하였다. 그 결과， 도 8에서 나타난 바와 같이 BD-특이적으로 발현되는 유전자의 발현 패턴을 나타냄을 확인하였으며 (도 8)， 총 217 개 유전자 중에서 사이토카인 및 케모카인 관련된 유전자만이 BD-HPCs 및 RA-HPCs에서 공통적으로 조절되는 유전자로서 11 개의 유전자를 선별하였다.
<5-4> BD_HPCs에서 약물 처리를통한바이오마커 후보유전자의 선별 BD 환자에 대하여, 약물 반웅을 예측할 수 있도록 하는 분자적인 바이오마커를 선별하기 위해서， BD 환자의 치료에 사용되고 있는 약물인 프레드니솔론 (prednisolone, PRED) 또는 황산히드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine sulfate, HCQ)의 처리 유무에 따른 BD-HPCs 내 유전자 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2>및 <3-1>의 방법을 수행하여 BD-iPSCs 및
BD-HPCs의 분화를 유도하였다. 유도 후， 수득한 세포는 4X104 세포 /웰의 밀도로 96웰 플레이트에 접종한 다음， 0.063내지 32 μΜ의 다양한 농도로 PRED 또는 HCQ(Sigma 사， 미국)를 처리하여 4 일 동안 배양하였다. 그런 다음， 20 ^의 CCKᅳ 8 염색 용액을 첨가하고 2 시간 동안 37°C에서 배양함으로써， Cell Counting Kit-8(CCK-8; Do j indo Laboratories사， 일본)을 이용하여 제조사에서 제공하는 프로토콜을 따라 약물 처리에 의해 유도된 세포독성 (cytotoxicity)을 확인하였다. 각각의 웰의 흡광도는 Spectra Max M3 마이크로플레이트 리더 (Molecular Devices 사)를 이용하여 450 nm 파장의 흡광도를 측정하였다. 또한， PRED 또는 HCQ를 처리하여 배양한 BD-HPCs를 수득하여， 상기 실시예 <5-1>의 방법으로 마이크로어레이 분석을 수행하여 유전자 발현 양상을 확인하였다. 확인한 유전자 발현은， Panther classification system(http://www. pantherdn.org)를 이용하여 발현량을 비교하여， 무처리 대조군과 비교하여 2 배 이상 발현 차이를 나타내는 유전자를 선별하였다. 무처리 대조군으로는， PRED또는 HCQ를 처리하지 않은 BD-HPCs를 동일 조건에서 배양한 후 사용하였다.
그 결과, 도 9에서 나타난 바와 같이 무처리 대조군에 비해, PRED 또는 HCQ를 처리하였을 때 전체적인 유전자 발현 양상이 유의적으로 변화하는 것을 확인하였다 (도 9a). 이러한 발현 양상의 변화는 PRED 또는 HCQ에 의해 유도된 세포독성 효과에 기인한 것은 아니며 (도 % 및 도 9c)， 생물학적 과정 및 분자적인 기능을 가지는 유전자의 발현 수준이 증가하는 것에 기인하였음을 확인하였다 (도 9d및 도 9e) . 또한， PRED 및 HCQ는 BD-HPCs에 유사한 영향을 미쳐, 세포 내에서 상향조절되는 항-염증성 사이토카인 및 케모카인 유전자의 양상이 유사하게 나타나는 것을 확인하였다 (도 9f ) .
