WO2016111417A1 - 노긴을 유효성분으로 함유하는 소교세포 활성 증진용, 또는 허혈성 질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

노긴을 유효성분으로 함유하는 소교세포 활성 증진용, 또는 허혈성 질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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noggin
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    • A23V2200/326—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having effect on cardiovascular health

Definitions

  • composition for enhancing microglia activity or preventing and treating ischemic disease containing nogin as an active ingredient
  • the present invention relates to a composition for enhancing microglia activity or preventing and treating ischemic disease containing Noggin as an active ingredient.
  • Ischemic stroke the leading cause of death worldwide, results in severe dysfunction unless spontaneous or thrombolytic reperfusion occurs in time.
  • Patient care generated by the received damage to the brain that survived the ischemic stroke (neurogenesis), 'axonal sprouting (axonal sprouting), glial cell development (gliogenesis) and ⁇ neovascularization (angiogenesis) endogenous neuronal repair (neurore p ara ti ve), such as Depending on the degree of process, differences in natural recovery occur (Crarmer, 2008a; Gutierrez-Fernandez et al., 2012).
  • Thrombolysis the only treatment for ischemic stroke, has a narrow therapeutic window and can be used only within 3 hours of symptoms, so only a small number of patients can receive treatment and most patients rely on conservative treatment. There is currently no treatment available to help with neurological repair.
  • Bone morphogenetic proteins (BMPs) and their endogenous antagonists Noggin are involved in the repair of spinal cord injury and post brain disease.
  • Increased BMP expression in the demyelinating lesions of the spinal cord and corpus callosum may be associated with the inhibition of mature oligodendrocytes due to astrogliosis and differentiation of ol igodendrocyte progenitor cells.
  • BMPs inhibit the production of neuronal and oligodendrocytes, and at the same time promote differentiation from oligodendroglial-astroglial progenitor and neural stem cells to astroglia (Mabie). wt al., 1997; Xi o et al., 2010).
  • AD Alzheimer's disease
  • AD mouse models are associated with decreased hippocampal neurogenesis
  • hippocampal neurogenesis Bonaguiya et al., 2008; Crews et al., 2010.
  • long-term injections during demyeli nation reduce the number of astrocytic cells, but increase the maturation and regeneration of oligodendrocytes by blocking the phosphorylation of SmacKSma and Mad Related Family, a lower level of BMP signaling.
  • BMP and nogin are associated with glial fibrillary acidic protein (GFAP) unipotent astrocytic cells and ionized calcium-binding adapter molecule (Iba-1) positive microglia in ischemic brain, respectively.
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • Iba-1 ionized calcium-binding adapter molecule
  • the present inventors have studied to solve the above problems, as a result of confirming by treatment with Nogin in the MCA0 induced ischemic stroke animal model, the brain atrophy was reduced, the expression of GAP-43 and VEGF related to brain tissue recovery Nogin is used to enhance microglial activity or to prevent ischemic disease by increasing the number of microglial cells, thereby increasing the activation of microglial cells, thereby contributing to brain tissue repair during ischemic stroke.
  • the present invention has been completed by revealing that it can be usefully used as an active ingredient of a therapeutic composition. [Detailed Description of the Invention]
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of microglia (mi crogl i) activity enhancer or ischemic disease (i schemi c di sease) containing Noggin as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease containing a gene carrier, a cell or a noggin protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food for preventing and improving ischemic disease containing a gene carrier, a cell containing a nogin gene, or a nogin protein as an active ingredient.
  • the present invention also provides a microglial activity enhancer containing a gene carrier, a cell or a noggin protein as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for treating ischemic disease, comprising administering a gene carrier, cell or nogin protein comprising a pharmaceutically effective amount of nogin gene to an individual suffering from ischemic disease.
  • the present invention also provides the use of gene carriers, cells or noggin proteins comprising noggin genes for use as pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of ischemic diseases.
  • the present invention provides a use of a gene carrier, cell or noggin protein comprising a noggin gene for use as a dietary supplement for preventing and improving ischemic disease.
  • the present invention also provides the use of a gene carrier, cell or noggin protein comprising a noggin gene for use as a microglial activity enhancer.
  • aCSF control group injected with artificial cerebrospinal fluid
  • Nogin 3 wks group injected with nogin for 3 weeks
  • Nogin 2 wks group injected with nogin for 2 weeks;
  • BMP7 3 wks group injected with BMP7 for 3 weeks.
  • BMP7 2 wks BMP7 injected for 2 weeks.
  • Figure 2 is a diagram confirming the change of noggin and BMP7 protein expression after injection of Noggin and BMP7 in MCA0 induced animal model:
  • aCSF Control group injected with artificial cerebrospinal fluid. '
  • FIG. 3 is a diagram illustrating brain blood flow changes (A) and brain images (B) after injection of Noggin and BMP7 in an MCA0 induced animal model:
  • FIG. 4 shows the contralateral hemisphere volume (A) and ipsilateral cortical volume (B) after injection of Noggin and BMP7 in an MCA0 induced animal model: aCSF: control group injected with artificial cerebrospinal fluid; And
  • FIG. 5 is a diagram confirming behavioral tests with neurological score (A) and wire suspension test (B) after injection of Noggin and BMP7 in MCA0 induced animal model:
  • aCSF control group injected with artificial cerebrospinal fluid
  • Figure 6 is a diagram confirming the change in the formation of glial scar after injection of Noggin in MCA0 induced animal model:
  • aCSF Comparative group in which artificial cerebrospinal fluid was injected.
  • FIG. 7 is a diagram showing changes in the expression of synaptophysin, GAP-43 and VEGF in the cortex and subcortex after injection of Noggin in an MCA0 induced animal model:
  • Control no treatment control
  • aCSF comparison group injected with artificial cerebrospinal fluid.
  • FIG. 8 is a graphical representation of FIG. 7 above:
  • aCSF Control group injected with artificial cerebrospinal fluid.
  • Figure 9 is a diagram confirming the blood vessel density by CD31 immunoreaction after injection of Nogin in the MCA0 induced animal model:
  • FIG. 10 is a diagram showing the change in expression of Iba-1 in the cortex and subcortex after injection of Noggin in an MCA0 induced animal model:
  • Control, Cont control group that did not process anything
  • aCSF control group injected with artificial cerebrospinal fluid.
  • FIG. 11 is a diagram confirming the expression changes of Iba-1 and CD169 in the MCA0 induced animal model by immunofluorescence staining in the cortex and subcortex:
  • Control, Cont control group not treated with anything
  • aCSF Control group injected with artificial cerebrospinal fluid.
  • FIG. 12 is a diagram showing changes in the expression of CD86, a marker of activated microglial Ml phenotype, IL-1 ⁇ , IL-12, CCL2 and TNF- ⁇ in the MCA0 induced animal model after activation of the microglia Ml phenotype. :
  • aCSF Control group injected with artificial cerebrospinal fluid.
  • FIG. 13 is a graphical representation of FIG. 12.
  • aCSF Control group injected with artificial cerebrospinal fluid.
  • Fig. 14 shows sobridized microglia after injection of Noggin in an MCA0 induced animal model.
  • Control control group that was not treated with anything
  • aCSF Control group injected with artificial cerebrospinal fluid.
  • FIG. 15 is a graphical representation of FIG. 14 above:
  • aCSF Control group injected with artificial cerebrospinal fluid.
  • Figure 16 is a diagram showing the expression changes in the 3 ⁇ 4 cortex of the pro-inflammatory mediator IL- ⁇ and its antagonist IL-lra after injection of Nogin in an MCA0 induced animal model:
  • aCSF Control group injected with artificial cerebrospinal fluid.
  • FIG. 17 shows the expression patterns of activated microglia marker (Iba-1) and activated glioblastoma phenotypes (IL12, CD86) after injection of Noggin in an MCA0 induced animal model:
  • aCSF Control group injected with artificial cerebrospinal fluid.
  • Figure 18 shows the expression patterns of activated microglia markers (Iba-1) and activated glioblastoma phenotypes (IL12, CD86) after injection of Noggin in an MCA0 induced animal model. It is confirmed:
  • aCSF Control group injected with artificial cerebrospinal fluid.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating ischemic disease, comprising a gene carrier, a cell, or a noggin protein as an active ingredient, including a noggin gene.
  • the present invention also provides a method for treating ischemic disease, comprising administering a gene carrier, cell or nogin protein comprising a pharmaceutically effective amount of nogin gene to an individual suffering from ischemic disease.
  • the present invention also provides the use of gene carriers, cells or noggin proteins comprising noggin genes for use as pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of ischemic diseases. .
  • the nogin is preferably described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene carrier is a vector or recombinant virus and the vector is preferably a linear DNA, plasmid DNA or a recombinant viral vector, wherein the recombinant virus is a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus and herpes simplex virus. It is preferably any one selected from the group consisting of.
  • the cell is preferably a hematopoietic stem cell (HSC) or a dendritic cell.
  • HSC hematopoietic stem cell
  • dendritic cell a dendritic cell
  • the ischemic disease is preferably any one selected from the group consisting of cerebral infarction, cerebral ischemia, cerebrovascular accident, and stroke.
  • the inventors confirmed that the injection of the nogin and BMP7 recombinant protein after MCA0 induction, pSmadl / 5/8 expression by 1 ig protein injection per day for 2 weeks after 2 weeks MCA0 induction Significantly increased, and the effective amount and the duration of recombinant protein administration were determined based on the above results, and further experiments were performed after injecting protein once a day for 2 weeks after 2 weeks of MCA0 induction (see FIGS. 1 to 2).
  • the inventors of the present invention confirmed that brain noguin prevents brain atrophy and improves the function of brain blood flow changes and images, but there was no change in brain blood flow.
  • the ipsilateral brain state was relatively preserved (see FIGS. 3A to 3B), and the brain volume was measured.
  • the lateral hemisphere, ipsilateral cortex and subcortical volume were all higher in the mice injected with noggin (see FIGS. 4A-4B), and in action also showed a significant improvement in the mice injected with noggin (FIG. 5). Reference) .
  • the present inventors confirmed the change in the formation of glial scars caused by Noggin, and confirmed that the GFAP-positive fiber was weakly stained in the mice injected with Noggin (see FIG. 6).
  • the expression of GAP-43 and VEGF increased in the group treated with noggin (see FIGS. 7 to 8).
  • the treated group was found to further increase blood vessel density in the ischemic brain (see FIG. 9).
  • the activation change of microglia not only the number of Iba-1 positive cells, markers of microglia, when treated with Noggin Expression level per cell also increased, but it was confirmed that CD169 positive cells showed no difference (FIGS. 11A-11B).
  • it was confirmed that noginin-induced brain repair process is caused by the increase of activated microglia rather than macrophage infiltration.
  • Activated microglial marker (Iba-1) and activated microglial expression As a result of confirming the expression of the markers (M1-IL12, CD86; M2-IL-10, CD206), the nogin treated group decreased the Ml phenotype markers IL-12 and CD86, and the M2 phenotype marker IL-10 And CD206 was found to increase, and the expression of the markers was confirmed to appear at the same position as Iba-1 (see FIGS. 17-18).
  • Nogin of the present invention inhibits brain atrophy, promotes expression of proteins related to brain tissue repair and angiogenesis, and increases microglial activity when administered for 2 weeks after MCA0 induction in MCA0 animal model.
  • the gene carrier, cell or nogin protein containing the nogin gene can be usefully used as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of ischemic diseases. It was.
