WO2016102735A1

WO2016102735A1 - Células madre irradiadas para el tratamiento del cáncer

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Publication number: WO2016102735A1
Application number: PCT/ES2015/070951
Authority: WO
Inventors: José Mariano RUIZ DE ALMODÓVAR RIVERA; Virginea DE ARAÚJO FARIAS; Jesús Joaquín LÓPEZ PEÑALVER; María del Carmen RUIZ RUIZ; Francisco Javier OLIVER POZO; Borja ALONSO LERMA; Rocío SEGUI JIMÉNEZ; Ana GUERRA-LIBRERO RITE; Beatriz Irene FERNÁNDEZ GIL
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Granada; Servicio Andaluz de Salud
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad de Granada; Servicio Andaluz de Salud
Priority date: 2014-12-23
Filing date: 2015-12-23
Publication date: 2016-06-30
Anticipated expiration: 2017-06-23

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de células madre activadas que comprende administrar bajas dosis de radiación, sus usos para elaborar composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de tumores localmente avanzado y del cáncer a nivel sistémico.

Description

CÉLULAS MADRE IRRADIADAS PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuentra dentro de la medicina, y más específicamente dentro de la terapia celular, y se refiere al empleo de células madre activadas mediante bajas dosis de radiación para el tratamiento del cáncer.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La radioterapia se ha mantenido constantemente como uno de los tratamientos más eficaces para el cáncer y aproximadamente el 50% de todos los pacientes con cáncer reciben radioterapia en alguna forma, ya sea aislada o en combinación con otras modalidades de tratamiento, en algún momento durante su gestión. Para muchos tumores y localizaciones, sin embargo, no se puede lograr una cura definitiva a pesar de que cada vez hay más eficaces tratamientos para el cáncer. La información fiable sobre los papeles relativos de la cirugía, la radioterapia, la quimioterapia y las nuevas áreas de desarrollo de fármacos contra el cáncer es difícil de obtener, pero cualquier mejora en la eficacia de la radioterapia, sin duda, beneficiará a un número significativo de pacientes (Begg et al., 201 1. Nat Rev Cáncer 1 1 , 239-253). El conocimiento de los mecanismos mediante los cuales la radiación induce la muerte celular se basa en datos de la supervivencia celular y del daño celular inducido por la radiación (Peacock et al, 1992. BJR supplement, 24, 57-60; Ruiz de Almodóvar et al, 1994b. International journal of radiation biology 65, 641-649; Steel et al, 1989, International journal of radiation biology 56, 1045-1048) y en las consecuencias que este daño genera tanto en las células tumorales (McMillan y Peacock, 1994. International journal of radiation biology 65, 49-55) como a nivel de los tejidos normales (Ruiz de Almodóvar et al, 1994a. International journal of radiation biology 65, 641-649; López et al, 2005 Breast cáncer resea re h: BCR 7, R690-698; López et al, 2002. Breast cáncer research and treatment 73, 127-134).

Los modelos propuestos hasta ahora para explicar el resultado de la terapia sobre el crecimiento del tumor y los efectos adversos ocasionados, hacen pensar que además de daños en el ADN (McMillan et al., 2001. International journal of radiation oncology, biology, physics 49, 373-377) los procesos de señalización celular promovidos por la radiación y que alcanzan localizaciones situadas fuera de la región irradiada -efectos abscopal y bystander- (Formenti y Demaria 2009. Lancet Oncol 10, 718-726; Mothersill y Seymour, 1997. International journal of radiation biology 71 , 421-427; Mothersill y Seymour, 2004. Nat Rev Cáncer 4, 158-164) pueden ser cruciales en la valoración del efecto global de la radioterapia (Gómez-Millán et al, 2012. Radiotherapy and Oncology, Journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology 102, 450-458). Estas evidencias obligan al desarrollo de un nuevo modelo capaz de explicar el efecto de la radiación sobre el tumor y los tejidos sanos simultáneamente (Lambin et al., 2013. Nat Rev Clin Oncol, 10, 27-40;). De hecho, la comunicación entre las células subletalmente dañadas y las indemnes puede conducir a la reducción de la población de las células cancerosas residuales al tratamiento (Prise y O'Sullivan, 2009. Nat Rev Cancer é, 351-360).

La radioterapia es una herramienta muy eficaz para erradicar las células tuumorales. Al igual que con muchos otros procedimientos médicos, la prescripción de un ciclo de radioterapia debe valorar el equilibrio entre el riesgo y el beneficio, cuyo peso relativo será determinante de ganancia terapéutica. Hoy entendemos que la terapia antineoplásica podría tener un efecto decisivo adicional: la respuesta de las células tumorales sub-letalmente lesionadas (Marples et al, 2003;. Mothersill y Seymour, 2004; Prise y O'Sullivan, 2009. Nat Rev Cáncer 9, 351-360) puede ser descrita como una interacción entre un ligando y su receptor (Gómez-Millan et al., 2012. Radiotherapy and oncology: journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology 102, 450-458). Poco tiempo después de cada sesión de radioterapia, las células incluidas en el volumen de irradiación quedan clasificadas, con propósitos operacionales, en la forma siguiente:

A) Células muertas: Células que han sufrido lesiones irreparables; estas son las incluidas en el compartimiento denominado lesión-letal del modelo de Curtís (Curtís, Radiat Res. 1986, 106(2):252-270)

B) Células comprometidas: Son células afectas por daños en su ADN y cuyo destino depende de un proceso competitivo entre la reparación y la fijación de las lesiones radioinducidas. Son las que se incluyen en el compartimiento de lesiones potencialmente-letales y responsables de la curvatura de las curvas de supervivencia celular a la radiación (Peacock, et al. 1992, BJR Supplement 24, 57-60).

C) Células activadas: Células que han sido mínimamente dañadas o que han sido capaces de reparar las lesiones inducidas hasta un nivel de daño residual compatible con la supervivencia de dichas células. Estas células son han resultado ser una fuente activa de citoquinas, especies reactivas de oxígeno y especies reactivas de nitrógeno que, través del espacio extracelular o mediante la circulación sanguínea y/o linfática, interaccionan y afectan a la masa total del tumor.

D) Células indemnes: Células que sobreviven tras cada fracción de la dosis y que obliga a la prolongación del tratamiento con sucesivas fracciones de la dosis para conseguir el control tumoral. La probabilidad de controlar el tumor depende, esencialmente, de la naturaleza y la extensión del tumor, de factores terapéuticos tales como dosis total, dosis por fracción y tiempo, y de factores biológicos como radiosensibilidad y probabilidad de efectos colaterales adversos.

La población de células en el compartimiento C es responsable: a) del efecto bystander de corto alcance (Prise KM & O'Sullivan JM, 2009. Nat Rev Cáncer 9(5): 351-360) que se produce por contacto directo célula-célula a través de las gap-junction y por comunicaciones mediadas por radicales libres, y b) del efecto bystander a distancia del tumor -efecto abscopal- (Formenti SC & Demaria S, 2009. Lancet Oncol 10(7): 718-726).

Según este modelo la acción bystander de la radiación debe ser considerada como la respuesta inmunológica global del tumor y de sus metástasis, si las hay, y de los tejidos peritumorales sanos, al estrés inducido por la radiación sobre el volumen blanco (López E, et al. (2005) Breast Cáncer Res 7(5):R690-698; Pinar et al. 2007, Radial Res. 168(4): 415-22. Resultados anteriores apoyan la hipótesis de que el efecto bystander puede ser un fenómeno generalizado que se produce cuando las células tumorales están en contacto con el medio extracelular condicionado por la irradiación de otras células del mismo tipo. Sin embargo, las células normales, representadas en nuestros experimentos previos por células madre mesenquimales derivadas del estroma del cordón umbilical (UCSSC) (Farías et al., 2011. Placenta, 32(1):86-95), aunque extremadamente sensibles a la radiación ionizante, son resistentes a cualquier efecto bystander inducido por el medio condicionado por irradiación de células tumorales (RCM) a dosis comprendidas entre 0 y 8 Gray (Gómez-Millán et al., 2012. Journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology 102, 450-458).

Las células MSCs han sido investigadas para el tratamiento de cánceres debido al hecho de estas células son capaces de alojarse preferentemente en el estroma de los tumores y se sabe que la incorporación de MSCs al tumor se incrementa con la radioterapia antitumoral. Existe literatura detallada que apoya el hecho de que para casi todos los vasos sanguíneos en el cuerpo, las células mesenquimales se observan en localizaciones perivasculares (Caplan y Correa, 201 1 ; Cell Stem Cell. 9, 1 1-15; Farias et al, 201 1 , Placenta, 32(1):86-95). Las MSC pueden o bien suprimir o promover tumores (Bergfeld et al, 2014; Mol Cáncer Ther. 13, 962- 75. Yagi and Kitagawa, 2013, Front Genet. 4, 261). La información existente propone que la activación secuencial de las MSC en respuesta a las lesiones tisulares podría tener un papel en la regeneración de los tejidos debido a la activación de estas MSC, movilizadas y activadas, actúan como "medicamento" (MSC*) y secretan factores que organizan un microambiente capaz de promover la terapia celular (Caplan y Dennis, 2006, J Cell Biochem, 98, 1076-84). Se ha descrito que la bioactivación de las MSC se puede lograr mediante diferentes tratamientos y que las moléculas secretadas por las MSC activadas (MSC*), afectan a diversos linajes de células inmunes para establecer un potente microambiente terapéutico (Lee et al., 2012, Cell Stem Cell, 2012, 825-35). Por otro lado también sabemos que las dosis bajas de radiación contribuyen a normalizar la vasculatura tumoral aberrante. Sería, por tanto, importante encontrar métodos alternativos de activación de MSCs para que éstas secreten las moléxulas al medio que favorecen la creación de un microambiente terapéutico. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención muestra una nueva terapia, basada en radioterapia, útil para el tratamiento de tumores localmente avanzado y del cáncer a nivel sistémico.

Un primer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de obtención de células madre activadas, de ahora en adelante procedimiento de la invención, que comprende administrar bajas dosis de radiación a células madre. En una realización preferida de este aspecto de la invención las células madre son irradiadas con una dosis de entre 0,03 cGy y 6 Gy, más preferiblemente con una dosis de entre 0,25 Gy y 4Gy, y aún más preferiblemente con una dosis de aproximadamente 2 Gy.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las células madre son células madre mesenquimales.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a una célula madre activada, de ahora en adelante célula madre activada de la invención, obtenida u obtenible por el procedimiento de la invención. Por tanto, se entiende como célula madre activada de la invención una célula madre obtenida por el procedimiento de la invención. En una realización más preferida, este aspecto de la invención se refiere a una población de células madre activadas, de ahora en adelante población de células madre activadas de la invención, que comprende al menos una célula madre activada de la invención. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, las células madre son células madre mesenquimales.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende al menos una célula madre activada de la invención o una población de células madre activadas de la invención. En una realización preferida de este aspecto, la composición de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida de este aspecto la composición de la invención además comprende otro principio activo. En otra realización más preferida, el principio activo es un inhibidor de PARP (poli (ADP-ribosa) polimerasa).