<5-5> BEHPCs의 진단및 약물 반웅 예측을위한 BD바이오마커의 선별
BD 환자에서는 발현 수준이 감소하나, 약물을 처리하였을 때 특이적으로 증가하는 유전자를 바이오마커로서 선별하기 위하여， BEHIPCs과 RA-HPCs에 각각 PREDᅵ또는 HCQ를 처리하고, 유전자 발현 수준꾀 차이를 분석함으로써， BD 바이오마커 유전자를 선별하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2〉 및 <3ᅳ1〉의 방법을 수행하여 BD-HPCs 및 RA-HPCs의 분화를 유도하였다. 유도 후， 상기 실시예 <5-3>과 같이 PRED 또는 HCQ를 처리하고， 마이크로어레이 분석을 수행하여 상거 실시예 <5-1>에서 선별한 217개의 유전자의 발현 양상을 확인하였다. 그런 다음， PRED 또는 HCQ를 처리하지 않은 BD-HPCs에서는 발현 수준이 높으나， PRED 또는 HCQ를 처리한 BD-HPCs에서 발현 수준이 2 배 이상 감소하고， RA-HPCs에서는 발현 수준이 증가하지 않는 유전자를 BD 바이오마커 후보군으로서 선별하였다. 선별한 BD 바이오마커 후보군 유전자는， 상기 실시예 <2-4〉와 동일한 방법으로 qRT-PCR 반웅을 수행하여 발현 수준을 정상 대조군과 정량적으로 비교하였다. 그 결과， 도 10에서 나타난 바와 같이 총 217 개 유전자 중에서， BD 바이오마커 후보군 유전자로서 AGTR2 , CA9 , CD44 , CXCL1 , HTN3 , IL-2 , PTGER4및 TSLP의 8 개 유전자를 선별하였으며 (도 10a) , 유전자 발현의 정량 분석을 통해 상기 8 개 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 또는 약물을 처리한 BI)-HPCs에 비해 약물을 처리하지 않은 BD-HPCs에서 특이적으로 발현 증가하는 것을 확인함으로써， 이들을 BD의 진단 및 약물 반웅의 예측을 위한 BD 바이오마커로 사용할 수 있음을 확인하였다 (도 10b) . <실시예 6> BD— HPCs에서 BD 바이오마커를 이용한 진단 방법으로의 적용 여부 확인
<6-1>유전자 발현 수준 및 단백질 발현 수준의 확인을 통한 시료 세포 내 바이오마커 발현 수준 확인
상기 실시예 <5-4>에서 선별한 BD 특이적인 바이오마커가 BD 지표로서 혈청, 조직 및 세포 시료 내에서 측정될 수 있는지 확인하기 위해， 선별한 바이오마커 중 가장 큰 차이를 나타내었던 CXCL1을 대상으로 배양액에 분비된 단백질 발현 수준을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>및 <3ᅳ 1>의 방법을 수행하여 BEHPSCs 및 BD-HPCs의 분화를 유도하여， 세포를 수득하였다. 수득한 세포는 상기 실시예 <4-3>와 방법으로 세포 상층액올 분리하고 ELISA 분석을 수행하여， 분비된 CXCL1단백질의 농도를 정량하였다. BD시료로서 상기 [표 1]에 기재된 2명의 BD환자에서 1명을 추가하여， 3명의 BD환자로부터 수득한 독립적인 BD-HPCs를 사용하였으며， 정상 대조군으로는 대조군 -iPSCs로부터 분화 유도한 HPCs를 사용하였다.
또한， 다양한 세포 종류를 시료로 사용하기 위해서는， BD-iPSCs를 내배엽인 간세포 (hepatocyte) , 중배엽인 심장근육세포 (cardiomyocyte) 및 외배엽인 신경 전구체 (neural progeni tor)로 분화 유도한 후， CXCL1 단백질 분비 수준을 확인하고， 상기 실시예 <2-4>와 동일한 방법으로 qRT-PCR반웅을 수행하여 CXCL1 유전자의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 11에서 나타난 바와 같이， BD-HPCs 배양의 경우에는 CXCL1 분비 수준이 현저히 증가하예 대조군 -HPCs에 비해 5.60배 증가한 것을 확인한 반면 (도 11 a 및 도 lib) , BE)-섬유아세포주 및 BEHPSCs를 배양한 경우에서는 CXCL1의 분비 수준이 낮아， 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않는 것을 확인하였다 (도 11c) .
