WO2016107722A1 - Verfahren zum bestimmen von partikeln - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for determining particles in a liquid, in particular bacteria in water with the features specified in the preamble of claim 1.
  • Such methods for the optical detection of particles in a liquid belong to the prior art.
  • the optical detection of the liquid sample is preferably carried out in a quasi-stationary state, ie when the particles have calmed so far within the liquid that they either gravitationally dropped, floated or are in a stationary limbo, ie their position between the light source and sensor in Essentially not change.
  • This method is well suited for determining larger particles, such as suspended particles, very fine sand, or the like, as occasionally carried in the water.
  • E. coli bacteria Escherichia coli
  • the present invention is therefore based on the object of improving a generic method such that, in particular, small particles, of the order of magnitude of bacteria, can be reliably determined with the least possible technical effort. It should be the preferred application for the determination of bacteria in drinking water.
  • the method according to the invention is used for determining particles or at least for classification in liquid, in particular of bacteria in water, for example in the regular checking of the drinking water with respect to germs, and is carried out using an imaging optical device which has a Light source and an optical sensor with an array of photosensitive pixels. Between the light source and the sensor to be examined liquid sample is arranged.
  • identifiers of at least one particle imagewise detected by the optical device with characteristics of a label collection for determining or classifying the detected particle are used. de ⁇ .
  • the markers are compared to determine the detected particle, in particular to determine whether it is a bacterium or a non-bacterium or to further determine the bacterium.
  • the dark field technique in which a dark field illumination takes place, ie in which the liquid sample to be examined is not in the direct beam path between the light source and the sensor, as is customary in bright field technology, but the sensor only the light, namely scattered light, which is deflected by the particles in the liquid sample.
  • the image acquisition in the dark field technique is thus carried out according to the invention in the way, as is known for example from the dark field illumination in transmitted light microscopy.
  • the particles are produced in light color against a dark background on the sensor image.
  • the dynamics of image acquisition according to a development of the invention z. B. increased by the fact that at least one pixel of the sensor, but preferably a majority or all pixels have such subpixels and of these subpixels in each case at least one highly amplified and at least one further low amplified.
  • Low-intensified in the sense of the present invention can also be understood as a weakening, depending on which sensitivity range the sensor should have.
  • CCD sensors whose pixels z. B. have four subpixels
  • advantageously two of these subpixels are high-boosted (high gains) and the other two low-gain (attenuated).
  • the number of subpixels is basically freely selectable or sensor-dependent and is selected according to the process requirements.
  • the determination of at least one particle on the basis of, for example, two-dimensional black and white images in different planes of the liquid sample is advantageously carried out by digital image analysis.
  • Such evaluation methods basically belong to the prior art, but must be adapted accordingly for the present method.
  • the determination of the particle does not necessarily have to mean the concrete identification of the particle, it may also be a classification, such as determining whether the particle is a bacterium or a non-bacterium, whether it is live or dead bacterium is what type of bacteria it is or the like done.
  • a characteristic of a particle that is particularly easy to grasp is its areal extent, which according to the invention is determined and used in an image in which the particle is in focus. Not only is the size registration of the area a characteristic, but it may also form the shape of the surface or a combination of these features.
  • a pixel limit value is set in the image of the particle detected by the sensor, all pixels whose pixel value is greater than or equal to the set pixel value. to 1 and all pixels whose pixel value is smaller than the set pixel value are set to 0, after which the areal extent of the particle is detected.
  • the image is digitized into black and white pixels, in which case, for example, the white pixels, ie those whose pixel value is greater than or equal to the set pixel, represent the area of the particle in the image, so that the appropriate evaluation of this black and white image areal extent as well as the shape of the area can be determined.
  • its rotation about its own axis is determined as a characteristic of a particle.
  • This characteristic is particularly useful in the determination of bacteria. With this label, it is often already possible to distinguish bacteria from non-bacteria or dead bacteria, since the rotation of a particle about its own axis is a typical feature of living bacteria but also of some other particles.
  • the rotation itself can also be used as a further characteristic in the determination of the particle, in particular of a bacterium.
  • a characteristic of a particle can be obtained by evaluating a series of images of the particle in different planes which are chosen such that the particle is in focus in some images and in some images out of focus, ie before and behind wherein the number of pixel values representing the particle is detected imagewise and the distribution of the detected numbers over the number of images forms the characteristic.
  • This is a way of detecting whether the particle, such as a living bacterium, is moving, or how, for example, a speck of dust remains immobile in its position in the liquid.
  • the standard deviation of the detected numbers is set in relation to the average of the detected numbers, so as to form a characteristic.
  • the shape of a particle can be determined by its moments. This is part of the state of the art in image analysis methods. Moments of a distribution in image processing are certain weighted average values from the brightness values of the individual pixels of an image. They are chosen in such a way that they have a certain geometrical meaning, as is the state of the art in digital image analysis, to which reference is made to this extent.
  • the shape of a particle can be determined by its inverse moments.
  • an evaluation of a series of images of the particle take place in different planes, whereby the particle lies in focus in at least one image and in a number of images in front of and behind it.
  • the pixel values of the image are subjected to a Fourier transformation, after which the DC components, ie the non-frequency components of the signal, are removed or at least reduced, the noise component of the signals is eliminated and then a torque determination is made, as is known in the art counts.
  • a characteristic is obtained, which has proven in practice to be very meaningful.
  • the classification or determination of a particle detected by means of the optical device is typically carried out by comparing characteristics of this particle with characteristics of a number plate collection, on the basis of which a categorization, classification or, ideally, a specific determination of the particle can take place.
  • the determination is advantageously carried out with a nonlinear system, preferably by means of a neural network, as a result of which, as a rule, a result can also be achieved if the identifiers determined do not permit an immediate conclusion as to the nature of the particle.
  • the use of a neural network is particularly advantageous if what has been proven in practice not only evaluates images in focus but also images immediately preceding and behind them, since this can increase the security of the classification or determination , even if the characteristics thus determined have a certain blurring.
  • the determination of a particle can be carried out by comparing the registered license plates with license plate number plates using a linear system. Both methods have their and disadvantages, which should be weighed carefully in each case, in which way the evaluation takes place.
  • the inventive method should have the required accuracy to distinguish with high reliability at least between bacteria and non-bacteria.
  • the lens preceding the sensor which is required in order to generate an image on the pixel plane of the sensor, has a numerical aperture between 0.05 and 0.4.
  • such a numerical aperture has the advantage that lenses of simple quality can be used which are inexpensive, but on the other hand the number of images to be evaluated does not become too large, as would be the case with increasing aperture.
  • the method of the invention does not necessarily require a specific particle determination, but it is expedient to carry out a classification of the particles, specifically in batches. bacteria, nonbacteria and other particles. Such a classification is particularly useful in drinking water monitoring.
  • E. coli bacteria are an indication of faeces, ie a feces indicator.
  • a classification of the determined particles into bacteria and non-bacteria can first be carried out, whereafter a germ killing, for example by UV light, heat or the like, is deliberately brought about in the liquid sample. After a certain waiting time, for example half an hour, a particle determination of the same sample is then carried out again and it is determined, for example, via the determination of the rotation of the particles, how the ratio between living and dead bacteria sets after the germination. This can indirectly z. B. be concluded on the proportion of E. coli bacteria.
  • the inventive method is basically applied on the basis of a number plate collection. However, such a license plate collection does not have to be complete. This can optionally be generated or supplemented with commissioning of the device self-learning. Thus, for example, in the first few days after the start-up of the examination device, only water which is known to have a permissible particle load can first be examined. The characteristics obtained in these investigations on the particles detected in the water can be used to create a number of identifiers, which in turn are the basis for further investigations, which do not focus on determining the particles, but rather on the agreement or non-conformity of the particle structure the pre-determined, which forms the basis for the number plate collection. [24] Parts of the method according to the invention are explained in more detail below with reference to drawings, in which:
  • FIG. 3 shows the structure of an optical sensor of the optical device
  • FIG. 4 shows the evaluation of the sensor signal, including the subpixels, in each case in image and signal representation
  • FIG. 5 is a series of images showing the same particle in different planes.
  • FIG. 8 shows two curves which include and determine the areas represented by the particle representations according to FIGS. 7b and 7c, respectively,
  • FIG. 9 shows twenty-five images of a particle in successive levels in and out of focus,
  • FIG. 10 shows the formation of two frequency distribution curves on the basis of the images according to FIG. 9,
  • FIG. 11 shows the mean value curve formed from the curves according to FIG. 10 with deviations to form a characteristic
  • Fig. 13 is an amplitude-frequency diagram of a Fourier transform image without DC component.