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a una preparación combinada, de ahora en adelante preparación combinada de la invención, que comprende: a) un componente A que es al menos una célula madre activada o una población de células madre activadas de la invención, o una composición de la invención, y,

b) un componente B que es un agente quimioterápico y/o un agente antiantiangiogénico.

En una realización preferida de este aspecto la preparación combinada de la invención además comprende al menos un inhibidor de PARP.

Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de una célula madre activada de la invención, de una composición de la invención, o de la preparación combinada de la invención, en la elaboración de un medicamento.

Un sexto aspecto de la invención se refiere al uso de una célula madre activada de la invención, de una composición de la invención, o de la preparación combinada de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el cáncer es un cáncer localmente avanzado o sistémico.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento de cáncer, de ahora en adelante primer método de tratamiento del cáncer de la invención, que comprende: a) administrar las células madre activadas de la invención, y

b) administrar radioterapia a dosis convencionales siguiendo los protocolos habituales. En una realización preferida, el paso (b) comprende administrar al paciente una dosis baja de radiación sobre el volumen ocupado por el tumor en una cantidad eficaz (2-6 Gy) para activar las células tumorales y favorecer el tropismo de las células madre hacia el tumor.

Preferiblemente las células madre son células madre mesenquimales (MSC), y/o las células madre activadas son células madre mesenquimales activadas (MSC*).

En otra realización preferida, se pueden hacer nuevas administraciones intravenosas con posterioridad, de células madre activadas, preferiblemente donde las células madre son células madre mesenquimales, y la administración posterior puede ser tanto de células MSC como células MSC* o células de la invención, por ejemplo, en los días de pausa de la radioterapia. En una realización preferida de este aspecto el primer método de tratamiento del cáncer de la invención además comprende administrar al menos un inhibidor de PARP. En otra realización preferida de este aspecto el primer método de tratamiento del cáncer de la invención además comprende administrar al menos un agente quimioterápico y/o un agente antiangiogénico. En otra realización preferida de este aspecto el cáncer es un cáncer sistémico.

Un octavo aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento de cáncer, de ahora en adelante segundo método de tratamiento del cáncer de la invención, que comprende:

a) administrar células madre sin tratar, dejar que se bio-distribuyan y, tras 24 horas, b) administrar radioterapia a dosis convencionales siguiendo los protocolos habituales.

En este procedimiento se supone que la activación de las células mesenquimales ocurrirá in situ en coincidencia con la irradiación del tumor.

En una realización preferida de este aspecto el segundo método de tratamiento del cáncer de la invención además comprende administrar al menos un inhibidor de PARP. En otra realización preferida de este aspecto el segundo método de tratamiento del cáncer de la invención además comprende administrar al menos un agente quimioterápico y/o un agente antiangiogénico. En otra realización preferida de este aspecto el cáncer es un cáncer sistémico.

En otra realización preferida, las células madre serán inyectadas al día siguiente y tras 24 horas de espera se proseguirá con el tratamiento con radiación. Nuevas administraciones intravenosas de células madre activadas se podrán hacer en los días de pausa de la radioterapia. En una realización más preferida de la invención, las células madre son células madre mesenquimales.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. RT-PCR cuantitativa para el mRNA de TRAIL, DR5 y DKK3 en células MSC del estroma de cordón umbilical humano en condiciones básales y tras estimulación de las células con dosis de 2 Gy de radiación de baja transferencia lineal de energía (rayos X o γ). La evolución de los niveles de expresión de cada uno de genes estudiados se sigue a lo largo del tiempo (intervalo comprendido entre 0 y 30 horas tras estímulo) y las diferencias respecto a los valores básales se calculan mediante el método 2^_ΔΔα. En el eje de las Y los valores son media ± ESM de triplicados de 3 ensayos independientes (*P<0,05; ** P < 0,01 ; *** P< 0,001 **** P< 0,0001). Los resultados son claramente indicativos de la regulación hacia arriba de TRAIL a 24 y 30 horas, DR5 después de 4 horas y de DKK3 a las 30 horas de la irradiación. Es importante entender que los valores de DKK3 son del orden de 5 veces mayores a las 30 horas del estímulo que los que se encuentran en situación basal de las células.

Figura 2. RT-PCR cuantitativa para el mRNA de TRAIL and DR5 and DKK3 en células MSC del estroma de cordón umbilical humano en condiciones básales y tras estimulación de las células con dosis de 6 Gy de radiación de baja transferencia lineal de energía (rayos X o γ). La evolución de los niveles de expresión de cada uno de genes estudiados se sigue a lo largo del tiempo (entre 0 y 30 horas tras estímulo) y las diferencias respecto a los valores básales se calculan mediante el método 2^_ΔΔα. En el eje de las Y los valores son media ± ESM de triplicados de 3 ensayos independientes (*P<0,05; ** P < 0,01 ; *** P< 0,001 **** P< 0,0001). Tras 6 Gy no se evidencia la regulación hacia arriba de TRAIL mientras que el incremento de componente celular (up-regulation) de DR5 ocurre a las 4, 24 and 30 horas tras tratamiento. La up-regulation de of DKK3 es evidente a las 24 y 30 horas. Figura 3. RT-PCR cuantitativa para el mRNA de TRAIL and DR5 and DKK3 en las líneas celulares A375 y G361 de melanoma humano y en MCF7 (cáncer de mama humano) en condiciones básales y tras estimulación de las células con dosis de 2 Gy de radiación de baja transferencia lineal de energía (rayos X o γ). La evolución de los niveles de expresión de cada uno de genes estudiados se sigue a lo largo del tiempo (entre 0 y 30 horas tras estímulo) y las diferencias respecto a los valores básales se calculan mediante el método 2^_ΔΔα. En el eje de las Y los valores son media ± ESM de triplicados de 3 ensayos independientes (*P<0,05; ** P < 0,01 ; *** P< 0,001 **** P< 0,0001). La expresión de estos genes también cambia en las líneas celulares ensayadas. Lo más relevante es la up-regulation of DR5 and DKK3 en A361 lo que indica un posible efecto radiosensibilizante y la up-regulation de TRAIL en MCF7. De gran interés es la ausencia de DKK3 en esta línea celular. Nótese que falta la gráfica correspondiente.

Figura 4. Otra RT-PCR cuantitativa para el mRNA de TRAIL and DR5 and DKK3 en otro ensayo sobre las líneas celulares A375 y G361 de melanoma humano y en MCF7 (cáncer de mama humano) en condiciones básales y tras estimulación de las células con dosis de 2 Gy de radiación de baja transferencia lineal de energía (rayos X o γ). La evolución de los niveles de expresión de cada uno de genes estudiados se sigue a lo largo del tiempo (intervalo comprendido entre 0 y 30 horas tras estímulo) y las diferencias respecto a los valores básales se calculan mediante el método 2^_ΔΔα. En el eje de las Y los valores son media ± ESM de triplicados de 3 ensayos independientes (*P<0,05; ** P < 0,01 ; *** P< 0,001 **** P< 0,0001). La expresión de estos genes también cambia en las líneas celulares ensayadas. La inducción de TRAIL ocurre a las 24 and 30 horas para la línea A375 and MCF7 y la inducción de DR5 es evidente para todas las líneas celulares tumorales estudiadas aunque hay diferencias en las cinética de expresión de este gen. No fue posible cuantificar la expresión de DKK3 en MCF7, ni a nivel basal ni tras el estímulo.

Figura 5. A, B: Niveles de las proteínas TRAIL y DKK3 medidos en el medio de cultivo de MSC derivadas del estroma de cordón umbilical (MSC-UCSSCs) en un experimento de cinética de liberación de estas proteínas tras estimulación de las células con una dosis de 2 Gy de radiación ionizante (rayos X o γ). Los tiempos en los que se realiza la cuantificación de proteínas por enzimo-inmuno-ensayo fueron 0, 24 y 48 tras tratamiento. En C y D, se representan los niveles de TRAIL y DKK3 en células completas. Para ello se ha utilizado un método que permite la cuantificación de proteínas mediante inmuno-ensayo en células intactas (Siles et al. British journal of cáncer 1996; 73(5):581-8). La evolución de los niveles intracelulares de estas proteínas se hizo en los tiempos Oh (control) y 24 y 48 horas tras irradiación. El ensayo en célula completa pone de manifiesto los cambios en la cantidad de la forma de TRAIL enlazado a la membrana celular en células control y tras tratamiento (0, 24 y 48 h). E muestra unos resultados representativos de la respuesta del método de enzimo- ensayo para medir la evolución de la expresión de TRAIL en las células en condiciones básales y tras ser irradiadas con 2 Gy. La imagen muestra con claridad el incremento, en función del tiempo, de los niveles de proteína existentes en las células irradiadas. El ensayo en célula completa, F, permite medir los niveles básales de TRAIL y sus cambios tras irradiación para cantidades de células tan bajas como 5000 células por pozo.

Figura 6. Niveles de las proteínas TRAIL y DKK3 medidas en un experimento de estimulación de MSC con dosis de 6 Gy utilizando radiación de bajo LET (Rayos X o γ). Los resultados obtenidos tras medir la expresión de TRAIL y DKK3 en el medio de cultivo se muestran en a y b. Los puntos corresponden a los tiempos de Oh (control), 24 y 48 horas tras irradiación. Los resultados de la medida de TRAIL mediante el ensayo en célula completa se muestran en c y d. Los valores se expresan en pg/ml en el enzimo-immuno-ensayo de TRAIL, ng/ml para el de DKK3 y en unidades relativas en el caso del ensayo sobre células completas. La inducción de la forma de la proteína TRAIL anclada a la membrana celular (ensayo en célula completa) de las células mesenquimales es evidente.