또한， HPCs 외에 다른 세포로 분화 유도하였을 경우, BD-iPSCs로부터 분화된 간세포 (내배엽)， 심장근육세포 (중배엽) 및 신경 전구체 (외배엽)과 같은 다른 세포 종류에서는 CXCL1 유전자의 발현 상승이 나타나지 않았고 (도 lid) , 심장근육세포 맟 신경 전구체 세포에서는 CXCL1 단백질의 분비 또한 유의적인 발현 증가를 나타내지 않는 반면， BD-iPSCs유래의 간세포에서는 대조군 유래의 간세포에 비해 CXCL1 단백질의 분비 수준이 2.97 배 증가하는 것을 확인하였다 (도 He) . 이를 통해, 본 발명의 BD-HPCs는 바이오마커의 인식 및 BD의 분자적인 면역발병기전 ( i麵 unopathogenes i s)을 조사하기 위한 질병 모델로서 사용할 수 있음을 확인하였다.
<6-2> 환자 혈청 시료 내에서 BD 바이오마커의 진단 지표로서의 효과 확인
본 발명에서 선별한 BD 특이적인 바이오마커를 진단 지표로서 사용할 수 있는지 확인하기 위하여, CXCL1 단백질과 BD 지표로서 사용되고 있는 IL-6의 단백질의 BD 환자 혈청 내 농도를 확인하였다 (Everekl ioglu , C . et al . , 2002； Hamzaoui , Κ. 2011. )
구체적으로 BD 환자 및 대조군의 혈청 시료를 분리하여， 상기 실시예 <4-3>의 방법으로 ELISA분석을 수행해 혈청 내 IL-6및 CXCL1단백질의 농도를 정량하였다.
그 결과， 도 12에서 나타난 바와 같이 건강한 대조군의 혈청 시료와 비교하였을 때 BD 환자의 혈청 시료에서 CXCL1의 분비 수준이 높은 것에 반해， IL-6의 분비 수준은 유의적인 차이를 나타내지 않는 것을 확인하여ᅳ 혈청 내의 CXCL1의 수준은 BD에 대해 정확하고 유용한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 확인하였다 (도 12) .
<실시예 7> BD—HPCs에서 BD 바이오마커를 이용한 약물 스크리닝으로의 적용 여부 확인
본 발명에서 선별한 BD 바이오마커를 BD에 대한 약물 스크리닝에 적용할 수ᅳ있는지 여부를 확인하기 위해서, 약물을 처리한 BD-HPCs에서 CXCL1의 분비 수준을 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2>및 <3-1>의 방법을 수행하여 BE)-iPSCs및 BD-HPCs의 분화를 유도하여， 세포를 수득하였다. 수득한 세포는 상기 [표 4]에 기재된 조혈 성숙 배지를 포함하는 96-웰 플레이트에 4X104 세포 /웰의 밀도로 접종한 다음， 1 일 동안 배양하였다. 1 일 후에， FDA에서 승인된 라이브러리 (#BML-2843, EMZO Life Science Inc. , USA)로부터 항염증활성 및 면역억제 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는 화합물 34 종을 선별한 하기 [표 5]에 기재된 약물을 각각의 웰에 Γ μΜ의 농도로 처리하고， 2 일 동안 배양하였다. 그런 다음. 300 g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 제거하고， 각각의 웰로부터 배양 상층액을 수득하였다. 수득한 배양 상층액은 상기 실시예 <4-3>의 방법을 사용하여 ELISA 분석을 통해 배양 상층액 내 CXCL1 및 IL-6의 농도를 정량 분석하였다. 무처리 대조군으로서, 약물을 처리하지 않고 DMS0를 처리한 BD-HPCs를 사용하였다.
【표 5】
BD-HPCs를 이용한 BD 약물 스크리닝 방법을 위해 사용한 FDA 승인된 화합물
이름 분자량 표시 (Indicat ion) 번
1 사이클로스포린 A(Cyclosporine A) 1202.6 면역억제제， 면역조절， 항류마티스， 피부치료제
2 시로리무스 (sirol imus) (라파마이신， Rapamycin) 914.2 면역억제제
3 아자치오프린 (Azathioprine) 277.3 면역억제제
4 덱사메타손 ( dexame t hasone ) 392.5 항염증， 호르몬제.