  • FIGS. 1 and 2 show how the dark-field technique, as used in the optical device according to the invention according to FIG. 1, differs from the classical bright-field technique, as illustrated in FIG.
  • a light source 1 is shown, which illuminates a arranged in a window 2 liquid sample for clarity only with a particle 3 therein.
  • the liquid sample in the window 2 is arranged between the optical light source 1 and a CCD sensor 4, which is preceded by a focusing lens 5, which symbolizes an imaging optics here.
  • the light source 1 is aligned in FIG. 1, for example, by means of a diaphragm so that direct beams 6 illuminate the window 2 with the particle 3, but neither the lens 5 nor the underlying CCD sensor 4 strike directly.
  • the light source 1 is directed directly to the window 2 and the particles 3 in the liquid as well as the lens 5 and the sensor 4.
  • the particle 3 which shadows the direct light 6, as a black dot in the image 8, that is generated on the CCD sensor 4.
  • the image 9 arranged accordingly next to it, three particles are visible whose black edges stand out against a gray background.
  • a central light source 1 instead of a central light source 1 separate light sources may be provided, which show the window 2 obliquely similar to that shown in Fig. 1. However, it is essential that only scattered light from the particle 3 reaches the lens 5 and the sensor 4 located behind it and no direct radiation from the light source to the sensor.
  • FIG. 3 shows the structure of a CCD sensor 4, as it is today in the market.
  • Each pixel 10 of the sensor 4 consists of four subpixels 1 1, namely a blue subpixel II a, a red subpixel II b and two green subpixels 1 1 c and 1 1 d.
  • the colors serve to give each pixel 10 besides the brightness information also the color information needed to produce a color image.
  • the CCD sensor 4 shown in FIG. 3 is a Bayer sensor with a Bayer matrix. Instead of evaluating the subpixels as usual in order to obtain the color information, they are here used, on the one hand, to increase the resolution, as the corresponding left upper image of FIG. 4 shows. In addition, the subpixels 1 1 and their signals are processed differently. Thus, the subpixels IIa and IIb are low-gained, whereas the subpixels 11c and 1d are high-gain. This results in a higher dynamic range, which can also be seen with reference to FIG. 4 in the lower left image.
  • the upper left image which is generated according to the method described above, shows the image generated by the method described above, not only a higher resolution but also a higher dynamic, as illustrated in particular by the gray values recognizable there.
  • the resolution is increased by a factor of four, the dynamics also significant.
  • the increased resolution is achieved by the use of the subpixel 1 1 as a pixel, the higher dynamics in that the subpixels 1 1 are respectively low amplified in pairs.
  • the image shown on the right in FIG. 4 is formed, which has a higher resolution and a higher dynamic range than an image created by conventional reading of the CCD sensor. Even if it is to be taken into account that the gray values visible there have a different quality than if these were carried out with conventional evaluation of the CCD sensor signal.
  • License plate collections can be created individually, for example for drinking water, for process water, for waste water, for water from sewage treatment plants or for other liquids with particles contained therein.
  • the license plate collection must be tailored to the requirements of the user. For example, for drinking water analysis, it can be clearly recognized whether bacteria or nonbacteria are involved, in addition to which bacteria. For example, the goal may be to determine E. coli bacteria to monitor water quality.
  • such number plates may be self-learning in situ if, in a number of preliminary studies, particles are identified which have been found to be acceptable and acceptable in both their form and number. Then deviations from the previously recorded quality can be ascertained with such automatically generated license plate collection. It is understood that a collection of markings, for example, for the monitoring of drinking water and location-dependent, ie, at different locations, may be different, since the types of bacteria that can pollute the water, vary depending on location and climate. The more characteristics of a captured particle match a label in the label collection, the more accurate the determination. There may be a few that are used for comparison. be moved or a few hundred or even more.
  • the evaluation is expediently carried out via a neural network, but can also take place by means of a linear system of equations.
  • a comparison of at least three characteristics, advantageously at least four characteristics is sufficient to determine this with sufficient reliability.
  • the number of license plates can be significantly higher.
  • An essential feature of a particle is always its surface in focus, where the size of the surface is a characteristic, the shape of the surface another characteristic.
  • a delimitation of the particle in the image is to be defined. This is typically done by defining a threshold value, that is, a gray level of the image that corresponds to a particular pixel value. Mitfels this limit, a pure black and white image is generated, ie all pixels whose pixel throwers are equal to or smaller than this limit, are black, all others are displayed white.
  • FIGS. 7a, 7b and 7c show how a change in this limit value affects the image. In the pictures according to FIG.
  • the method according to the invention now provides to vary the limit value and to determine whether, in particular, the shape of the particle changes significantly at different limit values, in order then to use the limit value which takes account of this pronounced shape.
  • the area of the particle in the image is determined by a hyperbola curve, which is laid over the white surface in sections, which defines the surface, as shown in FIG. 8 is shown. By integrating this curve, the enclosed area, ie the two-dimensional size of the particle can be determined. The corresponding curve is marked with 15. For comparison, a curve 16 is recorded in FIG. 8, which results when the image according to FIG. 7b is used. It becomes clear that it is precisely the variance of the limit value that leads to creating a characteristic characteristic with regard to the shape.
  • This characteristic is therefore an important indicator for determining whether it is a bacterial rium or another particle.
  • a stack of images as shown for example in FIG. 9, is first used for the evaluation.
  • the present 25 pictures showing the particles to be determined here inside and outside the focus are evaluated as follows:
  • a focus curve is first created.
  • the brightness of the four to seven brightest pixels determined in each image ie. H. the pixels having the highest pixel value are listed, each forming the average of these four to seven pixels, so that the curve 16 shown in FIG. 10 results, which has clearly visible peaks.
  • This curve 16 is filtered and thus smoothed.
  • This 15 smoothed curve is designated 1 7 in FIG.
  • the mean value and the standard deviation are determined. This standard deviation is a characteristic of the detected particle.
  • a characteristic for determining or classifying 25 particles is the torque formation, which is one of the state of the art in image processing, in particular evaluation and classification. This is done regularly on the basis of black and white images, preferably after their digitization in black and white values, as has already been described in the introduction.
  • a further characteristic is the moment of inertia (also called inverse moment) of a particle, thus also a characteristic which covers the spatial extent of the particle.
  • the starting point for this characteristic is, for example, seven images, one of which is arranged in focus and three on each side of the focus, as in FIG.
  • FIG. 13 shows such a curve of an image, wherein the horizontal axis represents the frequency and the vertical axis represents the amplitude.
  • the DC component is already removed in the diagram shown in FIG. 13, the noise components 19 are still present there.
  • the maximum and minimum values of this central moment each form a characteristic of the particle under investigation. The characteristics described above are generally sufficient to determine if the particle being tested is a bacterium or a non-bacterium.
  • a further variance of characteristics can be achieved by evaluating the series of images in different planes from the same liquid sample with illumination from different illumination angles and / or with illumination with light of different wavelengths.
  • the above-described characteristics are particularly useful for discriminating bacteria from non-bacteria, and as a rule, three or four of these characteristics are generally enough to provide this classification with sufficiently high safety.
  • such a classification is particularly important in the drinking water investigation of great importance, since after the classification then the determination can be carried out in detail or a sub-classification, typically the bacteria and not the other particles.

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Abstract

Das Verfahren dient zum Bestimmen von Partikeln (3), insbesondere Bakterien in Flüssigkeit, und arbeitet unter Verwendung einer bildgebenden optischen Vorrichtung mit einer Lichtquelle (1), mit einem optisehen Sensor (4) mit einem Feld von lichtempfindlichen Pixeln und mit einer zwischen Lichtquelle (1) und Sensor (4) angeordneten zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe. Es werden Kennzeichen von mindestens einem bildmäßig erfassten Partikel (3) mit Kennzeichen einer Kennzeichensammlung zur Bestimmung des erfassten Partikels (3) verglichen, wobei die Bilderfassung in Dunkelfeldtechnik erfolgt und ein lichtempfindliches Pixel mehrere Subpixel aufweist, die zur Bilderfassung genutzt werden.