Figura 7. El medio condicionado por irradiación de células mesenquimales (RCM) usado en forma reiterada como tratamiento sobre las células A375 y G361 produce una efecto de muerte celular que se manifiesta por la disminución de las colonias tamaño formadas por estas líneas celulares. En este experimento las células A375 y G361 se hicieron crecer durante 7 días para formar colonias. A partir de este punto (inicio del experimento) se definieron tres condiciones: La primera en la que las colonias se dejaron crecer en medio de cultivo normal (experimento control) cambiando diariamente el medio de cultivo por medio fresco. En los otras dos el medio de cultivo se reemplazó por RCM obtenido tras 24 horas y RCM obtenido tras 48 horas de la irradiación de células MSC. En el momento inicial la superficie total cubierta por las colonias de células tumorales se cuantificó tras tinción de las colonias obteniendo una imagen fotográfica que se analizó mediante el software ImageJ (punto 0 en los experimentos de cinética de crecimiento tumoral) y su crecimiento fue monitorizado durante 5 días adicionales. Utilizando los datos de las representaciones gráficas es posible obtener el porcentaje de pérdida celular referido al experimento control, que ocasiona cada tratamiento. Para las líneas celulares G361 and A361 , la comparación de los ajustes de los puntos experimentales a una ecuación exponencial muestra que las curvas de Control, y de tratamiento con RCM 24h y con RCM 48 h son estadísticamente diferentes. Los valores del tiempo de duplicación para cada una de las situaciones experimentales son: T_D para el crecimiento de las colonias de A375 y G361 en condiciones Control: 42,0 y 45,6 horas respectivamente; T_D para el crecimiento de las colonias tratadas con RCM 24h para A375 y G361 : 61 ,2 y 79,3 horas respectivamente. Estas cifras permiten calcular un porcentaje de pérdida celular del orden de 50% en ambos casos. Finalmente, el valor de las pendientes del crecimiento de las colonias de células tumorales (Tcg) en los experimentos realizados en la condición de tratamiento con RCM 48h resultaron ser: 1 ) una pendiente positiva muy lenta en el caso de la línea celular A375, y 2) una pendiente de valor negativo para las células G361 que indicaba la progresiva reducción del tamaño de la superficie cubierta por las colonias de estas células sometidas a tratamiento con RCM 48h. Esto permite concluir que la pérdida celular en ambos casos supera el 100%. Figura 8. Experimento representativo del crecimiento de los tumores experimentales constituidos por colonias de las líneas celulares A375 y G361 de melanoma crecidas durante 7 días y colonias de células MCF-7 de cáncer de mama crecidas durante 14 días. El estudio del crecimiento de las colonias se hizo en condiciones Control y tras varios tratamientos experimentales con células mesenquimales sin irradiar e irradiadas. También las colonias de las células tumorales se estudiaron sin irradiar y tras irradiación. En todos los casos la irradiación se hizo con una dosis de 2 Gy. La superficie cubierta por las colonias de células tumorales en cada una de las condiciones experimentales ensayadas se midió en el momento inicial (punto 0 en los experimentos de cinética de crecimiento) y la evolución de su tamaño fue seguida durante 5 días adicionales. En el eje Y se representan los valores medios ± SEM de las colonias observadas. Se hicieron tres experimentos diferentes cada uno de ellos por triplicado. Figura 9. Ensayo ¡n vivo en ratones. Resultados obtenidos tras el tratamiento de ratones con la irradiación de uno de los tumores del ratón con 3 Gy una vez por semana (marcado en la gráfica con RT). Los ratones se dividen en dos grupos: Control: Línea continua y símbolo O; Tratamiento: Líneas continuas y símbolos □ y La cinética de crecimiento del tumor irradiado es la línea marcada con□, RT 3Gy. La línea marcada con ^ representa la evolución en el tiempo del tamaño del tumor contralateral no-irradiado, Bystander. El día 19 se inyectaron las MSC. Tras esto los puntos correspondientes a la evolución del volumen de los tumores se separan claramente de la prolongación de las líneas que representan el crecimiento tumoral (Líneas punteadas).

Figura 10. Estudio del papel de las MSC como agentes tumor-supresor cuando se utilizan aisladamente o cuando se las usa en combinación con la radioterapia. Se cuantifica aisladamente el crecimiento del tumor en cuatro condiciones diferentes:

A) Sin tratamiento (Grupo Control, O), Tiempo de duplicación de volumen: 6,13 días

B) Tratados exclusivamente con radioterapia (Grupo RT, Δ, 8 tumores),

C) Tratados solo con células mesenquimales (MSC,♦, 16 tumores),

D) Tratados con mesenquimales y radioterapia (RT + MSC, O, 8 tumores)

Los tumores contralaterales en los grupos de ratones tratados con RT o con RT + MSC (8 tumores en cada uno de ellos) son los que en la gráfica se identifican como Bystander (RT), V, y Bystander (RT+MSC),♦.

Figura 11.- Conjunto de imágenes representativas de los ratones inoculados con 1 - 10⁶ células de la línea de melanoma humano G361. Los ratones con un tumor de aprox. 65 mm³ fueron tratados de diferentes formas durante 4 semanas Las imágenes del crecimiento del tumor están tomadas en los días 0 (comienzo del tratamiento), 7, 14, 21 y 28, tanto para el grupo control como para los grupos de cada tipo de tratamiento. Los puntos negros que se aprecian son marcas para facilitar la irradiación del tumor. En el grupo RT, se irradió el tumor del lado derecho (marcado con una flecha), mientras que en el grupo RT + MSC el tumor irradiado fue el de la izquierda (marcado con una flecha). Los tumores del lado opuesto se protegieron de la irradiación y solo se ven afectados por el efecto bystander.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los resultados de los autores de la presente invención indican que las células mesenquimales activadas con radiación, son fuente de citoquinas y su administración, preferiblemente conjunta con la radioterapia y los inhibidores de PARP, incrementarán los niveles de citoquinas liberadas en seno del tumor, aumentando así la efectividad de la radioterapia a través de la potenciación de la muerte celular por efecto bystander de corto y largo alcance.

Para comprobar esta hipótesis los inventores han investigado los mecanismos que determinan la sensibilidad celular al efecto bystander en más profundidad, utilizando un conjunto de líneas de células cancerosas y células mesenquimales derivadas de estroma del cordón umbilical (UCSSC), incluyendo la activación de las células UCSSC con radioterapia en dosis bajas para aumentar la expresión de TRAIL (TNFS10) y de DKK3. La activación de MSC con radioterapia logra efectos similares a los previamente descritos (Lee et al., 2012, Cell Stem Cell, 2012, 825- 35) y evita la utilización de moléculas altamente tóxicas como el TNFa.

La invención se soporta con resultados in vitro que son lo suficientemente consistentes como para demostrar que:

1. TRAIL y DKK-3 son moléculas producidas por el tumor y por las células mesenquimales que, como consecuencia del tratamiento de las células con dosis de radiación de bajo LET (Rayos X o γ) comprendidas entre 0,2 y 6 Gy, se secretan al medio extracelular, donde pueden actuar como moléculas de señalización para producir la muerte celular en las células tumorales no irradiadas.

2. Es posible aumentar el potencial de muerte de células tumorales usando una combinación de: 1) medio condicionado por la irradiación de células mesenquimales y 2) sustancias que farmacológicamente actúan como inhibidores de la enzima PARP-1 , que puede ser aplicada simultánea, o sucesivamente, sobre el modelo tumoral.

3. Se ha demostrado que la activación de las células MSC-UCSSC con radioterapia a baja dosis puede ser una estrategia útil que proporciona elementos celulares con capacidad tumor-supresor.

Por lo tanto, tal y como se muestra en los ejemplos de la invención, la utilización de células mesenquimales activadas (MSC*) potencia la acción de la radioterapia aplicada al tratamiento de modelos de cáncer humano. Además, sobre la base de estos resultados se muestra que la administración de células mesenquimales y radiación, junto con los inhibidores de PARP, podría conducir a un aumento en la eficacia de la radioterapia debido a la suma de: i) la acción de las citoquinas liberadas por las células MSC* al medio extracelular, ii) las acciones genotóxicas de la radiación y iii) el deterioro de los mecanismos de reparación del ADN derivados de la inhibición de PARP. Todo ello se traduce en la potenciación de los efectos de vecindad (bystander) de corto y largo alcance y, como consecuencia, en un mayor efecto del tratamiento.

Así, tal y como se puede ver en las Fig. 1 a 6, la radiación ionizante utilizada a bajas dosis sobre MSC, y sobre células tumorales, induce importantes cambios en la expresión de los genes de TRAIL, DR5 y DKK3 que se traduce, en las MSC, por cambios en los niveles de las proteínas codificadas por dichos genes. La forma de TRAIL anclado a la membrana de las MSC puede ser cuantificada por enzimo-ensayo sobre célula completa.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de obtención de células madre activadas, de ahora en adelante procedimiento de la invención, que comprende administrar a dichas células bajas dosis de radiación. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la dosis de radiación administrada se encuentra entre 0,2 y 6 Gy, más preferiblemente entre 0,25 y 6 Gy, entre 0,2 y 4 Gy, y entre 0,5 y 2 Gy. La radiación se administra de acuerdo con técnicas estándar conocidas en el estado del arte, y con equipos de megavoltaje estándar, tales como, por ejemplo, pero sin limitarnos, AECL Theratron 80, Varían Clinac 4 o Varían Clinac. Preferiblemente, el tamaño máximo del campo de radiación no debe ser mayor a 300 cm².

La radioterapia empleada en el procedimiento de la invención puede comprender una irradiación externa administrada a una célula o una población celular en una dosis de 0,2 a 8 Gy por fracción. Un intervalo preferido de la dosis de irradiación es de 0,5 a 3 Gy por fracción. En ciertas realizaciones, la dosis total de la terapia de radiación es menos de 80 Gy, tal como menos de 75 Gy, tal como menos de 70 Gy, tal como menos de 65 Gy, tal como menos de 60 Gy, tal como menos de 55 Gy, tal como menos de 50 Gy, tal como menos de 45 Gy. En ciertas realizaciones, la terapia de dosis o radiación es entre aproximadamente 60 a 80 Gy, tal como de aproximadamente 40 a 60 Gy, tal como de aproximadamente 30 a 50 Gy, tal como aproximadamente de 20 a 30 Gy. En ciertas realizaciones, la dosis de irradiación se selecciona de entre 15 a 30 Gy, tales como 10 a 20 Gy.

Una dosis de irradiación externa se puede administrar en 1 a 60 dosis fraccionarias, tales como de 5 a 30 dosis fraccionarias. En ciertas realizaciones, las dosis fraccionado se administran con aproximadamente 1 ,5 a aproximadamente 2 Gy por fracción, tal como de aproximadamente 1 ,5 Gy, tal como aproximadamente 1 ,6 Gy, tal como aproximadamente 1 ,7 Gy, tal como aproximadamente 1 ,8 Gy, tal como aproximadamente 1 ,9 Gy, tales como aproximadamente 2,0 Gy, tal como aproximadamente 2,1 Gy, tal como aproximadamente 2,2 Gy, tal como aproximadamente 2,3 Gy tal como aproximadamente 2,4 Gy, tal como aproximadamente 2,5 Gy por dosis fraccionada.

En otra realización preferida de este aspecto de la invención la célula madre sería una célula madre mesenquimal.

En otras realizaciones, la radioterapia se administra en una sola dosis y no en dosis fraccionadas. Por ejemplo, la dosis única puede administrarse con aproximadamente 10 a 20 Gy por dosis. Las células madre activadas se pueden administrar con una dosis de aproximadamente 1-5 Gy. En ciertas realizaciones, un sensibilizador a la radiación se administra a un paciente y el paciente se somete a una sola dosis de la terapia de radiación dentro de 10 minutos, en 20 minutos, en 30 minutos, en 40 minutos, dentro de los 50 minutos o una hora después de la administración del sensibilizador.

CÉLULAS DE LA INVENCIÓN

Un segundo aspecto de la invención se refiere a una célula madre aislada activada, de ahora en adelante célula madre aislada activada de la invención, obtenida por el procedimiento de la invención.

