WO2016080759A2 - 세포의 티올 수준을 측정하기 위한 실시간 이미징 센서 - Google Patents

세포의 티올 수준을 측정하기 위한 실시간 이미징 센서 Download PDF

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    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
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Definitions

  • the present invention was made by the task number HI10C0185 under the support of the Ministry of Health and Welfare, the research and management institution is the Korea Health Industry Promotion Agency, the research project name is "Health and Medical Technology Research and Development Project”, and the research title is "Pulmonary Fibrosis Treatment Technology Development Convergence Type.” Convergence Intermediation Research Center ", the lead organization is Seoul National University Industry-Academic Cooperation Group, and the research period is 2010.05.01-2014.03.31.
  • This patent application claims priority to Korean Patent Application No. 10-2014-0161860 filed with the Korean Patent Office on November 19, 2014, the disclosure of which is incorporated herein by reference.
  • the present invention relates to a fluorescence sensor capable of imaging in real time to measure the thiol level of the cell.
  • Intracellular tiers such as cysteine (Cys), homocysteine (Hcy) and glutathione (GSH) play many important roles in the physiological matrix.
  • Cys and Hcy are essential biomolecules required for cell and tissue growth in the biological system. Deficiency of cysteine causes various health problems such as growth retardation, hair bleaching, lethargy, liver damage, muscle and fat loss, and skin damage. Increased Hcy levels in human plasma increase the risk of developing Alzheimer's disease, cardiovascular disease, neural tube defects, inflammatory bowel disease, and osteoporosis.
  • the human body maintains homeostasis by properly removing reactive oxygen species (R0S) through the action of antioxidant systems, but when the balance between R0S production and antioxidant activity is broken, oxidative stress increases.
  • R0S reactive oxygen species
  • aging, as well as age-related degenerative diseases such as degenerative arthritis, cataracts, and Alzheimer's disease, various cancers, fibrosis diseases, and recently, has been attracting attention as a major common cause factor in the development of metabolic syndrome such as diabetes, obesity, cardiovascular disease.
  • the R0S is unstable and highly reactive, oxidizing biomolecules to cause biochemical and physiological damage, which is one of the main mechanisms of aging. Therefore, not only the oxidation of the human body but also the antioxidant activity or antioxidant capacity may be a major biomarker for measuring age.
  • GSH accounts for the majority of non-proteinogenic T cells in the cell and plays a pivotal role in maintaining the reducing environment and regulating the redox level in the cell. Specifically, the GSH in the human body removes various peroxides including 3 ⁇ 40 2 and itself is oxidized to GSSG to maintain redox homeostasis by controlling the degree of oxidation / reduction immediately. Is an important factor and an optimal human antioxidant It is an indicator. Indeed, GSH is associated with aging in various organs such as the C. elegance, ⁇ ⁇ U) rosophiIa elanogaster), mice, rats, and the human brain, heart, kidney, lens, lung, and blood. The reduction in the amount of L has been demonstrated in a number of papers.
  • GSH removes toxic substances extracellularly by glutathione S-transfase (GST) activity (Detoxification), and when GSH is oxidized to GSSG, it directly oxidizes cellular protein member T (PSH). Glutathionylation results in signal transduction by altering protein function.
  • the FreSH-tracer Fluorescent Real-time SH group-tracer
  • the present invention has been completed by confirming that it can be usefully used as a biosensor having remarkable sensitivity in detecting quantitatively or qualitatively in real time.
  • an object of the present invention is to provide a composition for detecting tee in living cells including a FreSH-tracer (Fluorescent Real-time SH group-tracer).
  • a FreSH-tracer Fluorescent Real-time SH group-tracer
  • the present invention provides a sensor for detection.
  • Another object of the present invention to provide a diagnostic kit for oxidative stress induced disease using FreSH-tracer.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a thiol increasing agent or inhibitor in living cells using FreSH-tracer.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for measuring antioxidant activity in living cells, including a FreSH-tracer.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for measuring antioxidant activity in living cells using FreSH-tracer.
  • the present invention provides a composition for detecting thiol in living cells (l iving cel l) comprising a compound represented by the following formula (1) or a salt thereof
  • 3 ⁇ 4 and R 2 in the formula are each independently hydrogen or d- 4 straight or branched alkyl, or 3 ⁇ 4 and X together are heterocycloalkyl or heterocycloalkenyl, which together form a five or six-membered ring; 3 ⁇ 4 is hydrogen or Cw straight or branched alkyl; 3 ⁇ 4 and 3 ⁇ 4 are each independently hydrogen, straight or branched chain alkyl,-
  • R 4 (Ci n-COO-ds straight or branched alkyl or (wherein m is an integer of 1-5), R 4, 3 ⁇ 4 and Y 3 together are C-7, forms a heterocycloalkyl wherein the heterocycloalkyl is unsubstituted eu Or heterocycloalkyl substituted by R 6 is —C00 (CH 2 ) N- 0C0—d- 5 straight or branched chain alkyl (where n is an integer of 1-5),-(CONH)-(CH 2 ) 0 -PPh 3 + Cr (where 0 is an integer from 1-5) or Linear or branched alkyl (where p is an integer of 1-5); R 7 is-(ayq-caxciUr-oco-ds straight chain Or branched alkyl, wherein Q and r are each an integer of 1-5; X and Y are each independently N or 0.
  • the FreSH-tracer Fluorescent Real-ime SH group-Tracer
  • the FreSH-tracer represented by the formula (1) was found that the fluorescence intensity is continuous, ratiometric and reversible increase and decrease in accordance with the amount of Ti in living cells It has been demonstrated that it can be usefully used as a biosensor with remarkable sensitivity to quantitatively or qualitatively detecting the amount of thiol in live cells.
  • Fluorescent tracer (Fluorescent Real-Time SH group tracer) is a compound represented by the formula (1), means a coumarin derivative (Qoumarin) having a cyanoacrylamide electrophile It is used as the fluorescent substance for detecting thiol of the present invention.
  • ratio means that the composition of the present invention directly increases or decreases the fluorescence intensity in proportion to the amount of thiol added.
  • detection refers to measuring the presence or amount of chemical species or biological substances in a sample.
  • the term "reversible" refers to a state in which a mixture of agung and product can produce an equilibrium mixture in a chemical reaction. More specifically, it means that the reaction of the compound represented by the formula (1) and the thi in the present specification is in an equilibrium state, the reaction can proceed reversibly by the counter reaction or reverse reaction depending on the amount of thiol.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 is a compound selected from the group consisting of the compound represented by Chemical Formula 2 to:
  • the fluorescence intensity of 430-550 nm shown increases. Of the thiol Fluorescence intensity is proportional and reversible.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 exhibits a maximum emission wavelength at 550-680 nm in a free state, that is, without a thiol group, and 430-550 in a Ti-bonded state. Maximum emission wavelength is shown in nm. According to another embodiment of the present invention, the compound represented by Formula 1 of the present invention exhibits a maximum emission wavelength at 550-650, 550-620, 550-600, 570-590 or 580 nm in the free state.
  • the compound represented by Formula 1 of the present invention has a maximum emission at 450-550, 470-550, 470-530, 490-530, 500-520 or 510 nm in combination with thiol Indicates the wavelength.
  • the compound of Formula 1 continuously and reversibly increases and decreases the fluorescence intensity of the emission wavelength as the Ti increases in living cells.
  • the fluorescence intensity of the emission wavelength is increased or decreased in the range of 430 nm to 680 nm.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 decreases in fluorescence intensity at 550-680 nm and increases in 430-550 nm as thiol is increased in living cells.
  • the detection of the thi is performed by obtaining a ratio of fluorescence intensity at 430-550 nm and fluorescence intensity at 550-680 nm (obtaining).
  • the ratio is the relationship between the fluorescence intensity at 430-550 nm and the fluorescence intensity at 550-680 nm.
  • the relationship is a mathematical ratio relationship between the ' fluorescence intensity at 430-550 nm and the fluorescence intensity at 550-680 nm, and the mathematical ratio relationship is proportional to the amount of tiles in living cells.
  • the rat iometrical ly is reversibly increased and decreased to show the amount of thiol in live cells in real time.
  • the detection is qualitative or quantitative detection of the thiol of the living cells.
  • said detection is real time quantitative detection.
  • the detection of the tee in the living cell indicates an oxidative stress or oxidation degree of the cell.
  • the thiol detection in the living cells indicates the degree of aging of the cells.
  • the term "thiol" refers to an organic sulfur compound including a sulfhydryl group bonded to carbon, and a sulfhydryl group or a thiol group is commonly used.
  • the thiol includes all of the thiols in the glutathione (glutathione, GSH), homocysteine (Hcy), cysteine (cysteine, Cys) or the cysteine residue of the protein, but is not limited thereto. no.
  • the invention comprises a composition of the invention It provides a sensor for detecting tee in living cells (l ive cel l).
  • the present invention provides a diagnostic kit for oxidative stress-induced disease comprising the composition of the present invention.
  • oxidative stress-induced disease refers to a disease caused by oxidative stress and is used in the same sense as “active oxygen species (R0S) associated disease”.
  • the oxidative stress-induced diseases of the present invention are aging, degenerative arthritis, cataracts, egg ⁇ heimer's disease, cancer, fibrosis, diabetes, obesity, ischemia, ischemic reperfusion injury, inflammation, systemic fungal lupus, Myocardial infarction, thrombotic stroke, hemorrhagic stroke, bleeding, spinal cord trauma, Down's syndrome, Crohn's disease, rheumatoid arthritis, uveitis, emphysema, gastric ulcer, oxygen poisoning, tumor or radiation.
  • the diagnostic kit of the present invention uses the thiol detection composition of the present invention, the common content between the two is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the invention provides a method for screening a thiol enhancer or inhibitor in living cells, comprising the following steps:
  • step (a) administering a composition of the present invention to living cells; (b) administering the test substance to the live cells of step (a); And (c) obtaining a ratio of fluorescence intensity at 430-550 nm and fluorescence intensity at 550-680 nm and comparing it with standard data to determine the test material as an increasing agent or inhibitor.
  • the thiol increases when the test substance is administered to live cells, when the fluorescence intensity at 430-550 nm increases in vivo compared to the fluorescence intensity at 550-680 nm compared with the standard data. It is determined by zero and vice versa by a thiol inhibitor.
  • the present invention provides a composition for measuring the antioxidant activity in living cells comprising the composition of the present invention.
  • the present invention provides a method for measuring antioxidant capacity in living cells, comprising the following steps:
  • the antioxidant activity measuring method of the present invention is the step
  • Antioxidant activity in a living cell measuring method (p) the fluorescence intensity ratio value of the fluorescence intensity ratio of the living cells not administered the oxidant or administering the oxidant Measuring the time to recover to the previous fluorescence intensity ratio value; (ii) the oxidant from the time of administration of the oxidant between the difference between the fluorescence intensity ratio value of the live cells not administered with the oxidant and the fluorescence intensity ratio value of the live cells administered with the oxidant Measuring an integral value up to the point of recovery to the fluorescence intensity ratio value before administration of (iii) titrating a minimum concentration of the oxidant at which the fluorescence intensity ratio value of living cells to which the oxidant is administered begins to decrease; Or ( ⁇ ) the ratio of the fluorescence intensity of living cells to which the oxidant is administered Titrating the minimum concentration of the oxidant which does not recover to the fluorescence intensity ratio value of the cell or to the fluor
  • the FreSH-tracer of the present invention reversibly changes the ratio of the fluorescence intensity according to the amount of Ti in live cells, and as described above, the thiol detection of the present invention indicates the oxidation degree of live cells. As the ratio of the fluorescence intensity is recovered after the oxidant treatment, the antioxidant ability of living cells can be measured.