Description

Titel: Verfahren zum Bestimmen von Partikeln
Beschreibung
[01 ] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen von Partikeln in einer Flüssigkeit, insbesondere von Bakterien in Wasser mit den im Oberbegriff des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
[02] Derartige Verfahren zum optischen Erfassen von Partikeln in einer Flüssigkeit, insbesondere zum Bestimmen oder zumindest zum Klassifizieren von Partikeln, zählen zum Stand der Technik. Es wird in diesem Zusammenhang auf EP 2 469 264 AI , WO 201 0/063293 AI und WO 201 4/094790 AI verwiesen. Dort sind Verfahren beschrieben, bei denen die Erfassung von Partikeln in Flüssigkeit mittels einer optischen Vorrichtung erfolgt, welche eine Lichtquelle und einen optischen Sensor mit einem Feld von lichtempfindlichen Pixeln aufweist, wobei zwischen der Lichtquelle und dem Sensor eine zu untersuchende Flüssigkeitsprobe angeordnet ist und bei welchen zum Bestimmen von Partikeln Kennzeichen von mindestens einem bildmäßig erfassten Partikel mit Kenn- zeichen einer Kennzeichensammlung zur Bestimmung oder zumindest zur Klassifizierung des erfassten Partikels verwendet, insbesondere verglichen werden. Die optische Erfassung der Flüssigkeitsprobe erfolgt dabei vorzugsweise in quasi stationärem Zustand, also dann, wenn sich die Partikel innerhalb der Flüssigkeit soweit beruhigt haben, dass sie entweder gravitationsbedingt abgesunken, aufgeschwommen oder in einem stationären Schwebezustand befindlich sind, also ihre Position zwischen Lichtquelle und Sensor im Wesentlichen nicht ändern. Dieses Verfahren ist zum Bestimmen von größeren Partikeln, beispielsweise Schwebeteilchen, feinstem Sand oder dergleichen, wie sie gelegentlich im Wasser mitgeführt werden, gut geeignet. Insbesondere jedoch für die Untersuchung von Trinkwasser, bei welchem es um die Bestimmung von Art und Anzahl von Bakterien, beispielsweise E.coli-Bakterien (E- scherichia coli) ankommt, stößt dieses Verfahren an seine Grenzen, da diese kleinen Partikel oft schwer oder gar nicht im Bild auszumachen sind.
[03] Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein gattungsgemäßes Verfahren dahingehend zu verbessern, dass insbesondere kleine Partikel, in der Größenordnung von Bakterien mit technisch möglichst geringem Aufwand zuverlässig bestimmt werden können. Dabei soll die bevorzugte Anwendung zur Bestimmung von Bakterien im Trinkwasser sein.
[04] Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch ein Verfahren mit den in Anspruch 1 aufgeführten Merkmalen gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen, der nach- folgenden Beschreibung und der Zeichnung angegeben. Hierbei können die in den Unteransprüchen und der Beschreibung angegebenen Merkmale jeweils für sich aber auch in geeigneter Kombination die erfindungsgemäße Lösung gemäß Anspruch 1 weiter ausgestalten.
[05] Das erfindungsgemäße Verfahren dient zum Bestimmen von Par- tikeln oder zumindest zum Klassifizieren in Flüssigkeit, insbesondere von Bakterien in Wasser, beispielsweise bei der regelmäßigen Überprüfung des Trinkwassers im Hinblick auf Keime, und wird unter Verwendung einer bildgebenden optischen Vorrichtung durchgeführt, die eine Lichtquelle aufweist und einen optischen Sensor mit einem Feld von licht- empfindlichen Pixeln. Zwischen Lichtquelle und Sensor ist die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe angeordnet. Bei dem Verfahren werden Kennzeichen von mindestens einem bildmäßig mit der optischen Vorrichtung erfassten Partikel mit Kennzeichen einer Kennzeichensammlung zur Bestimmung oder Klassifizierung des erfassten Partikels verwen- de†. Die Kennzeichen werden insbesondere verglichen, um den erfass- †en Partikel zu bestimmen, insbesondere um zu bestimmen, ob es sich hierbei um ein Bakterium oder um ein Nichtbakterium handelt bzw. im weiteren das Bakterium zu bestimmen. Um insbesondere diese kleinen Partikel mit technisch einfachen Mitteln mit ausreichender Genauigkeit zu erfassen, ist gemäß der Erfindung vorgesehen, dass die Bilderfassung zum einen in Dunkelfeldtechnik, d. h. unter Dunkelfeldbeleuchtung, erfolgt und zum anderen lichtempfindliche Pixel des Sensors mehrere Subpixel aufweisen, die zur Bilderfassung genutzt werden. Es versteht sich, dass vorteilhaft alle oder zumindest ein Großteil der lichtempfindlichen Pixel Subpixel aufweist, die zur Bilderfassung genutzt werden, um einerseits eine hohe Auflösung und andererseits eine hohe Dynamik zu gewährleisten. Dies ist insbesondere mit der Dunkelfeldtechnik von Vorteil, bei welcher eine Dunkelfeldbeleuchtung erfolgt, d. h. bei der die zu untersuchende Flüssigkeitsprobe nicht im direkten Strahlengang zwischen Lichtquelle und Sensor liegt, wie dies bei der Hellfeldtechnik üblich ist, sondern vom Sensor nur das Licht, nämlich Streulicht, empfangen wird, welches von den Partikeln in der Flüssigkeitsprobe abgelenkt wird. Die Bilderfassung in der Dunkelfeldtechnik erfolgt also gemäß der Erfindung in der Weise, wie dies beispielsweise von der Dunkelfeldbeleuchtung in der Durchlichtmikroskopie bekannt ist. Hierbei entstehen auf dem Sensorbild die Partikel in heller Farbe vor dunklem Hintergrund. Dies ist insbesondere bei den hier zu bestimmenden sehr kleinen Partikeln von Vorteil, da das aus der Hellfeldtechnik bekannte Überstrahlen wesentlich weniger auftritt und im Übrigen der Sensor auch nicht von direktem Licht der Lichtquelle beaufschlagt ist, weshalb insbesondere in Verbindung mit Nutzung der Subpixel eine wesentlich bessere Erfassung von kleinen Partikeln, wie beispielsweise Bakterien, möglich ist, ohne dass die technischen Voraussetzungen, wie beispielsweise die Auflö- sung des Sensors, die Qualität der verwendeten optischen Bauteile und dergleichen signifikant erhöht werden müssen. [06] Dabei ist es gemäß einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders vorteilhaft, wenn die Bilderfassung anhand von zweidimensionalen Schwarzweißbildern in unterschiedlichen Ebenen der Flüssigkeitsprobe erfolgt. Da es auf die Farbinformation nicht an- kommt, können vielmehr die Subpixel des Sensors, die hierfür sonst zur Verfügung stehen, dafür genutzt werden, die Auflösung des Sensors zu erhöhen bzw. dessen Dynamik zu erhöhen, wie dies gemäß einer Weiterbildung der Erfindung vorteilhaft vorgesehen sein kann.
[07] So wird die Dynamik der Bilderfassung gemäß einer Weiterbil- dung der Erfindung z. B. dadurch erhöht, dass mindestens ein Pixel des Sensors, vorzugsweise jedoch ein Großteil oder alle Pixel solche Subpixel aufweisen und von diesen Subpixeln jeweils mindestens eines hochverstärkt und mindestens ein weiteres niedrigverstärkt werden. Unter niedrigverstärkt im Sinne der vorliegenden Erfindung kann auch eine Ab- Schwächung verstanden werden, je nachdem welchen Empfindlichkeitsbereich der Sensor aufweisen soll. Bei den heutzutage vielfach verwendeten CCD-Sensoren, deren Pixel z. B. vier Subpixel aufweisen, werden gemäß der vorliegenden Erfindung vorteilhaft zwei dieser Subpixel hochverstärkt (high gained) und die zwei anderen niedrigverstärkt (low gained) bzw. abgeschwächt. Die Zahl der Subpixel ist jedoch grundsätzlich frei wählbar bzw. sensorabhängig und wird den Verfahrensanforderungen entsprechend ausgewählt.
[08] Die Bestimmung mindestens eines Partikels anhand von beispielsweise zweidimensionalen Schwarzweißbildern in unterschiedlichen Ebenen der Flüssigkeitsprobe erfolgt vorteilhaft durch digitale Bildauswertung. Derartige Auswertverfahren zählen grundsätzlich zum Stand der Technik, müssen jedoch für das vorliegende Verfahren entsprechend angepasst werden. Dabei ist es vorteilhaft, wenn mindestens drei, vorzugsweise mindestens vier unterschiedliche Kennzeichen zur Bestimmung oder Klassifizierung eines Partikels verwendet werden. Da- bei muss die Bestimmung des Partikels im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht notwendigerweise die konkrete Identifizierung des Partikels bedeuten, es kann auch eine Klassifizierung, wie beispielsweise die Feststellung, ob es sich bei dem Partikel um ein Bakterium oder um ein Nichtbakterium handelt, ob es sich um lebendes oder totes Bakterium handelt, um welche Art von Bakterium es sich handelt oder dergleichen, erfolgen.