La célula madre de la invención es una célula madre adulta, y más preferiblemente, es una célula madre mesenquimal. El término "célula madre adulta" se refiere a aquella célula madre que es aislada de un tejido o un órgano de un animal en un estado de crecimiento posterior al estado embrionario. Preferiblemente, las células madre de la invención son aisladas en un estado postnatal. Preferiblemente son aisladas de un mamífero, y más preferiblemente de un humano, incluyendo neonatos, juveniles, adolescentes y adultos. Se pueden aislar células madre adultas de una gran variedad de tejidos y órganos, como médula ósea (células madre mesenquimales, células progenitoras adultas multipotentes y células madre hematopoyéticas), tejido adiposo, cartílago, epidermis, folículo piloso, músculo esquelético, músculo cardíaco, intestino, hígado, neuronal. El término "célula madre mesenquimal" o "MSC", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula de estroma multipotente, originada a partir de la capa germinal mesodermal, que puede diferenciarse en una variedad de tipos de células, incluyendo osteocitos (células de hueso), condrocitos (células de cartílago) y adipocitos (células de grasa). Las MSC pueden ser obtenidas a partir de, sin quedar limitado a, médula ósea, tejido adiposo (tal como el tejido adiposo subcutáneo), hígado, bazo, testículos, sangre menstrual, fluido amniótico, páncreas, periostio, membrana sinovial, músculo esquelético, dermis, pericitos, hueso trabecular, cordón umbilical humano, pulmón, pulpa dental y sangre periférica. Las MSC de acuerdo con la invención pueden obtenerse a partir de cualquiera de los tejidos anteriores, tal como a partir de médula ósea, de tejido adiposo subcutáneo o de cordón umbilical.

Si se desea, la célula madre activada de la invención puede ser modificada genéticamente por cualquier método convencional incluyendo, a modo ilustrativo, no limitativo, procesos de transgénesis, deleciones o inserciones en su genoma que modifiquen la expresión de genes que sean importantes para sus propiedades básicas (proliferación, migración, diferenciación, etc.), o mediante la inserción de secuencias de nucleótidos que codifiquen proteínas de interés como, por ejemplo, proteínas con propiedades terapéuticas. Por tanto, en otra realización preferida, la célula madre activada de la invención ha sido modificada genéticamente.

En una realización particular de la invención, las células madre mesenquimales son obtenidas a partir de cordón umbilical, preferiblemente de cordón umbilical humano. Otra realización preferida de este aspecto de la invención se refiere a una población celular aislada, de ahora en adelante población celular de la invención, que comprende al menos una célula madre de la invención. En una realización preferida la población celular de la invención comprende al menos un 20%, preferiblemente un 40%, y aún más preferiblemente un 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, o un 99% de células madre adultas de la invención.

El término "aislada" indica que la célula o la población celular de la invención a la que se refiere, no se encuentran en su ambiente natural. Esto es, la célula o la población celular ha sido separada de su tejido circundante. Las células madre activadas de la invención, así como las células presentes en la población celular de la invención, pueden ser células de autólogo, alogénico o xenogénico. En una realización particular, dichas células son de origen autólogo, reduciendo así las complicaciones potenciales asociados con / o respuestas antigénicas e inmunogénicas de dichas células cuando se administran al individuo.

COMPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN

La célula madre aislada activada de la invención, o la población celular de la invención, pueden formar parte de una composición. Por tanto, un tercer aspecto de la invención se refiere a una composición, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende al menos una célula madre activada de la invención. En una realización preferida de este aspecto la composición de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida de este aspecto la composición de la invención además comprende otro principio activo.

Preferiblemente, la composición de células de la invención tiene, al menos, el 50%, al menos, el 60%, preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, aún más preferiblemente, el 90%, y, todavía aún más preferiblemente, el 95% de las células madre aisladas activadas de la invención.

Dicha composición de células adultas de la invención puede contener un medio en el que se encuentran las células de la invención; dicho medio debe ser compatible con dichas células. Por ejemplo, pero sin limitarse, soluciones isotónicas, opcionalmente suplementadas con suero; medios de cultivo celular o, alternativamente, un medio soporte sólido, semisólido, gelatinoso o viscoso. La composición de la invención, preferiblemente, es una composición farmacéutica para su administración a un sujeto.

El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo que debe estar aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal o enumerado en la Farmacopea Estadounidense o la Farmacopea Europea, u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más concretamente en humanos.

El término "vehículo" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se deben administrar las células o la población celular de la invención o de dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención; obviamente, dicho vehículo debe ser compatible con dichas células. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dicho vehículo incluyen cualquier vehículo fisiológicamente compatible, por ejemplo, soluciones isotónicas (por ejemplo, solución salina estéril al 0,9% NaCI, solución salina tamponada con fosfatos (PBS), solución Ringerlactato, etc.), opcionalmente suplementadas con suero, preferiblemente con suero autólogo; medios de cultivo celular (por ejemplo, DMEM, etc.); o, alternativamente, un medio soporte sólido, semisólido, gelatinoso o viscoso, tal como colágeno, colagen-glicosamino-glicano, fibrina, cloruro de polivinilo, poliaminoácidos, tales como polilisina, o poliornitina, hidrogeles, agarosa, sulfato de dextrano silicona. Asimismo, si se desea, el medio de soporte puede, en realizaciones específicas, contener factores de crecimiento u otros agentes.

Si el soporte es sólido, semisólido, o gelatinoso, las células pueden ser introducidas en una fase líquida del vehículo que es tratada posteriormente de forma tal que se convierte en una fase más sólida.

La composición farmacéutica de la invención, si se desea, puede contener también, cuando sea necesario, aditivos para aumentar, controlar o dirigir de otro modo el efecto terapéutico deseado de las células, los cuales comprenden dicha composición farmacéutica, y/o sustancias auxiliares o sustancias farmacéuticamente aceptables, tales como agentes tamponantes, tensioactivos, codisolventes, conservantes, etc. También, para estabilizar la suspensión celular, es posible añadir quelantes de metales. La estabilidad de las células en el medio líquido de la composición farmacéutica de la invención puede mejorarse mediante la adición de sustancias adicionales, tales como, por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, etcétera. Dichas sustancias farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en la composición farmacéutica de la invención son conocidas, en general, los técnicos en la materia y se usan normalmente en la elaboración de composiciones celulares.

Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E.W. Martin. Puede encontrarse información adicional sobre dichos vehículos en manuales de tecnología farmacéutica (Farmacia Galénica). Como se emplea aquí, el término "principio activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" o "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

En otra realización preferida, el principio activo se selecciona de la lista que consiste en: un inhibidor de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP); un radiosensibilizador como el nitroimidazol; un factores de crecimiento o GF (del inglés, "growth factor"); un agente dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE); un anticuerpo radiomarcado; un resto de direccionamiento; agentes quimioterapéuticos, que incluyen, pero sin limitarse, compuestos que inducen la apoptosis, compuestos que reducen la vida útil o compuestos que hacen que las células sensibles al estrés; bacterias, modificadas o no genéticamente; o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, el principio activo es un inhibidor de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP).

En otra realización más preferida de este aspecto de la invención, el principio activo es un factor de crecimiento. Más preferiblemente, el factor de crecimiento es un factor estimulante de colonias de granulocitos o G-CSF (por sus siglas en inglés Granulocyte colony-stimulating factor), y aún más preferiblemente, lenograstim y/o filgrastim.

PREPARACIÓN COMBINADA DE LA INVENCIÓN

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a una preparación combinada, de ahora en adelante preparación combinada de la invención, que comprende:

a) un componente A que es una célula madre activada de la invención

En una realización preferida de este aspecto la preparación combinada de la invención además comprende al menos un inhibidor de PARP (poli (ADP-ribosa) polimerasa). Tanto el componente A, como el componente B, o cualquier otro componente, pueden estar dispuestos para ser administrados a un sujeto de manera simultánea, combinada o secuencial en un tratamiento.

A modo de ejemplo no limitativo, pueden formar parte de los componentes de la invención, como principio activo: un inhibidor de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP); un radiosensibilizador como el nitroimidazol; un factores de crecimiento o GF; un agente dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE); un anticuerpo radiomarcado; un resto de direccionamiento; agentes quimioterapéuticos, que incluyen, pero sin limitarse, compuestos que inducen la apoptosis, compuestos que reducen la vida útil o compuestos que hacen que las células sensibles al estrés; bacterias, modificadas o no genéticamente; o cualquiera de las combinaciones de los principios activos mencionados.

USOS MÉDICOS DE LA INVENCIÓN

Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso de una célula madre activada de la invención, de una composición de la invención, o de la preparación combinada de la invención, en la elaboración de un medicamento. El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es un cáncer, y más preferiblemente es un cáncer sistémico.

La composición farmacéutica de la invención contendrá una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de las células de la invención o de la población celular de la invención, preferentemente, una población celular sustancialmente homogénea, para proporcionar el efecto terapéutico deseado.

Tal como se usa en la presente descripción, el término "cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva" se refiere a la cantidad de células de la invención contenida en la composición farmacéutica que es capaz de producir el efecto terapéutico deseado y, en general, se determinará, entre otros factores, por las propias características de las células y el efecto terapéutico deseado que se persigue. En general, la cantidad terapéuticamente efectiva de células de la invención que debe administrarse dependerá, entre otros factores, de las propias características del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la forma de administración, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben tenerse en cuenta sólo como guía para la persona conocedora de la técnica, que debe ajusfar esta dosis dependiendo de los factores anteriormente descritos. Como ejemplo ilustrativo y no limitativo, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse como una dosis única, que contenga aproximadamente entre 1x10⁵ y 10x10⁶ células de la invención por kilo de peso corporal del receptor, y más preferentemente entre 5x10⁵ y 5x10⁶ células de la 25 invención por kilo del peso corporal del receptor, en una forma de realización más preferente aún dicha composición farmacéutica contendrá aproximadamente entre 1x10⁶ y 2x10⁶ células de la invención por kilo del peso corporal del receptor, dependiendo de los factores descritos anteriormente. La dosis de células de la invención puede repetirse, dependiendo del estado y evolución del paciente, en intervalos temporales de días, semanas o meses que debe establecer el especialista en cada caso.

Un sexto aspecto de la invención se refiere al uso de una célula madre activada de la invención, de una composición de la invención, o de la preparación combinada de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el cáncer es un cáncer sistémico.

MÉTODO DE TRATAMIENTO DE LA INVENCIÓN

b) administrar radioterapia a dosis convencionales siguiendo los protocolos habituales.

En una realización preferida, el paso (b) comprende administrar al paciente una dosis baja de radiación sobre el volumen ocupado por el tumor en una cantidad eficaz (2-6 Gy) para activar las células tumorales y favorecer el tropismo de las células mesenquimales hacia el tumor.

En otra realización preferida, las células madre de la invención son células madre mesenquimales. En otra realización preferida, se pueden hacer nuevas administraciones intravenosas con posterioridad, tanto de células MSC como células MSC* o células madre de la invención, por ejemplo, en los días de pausa de la radioterapia.

