KR101983803B1 - 세포의 티올 수준을 측정하기 위한 실시간 이미징 센서 - Google Patents

세포의 티올 수준을 측정하기 위한 실시간 이미징 센서 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포의 티올 수준을 측정하기 위하여 실시간으로 이미징이 가능한 형광 센서에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명의 FreSH-트레이서(Fluorescent Real-time SH group-Tracer)가 생세포에서 티올의 양에 따라 형광 세기가 연속적이고, 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명함으로써, 살아있는 세포에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

세포의 티올 수준을 측정하기 위한 실시간 이미징 센서{Real-time Imaging Sensor for Measuring Cellular Thiol Levels}
본 발명은 세포의 티올 수준을 측정하기 위하여 실시간으로 이미징이 가능한 형광 센서에 관한 것이다.
시스테인(cysteine, Cys), 호모시스테인(homocysteine, Hcy) 및 글루타티온(glutathione, GSH)과 같은 세포 내 티올은 생리적 매트릭스에서 많은 중요한 역할을 담당하고 있다. 예를 들어, Cys 및 Hcy는 생체시스템에서 세포 및 조직 생장에 요구되는 필수적인 생체분자들이다. 시스테인의 결핍은 다양한 건강상의 문제들, 예를 들어, 생장 지연, 모발 탈색, 기면, 간 손상, 근육 및 지방 소실, 및 피부 손상을 유발한다. 사람의 혈장에서 Hcy의 수준이 증가할 경우, 알츠하이머병, 심혈관 질환, 신경관 결손, 염증성 장질환, 및 골다공증이 발생할 위험이 커진다.
인체는 항산화계의 작용을 통해 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 적절히 제거하여 항상성을 유지하나, ROS 생성과 항산화계 작용 사이의 균형이 깨지면 산화적 스트레스(oxidative stress)가 증가하고, 이는 노화를 비롯하여 퇴행성 관절염, 백내장, 알쯔하이머 등의 노화 관련 퇴행성 질환, 각종 암, 섬유화 질환을 비롯하여 최근에는 당뇨병, 비만, 심혈관질환 등의 대사성 증후군의 발병에 주요한 공통 원인 인자로 주목받고 있다. 상기 ROS는 불안정하고 반응성이 높아 생체 분자를 산화시켜 생화학적, 생리적 손상을 유발시키고 이는 노화의 주요 기전 중의 하나이다. 따라서 인체의 산화도 뿐 아니라 항산화도나 항산화능력은 생체나이 계측에 주요한 바이오 마커가 될 수 있다.
GSH는 세포 내 단백질 비구성원(non-proteinogenic) 티올의 대부분을 차지하며 세포에서 환원환경(reducing environment)을 유지하고, 산화환원 준위를 조절하는데 중추적인 역할을 담당하고 있다. 구체적으로, 인체 내 GSH는 H2O2를 비롯한 각종 과산화물질들을 제거하고 자신은 GSSG로 산화되어 산화/환원 정도를 즉각적으로 조절함으로써 산화 환원 항상성(redox homeostasis)을 유지시키는바, 인체의 항산화력을 유지하는 주요 인자이자 인체 항산화도를 나타내는 최적의 지표라 할 수 있다. 실제로, 예쁜 꼬마선충(C. elegance), 초파리(Drosophila melanogaster), 마우스, 랫트 등의 동물과 인체의 뇌, 심장, 신장, 수정체, 폐, 혈액 등의 여러 장기에서 노화에 따라 GSH의 양이 감소되는 사실이 다수의 논문들을 통해 증명된 바 있다1. 또한, ROS과 반응성이 높은 것으로 알려진 비타민 C, 비타민 E 또는 메티오닌(Methionine)은 H2O2나 초과산화물(Superoxide)와 같은 특정 ROS와는 반응하지 않는 것으로 알려져 있으나, GSH의 티올 그룹은 모든 ROS와 반응할 수 있다2. 또한, GSH는 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(glutatathione S-transferase, GST) 활성에 의해 독성물질을 세포 외로 제거하며(Detoxification), GSH가 GSSG로 산화되면 세포 단백질 구성원 티올(PSH)를 직접 산화수식(glutathionylation)하여 단백질의 기능을 변화시킴으로써 신호전달을 야기한다(Redox signaling).
상술한 바를 종합할 때, 생체시료에서 티올을 함유하는 물질의 검출 및 식별은 매우 중요하다. 지금까지, HPLC, 모세관 전기영동 및 UV-Vis 검출/비색 분석 등의 몇몇 티올 검출방법들이 개발되었다. 이들 방법들이 파쇄된 생체시료의 티올을 모니터링하기에는 유용하나, 생세포 내 티올을 검출할 수 있는 방법은 거의 없었다. 세포를 파쇄하지 않고 간단하고, 민감하며 효과적으로 티올을 검출하기 위해서는 형광 방법들이 더 바람직하다. 과거 몇 년 동안, 마이클 첨가(Michael addition), 이황화결합 교환(disulfide bond exchange)이나 Se-N 결합 분열, 금속이온과 황의 상호작용, 알데히드를 이용한 고리형성 등의 메커니즘에 기반을 둔 티올에 대한 다양한 형광 프로브들이 개발된 바 있다. 그러나, 지금까지 개발된 모든 종류의 티올 프로브는 티올과 비가역적으로 반응하므로 생세포에서 티올 양의 변화를 실시간으로 관찰하는데 사용할 수 없다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 본 발명의 FreSH-트레이서(Fluorescent Real-time SH group-Tracer)가 생세포에서 티올의 양에 따라 형광세기가 연속적이고 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명하고, 살아있는 세포에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서로서 유용하게 이용될 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 FreSH-트레이서(Fluorescent Real-time SH group-Tracer)를 포함하는 생세포(living cell)에서의 티올 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 FreSH-트레이서를 포함하는 생세포에서의 티올 검출용 센서를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 FreSH-트레이서를 이용한 산화 스트레스 유발 질환 진단 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 FreSH-트레이서를 이용한 생세포에서 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 FreSH-트레이서를 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 FreSH-트레이서를 이용한 생세포에서 항산화능 측정 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 생세포(living cell)에서의 티올 검출용 조성물을 제공한다:
화학식 1
Figure 112017068968177-pat00001
상기 화학식에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 또는 C1-4 직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나, R1, R2 및 X가 함께 5각 또는 6각 고리를 이루는 헤테로 사이클로알킬 또는 헤테로 사이클로알케닐이고; R3은 수소 또는 C1-4 직쇄 또는 가지쇄 알킬이며; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬, -(CH2)m-COO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬이거나(상기 m는 1-5의 정수이다), R4, R5 및 Y는 함께 C3-7 헤테로 사이클로알킬을 이루고, 상기 헤테로 사이클로알킬은 비치환 또는 R6으로 치환된 헤테로 사이클로알킬이고; 상기 R6은 -COO(CH2)n-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬(상기 n은 1-5의 정수이다), -(CONH)-(CH2)o-PPh3 +Cl-(상기 o는 1-5의 정수이다) 또는 -(CONH)-CHR7-COO(CH2)p-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬이며(상기 p는 1-5의 정수이다); 상기 R7은 -(CH2)q-COO(CH2)r-OCO-C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬(상기 q 및 r은 각각 1-5의 정수이다)이고; X 및 Y는 각각 독립적으로 N 또는 O이다.
본 발명자들은 살아있는 세포에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서를 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 FreSH-트레이서(Fluorescent Real-time SH group-Tracer)가 생세포에서 티올의 양에 따라 형광세기가 연속적이고 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명하고, 살아있는 세포에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서로서 유용하게 이용될 수 있다는 것을 입증하였다.