  • the gene delivery cell comprising the noggin gene of the present invention or the composition containing the noggin protein may further contain one or more active ingredients exhibiting the same or similar functions in addition to the above components.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive may include starch, gelatinized starch, microcrystalline salose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate. , Lactose, Manni, Peel, Arabian rubber, Pregelatinized starch, Corn starch, Powdered cellulose, Hydroxypropyl cellulose, Opadry, Sodium starch glycolate, Carnauba lead, Synthetic aluminum silicate, Stearic acid, Stearic acid Magnesium, aluminum stearate, calcium stearate, white sugar, dextrose, sorbitol and talc may be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included in the composition of 0.1 to 90 parts by weight, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention can be administered in various oral and parenteral dosage forms in actual clinical administration, and when formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are commonly used It can be prepared using.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like. Such solid preparations include at least one excipient, eg, starch, calcium, in a gene carrier, cell, or nogin protein containing nogin genes. It can be prepared by mixing carbonate (Cal cium carbonate), sucrose (Sucrose), lactose (Lactose) or gelatin.
  • Oral liquid preparations include suspending agents, liquid solutions, emulsions and syrups.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • injectable ester such as ethyl oleate, and the like
  • wi tepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • composition of the present invention is throat .
  • Oral or parenteral according to the method of dropping When parenteral administration is possible, external skin or intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intrathoracic injection injection method is preferable. Dosage varies according to the patient's weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, excretion rate and severity of disease.
  • Dosage units may contain, for example, 1, 2, 3 or 4 times the individual dosage or may contain 1/2, 1/3 or 1/4 times. Individual dosages specifically contain amounts in which the effective drug is administered at one time, which usually corresponds to all, 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily dose.
  • the effective dose of the composition of the present invention may be 0.0001 ⁇ 10 g / kg, specifically 0.001-1 g / kg, may be administered 1 to 6 times a day. However, the dose may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological reaction modifiers.
  • present invention provides a health functional food for preventing and improving ischemic disease containing a gene carrier, a cell containing a nogin gene, or a nogin protein as an active ingredient.
  • the present invention also provides the use of a gene carrier, cell or noggin protein containing noggin gene for use as a dietary supplement for preventing and improving ischemic disease.
  • the nogin is preferably described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene carrier is a vector or a recombinant virus
  • the vector is preferably a linear DNA, a plasmid DNA or a recombinant viral vector, and the recombinant virus is a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus and herpes simplex virus. It is preferably any one selected from the group consisting of.
  • the cells are hematopoietic stem cells or dendritic cells. "The ischemic disease is preferably one selected from the group consisting of stroke, cerebral ischemia, stroke.
  • the nogin of the present invention is ischemic by inhibiting brain atrophy, promoting the expression of proteins related to brain tissue repair and angiogenesis, and increasing the activity of microglia when administered for two to two weeks after MCA0 induction in an MCA0 animal model.
  • the gene carrier, cell or nogin protein containing the nogin gene can be usefully used as a dietary supplement for the prevention and improvement of ischemic disease.
  • Gene carriers, cells or nogin proteins comprising the nogin genes of the present invention can be prepared by various methods known in the food science or pharmaceutical field in order to be used for the prevention and amelioration of such ischemic diseases, or the food itself or food It can be prepared in any food form that can be taken orally in combination with a carrier, excipient, diluent, and the like which are acceptable. Preferably in the form of beverages, pills, granules, tablets or voxels.
  • the dietary supplement of the present invention may further include ingredients that are conventionally added in the manufacture of food and are food acceptable.
  • ingredients that are conventionally added in the manufacture of food and are food acceptable.
  • one or more components of citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, and juice may be further included in addition to the gene carrier, cell, or nogin protein containing the nogin gene of the present invention.
  • the amount that can be included as an active ingredient of the health functional food according to the present invention can be appropriately selected according to the age, sex, weight, condition, symptoms of the disease of the person who wants to prevent and improve ischemic disease, preferably adult standard 1 It is good to include about 0.01 g to 10.0 g per day, and by ingesting a health functional food having such a content, an ischemic disease prevention and improvement effect can be obtained.
  • the present invention also provides a microglial activity enhancer containing a gene carrier, a cell or a noggin protein as an active ingredient.
  • the present invention also provides the use of gene carriers, cells or nogin proteins comprising nogin genes for use as microglia activity enhancers.
  • the nogin is preferably described by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene carrier is a vector or a recombinant virus
  • the vector is preferably a linear DNA, a plasmid DNA or a recombinant viral vector, and the recombinant virus is a retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, and herpes simplex virus. It is preferably any one selected from the group consisting of.
  • the cells are hematopoietic stem cells or dendritic cells.
  • the present invention and Noggin inhibit ischemic stroke by inhibiting brain atrophy, promoting the development and development of angiogenesis of proteins involved in brain tissue repair, and increasing the activity of microglial cells when administered two weeks after MCA0 induction in an MCA0 animal model.
  • the gene carrier, cell or noggin protein containing the noggin gene can be usefully used as a microglial activity enhancer.
  • the present invention will be described in detail by way of examples. .
  • mice 10 to 11 week old male C57BL / 6 mice were purchased from Orient Bio Inc. Korea and used for the experiment. All courses followed the international guidelines for ethical use of laboratory animals and approval from the Ewha Womens University Laboratory Animal Steering Committee. Mice were set to light cycles 12 hours bright and 12 hours dark 2 weeks before the experiment, and the rooms were depressed at 22 ° C 2 ° C.
  • Example ⁇ 1-1> With the experimental animal of Example ⁇ 1-1>, an MCA0 animal model was prepared for the experiment.
  • MCA0 animal models were prepared using previously known methods (Shin et al., 2009). After the mouse was anesthetized using isoflurane, a fiber optic probe was attached to the right parietal bone (2 mm backward and 5 mm laterally relative to bregma). And an optical fiber laser Doppler flow meter (Per i flux System 5010, Sweden). Cerebral blood flow (CBF) was continuously recorded with a computer-based data collection system (Perisoft, Sweden) during MCAO and reperfusion.
  • CBF Cerebral blood flow
  • a 6-0 silicon coated black monofilament suture (Doccol Cooperation, USA) was inserted into the exposed right external carotid artery, inserted past the internal carotid artery and into the cerebral artery ring to prevent the origin of the middle cerebral artery. The filaments were left for 30 minutes and then recovered for cerebrovascular reset. During MCAO, cerebral blood flow was reduced by up to 85% in animal models. After 10 minutes of reperfusion, more than 80% recovery was achieved. The rectal temperature was set to 37.0 ⁇ 0.5 ° C. using an automatic silver padding device using a heating pad during surgery and recovery.
  • Recombinant nogin and BMP7 were administered to the MCA0 animal model prepared in Example ⁇ 1-2> to examine the effects of recombinant nogin and BMP7 on the BMP signaling pathway in the ischemic brain.
  • 0.5 or 1 protein was injected per day for 2 weeks after 2 weeks of MCA0 induction, or 3 weeks after MCA0 induction. Test doses were determined based on previous studies (Cate et al., 2010; Colak et al., 2008). Cortical and subcortical tissues were obtained from the brain hemispheres of each of the mice injected with the protein and subjected to western blotting. Tissues were treated with 10 mi SDS buffer (50 mM Tris-HCl, 1% IGEPAL CA-630, 0.25% deoxycholic acid, 150 mM NaCl, including a protease inhibitor cocktail (Complete Mini, Roche, Germany)).
  • Electrophoretic Protein I obilon-P by Electroblotting After transfer to a transfer membrane (Mil lipore Corporate, USA), the membrane was placed in a Tr is-buf fered saline (TBS) containing 0.1% Tween-20 and 10% milk powder for 1 hour blocking ( phosphorylated Smadl / 5/8 (pSmadl / 5/8, 1: 500) (Cell Signaling Technology Inc., USA) and Smadl / 5/8 (l: 500) (Santa Cruz Biotechnology, USA) The antibody was added and reacted overnight.
  • TBS Tr is-buf fered saline
  • the membrane was washed three times for 20 minutes with TBS containing 0.1% Twenty-20, and after reacting for 1 hour with HRP (horseradish peroxidase) bound secondary antibody, the membrane containing 0.1% Twenty-20 was added. Wash three times with TBS 20 minutes each. Protein bands were visualized using Western blotting luminol reagent (Santa Cruz Biotechnology). Quantification was shown by averaging the sum of phosphorylated and non-phosphorylated Smadl / 5/8 concentrations using Image J software (version 1.37, NIH, USA).
  • MCA0 induction 2 of nogin and BMP7 was performed as described above using the MCA0 animal model prepared in Examples ⁇ 1-2>. After weekly infusions of 1 per day for 2 weeks, Western blotting was performed, with Noggin (1: 200) (R & D Systems), BMP7 (l: 500) (Abeam, UK) and Actin (act in, 1: 1000) (Santa Cruz Biotechnology) antibody was used.
  • Nogin increased 1.19 times when compared to the cerebrospinal fluid, and BMP7 increased by 1.17 times.
  • p-value is ⁇ 0.05 (FIG. 2).
  • the low 3 week treatment effect of Nogin or BMP7 was either sufficient to prevent or enhance BMP signaling, or the sensitivity of the BMP receptor was altered by prolonged exposure of BMP.
  • pSmadl / 5/8 expression was significantly increased by 1 I 1 protein infusion per day for 2 weeks after 2 weeks of MCAO induction. Based on the above results, the effective amount and duration of recombinant protein well administration were determined. This was performed after injecting protein once a day for 2 weeks after the week.
  • Example 3 Confirmation of Noggin's Function in an Ischemic Stroke
  • Magnetic resonance imaging was anesthetized with isoflurane after 4 weeks of MCA0 induction and was performed using 3.0-Teslar whole body systemdntera, Philips Healthcare, The Netherlands.
  • the infusion pump was removed before the MR scan.
  • Cresyl vitreous staining is to stain the nucleus, euthanize the mouse, extract the brain and freeze Cut with cryostat (30 urn thickness). Brain sections were harvested at 600- intervals and stained with cross section by staining with Cresyl Violet.
  • Brain volume was measured to confirm that Nogin prevents brain atrophy and improves function in an MCA0 induced ischemic stroke animal model.
  • ipsilateral hemisphere volume was defined as the loss of brain volume, not the infarct portion.
  • Each hemisphere and ipsilateral cortical volume was measured by an image analyzer KAxiovision LE 4.1, Car Zei ss, Germany.
  • the volume of the ipsilateral cortex lower was measured by subtracting the ipsilateral cortex volume from the ipsilateral hemisphere volume.
  • ipsilateral cortical volume was higher in mice injected with nogin (59.13 ⁇ 2.07 ⁇ 3 ) than in mice injected with cerebrospinal fluid (49.46 ⁇ 2.46 ⁇ 3 , p ⁇ 0.01).
  • the mouse was placed for 30 seconds at the midpoint of the wire 60 cm long, 2 mm in diameter, and 60 cm high from the surface between the two supports.
  • Nogin and BMP7 were treated to the MCA0 animal model prepared in Example ⁇ 1-2> under the same conditions as in Example ⁇ 3-1>.
  • mice were anesthetized by intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (120 mg / kg), followed by physiological saline and cold 4% formaldehyde (0. ⁇ ⁇ sodium phosphate buffer).
  • the solution sodium phosphate buffer, pH 7.2
  • Brains were extracted and fixed overnight and then stored in 30% sucrose solution.