En otra realización preferida de este aspecto el primer método de tratamiento del cáncer de la invención además comprende administrar un principio activo como pueden ser: un inhibidor de la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP); un radiosensibilizador como el nitroimidazol; un factores de crecimiento o GF; un agente dirigido al receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE); un anticuerpo radiomarcado; un resto de direccionamiento; agentes quimioterapéuticos, que incluyen, pero sin limitarse, compuestos que inducen la apoptosis, compuestos que reducen la vida útil o compuestos que hacen que las células sensibles al estrés; bacterias, modificadas o no genéticamente; o cualquiera de las combinaciones de los principios activos mencionados.

Aún más preferiblemente otra realización preferida de este aspecto el primer método de tratamiento del cáncer de la invención además comprende administrar al menos un inhibidor de PARP (poli (ADP-ribosa) polimerasa). En otra realización preferida de este aspecto el primer método de tratamiento del cáncer de la invención además comprende administrar al menos un agente quimioterápico y/o un agente antiangiogénico. En otra realización preferida de este aspecto el cáncer es un cáncer sistémico.

a) administrar células madre sin tratar, y

b) administrar radioterapia a dosis convencionales siguiendo los protocolos habituales, y más preferiblemente, a dosis bajas, para activar las células madre en el interior del paciente. En otra realización preferida, entre el paso (a) y el paso (b) de la invención transcurren 24 horas para dejar que las células se bio-distribuyan.

Terapia de radiación

La fuente de energía utilizada para la terapia de radiación se puede seleccionar entre los rayos X o rayos gamma, que son las dos formas de radiación electromagnética. La fuente de energía para la terapia de radiación se puede seleccionar de los haces de partículas, que utilizan en rápido movimiento partículas subatómicas en lugar de fotones. Este tipo de radiación puede ser referido como la radioterapia con haz de partículas o radiación de partículas.

En la presente invención, el término "radiación ionizante" la radiación que comprende partículas o fotones que tienen la energía suficiente o pueden producir suficiente energía a través de las interacciones nucleares para producir la ionización, es decir, la ganancia o pérdida de electrones. La cantidad de radiación ionizante necesaria para matar una célula dada generalmente depende de la naturaleza de esa célula. Medios para determinar una cantidad efectiva de radiación son bien conocidos en la técnica. Se utiliza en el presente documento, el término "una dosis efectiva" de la radiación ionizante significa una dosis de radiación ionizante que produce un aumento en el daño celular. En ciertas realizaciones, la terapia de radiación comprende radiación ionizante, radiación de haz de electrones particularmente. Un haz de electrones puede ser entregado intraoperatoriamente para el sitio del tumor usando un sistema terapéutico de rayos de electrones tal como el descrito en la Patente de EE.UU. N ⁰ 5.418.372 y 5.321.271 la revelación completa de la cual se incorpora aquí por referencia. En realizaciones particulares, el sistema terapéutico de rayos de electrones de la invención proporciona una protección adecuada al tejido sano para los rayos X primarios generados por el sistema, así como para la radiación de dispersión. En realizaciones particulares, la terapia con haz de partículas es la terapia de haz de protones. Los protones depositan su energía en un volumen muy pequeño, que se llama el pico de Bragg. El pico de Bragg se puede utilizar para apuntar a dosis altas de la terapia de haz de protones a un tumor mientras se hace menos daño a los tejidos normales en delante de y detrás del tumor. La terapia de protones es generalmente reservado para los cánceres que son difíciles o peligrosas para tratar con cirugía, como un condrosarcoma en la base del cráneo, o se combina con otros tipos de radiación.

En algunas formas de realización, la terapia de radiación es estereotáctica (o estereotáxica) radiocirugía que utiliza una gran dosis de radiación para destruir el tejido tumoral. En ciertas realizaciones ejemplares, en el que el cáncer está en el cerebro, la cabeza del paciente se puede colocar en un marco especial, que está unido o se monta en el cráneo del paciente. La trama se utiliza para apuntar los haces de radiación de alta dosis directamente en el tumor en la cabeza del paciente. La dosis y el área de recepción de la radiación se coordinan de manera muy precisa lo que resulta en poco daño a los tejidos cercanos. En algunas aplicaciones de estereotaxia, no se necesita un marco para la cabeza. En ciertas formas de realización, los sistemas de formación de imágenes en tiempo real se utilizan en conjunción con el movimiento del acelerador, permitiendo ajustes por ordenador de la trayectoria del acelerador para compensar cualquier movimiento de la cabeza del paciente. Cuando una fuente de terapia de radiación es interna, la energía utilizada en la radiación interna puede provenir de una variedad de fuentes. Por ejemplo, el isótopo radiactivo puede ser yodo radiactivo, por ejemplo, yodo 125 o yodo 131 , estroncio 89, fósforo, paladio, cesio, iridio, fosfato, cobalto, o cualquier otro isótopo conocido en la técnica. En ciertas formas de realización, la radiación interna se administra como braquiterapia, un tratamiento de radiación sobre la base de semillas radiactivas implantadas emisores de radiación de cada semilla.

En ciertos aspectos, la invención comprende los métodos para la planificación de la radioterapia externa con el fin de dirigirse a las células cancerosas y limitar la exposición a las células sanas. En ciertas realizaciones, la planificación de los tratamientos de radiación se lleva a cabo en dos dimensiones (anchura y altura) o tres dimensiones, por ejemplo, con tridimensional (3-D), la terapia con radiación de conformación. En ciertas realizaciones, la radioterapia conformal 3-D utiliza la tecnología informática para permitir a los médicos a determinar con mayor precisión un tumor con rayos de radiación (con anchura, altura y profundidad). Una imagen 3-D de un tumor se puede conseguir mediante tomografía computarizada (TC), imágenes de resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET), o tomografía por emisión de fotón único (SPECT). Utilizando la información de la imagen, los programas de ordenador especiales pueden diseñar los haces de radiación que "se ajusten" a la forma del tumor. En ciertas formas de realización, debido a que el tejido sano que rodea el tumor se libró en gran medida por esta técnica, las dosis más altas de radiación se pueden utilizar para tratar el cáncer. En ciertas formas de realización particulares, la terapia de radiación es la radioterapia de intensidad modulada (IMRT). IMRT es un tipo de terapia conformal 3-D de radiación que utiliza haces de radiación, por ejemplo, los rayos X de diferentes intensidades para suministrar diferentes dosis de radiación a las pequeñas áreas de tejido al mismo tiempo. La tecnología permite la administración de dosis más altas de radiación en el tumor y menores dosis al tejido sano cercano. Algunas técnicas proporcionan una dosis más alta de radiación para el paciente cada día, potencialmente acortando el tiempo total de tratamiento y mejorar el éxito del tratamiento. La IMRT también puede dar lugar a menos efectos secundarios durante el tratamiento. En realizaciones particulares, la radiación se administra por un acelerador lineal que está equipado con un colimador multiláminas (un colimador ayuda a dar forma o esculpir los haces de radiación). El equipo se puede girar alrededor del paciente de manera que los haces de radiación se pueden enviar desde los mejores ángulos. Las vigas se conforman lo más estrechamente posible a la forma del tumor. En ciertas formas de realización, esta tecnología se utiliza para tratar tumores en el cerebro, cabeza y cuello, nasofaringe, de mama, de hígado, de pulmón, de próstata, y el útero.

Inhibidores de PARP

Los inhibidores de PARP son un grupo de los inhibidores farmacológicos de la enzima poli ADP ribosa polimerasa (PARP). Están desarrollados para múltiples indicaciones; la más importante es el tratamiento del cáncer. Varias formas de cáncer son más dependientes de PARP que las células normales, por lo que PARP un objetivo atractivo para la terapia del cáncer. Entre los inhibidores de PARP se encuentran, pero sin limitarse, iniparib (BSI 201), BMN-673, olaparib (AZD-2281), rucaparib (AG014699, PF-01367338), veliparib (ABT-888), CEP 9722, MK 4827, BGB-290, 3-aminobenzamida, o cualquiera de sus combinaciones.

Sensibilizadores de radiación

En algunas formas de realización, la invención proporciona métodos de administración de dosis reducidas de radiación mediante la combinación de radiación intraoperativa con sensibilizadores de radiación. Brown et al. (Int. J. Biol. Oncología Radioterápica. Phys., 2010, 78 (1): 323-327) proporcionan datos de modelos en favor del uso del sensibilizador etanidazol (etanidazol radiosensitizer ET), en combinación con la radioterapia estereotáctica ablativa (SABR). Al calcular el nivel esperado de la muerte celular del tumor después SABR, Brown et al. indican que la administración de ET antes de SABR reducirá la dosis y la frecuencia de irradiación necesaria para tratar tumores y metástasis, especialmente en tumores con altos niveles de hipoxia. Por lo tanto, en realizaciones particulares, la radiación se reduce hasta en un 1 %, hasta 5%, hasta 10%, hasta 15%>, hasta 20%>, hasta 25%>, hasta 30%, hasta al 35%, hasta un 40%, hasta un 45%, hasta el 50%, hasta un 55%, hasta el 60%, hasta un 65%, hasta el 70%, hasta el 75%, hasta un 80%, hasta al 85%, hasta 90%, hasta 95%, y hasta 99% en comparación con la terapia de radiación intraoperativa sin sensibilizadores. Por otra parte, la dosis de radiación en radioterapia intraoperatoria puede reducir en un 25-50% con respecto a la cantidad de radioterapia externa que pueda ser necesaria para tratar la enfermedad sin el sensibilizador. Por consiguiente, la invención también proporciona un método para administrar dosis reducidas de radiación a un paciente mediante la combinación de la IORT, SBRT o SRS con un sensibilizador a la radiación seleccionado de los nitroimidazoles, en el que la radiación se reduce hasta en un 75% con respecto a la terapia de radiación administrada sin sensibilizadores. La terapia de radiación puede ser usada en conjunto con la hipertermia, es decir, el uso de calor. En ciertas realizaciones, la combinación de calor y la radiación puede aumentar la tasa de respuesta de algunos tumores. Un radiosensibilizador se puede administrar en combinación con un agente adicional. Por ejemplo, un nitroimidazol se puede administrar en combinación con un agente adicional tal como un agente de focalización, un agente quimioterapéutico o un segundo radiosensibilizador. Agentes de direccionamiento incluyen cualquier agente adecuado para atacar a las células cancerosas, tales como anticuerpos. Nitroimidazol puede estar unido a la agente de dirección a través de enlaces covalentes o no covalentes archivos adjuntos. Por ejemplo, los nitroimidazoles, tales como 2-nitroimidazoles, pueden estar unidos a un agente de dirección a través de un enlazador tal como un enlazador biodegradable. Alternativamente, los nitroimidazoles pueden estar unidos a un agente de dirección a través de interacciones iónicas. En ciertas realizaciones, el radiosensibilizador y el agente adicional puede ser envuelto dentro de un liposoma. Otros sensibilizadores de radiación son, pero sin limitarnos, misonidazol, metronidazol, tirapazamina, trans sodium crocetinato, o cualquiera de sus combinaciones. Anticuerpos y Anticuerpos radiomarcados

La radiación puede ser administrada directamente al cáncer y potenciada mediante anticuerpos y/o mediante el uso de anticuerpos radiomarcados, es decir, la radioinmunoterapia.. Algunas células tumorales contienen antígenos específicos que desencadenan la producción de anticuerpos específicos de tumores. Grandes cantidades de estos anticuerpos se pueden producir en el laboratorio y se unen a las sustancias radiactivas, un proceso conocido como radiomarcaje. Una vez inyectado en el cuerpo, los anticuerpos buscan células cancerosas, que se destruyen por la radiación. Este enfoque puede reducir o minimizar el riesgo de daño de la radiación a las células sanas. En ciertas formas de realización, los tratamientos de radioinmunoterapia se seleccionan de ibritumomab tiuxetan (Zevalin ®) y el tositumomab y yodo 131 tositumomab (Bexxar ®). La radioinmunoterapia puede ser utilizada en el tratamiento de adultos avanzado de linfoma no Hodgkin (NHL). En ciertas realizaciones, la inmunoterapia se utiliza en el tratamiento de cánceres como la leucemia, el LNH, el cáncer colorrectal, y cáncer de hígado, pulmón, cerebro, próstata, tiroides, mama, ovario y páncreas.