  • the ratio of the fluorescence intensity of living cells to which the oxidant is administered is the ratio of the fluorescence intensity of the living cells to which the oxidant is not administered. The higher the value, or the minimum concentration of the oxidizing agent that prevents recovery in the fluorescence intensity ratio value prior to administration of the oxidizing agent will be determined in high antioxidant ability.
  • composition for measuring antioxidant capacity and the method for measuring antioxidant capacity of the present invention use the composition for detecting thiol of the present invention, the common content between the two is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention composition for detecting thiol in the living cell comprising a FreSH-tracer (Fluorescent Real-ime SH group-Tracer), a sensor, a diagnostic kit; And a thiol increasing agent or inhibitor screening method using the same.
  • a FreSH-tracer Fluorescent Real-ime SH group-Tracer
  • the present invention provides a composition for measuring antioxidant capacity in living cells, including a FreSH-tracer, and a method for measuring antioxidant capacity using the same.
  • the present invention quantitatively or positively determines the amount of thiol in live cells by identifying that the FreSH-tracer of the present invention continuously or proportionally and reversibly increases or decreases the fluorescence intensity according to the amount of tiles in living cells. It can be usefully used as a biosensor having remarkable sensitivity in sexual detection.
  • 1 is a diagram showing the results of experiments that the FreSH-tracer reacts reversibly and rapidly with the reduced form of glutathione (a. U. Is an arbitrary unit, Ex is the maximum excitation wavelength, and Em is the maximum emission wavelength, respectively).
  • La is a figure which shows the reversible reaction of a FreSH-tracer.
  • Lb shows the results of measuring the reversible reaction of the FreSH-tracer by UV visible light absorption spectrum.
  • Figure lc-lf monitors the fluorescence emission spectra of FreSH-tracers generated by excitation at 430 nm (Figure lc) and 520 nm (Figure Id) at 510 nm (F510) and 580 nm (F580), respectively. It is a figure shown by the graph (FIG. 1E).
  • Lg-lh is a diagram showing the real-time fluorescence change of the FreSH-tracer when alkylating the thiol group of glutathione by injection of 5 mM NEM (v ⁇ Ethyl Maleimide) after 800 seconds after reacting with 5 mM glutathione.
  • Figure lg shows the results of monitoring by F510 and F580
  • Figure lh shows the release rate.
  • FIG. Li shows the change in real-time fluorescence ratio of FreSH-tracer reacted with 3 ⁇ 40 2 of the indicated concentration 400 seconds after equilibration with 5 mM glutathione for 15 minutes and measurement of the ratiometric sensor reaction.
  • Figure lj shows the change in fluorescence ratio of FreSH-tracer after addition of 5 Um / ml glutathione reductase (GR) and 0.5 mM NADPH after 300 sec after reaction with 5 mM GSSG or 3 ⁇ 40 at 200 sec. Is a diagram showing.
  • FIG. 2 is a diagram showing that cellular protein member thiol (PSH) quantitatively reacts with FreSH-tracer and has a slower reaction rate than GSH.
  • PSH cellular protein member thiol
  • FIG. 2A illustrates the mixing of cellular proteins prepared from HeLa cell lysates (PSH) and NEM-alkylated cellular proteins (PS-NEM) in various ratios, thereby combining PSH with FreSH-tracers. It is a diagram showing a slow and quantitative reaction.
  • FIG. 2B is a diagram showing GSH rapidly and quantitatively reacting with FreSH-tracer in a 15 mg / ml Ti-free protein (PS-NEM) environment.
  • Figure 2c-e is a diagram showing the results of real-time observation of the fluorescence ratio of the FreSH 'tracer PSH and GSH oxidized by the diamide treatment of thiol oxidizer in the presence of 15 mg / ml protein.
  • FIG. 3 shows that FreSH-tracers can be used to image tee levels in live cells.
  • Figure 3b-3c is a view showing the results of the fluorescence intensity (Fig. 3a, arrowhead) of the two respective cells was measured (Fig. 3b), the fluorescence ratio was calculated (Fig. 3c).
  • FIG. 3D is a graph showing the average release rate in the whole cell region, cytoplasm and nucleus region obtained from four different cells.
  • Figure 3e was treated with 50 ⁇ 3 ⁇ 40 2 5 minutes after the start of measurement of the cells loaded with FreSH-tracer, showing the ratio of the fluorescence intensity of the cells at the indicated time point.
  • Figure 3f is a diagram showing the result of calculating the average emission fluorescence ratio in the whole cell region, cytoplasm and nuclear region obtained from seven different cells.
  • Figure 3g is a diagram showing the results of measuring the ratiometric sensor reaction in the whole cell region after 5 minutes from the start of the measurement the cells treated with the indicated concentration of 3 ⁇ 40 2 .
  • the blue line (50 ⁇ 0 2 ) shows the release rate of cells indicated by arrowheads in FIG. 3E.
  • FIG. 3H graphically depicts the maximum rate change reduced by treatment of various concentrations of 3 ⁇ 40 2 from the average fluorescence rate of the entire cell area during the initial 5 minutes, based on an experiment similar to FIG. 3G.
  • FIG. 4 is a diagram showing that the level of reduced thiols in cells is affected by cell density and serum depletion.
  • FIG. 4A shows incubated HeLa cells dispensed at different densities (low density, 1 ⁇ 10 4 medium density, 2 ⁇ 10 4 high density, 4 ⁇ 10 4 cells / cm 2 ) for 24 hours and treated with 5 ⁇ FreSH-tracer. After equilibration for 2 hours, it is shown by fluorescence analysis with confocal microscope and imaged fluorescence ratio. The corresponding emission intensity plot is shown in Figure 21b.
  • FIG. 4B was incubated for 18 hours in HeLa cells containing 0% or 10% FBS, and analyzed in the same manner as in FIG. 4A. The corresponding emission intensity plot is shown in FIG. 21C.
  • Figure 5 is a diagram showing the results of the real-time observation of the level of living cells in the living cells changed by NADPH oxidase activation in RAW264.7 cells using FreSH-tracer.
  • FIG. 5B measures the fluorescence ratio of one control cell (FIG. 5A, arrowhead) and two PMA treated cells (FIG. 5B, arrowhead) and shows it graphically versus time.
  • Figure 6 is a figure showing the chemical equilibrium constant 03 ⁇ 4) value of the sulfhydryl compound for FreSH-tracer.
  • Figure 7 shows the effect of pH on the value of FreSH-tracer and GSH. 8 is in vitro experiment 7? V / /) shows that 3 ⁇ 40 2 (5 mM) does not directly react with FreSH-tracer to induce changes in fluorescence ratio.
  • FIG. 9 shows that in the presence of varying amounts of glutathione, the FreS H ⁇ tracer fluorescence ratio is reduced to the same level by 0.5 mM diamide treatment.
  • Figure lla-c is a diagram comparing the reaction rate of PSH, GSH or FreSH-tracer derived from PSH and GSH in the oxidation reaction by 3 ⁇ 40 2 .
  • FIGS. 12A-B are diagrams illustrating the degree of survival of HeLa cells after 6 hours and 24 hours after treatment with the FreSH-tracer.
  • FreSH-tracer concentration ( ⁇ 5 ⁇ ) used in the cell experiments can be confirmed that there is no cytotoxicity.
  • FIG. 13 shows representative images of HeLa cells loaded with FreSH-tracers.
  • Figures 14a-d is a diagram showing the effect of NEM and DTT ithiothrei tol) on intracellular Ti level.
  • Figure 15a-c is a diagram showing the results of the analysis of HeLa cells treated with FreSH-tracer using a flow cytometer.
  • 16a-i show that stable single bond derivatives, in which coumarin-coupled double bonds are changed to single bonds in FreSH-tracers, are insensitive to thiol oxidant (diamid and 3 ⁇ 40 2 ) treatment in HeLa cells. It is also.
  • Figures 17A-C show the level of T-levels in lysates of HeLa cells treated with 3 ⁇ 43 ⁇ 4 for the indicated time using FreSH-tracer (Figure 17A) and EUman reagent (Figure 17B), and reduced GSH levels of glutathione reductase ( Figure shows the measurement using the GSH quantitative kit using GSH reductase) (Fig. 17c).
  • Figures 18a-b shows bis-chlo roethylnitrosourea (FIG. 18a) and glutathione, inhibitors of glutathione reductase (GSH reductase) on thiol levels in HeLa cells BSO (Buthionine sul foximine, FIG. 18B), an inhibitor of a synthase (gamma ⁇ glutamyl cysteine synthetase), shows the effect of treatment.
  • GSH reductase glutathione reductase
  • FIG. 19a-b is a fluorescence microscope (Fig. 19a) and a flow cytometer (Fig. 19b) after treatment with FreSH-tracer to live cells under the same conditions as GSH levels measured in lysate of HeLa cells treated with various concentrations of BS0. Shows the results of experiments on the relationship between the measured fluorescence ratios.
  • Figure 20a-b is a diagram showing the measurement of the level of reduced tee in living cells that vary depending on the cell density in culture using a flow cytometer.
  • 21A-D show images for fluorescence emission intensity.
  • Fig. 23B-C shows the fluorescence emission spectrum measured after reaction with the compound represented by Chemical Formula 3 after equilibration.
  • Fig. 26B-C shows the fluorescence emission spectrum measured for the reaction with the compound.
  • Fig. 27B-C shows the fluorescence emission spectrum of the reaction.
  • Fig. 28B-C is a diagram showing the fluorescence emission spectrum measured for reaction with the compound represented by the formula (8) after fitting.
  • Glutathione reductase is derived from EMD Mi 11 ipore, 3 ⁇ 40 2 , N-ethylmaleimide (NEM), di thiothreito (DTT), diamide, and Elman reagent ( El lman's reagent, bis-chloroethylnitrosourea (BCNU), butionine sulphoximine (BS0) and pobol 12-myristate 13-acetate (phorbol 12-myri state 13- acetate, PMA) were purchased from Sigma-Aldrich, respectively.
  • NEM N-ethylmaleimide
  • DTT di thiothreito
  • Elman reagent El lman's reagent, bis-chloroethylnitrosourea (BCNU), butionine sulphoximine (BS0) and pobol 12-myristate 13-acetate (phorbol 12-myri state 13- acetate, PMA) were purchased from Sigma-Ald
  • the chemical equilibrium between the thiol compound (0-200 mM) and the FreSH-tracer was measured, and the fluorescence emission spectrum emitted when excited with light of 430 nm wavelength was measured.
  • the correlation between the fluorescence intensity at the maximum emission wavelength (580 nm) and the thiol compound concentration was determined by nonlinear regression to determine the chemical equilibrium constant between the thiol compound and the FreSH-tracer.
  • HeLa cells were dispensed into 150 ram dishes, which reached 80% density after 2 days.
  • the cells were obtained by performing scraping in PBS and then centrifuged.
  • the cells were subjected to a suspension in PBS containing 0.1% Triton X-100 and completely destroyed by sonicat ion. 10 minutes at 12000 g and 4 ° C After centrifugation, the lysate was dialyzed in 4 ° C. PBS to remove low molecular weight thiol species, including glutathione.
  • the amount of protein was quantified by the BCA method. The method was used as a thiol-containing protein (PSH) sample.
  • PSH thiol-containing protein
  • the protein sample was reacted for 2 hours at room temperature with 100 mM NEM solution to remove the thiol group, and dialyzed at 4 ° C. in PBS to remove NEM having residual activity from the sample, and then at 4 ° C. in PBS containing 5 mM DTT. Dialysis for 1 hour at. The remaining DT was removed by dialysis in 4 ° C. PBS and the protein was then used as a sample of alkylated protein (PS—NEM) with NEM.