  • the brain was cut into the coronal plane from +1.4 to -1.0 mm from the bregma (thickness 20 ⁇ : interval 600- /) and fixed on a gelatin-coated slide.
  • Brain sections were placed in TBS containing 0.1% Triton ⁇ -100, 5% normal serum and 1% bovine serum albumin for 1 hour and the primary antibody GFAP (l: l000) ( Sigma-Aldrich, USA) was added to react overnight. Then, isothiocyanate (l: 1000) to which a secondary antibody, fluorescein, was bound (Vector Laboratories Inc., USA) and reacted for 1 hour. Sections were washed with TBS between all steps and included DAPKVector Laboratories Tnc. For nuclear staining.
  • Vectashield mounting medium was applied to the brain sections before the coverslips were raised. Fluorescence images were taken using a confocal microscope (LSM5 PASCAL; Car 1 Zeiss) with a filter set to 488 and 543 nm wavelengths, covering the entire depth of 20/4 intervals from the z axis of the section. Got it.
  • LSM5 PASCAL Car 1 Zeiss
  • the calibration bar (AxioVision) can be used to measure the thickness of glial scars.
  • the GFAP positive fibers surrounding the cavity were strongly stained (74.79 ⁇ 9.51 ⁇ thick) in the control group injected with the cerebrospinal fluid, but weakly stained in the mice injected with Noggin. (29.21 ⁇ 6.86! M thickness) was confirmed (p ⁇ 0.01 compared to the comparison group) (FIG. 6).
  • Synaptophysin is a pre-synaptic vesicle protein involved in synaptogenesis
  • GAP-43 is a growth cone protein involved in neurite growth. Diproteins are up-regulated during recovery from ischemic stroke and used as markers of neuronal plasticity (Stroemer et al., 1995).
  • VEGF is also involved in vascular repair and angiogenesis after ischemia (Greenberg and Jin, 2013; Hermann and Zechariah, 2009). Accordingly, the expression changes of synaptophysin, GAP-43 and VEGF, proteins related to brain tissue repair after ischemic disease, were confirmed.
  • Example ⁇ 1-2> Nogin and BMP7 were treated under the same conditions as in Example ⁇ 3-1>.
  • synaptopycin (l: 5000) (Millipore Corporation, USA), GAP-43 1: 1000) (Milipore Corporation) and VEGF 1: 500 (Santa Cruz Biotechnology) in the same manner as in ⁇ Example 2> Western blotting was performed using the antibody.
  • CD31 (l: 100) (BD Bioscience, USA) was identified as a primary antibody in the same manner as in Example ⁇ 4-1>.
  • CD31 immunoreflex green
  • pixels, fixels average intensity of two regions per mouse is expressed as area percentage (Sun et al., 2003).
  • CD31 immunoreactivity was higher in the comparison group (2.04 ⁇ 0.07% ⁇ P ⁇ 0.01) injected with artificial cerebrospinal fluid compared to the control group (1.51 ⁇ 0.03%) after 4 weeks of MCA0 induction.
  • Nogin treated group was confirmed to further increase the blood vessel density in the ischemic brain (3.91 ⁇ 0.13%, p ⁇ 0.01) compared to the comparative group (Fig. 9).
  • the results of Example 4 suggest that Noggin increases brain repair processes such as resolving scar formation, axon germination and angiogenesis during recovery from ischemic injury, and this process is associated with functional recovery and reduced brain atrophy. Confirmed.
  • Example 2> Nogin and BMP7 were treated to the MCA0 animal model prepared in Example ⁇ 1-2> under the same conditions as in Example ⁇ 3-1>.
  • Western blotting was performed using Iba-1 (l: 500) (Wako Pure Chemical Industries, Japan) antibody in the same manner as in ⁇ Example 2>.
  • Nogin-treated group showed higher Iba-1 expression in the ischemic cortex (1.53 fold change compared to the comparative group, P ⁇ 0.01).
  • ⁇ 5 Confirmation of microglial cells and their increased activity using immunofluorescence staining
  • Iba-1 protein a marker of activated microglial cells
  • macrophage immunity was confirmed to determine whether perivascular macrophages penetrated into the ischemic brain. Expression of the reaction marker CD169 was confirmed.
  • immunofluorescent staining was performed using Iba-l (l: 500) (Wako Pure Chemical Industries) or CD169 (l: 500) (Serotec) as the primary antibody in the same manner as in Example ⁇ 4-1>. Was performed. ,
  • Iba-1 or CD169 positive cells with large, rounded cell bodies were quantified in two consecutive brain sections from each mouse, and quantification was performed in three different groups in the ipsilateral cortex and subcortex in each brain section. Near ischemic location was performed at 500. The mean number of cells in 6 regions was calculated in each mouse (Shin et al., 2010).
  • Example 5 Based on the results of Example 5, Noggin increases the number of microglia activated in the ischemic cortex, and these results indicate that the majority of Iba-1 positive cells may be resident microgl ia. This supports recent studies showing that most of the cells involved in microgliosis in the acute stage of the ischemic brain are derived from the proliferation of microglia inhabiting (Li et al., 2013). Process macrophages It was confirmed that the increase was due to the increase of sobridized microglial cells.
  • Activated microglia are classified as either classically activated (Ml) or alternatively activated (M2) microglia (Henkel et al., 2009).
  • Ml classically activated
  • M2 alternatively activated
  • the Ml phenotype is involved in tissue damage, while the M2 phenotype plays a role in wound and tissue repair (Shechter and Schwartz, 2013).
  • markers of activated microglia phenotypes in the ischemic cortex were identified.
  • CD86 the marker of activated microglia Ml phenotype, IL- ⁇ , IL-12, CCL2 and TNF- ⁇ , which are pro-inflammatory mediators
  • Nogin and BMP7 were treated to the MCA0 animal model prepared in Example ⁇ 1-2> under the same conditions as in Example ⁇ 3-1>.
  • ARGl ARGl, CD206 and YM1, an antagonist of endogenous IL- ⁇ , and IL-10, an inflammatory cytokine, IL-10, markers of the activated microglial M2 phenotype were confirmed by Western blotting in the cortex.
  • Nogin and BMP7 were treated to the MCA0 animal model prepared in Example ⁇ 1-2> under the same conditions as in Example ⁇ 3-1>.
  • IL-lra 1: 200) (R & D Systems) (IL-10 (1: 250) (Abeam), ARGKl:; 1000) (Santa Cruz Biotechnology), CD206 ( 1: 500) (Serot ec K id 1 i ngt on, UK), YM1 (1: 1000) (Stem Cel Technologies, Canada) Western blotting was performed.
  • the control group injected with artificial cerebrospinal fluid was IL-lra (1.77 fold change), which is an antagonist of endogenous IL- ⁇ , and ARGK2.54 fold change, a marker of the M2 phenotype.
  • pro-inflammatory mediator IL- ⁇ and its antagonist IL-Ira was confirmed by ELISA (enzyme- 1 inked immunosorbent assay).
  • Example ⁇ 4-1> To confirm the expression pattern of the activated microglia marker (Iba-1) and the activated microglia phenotype markers (M1-IL12, CD86; M2-IL-10, CD206), the same method as in Example ⁇ 4-1> was used. Double immunofluorescence staining was carried out by the method, wherein the primary antibody was IL-12 (1: 250), CD86 (1: 500) or IL-10 (1: 250), CD206 (1: 500).
  • Iba-l (l: 500) was used and Alexa F 1 uor ® 568 (1: 1000) (Mo 1 ecu 1 ar as the secondary antibody) was used.

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Abstract

본 발명은 노긴(Noggin)을 유효성분으로 함유하는 소교세포 활성 증진용, 또는 허혈성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 노긴이 중뇌동맥협착(middle cerebral artery occlusion, MCAO) 동물 모델에서 MCAO 유도 2주 후부터 2주 동안 투여하였을 때, 뇌 위축을 억제하고, 뇌 조직 복구와 관련된 단백질들의 발현 및 혈관 신생을 촉진하며, 소교세포의 활성을 증가시킴으로써 허혈성 뇌졸중에서 회복되는 동안 뇌 조직의 복구에 기여하는 것을 확인하였다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭]
노긴을 유효성분으로 함유하는 소교세포 활성 증진용， 또는 허혈성 질환 예방 및 치료용 조성물
'
【기술분야】
본 발명은 노긴 (Noggin)을 유효성분으로 함유하는 소교세포 (microglia) 활성 증진용， 또는 허혈성 질환 (ischemic disease) 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
전세계적으로 사망의 주요 원인인 허혈성 뇌졸증 (ischemic stroke)은 자발적인 또는 혈전을 용해하는 재관류가 시간 내에 발생하지 않는 한 심각한 기능 장애의 결과를 초래한다. 허혈성 뇌졸중에서 살아남은 환자는 손상 받은 뇌에서 신경 생성 (neurogenesis)， '축삭발아 (axonal sprouting) , 아교세포 발생 (gliogenesis) 및 ■ 혈관신생 (angiogenesis) 등의 내생적 신경수복 (neuroreparative) 프로세스 정도에 따라 자연적인 회복의 차이가 나타난다 (Crarmer， 2008a; Gutierrez-Fernandez et al. , 2012). 유일한 허혈성 뇌졸중 치료제인 혈전용해제는 치료창이 좁아 증상 발생 3시간 이내에만 사용할 수 있으므로 소수의 환자만이 치료를 받을 수 있고 대부분의 환자는 보존적 치료에 의존하게 된다. 현재 신경수복을 도을 수 있는 치료 방법은 부재하다.
뇌졸중으로부터의 기능 회복 정도는 조직 복구를 지연시키는 요인과 뇌 가소성 및 복구 촉진 요인 사이의 균형에 따라 달라진다 (Popa-Wagner et al .， 2011). 주로 반웅성 성상세포 (reactive astrocytes)로 구성된 신경교흔 (glial scars)은 허혈성 뇌졸중 초기 단계에서 허혈성 영역의 경계를 표시하여 손상 조직을 보호하지만，장기적으로는 조직 복구를 방해한다 (Anderson er a 1.， 2003； Roitbak and Sykova, 1999) . 예를 들어， 노령 동물에서 허혈성 뇌졸중 후 증가된 신경교흔 형성이 젊은 동물과 비교하여 기능 회복 감소와 연관되어있다 (Badanet al . , 2003). 다른 한편으로는 골수기질세포 (bone marrow stromal cell) 투여， 간세포 성장인자 유전자의 이전 또는 허혈성 뇌졸중 후 에리트로포에틴 (erythropoietin)의 뇌실내 주입은 흉터 벽 두께를 감소시켜 행동 개선이 되고 이러한 개선은 축삭 재생 (axonal regeneration) 및 혈관신생과 같은 뇌 복구 프로세스와 관련되어있다 (Li et al. , 2005； Reitmeir et al. , 2011； Shimamura et al. , 2006). 따라서 , 허혈성 뇌에서 흉터 형성 및 이의 치료와 관련된 분자의 역할을 확인하는 것은 새로운 신경회복 치료법의 개발 S 이어질 것이다. 뼈형성단백질 (bone morphogenetic proteins, BMPs)과 이의 내생적 (endogenous) 길항제인 노긴 (Noggin)은 척수 손상과 뇌 질환 후 복구 과정에 관련되어 있다. 척수 및 뇌량 (corpus callosum)의 탈수초성 장애 (demyelinating lesions) 부위에서 BMP 발현 증가는 성상교세포증 (astrogliosis) 및 희소돌기아교세포 (ol igodendrocyte) 전구 세포의 분화로 성숙된 회소돌기아교세포의 억제와 관련되어있다 (Dummula et al. , 2011； Fuller et al. , 2007； Wang et al. , 2011). 또한， BMP는 신경 및 희소돌기아교세포의 생성을 억제하는 .동시에, 희소돌기아교 (oligodendroglial)-별아교 (astroglial) 전구 세포 및 신경줄기세포 (neural stem cells)로부터 별아교세포로의 분화를 촉진한다 (Mabie wt al. , 1997； Xi o et al. , 2010). 알츠하이머병 (Alzheimer' s disease, AD) 환자 및 알츠하이머병 마우스 모델에서 증가된 BMP 레벨은 해마 신경발생의 감소와 연관되어 있다 (Bonagui야 et al. , 2008； Crews et al . , 2010). 반면， 탈수초 (demyeli nation)동안 노긴 주입은 별아교세포의 수를 감소시키지만， BMP 신호전달의 하위단계인 SmacKSma and Mad Related Family) 단백질의 인산화를 막아서 희소돌기아교세포의 성숙 및 재생을 증가시킨다 (Cateet al. , 2010； Sabo et al.， 2011).