본 명세서에서, 용어 "FreSH-트레이서(Fluorescent Real-time SH group-Tracer)"는 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 시아노아크릴아마이드 친전자체(cyanoacrylamide electrophile)를 갖는 쿠마린(coumarin) 유도체를 의미하고, 본 발명의 티올 검출용 형광물질로서 사용된다.
본 명세서에서, 용어 "비율계량적(ratiometric)"은 산출량이 투입량(input)에 직접적으로 비례하는 것을 의미한다. 구체적으로, 본 발명의 일 구현예에서, "비율계량적"은 본 발명의 조성물이 티올 투입량에 따라 직접적으로 비례해서 형광세기가 증가 또는 감소하는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "검출"은 시료 속에서 화학종이나 생물학적 물질의 존재 유무나 그 양을 측정하는 것을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "가역적(reversible)"은 화학반응에서 반응물과 생성물의 혼합물이 평형상태의 혼합물을 생성하는 것이 가능한 상태를 의미한다. 보다 구체적으로는, 본 명세서에서 화학식 1로 표시되는 화합물과 티올의 반응이 평형상태를 이루어, 티올의 양에 따라 정반응 또는 역반응하여 가역적으로 반응이 진행될 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 화학식 2 내지 8로 표시되는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물이다:
화학식 2
Figure 112017068968177-pat00002
화학식 3
Figure 112017068968177-pat00003
화학식 4
Figure 112017068968177-pat00004
화학식 5
Figure 112017068968177-pat00005
화학식 6
Figure 112017068968177-pat00006
화학식 7
Figure 112017068968177-pat00007
화학식 8
Figure 112017068968177-pat00008
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 생세포에서 티올의 양이 증가함에 따라 FreSH-트레이서에 결합하는 티올의 양이 증가하므로, 프리 상태의 화합물이 나타내는 550-680 nm의 형광세기는 감소하고, 티올이 결합되어 있는 화합물이 나타내는 430-550 nm의 형광세기는 증가한다. 상기 티올의 양에 따른 형광세기는 비율계량적이고 가역적으로 증감한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 프리(free) 상태, 즉 티올기가 결합되지 않은 상태에서 550-680 nm에서 최대방출파장을 나타내고 티올과 결합된 상태에서 430-550 nm에서 최대방출파장을 나타낸다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 프리 상태에서 550-650, 550-620, 550-600, 570-590 또는 580 nm에서 최대방출파장을 나타낸다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 티올과 결합된 상태에서 450-550, 470-550, 470-530, 490-530, 500-520 또는 510 nm에서 최대방출파장을 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 생세포에서 티올이 증가함에 따라 방출파장의 형광세기가 연속적이고 가역적으로 증감한다. 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 방출파장의 형광세기는 430 nm 내지 680 nm의 범위에서 증감한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 생세포에서 티올이 증가함에 따라 550-680 nm에서의 형광세기가 감소하고 430-550 nm에서의 형광세기는 증가한다.
본 발명의 일 구현예 에 따르면, 상기 티올의 검출은 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 수득하여 (obtaining) 실시한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 비율은 상기 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 관계(relationship)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 관계는 상기 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 수학적 비율관계이고, 상기 수학적 비율관계는 생세포에서 티올의 양에 따라 비율계량적(ratiometrically)으로 가역적으로 증감하여 생세포에서의 티올 양을 실시간으로 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출은 상기 생세포의 티올의 정성 또는 정량적 검출이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출은 실시간 정량적 검출이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생세포에서의 티올 검출은 세포의 산화적 스트레스 또는 산화도를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생세포에서의 티올 검출은 세포의 노화도를 나타낸다.
본 명세서에서, 용어 "티올(thiol)"은 탄소와 결합된 설프히드릴기를 포함하는 유기 황합물을 의미하고, 설프히드릴기 또는 티올기는 혼용되어 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 티올은 글루타티온(glutathione, GSH), 호모시스테인(homocysteine, Hcy), 시스테인(cysteine, Cys) 또는 단백질의 시스테인 잔기에 있는 티올을 모두 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 생세포(live cell)에서의 티올 검출용 센서를 제공한다.
본 발명의 티올 검출용 센서는 본 발명의 티올 검출용 조성물을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 산화 스트레스 유발 질환 진단 키트를 제공한다. 본 명세서의 용어 "산화 스트레스 유발 질환"은 산화 스트레스에 의하여 발생하는 질환을 의미하며, "활성 산소종(ROS) 연관 질환"과 동일한 의미로 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 산화 스트레스 유발 질환은 노화, 퇴행성 관절염, 백내장, 알쯔하이머병, 암, 섬유화 질환, 당뇨병, 비만, 허혈, 허혈성 재관류 손상, 염증, 전신성 홍반 루푸스, 심근경색, 혈전성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 출혈, 척수 외상, 다운증후군, 크론병, 류마티스 관절염, 포도막염, 폐기종, 위궤양, 산소 중독, 종양 또는 방사선증이다.
본 발명의 진단 키트는 본 발명의 티올 검출용 조성물을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생세포에서의 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법을 제공한다:
*(a) 본 발명의 조성물을 생세포에 투여하는 단계; (b) 시험물질을 단계 (a)의 생세포에 투여하는 단계; 및 (c) 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 수득하여 표준데이터와 비교함으로써, 상기 시험물질을 티올 증가제 또는 억제제로 결정하는 단계.
상기 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법은 생세포에 시험물질을 투여하였을 때, 표준데이터와 비교하여 생체 내에서 430-550 nm에서의 형광세기가 550-680 nm에서의 형광세기보다 증가하는 경우 티올 증가제로 결정하고, 그 반대로 나타나는 경우 티올 억제제로 결정한다.
본 발명의 스크리닝 방법은 본 발명의 티올 검출용 조성물을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정 방법을 제공한다:
(a) 생세포에서 430-550 nm에서의 형광세기 및 550-680 nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 실시간으로 측정하는 단계; (b) 본 발명의 조성물을 생세포에 투여하는 단계; (c) 산화제를 단계 (b)의 생세포에 투여하는 단계; 및 (d) 상기 형광세기의 비율 값의 변화를 관찰하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항산화능 측정 방법은 상기 단계 (d) 이후 다음의 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 생세포에서의 항산화능 측정 방법: (i) 상기 형광세기의 비율 값이 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값 또는 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시간을 측정하는 단계; (ⅱ) 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값과 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값의 차이의 산화제 투여 시점부터 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시점까지의 적분값을 측정하는 단계; (ⅲ) 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값이 감소하기 시작하는 상기 산화제의 최소 농도를 적정하는 단계; 또는 (ⅳ) 상기 산화제를 투여한 생세포의 형광세기의 비율 값이 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값 또는 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하지 않는 상기 산화제의 최소 농도를 적정하는 단계로서, 상기 단계 (i)의 시간이 짧을수록, 상기 단계 (ⅱ)의 적분값이 작을수록, 상기 단계(ⅲ)의 최소 농도가 높을수록, 또는 상기 단계 (ⅳ)의 최소 농도가 높을수록 항산화능이 높은 것으로 판단한다.