  • PS—NEM alkylated protein
  • HeLa cells were dispensed into 150 mm dishes and incubated for 18 hours at 37 ° C., 5% CO 2 conditions. Cells were treated with 5 or 10 mM 3 ⁇ 40 2 for the indicated time points and washed twice with cold PBS. Cell pellets were obtained by centrifugation at 12000 g, 4 ° C. for 1 min and immediately frozen in liquid nitrogen. Frozen cell pellets were resuspended in 1 mL complete solution of pH 6 containing 50 mM MES, 50 mM phosphate and 1 mM EDTA and crushed by sonication, then centrifuged for 10 minutes at 12000 g and 4 ° C. Separated.
  • HeLa and RAW264.7 cells were treated with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS, Hyclone), 100 U / tnl penicillin, 100 g / ml straptomycin sulfate and 2 mM glutamine-free DMEM Incubated at. HeLa (1.8 x 10 5 cells / dish) and RAW264.7 (2 x 10 5 cells / dish) for 35 mm cover glass bottom dishes in a later 37 ° C, 5% C0 2 in the dispensing condition (SPL fesciences Li) Incubate for the indicated time.
  • FBS heat-inactivated fetal bovine serum
  • HeLa cells were cultured for 2 hours and RAW264.7 cells for 4 hours using 2 mL of culture medium containing 5 uM FreSH-tracer prior to fluorescence microscopy. Live images of the cells were obtained using a Nikon A1 laser scanning confocal microscope. 37 ° C and 5% in a chamber mounted on a Nikon ECLIPSE Ti reversed-phase microscope with CFI Plan Apochromat 60X and 1.40 numerical aperture (NA) objectives Imaging experiments were performed by culturing the cells under C0 2 conditions. FreSH-tracers were excited with 403 nm and 488 nm laser lines and fluorescence was detected through filters with 500-550 nm and 570-620 nm band spacing, respectively. NIS-Elements AR software was used to analyze the experimental data and image the fluorescence ratio.
  • HeLa cells were incubated in clear 96-well plates (Corning Incorporated) at the indicated density. After treatment with various concentrations of BS0 for 48 hours, cells were washed twice with HBSS and then total GSH and GSSG concentrations were measured using the GSH / GSSG-Glo Assay Kit (Promega). The reduced GSH amount was calculated by subtracting the GSSG amount from the total GSH amount. The GSH concentration in HeLa cells was calculated based on the known average HeLa cell volume of 3000 urn 3 and the number of cells in the sample. Experiment result
  • FreSH-tracers have values in the mM range for compounds containing sulfhydryl groups (thiol groups) (FIG. 6). This property of the FreSH tracer accounts for most of the low molecular weight thiols in the cell and is only suitable for measuring the amount of GSH present in concentrations in mM.
  • the inventors newly discovered that the fluorescence emission intensity ratios (F510 / F580) of the F510 and F580 of the FreSH tracer vary proportionally over a wide range of GSH concentrations (FIG. Le). This means that the sensor could be used as a ratiometric sensor.
  • the present inventors measured the reaction of various derivatives included in the FreSH-tracer, that is, the compound represented by Formulas 2 to 8 with beta-mercaptoethanol ([3-mercaptoethanol) or glutathione. The results are shown in FIGS. 22 to 28.
  • F510 / F580 fluorescence emission intensity ratios of F510 and F580 vary proportionally over a wide range of GSH concentrations.
  • the inventors then examined the reaction rate of the FreSH-tracer.
  • the addition of 5 mM GSH to the FreSH-tracer resulted in a rapid change in the emission patterns of F510 and F580 for approximately 240 seconds in an opposite pattern, followed by 5 mM N-ethylmaleimide O ethylmaleimide, a thiol alkylation reagent at 800 seconds
  • Each fluorescence intensity returned to the initial value within 500 seconds as a result of the addition of NEM).
  • the fluorescence ratio of this sensor increased to about 20 by adding 5 mM GSH and then immediately returned to the initial level by adding the same amount of NEM (FIG. Lh).
  • GSH rapidly increased the sensor fluorescence ratio even in the presence of 15 mg / ml PS-NEM (FIGS. 2B and 10B).
  • the inventors then determined that GSH and PSH were FreSH due to changes in sensor fluorescence ratios obtained from the three combinations of the two types of thiols during the oxidation process caused by the diamides (FIGS. 2C-E) and 3 ⁇ 402 (FIGS.
  • the reaction with the tracer was compared.
  • Sensa fluorescence ratios obtained from PSH decreased slowly by treatment of both oxidants (FIGS.
  • the inventors then observed the redox reaction of the cells against 3 ⁇ 40 2 using the FreSH-tracer.
  • the sensor loaded cells were treated with 50 uM 3 ⁇ 40 2
  • the sensor release rate immediately decreased for about 5 minutes and began to recover overall after about 20 minutes.
  • FIGS. 3E and 3F There was no difference in the pattern of change in fluorescence ratio between cytoplasm and nucleus (FIG. 3F).
  • the present inventors observed the response of the sensor after treating various amounts of 3 ⁇ 40 2 in living cells in order to measure the reactivity of the sensor according to the intensity of oxidative stress.
  • R0S caused by NADPH oxidase (Phox) activity in the phagocytic, is an essential protective agent that kills ⁇ microorganisms.
  • PMA phorbol 12-myristate 13-acetate

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Abstract

본 발명은 세포의 티을 수준을 측정하기 위하여 실시간으로 이미징이 가능한 형광 센서에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 FreSH-트레이서 (Fluorescent Real-time SH group-Tracer)가 생세포에서 티올의 양에 따라 형광 세기가 연속적이고， 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명함으로써， 살아있는 세포에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는바이오 센서로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
세포의 티올 수준을 측정하기 위한 실시간 이미징 센서 【기술분야】
본 발명은 대한민국 보건복지부 지원 하의 과제번호 HI10C0185에 의해 이투어진 것으로서， 연구관리 전문기관은 한국보건산업진홍원， 연구 사업명은 "보건의료기술연구개발사업" ， 연구과제명은 "폐섬유증 치료기술 개발 수렴형 융합 중개연구센터" ， 주관기관은 서울대학교 산학협력단， 연구기간은 2010.05.01 - 2014.03.31이다. 본 특허출원은 2014년 11월 19일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0161860호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명은 세포의 티올 수준을 측정하기 위하여 실시간으로 이미징이 가능한 형광 센서에 관한 것이다.
【배경기술】
시스테인 (cysteine, Cys) , 호모시스테인 (homocysteine, Hcy) 및 글루타티온 (glutathione, GSH)과 같은 세포 내 티을은 생리적 매트릭스에서 많은 중요한 역할을 담당하고 있다. 예를 들어， Cys 및 Hcy는 생체시스템에서 세포 및 조직 생장에 요구되는 필수적인 생체분자들이다. 시스테인의 결핍은 다양한 건강상의 문제들， 예를 들어， 생장 지연， 모발 탈색， 기면， 간 손상, 근육 및 지방 소실, 및 피부 손상을 유발한다. 사람의 혈장에서 Hcy의 수준이 증가할 경우， 알츠하이머병， 심혈관 질환， 신경관 결손， 염증성 장질환， 및 골다공증이 발생할 위험이 커진다,
인체는 항산화계의 작용을 통해 활성 산소종 (react ive oxygen species , R0S)을 적절히 제거하여 항상성을 유지하나， R0S 생성과 항산화계 작용사이의 균형이 깨지면 산화적 스트레스 (oxidat ive stress)가 증가하고, 이는 노화를 비롯하여 퇴행성 관절염, 백내장， 알쓰하이머 등의 노화 관련 퇴행성 질환， 각종 암, 섬유화 질환을 비롯하여 최근에는 당뇨병， 비만， 심혈관질환 등의 대사성증후군의 발병에 주요한 공통 원인 인자로 주목받고 있다. 상기 R0S는 불안정하고 반웅성이 높아 생체 분자를 산화시켜 생화학적， 생리적 손상을 유발시키고 이는 노화의 주요 기전 중의 하나이다. 따라서 인체의 산화도 뿐 아니라 항산화도나 항산화능력은 생체나이 계측에 주요한 바이오 마커가 될 수 있다.
GSH는 세포 내 단백질 비구성원 (non-proteinogenic) 티을의 대부분을 차지하며 세포에서 환원환경 (reducing environment )을 유지하고， 산화환원준위를 조절하는데 중추적인 역할을 담당하고 있다. 구체적으로， 인체 내 GSH는 ¾02를 비롯한 각종 과산화물질들을 제거하고 자신은 GSSG로 산화되어 산화 /환원 정도를 즉각적으로 조절함으로써 산화 환원 항상성 (redox homeostasis)을 유지시키는바， 인체의 항산화력을 유지하는 주요인자이자 인체 항산화도를 나타내는 최적의 지표라 할 수 있다. 실제로, 예쁜 꼬마선층 (C. elegance) , ^^\U)rosophiIa elanogaster) , 마우스， 랫트 등의 동물과 인체의 뇌， 심장， 신장， 수정체， 폐， 혈액 등의 여러 장기에서 노화에 따라 GSH의 양이 감소되는 사실이 다수의 논문들을 통해 증명된 바 있다 L. 또한， R0S과 반웅성이 높은 것으로 알려진 비타민 C, 비타민 E 또는 메티오닌 (Methionine)은 ¾02나 초과산화물 (Superoxide)와 같은 특정 R0S와는 반웅하지 않는 것으로 알려져 있으나， GSH의 티올 그룹은 모든 R0S와 반웅할 수 있다 2. 또한, GSH는 글루타티온 S-트랜스퍼라아제 (glutatathione S- transf erase, GST) 활성에 의해 독성물질올 세포 외로 제거하며 (Detoxification), GSH가 GSSG로 산화되면 세포 단백질 구성원 티을 (PSH)를 직접 산화수식 (glutathionylation)하여 단백질의 기능을 변화시킴으로써 신호전달을 야기한다 (Redox signaling).