Elementos de direccionamiento

En ciertas formas de realización, las células u otros agentes de la invención están asociados con un elemento de direccionamiento. El elemento de direccionamiento puede estar unido covalentemente a la nitroimidazol, o asociado con el nitroimidazol aunque las fuerzas no covalentes, tales como enlaces iónicos, enlaces de hidrógeno, o través de la encapsulación dentro de un liposoma. El elemento de direccionamiento, que asiste a la célula de la invención u otro agente en la localización de una región diana particular, entrar en una célula (s) del tumor diana, y / o la localización dentro de o proximal a la célula, se puede seleccionar sobre la base del tipo de células particular que se va dirigido. El elemento de direccionamiento puede comprender además cualquiera de un número de entidades químicas diferentes. En una realización, el elemento de direccionamiento es una molécula pequeña. Las moléculas que pueden ser adecuados para el uso como restos de direccionamiento en la presente invención incluyen haptenos, epítopos y fragmentos de dsDNA y análogos y derivados de los mismos. Tales elementos se unen específicamente a anticuerpos, fragmentos o análogos de los mismos, incluyendo miméticos (por haptenos y epítopos), y las proteínas de dedos de zinc (para fragmentos de ADN de doble cadena). Nutrientes cree que desencadenan la endocitosis mediada por receptor y restos de direccionamiento, por lo tanto útiles incluyen biotina, ácido fólico, riboflavina, carnitina, inositol, ácido lipoico, niacina, ácido pantoténico, tiamina, piridoxal, ácido ascórbico, y el lípido soluble en vitaminas A, D, E y K. Otro tipo ejemplar de resto que elige diana de molécula pequeña incluye lípidos esteroideos, tales como el colesterol y las hormonas esteroideas, tales como estradiol, testosterona, etc.

Elementos de direccionamiento también pueden comprender una o más proteínas. Los tipos particulares de proteínas se pueden seleccionar sobre la base de características conocidas de la zona diana o células diana. Por ejemplo, la sonda puede ser un anticuerpo monoclonal o policlonal, donde un antígeno correspondiente se muestra en el sitio diana. En situaciones en las que un determinado receptor se expresa por las células diana, el elemento de direccionamiento puede comprender una proteína o ligando peptidomimético capaz de unirse a ese receptor. Proteínas ligandos de receptores de la superficie celular conocidos incluyen lipoproteínas de baja densidad, transferrina, insulina, enzimas fibrinolíticas, anti-HER2, proteínas de unión a plaquetas tales como anexinas, y modificadores de respuesta biológica (incluyendo interleuquina, interferón, eritropoyetina y factor estimulante de colonias). Una serie de anticuerpos monoclonales que se unen a un tipo específico de células se han desarrollado, incluyendo anticuerpos monoclonales específicos para los antígenos asociados a tumores en humanos. Entre los muchos anticuerpos monoclonales tales que pueden ser utilizados son anti-TAC, u otros anticuerpos de receptores de interleuquina-2; 9.2.27 y NR-ML-05 a la 250 kilodaltons proteoglicano asociado al melanoma humano; y NR-LU-10 a una glicoproteína pancarcinoma. Un anticuerpo empleado en la presente invención puede ser una molécula intacta (completa), un fragmento de la misma, o un equivalente funcional de la misma. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo son F (ab ') 2, Fab', Fab, y fragmentos Fv, que se puede producir por métodos convencionales o por ingeniería genética o de proteínas.

Otros elementos de direccionamiento preferidos incluyen azúcares, por ejemplo, glucosa, fucosa, galactosa, mañosa, que son reconocidos por receptores específicos de la diana. Por ejemplo, algunas construcciones pueden ser glicosilados con residuos de mañosa, por ejemplo, que se adjunta como C-heterósidos a un nitrógeno libre, para producir construcciones específicas y con mayor afinidad de unión a los tumores que expresan receptores de mañosa, por ejemplo, glioblastomas y gangliocitomas y bacterias, que también se sabe que expresan receptores de mañosa (Bertozzi, CR y MD Bednarski Carbohydrate Research 223:243 (1992); J. Am. Chem. Soc. 1 14:2242,5543 (1992)), así como potencialmente otros restos infecciosas. Ciertas células, como las células malignas y las células de la sangre (por ejemplo, A, AB, B, etc) muestran carbohidratos particulares, para los cuales una lectina correspondiente puede servir como un elemento de direccionamiento. Agentes quimioterapéuticos

En ciertas realizaciones, se pueden administrar agentes quimioterapéuticos conjuntamente con las células, composiciones o preparaciones combinadas de la invención. Los agentesquimioterapéuticos incluyen, pero sin limitarse a, aquellos compuestos con actividad anti-cáncer, por ejemplo, compuestos que inducen la apoptosis, compuestos que reducen la vida útil o compuestos que hacen que las células sensibles al estrés e incluyen: aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, asparaginasa, Beg, bicalutamida, bleomicina, buserelina, busulfán , campothecin, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clodronato, colchicina, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, dienestrol, dietilestilbestrol, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, estradiol, estramustina, etopósido, exemestano, filgrastim , fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximesterona, flutamida, gemcitabina, la genisteína, goserelina, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, imatinib, el interferón, irinotecan, irinotecán, el letrozol, la leucovorina, leuprolide, levamisol, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalán, mercaptopurina , mesna, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, nocodazole, octreotida, oxaliplatino, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, porfímero, procarbazina, raltitrexed, rituximab, estreptozocina, suramina, tamoxifeno, temozolomida, tenipósido, testosterona, tioguanina, tiotepa, dicloruro de titanoceno, topotecán, trastuzumab, tretinoína, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, o cualquiera de sus combinaciones.

Estos agentes quimioterapéuticos se pueden clasificar por su mecanismo de acción, pero sin limitarnos, en, por ejemplo, los grupos siguientes: agentes anti-metabolites/anti-cancer, tales como análogos de pirimidina (5-fluorouracilo, floxuridina, capecitabina, gemcitabina y citarabina) y análogos de la purina, folato antagonistas e inhibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina y 2-clorodeoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos / antimitóticos, incluyendo productos naturales tales como alcaloides de la vinca (vinblastina, vincristina, y vinorelbina), disruptores de microtúbulos tales como taxanos (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas, y navelbina, epidipodophyllotoxms (tenipósido), agentes que dañan el ADN (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, busulfán, camptotecina, carboplatino, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, Cytoxan, dactinomicina, daunorubicina, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, hexametilmelamina, oxaliplatino, ifosfamida, melfalán, merchlorethamine, mitomicina, mitoxantrona, nitrosourea, paclitaxel, plicamicina, procarbazina, tenipósido, trietilentiofosforamida y etopósido (VP 16)); antibióticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina , (mitramicina) y mitomicina; enzimas (L-asparaginasa que metaboliza sistémicamente la L-asparagina y priva a las células que no tienen la capacidad de sintetizar su propia asparagina); antiagregantes plaquetarios; agentes alquilantes antiproliferativos / antimitoticos tales como mostazas de nitrógeno (mecloretamina, ciclofosfamida y análogos, melfalán, clorambucil), etileniminas y metilmelaminas (hexametilmelamina y tiotepa), sulfonatos de alquilo (busulfán), nitrosoureas (carmustina (BCNU) y análogos, estreptozocina), trazenes (por ejemplo, dacarbazinina (DTIC)); antimetabolitos antiproliferativos / antimitoticos tales como análogos de ácido fólico (metotrexato); complejos de coordinación de platino (cisplatino, carboplatino), procarbazina, hidroxiurea, mitotano, aminoglutetimida; hormonas, análogos de hormonas (estrógeno, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) y los inhibidores de la aromatasa(letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sales de heparina sintética y otros inhibidores de trombina); agentes fibrinolíticos (tales como activador de plasminógeno tisular, estreptoquinasa y uroquinasa), aspirina, inhibidores de la COX-2, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratorio; agentes antisecretores (breveldina); inmunosupresores (ciclosporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), azatioprina, micofenolato mofetilo); compuestos anti-angiogénicos (TNP-470, genisteína) y inhibidores de factores de crecimiento (factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) inhibidores, inhibidores de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) inhibidores); bloqueador del receptor de la angiotensina; donadores de óxido nítrico; oligonucleótidos antisentido; anticuerpos (trastuzumab); inhibidores del ciclo celular e inductores de diferenciación (tretinoína); inhibidores de mTOR, inhibidores de la topoisomerasa (doxorubicina (adriamicina), amsacrina, camptotecina, daunorubicina, dactinomicina eniposide, epirubicina, etopósido, idarrubicina, irinotecan (CPT-1 1) y la mitoxantrona, topotecan, irinotecan), corticosteroides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona , prednisona y prednisolona); inhibidores de quinasa de transducción de señales del factor de crecimiento; Los inductores de la disfunción mitocondrial y activadores de caspasas; disruptores cromatina.

Radioprotectores

También pueden administrarse radioprotectores a un paciente en combinación con las células, composiciones o preparaciones combinadas descritas en el presente documento. Los radioprotectores son fármacos que protegen a las células normales (no cancerosos) de los daños causados por la radioterapia. Estos agentes promueven la reparación de las células normales que están expuestas a la radiación. Radioprotectores ejemplares incluyen amifostina (nombre comercial Ethyol ®).

En ciertas realizaciones, los métodos de la invención comprenden además la administración de una bacteria tal como la salmonela o variantes de ingeniería genética de los mismos.