[09] Ein besonders gut zu erfassendes Kennzeichen eines Partikels ist seine flächenmäßige Erstreckung, die gemäß der Erfindung in einem Bild ermittelt und weiter verwendet wird, in welchem das Partikel im Fokus ist. Dabei gibt nicht nur die größenmäßige Erfassung der Fläche ein Kennzeichen, sondern es kann auch die Form der Fläche ein Kennzeichen bilden oder eine Kombination dieser Merkmale.
[10] Zur Erfassung der flächenmäßigen Erstreckung eines Partikels ist gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, dass in dem mittels des Sensors erfassten Bild des Partikels ein Pixelgrenzwert festgesetzt wird, wobei alle Pixel, deren Pixelwert größer oder gleich dem festgesetzten Pixel wert ist, zu 1 und alle Pixel, deren Pixelwert kleiner als der festgesetzte Pixel wert ist, zu 0 ge- setzt werden, wonach die flächenmäßige Erstreckung des Partikels er- fasst wird. Es erfolgt also eine Digitalisierung des Bildes in schwarze und weiße Pixel, wobei dann beispielsweise die weißen Pixel, also die, deren Pixelwert größer oder gleich dem festgesetzten Pixel grenzwert ist, die Fläche des Partikels im Bild repräsentieren, sodass durch geeignete Auswertung dieses Schwarzweißbildes sowohl die flächenmäßige Erstreckung als auch die Form der Fläche ermittelt werden kann.
[1 1 ] Dabei hat sich in der praktischen Erprobung des Verfahrens herausgestellt, dass es vorteilhaft ist, hier nicht einen absoluten Pixelgrenzwert festzusetzen, sondern die flächenmäßige Erstreckung des Partikels vorteilhaft unter Zugrundelegung mehrere unterschiedlicher festgesetzter Pixel grenzwerte zu bestimmen. Nur hierdurch ist es bei einigen Partikeln möglich, deren Form zu bestimmen und eine ausreichende Differenzierung von anderen Partikeln herbeizuführen. Es ist von besonderem Vorteil wenn sich die Pixelgrenzwerte automatisch, d. h. selbstanpassend einstellen.
[12] Vorteilhaft wird als ein Kennzeichen eines Partikels dessen Rotation um seine eigene Achse bestimmt. Dieses Kennzeichen ist insbesondere bei der Bestimmung von Bakterien zweckmäßig. Mit diesem Kenn- zeichen ist es häufig schon möglich, Bakterien von Nichtbakterien bzw. toten Bakterien zu unterscheiden, da die Rotation eines Partikels um die eigene Achse ein typisches Merkmal von lebenden Bakterien allerdings auch von einigen anderen Partikeln ist. Im Weiteren kann die Rotation selbst auch als weiteres Kennzeichen bei der Bestimmung des Partikels, insbesondere eines Bakteriums herangezogen werden.
[13] Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann ein Kennzeichen eines Partikels durch Auswertung einer Reihe von Bildern des Partikels in unterschiedlichen Ebenen erfolgen, die so gewählt sind, dass das Partikel in einigen Bildern im Fokus und in einigen Bildern außerhalb des Fokus, also davor und dahinter liegt, wobei die Anzahl der das Partikel repräsentierenden Pixelwerte bildweise erfasst und die Verteilung der erfassten Anzahlen über die Zahl der Bilder das Kennzeichen bildet. Dies ist eine Art zu erfassen, ob sich das Partikel, wie beispielsweise ein lebendes Bakterium bewegt oder wie beispielsweise ein Staubkorn un- verändert in seiner Position in der Flüssigkeit verharrt. Dabei wird vorteilhaft nicht nur die Verteilung der erfassten Anzahlen über die Zahl der Bilder erfasst, sondern gemäß einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Standardabweichung der erfassten Anzahlen zu dem Mittelwert der erfassten Anzahlen ins Verhältnis gesetzt, um so ein Kennzeichen zu bilden. [14] Wie eingangs erläutert, wird vorteilhaft nicht nur die flächenmäßige Erstreckung eines Partikels im Fokus erfasst, sondern darüber hinaus auch seine Form, um ein Kennzeichen zu bilden. Die Form eines Partikels kann durch seine Momente bestimmt werden. Dies zählt bei Bildauswer- tungsverfahren zum Stand der Technik. Momente einer Verteilung sind in der Bildverarbeitung bestimmte gewichtete Mittelwerte aus den Helligkeitswerten der einzelnen Pixel eines Bildes. Sie werden so gewählt, dass sie eine gewisse geometrische Aussage besitzen, wie dies an sich bei der digitalen Bildauswertung zum Stand der Technik zählt, auf die insoweit verwiesen wird.
[15] Alternativ oder zusätzlich kann die Form eines Partikels durch seine inversen Momente bestimmt werden. Gemäß einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann zur Erfassung der inversen Momente eines Partikels eine Auswertung einer Reihe von Bildern des Partikels in unterschiedlichen Ebenen erfolgen, wobei das Partikel in mindestens einem Bild im Fokus liegt und in einer Anzahl von Bildern davor und dahinter. Dabei werden die Pixelwerte des Bildes einer Fouriertransformation unterzogen, wonach die DC-Anteile, also die nichtfre- quenten Anteile des Signals, entfernt oder zumindest verringert, der Rauschanteil der Signale eliminiert und dann eine Momentenbestimmung gemacht wird, wie sie an sich zum Stand der Technik zählt. Hierdurch wird ein Kennzeichen gewonnen, das sich in der Praxis als sehr aussagekräftig erwiesen hat.
[1 6] Um insbesondere bei der Untersuchung über einen längeren Zeit- räum, wie dies bei der Überwachung des Trinkwassers z. B. der Fall ist, sicherzustellen, dass vergleichbare Ergebnisse auch über einen langen Zeitraum erzielt werden, ist gemäß einer Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, die Beleuchtungsstärke der Lichtquelle konstant zu halten und hierfür eine Regelung vorzusehen, welche die Ist- Beleuchtungsstärke erfasst, mit einer Soll-Beleuchtungsstärke vergleicht und gegebenenfalls die Lichtquelle entsprechend ansteuert. Dies ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren von besonderer Bedeutung, da der Bildsensor aufgrund der Dunkelfeldbeleuchtung nie direktes Licht von der Lichtquelle erfasst und somit beispielsweise eine Verringerung der Hintergrundhelligkeit nicht notwendigerweise auf eine abfallende Beleuchtungsstärke der Lichtquelle zurückzuführen ist, sondern auch durch Anwachsen von Ablagerungen im Fenster für die Flüssigkeitsprobe liegen kann. Es ist also vorteilhaft ein gesonderter Sensor vorgesehen, mit welchem die Ist-Beleuchtungsstärke der Lichtquelle erfasst werden kann, sodass mittels der Regelung bei nachlassender Lichtstärke dies durch beispielsweise Ansteuerung mit einer höheren Spannung ausgeglichen werden kann.
[1 7] Die Klassifizierung oder Bestimmung eines mittels der optischen Vorrichtung erfassten Partikels erfolgt typischerweise durch Vergleich von Kennzeichen dieses Partikels mit Kennzeichen einer Kennzeichensammlung, anhand der dann eine Kategorisierung, Klassifizierung oder im Idealfall eine konkrete Bestimmung des Partikels erfolgen kann. Die Bestimmung erfolgt vorteilhaft mit einem nichtlinearen System, vorzugsweise mittels eines neuronalen Netzwerkes, hierdurch kann in der Regel auch ein Ergebnis erzielt werden, wenn die ermittelten Kennzeichen keinen unmittelbaren Rückschluss auf die Art des Partikels zulassen. Die Verwendung eines neuronalen Netzwerkes ist insbesondere dann von Vorteil, wenn, was sich in der Praxis bewährt hat, nicht nur Bilder im Fokus sondern auch unmittelbar davor- und dahinterliegende Bilder aus- gewertet werden, da damit die Sicherheit der Klassifizierung oder Bestimmung erhöht werden kann, auch wenn die damit ermittelten Kennzeichen eine gewisse Unschärfe aufweisen.