상술한 바를 종합할 때， 생체시료에서 티을을 함유하는 물질의 검출 및 식별은 매우 중요하다. 지금까지， HPLC, 모세관 전기영동 및 UV-Vis 검출 /비색 분석 등의 몇몇 티을 검출방법들이 개발되었다. 이들 방법들이 파쇄된 생체시료의 티올올 모니터링하기에는 유용하나， 생세포 내 티을을 검출할 수 있는 방법은 거의 없었다. 세포를 파쇄하지 않고 간단하고， 민감하며 효과적으로 티을을 검출하기 위해서는 형광 방법들이 더 바람직하다. 과거 몇 년 동안， 마이클 첨가 (Michael addition), 이황화결합 교환 (disulfide bond exchange)이나 Se-N 결합 분열, 금속이온과 황의 상호작용, 알데히드를 이용한 고리형성 등의 메커니즘에 기반을 둔 티을에 대한 다양한 형광 프로브들이 개발된 바 있다. 그러나 지금가지 개발된 모든 종류의 티을 프로브는 티올과 비가역적으로 반웅하므로 생세포에서 티올 양의 변화를 실시간으로 관찰하는데 사용할 수 없다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명자들은 본 발명의 FreSH-트레이서 (Fluorescent Real-time SH group- Tracer)가 생세포에서 티을의 양에 따라 형광세기가 연속적이고 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명하고， 살아있는 세포에서 티을의 양을 실시간으로 정량또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서로서 유용하게 이용될 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명의 목적은 FreSH-트레이서 (Fluorescent Real-time SH group- Tracer)를 포함하는 생세포 (living cell)에서의 티을 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 FreSH-트레이서를 포함하는 생세포에서의 티을 검출용 센서를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 FreSH-트레이서를 이용한 산화 스트레스 유발 질환 진단 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 FreSH-트레이서를 이용한 생세포에서 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 FreSH-트레이서를 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 FreSH-트레이서를 이용한 생세포에서 항산화능 측정 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
【기술적 해결방법】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 생세포 ( l iving cel l )에서의 티올 검출용 조성물을 제공한
Figure imgf000004_0001
상기 화학식에서 ¾ 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 d-4 직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나, ， ¾ 및 X가 함께 5각 또는 6각 고리를 이루는 헤테로 사이클로알킬 또는 헤테로 사이클로알케닐이고; ¾은 수소 또는 Cw 직쇄 또는 가지쇄 알킬이며; ¾및 ¾는 각각 독립적으로 수소， 직쇄 또는 가지쇄 알킬， -
(Ci n-COO-d-s직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나 (상기 m는 1-5의 정수이다) , R4, ¾및 Y는 함께 C3-7 헤테로 사이클로알킬을 이루고ᅳ 상기 헤테로 사이클로알킬은 비치환 또는 으로 치환된 헤테로 사이클로알킬이고; 상기 R6은 -C00(CH2)N-0C0— d-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬 (상기 n은 1-5의 정수이다)， -(CONH)-(CH2)0-PPh3 +Cr (상기 0는 1- 5의 정수이다) 또는
Figure imgf000004_0002
직쇄 또는 가지쇄 알킬이며 (상기 p는 1-5의 정수이다) ; 상기 R7은 -(ayq-caxciUr-oco-d-s 직쇄 또는 가지쇄 알킬 (상기 Q 및 r은 각각 1-5의 정수이다)이고; X 및 Y는 각각 독립적으로 N또는 0이다.
본 발명자들은 살아있는 세포에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서를 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 FreSH- 트레이서 (Fluorescent Real-t ime SH group-Tracer )가 생세포에서 티을의 양에 따라 형광세기가 연속적이고 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명하고, 살아있는 세포에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서로서 유용하게 이용될 수 있다는 것을 입증하였다.
본 명세서에서， 용어 "FreSH-트레이서 (Fluorescent Real-t ime SH group- Tracer)" 는 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 시아노아크릴아마이드 친전자체 (cyanoacrylamide electrophi le)를 갖는 쿠마린 (Qoumarin) 유도체를 의미하고， 본 발명의 티올 검출용 형광물질로서 사용된다.
본 명세서에서, 용어 "비율계량적 (rat iometric)" 은 산출량이 투입량 (input )에 직접적으로 비례하는 것을 의미한다. 구체적으로， 본 발명의 일 구현예에서， "비율계량적" 은 본 발명의 조성물이 티올 투입량에 따라 직접적으로 비례해서 형광세기가 증가또는 감소하는 것을 의미한다.
본 명세서에서， 용어 "검출" 은 시료 속에서 화학종이나 생물학적 물질의 존재 유무나 그 양을 측정하는 것을 의미한다.
본 명세서에서， 용어 "가역적 (reversible)" 은 화학반응에서 반웅물과 생성물의 흔합물이 평형상태의 흔합물을 생성하는 것이 가능한 상태를 의미한다. 보다 구체적으로는， 본 명세서에서 화학식 1로 표시되는 화합물과 티을의 반응이 평형상태를 이루어, 티올의 양에 따라 정반웅 또는 역반응하여 가역적으로 반응이 진행될 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2 내지 되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물이다:
Figure imgf000005_0001
증화화
합가합
물물함
에이이본
Figure imgf000006_0001
합티프
올되양리
어에의 상 따양있태 는른의이
Figure imgf000006_0002
발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 생세포에서
따라 FreSH-트레이서에 결합하는 티올의 양이 증가하므로，
나타내는 550-680 nm의 형광세기는 감소하고, 티올이 결
나타내는 430-550 nm의 형광세기는 증가한다. 상기 티올의 형광세기는 비율계량적이고 가역적으로 증감한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 프리 (free) 상태， 즉 티올기가 결합되지 않은 상태에서 550-680 nm에서 최대방출파장을 나타내고 티을과 결합된 상태에서 430-550 nm에서 최대방출파장을 나타낸다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 프리 상태에서 550-650， 550-620, 550-600, 570-590 또는 580 nm에서 최대방출파장을 나타낸다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면， 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 티올과 결합된 상태에서 450-550 , 470-550, 470-530, 490-530 , 500-520 또는 510 nm에서 최대방출파장을 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 화학식 1의 화합물은 생세포에서 티을이 증가함에 따라 방출파장의 형광세기가 연속적이고 가역적으로 증감한다. 보다 구체적인 구현예에 따르면， 상기 방출파장의 형광세기는 430 nm 내지 680 nm의 범위에서 증감한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 생세포에서 티올이 증가함에 따라 550-680 nm에서의 형광세기가 감소하고 430-550 nm에서의 형광세기는 증가한다.
본 발명의 일 구현예 에 따르면, 상기 티을의 검출은 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 비율 (rat io)을 수득하여 (obtaining) 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 비율은 상기 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 관계 (relat ionship)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 관계는 상기 430-550 nm에서의 ' 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 수학적 비율관계이고, 상기 수학적 비율관계는 생세포에서 티을의 양에 따라 비율계량적 (rat iometrical ly)으로 가역적으로 증감하여 생세포에서의 티올 양을 실시간으로 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 검출은 상기 생세포의 티올의 정성 또는 정량적 검출이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출은 실시간 정량적 검출이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 생세포에서의 티을 검출은 세포의 산화적 스트레스 또는 산화도를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 상기 생세포에서의 티올 검출은 세포의 노화도를 나타낸다.
본 명세서에서， 용어 "티을 (thiol )" 은 탄소와 결합된 설프히드릴기를 포함하는 유기 황합물을 의미하고， 설프히드릴기 또는 티올기는 흔용되어 사용된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 티올은 글루타티은 (glutathione , GSH) , 호모시스테인 (homocysteine , Hcy) , 시스테인 (cysteine , Cys) 또는 단백질의 시스테인 잔기에 있는 티올을 모두 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 생세포 ( l ive cel l )에서의 티을 검출용 센서를 제공한다.
본 발명의 티올 검출용 센서는 본 발명의 티을 검출용 조성물을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 산화 스트레스 유발 질환 진단 키트를 제공한다. 본 명세서의 용어 "산화 스트레스 유발 질환" 은 산화 스트레스에 의하여 발생하는 질환을 의미하며 , "활성 산소종 (R0S) 연관 질환" 과 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 산화 스트레스 유발 질환은 노화， 퇴행성 관절염， 백내장， 알≤하이머병， 암, 섬유화 질환, 당뇨병， 비만， 허혈， 허혈성 재관류 손상, 염증， 전신성 흥반 루푸스， 심근경색, 혈전성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 출혈, 척수 외상， 다운증후군, 크론병， 류마티스 관절염， 포도막염， 폐기종， 위궤양， 산소 중독， 종양또는방사선증이다.
본 발명의 진단 키트는 본 발명의 티올 검출용 조성물을 이용하기 때문에， 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생세포에서의 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 조성물을 생세포에 투여하는 단계; (b) 시험물질을 단계 (a)의 생세포에 투여하는 단계; 및 (c) 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 비율 (rat io)을 수득하여 표준데이터와 비교함으로써， 상기 시험물질을 티을 증가제 또는 억제제로 결정하는 단계.
상기 .티을 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법은 생세포에 시험물질을 투여하였을 때， 표준데이터와 비교하여 생체 내에서 430-550 nm에서의 형광세기가 550-680 nm에서의 형광세기보다 증가하는 경우 티올 증가제로 결정하고, 그 반대로 나타나는 경우 티올 억제제로 결정한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 본 발명의 티을 검출용 조성물을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정 방법을 제공한다:
(a) 생세포에서 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 비율 (rat io)을 실시간으로 축정하는 단계; (b) 본 발명의 조성물을 생세포에 투여하는 단계; (c) 산화제를 단계 (b)의 생세포에 투여하는 단계; 및 (d) 상기 형광세기의 비율 값의 변화를 관찰하는 단계 . 본 발명의 일 구현예에 따르면， 본 발명의 항산화능 측정 방법은 상기 단계
(d) 이후 다음의 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생세포에서의 항산화능 측정 방법: ( Π 상기 형광세기의 비율 값이 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값 또는 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시간을 측정하는 단계; ( i i ) 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값과 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값의 차이의 산화제 투여 시점부터 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시점까지의 적분값을 측정하는 단계; ( iii ) 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값이 감소하기 시작하는 상기 산화제의 최소 농도를 적정하는 단계; 또는 ( ίν ) 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기의 비율 값이 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값 또는 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하지 않는 상기 산화제의 최소 농도를 적정하는 단계로서， 상기 단계 ( i )의 시간이 짧을수록, 상기 단계 ( Π )의 적분값이 작을수록, 상기 단계 ( iii )의 최소 농도가 높을수록， 또는 상기 단계 ( iv )의 최소 농도가 높을수록 항산화능이 높은 것으로 판단한다.
하기 실시예에서 입증한 바와 같이， 본 발명의 FreSH-트레이서는 생세포에서 티을의 양에 따라 형광세기의 비율이 가역적으로 변화하고 상술한 바와 같이 본 발명의 티올 검출은 생세포의 산화도를 나타내는바, 상기 형광세기의 비율이 산화제 처리 후 회복되는 것으로 생세포의 항산화능을 측정 가능하다. 따라서 ( i ) 형광세기의 비율 값이 산화제 투여 전 또는 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값으로 회복되는 시간이 짧을수록， ( i i ) 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값과 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값의 차이의 산화제 투여 시점부터 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시점까지의 적분값이 적을수록 (즉， 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값에 대한 그래프와 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값에 대한 그래프 사이의 면적 값이 작을수톡)， ( iii ) 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값이 감소하기 시작하는 산화제의 최소 농도가 높을수록， ( iv ) 산화제를 투여한 생세포의 형광세기의 비율 값이 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값 또는 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하지 못하게 하는 산화제의 최소 농도가 높을수록 항산화능이 높다고 판단할수 있는 것이다.
본 발명의 항산화능 측정용 조성물 및 항산화능 측정 방법은 본 발명의 티올 검출용 조성물을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을요약하면 다음과 같다: (a) 본 발명은 FreSH-트레이서 (Fluorescent Real-t ime SH group-Tracer)를 포함하는 생세포 ( l iving cel l )에서의 티올 검출용 조성물, 센서, 진단키트; 및 이를 이용한 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 FreSH-트레이서를 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물 및 이를 이용한 항산화능 측정 방법을 제공한다.
(c) 본 발명은 본 발명의 FreSH-트레이서가 생세포에서 티을의 양에 따라 형광세기가 연속적이고， 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명함으로써, 살아있는 세포에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서로서 유용하게 이용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 FreSH-트레이서가 글루타티온의 환원형과 가역적이고 빠르게 반응한다는 실험결과를 나타내는 도이다 (a. u.는 임의 단위， Ex는 최대 여기 파장, Em은 최대 방출 파장를 각각 나타낸다) .
도 la는 FreSH—트레이서의 가역반웅을 나타내는 도이다.