항종약제
5 메살라닌 (Mesalamine)(5ᅳ아미노살리실산, 153.1 항염증
5-Aminosal icyl ic Acid)
6 베타메타손 ( be t ame t ha sone ) 392.5 항염충， 면역억제제
7 탈리도마이드 (Thai idomide) 258.2 면역억제제， 나균억제제， 혈관형성억제제 클로베타졸 프로피온산 (clobetasol propionate) 467.0 항염증, 코르티코스테로이드
(Cort icosteroid) 플루오시놀론 .아세토나이드^1110(：^10101 452.5 항염증
Acetonide)
히드로코르티손 (hydrocor t i sone) 362.5 항염증
히드로코르티손아세테이트 (Hydrocor t i sone 404.5 항염증
Acetate)
메틸프레드니솔론 (methylprednisolone) 374.5 항염증， 구토방지제， 신경보호작용
Amcinonide (암시노나이드) 502.6 항염증
발살라지드 (Balsalazide) 354.3 항염증， 항궤양, 위장제제 부데소니비드 ( Budeson i de ) 430.5 항염증, 기관지확장제 코티존 아세테이트 (Cortisone Acetate) 402.5 항염증， 코르티코스테로이드 데소나이드 (Desonide) '416.5 항염증, 코르티코스테로이드 데속시메타손 (Desoximetasone) 376,5 항염증， 글루코코르티코이드
(Glucocort icoid) 에베로리무스 (Everolimus) 958.2 면역억제제 플루니솔리드 (flunisolide) 434.5
.풀루오시노니드 (fluocinonide) 494.5 하 dᄋ -a 3 ¾ o
플루오로메틀론 (Fluorometholone) 376.5 ο
플루란데레놀리드 (Flurandrenolide) 436.5 하ᄋ^
할시노니드 (Halcinonide) 455.0 항염증
케토를락 트로메타민 (Ketorolac Tromethamine) 376.4 항염증 (NSAID)
로테프레드놀 에타보네이트 ( Lo t epr edno 1 467.0 항염증. 항알러지
Et bonate)
메르갑토푸린 수화물 (Mercaptopurine Hydrate) 170.2 면역억제제
모메타손 푸로에이트 (Mome sone Furoate) 521.4 항염증， 항알러지 29 올살라진 나트륨 (Olsalazine · Na) 302.2 염증성 장질환 (Inflammatory
Bowel Disease) 및 궤양성 대장염 (ulcerative colitis)의 치료에서 항염증제로 사용됨
30 옥사프로진 (Oxaprozin) 293.3 항염증
31 페니실라민 (Penicillamine) (으페니실라민, 149.2 면역억제제， 킬레이테: chelator)
D-Penici 11 amine)
32 피메클로리무스 (pimecrol imus) 810.5 면역억제제' , 면역조절.제
33 타크로리무스 (Tacrolimus; Fk506) 804.0 동종 기관 이식 후에
주로 사용되는 항면역억제제
34 트리암시놀론 아세토니드 (Triamcinolone 434.5 항염증; 스테로이드계
Acetonide) 그 결과, 도 13에서 나타난 바와 같이 약물을 처리하였을 때， IL-6의 농도는 무처리 대조군에 비해 7.38 내지 23.58%의 감소 수준을 보여 다소 감소하는 경향을 나타내는 것을 확인하였다 (도 13a). 이에 반해， CXCL1의 경우에는 IL-6에 비해 유의적으로 농도가 감소하는 경향을 나타내었으며， 특히 34 개 약물 중 9 개의 경우에 40% 이하의 농도 감소 수준을 나타내는 것을 확인하였으며， 이 중 3 개의 약물은 BD의 치료제로서 사용되고 있음을 확인하였다 (도 13b). 이를 통해， IL-6 및 CXCL1이 약물 처리에 대해 BD-HPCs에서 분비 경향은 유사하나， CXCL1이 IL-6에 비해 약물에 대한 민감도가 높은 것을 확인하였다 (도 13a 및 13b).

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 베체트병 (Behcet's disease, BD)의 유도만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells; iPSCs) 모델:
i) 정상 세포의 iPSCs 형태;
ii) 0CT4, NANOG, TRA-1-60 및 SSEA를 포함하는 전분화능 마커 (pi uri potency marker) 단백질을 발현; 및
iii) 0CT4, S0X2, NANOG및 REX를 포함하는 전분화능 마커 유전자 mRNA를 발현 .