하기 실시예에서 입증한 바와 같이, 본 발명의 FreSH-트레이서는 생세포에서 티올의 양에 따라 형광세기의 비율이 가역적으로 변화하고 상술한 바와 같이 본 발명의 티올 검출은 생세포의 산화도를 나타내는바, 상기 형광세기의 비율이 산화제 처리 후 회복되는 것으로 생세포의 항산화능을 측정 가능하다. 따라서 (i) 형광세기의 비율 값이 산화제 투여 전 또는 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값으로 회복되는 시간이 짧을수록, (ⅱ) 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값과 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값의 차이의 산화제 투여 시점부터 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하는 시점까지의 적분값이 적을수록(즉, 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값에 대한 그래프와 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값에 대한 그래프 사이의 면적 값이 작을수록), (ⅲ) 산화제를 투여한 생세포의 형광세기 비율 값이 감소하기 시작하는 산화제의 최소 농도가 높을수록, (ⅳ) 산화제를 투여한 생세포의 형광세기의 비율 값이 상기 산화제를 투여하지 않은 생세포의 형광세기 비율 값 또는 상기 산화제를 투여하기 전의 형광세기 비율 값으로 회복하지 못하게 하는 산화제의 최소 농도가 높을수록 항산화능이 높다고 판단할 수 있는 것이다.
본 발명의 항산화능 측정용 조성물 및 항산화능 측정 방법은 본 발명의 티올 검출용 조성물을 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 FreSH-트레이서(Fluorescent Real-time SH group-Tracer)를 포함하는 생세포(living cell)에서의 티올 검출용 조성물, 센서, 진단키트; 및 이를 이용한 티올 증가제 또는 억제제 스크리닝 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 FreSH-트레이서를 포함하는 생세포에서의 항산화능 측정용 조성물 및 이를 이용한 항산화능 측정 방법을 제공한다.
(c) 본 발명은 본 발명의 FreSH-트레이서가 생세포에서 티올의 양에 따라 형광세기가 연속적이고, 비율계량적이며 가역적으로 증감한다는 것을 규명함으로써, 살아있는 세포에서 티올의 양을 실시간으로 정량 또는 정성적으로 검출하는데 현저한 민감성을 갖는 바이오 센서로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 FreSH-트레이서가 글루타티온의 환원형과 가역적이고 빠르게 반응한다는 실험결과를 나타내는 도이다(a.u.는 임의 단위, Ex는 최대 여기 파장, Em은 최대 방출 파장를 각각 나타낸다).
도 1a는 FreSH-트레이서의 가역반응을 나타내는 도이다.
도 1b 내지 1f는 FreSH-트레이서를 20분 동안 다양한 농도의 글루타티온([GSH]0 = 0-200 mM)으로 평형을 맞춘 후 그 반응을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 FreSH-트레이서의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 1c-1f는 430 nm(도 1c) 및 520 nm(도 1d)에서 여기(excitation)에 의하여 발생된 FreSH-트레이서의 형광 방출 스펙트럼을 510 nm(F510) 및 580nm(F580)에서 각각 모니터링하여, 그래프(도 1 e)로 나타낸 도이다.
도 1f는 F510 및 F580로 나누어서 계산하고 증가된 농도의 글루타티온에 맞춘 방출 비율을 나타낸 도이다.
도 1g-1h는 5 mM 글루타티온과 반응하고 800초 후 5 mM NEM(N-Ethyl Maleimide)의 주입에 의하여 글루타티온의 티올기를 알킬화하였을 때 FreSH-트레이서의 실시간 형광변화를 나타낸 도이다. 도 1g는 F510 및 F580에 의하여 모니터링을 한 결과를 나타내었고, 도 1h는 그 방출 비율을 나타내었다.
도 1i는 5 mM 글루타티온과 15분 동안 평형을 맞추고 비율계량적 센서 반응의 측정을 시작한 지 400초 후, 표시된 농도의 H2O2와 반응시킨 FreSH-트레이서의 실시간 형광비의 변화를 나타낸 도이다.
도 1j는 5 mM GSSG 또는 H2O와 200초에서 반응시킨 후, 5 U/ml의 글루타티온 환원효소(glutathione redu ctase, GR) 및 0.5 mM NADPH를 300초 후 추가적으로 첨가한 FreSH-트레이서의 형광비의 변화를 나타낸 도이다.
도 2는 세포 단백질 구성원 티올(PSH)이 FreSH-트레이서와 정량적으로 반응하고 GSH보다 반응속도가 느리다는 것을 나타낸 도이다.
도 2a는 HeLa 세포 용해물로부터 제조한 세포 단백질(PSH) 및 NEM으로 알킬화된 세포 단백질(PS-NEM)을 여러 비율로 혼합하여 PSH가 FreSH-트레이서와 느리게 정량적으로 반응하는 것을 나타낸 도이다.
도 2b는 15 mg/ml의 티올기 없는 단백질(PS-NEM) 환경에서 GSH가 FreSH-트레이서와 빠르게 정량적으로 반응하는 것을 나타낸 도이다.
도 2c-e는 15 mg/ml의 단백질 존재하에서 PSH와 GSH가 티올 산화제인 디아마이드(diamide) 처리에 의해 산화되는 것을 FreSH-트레이서의 형광비로 실시간 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 FreSH-트레이서로 생세포 내 티올 수준을 이미징화할 수 있음을 나타내는 도이다.
도 3a는 FreSH-트레이서로 로딩된 세포의 현미경 관찰을 개시한 지 45초 후에 0.5 mM 디아마이드를 세포 배양액에 처리하고, 125 초 후에 0.5 mM DTT를 주입한 후, 그 공초점 현미경 형광 이미지를 나타낸 도이다. (F510 = Ex403-Em525/25; F580 = Ex488-Em595/25; 크기막대 = 10 μm)
도 3b-3c는 두 개의 각각의 세포의 형광세기(도 3a, 화살촉)를 측정하였고(도 3b), 그 형광비를 계산(도 3c)한 결과를 나타낸 도이다.
도 3d 는 4개의 서로 다른 세포로부터 수득된 전체 세포 영역, 세포질 및 핵질 영역에서의 평균 방출 비율을 그래프로 나타낸 도이다.
도 3e는 FreSH-트레이서로 로딩된 세포를 측정을 시작한지 5분 후 50 μM H2O2로 처리하였고, 표시된 시점에서 세포의 형광세기의 비율을 나타낸 도이다. 해당 방출 세기 도면은 도 21a에 나타내었다(크기막대 = 10 μm).
도 3f는 7개의 서로 다른 세포로부터 수득된 전체 세포 영역, 세포질 및 핵질 영역에서의 평균 방출 형광 비율을 계산한 결과를 나타낸 도이다.
도 3g는 측정을 개시한지 5분 후 세포를 표시된 농도의 H2O2로 처리하였고 전체 세포 영역에서 비율계량적 센서 반응을 측정한 결과를 나타낸 도이다. 파란선(50 μM H2O2)은 도 3e에서 화살촉으로 표시된 세포의 방출 비율을 나타낸 것이다.
도 3h는 도 3g와 유사한 실험에 기초하여, 초기 5분 동안의 전체 세포 영역의 평균 형광 비율로부터 여러 농도의 H2O2 처리에 의해 감소하는 최대 비율 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 세포 내 환원된 티올의 수준이 세포 밀도 및 혈청 고갈에 의하여 영향을 받는다는 것을 나타내는 도이다. 실험데이터는 3번의 반복 실험에 대한 대푯값이다(F510 = Ex403-Em525/25; F580 = Ex488-Em595/25; 크기막대 = 10 μm; *P<0.05, **P<0 .01, ***P<0.001).
도 4a는 서로 다른 밀도(저밀도, 1 x 104 중밀도, 2 x 104 고밀도, 4 x 104 세포/cm2)에서 분주된 HeLa 세포를 24시간 동안 배양하고 5 μM FreSH-트레이서를 처리하여 2시간 동안 평형을 맞춘 후 공초점 현미경으로 형광 분석하고 형광비를 이미지화하여 나타낸 도이다. 해당 방출 세기 도면을 도 21b에 나타내었다.