[18] Alternativ kann die Bestimmung eines Partikels durch Vergleich von erfassten Kennzeichen mit Kennzeichen der Kennzeichensammlung mittels eines linearen Systems erfolgen. Beide Verfahren haben ihre Vor- und Nachteile, wobei im Einzelfall sorgfältig abgewogen werden sollte, in welcher Weise die Auswertung erfolgt.
[19] Um das erfindungsgemäße Verfahren kostengünstig durchführen zu können, ist es einerseits erforderlich, den vorrichtungsmäßigen Auf- wand einfach zu halten, andererseits den Rechenaufwand möglichst klein zu halten. Allerdings soll das erfindungsgemäße Verfahren die erforderliche Genauigkeit aufweisen, um mit hoher Zuverlässigkeit zumindest zwischen Bakterien und Nichtbakterien unterscheiden zu können. Hierzu ist gemäß einer Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, dass die dem Sensor vorgeschaltete Linse, die erforderlich ist, um auf der Pixelebene des Sensors ein Bild zu erzeugen, eine numerische Apertur zwischen 0,05 und 0,4 aufweist. Eine solche numerische Apertur hat einerseits den Vorteil, dass Linsen einfacher Qualität verwendet werden können, die kostengünstig sind, andererseits die Anzahl der auszuwer- tenden Bilder nicht zu groß wird, wie dies bei zunehmender Apertur der Fall wäre.
[20] Um weitere Differenzierungsmöglichkeiten bei der Erfassung der Partikel zu geben, ist gemäß der Erfindung vorgesehen, dass Bilder von derselben Flüssigkeitsprobe unter Beleuchtung mit unterschiedlichem Beleuchtungswinkel ausgewertet werden. Hierdurch können die beispielsweise vorbeschriebenen Kennzeichen weiter differenziert werden. Auch kann gegebenenfalls zusätzlich oder alternativ bei der Erstellung dieser Bilder mit Beleuchtung mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge gearbeitet werden. Dies stellt eine weitere Differenzierungsmöglichkeit von Kennzeichen dar, die insbesondere für kleine Partikel in Größe von Bakterien von Vorteil sein können.
[21 ] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren muss nicht notwendigerweise eine konkrete Partikelbestimmung erfolgen, es erfolgt jedoch zweckmäßigerweise eine Klassifikation der Partikel, und zwar in Bakte- rien, Nichtbakterien und andere Partikel. Eine solche Klassifikation ist insbesondere bei der Trinkwasserüberwachung zweckmäßig.
[22] Dabei kann es insbesondere bei der Trinkwasserüberwachung erforderlich sein, nicht nur die Anzahl der Bakterien im Wasser zu erfas- sen, sondern auch die Art. So sind beispielsweise E.coli-Bakterien ein Indiz für Fäkalien, also ein Fäkalienindikator. Zu deren Erfassung kann beispielsweise im erfindungsgemäßen Verfahren zunächst einmal eine Klassifikation der ermittelten Partikel in Bakterien und Nichtbakterien erfolgen, wonach in der Flüssigkeitsprobe gezielt eine Keimtötung, bei- spielsweise durch UV-Licht, Wärme oder dergleichen, herbeigeführt wird. Es wird dann nach einer gewissen Wartezeit, beispielsweise einer halben Stunde nochmals eine Partikelbestimmung derselben Probe durchgeführt und dabei beispielsweise über die Bestimmung der Rotation der Partikel ermittelt, wie sich das Verhältnis zwischen lebenden und toten Bakterien nach der Keimtötung einstellt. Hierdurch kann indirekt z. B. auf den Anteil der E.coli-Bakterien geschlossen werden.
[23] Das erfindungsgemäße Verfahren wird grundsätzlich unter Zugrundelegung einer Kennzeichensammlung angewendet. Eine solche Kennzeichensammlung muss jedoch nicht vollständig vorhanden sein. Diese kann gegebenenfalls mit Inbetriebnahme der Vorrichtung selbstlernend erzeugt oder ergänzt werden. So kann beispielsweise in den ersten Tagen nach Inbetriebnahme der Untersuchungsvorrichtung zunächst nur Wasser untersucht werden, von dem bekannt ist, dass es eine zulässige Partikelbelastung aufweist. Mit den bei diesen Untersu- chungen gewonnen Kennzeichen über die im Wasser erfassten Partikel kann eine Kennzeichensammlung angelegt werden, die wiederum Grundlage für weitere Untersuchungen ist, bei denen allerdings dann nicht die Bestimmung der Partikel im Vordergrund stehen, sondern die Übereinstimmung oder Nichtübereinstimmung der Partikelstruktur mit der vorermittelten, welche Basis für die Kennzeichensammlung bildet. [24] Teile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind nachfolgend anhand von zeichnerischen Darstellungen näher erläutert, es zeigen:
Fig. 1 in stark vereinfachter schematischer Darstellung eine optische Vorrichtung zur Untersuchung einer Flüssig- keitsprobe in Dunkelfeldtechnik,
Fig. 2 eine optische Vorrichtung nach dem Stand der Technik in Hellfeldtechnik,
Fig. 3 den Aufbau eines optischen Sensors der optischen Vorrichtung, Fig. 4 die Auswertung des Sensorsignals unter Einbeziehung der Subpixel jeweils in Bild- und Signaldarstellung,
Fig. 5 eine Reihe von Bildern, welche dasselbe Partikel in unterschiedlichen Ebenen zeigt,
Fig. 6 elf aufeinanderfolgende Bilder desselben Partikels in unterschiedlichen Ebenen, drei digitalisierte Partikeldarstellungen desselben Partikels unter Anwendung unterschiedlicher Grenzwerte jeweils mit einer Grauwertdarstellung zum Vergleich,
Hg. 8 zwei Kurven, welche die durch die Partikeldarstellungen gemäß Fig. 7b bzw. 7c dargestellten Flächen einschließen und bestimmen, Fig. 9 fünfundzwanzig Bilder eines Partikels in aufeinanderfolgenden Ebenen in- und außerhalb des Fokus,
Fig. 10 die Bildung zweier Häufigkeitsverteilungskurven aufgrund der Bilder gemäß Fig. 9, Fig. 1 1 die aus den Kurven gemäß Fig. 10 gebildete Mittelwertkurve mit Abweichungen zur Bildung eines Kennzeichens,
Fig. 12 drei Bilder im Zusammenhang mit der Auswertung des
Trägheitsmoments als Kennzeichen und Fig. 13 ein Amplituden-Frequenz-Diagramm eines fouriertransformierten Bildes ohne DC-Anteil.
[25] Anhand der Figuren 1 und 2 ist dargestellt, wie sich die Dunkelfeldtechnik, wie sie bei der optischen Vorrichtung nach der Erfindung gemäß Fig. 1 angewendet wird, von der klassischen Hellfeldtechnik, wie sie in Fig. 2 dargestellt ist, unterscheidet. In beiden Figuren ist eine Lichtquelle 1 dargestellt, welche eine in einem Fenster 2 angeordnete Flüssigkeitsprobe zur Verdeutlichung nur mit einem darin befindlichen Partikel 3 anstrahlt. Die im Fenster 2 befindliche Flüssigkeitsprobe ist zwischen der optischen Lichtquelle 1 und einem CCD-Sensor 4 angeordnet, dem eine fokussierende Linse 5 vorgeschaltet ist, die hier eine bildgebende Optik symbolisiert. Die Lichtquelle 1 ist in Fig. 1 beispielsweise mittels einer Blende so ausgerichtet, dass direkte Strahlen 6 das Fenster 2 mit dem Partikel 3 beleuchten, jedoch weder die Linse 5 noch den dahin- terliegenden CCD-Sensor 4 direkt treffen. Vom Partikel 3 gelangt ledig- lieh Streulicht 7 zur fokussierenden Linse 5 zu dem dahinterliegenden CCD-Sensor 4. Hieraus ergibt sich ein Bild 8, bei dem das Partikel 3 weiß vor schwarzem Hintergrund dargestellt ist. Das daneben dargestellte Bild 9 verdeutlicht, wie ein Bild von zwei Partikeln bei dieser Beleuchtung praktisch aussehen kann.