허혈성 뇌에서 BMP와 노긴의 증가는 보고되어있으나 (Chang et al. , 2003； Lei et al.' 2012； Shin et al. , 2012), 허혈성 뇌졸증 후의 만성기 시기 복구 프로세스에서의 이들의 역할은 명확히 밝혀지지않았다. 허혈성 질환 후 회복에 관여하는 것이 보고되어있는 BMP7(Chang et al. , 2003； Chou et al. , 2006)과 같은 BMP는 허혈성 뇌에서 BMP의 활성이 다를 수 있다는 가능성을 제기한다. 본 발명자들은 이전 연구에서 BMP 및 노긴의 발현에 있어서 시간적 변화가 허혈성 질환 후 신경회복 활성에 대한 단서임을 제공한다. BMP 및 노긴은 일시적 허혈성 뇌졸중 후 처음 4주 동안 다르게 발현되고, 이돌의 발현은 별아교교흔 (astroglial scar) 형성에 관여하는 것으로 여겨진다 (Shin et al. , 2012). 증가된 ΒΜΡ2및 ΒΜΡ7의 발현은 허혈성 뇌졸중 후 첫 1주와 마지막 4주에 관찰되었고, 이러한 레벨은 성상교세포증 (astrogliosis)과 관련되었다. BMP에 비해 노긴의 발현은 상대적으로 약하였으나， 허혈성 뇌졸중 2주 후에 유의적으로 증가하였고， 4주 후에는 더욱 증가하였다. 또한， BMP 및 노긴의 발현이 허혈성 뇌에서 각각 신경교섬유질산성단백질 (glial fibrillary acidic protein, GFAP)一양성 성상세포 및 Iba-1( ionized calcium-binding adapter molecule— 1) 양성 소교세포 (microglia)와 연관되어있는 것을 확인하였다. 이러한 연구 결과는 BMP 및 노긴이 허혈성 닉졸중 후 만성 단계 동안의 복구 프로세스에서 서로 다른 역할을 하는 것을 나타낸다 (Shin et al. , 2012). 그러나 노긴이 허혈성 뇌졸중의 치료에 사용될 수 있는지에 대해서는 연구된 바가 없다. 이에， 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위해 연구한 결과， MCA0를 유도한 허혈성 뇌졸중 동물 모델에서 노긴을 처리하여 확인한 결과, 뇌 위축이 감소하였고， 뇌 조직복구와 관련된 GAP-43 및 VEGF의 발현이 증가하였으며， 소교세포의 수를 증가시켰고， 이를 통해 소교세포의 대체 활성화를 증가시켜 허혈성 뇌졸중을 회복하는 동안 뇌 조직 복구에 기여하는 것을 확인함으로써, 노긴을 소교세포 활성 증진용， 또는 허혈성 질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다. 【발명의 상세한 설명】
[기술적 과제 ]
본 발명의 목적은 노긴 (Noggin)을 유효성분으로 함유하는 소교세포 (mi crogl i a)활성 증진제，또는 허혈성 질환 ( i schemi c di sease)예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법]
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 노긴 (Noggin) 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한， 본 발명은 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 유효성분으로 함유하는 소교세포 활성 증진제를 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 허혈성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 허혈성 질환 치료 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 소교세포 활성 증진제로 사용하기 위한 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질의 용도를 제공한다. 【유리한 효과]
본 발명은 노긴 (Noggin)을 유효성분으로 함유하는 소교세포 활성 증진용， 또는 허혈성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로， 노긴이 중뇌동맥협착 (middle cerebral artery occlusion, MCAO)동물 모델에서 MCAO유도 2주 후부터 2주 동안 투여하였을 때, 뇌 위축을 억제하고， 뇌 조직 복구와 관련된 단백질들의 발현 및 혈관 신생을 촉진하며, 소교세포의 활성을 증가시킴으로써 허혈성 뇌졸중에서 회복되는 동안 뇌 조직의 복구에 기여하는 것을 확인하였다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴 및 BMP7에 의한 pSmadl/5/8 발현 레벨 변화를 확인한 도이다:
Cont: 아무것도처리하지 않은 대조군;
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군; - 노긴 3 wks: 노긴을 3주 동안 주입한 군;
노긴 2 wks: 노긴을 2주 동안 주입한 군;
BMP7 3 wks: BMP7을 3주 동안 주입한 군; 및
BMP7 2 wks: BMP7을 2주 동안 주입한 군.
도 2는 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴 및 BMP7을 주입한 후 노긴 및 BMP7 단백질 발현 변화를 확인한 도이다:
Cont: 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군. '
도 3은 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴 및 BMP7을 주입한 후 뇌 혈류 변화 (A) 및 뇌 이미지 (B)를 확인한 도이다:
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군; 및
pre: MCAO유도 전.
도 4는 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴 및 BMP7을 주입한 후 대측성 반구 부피 (A) 및 동측 피질 부피 (B)를 확인한 도이다: aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군; 및
pre: MCAO 유도 전.
도 5는 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴 및 BMP7을 주입한 후 신경학적 점수 (A) 및 와이어 서스펜션 테스트 (B)로 행동 테스트를 확인한 도이다:
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군; 및
pre: MCAO유도 전.
도 6은 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴을 주입한 후 신경교상흔 (glial scar) 형성 변화를 확인한 도이다:
aCSF: 인공 뇌척수액올 주압한 비교군.
도 7은 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴을 주입한 후 시냅토파이신 (synaptophysin), GAP-43 및 VEGF의 발현 변화를 피질 및 피질 하부에서 확인한 도이다:
Control: 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및 - aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한비교군.
도 8은 상기 도 7을 그래프로 나타낸 도이다:
Control： 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군.
도 9는 MCA0유도 동물 모델에서 노긴을 주입한 후 CD31면역반웅에 의해 혈관 밀도를 확인한 도이다:
Control: 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군.
도 10은 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴을 주입한 후 Iba-1의 발현 변화를 피질 및 피질 하부에서 확인한 도이다:
Control, Cont： 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및
- aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군.
도 11은 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴을 주입한 후 Iba-1 및 CD169의 발현 변화를 피질 및 피질 하부에서 면역형광염색법으로 확인한 도이다:
Control, Cont: 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및 aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군.
도 12는 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴을 주입한 후 활성화된 소교세포 Ml 표현형의 마커인 CD86, 전염증매개체인 IL— 1β, IL-12, CCL2 및 TNF- α의 발현 변화를 피질에서 확인한 도이다:
Control： 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군.
도 13은 상기 도 12를 그래프로 나타낸 도이다:
Cont: 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군.
도 14는 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴을 주입한 후 활상화된 소교세포
M2 표현형의 마커인 ARGl, CD206 및 YM1, 내생 IL—Ιβ의 길항제인 IL-lra, 염증성 사이토카인인 IL-10의 발현 변화를 피질에서 확인한 도이다:
Control: 아무것도 처리하자 않은 대조군; 및
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군.
도 15는 상기 도 14를 그래프로 나타낸 도이다:
Cont: 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군.
도 16은 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴을 주입한 후 전염증매개체인 IL-Ιβ 및 이의 길항제인 IL-lra의 발현 변화 ¾ 피질에서 확인한 도이다:
Cont: 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군.
도 17은 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴을 주입한 후 활성화된 소교세포 마커 (Iba-1)와 활성화된 소교세포 표현형의 마커 (IL12, CD86)의 발현 양상을 확인한 도이다:
Cont: 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군.
도 18은 MCA0 유도 동물 모델에서 노긴을 주입한 후 활성화된 소교세포 마커 ( Iba-1)와 활성화된 소교세포 표현형의 마커 (IL12, CD86)의 발현 양상을 확인한 도이다:
Cont： 아무것도 처리하지 않은 대조군; 및
aCSF: 인공 뇌척수액을 주입한 비교군. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명올 상세히 설명한다. 본 발명은 노긴 (Noggin) 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 허혈성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 허혈성 질환 치료 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질의 용도를 제공한다. .
상기 노긴은 서열번호 1의 염기서열로 기재된 것이 바람직하다.
상기 유전자 전달체는 백터 또는 재조합 바이러스인 것이 바람직하고ᅳ 상기 백터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 백터인 것이 바람직하며 , 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스， 아데노 바이러스， 아데노 부속 바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 세포는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell, HSC) 또는 수지상 세포 (dendritic cell)인 것이 바람직하다.
상기 허혈성 질환은 뇌경색 (cerebral infarction), 뇌허혈 (cerebral ischemia) , 뇌중풍 (cerebrovascular accident) , 뇌졸중 (stroke)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다. 본 발명의 구체작인 실시예에서, 본 발명자들은 노긴 및 BMP7 재조합 단백질을 MCA0유도 후 주입하여 확인한 결과， pSmadl/5/8발현은 MCA0유도 2주 후 2주 동안 하루에 1 ig 단백잘 주입에 의해 현저히 증가하였고， 상기 결과를 토대로 유효량 및 재조합 단백질 투여의 기간을 결정하여 앞으로의 실험은 MCA0유도 2주 후 2주 동안 하루에 1 씩 단백질을 주입한 후 수행하였으며 (도 1 내지 도 2 참조)， 또한, 본 발명자들은 노긴이 뇌 위축을 방지하고， 기능을 향상시키는 것을 확인하기 위해 뇌혈류 변화 및 이미지를 확인한 결과， 뇌혈류의 변화는 차이를 보이지 않았으나， 이미지에서는 노긴을 주입한 실험군은 동측 측뇌실이 커져있음에도 불구하고 동측 뇌의 상태는 상대적으로 보존되어있음을 확인하였고 (도 3A 내지 도 3B 참조)， 뇌 부피를 측정한 결과， 동측 반구, 동측 피질 및 피질 하부 부피 모두 노긴을 주입한 마우스에서 더 높게 나타나는 것을 확인하였으며 (도 4A 내지 도 4B 참조) , 행동에서 또한 노긴을 주입한 마우스에서 유의한 개선 효과를 확인하였다 (도 5 참조) . 상기 결과들로 허혈성 뇌졸중 이후 단계에서 노긴이 BMP 신호 전달을 억제하여， 뇌 위축 및 기능적 결과를 개선하는 것을 확인하였다.