【청구항 2】
i) 시험관 내 (in vitro)에서 베체트병 환자로부터 분리된 섬유아세포 (fibroblasts)를 iPSCs로 유도하는 단계; 및
ii)상기 단계 i)에서 유도된 iPSCs를 수득하는 단계를 포함하는， 시험관 내에서 베체트병 iPSCs 모델의 제조 방법.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 단계 i)의 유도는 전분화능 마커 (pluripotent marker)의 이소성 발현 (ectopic expression)을 사용하는 것을 특징으로 하는 시험관 내에서 베체트병 iPSCs 모델의 제조 방법.
【청구항 4]
하기 i) 내지 vi) 중 어느 하나 이상을 특징으로 하는 베체트병의 조혈전구세포 (hematopoietic progenitor cells, HPCs) 모델:
i) CD43 및 CD45를 S함하는 조혈ᅳ바케—발현; ―
ii) SCL, GATAl, GATA2, KDR, CD34, CD43 및 CD45를 포함하는 조혈 마커 유전자 발현; iii) 정상 세포에 비해， IL-6, IL-8 및 TNFa를 포함하는 전-염증성 사이토카인의 분비 수준 증가; 및
iv) 정상 세포에 비해， CXCL1유전자의 발현 수준 증가;
v) 정상 세포에 비해, CXCL1 단백질의 분비 수준 증가; 및
vi) 정상 세포에 비해， IL-2 유전자의 발현 수준 증가.
[청구항 5】
i) 시험관 내에서 베체트병 환자로부터 분리된 섬유아세포를 iPSCs로 제작하는 단계 ; 및
ii) 상기 단계 i)에서 제작한 iPSCs를 조혈전구세포 (hematopoiet ic progenitor cells, HPCs)로 유도하는 단계; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 유도된 HPCs를 수득하는 단계를 포함하는， 시험관 내에서 베체트병 조혈전구세포 모델의 제조 방법.
【청구항 6】
i) 베체트병 iPSCs 모델로부터 배상체 (embryoid body, EB) 또는 조혈전구세포 (HPCs)로 분화를 유도하는 단계; 및
ii) 상기 단계 i)에서 유도된 쎄상체의 분화 마커 또는 조혈전구세포의 특징을 분석하는 단계를 포함하는， iPSCs 또는 조혈전구세포를 베체트병의 모델로 사용하는 방법ᅳ
【청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 배상체의 분화마커는 외배엽 (ectoderm) 마커인 NESTIN및 TUJ1,내배엽 (endodenti)마커인 S0X17및 F0XA2, 및 중배엽 (mesoderm) 마커인 알파-평활근 액틴 (α-smooth muscle actin, α-SMA) 및 DESMIN 중 어느 하나 이상을 발현하는 것을 특징으로 하는， iPSCs 또는 조혈전구세포를 베체트병의 모델로 사용하는 방법 .
【청구항 8】
제 6항에 있어서， 상기 조혈전구세포는 하기 i) 내지 vi) 중 어느 하나를 특징으로 하는， iPSCs 또는 조혈전구세포를 베체트병의 모델로 사용하는 방법: i) CD43 및 CD45를 포함하는 조혈 마커 발현;
ii) SCL, GATA1, GATA2, DR, CD34, CD43 및 CD45를 포함하는 조혈 마커 유전자 발현;
Hi) 정상 세포에 비해， IL-6, IL-8 및 TNFa를 포함하는 전-염증성 사이토카인의 분비 수준 증가; 및
iv) 정상 세포에 비해， cxai유전자의 발현 수준 증가;
V) 정상 세포에 비해, cxai단백질의 분비 수준 증가; 및
vi) 정상 세포에 비해， IL-2 유전자의 발현 수준 증가.