도 4b는 HeLa 세포를 0% 또는 10% FBS를 포함하는 배지에서 18시간 동안 배양하였고, 도 4a와 같은 방법으로 분석하였다. 해당 방출 세기 도면을 도 21c에 나타내었다.
도 5는 FreSH-트레이서를 이용하여 RAW264.7 세포에서 NADPH 산화효소 활성화에 의하여 변하는 생세포 내 티올 수준을 실시간으로 관찰한 실험결과를 나타내는 도이다.
도 5a는 표시된 시점에서 용매인 에탄올 또는 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate)로 처리된 세포군의 형광 비율 이미지를 나타낸 것이다(크기 막대 = 10 μm). 해당 방출 세기 도면을 도 21d에 나타내었다.
도 5b는 하나의 대조군 세포(도 5a, 화살촉) 및 두 개의 PMA로 처리된 세포(도 5b, 화살촉)의 형광 비율을 측정하였고, 이를 시간에 대한 그래프로 나타낸 도이다.
도 6은 FreSH-트레이서에 대한 설프히드릴 화합물의 화학평형상수(K d)값을 나타낸 도이다.
도 7는 FreSH-트레이서와 GSH의 Kd값에 대한 pH의 영향을 나타낸 도이다.
도 8은 시험관 실험(in v itro)을 통해 H2O2(5 mM)가 직접 FreSH-트레이서와 반응하여 형광 비율의 변화를 유도하지 않음을 나타낸 도이다.
도 9는 다양한 양의 글루타티온의 존재하에서 FreS H-트레이서 형광 비율이 0.5 mM 디아마이드 처리에 의하여 동일한 수준으로 감소된다는 것을 나타낸 도이다.
도 10a-b는 고농도의 세포 단백질의 존재 하에서 글루타티온(GSH) 및 PSH가 FreSH-트레이서 센서 반응을 이용하여 정량적으로 검출된다는 것을 나타낸다.
도 11a-c는 H2O2에 의한 산화반응에서 PSH, GSH 또는 PSH 및 GSH로부터 유래된 FreSH-트레이서의 반응속도를 비교한 도이다.
도 12a-b는 FreSH-트레이서를 처리하고 6시간과 24시간 후 HeLa 세포가 생존한 정도를 관찰한 도이다. 세포실험에 사용하는 FreSH-트레이서 농도(~ 5 μM)에서는 세포 독성이 없음을 확인할 수 있다.
도 13은 FreSH-트레이서가 로딩된 HeLa 세포의 대표적인 이미지를 나타낸 도이다.
도 14a-d는 세포 내 티올 수준에 대한 NEM과 DTT(dithiothreitol)의 효과를 나타낸 도이다.
도 15a-c는 유세포 분석기를 사용한 FreSH-트레이서로 처리된 HeLa 세포를 분석한 실험결과를 나타낸 도이다.
도 16a-i는 FreSH-트레이서에서 쿠마린(coumarin)이 결합된 이중 결합이 단일 결합으로 변화된, 안정한 단일 결합 형태의 유도체가 HeLa 세포에서 티올 산화제(디아마이드와 H2O2) 처리에 민감하지 않다는 것을 나타내는 도이다.
도 17a-c는 표시된 시간동안 H2O2로 처리된 HeLa 세포의 용해물에서 티올 수준을 FreSH-트레이서(도 17a)와 Ellman 시약(도 17b)을 사용하여 측정하였고, 환원형 GSH 수준을 글루타티온 환원 효소(GSH reductase)를 이용한 GSH 정량 키트를 이용하여 측정하여 나타낸 도이다(도 17c).
도 18a-b는 HeLa 세포의 티올 수준에 대한 글루타티온 환원효소(GSH reductase)의 억제제인 BCNU(bis-chlo roethylnitrosourea, 도 18a)와 글루타티온 합성효소(gamma-glutamyl cysteine synthetase)의 억제제인 BSO (Buthionine sulfoximine, 도 18b)의 처리 효과를 나타낸 도이다.
도 19a-b는 여러 농도의 BSO로 처리된 HeLa 세포의 용해물에서 측정한 GSH 수준과 같은 조건의 생세포에 FreSH-트레이서를 처리한 후 형광현미경(도 19a)과 유세포분석기(도 19b)를 사용하여 측정한 형광 비율의 관계를 실험한 결과를 나타낸 도이다.
도 20a-b는 유세포 분석기를 이용하여 배양되는 세포 밀도에 따라 변하는 생세포 내 환원된 티올 수준을 측정하여 나타낸 도이다.
도 21a-d는 형광 방출 세기에 대한 이미지를 나타낸 도이다.
도 22a-c는 화학식 2로 표시되는 화합물의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과(도 22a) 및 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)(K d = 12 ± 1 mM)로 평형을 맞춘 후 화학식 2로 표시되는 화합물과의 반응을 측정한 형광 방출 스펙트럼(도 22b-c)을 나타낸 도이다.
도 23a-c는 화학식 3으로 표시되는 화합물의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과(도 23a) 및 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)(K d = 14 ± 1 mM)로 평형을 맞춘 후 화학식 3으로 표시되는 화합물과의 반응을 측정한 형광 방출 스펙트럼(도 23b-c)을 나타낸 도이다.
도 24a-c는 화학식 4로 표시되는 화합물의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과(도 24a) 및 글루타티온(GSH)(K d = 2.8 ± 0.4 mM)로 평형을 맞춘 후 화학식 4로 표시되는 화합물과의 반응을 측정한 형광 방출 스펙트럼(도 24b-c)을 나타낸 도이다.
도 25a-c는 화학식 5로 표시되는 화합물의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과(도 25a) 및 베타-머캅토에탄올(β-merca ptoethanol)(K d = 2.2 ± 0.1 mM)로 평형을 맞춘 후 화학식 5로 표시되는 화합물과의 반응을 측정한 형광 방출 스펙트럼(도 25b-c)을 나타낸 도이다.
도 26a-c는 화학식 6으로 표시되는 화합물의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과(도 26a) 및 글루타티온(K d = 1.3 ± 0.1 mM)으로 평형을 맞춘 후 화학식 6으로 표시되는 화합물과의 반응을 측정한 형광 방출 스펙트럼(도 26b-c)을 나타낸 도이다.
도 27a-c는 화학식 7로 표시되는 화합물의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과(도 27a) 및 글루타티온(K d = 3.7 ± 0.2 mM)으로 평형을 맞춘 후 화학식 7로 표시되는 화합물과의 반응을 측정한 형광 방출 스펙트럼(도 27b-c)을 나타낸 도이다.
도 28a-c는 화학식 8로 표시되는 화합물의 가역반응을 UV 가시광선 흡수 스펙트럼에 의하여 측정한 결과(도 28a) 및 다양한 농도의 베타-머캅토에탄올(K d = 2.2 ± 0.1 mM)로 평형을 맞춘 후 화학식 8로 표시되는 화합물과의 반응을 측정한 형광 방출 스펙트럼(도 28b-c)을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 재료 및 실험 방법
1. 시약
글루타티온 환원효소(glutathione reductase)는 EMD Millipore로부터, H2O2, N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide, NEM), 다이티오트레이톨(dithiothreito, DTT), 디아마이드(diamide), 엘만 시약(Ellman’s reagent), 비스-클로로에틸니트로소유레아 (bis-chloroethylnitrosourea, BCNU), 부티오닌 설폭시민(buthionine sulphoximine, BSO) 및 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)를 각각 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다.