Los sensibilizadores de radiación se pueden formular de una manera convencional usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente aceptables. Por ejemplo, pueden formularse para la administración mediante, por ejemplo, inyección (por ejemplo subcutánea, intramuscular, intraparenteral), inhalación o insuflación (ya sea a través de la boca o de la nariz) o administración oral, bucal, sublingual, transdérmica, nasal, parenteral o rectal. En una forma de realización, un compuesto de la invención se puede administrar localmente, en el sitio donde están presentes las células tumorales, es decir, en una específica de tejido, órgano o fluido (por ejemplo, sangre, líquido cefalorraquídeo, etc.)

Típicamente, los compuestos de la invención se administran por vía intravenosa. La frase "farmacéuticamente aceptable" o "fisiológicamente aceptable" se emplea aquí para referirse a aquellos ligandos, materiales, composiciones, y / o formas de dosificación que son, dentro del alcance del juicio médico, son adecuadas para uso en contacto con los tejidos de humanos seres y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio / riesgo razonable.

Sensibilizadores de radiación de la invención pueden formularse para una variedad de modos de administración. Las técnicas y formulaciones generalmente se pueden encontrar en Remington Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. La notación decimal empleada en el presente documento utiliza el símbolo "," para separar unidades de decimales.

EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN

Se describe a continuación un ejemplo de la invención haciendo referencia a las figuras adjuntas. EJEMPLO 1. Ensayos in vitro

Los ensayos realizados ponen de manifiesto que la activación de células tumorales y mesenquimales con radiación induce la expresión de TRAIL y su receptor DR5 y que la forma soluble de TRAIL se secreta al espacio extracelular en el que las células han sido irradiadas; además, la irradiación de células MSC con una dosis de 2 Gy induce DKK3. El efecto de la radiación sobre la expresión de TRAIL es claramente superior en las células MSC-UCSSCs que en las tumorales (Figuras 1 a 4) y la actividad del medio de cultivo procedente de la incubación durante 24 o 48 horas de células MSC irradiadas con 2 Gy es evidente.

Como consecuencia de la inducción de TRAIL y DKK3 tras irradiación las moléculas de estas proteínas son secretadas al medio de cultivo donde pueden ser cuantificadas como las formas solubles TRAIL (sTRAIL) y DKK3 (Fig. 5 y 6). Nuestros experimentos demuestran el espectacular efecto de UCSSCs-RCM usado como tratamiento reiterado de colonias de A375 y colonias de G361 (Fig. 7). El estudio cuantitativo de las colonias de A375 y G361 en los experimentos de cinética del crecimiento tumoral bajo tratamiento con UCSSCs-RCM pone de manifiesto que en las colonias tratadas la pérdida celular es del orden del 50% de la que existe en los experimentos de crecimiento en condiciones control.

Además como es conocido que la actividad tumor-supresora de las células MSC, cuando se activan con TNF-α, se debe fundamentalmente a la expresión, en estas células, de altos niveles de la forma de TRAIL enlazado a la membrana celular (Lee et al. 2012, Cell Stem Cell, 2012. 11 (6): p. 825-35) en los experimentos se ha comprobado, mediante el enzimo-ensayo de TRAIL en célula completa, que la radiación induce no solo la secreción de TRAIL y DKK3 al medio sino que también aumenta la expresión, en cantidades relevantes, de la forma molecular de TRAIL-transmembrana que permanece unida en la célula (Fig. 5 y 6). Los experimentos de co-cultivo de células tumorales y MSC irradiadas o sin irradiar nos han demostrado la mayor actividad tumor-supresora de las células UCSSCs cuando dichas células han sido previamente irradiadas con baja dosis de radiación, 2 Gy (Tabla 1). El análisis de los datos resumidos en la Tabla 1 permite concluir que el tratamiento de modelos tumorales con MSC ocasiona un retraso del crecimiento de los modelos de tumor conseguidos a partir de cualquiera de las tres líneas celulares estudiadas G361 , A375 o MCF7. Este retraso del crecimiento resulta ser función de la activación tanto de las células MSC como de las células tumorales puesto que la radiación induce TRAIL en las MSC mientras que induce también la expresión del receptor de TRAIL (DR5) en las células tumorales. Este mecanismo explica el hecho de que en los experimentos en los que tanto las células MSC-UCSSCs como las células tumorales han sido irradiadas el incremento de componente celular (o "up-regulation') de ambos genes conduzca al incremento de la muerte celular (Tablal).

Tabla 1. Parámetros de la cinética de crecimiento de tumores experimentales in vitro en condiciones Control y tras distintos tratamientos.

Además, puesto que tras la irradiación de MSC las formas solubles de las proteínas TRAIL y DKK3 se secretan al medio extracelular, las células MSC pueden ser consideradas como células "medicinales" (Caplan, A.l. & Correa, D. 201 1. Cell stem cell 9, 1 1-15); además, aceptando que entre las características funcionales de las células MSC está su tropismo - como determinante para alcanzar los lugares del cuerpo en los que existen lesiones- y su capacidad inmunomoduladora (Ranganath, et al., 2012. Cell stem cell 10, 244-258) entendemos que las MSC inyectadas en el organismo puede actuar como "almacenes de productos farmacéuticos", y estas células se pueden emplear en procedimientos de terapia celular como complemento de la radioterapia, puesto que, una vez activadas con radiación se convierten en fuente de citocinas y proteínas tumor-supresor citotóxicas para las células tumorales lo cual puede suponer una importante mejora de la eficacia biológica de la radiación sobre los tumores. Estos datos aparecen como coeficiente MSC-ER en la Tabla 1. Además, los resultados de los ensayos sugieren que el tratamiento con radiación más MSC podría ser usado como una estrategia para conseguir la radiosensibilización de los tumores. Desde un punto de vista teórico el papel adyuvante de las MSC a la radioterapia podría ser pensado como una herramienta capaz de incrementar el peso del segundo factor {entre corchetes} de nuestro modelo matemático de acción biológica de la radiación sobre los tumores, aumentando a través de la potenciación del mecanismo bystander la probabilidad de muerte celular (Gómez-Millán et al., 2012. Journal of the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology 102, 450-458; Lara et ai, 2013, Cáncer Letters, 2015. 356: p. 5-16)

En la ecuación anterior S es la fracción de supervivencia, D la dosis, α y β los coeficientes del modelo lineal-cuadrático, χ representa la muerte celular producida por efecto bystander, xmax la máxima probabilidad de muerte producida por efecto bystander para la dosis D, y KBy la constante de asociación entre el receptor de muerte y su ligando. Y esto es biológicamente concebible porque con las células MSC activadas con radiación conseguimos liberar en el seno del tumor las moléculas de TRAIL y DKK3 que actúan como proteínas pro-apoptóticas in situ. Además, la radiación aplicada al tumor induce el incremento de la expresión en sus células de receptores de muerte celular -como DR5-. De esta manera desde el punto de vista teórico, entendemos justificado este efecto. Los datos muestran que se trata de una herramienta terapéutica aplicable al tratamiento sistémico de tumores avanzados.

La combinación RT+MSC puede ser una inmejorable combinación para el tratamiento del cáncer por cuanto:

i) La radioterapia es uno de los dos tratamientos más eficaces contra el cáncer y más de la mitad de pacientes reciben radioterapia en algún momento de la evolución de su proceso neoplásico;

ii) el conocimiento del papel de las MSC en el tratamiento oncológico está aumentado de manera continuada y se sabe que las MSC se incorporan al estroma tumoral y que esta capacidad de integrase en el tumor aumenta cuando el proceso neoplásico está siendo tratado con radioterapia

iii) la activación de MSC con 2 Gy (dosis que se ajusta a las más comúnmente utilizadas en oncología radioterápica) induce la expresión de TRAIL y DKK3 y las proteínas que estos genes codifican incrementan su concentración intracelular y se liberan al espacio extracelular donde pueden identificarse de manera cuantitativa (Fig. 5 y 6). La expresión de DKK3 se encuentra significativamente disminuida, o ausente, en muchos tumores experimentales (líneas celulares tumorales, en nuestro caso en la línea celular MCF-7) y clínicos (Tsuji et al. 2000. Biochem. Biophys. Res. Commun. 268, 20-24). La ausencia de expresión del gen se asocia con la hipermetilación de su promotor. Se sabe que

REIC/DKK3 interfiere con la ruta de señalización de Wnt vía receptores de Wnt a través de la cual juegan diferentes papeles en la inducción de apoptosis y la inhibición del proceso metatásico y se ha demostrado que en células modificadas para expresar REIC/DKK3 utilizando el adenovirus vector (Ad-REIC) se produce estrés en el sistema retículo endoplasmático (ER) y se ponen en marcha mecanismos de apoptosis específicos en células de cáncer humano tanto de próstata como de pulmón (Shien, K., et al., 2014. PloS one 9, e879004). De ello se entiende que la liberación de DKK3 que se produce cuando las células MSC-UCCSCs se incorporan al tumor y son activadas mediante radiación podría ser una estrategia útil en la búsqueda de la respuesta anti- tumoral de las células malignas.

iv) Los ejemplos de la invención han permitido demostrar el significativo incremento en la expresión de la forma de la proteína TRAIL-transmembrana cuando las células MSC se tratan con dosis de 2 Gy de radiación ionizante de bajo LET. Considerando el natural tropismo de las células MSCs hacia los tumores, una terapia adecuada sería inyectar células MSCs durante las pausas en que se interrumpe el tratamiento diario con radiación (fines de semana en el curso de un tratamiento estándar de radioterapia por cáncer). Una vez inyectadas, la células se acumularían en el entorno del volumen corporal sometido a tratamiento (Kim, S.M., et al., 2010, Stem cells 28, 2217-2228) con lo que al término del descanso, entre semanas de tratamiento, la subsiguiente irradiación del tumor activaría las células MSC integradas en el volumen terapéutico, y allí convertidas en fuentes de citocinas y proteínas tumor-supresoras contribuirían a incrementar los efectos de la radioterapia antitumoral a través de la potenciación de los efectos de vecindad de corto y largo alcance. Con este procedimiento sería posible evitar las complejidades y los peligros que supone la utilización de células MSC genéticamente modificadas con vectores virales para expresar TRAIL o DKK3 o la activación de estas células con moléculas con importantes efectos secundarios, como es el TNFa. Y esto es así puesto que la radiación que se utilizaría sería la misma que se utiliza de manera normal en los tratamientos en oncología radioterápica y el producto que se añadiría: "MSC activadas mediante radiación", se conseguiría bien antes de la irradiación terapéutica del paciente, bien durante el curso de la misma. Dispondríamos así dentro del tumor de células MSC medicinales de las que, activadas con radiación, se liberarían moléculas con actividad biológica capaz de actuar reforzando las funciones inmunológicas tumor-supresoras dentro del núcleo del propio tumor. Además, no podemos dejar de subrayar que las formas solubles de las moléculas de sTRAIL y DKK3 pueden, vía circulación linfática o sanguínea, alcanzar localizaciones distales de células tumorales contribuyendo así a potenciar los efectos sistémicos de la radioterapia si esta forma de terapia célula se utiliza conjunta y racionalmente con la radioterapia clínica.