도 lb 내지 If는 FreSH-트레이서를 20분 동안 다양한 농도의 글루타티온 ( [GSH]0 = 0-200 mM)으로 평형을 맞춘 후 그 반웅을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 lb는 FreSH-트레이서의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 lc-lf는 430 nm (도 lc) 및 520 nm (도 Id)에서 여기 (exci tat ion)에 의하여 발생된 FreSH-트레이서의 형광 방출 스펙트럼을 510 nm(F510) 및 580nm(F580)에서 각각 모니터링하여， 그래프 (도 1 e)로 나타낸 도이다.
도 If는 F510 및 F580로 나누어서 계산하고 증가된 농도의 글루타 티온에 맞춘 방출 비율을 나타낸 도이다.
도 lg-lh는 5 mM 글루타티온과 반웅하고 800초 후 5 mM NEM(v^Ethyl Maleimide)의 주입에 의하여 글루타티온의 티을기를 알킬화하였을 때 FreSH- 트레이서의 실시간 형광변화를 나타낸 도이다. 도 lg는 F510 및 F580에 의하여 모니터링을 한 결과를 나타내었고, 도 lh는 그 방출 비율을 나타내었다.
도 li는 5 mM 글루타티온과 15분 동안 평형을 맞추고 비율계량적 센서 반웅의 측정을 시작한 지 400초 후， 표시된 농도의 ¾02와 반웅시킨 FreSH- 트레이서의 실시간 형광비의 변화를 나타낸 도이다.
도 lj는 5 mM GSSG 또는 ¾0와 200초에서 반웅시킨 후， 5 U/ml의 글루타티온 환원효소 (glutathione redu ctase , GR) 및 0.5 mM NADPH를 300초 후 추가적으로 첨가한 FreSH-트레이서의 형광비의 변화를 나타낸 도이다.
도 2는 세포 단백질 구성원 티올 (PSH)이 FreSH-트레이서와 정량적으로 반웅하고 GSH보다 반응속도가 느리다는 것을 나타낸 도이다.
도 2a는 HeLa 세포 용해물로부터 제조한 세포 단백질 (PSH) 및 NEM으로 알킬화된 세포 단백질 (PS-NEM)을 여러 비율로 흔합하여 PSH가 FreSH-트레이서와 느리게 정량적으로 반웅하는 것을 나타낸 도이다.
도 2b는 15 mg/ml의 티을기 없는 단백질 (PS—NEM) 환경에서 GSH가 FreSH- 트레이서와 빠르게 정량적으로 반웅하는 것을 나타낸 도이다.
도 2c-e 는 15 mg/ml의 단백질 존재하에서 PSH와 GSH가 티올 산화제인 디아마이드 (di amide) 처리에 의해 산화되는 것을 FreSHᅳ트레이서의 형광비로 실시간 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 FreSH-트레이서로 생세포 내 티을 수준올 이미징화할 수 있음을 나타내는 도이다.
도 3a는 FreSH-트레이서로 로딩된 세포의 현미경 관찰을 개시한 지 45초 후에 0.5 mM 디아마이드를 세포 배양액에 처리하고, 125 초 후에 0.5 mM DTT를 주입한 후， 그 공초점 현미경 형광 이미지를 나타낸 도이다. (F510 = Ex403- Em525/25 ; F580 = Ex488-Em595/25； 크기막대 = 10 μπι)
도 3b-3c는 두 개의 각각의 세포의 형광세기 (도 3a , 화살촉)를 측정하였고 (도 3b) , 그 형광비를 계산 (도 3c)한 결과를 나타낸 도이다.
도 3d 는 4개의 서로 다른 세포로부터 수득된 전체 세포 영역， 세포질 및 핵질 영역에서의 평균 방출 비율을 그래프로 나타낸 도이다.
도 3e는 FreSH-트레이서로 로딩된 세포를 측정을 시작한지 5분 후 50 μΜ ¾02로 처리하였고， 표시된 시점에서 세포의 형광세기의 비율을 나타낸 도이다. 해당 방출 세기 도면은 도 21a에 나타내었다 (크기막대 = 10 μηι) .
도 3f는 7개의 서로 다른 세포로부터 수득된 전체 세포 영역， 세포질 및 핵질 영역에서의 평균 방출 형광 비율을 계산한 결과를 나타낸 도이다.
도 3g는 측정을 개시한지 5분 후 세포를 표시된 농도의 ¾02로 처리하였고 전체 세포 영역에서 비율계량적 센서 반웅을 측정한 결과를 나타낸 도이다. 파란선 (50 μΜ 02)은 도 3e에서 화살촉으로 표시된 세포의 방출 비율을 나타낸 것이다.
도 3h는 도 3g와 유사한 실험에 기초하여, 초기 5분 동안의 전체 세포 영역의 평균 형광 비율로부터 여러 농도의 ¾02 처리에 의해 감소하는 최대 비율 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 세포 내 환원된 티을의 수준이 세포 밀도 및 혈청 고갈에 의하여 영향을 받는다는 것을 나타내는 도이다. 실험데이터는 3번의 반복 실험에 대한 대푯값이다 (F510 = Ex403-Em525/25 ; F580 = Ex488-Em595/25； 크기막대 = 10 μηι ; *Ρ<0. 05, **Ρ<0 . 01, ***Ρ<0. 001) .
도 4a는 서로 다른 밀도 (저밀도， 1 X 104 중밀도, 2 X 104 고밀도, 4 x 104 세포 /cm2)에서 분주된 HeLa 세포를 24시간 동안 배양하고 5 μΜ FreSH-트레이서를 처리하여 2시간 동안 평형을 맞춘 후 공초점 현미 경으로 형광 분석하고 형광비를 이미지화하여 나타낸 도이다. 해당 방출 세기 도면을 도 21b에 나타내었다 .
도 4b는 HeLa 세포를 0% 또는 10% FBS를 포함하는 배지에서 18시간 동안 배양하였고, 도 4a와 같은 방법으로 분석하였다. 해당 방출 세기 도면을 도 21c에 나타내었다. 도 5는 FreSH-트레이서를 이용하여 RAW264.7 세포에서 NADPH 산화효소 활성화에 의하여 변하는 생세포 내 티을 수준을 실시간으로 관찰한 실험결과를 나타내는 도이다.
도 5a는 표시된 시점에서 용매인 에탄올 또는 PMA(phorbol 12-myri state 13- acetate)로 처리된 세포군의 형광 비율 이미지를 나타낸 것이다 (크기 막대 = 10 Mm) . 해당 방출 세기 도면을 도 21d에 나타내었다.
도 5b는 하나의 대조군 세포 (도 5a， 화살촉) 및 두 개의 PMA로 처리된 세포 (도 5b, 화살촉)의 형광 비율을 측정하였고， 이를 시간에 대한 그래프로 나타낸 도이다.
도 6은 FreSH-트레이서에 대한 설프히드릴 화합물의 화학평형상수 0¾)값을 나타낸 도이다.
도 7는 FreSH-트레이서와 GSH의 값에 대한 pH의 영향을 나타낸 도이다. 도 8은 시험관 실험 7? V / / )을 통해 ¾02(5 mM)가 직접 FreSH-트레이서와 반웅하여 형광 비율의 변화를 유도하지 않음을 나타낸 도이다.
도 9는 다양한 양의 글루타티온의 존재하에서 FreS Hᅳ트레이서 형광 비율이 0.5 mM 디아마이드 처리에 의하여 동일한 수준으로 감소된다는 것을 나타낸 도이다 .
도 10a-b는 고농도의 세포 단백질의 존재 하에사 글루타티온 (GSH) 및 PSH가 FreSH-트레이서 센서 반웅을 이용하여 정량적으로 검출된다는 것을 나타낸다.
도 lla-c는 ¾02에 의한 산화반응에서 PSH, GSH 또는 PSH 및 GSH로부터 유래된 FreSH-트레이서의 반웅속도를 비교한 도이다.
도 12a-b는 FreSH-트레이서를 처리하고 6시간과 24시간 후 HeLa 세포가 생존한 정도를 관찰한 도이다. 세포실험에 사용하는 FreSH-트레이서 농도 (~ 5 μΜ)에서는 세포 독성이 없음을 확인할 수 있다.
도 13은 FreSH-트레이서가 로딩된 HeLa 세포의 대표적인 이미지를 나타낸 도이다.
도 14a-d는 세포 내 티을 수준에 대한 NEM과 DTT ithiothrei tol )의 효과를 나타낸 도이다.
도 15a-c는 유세포 분석기를 사용한 FreSH-트레이서로 처리된 HeLa 세포를 분석한 실험결과를 나타낸 도이다.
도 16a-i는 FreSH-트레이서에서 쿠마린 (coumarin)이 결합된 이중 결합이 단일 결합으로 변화된， 안정한 단일 결합 형태의 유도체가 HeLa 세포에서 티올 산화제 (디아마이드와 ¾02) 처리에 민감하지 않다는 것올 나타내는 도이다.
도 17a-c는 표시된 시간동안 ¾¾로 처리된 HeLa 세포의 용해물에서 티을 수준을 FreSH-트레이서 (도 17a)와 EUman 시약 (도 17b)을 사용하여 측정하였고， 환원형 GSH 수준을 글루타티온 환원 효소 (GSH reductase)를 이용한 GSH 정량 키트를 이용하여 측정하여 나타낸 도이다 (도 17c) .
도 18a-b는 HeLa 세포의 티올 수준에 대한 글루타티온 환원효소 (GSH reductase)의 억제제인 BCNU(bis-chlo roethylnitrosourea, 도 18a)와 글투타티온 합성효소 (gamma一 glutamyl cysteine synthetase)의 억제제인 BSO (Buthionine sul foximine , 도 18b) 처리 효과를 나타낸 도이다.
도 19a-b는 여러 농도의 BS0로 처리된 HeLa 세포의 용해물에서 측정한 GSH 수준과 같은 조건의 생세포에 FreSH-트레이서를 처리한 후 형광현미경 (도 19a)과 유세포분석기 (도 19b)를 사용하여 측정한 형광 비율의 관계를 실험한 결과를 나타낸 도이다.
도 20a-b는 유세포 분석기를 이용하여 배양되는 세포 밀도에 따라 변하는 생세포 내 환원된 티을 수준을 측정하여 나타낸 도이다.
도 21a-d는 형광 방출 세기에 대한 이미지를 나타낸 도이다.
도 22a-c는 화학식 2로 표시되는 화합물의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과 (도 22a) 및 베타-머캅토에탄을 mercapt ethanol ) (v¾ = 12 士 1 mM)로 평형을 맞춘 후 화학식 2로 표시되는 화합물과의 반웅을 측정한 형광 방출 스펙트럼 (도 22b-c)을 나타낸 도이다.
도 23a-c는 화학식 3으로 표시되는 화합물의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과 (도 23a) 및 베타-머캅토에탄을 ((3- mercaptoethanol ) (^ = 14 ± 1 mM)로 평형을 맞춘 후 화학식 3으로 표시되는 화합물과의 반웅을 측정한 형광 방출 스펙트럼 (도 23b-c)을 나타낸 도이다.
도 24a-c는 화학식 4로 표시되는 화합물의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과 (도 24a) 및 글루타티온 (GSH) / = 2.8 土 0.4 mM)로 평형을 맞춘 후 화학식 4로 표시되는 화합물과의 반응을 측정한 형광 방출 스펙트럼 (도 24b-c)을 나타낸 도이다.
도 25a-c는 화학식 5로 표시되는 화합물의 가역반웅을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과 (도 25a) 및 베타-머갑토에탄올 ((3-merca ptoethanol X^ = 2.2 士 0. 1 mM)로 평형을 맞춘 후 화학식 5로 표시되는 화합물과의 반응을 측정한 형광 방출 스펙트럼 (도 25b-c)을 나타낸 도이다.