2. FreSH -트레이서(Fluorescent Real-time SH group-Tracer)의 티올 화합물과의 In vitro 반응
티올 화합물(0-200 mM)과 FreSH-트레이서(10 μM)가 혼합된 완충용액(인산염 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4, H2O:DMSO = 98:2)을 제조하고, 이 용액의 시간에 따른 UV 가시광선 흡수 스펙트럼과 형광 방출 스펙트럼 변화를 각각 신코 S-3100와 Hitachi F-7000 분광광도계로 측정하였다. pH 4와 5, 그리고 9와 10에서의 in vitro 실험을 위한 완충용액 제조에는 인산염 대신 각각 아세트산염(acetate)과 CHES(2- (cyclohexylamino)ethanesulfonate)를 사용하였다.
3. 티올 화합물의 K d 값의 계산
In vitro 반응을 통해 티올 화합물(0-200 mM)과 FreSH-트레이서 사이의 화학평형을 형성한 후, 430 nm 파장의 빛으로 여기시켰을 때 방출되는 형광 방출 스펙트럼을 측정하였다. 최대 방출 파장(580 nm)에서의 형광세기와 티올 화합물 농도 간의 상관관계를 비선형회귀분석하여 티올 화합물과 FreSH-트레이서 사이의 화학평형상수(K d)를 구하였다.
4. HeLa 세포 단백질의 제조
HeLa 세포를 150 mm 디쉬에 분주하였고, 이 세포들은 2일 후 80%의 밀집도에 도달하였다. 상기 세포들을 PBS에서 스크래핑(scraping)을 수행함으로써 수득하였고, 이후 원심분리하였다. 세포의 단백질을 수득하기 위하여, 세포들을 0.1% Triton X-100를 포함하는 PBS에서 리서스펜션(resuspension)을 수행하였고, 음파처리(sonication)에 의하여 완전히 파괴하였다. 12000 g 및 4℃ 조건에서 10분 동안 원심분리를 한 후, 용해물을 글루타티온을 포함하는 저분자량 티올 종을 제거하기 위하여 4℃ PBS에서 투석하였다. 단백질의 양을 BCA 방법에 의하여 정량화하였다. 상기 방법은 티올을 포함하는 단백질(thiol-containing protein, PSH) 샘플로 이용되었다. 단백질 샘플에서 티올기를 없애기 위해 100 mM NEM 용액과 상온에서 2시간 동안 반응시켰고, 샘플에서 잔여 활성을 갖는 NEM을 제거하기 위해 PBS에서 4℃ 조건에서 투석하였고 이후 5 mM DTT를 포함하는 PBS에서 4℃에서 1시간 동안 투석하였다. 잔여 DTT를 4℃ PBS에서 투석하여 제거하였고 이후 상기 단백질을 NEM으로 알킬화된 단백질(PS-NEM) 샘플로 이용하였다.
5. H 2 O 2 로 처리된 HeLa 세포의 용해물에서 티올 및 GSH 수준의 측정
2.5x106 HeLa 세포를 150 mm 디쉬에 분주하였고, 37℃, 5% CO2 조건에서 18시간 동안 배양하였다. 세포를 표시된 시점 동안 5 또는 10 mM의 H2O2로 처리하였고 차가운 PBS로 두 번 세척하였다. 세포 펠렛을 12000 g, 4℃ 조건에서 1분 동안 원심분리하여 수득한 후 바로 액체 질소에 넣어 얼렸다. 얼린 세포 펠렛을 50 mM MES, 50 mM 인산염 및 1 mM EDTA를 포함하는 pH6의 1 mL 완충용해액에서 리서스펜젼하였고 음파처리에 의하여 파쇄한 후, 12000 g 및 4℃ 조건에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 BCA 단백질 정량법을 이용하여 총단백질양을 맞춘 후, 티올 및 GSH 수준 분석을 수행하 였다. FreSH-트레이서를 이용하여 티올 수준을 분석하기 위하여, 180 μL의 상등액을 20 μL의 10 μM FreSH-트레이서와 96웰 블랙 플레이트에서 혼합하였고 상온에서 90분 동안 반응시켰다. F510(Ex430-Em510) 및 F580(Ex520-Em580)의 형광세기를 Infinite M200Pro(TECAN) 마이크로플레이트 리더를 이용하여 측정하였다. 엘만(Ellman) 분석을 위하여, 10 μL의 상등액을 96웰 플레이트에서 1 mM EDTA를 포함하는 PBS에 용해된 100 μg/ μL의 Ellman 시약을 이용하여 혼합하였고 상온에서 15분 동안 반응시켰다. 티올의 양은 412 nm에서 흡광도로 측정하였다. 잔여 상등액을 글루타티온 분석 키트(Cayman)를 이용한 GSH 분석을 이용하였다. 환원된 GSH의 양은 전체 GSH 농도로부터 GSSG 농도의 두 배를 빼어 계산하였다.
6. 살아있는 세포의 이미징(imaging)
HeLa 및 RAW264.7 세포를 10% 열-불활성화 소태아혈청(FBS, Hyclone), 100 U/ml의 페니실린, 100 μg/ml의 스트렙토마이신 황산염 및 2 mM 글루타민을 포함하고 페놀레드가 없는 DMEM에서 배양하였다. HeLa(1.8 x 105 세포/디쉬) 및 RAW264.7(2 x 105 세 포/디쉬)를 35 mm 커버글라스 바닥 디쉬(SPL Lifesciences)에 분주한 후 37℃, 5% CO2 조건 에서 표시된 시간 동안 배양하였다. 형광현미경 분석 전에 5 μM의 FreSH-트레이서를 포함하는 2 mL의 배양 배지를 이용하여 HeLa 세포를 2시간 동안 그리고 RAW264.7 세포를 4시간 동안 배양하였다. 세포의 실시 간 이미지를 Nikon A1 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용하여 얻었다. CFI 플랜 아포크로마트 60X(Plan apochromat 60X) 및 1.40 개구수(numerical aperture, NA) 대물렌즈를 갖춘 Nikon ECLIPSE Ti 역상 현미경에 장착된 챔버 안에서 37℃ 및 5% CO2 조건으로 세포를 배양하며 이미징 실험을 진행하였다. FreSH-트레이서를 403 nm 및 488 nm 레이저선으로 여기시켰고 각각 500-550 nm 및 570-620 nm 밴드 간격의 필터를 통하여 형광을 검출하였다. NIS-Elements AR 소프트웨어를 이용하여 실험데이터의 분석과 형광 비율을 이미지화하였다.
7. 유세포 분석(flow cytometry)
HeLa 세포를 100 mm 디쉬에 서로 다른 밀도로 하루 정도 배양한 후. 5 μM FreSH-트레이서를 1.5 시간 동안 처리하였다. 트립신으로 세포를 디쉬에서 떼어내고 단일세포화 한 후, 원심분리로 트립신을 제거하였다. 이후 HeLa 세포를 5 μM FreSH-트레이서를 포함하는 배양 배지에서 리서스펜션시켰고 LSRII 유세포 분석기 시스템(LSRII Flow Cytom eter System, BD Biosciences)을 이용하여 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 이용하여 405와 488 nm에서 각각 여기 후 방출되는 형광(530/30 nm)의 비율을 계산하였다.