EJEMPLO 2. Ensayo in vivo

Para los ensayos in vivo se emplearon ratones con tumores implantados en la parte superior de cada una de las patas traseras. Se utilizaron ratones NOD/SCID de 7 a 9 semanas de edad que fueron inoculados con células de cáncer de mama humano (A375, G361 o MCF-7).

Se incluyeron en el estudio grupos de 6 a 8 ratones que fueron tratados con: Radioterapia, Terapia Celular con células MSC, Radioterapia mas MSC, y no sometidos a ningún tratamiento (Grupo Control).

Todos los experimentos han sido realizados de acuerdo con las recomendaciones de la Guía de Cuidados y Usos para animales de laboratorio del Comité de Bioética de la Universidad de Granada y los protocolos fueron también aprobados por el Comité de ética para animales de experimentación del CSIC.

Las células fueron inoculadas en los pliegues de la piel dorsal de los ratones NOD/SCID mice (1-3- 10⁶ células en 0,1 mi de suero salino sobre cada una de las patas traseras del ratón). Los ratones fueron monitorizados cada 2-3 días midiendo dos diámetros perpendiculares de cada uno de los tumores. El volumen tumoral se calculó usando la fórmula v = (π/6)(α² · b) donde a y b son los valores del diámetro y del diámetro menor respectivamente. Se seleccionaron ratones con tumores superiores a 64 mm³ para los experimentos siguientes:

Ensayo in vivo (I) Radioterapia En este experimento los ratones anestesiados con ketamina fueron tratados con una dosis de 3 Gy. La radiación fue administrada mediante un tubo de Rayos X (YXLON, model Y, Tu 320- D03) usando un voltaje de 240,4 kV, y trabajando con una corriente de 13,0 mA, con un filtro de 0,32 mm Cu, un foco de irradiación de 5 mm de diámetro, estando el tumor situado a una distancia de 10 cm, siendo el campo de irradiación un círculo de 0,78 cm², y utilizando un ritmo de administración de la dosis de 1502 ± 0,3 mGy/min. El tumor del ratón se colocó en el orificio practicado sobre una hoja de acero de 8 mm de espesor que fue utilizada como blindaje del resto del cuerpo del ratón. La dosis de radiación que alcanza cualquier región del cuerpo del ratón situada a más de 20 mm del centro del orificio que se utilizó para permitir que la radiación alcanzara el tumor fue igual o inferior a 2,0 ± 0,4 mGy /min. Esta tasa de dosis permite calcular que la dosis recibida por el ratón en cualquier lugar de su cuerpo incluyendo el tumor contra lateral fue inferior a 4,0 mGy.

El tratamiento fue repetido cada semana hasta completar tres a cinco semanas (según el experimento realizado). Después de la última dosis se continuó el estudio de los ratones durante 7 días más. Los ratones del grupo control no recibieron RT ni terapia con células MSC.

La pérdida de células tumorales derivada de cada tratamiento se calcula utilizando la ecuación propuesta por (Steel, Eur J Cáncer, 1967. 3(4): p. 381-7). Obviamente la fracción de células supervivientes es: (S_F = 1 - C_L). El valor de supervivencia celular esperado para la combinación terapéutica RT + MSC se calcula multiplicando la S_F después de RT por la S_F después de terapia con MSC. El valor observado para la combinación (O) resulta de aplicar la ecuación de Steel a los datos observados para el experimento. El modelo aditivo (Valeriote and Lin, Cáncer Chemother Rep, 1975. 59(5): p. 895-900) predice que si los tratamientos combinados muestran efectos aditivos cuando la relación O/E = 0,8-1 ,2; los efectos son subaditivos o antagónicos cuando O/E > 1 ,2, y se dice que la combinación terapéutica tiene efectos sinérgicos cuando la relación O/E < 0,8. Los resultados obtenidos (Figura 9) nos permiten concluir que en las tres líneas celulares tumoral ensayadas in vivo el crecimiento tumoral muestra un patrón ajustable al modelo de crecimiento exponencial; que la radioterapia produce un efecto citoreductor que se traduce por el enlentecimiento del crecimiento del tumor y que el efecto bystander medido sobre el tumor contralateral (no-irradiado) es también claramente manifiesto en los experimentos in vivo. Además, en esa misma figura puede observarse que, tras la inyección de células mesenquimales (día 20 de experimento), hay un cambio notorio en la cinética del crecimiento de los tumores puesto que el volumen medido para ellos los días 21 y 22 se aleja claramente de lo que la función del crecimiento tumoral encontrada para ellos (líneas discontinuas en la figura) predice. Estadísticamente, las tres curvas que se incluyen en la figura 9 son diferentes (P < 0,0001). Consecuentemente conocidos los tiempos de duplicación de volumen de cada una de ellas Control T_D = 4.27 (95% Cl: 4, 13 to 4,41); Tratamiento con RT T_D = 10,55 (95% Cl: 10,21 to 10,92) y crecimiento de los tumores contralaterales al irradiado (Bystander) T_D = 5.07 (95% Cl: 4,82 to 5,33). Con estos datos se puede calcular que la pérdida celular para el tratamiento con radioterapia es mayor del 55% y que la irradiación del tumor situado en el foco de tratamiento produce, en el tumor no-irradiado, una pérdida celular por efecto bystander del orden del 15%.

Ensayo in vivo (II) Radioterapia + MSCs

Los resultados anteriores han sido confirmados mediante un experimento en el que se ha estudiado el papel de las células MSCs como agentes supresores de tumores cuando se utilizan aisladamente o cuando se las usa en combinación con la radioterapia (Fig. 10). Para ello hemos utilizado un total de 32 ratones en los que se implantaron 3- 10⁶ células G361 en la parte superior de cada una de las dos patas traseras del animal. Cuando los tumores alcanzaron el tamaño de 64 mm³ se establecieron los siguientes grupos: Grupo Control (8 ratones, 16 tumores); Grupo MSC (16 ratones con tumores G361 , 32 tumores) todos ellos fueron tratados con inyecciones intraperitoneales de 10⁶ MSC administradas cada siete días durante 4 semanas sucesivas. Al día siguiente al primer tratamiento la mitad del grupo, (8 ratones, 16 tumores, 8 de ellos irradiados) fueron aleatoriamente seleccionados para ser irradiados de la misma manera que se ha descrito en el párrafo anterior. La combinación terapéutica MSC + RT 3 Gy se continuó durante tres semanas más. Los otros 8 siguieron siendo tratados sólo con MSC durante las tres semanas adicionales.

Durante los intervalos entre cada sesión de tratamiento todos los ratones incluidos en los grupos: Control, Radioterapia, terapia con MSC y Radioterapia mas MSC, fueron seguidos para controlar el tamaño del tumor presente en cada uno de sus flancos y tener datos suficientes para calcular la cinética del crecimiento de cada tumor en función del tiempo y en función de las variables terapéuticas. Los datos correspondientes a este experimento se muestran en la Figura 10 y la evolución de los tumores en la Figura 11. Los valores correspondientes a los tiempos de duplicación de volumen de cada una de las series de tumores seguidas han permitido calcular las pérdidas celulares derivadas de cada condición experimental en relación con el crecimiento del Grupo Control. Nótese que en la gráfica se marca con una línea azul el día del tratamiento con MSC y con una línea roja el día del tratamiento con RT.

Parámetro Control MSC RT 3Gy Bys RT+ SC

RT RT + MSC Bys

T_D (días) 6,13 6,69 1 1 ,55 9,03 22, 13 9,88

C_L (%) 0,0 8,3 46,9 32, 1 72,3 38,0

MSC-ER 1 0,68 1 ,5 0,81

S_F (%) 100,0 91 ,7 53, 1 67,9 27,7 62,0

O/E 0,57 Tabla 2. Valores representativos de la cinética de crecimiento tumoral tras RT, MSC y RT + MSC

Aplicando el modelo aditivo los resultados experimentales demuestran concluyentemente que la combinación RT + MSC tiene efecto sinérgico (O/E = 0,57) y que potencia la acción de la RT en un factor de 1 ,5.

También resulta claro que, para en el modelo utilizado, las células mesenquimales son tumor- supresoras disminuyendo la supervivencia celular en torno al 10%, y que, por efecto bystander, el tumor contralateral al irradiado disminuye su actividad proliferativa en torno al 30%, y que cuando se aplica la terapia combinada RT + MSC esta disminución se potencia hasta superar el 35%. Las curvas representativas del crecimiento muestran que estas diferencias, aunque pequeñas, son estadísticamente significativas. Todos estos resultados demuestran, tanto in vitro (Figs. 7 y 8) como in vivo (Figs. 9, 10 y 11), que el tratamiento de modelos tumorales con células MSC tiene como resultado una acción tumor-supresora y que esta actividad se potencia cuando las células son pre-activadas con radioterapia a bajas dosis y, más claramente, cuando las células son activadas directamente in vivo al tratar el tumor con radioterapia. La prolongación del efecto de la radioterapia a distancia (efectos bystander y abscopal) y su potenciación mediante la presencia de células MSC tanto en el volumen del tumor irradiado como situadas en focos distales al tumor principal, puede ser de enorme interés en Oncología Radioterápica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de obtención de células madre activadas que comprende administrar bajas dosis de radiación.

2. El procedimiento de obtención de células madre activadas según la reivindicación anterior, donde las células madre son irradiadas con una dosis de entre 0,03 cGy y 6 Gy.

3. Un procedimiento de obtención de células madre activadas según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde las células madre son irradiadas con una dosis de entre 0,25 Gy y

4 Gy.

4. Un procedimiento de obtención de células madre activadas según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde las células madre son irradiadas con una dosis de aproximadamente 2 Gy.

5. Un procedimiento de obtención de células madre activadas según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde las células madre son células madre mesenquimales.

6. Una célula madre aislada activada obtenida por un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Una población celular que comprende al menos una célula madre aislada activada según la reivindicación 6.

8. Una composición que comprende al menos una célula madre activada según la reivindicación 6, o una población celular según la reivindicación 7.

9. La composición según la reivindicación anterior, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, que además comprende otro principio activo.

1 1. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 8-10, donde el principio activo adicional es un inhibidor de PARP (poli (ADP-ribosa) polimerasa

12. Una preparación combinada que comprende:

a) un componente A que es una célula madre activada según la reivindicación 6, una población celular según la reivindicación 7, o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8-11 ,

13. La preparación combinada según la reivindicación anterior, que además comprende, al menos, un inhibidor de PARP (poli (ADP-ribosa) polimerasa).

14. El uso de una célula madre activada según la reivindicación 6, de una población celular según la reivindicación 7, de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8-11 , o de la preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en la elaboración de un medicamento.

15. El uso de una célula madre según la reivindicación 6, de una población celular según la reivindicación 7, de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 8-1 1 , o de la preparación combinada según cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

16. El uso de una célula madre activada, de una población celular, de una composición, o de la preparación combinada según la reivindicación anterior, donde el cáncer es un cáncer sistémico.