[26] Im Vergleich dazu ist in Fig. 2 die Lichtquelle 1 direkt auf das Fenster 2 und den in der Flüssigkeit befindlichen Partikel 3 sowie die Linse 5 und den Sensor 4 gerichtet. Mittels der Linse 5 wird das Partikel 3, welches das direkte Licht 6 abschattet, als schwarzer Punkt im Bild 8, also auf dem CCD-Sensor 4 erzeugt. In dem entsprechend daneben angeordneten Bild 9 sind drei Partikel zu sehen, deren schwarze Ränder sich vor grauem Hintergrund abheben.
[27] Mit der Dunkelfeldbeleuchtung, wie sie in Fig. 1 beispielhaft dargestellt ist, können insbesondere kleine Partikel wesentlich besser im 2D- Bild 8, 9 dargestellt werden als dies bei der Hellfeldbeleuchtung, wie sie anhand von Fig. 2 dargestellt ist, möglich ist. Dort wird der Rand des Partikels 3 im Bild 8 stark überstrahlt. Da die direkten Strahlen 6 auf den CCD-Sensor 4 auftreten, ist der Kontrast zwischen dem dargestellten Partikel und dem Hintergrund extrem hoch und die Auflösung innerhalb des abgebildeten Partikels somit schlecht. Bei dem Bild 9 der Fig. 1 ist deutlich erkennbar, welche nuancierten Abstufungen vor dem schwar- zen Hintergrund schon mit bloßem Auge sichtbar sind. Die Dunkelfeldbeleuchtung, wie sie in Fig. 1 dargestellt ist, ist nur beispielhaft zu verstehen. So können beispielsweise statt einer zentralen Lichtquelle 1 gesonderte Lichtquellen vorgesehen sein, welche das Fenster 2 ähnlich wie in Fig. 1 dargestellt schräg durchscheinen. Wesentlich ist jedoch, dass vom Partikel 3 nur Streulicht zur Linse 5 und dem dahinterliegenden Sensor 4 gelangt und keine direkte Strahlung von der Lichtquelle zum Sensor.
[28] Fig. 3 zeigt die Struktur eines CCD-Sensors 4, wie er heute marktüblich ist. Jeder Pixel 10 des Sensors 4 besteht aus vier Subpixeln 1 1 , und zwar aus einem blauen Subpixel I I a, einem roten Subpixel I I b und zwei grünen Subpixeln 1 1 c und 1 1 d. Die Farben dienen dazu, um jedem Pixel 10 neben der Helligkeitsinformation auch die Farbinformation zu geben, die benötigt wird, um ein Farbbild zu erzeugen.
[29] Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden 2D-Bilder in schwarzweiß, d. h. mit Grauwerten erzeugt, die Farbinformation wird nicht benötigt. Die Subpixel 1 1 werden daher zum Erhöhen von Auflösung und Dynamik eingesetzt.
[30] Es handelt sich bei dem in Fig. 3 dargestellten CCD-Sensor 4 um einen Bayer-Sensor mit einer Bayer-Matrix. Statt wie üblich die Subpixel zum Erhalt der Farbinformation auszuwerten, werden diese hier einerseits zur Erhöhung der Auflösung verwendet, wie das entsprechende linke obere Bild der Figur 4 zeigt. Darüber hinaus werden die Subpixel 1 1 bzw. deren Signale unterschiedlich verarbeitet. So werden die Subpixel I I a und I I b niedrigverstärkt (low gained), wohingegen die Subpixel 1 1 c und 1 I d hochverstärkt (high gained) werden. Hierdurch ergibt sich ein höherer Dynamikbereich, was ebenfalls anhand von Fig. 4 im linken unteren Bild ersichtlich ist. Wie das linke obere Bild, das nach dem vorbeschriebenen Verfahren erzeugt ist, zeigt, weist das mit dem vorbeschriebenen Verfahren erzeugte Bild nicht nur eine höhere Auflösung sondern auch eine höhere Dynamik auf, wie insbesondere die dort erkennbaren Grauwerte verdeutlichen. Die Auflösung ist um den Faktor vier erhöht, die Dynamik ebenfalls erheblich. Wie sowohl in dem linken oberen Bild als auch in der darunter befindlichen Signalkurve ersichtlich ist, wird die erhöhte Auflösung durch die Verwendung der Subpixel 1 1 als Pixel erreicht, die höhere Dynamik dadurch, dass die Subpixel 1 1 jeweils paarweise niedrigverstärkt bzw. hochverstärkt werden. Durch Interpolieren der niedrigverstärkten Subpixel mit dem hochverstärkten Subpixel entsteht dann das in Fig. 4 rechts dargestellte Bild, welches eine höhere Auflösung und eine höhere Dynamik als ein bei konventio- neller Auslesung des CCD-Sensors erstelltes Bild aufweist. Auch wenn diese verbesserten Bildinformationen auf der in Fig. 4 rechten Bild- bzw. Signaldarstellung so nicht ohne weiteres erkennbar sind, so ist zu berücksichtigen, dass die dort sichtbaren Grauwerte eine andere Qualität aufweisen, als wenn diese unter üblicher Auswertung des CCD- Sensorsignals erfolgt wären.
[31 ] Um einen mit dem CCD-Sensor 4 erfassten Partikel zu bestimmen oder zumindest zu klassifizieren, ist es erforderlich, verschiedene Kennzeichen des Partikels zu ermitteln und diese dann mit einer vorhandenen Kennzeichensammlung zu vergleichen, um festzustellen, um wel- che Art von Partikel oder im Idealfall um welchen Partikel es sich handelt. Dabei können Kennzeichensammlungen individuell erstellt werden, beispielsweise für Trinkwasser, für Brauchwasser, für Abwasser, für Wasser aus Kläranlagen oder auch für andere Flüssigkeiten mit darin befindlichen Partikeln. Dabei ist die Kennzeichensammlung auf die Er- fordernisse des Anwenders abzustellen. So ist beispielsweise für die Trinkwasseranalyse wesentlich zu erkennen, ob es sich um Bakterien oder Nichtbakterien handelt, im Weiteren, um welche Bakterien. Beispielsweise kann es das Ziel sein, E.coli-Bakterien zu bestimmen, um die Wasserqualität zu überwachen. Solche Kennzeichensammlungen kön- nen gegebenenfalls vor Ort selbstlernend erstellt werden, wenn in einer Anzahl von Voruntersuchungen Partikel bestimmt werden, die in ihrer Form und in ihrer Anzahl als zulässig und akzeptabel festgestellt worden sind. Dann können mit einer solchen selbsttätig erstellten Kennzeichensammlung Abweichungen von der zuvor erfassten Qualität festgestellt werden. Es versteht sich, dass eine Kennzeichensammlung beispielsweise für die Überwachung von Trinkwasser auch ortsabhängig, d. h. an verschiedenen Orten, unterschiedlich sein kann, da die Bakterienarten, die das Wasser belasten können, orts- und klimaabhängig variieren. Je mehr Kennzeichen eines bilderfassten Partikels mit einem Kennzeichen in der Kennzeichensammlung übereinstimmen, um so genauer ist die Bestimmung. Es können einige wenige sein, die zum Vergleich herange- zogen werden oder einige hundert oder gar mehr. Die Auswertung erfolgt zweckmäßigerweise über ein neuronales Netzwerk, kann jedoch auch mittels eines linearen Gleichungssystems erfolgen. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass für die Frage, ob es sich um ein Bakterium oder ein Nichtbakterium handelt, ein Vergleich von mindestens drei Kennzeichen, vorteilhaft mindestens vier Kennzeichen, genügt, um dies mit ausreichender Zuverlässigkeit zu bestimmen. In besonderen Fällen kann die Anzahl der Kennzeichen deutlich höher sein.
[32] Die Erfassung einer Flüssigkeitsprobe mit den darin befindlichen quasi stationären Partikeln erfolgt durch eine Vielzahl von Bildern paralleler Ebenen. Es werden also bei der Bildauswertung nach einer ersten Objektprüfung, welche z. B. übergroße Objekte wie Luftblasen und dergleichen sowie offensichtlich nicht auswertbare Bereiche von der weiteren Auswertung ausschließt (Integritätsprüfung), für jeden bilderfass- ten Partikel Gruppen von Bildern desselben Partikels erstellt, die diesen Partikel in unterschiedlichen Ebenen darstellen. Da bedingt durch die Apertur der bildgebenden Linse 5 der optischen Vorrichtung eine konturenscharfe Darstellung nur in der Fokusebene möglich ist, erscheinen diese Partikel in den Gruppen von Bildern typischerweise in mehreren (unscharfen) Vorfokuspositionen, in einer oder mehreren Fokuspositionen und in mehreren (unscharfen) Nachfokuspositionen. Solche Bilder eines Partikels sind beispielsweise in Fig. 5 dargestellt, die 39 Bilder desselben Partikels im Fokus und außerhalb des Fokus zeigt. Zu diesen Bildern wird rechnerisch erfasst, in welchem Bild bzw. in welchen Bildern das Partikel 3 im Fokus dargestellt ist. In Fig. 5 ist dieses Bild mit dem Partikel 3 im Fokus mit 12 gekennzeichnet. Die Berechnung erfolgt in an sich bekannter Weise mittels eines Sobel-Operators, also eines einfachen Kanten-Detektions-Filters, der dies ermittelt.