8. BSO 처리된 HeLa 세포에서 GSH의 정량
HeLa 세포를 표시된 밀도로 투명한 바닥의 흰색 96웰 플레이트(Corning Incorporated)에서 배양하였다. 여러 농도의 BSO를 48시간 동안 처리한 후, 세포를 HBSS로 두 번 세척한 이후 전체 GSH 및 GSSG 농도를 GSH/GSSG-Glo 분석 키트(Promega)를 이용하여 측정하였다. 환원형 GSH 양은 전체 GSH 양 으부터 GSSG 양을 차감하여 계산하였다. HeLa 세포 내 GSH 농도는 기존에 알려진 평균 HeLa 세포의 부피가 3000 μm3 라는 것과 시료 일부의 세포수를 세어 전체 시료의 세포수를 계측한 값에 기초하여 계산하였다.
실험 결과
1. FreSH -트레이서(tracer)의 비율계량적이고 가역적으로 GSH와 빠르게 반응하는 특성 관찰
FreSH-트레이서는 설프히드릴기(티올기)를 포함하는 화합물에 대하여 mM 범위의 Kd값을 갖는다(도 6). FreSH 트레이서의 이러한 특성은 세포 내 저분자량 티올(thiol)의 대부분을 차지하며 유일하게 mM 단위의 농도로 존재하는 GSH 양을 측정하기 위해 적절하다. FreSH-트레이서에 GSH의 농도를 증가시키면서 첨가한 경우, 자외선 및 가시광선에 대한 흡광도가 λ max = 430 nm에서 증가하고 λmax = 520 nm에서는 감소하였고(도 1b), 형광 방출 세기는 약 510 nm(F510, λex = 430nm; λem = 510 nm)에서 증가하였고 약 580 nm(F 580, λex = 520 nm; λem = 580 nm)에서 감소하였다(도 1c-e). 본 발명자들은 FreSH 트레이서의 F510과 F580의 형광방출세기 비(F510/F580)가 넓은 GSH 농도 범위에서 비례적으로 변한다는 사실을 새롭게 발견하였다(도 1e). 이것은 상기 센서가 비율계량적 센서로서 이용될 수 있다는 것을 의미한다. 형광비로부터 수득된 회귀 곡선은 세포 내 존재하는 GSH 농도보다 넓은 범위(0-50 mM)에서 선형성(R2 = 0.9938)을 나타내었다(도 1f).
또한, 본 발명자들은 FreSH-트레이서에 포함되는 다양한 유도체, 즉 화학식 2 내지 8로 표시되는 화합물과 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 또는 글루타티온과의 반응을 측정하였다. 상기 결과를 도 22 내지 도 28에 나타내었다.
도 22 내지 도 28에 나타낸 바와 같이, FreSH-트레이서에 포함되는 다양한 유도체들 또한 자외선 및 가시광선에 대한 흡광도가 λmax = 430 nm에서 증가하고 λmax = 520 nm에서는 감소하였고, 형광 방출 세기는 약 510 nm(F510, λex = 430nm; λem = 510 nm)에서 증가하였으며 약 580 nm(F580, λex = 520 nm; λem = 580 nm)에서 감소하였다. 또한, F510과 F580의 형광방출세기 비(F510/F580)가 넓은 GSH 농도 범위에서 비례적으로 변한다는 사실을 동일하게 규명하였다
따라서, 본 발명자들은 FreSH 트레이서에 포함될 수 있는 모든 다양한 유도체들 또한 본 발명의 센서로서 이용될 수 있다는 것을 입증하였다.
FreSH-트레이서와 GSH 사이의 화학평형상수 K d는 pH 6과 9 사이에서 큰 변화를 나타내지 않았으며(도 7), 이는 일반적인 세포 내 pH 변 화가 FreSH-트레이서의 티올에 대한 반응성에 크게 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
상기 데이터는 FreSH-트레이서가 세포 내 GSH 양을 모니터링하기 위한 최적의 센서 특성을 갖고 있다는 것을 제시한다.
이후, 본 발명자들은 FreSH-트레이서의 반응 속도를 조사하였다. FreSH-트레이서에 5 mM GSH를 첨가한 결과 약 240초 동안 F510 및 F580의 방출세기가 서로 반대되는 패턴으로 빠르게 변화하였고, 이후 800초에서 티올 알킬화 시약인 5 mM의 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide, NEM)를 첨가한 결과 500초 이내에 각각의 형광세기가 초기 값으로 회귀하였다. 해당 센서의 형광비는 5 mM GSH를 첨가함으로써 약 20까지 증가하였고, 이후 즉시 동일한 양의 NEM을 첨가함으로써 초기 수준으로 되돌아갔다(도 1h). 본 발명자는 이후 FreSH-트레이서가 GSH의 산화된 형태에 대하여 반응하지 않는다는 것을 검증하였다. 첫째로, 본 발명자들은 산화된 GSH에 티올-특이적인 산화제인 디아마이드를 이용하였다. 0.5 mM 디아마이드의 첨가는 다양한 양의 GSH로부터 수득된 센서 형광비를 약 4 정도로 일정하게 감소시켰다. 둘째로, 5 mM GSH로부터 수득된 센서 형광비는 H2O2의 투여량에 의존적으로 감소하였다(도 1i). 본 발명자들은 실험에 사용한 농도에서 H2O2(보충도 4a) 및 디아마이드(데이터는 나타내지 않음)가 직접적으로 영향을 주지 않는 것을 확인하였다(도 8a 및 8b). 셋째로, GSSG의 첨가는 센서의 형광비에 영향을 주지 않았다(도 1j). GSSG를 GSH로 환원시키는 필수 구성성분인 글루타티온 환원 효소 및 NADPH가 혼합물에 첨가되었을 때, 센서 형광비는 빠르게 증가되었다.
따라서, 상기 결과들은 FreSH-트레이서가 시험관 내에서(in vitro) 환원된 GSH 양의 변화를 실시간 모니터링하는데 이용될 수 있다는 것을 입증하였다.
2. 세포의 PSH ( cysteine residues of proteins)에 반응하는 FreSH -트레이서의 동역학적 특성
세포 내 티올기는 GSH와 함께 PSH에서 풍부하게 발견되기 때문에, 본 발명자들은 FreSH-트레이서가 PSH에 대해 어떻게 반응하는지를 연구하였다. 센서 형광비 변화에 대한 PSH의 직접적인 효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 투석에 의하여 GSH를 포함하는 저분자량 티올이 제거된, 헬라(HeLa) 세포 용해물로부터 수득된 세포의 PSH를 제조하였고, NEM으로 알킬화된 단백질(PS-NEM)을 첨가함으로써, 세포 내에서 평가된 단백질 농도의 약 10분의 1인 15 mg/ml로 전체 단백질양을 조절하여 실험하였다. 센서 형광비는 PSH 투여량 의존적으로 느리게 증가하였다(도 2a 및 도 10a). 한편, GSH는 15 mg/ml PS-NEM이 존재하는 조건에서도 센서 형광비를 빠른 속도로 증가시켰다(도 2b 및 도 10b). 이후, 본 발명자들은 디아마이드(도 2c-e) 및 H2O2(도 11a-c)에 의하여 야기된 산화과정 동안 두 종류의 티올의 3가지 배합으로부터 수득한 센서 형광비율의 변화로 GSH와 PSH가 FreSH-트레이서와 반응하는 특성을 비교하였다. 본 발명자들은 세포의 단백질 혼합물에 존재하는 카탈레이즈 활성을 제거하기 위하여 0.1 mM 나트륨 아자이드를 전처리하고 H2O2 실험을 하였다. PSH로부터 수득한 센서 형광비는 두 산화제의 처리에 의하여 천천히 감소한 반면에(도 2c 및 도 11a), GSH로부터 수득한 센서 비율은 더 빠르게 감소하였다(도 2d 및 도 11b). PSH 및 GSH로 배합된 센서 형광비는 산화제 처리에 의하여 GSH 및 PS-NEM으로 혼합된 샘플로부터 수득된 형광비와 유사한 동역학적 양상으로 감소되었다(도 2e 및 도 11c). 또한, 본 발명자들은 현미경을 이용하여 포름알데히드로 고정된 세포에서 티올 센서에 대한 세포 유래 PSH 및 GSH의 역할을 확인하였다. 고정된 세포에 세제(detergent)를 처리하여 세포막의 투과성을 높히면 GSH를 포함하는 저분자량 티올이 제거되기 때문에, 세제 처리 없이 고정된 세포는 GSH 및 PSH를 포함하지만 세제 처리된 세포는 단지 PSH만을 포함하는 것으로 간주하고 실험하였다. 본 발명자들이 공초점 현미경 분석을 통해서 기저 센서 형광비를 관찰하였을 때, 세제 처리에 의하여 약 4분의 1로 감소되었다. 이것은 GSH가 세포에서 센서와 반응하는 주요한 티올이라는 것을 제시한다. 본 발명자들은 산화제 처리에 의하여 고정된 세포에서의 센서 반응을 관찰하였다. 센서의 형광비는 20 μM 또는 100 μM 디아마이드의 처리에 의하여 GSH 및 PSH를 포함하는 손상되지 않은 세포에서 빠르게 감소되었고, GSH를 포함하지 않는 투과된 세포에서 느리게 감소하였다. 상기 동역학적 결과는 도 2e 및 2c에서 무세포 샘플로부터 수득된 결과와 각각 유사하였다. 본 발명자들은 H2O2 처리의 실험에서 유사한 결과를 확인하였다(데이터는 나타내지 않음).