【청구항 9】
하기 유전자 또는 하기 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍을 하나 또는 둘 이상 포함하는, 베체트병 (Behcet's disease, BD)의 진단용 키트: 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 AGTR2( angiotensin II receptor, type 2) 유전자;
서열번호 2의 염기서열로 구성되는 CA9(carbonic anhydrase IX) 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 CD44 유전자;
서열번호 4의 염기서열로 구성되는 HTN3(histatin 3) 유전자;
서열번호 5의 염기서열로 구성되는 PTGER4( pros tag land in E receptor 4, subtype EP4) 유전자； 및
서열번호 6의 염기서열로 구성되는 TSLP( thymic stromal lymphopoiet in) 유전자.
【청구항 10
제 9항에 있어서， 추가로 하기 유전자 또는 하기 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍을 하나 또는 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 하는， 베체트병의 진단용 키트:
서열번호 7의 염기서열로 구성되는 CXCL1 유전자; 및
서열번호 8의 염기서열로 구성되는 IL-2 유전자.
【청구항 11】
하기 단백질 또는 하기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 하나 또는 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 하는， 베체트병의 진단용 키트:
서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 AGTR2(angiotens in I I receptor , type 2) 단백질;
서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 CA9(carboni c anhydrase IX) 단백질;
서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되는 CD44 단백질;
서열번호 12의 아미노산 서열로 구성되는 HTN3(hi stat in 3) 단백질; 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 PTGER4(prostaglandin E receptor 4， subtype EP4) 단백질; 및
서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 TSLP thymi c stromal lymphopoiet in) 단백질.
【청구항 12】
제 11항에 있어서， 추가로 하기 단백질 또는 하기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 하나 또는 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 하는， 베체트병의 진단용 키트:
서열번호 15의 아미노산 서열로 구성되는 CXCL1 단백 ¾ ; 및
서열번호 16의 아미노산 서열로 구성되는 IL-2 단백질.
【청구항 13】
i ) 개체로부터 분리된 시료를 제 9항 또는 제 11항의 키트에 처리하는 단계; ii) 상기 단계 i)에서 처리한 키트에서 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 분석하는 단계 ; 및
iii) 상기 단계 Π)에서 분석한 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군과 비교하여 증가하는 경우 상기 개체를 베체트병에 걸리거나 또는 베체트병에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는， 베체트병의 진단， 치료， 치료제 반옹성 및 예후를 위한 정보를 제공하는 방법.
[청구항 14】
i) 제 9항 또는 제 11항의 키트에 피검물질을 처리하는 단계;
ii) 상기 단계 i)의 처리한 키트에서 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 분석하는 단계 ; 및
iii) 상기 단계 ii)에서 분석한 유전자 또는 단백질의 수준이 무처리 대조군에 비교하여 감소하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는， 베체트병의 치료제 후보 물질의 스크리닝 방법.
【청구항 15
하기 유전자 또는 하기 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 쌍을 하나 또는 둘 이상 포함하는， 베체트병 (Behcet's disease, BD)의 진단용 키트의 용도:
서열번호 1의 염기서열로 구성되는 angiotensin II receptor, type 2) 유전자;
서열번호 2의 염기서열로 구성되는 C4 (carbonic anhydrase IX) 유전자; 서열번호 3의 염기서열로 구성되는 유전자;
서열번호 4의 염기서열로 구성되는 ^ ?(histatin 3) 유전자;
서열번호 5의 염기서열로 구성되는 7i 7 ( pros tag land in E receptor 4， subtype EP4) 유전자; 및
서열번호 6의 염기서열로 구성되는 ¾ thymic stromal lymphopoiet in) 유쟌자. 【청구항 16】
하기 단백질 또는 하기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 하나 또는 둘 이상 포함하는 것을 특징으로 하는， 베체트병의 진단용 키트의 용도:
서열번호 9의 아미노산 서열로 구성되는 angiotensin II receptor, type 2) 단백질;
서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되는 (^^(carbonic anhydrase IX) 단백질;
서열번호 11의 아미노산 서열로 구성되는 단백질;
서열번호 12의 아미노산 서열로 구성되는 j WOiistatin 3) 단백질; 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 ( ) (prostaglandin E receptor 4， subtype EP4) 단백질; 및
서열번호 14의 아미노산 서열로 구성되는 T^^thymic stromal lymphopoiet in) 단백질.
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