[33] Grundsätzlich erfolgt die Auswertung eines Kennzeichens eines Partikels im fokussierten Bild, es sei denn, dass das Kennzeichen gerade auf eine Eigenschaff zwischen fokussierfem und nichffokussierfem Bild abzielt. Die Auswerfung wird jedoch, wie Versuche ergeben haben, deutlich stabiler, wenn nicht nur das im Fokus befindliche Bild 12, sondern jeweils auch ein außerhalb des Fokus liegendes Bild im Vorfokusbe- reich 13 sowie im Nachfokusbereich 14 ausgewertet wird, wobei dann der Einsatz eines neuronalen Netzwerkes zweckmäßig ist, um auch diese„unscharfen" Kennzeichen zuzuordnen (Fig. 6).
[34] Ein wesentliches Kennzeichen eines Partikels ist stets seine Fläche im Fokus, dabei ist die Größe der Fläche ein Kennzeichen, die Form der Fläche ein anderes Kennzeichen. Um diese Größen zu erfassen, ist eine Abgrenzung des Partikels im Bild festzulegen. Dies erfolgt typischerweise durch Festlegung eines Grenzwertes, also eines Grauwerfes des Bildes, der einem bestimmten Pixelwertes entspricht. Mitfels dieses Grenzwertes wird ein reines Schwarzweißbild erzeugt, d. h. alle Pixel, deren Pixelwerfe gleich oder kleiner dieses Grenzwertes sind, werden schwarz, alle anderen weiß dargestellt. Anhand der Figuren 7a, 7b und 7c ist dargestellt, wie sich eine Veränderung dieses Grenzwertes auf das Bild auswirkt. Es sind in den Bildern nach Fig. 7 nur die weißen Flächen zu betrachten, die grauen, schatfenartigen Flächen dienen hier nur der Verdeufli- chung der unterschiedlichen Grenzwerfe und wären normalerweise schwarz. Die grauen schaftenarfigen Flächen zeigen die wirkliche Form des Partikels. Deutlich sichtbar ist in Fig. 7a, dass der Grenzwerf, der dort zu 47 % des maximalen Pixelwerfes gesetzt worden ist, vergleichsweise hoch ist, da ein Großteils des Partikels in den Schwarzbereich fällt und hier vermutlich wesentliche Charakteristika, die ein Kennzeichen der Fläche sind, verloren gehen. In Fig. 7b ist der Grenzwerf auf 30 % festgesetzt. Hier ergibt sich schon eine wesentlich abweichende Form des Partikels im Vergleich zu der Darstellung nach Fig. 7a. Wird jedoch der Grenzwert auf 20 % heruntergesetzt, dann ergibt sich das Bild gemäß Fig. 7c, in dem die deutlich längliche Form des Partikels sichtbar wird, die gleichzeitig ein wesentliches Kennzeichen dieses Partikels ist. Das erfindungsgemäße Verfahren sieht nun vor, den Grenzwert zu variieren und zu ermitteln, ob sich bei unterschiedlichen Grenzwerten insbesondere die Form des Partikels signifikant ändert, um dann den Grenzwert heranzuziehen, welcher dieser ausgeprägten Form Rechnung trägt. [35] Nachdem durch Varianz des Grenzwertes das Schwarzweißbild erzeugt worden ist, welches Grundlage für die weitere Auswertung bildet, wird die Fläche des Partikel im Bild durch eine abschnittsweise um die weiße Fläche herumgelegte Hyperbelkurve bestimmt, welche die Fläche definiert, wie dies in Fig. 8 dargestellt ist. Durch Integrieren dieser Kurve kann die eingeschlossene Fläche, also die zweidimensionale Größe des Partikels ermittelt werden. Die entsprechende Kurve ist mit 15 gekennzeichnet. Zum Vergleich ist in Fig. 8 eine Kurve 16 aufgezeichnet, die sich ergibt, wenn das Bild gemäß Fig. 7b zugrundegelegt wird. Es wird deutlich, dass gerade die Varianz des Grenzwertes dazu führt, ein charakteristisches Kennzeichen hinsichtlich der Form zu schaffen.
[36] Bei der Betrachtung eines Bildstapels ist es häufig zu beobachten, dass sich die Fläche und Form des erfassten Partikels innerhalb und außerhalb des Fokus ändert, wie dies bei den Bildern gemäß Fig. 5 und Fig. 6 sichtbar ist. Während sich bei Fig. 5 im Wesentlichen die Position ändert, die übrigen Änderungen eher fokusbedingt sind, ändert sich bei dem anhand der Bilder in Fig. 6 erfassten Partikel offensichtlich auch die Form. Diese Änderung wird durch eine Bewegung des Partikels verursacht, d. h. eine Bewegung des Partikels von einem Bild zum nächsten. Wenn ein Partikel, der nicht kugelförmig ist, sich dreht, wird das Licht in Abhängigkeit davon, wie schnell und um welche Achse er sich dreht, beeinflusst. Bei der Beobachtung mit dem Auge wird dies als Blinken wahrgenommen. Dies ist eine Eigenschaft, die häufig bei lebenden Bakterien zu beobachten ist, nicht jedoch bei toten Bakterien oder selten bei Partikeln, die keine Bakterien sind. Diese Eigenschaft ist daher mit ein wichtiges Kennzeichen zur Bestimmung, ob es sich um ein Bakte- rium oder um einen anderen Partikel handelt. Um dieses Kennzeichen zu ermitteln, wird zunächst ein Stapel von Bildern, wie er beispielsweise in Fig. 9 dargestellt ist, zur Auswertung herangezogen. Die vorliegenden 25 Bilder, die den hier zu bestimmenden Partikel in- und außerhalb des 5 Fokus zeigen, werden wie folgt ausgewertet:
[37] Nachdem der zu bestimmende Partikel und die dafür in Frage kommenden Bilder gewählt worden sind, so wie diese in Fig. 9 dargestellt sind, wird zunächst eine Fokuskurve erstellt. Auf der horizontalen Achse wird die Anzahl der Bilder und auf der vertikalen Achse die Hell o ligkeit der in jedem Bild ermittelten vier bis sieben hellsten Pixel, d. h. die Pixel, welche den höchsten Pixelwert haben, aufgeführt, und zwar jeweils unter Bildung des Mittelwertes dieser vier bis sieben Pixeln, sodass sich die aus Fig. 10 ersichtliche Kurve 16 ergibt, welche deutlich sichtbare Spitzen aufweist. Diese Kurve 1 6 wird gefiltert und so geglättet. Diese 15 geglättete Kurve ist in Fig. 10 mit 1 7 gekennzeichnet. Schließlich wird zu der Kurve 1 7 der Mittelwert und die Standardabweichung ermittelt. Diese Standardabweichung ist ein Kennzeichen für den erfassten Partikel. Je höher dieser Wert ist, um so größer ist dieser„Blink-Effekt" des erfassten Partikels, was auf eine Bewegung des Partikels, insbesondere eine 20 Drehung um eine Achse hinweist. Diese Kurven 1 6 und 1 7 in Fig. 10 werden voneinander subtrahiert, sodass sich die in Fig. 1 1 dargestellte Kurve ergibt, welche den Mittelwert und die Abweichungen hiervon darstellen.