도 26a-c는 화학식 6으로 표시되는 화합물의 가역반웅을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과 (도 26a) 및 글루타티온 0 = 1.3 士 0. 1 mM)으로 평형을 맞춘 후 화학식 6으로 표시되는 화합물과의 반응을 측정한 형광 방출 스펙트럼 (도 26b-c)을 나타낸 도이다.
도 27a-c는 화학식 7로 표시되는 화합물의 가역반웅을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과 (도 27a) 및 글루타티온 0 = 3.7 ± 0.2 mM)으로 평형을 맞춘 후 화학식 7로 표시되는 화합물과의 반웅을 측정한 형광 방출 스펙트럼 (도 27b-c)을 나타낸 도이다.
도 28a-c는 화학식 8로 표시되는 화합물의 가역반웅을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과 (도 28a) 및 다양한 농도의 베타-머갑토에탄올 0 = 2.2 士 0. 1 mM)로 평형을 맞춘 후 화학식 8로 표시되는 화합물과의 반응을 측정한 형광 방출 스펙트럼 (도 28b-c)을 나타낸 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】 이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예 실험 재료 및 실험 방법
1. 시약
글루타티온 환원효소 (glutathione reductase)는 EMD Mi 11 ipore로부터， ¾02， N-에틸말레이미드 (^ethylmaleimide, NEM) , 다이티오트레이를 (di thiothreito , DTT)， 디아마이드 (di amide) , 엘만 시약 (El lman' s reagent ) , 비스- 클로로에틸니트로소유레아 (bis-chloroethylnitrosourea, BCNU) , 부티오닌 설폭시민 (buthionine sulphoximine , BS0) 및 포볼 12-미리스테이트 13- 아세테이트 (phorbol 12-myri state 13-acetate, PMA)를 각각 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
2. FreSH-트레이서 (Fluorescent Real-t ime SH group-Tracer)의 티올 화합물과의 In vitro반웅
티올 화합물 (0-200 mM)과 FreSH-트레이서 (10 μΜ)가 흔합된 완층용액 (인산염 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4, H20:DMS0 = 98 :2)을 제조하고， 이 용액의 시간에 따른 UV 가시광선 홉수 스꽥트럼과 형광 방출 스펙트럼 변화를 각각 신코 S-3100와 Hitachi F-7000 분광광도계로 측정하였다. pH 4와 5， 그리고 9와 10에서의 in vitro 실험을 위한 완층용액 제조에는 인산염 대신 각각 아세트산염 (acetate)과 CHES(2- (cyclohexylamino)ethanesul fonate)를 사용하였다. 이명것 들은의
3. 티을화합물의 j¾ 값의 계산
In vitro 반웅을 통해 티올 화합물 (0-200 mM)과 FreSH-트레이서 사이의 화학평형을 형성한 후， 430 nm 파장의 빛으로 여기시켰을 때 방출되는 형광 방출 스펙트럼을 측정하였다. 최대 방출 파장 (580 nm)에서의 형광세기와 티올 화합물 농도 간의 상관관계를 비선형회귀분석하여 티올 화합물과 FreSH-트레이서 사이의 화학평형상수 를 구하였다.
4. HeLa 세포 단백질의 제조
HeLa 세포를 150 ram 디쉬에 분주하였고， 이 세포들은 2일 후 80%의 밀집도에 도달하였다. 상기 세포들을 PBS에서 스크래핑 (scraping)을 수행함으로써 수득하였고， 이후 원심분리하였다. 세포의 단백질을 수득하기 위하여, 세포들을 0.1% Triton X-100를 포함하는 PBS에서 리서스펜션 (resuspension)을 수행하였고, 음파처리 (sonicat ion)에 의하여 완전히 파괴하였다. 12000 g 및 4°C 조건에서 10분 동안 원심분리를 한 후， 용해물을 글루타티은을 포함하는 저분자량 티올 종을 제거하기 위하여 4°C PBS에서 투석하였다. 단백질의 양을 BCA 방법에 의하여 정량화하였다. 상기 방법은 티올을 포함하는 단백질 (thiol-containing protein, PSH) 샘플로 이용되었다. 단백질 샘플에서 티올기를 없애기 위해 100 mM NEM 용액과 상온에서 2시간 동안 반웅시켰고, 샘플에서 잔여 활성을 갖는 NEM을 제거하기 위해 PBS에서 4Ό 조건에서 투석하였고 이후 5 mM DTT를 포함하는 PBS에서 4°C에서 1시간 동안 투석하였다. 잔여 D T를 4°C PBS에서 투석하여 제거 하였고 이후 상기 단백질을 NEM으로 알킬화된 단백질 (PS— NEM) 샘플로 이용하였다.
5. ¾02로 처리된 HeLa 세포의 용해물에서 티을 및 GSH수준의 측정
2.5xl06 HeLa 세포를 150 mm 디쉬에 분주하였고， 37°C , 5% C02 조건에서 18시간 동안 배양하였다. 세포를 표시된 시점 동안 5 또는 10 mM의 ¾02로 처리하였고 차가운 PBS로 두 번 세척하였다. 세포 펠렛을 12000 g, 4°C 조건에서 1분 동안 원심분리하여 수득한 후 바로 액체 질소에 넣어 얼렸다. 얼린 세포 펠렛을 50 mM MES, 50 mM 인산염 및 1 mM EDTA를 포함하는 pH6의 1 mL 완층용해액에서 리서스펜견하였고 음파처리에 의하여 파쇄한 후, 12000 g 및 4°C 조건에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액올 BCA 단백질 정량법을 이용하여 총단백질양을 맞춘 후， 티올 및 GSH 수준 분석을 수행하 였다. FreSH-트레이서를 이용하여 티올 수준을 분석하기 위하여， 180 uL의 상등액을 20 |儿의 10 μΜ FreSH- 트레이서와 96웰 블랙 플레이트에서 혼합하였고 상온에서 90분 동안 반응시켰다. F510(Ex430-Em510) 및 F580(Ex520-Em580)의 형광세기를 Inf inite M200Pro(TECAN) 마이크로플레이트 리더를 이용하여 측정하였다. 엘만 (El lman) 분석을 위하여， 10 IJL의 상등액을 96웰 플레이트에서 1 mM EDTA를 포함하는 PBS에 용해된 100 |jg/ 의 El lman 시약을 이용하여 흔합하였고 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 티을의 양은 412 nm에서 흡광도로 측정하였다. 잔여 상등액올 글루타티온 분석 키트 (Cayman)를 이용한 GSH 분석을 이용하였다. 환원된 GSH의 양은 전체 GSH 농도로부터 GSSG농도의 두 배를 빼어 계산하였다.
6. 살아있는 세포의 이미징 ( imaging)
HeLa 및 RAW264.7 세포를 10% 열-불활성화 소태아혈청 (FBS, Hyclone) , 100 U/tnl의 페니실린， 100 g/ml의 스트랩토마이신 황산염 및 2 mM 글루타민을 포함하고 페놀레드가 없는 DMEM에서 배양하였다. HeLa(1.8 x 105 세포 /디쉬) 및 RAW264.7(2 x 105세 포 /디쉬)를 35 mm 커버글라스 바닥 디쉬 (SPL Li fesciences)에 분주한 후 37°C , 5% C02조건 에서 표시된 시간 동안 배양하였다. 형광현미경 분석 전에 5 uM의 FreSH-트레이서를 포함하는 2 mL의 배양 배지를 이용하여 HeLa 세포를 2시간 동안 그리고 RAW264.7 세포를 4시간 동안 배양하였다. 세포의 실시 간 이미지를 Nikon A1 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용하여 얻었다. CFI 플랜 아포크로마트 60X(Plan apochromat 60X) 및 1.40 개구수 (numerical aperture, NA) 대물렌즈를 갖춘 Nikon ECLIPSE Ti 역상 현미경에 장착된 챔버 안에서 37°C 및 5% C02조건으로 세포를 배양하며 이미징 실험을 진행하였다. FreSH-트레이서를 403 nm 및 488 nm 레이저선으로 여기시켰고 각각 500-550 nm 및 570-620 nm 밴드 간격의 필터를 통하여 형광을 검출하였다. NIS-Elements AR 소프트웨어를 이용하여 실험데이터의 분석과 형광 비율을 이미지화하였다.
7. 유세포 분석 (f low cytometry)
HeLa 세포를 100 mm 디쉬에 서로 다른 밀도로 하루 정도 배양한 후. 5 μΜ FreSH-트레이서를 1.5 시간 동안 처리하였다. 트립신으로 세포를 디쉬에서 떼어내고 단일세포화 한 후， 원심분리로 트립신을 제거하였다. 이후 HeLa 세포를 5 μΜ FreSH-트레이서를 포함하는 배양 배지에서 리서스펜션시켰고 LSRI I 유세포 분석기 시스템 (LSRI I Flow Cytom eter System, BD Biosciences)을 이용하여 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 이용하여 405와 488 nm에서 각각 여기 후 방출되는 형광 (530/30 nm)의 비율을 계산하였다.
8. BS0처리된 HeLa 세포에서 GSH의 정량
HeLa 세포를 표시된 밀도로 투명한 바닥의 흰색 96웰 플레이트 (Corning Incorporated)에서 배양하였다. 여러 농도의 BS0를 48시간 동안 처리한 후， 세포를 HBSS로 두 번 세척한 이후 전체 GSH 및 GSSG 농도를 GSH/GSSG-Glo 분석 키트 (Promega)를 이용하여 측정하였다. 환원형 GSH 양은 전체 GSH 양 으부터 GSSG 양을 차감하여 계산하였다. HeLa 세포 내 GSH 농도는 기존에 알려진 평균 HeLa 세포의 부피가 3000 urn3 라는 것과 시료 일부의 세포수를 세어 전체 시료의 세포수를 계측한 값에 기초하여 계산하였다. 실험결과
1. FreSH—트레이서 (tracer)의 비율계량적이고 가역적으로 GSH와 빠르게 반웅하는 특성 관찰
FreSH-트레이서는 설프히드릴기 (티올기)를 포함하는 화합물에 대하여 mM 범위의 값을 갖는다 (도 6) . FreSH 트레이서의 이러한 특성은 세포 내 저분자량 티올 (thiol )의 대부분을 차지하며 유일하게 mM 단위의 농도로 존재하는 GSH 양을 측정하기 위해 적절하다. FreSH-트레이서에 GSH의 농도를 증가시키면서 첨가한 경우， 자외선 및 가시광선에 대한 흡광도가 raax = 430 nm에서 증가하고 ^ax = 520 nm에서는 감소하였고 (도 lb) , 형광 방출 세기는 약 510 nm(F510 , λβχ = 430nm; Xem = 510 nm)에서 증가하였고 약 580 mi(F 580 , λ6Χ = 520 nm; λ∞ = 580 nm)에서 감소하였다 (도 lc-e) . 본 발명자들은 FreSH 트레이서의 F510과 F580의 형광방출세기 비 (F510/F580)가 넓은 GSH 농도 범위에서 비례적으로 변한다는 사실을 새롭게 발견하였다 (도 le) . 이것은 상기 센서가 비율계량적 센서로서 이용될 수 았다는 것을 의미한다. 형광비로부터 수득된 회귀 곡선은 세포 내 존재하는 GSH 농도보다 넓은 범위 (0-50 mM)에서 선형성 (R2 = 0.9938)을 나타내었다 (도 10 . 또한， 본 발명자들은 FreSH-트레이서에 포함되는 다양한 유도체， 즉 화학식 2 내지 8로 표시되는 화합물과 베타-머갑토에탄올 ([3-mercaptoethanol ) 또는 글루타티온과의 반응을 측정하였다. 상기 결과를 도 22 내지 도 28에 나타내었다. 도 22 내지 도 28에 나타낸 바와 같이， FreSH-트레이서에 포함되는 다양한 유도체들 또한 자외선 및 가시광선에 대한 흡 광도가 λ Χ = 430 nm에서 증가하고 Xmx = 520 nm에서는 감소하였고, 형광 방출 세기는 약 510 nm(F510 , λβχ = 430nm ; em = 510 nm)에서 증가하였으며 약 580 nm(F580 , λβχ = 520 nm ; Xem = 580 nm)에서 감소하였다. 또한， F510과 F580의 형광방출세기 비 (F510/F580)가 넓은 GSH 농도 범위에서 비례적으로 변한다는 사실을 동일하게 규명하였다
따라서， 본 발명자들은 FreSH 트레이서에 포함될 수 있는 모든 다양한 유도체들 또한본 발명의 센서로서 이용될 수 있다는 것을 입증하였다.