종합적으로, 상기 실험결과들은 FreSH-트레이서가 세포 내 티올 중 PSH보다 GSH와 우선적으로 반응한다는 것을 입증하였다.
3. FreSH -트레이서의 비율계량적 분석에 의한 살아있는 세포에서 티올 수준 변화의 가시화
본 발명자들은 살아있는 세포에서 티올 수준의 변화를 연구하는 데에 있어서 FreSH-트레이서의 적용 가능성을 연구하였다. 본 발명자들은 최소 24시간 동안 독성이 없는 5 μM FreSH-트레이서를 첨가한 배지에서 HeLa 세포를 배양하면서 공초점 현미경 분석을 통해 측정된 형광비를 가색상(false color) 이미지로서 세포 내 티올 수준을 묘사할 수 있었다(도 13). 센서가 세포 내 티올의 산화 환원 조건의 변화에 반응하는지를 규명하기 위하여, 본 발명자들은 세포 내 티올을 산화시키기 위하여 센서가 로딩된 생세포에 0.5 mM 디아마이드를 처리하였고, 125초 후 0.5 mM 다이티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)를 첨가하여 세포 내 티올을 환원시켰다. 배양 배지에 디아마이드 및 DTT를 첨가하면 생세포에서 즉각적인 센서 반응이 유도됨을 확인하였다(도 3a-d). F510 방출세기는 디아마이드 처리에 의하여 빠르게 감소되었고 DTT의 첨가에 의하여 즉시 회복되었으며, F580 신호는 완전히 반대 패턴의 변화를 나타내었다(도 3a 및 3b). 살아있는 세포 이미지로부터 계산된 해당 센서의 형광비는 디아마이드 처리에 의하여 감소되었고, 센서와 DTT간의 직접적인 반응 때문에 DTT 첨가에 의하여 급격하게 과포화되었다(도 3a 및 3b). 핵원형질의 형광 비율은 세포질의 비율보다 더 높았지만, 두 지역의 비율 변화 패턴에서의 차이는 없었다(도 3a 및 3d). 본 발명자들은 NEM을 이용한 상기 결과를 개괄할 수 있었다(도 14a-d). 또한 본 발명자들은 유세포 분석기를 이용하여 살아있는 HeLa 세포에서 센서의 형광비가 디아마이드 및 DTT의 처리에 의해 같은 패턴으로 변하는 결과를 수득할 수 있었다(도 15a-c). 반면, 티올과 반응하지 않고 지속적으로 F510 형광만 방출하는 FreSH-트레이서 유래 화합물은 산화제 처리에 의하여 반응하지 않았다(도 16a-i). 따라서, FreSH-트레이서의 형광세기는 상기 산화제의 처리에 의하여 직접적인 영향을 받지 않는다는 것을 확인하였다.
이후, 본 발명자들은 FreSH-트레이서를 이용하여 H2O2에 대한 세포의 산화환원 반응을 관찰하였다. 센서가 로딩된 세포에 50 μM H2O2를 처리하였을 경우, 센서 방출 비율은 약 5분 동안 즉시 감소되었고 약 20분 후 전반적으로 회복되기 시작하였다. 이는 살아있는 세포에서 산화적 스트레스에 대한 효과적인 항산화 반응이 작동되고 있음을 보여준다(도 3e 및 3f). 세포질과 핵질 사이에 형광비율이 변화하는 패턴의 차이는 없었 다(도 3f). 이후, 본 발명자들은 산화적 스트레스의 강도에 따른 센서의 반응성을 측정하기 위하여 다양한 양의 H2O2를 생세포에 처리한 후 센서의 반응을 관찰하였다. 처리한 H2O2의 양이 증가함에 따라 센서의 형광비가 회복하는데 소요되는 시간이 증가되었을 뿐만 아니라, 형광비의 최대 변화폭도 증가되는 경향이 있었다(도 3g 및 3h). 본 발명자들은 FreSH-트레이서 및 엘만(Ellman) 시약을 이용하여 5 및 10 mM H2O2로 처리된 HeLa 세포의 용해물에서 티올 산화 수준의 변화를 측정하는 실험을 통하여 비슷한 양상의 결과를 수득하였다(도 17a 및 17b). 본 발명자들이 동일한 샘플에서 GSH의 양을 분석하였을 경우, 환원된 GSH 수준의 변화 패턴은 전체 세포의 티올 수준의 패턴과 동일하였다(도 17c).
상기 실험결과들은 살아있는 세포에서의 FreSH-트레이서 형광비율이 대부분 환원형 GSH의 양을 나타내는 것이라는 사실을 입증하였다.
4. GSH 관련 효소 억제제의 처리에 의하여 변화된 세포 내 GSH 양의 FreSH -트레이서를 이용한 탐지
GSH 물질대사와 관련된 효소의 억제에 의하여 유발된 세포 내 GSH 수준 변화가 FreSH-트레이서를 이용하여 검출될 수 있는지를 명확히 하기 위하여, 본 발명자들은 HeLa 세포 내 환원형 GSH 수준을 낮추기 위하여 글루타티온 환원효소(glutathione reductase)의 억제제인 비스-클로로에틸니트로소유레아(bis-chloroethylnitrosourea, BCNU)와 감마-글루타밀 시스테인 합성요소(γ-glutamyl cysteine synthetase)의 억제제인 부티오닌 설폭시민(buthionine sulphoximine, BSO)을 세포 배양액에 처리하였고 형광비 측정 전 2시간 동안 FreSH-트레이서를 배양액에 첨가한 후 센서의 형광비를 측정하였다. 센서 형광비율은 두 억제제의 처리로 모두 낮아졌다(도 18a-b). 형광비가 감소하는 경향은 세포질 및 핵질을 포함하는 세포 내 전체 지역에서 관찰되었다(도 18a-b). 살아 있는 세포에서의 센서의 형광비와 환원형 GSH 양과의 관계를 추가적으로 조사하기 위하여, 본 발명자들은 다양한 농도의 BSO를 HeLa 세포에 24시간 동안 처리하였다. 상기 생세포에 FreSH-트레이서를 처리한 후 현미경 및 유세포 분석기로 측정한 센서 형광비와 같은 조건의 세포를 파쇄한 용해물에서 정량 분석된 환원형 GSH의 농도를 비교하였다. 측정된 센서 형광비율과 세포 용해물 속 환원형 GSH 양을 그래프로 나타내었을 때, 상기 그래프들은 모두 선형 관계를 갖는다는 것을 보여주었다(도 19a-b). 즉, BSO를 처리한 세포에서 측정한 FreSH-트레이서의 형광비는 세포 내 존재하는 환원형 GSH 수준을 나타내고 있음을 알 수 있다.