또한， 본 발명자들은 노긴에 의한 신경교상흔 (gl ial scar ) 형성 변화를 확인한 결과， 노긴을 주입한 마우스에서 GFAP 양성 파이버가 약하게 염색되는 것을 확인하였고 (도 6 참조)， 뇌 조직 복구와 관련된 단백질의 발현 변화를 확인한 결과， 노긴을 처리한 군에서 GAP-43 및 VEGF의 발현이 증가하는 것을 확인하였으며 (도 7 내지 도 8 참조) , 혈관 신생 생성 증가를 확인하기 위해 혈관 밀도를 확인한 결과， 노긴을 처리한 군은 허혈성 뇌에서 혈관 밀도를 더 증가시키는 것을 확인하였고 (도 9 참조)， 소교세포의 활성화 변화를 확인한 결과， 노긴을 처리하였을 때 소교세포의 마커인 Iba-1 양성 세포의 수뿐만 아니라 세포당 발현 레벨도 증가하였으나， CD169 양성 세포는 차이가 보이지 않는 것을 확인하였다 (도 11A 내지 도 11B) . 상기 결과로 노긴으로 유도되는 뇌 복구 프로세스가 대식세포의 침윤보다 활성화된 소교세포의 증가에 의한 것.임을 확인하였다.
또한， 본 발명자들은 활성화된 소교세포 Ml 표현형의 마커 (CD86) 및 전염증매개체 ( IL-Ι β， IL-12 , CCL2 및 TNF- α )의 활성을 확인한 결과， 노긴을 처리한 군에서 MCA0에 의해 증가된 Ml 표현형의 마커 및 전염증매개체의 발현을 억제하는 것을 확인하였고 (도 12 내지 도 13 참조)， 활성화된 소교세포 M2표현형의 마커 (ARGl , CD206및 YM1) , 내생 IL-Ιβ의 길항제인 IL-lra , 염증성 사이토카인인 IL-10의 활성을 확인한 결과, 노긴을 처리한 군에서 M2 표현형의 마커 (ARGl , CD206 및 YM1) , 내생 IL-Ι β의 길항제인 IL-lra , 염증성 사이토카인인 IL-10 모두 유의적으로 증가하는 것을 확인하였으며 (도 14 내지 도 15참조)， 전염증매개체인 IL-Ι β 및 이의 길항제인 IL-lra의 발현을 확인한 결과， 노긴을 처리한 군은 IL-Ι β는 감소하였으나， IL-lra는 증가하는 것을 확인하였고 (도 16 참조)， 활성화된 소교세포 마커 ( Iba-1)와 활성화된 소교세포 표현형의 마커 (M1-IL12 , CD86 ; M2-IL-10 , CD206)의 발현을 확인한 결과， 노긴을 처리한 군은 Ml 표현형 마커인 IL-12 및 CD86은 감소하였고， M2 표현형 마커인 IL-10 및 CD206은 증가하는 것을 확인하였으며， 상기 마커들의 발현은 Iba— 1과 같은 위치에서 나타나는 것올 확인하였다 (도 17 내지 도 18 참조) . 상기 결과로 노긴 처리가 활성화된 소교세포의 Ml 표현형을 M2 표현형으로 변화를 유도하고， 노긴에 의한 소교세포의 대체 활성화 (M2)의 증가는 허혈성 뇌졸중을 회복하는 동안 뇌 조직 복구에 기여하는 것을 확인하였다.
따라서， 본 발명의 노긴은 MCA0동물 모델에서 MCA0유도 2주 후부터 2주 동안 투여하였을 때， 뇌 위축을 억제하고， 뇌 조직 복구와 관련된 단백질들의 발현 및 혈관 신생을 촉진하며， 소교세포의 활성을 증가시킴으로써 허혈성 뇌졸중에서 회복되는 동안 뇌 조직의 복구쎄 기여하는 것을 확인함으로써， 상기 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질은 허혈성 질환 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체 세포 또는 노긴 단백질을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며， 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분， 젤라틴화 전분， 미결정샐를로오스， 유당， 포비돈， 콜로이달실리콘디옥사이드， 인산수소칼슘， 락토스， 만니를， 엿， 아라비아고무， 전호화전분， 옥수수전분， 분말셀를로오스， 히드록시프로필셀를로오스, 오파드라이， 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄， 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄， 스테아린산칼슘， 백당， 덱스트로스， 소르비를 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0. 1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉， 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데， 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제， 증량제， 결합제, 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제， 환제， 산제, 과립제， 캡슐제 등이 포함되며， 이러한 고형 제제는 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 칼슘카보네이트 (Cal cium carbonate) , 수크로스 (Sucrose) , 락토오스 (Lactose) 또는 젤라틴 둥을 섞어 조제될 수 있다. 또한， 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제，유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제, 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제，좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제， 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol ) , 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크로골, 트읜 ( tween) 61 , 카카오지， 라우린지， 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목.적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 았으며， 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사， 피하주사， 정맥주사， 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중， 연령, 성별, 건강상태, 식이， 투여시간ᅳ 투여방법 , 배설률 및 질환의 증증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
투약 단위는， 예를 들면 개별 투약량의 1， 2， 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2 , 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부， 1/2， 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/kg일 수 있고,구체적으로 0.001 - 1 g/kg일 수 있으며， 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다. 그러나, 투여 경로， 질병의 중증도， 성별， 체중， 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술， 방사섰 치료， 호르몬 치료， 화학 치료 및 생물학적 반웅 조절제를 사용하는방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한， 본 발명은 허혈성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체, 세포 또는 노긴 단백질의 용도를 제공한다.
상기 노긴은 서열번호 1의 염기서열로 기재된 것이 바람직하다.
상기 유전자 전달체는 백터 또는 재조합 바이러스인 것이 바람직하고, 상기 백터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 백터인 것이 바람직하며， 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스， 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다. 상기 세포는 조혈모세포 또는 수지상 세포인 것이 바람직하다. ' 상기 허혈성 질환은 뇌경색， 뇌허혈， 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.
본 발명의 노긴은 MCA0 동물 모델에서 MCA0 유도 2주 후부터 2주 동안 투여하였을 때, 뇌 위축을 억제하고， 뇌 조직 복구와 관련된 단백질들의 발현 및 혈관 신생을 촉진하며, 소교세포의 활성을 증가시킴으로써 허혈성 뇌졸중에서 회복되는 동안 뇌 조직의 복구에 기여하는 것을 확인함으로써， 상기 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는노긴 단백질은 허혈성 질환 예방 및 개선을 위한 건강기능식품으로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질이 상기와 같은 허혈성 질환 예방 및 개선을 위해 이용되기 위해서는， 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체， 부형제， 희석제 둥과 흔합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료， 환, 과립， 정제 또는 갑셀 형태이다.
본 발명의 건강기능식품은， 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대， 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질 이외에 구연산， 액상과당, 설탕， 포도당， 초산， 사과산， 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품의 유효성분으로 포함돨 수 있는 양은 허혈성 질환 예방 및 개선을 원하는 사람의 연령， 성별， 체중, 상태， 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며， 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g내지 10.0 g 정도로 포함되는 것이 좋으며， 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 허혈성 질환 예방 및 개선 효과를 얻을 수 있다. 1.4 또한，본 발명은 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 유효성분으로 함유하는 소교세포 활성 증진제를 제공한다 .
또한, 본 발명은 소교세포 활성 증진제로 사용하기 위한 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질의 용도를 제공한다.
상기 노긴은 서열번호 1의 염기서열로 기재된 것이 바람직하다.
상기 유전자 전달체는 백터 또는 재조합 바이러스인 것이 바람직하고， 상기 백터는 선형 DNA , 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 백터인 것이 바람직하며， 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스， 아데노 바이러스， 아데노 부속 바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 세포는 조혈모세포 또는 수지상 세포인 것이 바람직하다.
본 발명와 노긴은 MCA0 동물 모델에서 MCA0 유도 2주 후부터 2주 동안 투여하였을 때， 뇌 위축을 억제하고， 뇌 조직 복구와 관련된 단백질들의 발휜 및 혈관 신생을 촉진하며， 소교세포의 활성을 증가시킴으로써 허혈성 뇌졸중에서 회복되는 동안 뇌 조직의 복구에 기여하는 것을 확인함으로써， 상기 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질은 소교세포 활성 증진제로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. .
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 통계처리
실험결과는 평균土표준편차로 표기하였다. 두 그룹간의 비교는 unpaired Student ' s —test s를 사용하여 분석하였고， 두 그룹 이상의 비교는 평균값의 집단 간 비교는 사후 피셔의 최소유의차검정 (Fi sher ' s protected least signi f i cant di f ference tests) (Statview version 5 , SAS Inst i tute Ins . , 미국)을 이용하여 AN0VA 단방향 분석으로 수행하였다. 신경학적 검사 및 와이어 서스펜션 테스트 점수는 Wilcoxon-Mann-Whitney ^tests(Prism 4， GraphPad Software Inc., 미국)를 사용하여 분석하였다. 유의성 있는 p값은 〈0.05로 표기하였다. <실시예 1>중뇌동맥 협착 (middle cerebral artery occlusion, CAO)동물 모델의 제조
<1-1>실험 동물의 준비
10내지 11주령 수컷 C57BL/6마우스를 오리엔트 바이오 (Orient Bio Inc. 대한민국)에서 구매하여 실험에 사용하였다. 모든 과정은 이화여자대학교 의과대학 실험동물운영위원회의 승인 및 실험동물의 윤리적인 사용을 위한 국제 가이드라인을 따랐다. 마우스는 실험하기 2주 전 조명 사이클을 12시간은 밝게ᅳ 12시간은 어둡게 설정하였고， 방은 22土 2°C온도로 적웅시켰다.
<1-2> MCA0동물 모델의 제조
상기 실시예 <1-1>의 실험 동물을 가지고， 실험을 위한 MCA0동물 모델을 제조하였다.
구체적으로， MCA0 동물 모델은 이전에 알려진 방법을 사용하여 제조하였다 (Shin et al. , 2009) . 마우스를 아이소플투레인 ( isoflurane)을 이용하여 마취시킨 후， 광심유 측정소자 (fiber optic probe)를 오른쪽 정수리 뼈 (브레그마 (bregma)를 기준으로 뒤로 2 隱， 옆으로 5 画)에 부착하고， 광파이버형 레이저 도플러 혈류속계 (laser Doppler flow meter ) (Per i flux System 5010， 스웨덴)에 연결하였다. 뇌혈류 (cerebral blood flow, CBF)는 MCAO 및 재관류 (reperfusion) 기간 동안 컴퓨터 기반 데이터 수집 시스템 (Perisoft， 스웨덴)으로 연속적으로 기록하였다. 6-0실리콘 코팅된 검은색 모노필라멘트 봉합사 (Doccol Cooperation, 미국)는 노출된 오른쪽 외경동맥에 삽입되어， 내경동맥을 지나 대뇌동맥륜 속에 끼어들어가서 중뇌동맥의 기원을 막도록 삽입되었다. 상기 필라멘트를 30분 동안 방치한 후， 뇌혈류 재설정을 위해 회수하였다. MCAO 동안에는 동물 모델에서 뇌혈류가 최대 85% 감소하였고， 재관류 10분 후에는 80% 이상 회복되었다. 직장 (rectal)의 온도는 수술 및 회복기간 동안 가열 패드를 이용하여 자동 은도조절 장치로 37.0±0.5°C로 맞춰주었다. <실시예 2>노긴 (noggin) 및 BMP7투여 용량 및 기간 결정
허혈성 뇌의 BMP 신호 전달 경로에서 재조합 노긴과 BMP7의 효과를 알아보기 위해 상기 실시예 <1-2〉에서 제조된 MCA0 동물모델에 재조합 노긴 및 BMP7을 투여하였다.