FreSH-트레이서와 GSH 사이의 화학평형상수 ^는 pH 6과 9 사이에서 큰 변화를 나타내지 않았으며 (도 7)， 이는 일반적인 세포 내 pH 변 화가 FreSH- 트레이서의 티올에 대한 반웅성에 크게 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 상기 데이터는 FreSH-트레이서가 세포 내 GSH 양을 모니터링하기 위한 최적의 센서 특성을 갖고 있다는 것을 제시한다.
이후, 본 발명자들은 FreSH-트레이서의 반웅 속도를 조사하였다. FreSH- 트레이서에 5 mM GSH를 첨가한 결과 약 240초 동안 F510 및 F580의 방출세기가 서로 반대되는 패턴으로 빠르게 변화하였고， 이후 800초에서 티올 알킬화 시약인 5 mM의 N-에틸말레이미드 O ethylmaleimide , NEM)를 첨가한 결과 500초 이내에 각각의 형광세기가 초기 값으로 회귀하였다. 해당 센서의 형광비는 5 mM GSH를 첨가함으로써 약 20까지 증가하였고， 이후 즉시 동일한 양의 NEM을 첨가함으로써 초기 수준으로 되돌아갔다 (도 lh) . 본 발명자는 이후 FreSHᅳ트레이서가 GSH의 산화된 형태에 대하여 반웅하지 않는다는 것을 검증하였다. 첫째로， 본 발명자들은 산화된 GSH에 티올-특이적인 산화제인 디아마이드를 이용하였다. 0.5 mM 디아마이드의 첨가는 다양한 양의 GSH로부터 수득된 센서 형광비를 약 4 정도로 일정하게 감소시켰다. 둘째로， 5 mM GSH로부터 수득된 센서 형광비는 ¾02의 투여량에 의존적으로 감소하였다 (도 li ) . 본 발명자들은 실험에 사용한 농도에서 ¾02(보층도 4a) 및 디아마이드 (데이터는 나타내지 않음)가 직접적으로 영향을 주지 않는 것을 확인하였다 (도 8a 및 8b) . 셋째로， GSSG의 첨가는 센서의 형광비에 영향을 주지 않았다 (도 lj ) . GSSG를 GSH로 환원시키는 필수 구성성분인 글루타티온 환원 효소 및 NADPH가 흔합물에 첨가되었을 때， 센서 형광비는 빠르게 증가되었다. 따라서， 상기 결과들은 FreSH-트레이서가 시험관 내에서 vitro) 환원된 GSH 양의 변화를 실시간 모니터링하는데 이용될 수 있다는 것을 입증하였다.
2. 세포의 PSH(cysteine residues of proteins)에 반응하는 FreSH-트레이서의 동역학적 특성
세포 내 티을기는 GSH와 함께 PSH에서 풍부하게 발견되기 때문에， 본 발명자들은 FreSH-트레이서가 PSH에 대해 어떻게 반웅하는지를 연구하였다. 센서 형광비 변화에 대한 PSH의 직접적인 효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 투석에 의하여 GSH를 포함하는 저분자량 티을이 제거된， 헬라 (HeLa) 세포 용해물로부터 수득된 세포의 PSH를 제조하였고， NEM으로 알킬화된 단백질 (PS- NEM)을 첨가함으로써， 세포 내에서 평가된 단백질 농도의 약 10분의 1인 15 mg/ml로 전체 단백질양을 조절하여 실험하였다. 센서 형광비는 PSH 투여량 의존적으로 느리게 증가하였다 (도 2a 및 도 10a) . 한편， GSH는 15 mg/ml PS-NEM이 존재하는 조건에서도 센서 형광비를 빠른 속도로 증가시켰다 (도 2b 및 도 10b) . 이후， 본 발명자들은 디아마이드 (도 2c-e) 및 ¾02(도 lla-c)에 의하여 야기된 산화과정 동안 두 종류의 티올의 3가지 배합으로부터 수득한 센서 형광비율의 변화로 GSH와 PSH가 FreSH-트레이서와 반응하는 특성을 비교하였다. 본 발명자들은 세포의 단백질 흔합물에 존재하는 카탈레이즈 활성을 제거하기 위하여 0.1 mM 나트륨 아자이드를 전처리하고 ¾02 실험을 하였다. PSH로부터 수득한 센사 형광비는 두 산화제의 처리에 의하여 천천히 감소한 반면에 (도 2c 및 도 11a)， GSH로부터 수득한 센서 비율은 더 빠르게 감소하였다 (도 2d 및 도 lib) . PSH 및 GSH로 배합된 센서 형광비는 산화제 처리에 의하여 GSH 및 PS-NEM으로 흔합된 샘플로부터 수득된 형광비와 유사한 동역학적 양상으로 감소되었다 (도 2e 및 도 11c) . 또한, 본 발명자들은 현미경을 이용하여 포름알데히드로 고정된 세포에서 티을 센서에 대한 세포 유래 PSH 및 GSH의 역할을 확인하였다. 고정된 세포에 세제 (detergent )를 처리하여 세포막의 투과성을 높히면 GSH를 포함하는 저분자량 티올이 제거되기 때문에， 세제 처리 없이 고정된 세포는 GSH 및 PSH를 포함하지만 세제 처리된 세포는 단지 PSH만을 포함하는 것으로 간주하고 실험하였다. 본 발명자들이 공초점 현미경 분석을 통해서 기저 센서 형광비를 관찰하였을 때, 세제 처리에 의하여 약 4분의 1로 감소되었다. 이것은 GSH가 세포에서 센서와 반웅하는 주요한 티올이라는 것올 제시한다. 본 발명자들은 산화제 처리에 의하여 고정된 세포에서의 센서 반웅을 관찰하였다. 센서의 형광비는 20 μΜ 또는 100 μΜ 디아마이드의 처리에 의하여 GSH 및 PSH를 포함하는 손상되지 않은 세포에서 빠르게 감소되었고， GSH를 포함하지 않는 투과된 세포에서 느리게 감소하였다. 상기 동역학적 결과는 도 2e 및 2c에서 무세포 샘플로부터 수득된 결과와 각각 유사하였다. 본 발명자들은 ¾02 처리의 실험에서 유사한 결과를 확인하였다 (데이터는 나타내지 않음) .
종합적으로, 상기 실험결과들은 FreSH-트레이서가 세포 내 티올 중 PSH보다 GSH와 우선적으로 반응한다는 것을 입증하였다.
3. FreSH-트레이서의 비을계량적 분석에 의한 살아있는 세포에서 티올 수준 변화의 가시화
본 발명자들은 살아있는 세포에서 티을 수준의 변화를 연구하는 데에 있어서 FreSH-트레이서의 적용 가능성을 연구하였다. 본 발명자들은 최소 24시간 동안 독성이 없는 5 μΜ FreSH-트레이서를 첨가한 배지에서 HeLa 세포를 배양하면서 공초점 현미경 분석을 통해 측정된 형광비를 가색상 ( fal se color) 이미지로서 세포 내 티올 수준을 묘사할 수 있었다 (도 13) . 센서가 세포 내 티올의 산화 환원 조건의 변화에 반웅하는지를 규명하기 위하여， 본 발명자들은 세포 내 티올을 산화시키기 위하여 센서가 로딩된 생세포에 0.5 mM 디아마이드를 처리하였고, 125초 후 0.5 mM 다이티오트레이를 (di thiothrei tol , DTT)를 첨가하여 세포 내 티올을 환원시켰다. 배양 배지에 디아마이드 및 DTT를 첨가하면 생세포에서 즉각적인 센서 반응이 유도됨을 확인하였다 (도 3a-d) . F510 방출세기는 디아마이드 처리에 의하여 빠르게 감소되었고 DTT의 첨가에 의하여 즉시 회복되었으며, F580 신호는 완전히 반대 패턴의 변화를 나타내었다 (도 3a 및 3b) . 살아있는 세포 이미지로부터 계산된 해당 센서의 형광비는 디아마이드 처리에 의하여 감소되었고， 센서와 DTT간의 직접적인 반응 때문에 TT 첨가에 의하여 급격하게 과포화되었다 (도 3a 및 3b) . 핵원형질의 형광 비율은 세포질의 비율보다 더 높았지만, 두 지역의 비율 변화 패턴에서의 차이는 없었다 (도 3a 및 3d) . 본 발명자들은 NEM을 이용한 상기 결과를 개괄할 수 있었다 (도 14a-d) . 또한 본 발명자들은 유세포 분석기를 이용하여 살아있는 HeLa 세포에서 센서의 형광비가 디아마이드 및 DTT의 처리에 의해 같은 패턴으로 변하는 결과를 수득할 수 있었다 (도 15a-c) . 반면， 티을과 반웅하지 않고 지속적으로 F510 형광만 방출하는 FreSH-트레이서 유래 화합물은 산화제 처리에 의하여 반응하지 않았다 (도 16a-i ) . 따라서， FreSH-트레이서의 형광세기는 상기 산화제의 처리에 의하여 직접적인 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다.
이후， 본 발명자들은 FreSH-트레이서를 이용하여 ¾02에 대한 세포의 산화환원 반웅을 관찰하였다. 센서가 로딩된 세포에 50 uM ¾02를 처리하였을 경우， 센서 방출 비율은 약 5분 동안 즉시 감소되었고 약 20분 후 전반적으로 회복되기 시작하였다. 이는 살아있는 세포에서 산화적 스트레스에 대한 효과적인 항산화 반웅이 작동되고 있음을 보여준다 (도 3e 및 3f) . 세포질과 핵질 사이에 형광비율이 변화하는 패턴의 차이는 없었 다 (도 3f ) . 이후, 본 발명자들은 산화적 스트레스의 강도에 따른 센서의 반응성을 측정하기 위하여 다양한 양의 ¾02를 생세포에 처리한 후 센서의 반응을 관찰하였다. 처리한 ¾02의 양이 증가함에 따라 센서의 형광비가 회복하는데 소요되는 시간이 증가되었을 뿐만 아니라， 형광비의 최대 변화폭도 증가되는 경향이 있었다 (도 3g 및 3h) . 본 발명자들은 FreSH-트레이서 및 엘만 (El lman) 시약을 이용하여 5 및 10 mM ¾02로 처리된 HeLa 세포의 용해물에서 티올 산화 수준의 변화를 측정하는 실험을 통하여 비슷한 양상의 결과를 수득하였다 (도 17a 및 17b) . 본 발명자들이 동일한 샘플에서 GSH의 양을 분석하였을 경우， 환원된 GSH 수준의 변화 패턴은 전체 세포의 티올 수준의 패턴과 동일하였다 (도 17c) .
상기 실험결과들은 살아있는 세포에서의 FreSH-트레이서 형광비율이 대부분 환원형 GSH의 양을 나타내는 것.이라는 사실을 입증하였다.