5. 세포 배양 조건에 따라 변하는 세포 내 티올 수준의 변화 관찰
본 발명자들은 FreSH-트레이서가 세포의 내인성 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의하여 변화된 세포 내 티올 수준도 검출 가능한지를 확인하고자 하였다. 세포 배양시 세포 내 ROS의 발생량이 세포 밀도에 따라 다르다는 것이 알려져 있다3. 세포 내 티올 수준도 세포 밀도에 영향을 받는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 HeLa 세포를 다양한 밀도로 배양한 후 FreSH-트레이서를 처리하고 현미경(도 4a) 및 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석하였다(도 20a-b). 본 발명자들은 두 분석기술을 이용하여 세포 밀도와 세포 내 티올 수준간에 재현 가능한 연관성이 있음을 관찰하였다. 배양시 세포 밀도가 높을수록, 세포질 및 핵질을 포함하는 전 세포 지역에서 티올 수준이 유의적으로 높음을 확인하였다.
세포 배양시 혈청 결핍은 세포 내 ROS의 발생을 유도한다는 것 또한 잘 알려진 사실이다4. 본 발명자들은 혈청을 포함하고 있거나 또는 혈청이 결핍된 성장 배지에서 HeLa 세포를 배양하고, FreSH-트레이서를 이용하여 세포 내 티올 수준을 현미경으로 측정하였다(도 4b). 그 결과 세포 내 티올 수준은 혈청 결핍 조건에서 유의하게 감소하였다.
종합해서, 상기 실험결과들을 통해 FreSH-트레이서가 내인성 ROS에 의해 조절되는 세포 내 티올 수준을 분석하는 데에도 충분히 이용될 수 있다는 것을 규명한 것이다.
6. NADP H 산화효소( oxidase )에서 유래하는 ROS에 의하여 변화되는 세포 내 티올 수준 관찰
식세포의(phagocytic)에서 NADPH oxidase(Phox) 활성에 의해 발생하는 ROS는 침투하는 미생물을 살상하는 필수적인 방어 물질이다. GSH 및 PSH를 포함하는 세포의 티올의 산화 환원 상태가 Phox 활성화에 의하여 급격하게 변화한다는 것이 알려져 있다5. 본 발명자들은 FreSH-트레이서로 로딩된 RAW264.4 대식세포의 P hox를 활성화시키기 위하여 포르볼(phorbol) 12-미리스테이드(myristate) 13-아세테이드(PMA)로 처리하였다. 세포 내 티올 수준은 PMA 처리에 의하여 10분에서 20분 동안 감소하였고 40분에서 50분 후 기저 수준으로 회복한 반면에, 운반체인 에탄올만 처리한 세포는 초기 티올의 양을 그대로 유지하였다(도 5).
종합적으로, 상기 실험결과는 FreSH-트레이서가 시험관 내에서(in vitro) 및 생체 내에서(in vivo) 티올 수준에 대한 바이오센서로 이용될 수 있다는 것을 입증한 것이다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
참고자료
1. Maher P. The effects of stress and aging on glutathione metabolism. Ageing Res Rev. 2005 May;4(2):288-314.
2. Winterbourn CC1, Hampton MB., Free Radic Biol Med . 2008 Sep 1;45(5):549-61.
3. Pani, G. et al. A redox signaling mechanism for density-dependent inhibition of cell growth. J.Biol.Chem.275,38891-38899 (2000).
4. Satoh, T., Sakai, N., Enokido, Y., Uchiyama, Y. & Hatanaka, H. Survival factor-insensitive generation of reactive oxygen species in duced by serum deprivation in neuronal cells. BrainRes.733,9-14 (1996).
5. Seres, T. et al. Protein S-thiolation and dethiolation during the respiratory burst in human monocytes. A reversible post-translational modification with potential for buffering the effects of oxidantstress. J.Immunol. 156,1973-1980 (1996).

Claims (13)

  1. 하기의 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하고,
    상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 프리(free) 상태에서 580 nm에서 최대방출파장을 나타내고, 티올과 결합된 상태에서 510 nm에서 최대방출파장을 나타내며,
    510 nm에서 형광 세기 및 580 nm에서의 형광세기의 비율(ratio)을 수득(obtaining)하고,
    상기 비율은 상기 510 nm에서의 형광세기 및 580 nm에서의 형광세기의 관계(relationship)가 생세포에서 티올의 양에 따라 비율계량적(ratiometrically)으로 가역적으로 증감하여 생세포에서의 티올 양을 실시간으로 나타내어, 상기 티올양으로 항산화 회복능을 측정하는 생세포에서의 항산화 회복능 측정용 조성물:
    화학식 2
    Figure 112019031304184-pat00009
    .
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항산화 회복능 측정은 산화 스트레스에 대한 생세포의 반응을 측정하는 것인, 생세포에서의 항산화 회복능 측정용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 세포의 반응 측정은 제 1항에 따른 화합물이 생세포에서 티올 증가 또는 감소에 따라 방출파장의 형광세기가 연속적이고 가역적으로 증감하는 것을 측정하는 것인, 생세포에서의 항산화 회복능 측정용 조성물.
  4. 삭제
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 화합물은 생세포에서 티올이 증가함에 따라 580 nm에서의 형광세기가 감소하고 510 nm에서의 형광세기는 증가하는 것인, 생세포에서의 항산화 회복능 측정용 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 측정은 상기 생세포의 티올 변화에 대한 정성 또는 정량적 측정인 것인, 생세포에서의 항산화 회복능 측정용 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 항산화 회복능 측정은 실시간 정량적 측정인 것인, 생세포에서의 항산화 회복능 측정용 조성물.
  11. 제 3항에 있어서, 상기 티올은 글루타티온(GSH, glutathione), 호모 시스테인(Hcy, homocysteine), 시스테인(Cys, cysteine) 및 단백질의 시스테인 잔기에 있는 티올로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인, 생세포에서의 항산화 회복능 측정용 조성물.
  12. 다음의 단계를 포함하는 생세포에서의 항산화 회복능 측정 방법:
    (a) 생세포에서 510nm에서의 형광세기 및 580nm에서의 형광세기의 비율을 측정하는 단계;
    (b) 제 1항의 조성물을 생세포에 투여하는 단계;
    (c) 산화 스트레스를 유발하는 산화제를 단계 (b)의 생세포에 투여하는 단계;
    (d) 상기 (a) 단계의 형광세기의 비율 값의 변화를 관찰하는 단계;
    (e) 상기 (d) 단계 이후 형광세기의 비율 값을 (a) 단계에서 측정한 형광세기의 비율 값과 비교하여 동일한 값으로 회복하는 시간을 측정하는 단계.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 조성물 농도가 낮을수록, 단계 (c)의 산화제 농도가 높을수록, 또는 단계 (e)의 시간이 짧을수록 생세포에서의 항산화 회복능이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가적으로 포함하는, 생세포에서의 항산화 회복능 측정 방법.
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