구체적으로， 재조합 인간 노긴 (R&D Systems, 미국) 및 인간 BMP7(Biovision ,Inc. , 미국)을 인공뇌척수액 (artificail cerebrospinal fluid, aCSF)(R&D Systems)에 용해시켰다. 각각의 단백질 또는 인공뇌척수액은 제조업체의 사용방법에 따라 ALZET 삼투 펌프 (osmotic pumps) (DURECT Corporation, 미국)에 의해 동측 측내실로 전달하였다. 삼투 펌프에 결합된 캐뉼라 (cannula) (ALZET Brain infusion kit 3, DURECT Corporation)는 브레그마 0.5國 앞， 정중선으로부터 1 隨 옆 및 두개골 표면 3 讓 아래에 심었다. MCA0 유도 2주 후， 2주 동안 또는 MCA0 유도 1주 후， 3주 동안 하루에 0.5 또는 1 의 단백질을 주입하였다. 테스트 용량은 이전 연구에 기초하여 결정하였다 (Cate et al . , 2010； Colak et al. , 2008). 단백질을 주입한 마우스 각각의 뇌 반구로부터 피질 및 피질 하부 조직을 얻어 웨스턴 블랏팅 (western blotting)을 수행하였다. 조직은 단백질 분해효소 칵테일 (protease inhibitor cocktail) (Complete Mini, Roche, 독일)을 포함하는 10 mi SDS 완충용액 (50 mM Tris-HCl, 1% IGEPAL CA-630 , 0.25% deoxycholic acid, 150 mM NaCl , 1 mM ethylene-diamine tetra acetic acid, 1 mM NaF, 0.1% sodium dodecyl sulfate, !)11 7.4)으로 용해하였고， 20분 동안 얼음에 놓아둔 후， 4°C에서 15,700 Xg로 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액의 단백질 농도를 확인한 뒤 (Bio-Rad Laboratories, 미국), SDS-PAGE ( SDS-po 1 yac r y 1 am i de gel electrophoresis)를 위해 80 의 단백질을 로딩 ( loading)하였다. 전기영동한 단백질을 일렉트로블랏팅 (electroblotting) 장치를 이용하여 I隱 obilon-P transfer 멤브레인 (Mil lipore Corporate, 미국)으로 이동시킨 뒤， 상기 멤브레인은 0.1%트원— 20(Tween-20) 및 10%분유를 포함하는 TBS(Tr is-buf fered saline)에 넣어 1시간 동안 블로킹 (blocking)한 후， 인산화된 Smadl/5/8(pSmadl/5/8, 1： 500) (Cell Signaling Technology Inc. , 미국) 및 Smadl/5/8(l: 500) (Santa Cruz Biotechnology, 미국) 항체를 넣고 밤새 반웅시켰다. 그리고나서， 멤브레인은 0.1% 트원 -20을 포함하는 TBS로 20분씩 3번 세척하고, HRP( horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체를 넣고 1시간 동안 반웅시킨 후， 0.1% 트원 -20을 포함하는 TBS로 20분씩 3번 세척하였다. 단백질 밴드는 웨스턴 블¾팅 루미놀 시약 (luminol reagent) (Santa Cruz Biotechnology)을 이용하여 시각화하였다. 정량은 Image J소프트웨어 (version 1.37, NIH, 미국)를 이용하여 인산화 및 비인산화 Smadl/5/8 농도의 합계로 평균화하여 나타내었다.
그 결과 도 1에 나타내 바와 같이 , 노긴을 2주 또는 3주 동안 0.5 iig 처리하였을 때， pSmadl/5/8발현 감소가 보이자 않았으나, 1 fig 노긴을 2주 동안 처리했을 때만 눈에 띄게 pSmadl/5/8 발현 감소를 확인하였다 (인공뇌척수액과 비교하여 0.72배 변화， ρ=0·02). 또한, ΒΜΡ7의 경우 2주 동안 1 jg 처리하였을 때， pSmadl/5/8 발현이 눈에 띄게 증가하는 것을 확인하였다 (인공뇌척수액과 비교하여 1.70배 변화, p〈0.01) (도 1). 또한， 노긴 및 BMP7을 하루에 1 씩 2주 동안 투여하였을 때 MCA0 유도
4주 후 허혈성 피질 (ischemic cortex)에서 노긴 및 BMP7 단백질 레벨 변화를 확인하기 위해，상기 실시예 <1— 2>에서 제조한 MCA0동물 모델을 사용하여 상기 서술한 바와 같이 노긴 및 BMP7을 MCA0 유도 2주 후부터 2주 동안 하루에 1 씩 주입한 후, 웨스턴 블랏팅을 수행하였고， 이 때 노긴 (1:200) (R&D Systems), BMP7(l: 500) (Abeam, 영국) 및 액틴 (act in, 1： 1000) (Santa Cruz Biotechnology) 항체를 사용하였다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이， 노긴의 경우 인공뇌척수액과 비교했을 때, 1.19 배 증가하였고， BMP7의 경우 1.17배 증가하였으며， 모든 p값은 〈0.05이다 (도 2). 노긴 또는 BMP7의 3주 처리 효과가 낮은 이유는 BMP 신호전달을 막거나， 강화하기에 충분했거나， BMP의 장시간 노출에 의해 BMP 수용체의 민감도가 바뀌었기 때문이다. pSmadl/5/8 발현은 MCAO 유도 2주 후 2주 동안 하루에 1 I返 단백질 주입에 의해 현저히 증가하였고， 상기 결과를 토대로 유효량 및 재조합 단백잘투여의 기간을 결정하여 앞으로의 실험은 MCA0 유도 2주 후 2주 동안 하루에 1 씩 단백질을 주입한 후 수행하였다. <실시예 3>허혈성 뇌졸중 (ischemic stroke)에서 노긴의 기능 확인
<3-1>뇌 위축 (brain atrophy) 억제 효과 확인
MCA0를 유도한 허혈성 뇌졸중 동물 모델에서 노긴이 뇌 위축을 방지하고， 기능을 향상시키는 것을 확인하기 위해， 뇌혈류 변화 및 이미지를 확인하였다. 구체적으로， 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 MCAO동물모델에서 MCAO유도 2주 후부터 2주 동안 하루에 노긴 및 BMP7 단백질 1 을 각각 주입하고， 비교군으로 인공뇌척수액을 주입한 뒤, 뇌혈류 변화는 MCA0 및 재관류 (reperfusion) 기간 동안 컴퓨터 기반 데이터 수집 시스템 (Perisoft， 스웨덴)으로 연속적으로 기록하여 확인하였고， 뇌 이미지를 확인하기위해 자기공명영상 (Magnetic resonance imaging) 및 크레질 바이올렛 (cresyl_ violet， CV) 염색을 수행하였다. 자기공명영상은 MCA0 유도 4주 후 아이소플루레인 (isoflurane)으로 마취하여， 3.0-Teslar whole body systemdntera, Philips Healthcare, 네덜란드)를 사용하여 행하였다. 주입 펌프는 MR스캔 전 제거하였다. 관상면 (coronal ) T2-weighted images(T2WIs)는 반복시간 (repetition time, TR)/반사시간 (echo time, TE) =4000/ 100 ms, 관측시야 (field of view, FOV) 50X50， 1.0 mm슬라이스 두께， 200x200매트릭스 및 5분 4초 스캔시간 (scan time)으로 획득하였다. 직장 온도， 심장 박동 및 호흡수는 스캔하는 동안 관찰되었다. 또한， 크레질 바이을렛 염색은 세포핵을 염색하는 것으로, 상기 마우스를 안락사시키고， 뇌를 적출하여 냉동시키고 크라이오스탯 (cryostat )으로 절단하였다 (30 urn 두께) . 뇌 절편은 600- 간격으로 수거하고， 크레질 바이올렛으로 염색하여 뇌 단면을 염색하였다.
그 결과 도 3A에 나타낸 바와 같이， 뇌혈류의 변화는 인공뇌척수액을 주입한 비교군이나, 노긴 또는 BMP7 단백질을 주입한 실험군에서 차이를 보이지않았으나 (도 3A) , 도 3B에 나타낸 바와 같이， 뇌 이미지에서는 인공뇌척수액을 주입한 비교군은 동측 측뇌실이 커졌고， 동측 반구의 측면 공간이 뇌척수액으로 채워져있어 심한 뇌위축을 나타내었으나， 노긴을 주입한 실험군은 동측 측뇌실이 커져있음에도 불구하고 동측 뇌의 상태는 상대적으로 보존되었고, 이와 대조적으로 BMP7을 주입한 실험군은 인공뇌척수액을 주입한 비교군과 같은 결과를 보이는 것을 확인하였다 (도 3B) .
<3-2>뇌 부피 (brain volume) 감소 억제 확인
MCA0를 유도한 허혈성 뇌졸중 동물 모델에서 노긴이 뇌 위축을 방지하고， 기능을 향상시키는 것을 확인하기 위해， 뇌 부피를 측정하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 노긴 및 BMP7을 처리한 후， 크레질 바이올렛으로 염색하였다. 허혈성 뇌 부피는 MCA0유도 4주 후 성상교세포증 (astrogl iosi )에 의해 감소되므로, 동측 반구 부피는 경색증 부분이 아닌 뇌 부피의 손실로 정의하여 측정하였다. 각 반구 및 동측 피질 부피는 이미지 분석기 ( image analyzer KAxiovi sion LE 4.1， Car l Zei ss , 독일)로 측정하였다. 동측 피질 하부의 부피는 동측 반구 부피로부터 동측 피질 부피를 빼서 측정하였다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이， 대측성 반구 부피는 차이가 없으나， 동측 반구 부피는 인공뇌척수액을 주입한 마우스 (91.20±3.68 mm3, p〈0.01) 보다 노긴을 주입한 마우스 ( 109.07 ± 2.68 隱 3)에서 유의하게 높은 것을 확인하였다 (도 4A) . 또한, 동측 피질 부피는 인공뇌척수액을 주입한 마우스 (49.46± 2.46 隱 3, p〈0.01) 보다 노긴을 주입한 마우스 (59.13± 2.07 隱 3)에서 높게 나타났고， 또한， 피질 하부 부피도 인공뇌척수액을 주입한 마우스 (41.84土 1.76 mm3 , p〈0.01)보다 노긴을 주입한 마우스 (49.94± 1. 18 隱 3)에서 더 높게 나타나는 것을 확인하였다 (도 4B) . 그러나， BMP7을 처리한 경우에는 뇌 부피의 감소를 억제하지 않았다.