4. GSH 관련 효소 억제제의 처리에 의하여 변화된 세포 내 GSH 양의 FreSH- 트레이서를 이용한 탐지 GSH 물질대사와 관련된 효소의 억제에 의하여 유발된 세포 내 GSH 수준 변화가 FreSH—트레이서를 이용하여 검출될 수 있는지를 명확히 하기 위하여, 본 발명자들은 HeLa 세포 내 환원형 GSH 수준을 낮추기 위하여 글루타티온 환원효소 (glutathione reductase)의 억제제인 비스-클로로에틸니트로소유레아 (bi s- chloroethylnitrosourea, BCNU)와 감 마-글루타밀 시스테인 합성요소 (y-ghitamyl cysteine synthetase)의 억제제인 부티오닌 설폭시민 (buthionine sulphoximine, BS0)을 세포 배양액에 처리하였고 형광비 측정 전 2시간 동안 FreSH-트레이서를 배양액에 첨가한 후 센서의 형광비를 측정하였다. 센서 형광비율은 두 억제제의 처리로 모두 낮아졌다 (도 18a-b) . 형광비가 감소하는 경향은 세포질 및 핵질을 포함하는 세포 내 전체 지역에서 관찰되었다 (도 18a-b) . 살아 있는 세포에서의 센서의 형광비와 환원형 GSH 양과의 관계를 추가적으로 조사하기 위하여， 본 발명자들은 다양한 농도의 BS0를 HeLa 세포에 24시간 동안 처리하였다. 상기 생세포에 FreSH-트레이서를 처리한 후 현미경 및 유세포 분석기로 측정한 센서 형광비와 같은 조건의 세포를 파쇄한 용해물에서 정량 분석된 환원형 GSH의 농도를 비교하였다. 측정된 센서 형광비율과 세포 용해물 속 환원형 GSH 양을 그래프로 나타내었을 때, 상기 그래프들은 모두 선형 관계를 갖는다는 것을 보여주었다 (도 19a-b) . 즉， BS0를 처리한 세포에서 측정한 FreSH-트레이서의 형광비는 세포 내 존재하는 환원형 GSH수준을 나타내고 있음을 알 수 있다.
5. 세포 배양조건에 따라 변하는 세포 내 티올 수준의 변화 관찰
본 발명자들은 FreSH-트레이서가 세포의 내인성 활성 산소종 (react ive oxygen species , R0S)에 의하여 변화된 세포 내 티올 수준도 검출 가능한지를 확인하고자 하였다. 세포 배양시 세포 내 R0S의 발생량이 세포 밀도에 따라 다르다는 것이 알려져 있다 3. 세포 내 티올 수준도 세포 밀도에 영향을 받는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 HeLa 세포를 다양한 밀도로 배양한 후 FreSH- 트레이서를 처리하고 현미경 (도 4a) 및 유세포 분석기 ( f low cytometry)로 분석하였다 (도 20a-b) . 본 발명자들은 두 분석기술을 이용하여 세포 밀도와 세포 내 티올 수준간에 재현 가능한 연관성이 있음을 관찰하였다. 배양시 세포 밀도가 높을수록, 세포질 및 핵질을 포함하는 전 세포 지역에서 티을 수준이 유의적으로 높음을 확인하였다.
세포 배양시 혈청 결핍은 세포 내 R0S의 발생을 유도한다는 것 또한 잘 알려진 사실이다 4. 본 발명자들은 혈청을 포함하고 있거나 또는 혈청이 결핍된 성장 배지에서 HeLa 세포를 배양하고， FreSH-트레이서를 이용하여 세포 내 티을 수준을 현미경으로 측정하였다 (도 4b) . 그 결과 세포 내 티올 수준은 혈청 결핍 조건에서 유의하게 감소하였다.
종합해서， 상기 실험결과들을 통해 FreSH-트레이서가 내인성 R0S에 의해 조절되는 세포 내 티올 수준을 분석하는 데에도 충분히 이용될 수 있다는 것을 규명한 것이다.
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6. NADPH 산화효소 (oxidase)에서 유래하는 R0S에 의하여 변화되는 세포 내 티올 수준 관찰
식세포의 (phagocytic)에서 NADPH oxidase(Phox) 활성에 의해 발생하는 R0S는 ≥ 미생물을 살상하는 필수적인 방어 물질이다. GSH 및 PSH를 포함하는 티올의 산화 환원 상태가 Phox 활성화에 의하여 급격하게 변화한다는 것이 있다 5. 본 발명자들은 FreSH-트레이서로 로딩된 RAW264.4 대식세포의 P hox를 활성화시키기 위하여 포르볼 (phorbol) 12-미리스테이드 (myristate) 13- 아세테이드 (PMA)로 처리하였다. 세포 내 티올 수준은 PMA 처리에 의하여 10분에서 20분 동안 감소하였고 40분에서 50분 후 기저 수준으로 회복한 반면에, 운반체인 에탄올만 처리한 세포는 초기 티올의 양을 그대로 유지하였다 (도 5).
종합적으로， 상기 실험결과는 FreSH-트레이서가 시험관 내에서 (//? vitro) 및 생체 내에서 (/7 vivo) 티을 수준에 대한 바이오센서로 이용될 수 있다는 것을 입증한 것이다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일
， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 참고자료
1. Maher P. The effects of stress and aging on glutathione metabolism. Ageing Res Rev. 2005 May ;4(2) :288-314.
2. Winterbourn CC1, Hampton MB. , Free Radic Biol Med. 2008 Sep 1； 45(5) :549-61.
3. Pani , G. et al . A redox signaling mechanism for densityᅳ dependent inhibition of cell growth. J. Biol . Chem.275 , 38891-38899 (2000) .
4. Sat oh, T. , Sakai , N. , Enokido, Y. , Uchiyama, Y. & Hatanaka, H. Survival factor-insensitive generation of reactive oxygen species in duced by serum deprivation in neuronal cells. BrainRes .733 , 9- 14 (1996) .
5. Seres, T. et al . Protein S-thiolation and dethiolation during the respiratory burst in human monocytes. A reversible post-translational modification with potential for buffering the effects of oxidantstress. J. Immunol. 156,1973-1980 (1996).

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
하기의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 생세포 ( l iving cell )
Figure imgf000022_0001
상기 화학식에서 ¾ 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 4 직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나， , R2 및 X가 함께 5각 또는 6각 고리를 이루는 헤테로 사이클로알킬 또는 헤테로 사이클로알케닐이고; ¾은 수소 또는 d-4 직쇄 또는 가지쇄 알킬이며; 및 ¾는 각각 독립적으로 수소， 직쇄 또는 가지쇄 알킬， - (C¾)ra-C00-Ci-5직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나 (상기 m는 1-5의 정수이다)， R4, R5및 Y는 함께 C3ᅳ 7 헤테로 사이클로알킬을 이루고， 상기 헤테로 사이클로알킬은 비치환 쇄 1-
Figure imgf000022_0002
각 가지쇄 알킬 (상기 q 및 r은 각각 1-5의 정수이다)이고; X 및 Y는 각쇄쇄 독립적으로 N또는 0이다.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2 내지 8로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 티올 검출용 조성물:
Figure imgf000022_0003
Figure imgf000023_0001
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시 되는 화합물은 프리 (free) 상태에서 550-680 nm에서 최대방출파장을 나타내고 티올과 결합된 상태에서 430- 550 nra에서 최대방출파장을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서， 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 생세포에서 티올이 증가함에 따라 방출파장의 형광세기가 연속적이고 가역적으로 증감하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 5】
제 4 항에 있어서， 상기 방출파장의 형광세기는 430 nm 내지 680 nm의 범위에서 증감하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6】
제 4 항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화 합물은 생세포에서 티을이 증가함에 따라 550-680 nm에서의 형광세기가 감소하고 430-550 nm에서의 형광세기는 증가하는 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 7】
제 1 항에 있어서， 상기 티올의 검출은 430-550 nm에서의 형광세기 및 550- 680 nm에서의 형광세기의 비율 (rat io)을 수득하여 (obtaining) 실시하는 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 8】
제 7 항에 있어서， 상기 비율은 상기 430-550 nm에서의 형광세기 및 55으 680 nm에서의 형광세기의 관계 (relat ionship)인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 9】
제 8 항에 있어서， 상기 관계는 상기 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 수학적 비율관계이고 상기 수학적 비율관계는 생세포에서 티을의 양에 따라 비율계량적 (rat iometr ical ly)으로 가역적으로 증 감하여 생세포에서의 티올 양을 실시간으로 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 10】
제 1 항에 있어서， 상기 검출은 상기 생세포의 티을의 정성 또는 정량적 검출인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 11】
제 1 항에 있어서， 상기 검출은 실시간 정량적 검출인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 12】
제 1 항에 있어서， 상기 생세포에서의 티올 검출은 세포의 산화적 스트레스 또는산화도를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 13】
제 1 항에 있어서， 상기 생세포에서의 티을 검출은 세포의 노화도를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 14】
제 1 항에 있어서， 상기 티을은 글루타티온 (glutathione , GSH) , 호모 시스테인 (homocysteine , Hcy) , 시스테인 (cysteine, Cys) 또는 단백질의 시스테인 잔기에 있는 티을인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 15】
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 생세포 ( l ive cel l )에서의 티을 검출용 센서.
【청구항 16]
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 산화 스트레스 유발 질환 진단 키트.
【청구항 17】
다음의 단계를 포함하는 생세포에서의 티을 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법: ᅳ
(a) 제 1 항의 조성물을 생세포에 투여하는 단계;
(b) 시험물질을 단계 (a)의 생세포에 투여하는 단계; 및
(c) 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 비율 (rat io)을 수득하여 표준데이터와 비교함으로써， 상기 시험물질을 티을 증가제 또는 억제제로 결정하는 단계.
【청구항 18】
제 1 항의 조성물을 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물.
【청구항 19】
다음의 단계를 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정 방법:
(a) 생세포에서 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 비율 (rat io)을 실시간으로 측정하는 단계;
(b) 제 1 항의 조성물을 생세포에 투여하는 단계;
(c) 산화제를 단계 (b)의 생세포에 투여하는 단계; 및 (d) 상기 형광세기의 비율 값의 변화를 관찰하는 단계 .
【청구항 20】
제 19 항에 있어서， 상기 항산화능 측정 방법은 상기 단계 (d) 이후 상기 형광세기의 비율 값이 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값 또는 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시간을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생세포에서의 항산화능 측정 방법으로， 상기 시간이 짧을수록 항산화능이 높은 것으로 판단한다.
【청구항 21】
제 19 항에 있어서, 상기 항산화능 측정 방법은 상기 단계 (d) 이후 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값과 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값의 차이의 산화제 투여 시점부터 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시점까지의 적분값을 측정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생세포에서의 항산화능 측정 방법으로, 상기 적분값이 작을수록 항산화능아높은 것으로 판단한다.
【청구항 22】
제 19 항에 있어서， 상기 항산화능 측정 방법은 상기 단계 (d) 이후 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값이 감소하기 시작하는 상기 산화제의 최소 농도를 적정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생세포에서의 항산화능 측정 방법으로， 상기 최소 농도가 높을수록 항산화능이 높은 것으로 판단한다.
【청구항 23】
제 19 항에 있어서, 상기 항산화능 측정 방법은 상기 단계 (d) 이후 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기의 비율 값이 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값 또는 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하지 않는 상기 산화제의 최소 농도를 적정하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생세포에서의 항산화능 측정 방법으로， 상기 최소 농도가 높을수록 항산화능이 높은 것으로 판단한다.
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