[38] Ein weiteres Kennzeichen zum Bestimmen oder Klassifizieren von 25 Partikeln ist die Momentenbildung, welche bei der Bildverarbeitung, insbesondere Auswertung und Klassifizierung, zum Stand der Technik zählt. Diese erfolgt regelmäßig anhand von Schwarzweißbildern, vorzugsweise nach deren Digitalisierung in schwarz- und weiß-Werte, wie dies einleitend bereits beschrieben worden ist. [39] Ein weiteres Kennzeichen ist das Trägheitsmoment (auch inverses Moment genannt) eines Partikels, also auch ein Kennzeichen, welches die räumliche Erstreckung des Partikels erfasst. Ausgangspunkt dieses Kennzeichens sind beispielsweise sieben Bilder, von denen eins im Fokus und drei auf jeder Seite des Fokus angeordnet sind, so wie dies in Fig. 6 durch das mittlere Bild 12 sowie ein Vorfokusbild 13 und die beiden zwischen den Bildern 12 und 13 liegenden Bilder sowie ein Nachfokusbild 14 und die beiden zwischen dem Fokusbild und dem Nachfokusbild liegenden Bildern gegeben ist. Von jedem dieser sieben Bilder, von de- nen eines beispielhaft in Fig. 12a dargestellt ist, wird eine Fouriertransformation ausgeführt, sodass sich ein Bild wie in Fig. 12b dargestellt, ergibt. Die Fouriertransformation ergibt jeweils den in dem jeweiligen Bild abgebildeten Partikel im reziproken Raum (in Analogie zum reziproken Gitter der Kristallographie). Es werden dann die Gleichstrom kom- ponenten (DC-Komponenten) entfernt oder zumindest verringert, sodass sich ein Bild wie in Fig. 12c dargestellt ist, ergibt. Auch wird das Rauschen durch einen geeigneten Filter eliminiert, wonach das zentrale Moment jedes der Objekte der sieben Bilder berechnet wird. In Fig. 13 ist eine solche Kurve eines Bildes dargestellt, wobei die horizontale Ach- se die Frequenz und die vertikale Achse die Amplitude darstellt. Der DC-Anteil ist bei dem in Fig. 13 dargestellten Diagramm bereits entfernt, die Rauschanteile 19 sind dort noch vorhanden. Der Maximal- und Minimalwert dieses zentralen Momentes bildet jeweils ein Kennzeichen des untersuchten Partikels. Die vorstehend beschriebenen Kennzeichen, genügen in der Regel, um zu bestimmen, ob es sich bei dem untersuchten Partikel um ein Bakterium oder ein Nichtbakterium handelt.
[40] Eine weitere Varianz von Kennzeichen kann dadurch erzielt werden, dass die Reihen von Bildern in unterschiedlichen Ebenen von derselben Flüssigkeitsprobe mit Beleuchtung aus unterschiedlichen Be- leuchtungswinkeln ausgewertet werden und/oder mit Beleuchtung mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge. Welche Kennzeichen für welche Partikel, insbesondere Bakterien, besonders geeignet sind, um diese zu klassifizieren oder gar zu bestimmen, bedarf empirischer Ermittlungen. Die vorstehend beschriebenen Kennzeichen sind jedoch besonders geeignet, um Bakterien von Nichtbakterien zu unterscheiden, und zwar genügen dazu in der Regel drei oder vier dieser Kennzeichen, um diese Klassifizierung mit ausreichend hoher Sicherheit zu treffen. Eine solche Klassifizierung ist jedoch insbesondere bei der Trinkwasseruntersuchung von großer Bedeutung, da nach erfolgter Klassifizierung dann die Bestimmung im Einzelnen bzw. eine Unterklassifizierung erfolgen kann, und zwar typischerweise der Bakterien und nicht der übrigen Partikel.
Bezugszeichenliste
1 Lichtquelle
2 Fenster
3 Partikel
4 CCD-Sensor (Ebene des Sensors)
5 fokussierende Linse
6 direkte Strahlen
7 Streulicht
8 Sensorbild
9 Beispiel bild
10 Pixel
1 1 Subpixel
I I a blauer Subpixel
I I b roter Subpixel
1 1 c grüner Subpixel
l l d grüner Subpixel
12 mittleres Bild im Fokus
13 Vorfokusbild
14 Nachfokusbild
16 ungeglattete Kurve
1 7 geglättete Kurve
18 Mittelwertkurve
19 Rauschanteile

Claims

Ansprüche
Verfahren zum Bestimmen von Partikeln, insbesondere Bakterien in Flüssigkeit, unter Verwendung einer bildgebenden optischen Vorrichtung mit einer Lichtquelle, mit einem optischen Sensor mit einem Feld von lichtempfindlichen Pixeln und mit einer zwischen Lichtquelle und Sensor angeordneten zu untersuchenden Flüssigkeitsprobe, bei dem Kennzeichen von mindestens einem bildmäßig erfassten Partikel mit Kennzeichen einer Kennzeichensammlung zur Bestimmung des erfassten Partikels verglichen werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Bilderfassung in Dunkelfeldtechnik erfolgt und dass ein lichtempfindliches Pixel mehrere Subpixel aufweist, die zur Bilderfassung genutzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Partikel anhand von zweidimensionalen schwarz- weiß-Bildern in unterschiedlichen Ebenen der Flüssigkeitsprobe er- fasst wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Subpixel zur Erhöhung der Auflösung und/oder der Empfindlichkeit des Sensors verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Pixel des Sensors mehrere Subpixel aufweist, von denen mindestens eines hochverstärkt und mindestens eines niedrig verstärkt werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens drei, vorzugsweise vier unter- schiedliche Kennzeichen eines Partikels zu dessen Bestimmung verwendet werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als ein Kennzeichen eines Partikels seine flächenmäßige Erstreckung in dem Bild, in welchem das Partikel im Fokus ist, verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erfassung der flächenmäßigen Erstreckung des Partikels ein Pixelgrenzwert festgesetzt wird, wobei alle Pixel, deren Pixelwert größer oder gleich dem festgesetzten Pixelgrenzwert ist, zu 1 und alle Pixel, deren Pixelwert kleiner als der festgesetzte Pixelgrenzwert ist, zu 0 gesetzt werden, wonach die flächenmäßige Erstreckung des Partikels erfasst wird.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die flächenmäßige Erstreckung des Partikels unter Zugrundelegung mehrerer unterschiedlicher festgesetzter Pixelgrenzwerte erfolgt.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als ein Kennzeichen eines Partikels dessen Rotation um seine eigene Achse bestimmt wird. 10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Kennzeichen eines Partikels durch Auswertung einer Reihe von Bildern des Partikels in unterschiedlichen Ebenen erfolgt, bei denen das Partikel in einigen Bildern im Fokus und in einigen Bildern ausserhalb des Fokus liegt, wobei die Anzahl der das Partikel repräsentierenden Pixelwerte bildweise erfasst und die Verteilung der erfassten Anzahlen über die Zahl der Bilder das Kennzeichen bildet.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Standardabweichung der erfassten Anzahlen zu dem Mittelwert der erfassten Anzahlen ein Kennzeichen bildet.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als ein Kennzeichen die Form eines Partikels verwendet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Form eines Partikels durch seine Momente bestimmt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Form eines Partikels durch seine inversen Momente bestimmt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erfassung der inversen Momente eines Partikels eine Auswertung einer Reihe von Bildern des Partikels in unterschiedlichen Ebenen erfolgt, wobei das Partikel in mindestens einem Bild im Fokus liegt, und in einer Anzahl von Bildern davor und dahinter, wobei die Pixelwerte jedes Bildes einer Fouriertransformation unterzogen werden wonach die DC-Anteile entfernt oder zumindest verringert werden, der Rauschanteil der Signale eliminiert und dann eine
Momentenbestimmung erfolgt.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Beleuchtungsstärke der Lichtquelle kon- stalt gehalten wird und dass eine Regelung vorgesehen ist, welche die Beleuchtungsstärke vorzugsweise mittels des Sensors erfasst und die Lichtquelle entsprechend ansteuert.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung eines Partikels durch Ver- gleich von erfassten Kennzeichen mit Kennzeichen der Kennzeichensammlung mittels eines nicht linearen Systems, vorzugsweise mittels eines neuronalen Netzwerkes, erfolgt.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung eines Partikels durch Ver- gleich von erfassten Kennzeichen mit Kennzeichen der Kennzeichensammlung mittels eines linearen Systems erfolgt.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine dem Sensor vorgeschaltete bilderzeugende Linse verwendet wird, die eine numerische Apertur zwi- sehen 0,05 und 0,4 aufweist.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Bilder von derselben Flüssigkeitsprobe mit Beleuchtung mit unterschiedlichem Beleuchtungswinkel ausgewertet werden. 21 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Bilder von derselben Flüssigkeitsprobe mit Beleuchtung mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge nacheinander ausgewertet werden. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Klassifikation das Partikel in Bakterien, Nicht-Bakterien und andere Partikel erfolgt.
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