<3-3> 행동 테스트 (behavioral tests)로 변화 확인
MCA0를 유도한 허혈성 뇌졸중 동물 모델에서 노긴이 뇌 위축을 방지하고 기능을 향상시키는 것을 확인하기 위해, 행동 테스트로 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 MCA0 동물모델에， 상기 실시예 <3-1〉과 동일한 조건으로 노긴 및 BMP7을 처리하였다. 와이어 서스펜션 테스트에서 신경학적 점수 및 성능은 MCA0 유도 전과 후 매주 측정하였다. 신경학적 점수는 4점 둥급 평가 시스템을 기반으로 하였다 (Li et al . , 2004)： 0=장애없음， 1=앞다리 약화되고， 몸통은 꼬리에 의해 동측에 의지， 2=영향을 받는 쪽으로 듬' 3=영향을 받는 쪽의 무게를 견딜 수 없음 및 4=자발적인 운동 활성 또는 배럴 를¾ (barrel rolling)없음. 와이어 서스펜션 테스트는 이전 연구 (Takahashi et al . , 2009)를 수정하여 진행하였다. 두 개의 지지대 사이에 길이 60 cm , 직경 2 隱이고， 표면으로부터 60 cm 높이에 위치한 와이어의 중간지점에 마우스를 30초 동안 올려놓았다. 행동은 다음과 같은 점수로 평가하였다: 0=와이어에서 떨어짐 1=두 앞발로 와이어에 매달림， 2=두 앞발로 와이어에 매달리고， 와이어에 을라가려고 시도함， 3=두 앞발과 하나 또는 두 뒷발로 와이어에 매달림， 4=꼬리로 와이어를 감싸며， 네 발 모두 와이어에 매달림， 5=지지대로 탈출함. 세 번 실험하여 이의 평균 점수를 계산하였다. 또한, 체중도 MCA0 유도 후 4주 동안 매주 측정하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이， MCA0 유도 전이나 단백질을 처리시작점인 MCA0유도 2주차까지는 행동에 차이가 없었고， MCA0유도 4주 후， 비교군 마우스는 상기 증상이 개선되지 않았으나， 노긴올 주입한 마우스는 행동에서 유의한 개선 (신경학적 점수에서 p=0.04 , 와이어 서스펜션 테스트에서 P〈0.01)을 확인할 수 있었다 (도 5) . BMP7은 결과에 영향을 미치지않았다. 또한， 마우스의 체중은 MCA0 유도 2주 후에도 각 군별로 차이가 없었으나 (비교군: 23. 13± 0.24 g, 노긴 처리군: 23.75± 0.34 g , BMP7 처리군: 23·13±0.45 g), MCAO 유도 4추 후에는 비교군 (24.57±0.28 g) 또는 BMP7 처리군 (24.40±0.57g)에 비해 노긴 처리군 (25.58±0.31g)의 체중이 더 증가한 것을 확인하였다 (비교군 대비 p=0.02). 이는 허혈성 뇌졸중의 후기 단계 동안 노긴이 BMP 신호 전달을 억제하여 뇌 위축을 감소시키고, 뇌의 기능을 개선하는 것올 나타낸다.
<실시예 4>허혈성 뇌에서 노긴의 회복 효과 확인
<4-1>신경교상흔 (glial scar)의 확인
본 발명자들의 이전 연구에서 MCA0 유도 4주 후 허혈성 뇌에서 성상교세포증이 유지되는 것을 확인하였다 (Shin et al. , 2012). 이에 신경교상흔 형성을 노긴이 조절하는지 확인하기 위해 액화 ( liquefied) 및 낭성 공동화 (cystic cavitation) 형성된 허 1성 중심 (core)의 벽에서 흉터 두께를 GFAP(glial fibrillary acidic protein) 염색을 통해 측정하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 MCA0 동물모델에， 상기 실시예 <3-1>과 동일한 조건으로 노긴 및 BMP7을 처리하였다. MCA0 유도 4주 후 마우스에 펜토바비탈나트륨 (sodium pentobarbital, 120 mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취시킨 후， 생리식염수와차가운 4% 포름알데히드 (formaldehyde)가 들어있는 0.Γ Μ 인산나트륨 완충용액 (sodium phosphate buffer, pH 7.2)올 경심관류 (transcardially)로 관류시켰다. 뇌를 적출한 뒤 밤새 고정시킨 다음 30% 수크로스 (sucrose) 용액에 보관하였다. 크라이오스탯을 이용하여 브레그마로부터 +1.4부터 -1.0 mm위치를 관상면으로 뇌를 절단하고 (두께 20 μπι: 간격 600-/ ), 젤라틴 코팅된 슬라이드에 올려 고정하였다. 뇌 절편은 0.1% Triton Χ-100, 5% 일반혈청 (nomal serum) 및 1% 소혈청알부민 (bovine serum albumin)이 들어있는 TBS에 1시간 동안 넣어두고， 1차 항체 GFAP(l:l000)(Sigma-Aldrich, 미국)를 첨가하여 밤새 반웅시켰다. 그 후， 2차 항체인 플루오레세인 (fluorescein)이 결합된 이소티오시아네이트 (isothiocyanate)(l:1000)(Vector Laboratories Inc.， 미국)를 넣고 1시간 동안 반응시켰다. ' 절편은 모든 단계 사이에 TBS로 세척하였으며， 핵 염색용 DAPKVector Laboratories Tnc.)를 포함하는
Vectashield mounting medium을 커버슬립을 올리기 전에 뇌 절편에 처리하였다. 형광 이미지는 488 및 543 nm 파장으로 세팅된 필터를 가진 공초점 현미경 (confocal microscope) (LSM5 PASCAL; Car 1 Zeiss)을 사용하여 절편의 z 축으로부터 4- 간격, 20 / 의 전체 깊이를 덮는 부분에서 얻었다.
또한, 신경교상흔의 두께를 측정하기 위해 calibration bar(AxioVision
1』; 4.3)을 이용하여 허혈성 증심 부분의 강하게 염색된 GFAP 양성 성상세포 파이버 (fibers)와 평행하게 수평으로 측정하였다. 각각의 마우스에서 순차적인 두개의 뇌 절편이 사용되었고， 측정은 동측 선조체 (striatum)에서 흉터 둘레 (border)의 세 필드 (fields)에서 수행하였다. 마우스당 6군데로부터 평균 두께를 측정하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이， 인공뇌척수액을 주입한 비교군에서 구멍 (cavity)을 둘러싼 GFAP 양성 파이버가 강하게 염색되었으나 (74.79±9.51 μη 두께)， 노긴을 주입한 마우스에서 GFAP 양성 파이버가 약하게 염색되는 것 (29.21±6.86 !M 두께)을 확인하였다 (비교군 대비 p〈0.01) (도 6).
<4-2>뇌 조직 복구와관련된 단백질 발현 변화확인
시냅토파이신 (synaptophysin)은 시냅스형성 (synaptogenesis)에 관련된 전시냅스 소포 단백질 (pre-synaptic vesicle protein)이고， GAP-43은 신경돌기 성장 (neurite growth)에 관련된 성장 돌기 단백질 (growth cone protein)이다. 이단백질들은 허혈성 뇌졸중으로부터 회복되는 동안 증가되고 (up-regulated), 신경 가소성 (neuronal plasticity)의 마커로 사용된다 (Stroemer et al. , 1995) . 또한, VEGF는 허혈성 이후 혈관 복구 및 혈관 신생에 관련된다 (Greenberg and Jin, 2013； Hermann and Zechariah, 2009) . 이에， 허혈성 질환 이후 뇌 조직 복구와 관련된 단백질인 시냅토파이신 (synaptophysin), GAP-43 및 VEGF의 발현 변화를 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 MCA0 동물모델에， 상기 실시예 <3-1>과 동일한 조건으로 노긴 및 BMP7을 처리하였다. 또한, 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 시냅토파이신 (l:5000)(Millipore Corporation, 미국)， GAP-43 1:1000) (Mi llipore Corporation) 및 VEGF 1:500) (Santa Cruz Biotechnology) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.
그 결과 도 7 내지 도 8에 나타낸 바와 같이, MCA0 유도 4주 후에 아무것도 처리하지 않은 대조군， 인공뇌척수액을 주입한 비교군 및 노긴을 처리한 군에서 시냅토파이신의 발현은 비슷한 레밸인 것을 확인하였고， GAP-43은 대조군에 비해 비교군이 피질하부 (p=0.07)보다 허혈성 피질 (1.34 배 변화， p〈0.01)에서 더 많이 발현되는 것을 확인하였으며， 노긴을 처리한 군은 허혈성 피질 (비교군 대비 1.17 배 변화, p=0,03)과 피질하부 (비교군 대비 1.51 배 변화， p〈0.01)모두에서 GAP-43의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한， VEGF는 대조군에 비해 비교군이 허혈성 피질 (1.27 배 변화， p=0.01) 및 피질하부 (1.60 배 변화， p=0.01)에서 발현 레벨이 더 높았고， 노긴을 처리한 군은 GAP-43과 비슷하게 허혈성 피질 (비교군 대비 1.24 배 변화， p=0.04)과 피질하부 (비교군 대비 1.53 배 변화. p〈0.01)에서 발현이 증가하는 것을 확인하였다 (도 7 내지 도 8).
<4-3>혈관신생 (angiogenesis) 촉진 확인
노긴을 처리함에 따라 혈관신생이 증가하는 것을 확인하기 위해, 동측 피질의 주변 허혈 부위에서 내피세포 마커인 CD31 면역반웅성 (i隱 unoreactivity)에 의한 혈관 밀도 변화를 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <4-1〉과 동일한 방법으로 1차 항체로 CD31(l:100)(BD Bioscience, 미국)을 사용하여 확인하였다.
혈관의 밀도 분석을 위해， 절편당 미리 정해놓은 영역 (픽샐, fixels)에서 CD31 면역반웅성 (녹색)의 픽셀 강도는 AxioVision LE 4.3 프로그램을사용하여 각 마우스로부터 두 연속적인 뇌 절편의 허혈성 피질 근처에서 측정되었다. 마우스당 두 개 영역의 평균 강도는 면적 백분율로 나타내었다 (Sun et al., 2003) 그 결과 도 9에 나타낸 바와 같이， MCA0 유도 4주 후 대조군 (1.51±0.03%)에 비해 인공뇌척수액을 주입한 비교군 (2.04±0.07%ᅳ P〈0.01)에서 CD31면역반응성이 더 높게 나타났고, 노긴을 처리한 군은 허혈성 뇌에서의 혈관 밀도를 더 증가시키는 것 (비교군 대비 3.91±0.13%， p〈0.01)을 확인하였다 (도 9). 상기 <실시예 4>의 결과를 통해 노긴은 허혈성 손상으로부터의 회복동안 흉터 형성의 해결， 축삭 발아 및 혈관신생과 같은 뇌 복구 프로세스를 증가시키고， 이러한 프로세스는 기능 회복과 뇌 위축의 감소와 연관됨을 확인하였다.
<실시예 5>노긴에 의한소교세포 (microglia) 활성 증가 확인
<5-1>웨스턴 블랏팅을 이용한소교세포의 활성 증가 확인
최근 연구에서 활성화된 소교세포 (microglia)가 신경이 망가진 후 신경 가소성 (neural plasticity) 및 신경 복원 (neurorestorat ion)에 관여하는 것이 알려졌다 (Kettenmann et al. , 2011). 이에， 노긴을 처리하였을 때 소교세포의 활성화를 변화시키는지 확인하기 위해 활성화된 소교세포의 마커인 Iba-1 단백질의 발현을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <1-2〉에서 제조한 MCA0 동물모델에， 상기 실시예 <3-1>과 동일한 조건으로 노긴 및 BMP7을 처리하였다. 또한, 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 Iba-l(l:500)(Wako Pure Chemical Industries, 일본) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.
그 결과 도 10에 나타낸 바와 같이， 대조군에 비해 인공뇌척수액을 주입한 비교군이 허혈성 피질 (1.39배 변화， p=0.01)및 피질 하부 (1.88배 변화， p=0.02) 모두에서 Iba-1 발현이 더 높게 나타났고, 노긴을 처리한 군은 허혈성 피질에서만 Iba-1 발현이 유의하게 증가하는 것 (비교군 대비 1.53 배 변화， P〈0.01)을 확인하였다 (도 10). <5"2> 면역형광염색을 이용한소교세포와 활성 증가 확인
노긴을 처리하였을 때 소교세포의 활성화를 변화시키는지 확인하기 위해 활성화된 소교세포의 마커인 Iba-1 단백질의 발현을 확인하였고， 혈관 주위 대식세포의 허혈성 뇌로 침투 여부를 확인하기 위해 대식세포의 면역반웅 마커인 CD169의 발현을 확인하였다.
구체적으로， 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 1차 항체로 Iba-l(l:500)(Wako Pure Chemical Industries) 또는 CD169(l:500)(Serotec)를 이용하여 면역형광염색법을 수행하였다. ,
정량을 위해， 등글고 세포체가 커진 강하게 염색된 Iba-1 또는 CD169 양성 세포는 각각의 마우스로부터 두 개의 연속된 뇌 절편에서 수량화하였고， 정량은 각각의 뇌 절편에서 동측 피질 및 피질 하부에서 3개의 다른 허혈성 근처 위치 (500 에서 수행하였다. 6개 영역의 세포 수의 평균은 각각의 마우스에서 계산하였다 (Shin et al., 2010).
그 결과 도 11A에 나타낸 바와 같이， 노긴을 처리하였을 때 허혈성 피질에서 등글고， 세포체가 커지고， 굵고 짧아진 과정의 Iba-1 양성 세포의 수가 증가하는 것 (비교군 대비 1.42배 변화， p=0.01)을 확인하였고， Iba-1양성 세포의 수뿐만 아니라 세포당 Iba-1 발현 레벨도 강하게 증가하는 것올 확인하였고 (도 11A), 그 결과 도 11B에 나타낸 바와 같이， 강하게 염색된 적은 수의 CD169 양성 세포는 허혈성 피질 하부에서만 관찰되었고, 비교군이나 노긴을 처리한 군에 따른 차이가 보이지 않는 것 (p=0.33)을 확인하였다 (도 11B). 상기 <실시예 5>의 결과를 토대로 노긴은 허혈성 피질에서 활성화된 소교세포의 수를 증가시키고， 이러한 결과는 Iba-1 양성 세포의 대다수가 거주하는 소교세포 (resident microgl ia)일지도 모름을 나타내며， 이는 최근 연구에서 보여주는 허혈성 뇌의 급성 단계에서 신경교증 (microgliosis)에 연관된 세포가 거주하는 소교세포의 증식으로부터 대부분 유도되는 것 (Li et al., 2013)임을 뒷받침해주며， 노긴으로 유도되는 뇌 복구 프로세스가 대식세포 침윤보다 활상화된 소교세포의 증가에 의한 것임을 확인하였다.
<실시예 6>노긴의 활성화된 소교세포 표현형 조절 효과 확인
활성화된 소교세포는 고전적 활성화 (classically activated, Ml) 또는 대체 활성화 (alternatively activated, M2)소교세포로분류된다 (Henkel et al. , 2009) . Ml 표현형은 조직 손상에 관여하는 반면， M2 표현형은 상처 및 조직 복구에 역할을 한다 (Shechter and Schwartz, 2013). 이에， 노긴에 의한 활성화된 소교세포의 증가를 이해하기 위해， 허혈성 피질에서 활성화된 소교세포 표현형의 마커를 확인하였다.
<6-1> 고전적 활성화 (classically activated, Ml) 소교세포 마커의 활성 조절 확인
활성화된 소교세포 Ml 표현형의 마커인 CD86, 전염증매개체인 IL-Ιβ , IL-12, CCL2 및 TNF-α의 활성을 피질에서 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 구체적으로， 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 MCA0 동물모델에， 상기 실시예 <3-1>과 동일한 조건으로 노긴 및 BMP7을 처리하였다. 또한， 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 IL-1P(1:100)(R&D Systems), IL-12( 1：250) (Santa Cruz Biotechnology), CCL2( 1:250) (Santa . Cruz Biotechnology , TNF- a (l:500)(Santa Cruz Biotechnology), CD86(1:500)(BD Bioscience, 미국) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.
그 결과 도 12 내지 도 13에 나타낸 바와 같이， 대조군에 비해 인공뇌척수액을 주입한 비교군에서 전염증매개체인 IL-1^(2.62 배 변화)， IL-12U.54배 변화)， CCL2(2.0배 변화)및 TNF- α (3.31배 변화) , 및 Ml표현형 마커인 CD86(4.23 배 변화) (모든 변화 p〈0.01)의 발현이 높게 나타나는 것을 확인하였고， 노긴을 처리한 군은 이러한 증가를 억제하는 것 (비교군 대비 IL-Ιβ는 0.69배 변화， p〈0.01; IL-12는 0.76배 변화， p=0.02; CCL2는 0.63배 변화， p=0.01; TNF-α는 0.62배 변화， p〈0.01; CD86은 0.58배 변화)을 확인하였다 (도 12 내지 도 13). <6-2> 대체 활성화 (alternatively activated, M2) 소교세포 마커의 활성 조절 확인
활성화돤 소교세포 M2 표현형의 마커인 ARGl , CD206 및 YM1 , 내생 IL-Ιβ의 길항제인 IL-lra, 염증성 사이토카인인 IL-10의 활성을 피질에서 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 MCA0 동물모델에， 상기 실시예 <3-1>과 동일한 조건으로 노긴 및 BMP7을 처리하였다. 또한， 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 IL-lra( 1 : 200) (R&D Systems) , IL-10( 1：250) (Abeam) , ARGKl : ;1000) (Santa Cruz Biotechnology) , CD206 ( 1： 500 ) ( Ser ot ec K i d 1 i ngt on , 영국)， YM1( 1 : 1000) (Stem Cel l Technologies , 캐나다) 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.
그 결과 도 14 내지 도 15에 나타낸 바와 같이， 대조군에 비해 인공뇌척수액올 주입한 비교군이 내생 IL-Ιβ의 길항제인 IL-lra(1.77 배 변화)， 및 M2 표현형의 마커인 ARGK2.54 배 변화)， CD206(2.48 배 변화) (모든 변화 p〈0.01)의 발현이 높게나타났으나， 염증성 사이토카인인 IL-10(p=0.11) 및 다른 M2 표현형의 마커인 ΥΜ1(ρ=0.79)의 발현은 변화가 없는 것을 확인하였고， 이와 반대로 노긴을 처리한 군은 비교군과 비교하여 IL-lra( 1.24 배 변화) , IL-10 1.63 배 변화)， ARGK2.17 배 변화) , CD206( 1.40 배 변화) 및 YMK2.72 배 변화) (모든 변화 p〈0.01) 모두 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다 (도 14 내지 도 15) .
<6-3>전염증매개체의 단백질 발현 변화 확인
전염증매개체인 IL-Ιβ 및 이의 길항제인 IL— Ira의 발현을 EL ISA( enzyme- 1 inked immunosorbent assay)로 확인하였다.
구체적으로， ELISA는 Quant ikine® EL ISA ki t (R&D Systems)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 진행하였다. 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 피질 조직을 준비하여 이로부터 50 (8 /zg/^)상층액을 얻고， IL-Ιβ 또는 IL-lra에 특이적인 단일클론항체가 코팅된 마이크로플레이트 (microplate)에 로딩 (loaded)하였다. 이를 세척한 후， 마우스 IL-Ιβ 또는 IL-lra에 특이적인 효소 결합된 다클론항체를 첨가한 뒤， 이를 세척한 후， 기질용액 (substrate solutions)을 첨가하였다. 효소 반웅의 강도는 분광기 (spectrometer)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 마우스 당 (n=3) 두 개의 웰 (wells)로부터 측정하여 평균치를 구하였다.
그 결과 도 16에 나타낸 바와 같이， 노긴을 처리한 군은 비교군과 비교하여 IL—Ιβ는 감소하였고 (0.65 배 변화)， IL-lra는 증가하는 것 (8.42 배 변화) (P〈0.01)을 확인하였다 (도 16).
<실시예 7 활성화돤소교세포 및 소교세포 표현형의 발현 확인
활성화된 소교세포 마커 (Iba-1)와 활성화된 소교세포 표현형의 마커 (M1-IL12, CD86; M2-IL-10, CD206)의 발현 양상을 확인하기 위하여 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 이중면역형광염색을 수행하였고， 이때， 1차 항체로 IL-12(1:250), CD86(1:500) 또는 IL-10(1:250), CD206(1:500)과 함께
Iba-l(l:500)을 사용하였고， 2차 항체로 Alexa F 1 uor ® 568 ( 1： 1000 ) (Mo 1 ecu 1 ar
Probes, 미국)을 사용하였다.
그 결과 도 17 내지 도 18에 나타낸 바와 같이， 상기 <실시예 6>의 결과와 동일하게 노긴을 처리한 군은 비교군과 비교하여 Ml 표현형 마커인 IL-12및 CD86은 감소하였고， M2표현형 마커인 IL-10및 CD206은 증가하는 것을 확인하였으며， 상기 마커들의 발현은 Iba-1과 같은 위치에서 나타나는 것을 확인하였다 (도 17 내지 도 18)· 상기 <실시예 6> 내지 <실시예 7>의 결과는 노긴 처리가 활성화된 소교세포의 Ml 표현형을 M2 표현형으로 변화를 유도하고, 노긴에 의한 소교세포의 대체 활성화 (M2)의 증가는 허혈성 뇌졸중을 회복하는 동안 뇌 조직 복구에 기여하는 것을 나타낸다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
노긴 (Noggin) 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 노긴은 서열번호 1의 염기서열로 기재된 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물. 【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 유전자 전달체는 백터 또는 재조합 바이러스인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
[청구항 4】
제 3항에 있어서, 상기 백터는 선형 DNA, 풀라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 백터인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【창구항 5】
제 4항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스， 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스 및 헤르페스 심플렉스 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물. [청구항 6Γ
제 1항에 있어서， 상기 세포는 조혈모세포 또는 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물. 【청구항 7】
제 1항에 있어서， 상기 허혈성 질환은 뇌경색 (cerebral infarct ion) , 뇌하혈 (cerebral i schemi a) , 뇌중풍 (cerebrovascular acc ident ) , 뇌졸중 (stroke)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 8】
노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 유효성분으로 함유하는 허혈성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
[청구항 9】
제 8항에 있어서, 상기 노긴은 서열번호 1의 염기서열로 기재된 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
[청구항 10】
제 8항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 뇌경색， 뇌허혈， 뇌중풍， 뇌졸증으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품ᅳ
【청구항 11】
노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 유효성분으로 함유하는 소교세포 활성 증진제.
[청구항 12】
제 11항에 있어서， 상기 노긴은 서열번호 1의 염기서열로 기재된 것을 특징으로 하는 소교세포 활성 증진제.
【청구항 13】 약학적으로 유효한 양의 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질을 허혈성 잘환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 허혈성 질환 치료 방법. [청구항 14]
허혈성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질의 용도.
[청구항 15】
허혈성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 노긴 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질의 용도. 【청구항 16】 '
소교세포 활성 증진제로 사용하기 위한 노간 유전자를 포함하는 유전자 전달체， 세포 또는 노긴 단백질의 용도.
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